Khóa luận Phân tích thành phần hóa học của lá mơ lông Việt Nam (Paederia lanuginosa)

Nội dung text: Khóa luận Phân tích thành phần hóa học của lá mơ lông Việt Nam (Paederia lanuginosa)

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y- DƯỢC ĐÀM VIỆT HÙNG PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LÁ MƠ LÔNG VIỆT NAM (Paederia lanuginosa) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2019
2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y- DƯỢC ĐÀM VIỆT HÙNG PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LÁ MƠ LÔNG VIỆT NAM (Paederia lanuginosa) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: QH.2014 NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. LÊ THỊ THU HƯỜNG TS. NGUYỄN HỮU TÙNG Hà Nội – 2019
3. LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp, em đã nhận được sự giúp đỡ, tạo điều kiện, đóng góp ý kiến và chỉ bảo tận tình, tâm huyết của các thầy cô, gia đình và bạn bè. Em xin chân thành cảm ơn TS. Lê Thị Thu Hường - giảng viên Bộ môn Dược liệu – Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội và TS. Nguyễn Hữu Tùng – giảng viên Bộ môn Hóa dược và kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, là những người Thầy đã tận tâm hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khoá luận. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Dược liệu – Dược học Cổ truyền, Bộ môn Hóa dược và kiểm nghiệm thuốc của Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã luôn tạo điều kiện thuận lợi, hướng dẫn và giúp đỡ em trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Em cũng xin chân thành cảm ơn tất cả các quý thầy cô trong Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã dạy dỗ, trang bị kiến thức cho em trong suốt 5 năm theo học tại Khoa. Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè, những người đã luôn theo sát động viên, quan tâm và tạo điều kiện giúp con hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Hà Nội, ngày 26 tháng 4 năm 2019 Sinh viên Đàm Việt Hùng
4. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Tên ký hiệu, viết tắt Tên đầy đủ 1 A Độ hấp thụ quang (Absorption) 2 C Nồng độ (Concentration) 3 EtOH Ethanol Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance 4 HPLC Liquid Chromatography) 5 MeOH Methanol 6 R2 Hệ số tương quan 6 STT Số thứ tự 7 TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) 8 UV Vùng tử ngoại (Ultra Violete)
5. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình vẽ, đồ thị Trang Hình 1.1. Cây mơ lông 4 Hình 1.2. Các iridoid glucoside có trong cây mơ lông 7 Hình 1.3. Iridoid dạng đime số 6 7 Hình 1.4. Iridoid dạng đime số 7 8 Hình 1.5. Iridoid dạng đime số 8 8 Hình 1.6. Một số hợp chất anthraquinon có trong cây mơ lông 9 Hình 2.1. Mẫu lá tươi của cây mơ lông 11 Hình 3.1. Sắc ký đồ pha đảo của mẫu cao lá mơ với hệ dung môi MeOH- 20 H2O ở các tỷ lệ lần lượt là 1:2 (A), 2:1 (B), 1:1 (C) Hình 3.2. Sắc ký đồ pha đảo của cao tổng với hệ dung môi MeOH-H2O 20 (1:2) Hình 3.3. Sắc ký đồ HPLC của mẫu cao lá mơ 21 Hình 3.4. Phổ UV của chất có thời gian lưu 6,099 phút 22 Hình 3.5. Phổ UV của chất có thời gian lưu 10,212 phút 22 Hình 3.6. Phổ UV của chất có thời gian lưu 11,146 phút 23 Hình 3.7. Phổ UV của chất có thời gian lưu 15,039 phút 23 Hình 3.8. Phổ UV của chất có thời gian lưu 15,872 phút. 24 Hình 3.9. Phổ UV của chất có thơi gian lưu 16,532 phút. 24 Hình 3.10. Phổ UV của chất có thời gian lưu 17,012 phút 25 Hình 3.11. Phổ UV của chất có thời gian lưu 18,539 phút 25 Hình 3.12. Đồ thi miêu tả sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang vào nồng độ 26 của mẫu chuẩn iridoid
6. DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp trong mẫu 19 cao lá mơ bằng phản ứng hóa học Bảng 3.2. Nồng độ và giá trị độ hấp thụ quang tương ứng của mẫu chuẩn 26 iridoid Bảng 3.3. Hàm lượng iridoid trong mẫu tươi tính được dựa vào độ hấp thụ 27 quang của mẫu thử
7. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan về cây mơ lông (Paederia lanuginosa) 2 1.1.1. Đặc điểm họ Cà phê (Rubiaceae) 2 1.1.2. Vị trí, phân loại của chi Paederia 2 1.1.3. Đặc điểm thực vật cây mơ lông 3 1.1.4. Tác dụng dược lý cây mơ lông 5 1.1.5. Thành phần hóa học của cây mơ lông 6 CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1. Đối tượng nghiên cứu 11 2.2. Phương tiện nghiên cứu 11 2.2.1. Thiết bị dụng cụ 11 2.2.1. Hóa chất, dung môi 12 2.2. Phương pháp nghiên cứu 12 2.2.1. Phương pháp xử lý mẫu và chiết mẫu 12 2.2.2. Phương pháp định tính mẫu cao lá mơ bằng các phản ứng hóa học 13 2.2.3. Phương pháp định tính bằng sắc ký lớp mỏng 16 2.2.4. Phương pháp định tính bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 17 2.2.5. Phương pháp định lượng iridoid toàn phần 17 CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 18 3.1. Chiết xuất 18 3.2. Phân tích định tính các nhóm chất hữu cơ có trong cao lá mơ 18 3.2.1. Kết quả phân tích định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học . 18 3.2.2. Kết quả phân tích định tính iridoid bằng sắc ký lớp mỏng 20 3.2.3. Kết quả phân tích định tính bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 21
8. 3.3. Định lượng iridoid toàn phần có trong mẫu cao lá mơ 25 3.4. Bàn luận 27 3.4.1. Về chiết xuất cao toàn phần từ mẫu lá mơ 27 3.4.2. Về định tính mẫu cao lá mơ 27 3.4.3. Về định lượng iridoid toàn phần 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO A. Tài liệu tiếng Việt B. Tài liệu tiếng Anh
9. ĐẶT VẤN ĐỀ Thuốc phòng bệnh và chữa bệnh được điều chế từ 2 nguồn chính: dược liệu và hóa chất tổng hợp. Riêng thảo dược, thống kê chưa đầy đủ của Tổ chức y tế thế giới cho thấy hơn 21.000 loài cây cỏ được các dân tộc trên thế giới dùng làm thuốc. Không chỉ các nước Á Đông mà các nước phương Tây cũng tiêu thụ một lượng rất lớn dược liệu. Do đó, việc sản xuất thuốc từ nguồn gốc thảo dược là một hướng nghiên cứu được các nhà nghiên cứu khoa học đặc biệt chú trọng hiện nay. Nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa, có một thảm thực vật vô cùng phong phú và đa dạng với nhiều loại thảo dược quý. Trong đó có những cây thuốc được dân gian sử dụng từ hàng ngàn năm nay như lá mơ, lá ngải cứu, lá lốt Tuy nhiên, các thảo dược này hầu hết vẫn chỉ được sử dụng trực tiếp hoặc chế biến thành nguyên liệu thô, do vậy chưa phát huy được hết công dụng của chúng. Một trong số đó phải kể đến cây mơ lông (Paederia lanuginosa họ Cà phê-Rubiaceae) thuộc chi Paederia. Cây mơ lông (mơ tam thể) Paederia lanuginosa thuộc họ Cà phê (Rubiaceae) là loại thân cây leo, mọc hoang ở Việt Nam, Trung Quốc, Nhật Bản. Các bộ phận của cây đã được sử dụng làm thuốc như thuốc lợi tiểu, gây nôn, kháng viêm, diệt khuẩn Các nghiên cứu trước đây về cây mơ lông đã cho thấy nó có chứa hai thành phần chính là các iridoid glucoside và các anthraquinon. Nghiên cứu về các hợp chất hóa học có hoạt tính từ cây mơ lông là một trong những hướng nghiên cứu triển vọng và được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm. Tuy nhiên, ở Việt Nam, các nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như tác dụng dược lý của cây mơ lông vẫn chưa nhiều. Do vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân tích thành phần hóa học của lá mơ lông Việt Nam (Paederia lanuginosa)”. Mục tiêu của đề tài: Chiết xuất và xác định một số thành phần hóa học có trong lá của cây mơ lông. Đề tài được thực hiện với các nội dung chính sau: 1. Chiết xuất và xác định các nhóm hợp chất hữu cơ thường có trong mẫu nghiên cứu bằng các phản ứng hóa học và phương pháp sắc ký lớp mỏng. 2. Xác định sơ bộ các nhóm hợp chất hữu cơ có trong mẫu cao lá mơ lông bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. 3. Định lượng iridoid toàn phần có trong mẫu cao lá mơ lông bằng phương pháp đường chuẩn. 1
10. CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cây mơ lông (Paederia lanuginosa) 1.1.1. Đặc điểm họ Cà phê (Rubiaceae) Các cây thuộc họ Cà phê (Rubiaceae) thường là loại cây thân gỗ, cây bụi hoặc nửa bụi, đôi khi là cây thân thảo hay dây leo. Lá mọc đối, luôn có lá kèm với nhiều hình dạng khác nhau. Hoa thường tập hợp thành cụm hình xim, đôi khi hình đầu, mẫu 5 hoặc 4. Đài và tràng đều hợp, tràng có tiền khai hoa thường vặn. Trong một vài trường hợp, số thùy của tràng có thể lên tới 8 hoặc 10. Số nhị thường bằng với số thùy tràng và nằm xen kẽ giữa các thùy, dính vào ống tràng hoặc họng tràng. Bộ nhụy gồm hai lá noãn dính vào nhau thành bầu dưới, có hai buồng. Một vòi nhụy mảnh, đầu nhụy chia hai. Mỗi buồng của bầu chứa một đến nhiều noãn đảo hay thẳng. Quả mọng, hạch hay quả khô (quả mở hoặc quả phân thành những hạch nhỏ). Hạt thường có phôi thẳng có nội nhũ hoặc đôi khi không có [8,18]. Trên thế giới, họ Cà phê (Rubiaceae) là một trong năm họ có nhiều loài nhất trong nhóm thực vật có hoa, với khoảng 13.000 nghìn loài [18], được phân bố trong 620 chi, hơn 40 tông và được chia làm 3 phân họ: Cinchonoideae, Ixoroideae, Rubioideae [18]. Chúng được tìm thấy ở tất cả các lục địa, kể cả nam cực, với một vài loài của chi Coprosma, Galium, và Sherardia [18]. Phần lớn được phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam, theo các tài liệu nghiên cứu đã công bố mới nhất về họ Cà phê cho thấy, họ này có khoảng 93 chi và 450 loài, phân bố rộng khắp cả nước [1,8]. 1.1.2. Vị trí, phân loại của chi Paederia Vị trí của chi Paederia trong hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (1987) [27]: Giới thực vật (Planta) Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa Môi (Lamiidae) Bộ Cà Phê (Rubiales) Họ Cà Phê (Rubiaceae) Chi Paederia 2
11. Ở Việt Nam, có hai loài là Paederia lanuginosa (Mơ lông) và Paederia foetida (Mơ leo) [8]. 1.1.1.1. Mơ leo (Paederia foetida) Phân bố: Cây phân bố ở vùng Ấn Độ - Malaysia. Ở Việt Nam, cây mọc ở lùm bụi và cũng được trồng làm cây dược liệu. Công dụng: Chữa co thắt túi mật và dạ dày ruột, tê đau do chấn thương; trẻ em cam tích, tiêu hoá kém và suy dinh dưỡng; viêm gan, vàng da, viêm ruột, lỵ; viêm khí quản, ho gà, lao phổi; phong thấp đau nhức gân cốt, đòn ngã tổn thương; giảm bạch cầu gây ra bởi bức xạ; nhiễm độc bởi phốt pho hữu cơ trong các sản phẩm nông nghiệp; dùng ngoài trị viêm da, eczema, lở loét, áp xe; toàn cây còn dùng chữa vết thương do côn trùng độc cắn [18]. 1.1.1.2. Mơ lông (Paederia lanuginosa) Dây leo bằng thân quấn. Lá mọc đối hình trứng, nếu mặt dưới lá màu tím đỏ thì gọi là mơ tam thể. Hoa màu tím nhạt, mọc thành xim ở kẽ lá. Quả dẹt. Toàn cây có lông mềm và có mùi khó ngửi [18]. Phân bố: Cây được phát hiện ở một số nước châu Á như Nhật Bản, Trung Quốc. Ở nước ta, cây mọc hoang và được trồng vào các mùa xuân, thu ở các bờ rào để làm thuốc hoặc gia vị trong các bữa ăn [18]. Công dụng: Chữa lỵ trực trùng; kiết lỵ mới phát; tiêu chảy do nóng; sôi, đầy bụng, ăn khó tiêu; tiêu chảy ra máu; ho gà [18]. 1.1.3. Đặc điểm thực vật cây mơ lông Mơ lông còn có tên khác là dây mơ lông, dây mơ tròn, ngưu bì đống, rau mơ, dắm chó, ngũ hương đẳng [8] Tên khoa học: Paederia lanuginosa. Thuộc họ Cà phê (Rubiaceae). Mô tả: Dây leo bằng thân quấn, sống nhiều năm. Thân màu xanh lục hoặc màu tím, có nhiều lông cứng màu trắng; tiết diện tròn ở thân già, hơi dẹt ở thân non. Lá đơn, nguyên, mọc đối, có mùi đặc trưng; phiến lá hình tim đỉnh nhọn, dài 9-11 cm, rộng 4-6 cm, mặt trên màu xanh lục mặt dưới màu tím, có nhiều lông cứng màu trắng; gân lá hình lông chim nổi rõ ở mặt dưới, 6 cặp gân phụ đối hoặc gần đối [18]. Cuống lá hình lòng máng nông, dài 2-3 cm, màu xanh, có nhiều lông trắng; 2 lá kèm ở giữa 2 cuống lá, dạng vẩy tam giác hoặc hình tim dài 0,3-0,5 cm, màu xanh, tồn tại. Cụm hoa xim hai ngả rất phân nhánh ở nách lá hoặc ngọn cành, dài 10-50 cm. Hoa nhỏ, đều, lưỡng 3
12. tính, mẫu 5 rất ít mẫu 6, không cuống, lá bắc hình tam giác nhỏ. Đài hoa: 5-6, rời, hình tam giác nhỏ cao 1 mm, màu xanh hơi tím, có lông trắng, tiền khai vặn. Tràng hoa: 5-6 cánh đều, màu tím mặt ngoài màu trắng xanh ở mặt trong, dính nhau ở 2/3 dưới tạo thành ống tràng dài 0,4-0,5 cm, phía trên xòe ra 5 phiến dài 0,2 cm có nhiều gai nạc, mỗi phiến có 3-4 thùy cạn không đều và uốn lượn; mặt trong họng tràng có nhiều lông tiết màu tím nhạt, dài 0,2-0,3 cm, chân dài đa bào (tế bào to dần về phía đỉnh của lông tiết) đầu đơn bào to tròn dài; mặt ngoài ống tràng có rất nhiều lông màu trắng, 4-6 tế bào mọng nước xếp chồng lỏng lẻo. Bộ nhị: 5-6 nhị đều, rời, đính ở đáy ống tràng xen kẽ cánh hoa. Chỉ nhị dạng sợi mảnh, màu hồng hoặc tím nhạt dài 0,2-0,25 cm, nhẵn bóng. Bao phấn 2 ô, màu trắng, thuôn dài 0,3-0,35 cm, nứt dọc, hướng trong, đính lưng. Hạt phấn mở, rộng 20-25 µm, màu trắng, hình bầu dục 2 đầu thuôn tròn, có 3 rãnh dọc, có vân, dài 42,5-50 µm. Bộ nhụy: bầu dưới hình chuông 2 ô, mỗi ô có 1 noãn, đính noãn trung trụ; 1 vòi nhụy ngắn, màu hồng nhạt; 2 đầu nhụy dạng sợi uốn lượn, dài 0,4-0,7 cm, màu hồng nhạt, có nhiều lông mịn màu trắng; đĩa mật hình khoen bao quanh gốc vòi nhụy [8,17]. Phân bố: Cây mọc hoang ở các nước châu Á như Việt Nam, Trung Quốc, Nhật Bản và Philippin. Ở Việt Nam, cây mọc hoang và cũng được trồng xung quanh nước ta để làm thuốc và gia vị. Cây thường được trồng vào mùa xuân, thu, ở các bờ rào, bờ ao có lùm bụi cho leo [8]. Bộ phận dùng: Lá, thân, rễ [4,8]. Hình 1.1. Cây mơ lông 4
13. 1.1.4. Tác dụng dược lý cây mơ lông 1.1.4.1. Tác dụng chống tiêu chảy Hoạt tính chống tiết niệu của dịch chiết lá mơ lông trong ethanol đã được nghiên cứu. Nghiên cứu này sử dụng mô hình tiêu chảy do dầu thầu dầu và magie sulphate gây ra ở chuột. Kết quả cho thấy chiết xuất lá mơ làm tăng thời gian tiềm ẩn tiêu chảy ở chuột và làm giảm đáng kể khả năng vận động của đường tiêu hóa [24]. 1.1.4.2. Tác dụng bảo vệ gan Dịch chiết lá mơ lông trong methanol đươc chứng minh có tác dụng cải thiện các tổn thương tại gan trên mô hình chuột Sprague Dawley (SD). Mô hình invivo được xây dựng bằng cách tiêm carbon tetrachloride (CCl4) vào màng bụng chuột và sau đó tiêm dịch chiết cho chuột trong vòng ba tuần liên tiếp. Việc sử dụng dịch chiết làm giảm đáng kể nồng độ lipid peroxide gan (LPO) trong chuột nhiễm độc CCl4 (khoảng 40%). Sự gia tăng các enzyme hoạt động trong huyết thanh như GPT, GOT, ALP khi bị nhiễm độc CCl4 cũng được hạn chế đáng kể. Kết quả của nghiên cứu này cho thấy lá mơ tam thể có thể làm giảm các tổn thương tại tế bào gan bằng cách ức chế các chất oxy hóa [24]. 1.1.4.3. Tác dụng tiêu diệt ký sinh trùng Chiết xuất methanol của lá mơ đã được sàng lọc hoạt tính chống sán lá đối với Pheretima posthuma và Tubifex tubifex. Chiết xuất thể hiện hoạt tính thuốc tẩy giun sán cao nhất ở nồng độ 100 mg/ml so với piperazine citrate (10 mg/ml) làm chất chuẩn và nước cất là mẫu chứng [24]. 1.1.4.4. Hoạt tính chống viêm Hoạt tính chống viêm của dịch chiết lá mơ lông trong ethanol đã được nghiên cứu để tìm cơ sở cho việc ứng dụng các tác dụng sinh học của cây. Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết có khả năng ức chế đáng kể sự hình thành mô hạt ở chuột cấy bông. Nó cũng ức chế sự gia tăng nồng độ orosomucoid trong huyết thanh ở chuột, cho thấy khả năng chống bệnh thấp khớp của dịch chiết [24]. 1.1.4.5. Hoạt tính chống loét Hoạt tính chống loét của cao chiết từ lá mơ được đánh giá bằng hai phương pháp: phương pháp thắt môn vị và phương pháp loét do aspirin gây ra ở chuột. Thể tích axit dạ dày, tổng độ axit và độ axit tự do được đo để đánh giá khả năng chống loét của dịch chiết lá mơ. Kết quả nghiên cứu cho thấy tác dụng chống loét của dịch chiết có thể là do ức chế thụ thể H2 dẫn đến ức chế bài tiết acid dạ dày [24]. 5
14. 1.1.4.6. Một số tác dụng dược lý khác Tác dụng trị tiêu chảy: lá mơ có tác dụng chống tiêu chảy do ức chế sự vận động của hệ tràng vị [24]. Tác dụng chống oxy hóa: dịch chiết lá (tươi hoặc khô) của lá mơ có tác dụng chống oxy hóa trên mô hình ABTS (2,2’-azinnobis (3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) và β-caroten ở mức độ trong khoảng 50-80%. Lá tươi có tác dụng mạnh hơn lá khô [4]. Tác dụng kháng viêm: phân đoạn tan trong nước của dịch chiết cồn 50% của lá mơ có tác dụng kháng viêm trên nhiều mô hình thử nghiệm gây phù cấp và bán cấp với carrageenan, histamine và dextran. Tác dụng phụ thuộc vào liều dùng. Tác dụng tăng khi sử dụng qua phúc mô [4]. Tác dụng bảo vệ gan: Dịch chiết methanol của lá mơ có tác dụng bảo vệ gan ở mức độ trung bình [4]. Ngoài ra, lá mơ còn có tác dụng chống lại các thương tổn kiểu viêm xương khớp, làm giảm sự thoái hóa sụn khớp [4]. 1.1.5. Thành phần hóa học của cây mơ lông Các nghiên cứu trước về cây mơ lông đã cho thấy nó có chứa hai thành phần chính là các iridoid và anthraquinon [20-23]. 1.1.5.1. Các iridoid glucoside Đây là một trong những thành phần chính trong cây mơ lông. Trong quá trình nghiên cứu, các nhà nghiên cứu người Nhật đã phát hiện ra một vài hợp chất iridoid của cây mơ lông còn có chứa lưu huỳnh. Ví dụ như: paederoside (1), asperuloside (2) và paederosidic axit (3) được tìm thấy trong lá và thân của cây mơ lông Nhật Bản [20- 23,26]. 6
15. Hình 1.2. Các iridoid glucoside có trong cây mơ tam thể (GlcH4 là glucose) 1.1.5.1. Các iridoid dạng đimer Gần đây, trong quá trình nghiên cứu về rễ cây mơ lông ở Việt Nam, PGS.TS Đặng Ngọc Quang và cộng sự đã tinh sạch được ba hợp chất iridoid glucosid dạng đime (6-8). Đây là những đime đầu tiên được tìm thấy trong chi Paederia. Đime 6 tạo thành do sự kết hợp của hai monomer là paederosidic axit methyl ester và paederosidic axit. Liên kết được hình thành giữa nhóm cacboxylic của axit paederosidic và nhóm 6- OH trong phần đường của axit paederosidic metyl ester [22]. Hình 1.3. Iridoid dạng đime số 6 7
16. Hình 1.4. Iridoid dạng đime số 7 Trong khi đó đime số 7 được tạo thành từ hai phân tử axit paederosidic. Dựa vào công thức cấu tạo ở trên, có thể dự đoán hợp chất này được tạo thành do sự este hóa của nhóm axit cacboxylic trong axit paederosidic với nhóm 3-OH của glucozơ trong phân tử axit paederosidic kia [22]. Đime thứ 3 là hợp chất số 8 cũng được tạo thành từ hai monome paederoside [22]. Hình 1.5: Iridoid dạng đime số 8 8
17. 1.1.5.3. Các anthraquinon Đây cũng là một trong các thành phần chính của các cây thuộc họ Cà phê. Tuy nhiên, việc phát hiện ra các hợp chất anthraquinon từ cây mơ lông còn rất hạn chế. Gần đây, Đặng Ngọc Quang và cộng sự đã tinh sạch được 7 hợp chất anthraquinon (9-15) và một coumarin (16) từ rễ cây mơ lông của Việt Nam chúng là những hợp chất có hoạt tính kháng sinh mạnh [15,16]. Hình 1.6. Một số hợp chất anthraquinon có trong cây mơ lông Các tài liệu trước đây đã chỉ ra rằng anthraquinon là các hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học quan trọng. Có thể kể đến như tác dụng ức chế Epstein-Barr virus của hợp chất số 13, tác dụng kháng virus (14) và hoạt tính gây độc tế bào (15) [15,16]. 1.1.5.4. Các thành phần khác Ngoài ra, trong cây mơ lông còn chứa một số nhóm hợp chất hữu cơ khác như: Alkaloid: α-paederin và β-paederin [4]. Tinh dầu: trong toàn cây và hoa có tinh dầu với hàm lượng cao. Tinh dầu có trên 70 cấu tử trong đó có linalool là thành phần chính, ngoài ra còn có α-terpineol và geraniol [4]. 9
18. Các steroid và triterpen: sistosterol, stigmasterol và campesterol, acid urosolic, epifriedelinol, friedelin [4]. Ngoài ra, trong thân và lá còn chứa các hydrocacbon mạch dài như hentriacontan, hentrinacontanol và cetyl alcohol; các dẫn chất furan như 2,3- dihydrobenzofuran, benzofuran; các acid béo như nonionic, capric, lauric, myristic, arachidic, palmitic và carotene, vitamin C [4]. Đặc biệt, các dẫn chất lưu huỳnh là dimethyl sulfide, dimethyl trisulfid và methyl mercaptan làm cho thân và lá tươi có mùi đặc biệt [4]. 10
19. CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Mẫu nghiên cứu là lá mơ lông được thu mua tại chợ Bưởi, Hà Nội vào tháng 9 năm 2018 và được giám định thực vật học bởi TS. Nghiêm Đức Trọng - trường Đại học Dược Hà Nội. Mẫu được lưu giữ tại Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm của phòng thí nghiệm. Hình 2.1. Mẫu lá tươi của cây mơ lông 2.2. Phương tiện nghiên cứu 2.2.1. Thiết bị dụng cụ Các thiết bị, dụng cụ được sử dụng trong quá trình thực nghiệm bao gồm: Tủ sấy Memmert (Memmert-Đức). Máy cô quay chân không Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi, Thụy Sĩ). Máy siêu âm Power sonic 405 (Powersonic - Hàn Quốc). Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR (Precisa-Thụy Sĩ). 11
20. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Mỹ). Bình chạy sắc ký lớp mỏng. Máy ly tâm. Máy khuấy từ. Các dụng cụ thường dùng trong quá trình thực nghiệm khác như: bình nón, ống đong, ống nghiệm, pipet, ống nhỏ giọt, cốc có mỏ Máy ảnh. 2.2.1. Hóa chất, dung môi Dung môi dùng để chiết xuất: Etanol 80%. Dung môi để chạy sắc ký lớp mỏng: Methanol, nước cất 2 lần. Dung môi dùng để chạy HPLC: Acetolnitril, acid sulfuric 0,05%. Dung môi để định lượng iridoid: Acid acetic, Đồng sunphat 0,2%, acid hidrocloric 1%. Các dung môi, hóa chất dùng để định tính bằng các phản ứng hóa học: Methanol, CuSO4 0,05%, HCl 1%, Acid acetic, FeCl3, NaOH, H2SO4, Anhydrid acetic, chloroform, dung dịch NH3, thuốc thử Mayer, thuốc thử Bouchardat, bột Magnesi. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp xử lý mẫu và chiết mẫu Mẫu lá mơ được sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 80℃, sau đó vò nát. Mẫu được đem chiết 3 lần bằng cồn 80 độ. Mỗi lần chiết kéo dài 24 giờ. Dịch chiết thu được được lọc qua phễu lọc Bucher. Dịch chiết sau khi đã lọc được đưa vào máy cô quay chân không để cô lấy cao ở nhiệt độ 75℃ [6,12]. Sơ đồ cụ thể như sau: Lá mơ lông tươi (2 kg) Sấy khô Mẫu khô (253,18 g) Ethanol 80 độ, 3 lần Dịch chiết Cô quay chân không Cao đặc (22,29 g) 12
21. 2.2.2. Phương pháp định tính mẫu cao lá mơ bằng các phản ứng hóa học Phương pháp định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp được thực hiện theo các phản ứng được ghi trong sách Dược liệu, Thực tập dược liệu, nhà xuất bản Y học [2,4]. 2.2.2.1. Phương pháp định tính iridoid Phản ứng với thuốc thử Trim-Hill Muốn phát hiện iridoid, ngưới ta thường dùng thuốc thử Trim-Hill: 10 ml acid acetic + 1 ml CuSO4 0,2% + 0,5 ml HCl 1%. Cho vào ống nghiệm 1-2 ml giọt dịch chiết ethanol, thêm 10 ml thuốc thử. Sau khoảng vài phút ống nghiệm sẽ xuất hiện màu xanh dương. Tuy nhiên, cũng có một số iridoid âm tính với thuốc thử trên [4,14]. 2.2.2.2. Phương pháp định tính flavonoid Phản ứng Cyanidin Đây là phản ứng khử hay được sử dụng để tìm sự có mặt của các dẫn chất nhóm flavonoid. Cho vào ống nghiệm 2-3 ml dịch chiết ethanol, thêm một ít bột magnesi kim loại, nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3-5 giọt). Sau 1 đến 2 phút sẽ có màu đỏ cam, đỏ thẫm hoặc đỏ tươi với các dẫn chất flavon, flavonol, flavanonol, flavanon [9]. Phản ứng này dựa trên khả năng chống oxi hóa của flavonoid. Màu sắc đôi khi có thể bị thay đổi tùy theo loại, vị trí nhóm thế ví dụ các dẫn chất methoxy flavon thì âm tính [4,25]. Tác dụng với FeCl3 Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5%, lắc sẽ xuất hiện màu [7,10]. Tùy theo nhóm flavonoid và tùy theo số lượng nhóm OH trong phân tử mà cho màu lục, xanh, nâu. Đa số các phân tử flavonoid đều có nhóm OH phenol, do đó nó có khả năng tạo phức màu với Fe3+ [4,25]. Tác dụng với kiềm Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết. Thêm vài giọt dung dịch NaOH 5%. Sẽ thấy xuất hiện kết tủa màu vàng. Thêm 1 ml HCl, tủa sẽ tan và màu vàng của dung dịch sẽ tăng lên [25]. 13
22. 2.2.2.3. Phương pháp định tính saponin Dựa trên tính chất tạo bọt đây là tính chất đặc trưng nhất của saponin. Do phân tử saponin có tính chất hoạt động bề mặt, đặc tính này được giải thích bởi tính chất vừa thân dầu vừa thân nước của phân tử saponin. Phần aglycon có tính thân dầu còn phần đường có tính thân nước nên saponin có đặc tính làm giảm sức căng bề mặt và tạo bọt. Khả năng tạo bọt thay đổi theo cấu trúc của saponin: phần genin, số mạch đường, chiều dài mạch đường nhờ đặc tính này mà saponin tạo bọt nhiều khi lắc với nước [4]. Dược liệu được chiết bằng cồn 70%, dịch chiết được bốc hơi trong dung môi và hòa tan lại trong một ít nước. Lấy dung dịch này cho vào ống nghiệm. Thêm nước cất, dùng ngón tay bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều [2]. Dọc ống nghiệm trong 1 phút (=30 lần lắc). Quan sát lớp bọt trong 15 phút, nếu ống nghiệm còn bọt trên bề mặt chứng tỏ có saponin [25]. 2.2.2.4. Phương pháp định tính tanin Phản ứng Braemer’s: đây là phản ứng kết tủa với kim loại, tanin cho tủa với các muối kim loại nặng như chì, thủy ngân, kẽm, sắt, đồng. Với muối sắt, các tanin khác nhau cho màu xanh lá hay xanh đen với độ đậm khác nhau. Có thể dựa vào màu sắc của tủa với muối sắt để xác định tanin trên vi phẫu [4]. Cách tiến hành: Cân 100 mg cao chiết, thêm 10ml ethanol, hòa tan. Lấy 2ml dịch thử cho vào ống nghiệm, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5% . 2.2.2.5. Phương pháp định tính steroid Phản ứng Libermann-Burchardt hay dùng để phân biệt 2 loại saponin triterpenoid và saponin steroid. Lấy vài miligram sapogenin (phần aglycon của saponin) hòa nóng vào 1 ml anhydride acetic, cho thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc, nếu là dẫn chất steroid thì có màu lơ – xanh lá, còn dẫn chất triterpenoid thì có màu hồng đến tía [2,4]. Cách tiến hành: Lấy 1 ml dịch chiết, thêm 1 ml chloroform, thêm 2-3 ml anhydride acetic và 1-2 giọt acid sunfuric đặc. 2.2.2.6. Phương pháp định tính tinh dầu Cách tiến hành: Lấy 2 ml dịch thử, thêm 0,1 ml dung dịch NaOH 5% và một lượng nhỏ dung dịch HCl 5%. Xuất hiện kết tủa trắng chứng tỏ trong thành phần dược liệu có chứa tinh dầu [25]. 14
23. 2.2.2.7. Phương pháp định tính terpenoid Phản ứng Liebermann-Burchardt Cân 100 mg cao chiết, thêm 10 ml ethanol, lấy 2ml dịch thử cho vào ống nghiệm,hòa tan thêm 1 ml chloroform, 2- 3ml của acetic anhydride, 1-2 giọt axit sulfuric đậm đặc [25]. Phản ứng Salkowski Cân 100 mg cao chiết lá mơ, thêm 10ml etanol, hòa tan. Lấy 2 ml dịch thử cho vào ống nghiệm. Thêm 2 ml cloroform và 3 ml sulfuric axit H2SO4 [5]. 2.2.2.8. Phương pháp định tính alkaloid Định tính alkaloid bằng các phản ứng tủa với một số thuốc thử. Các alkaloid có khả năng tạo tủa ít tan trong nước với một số thuốc thử chung của alkaloid. Tủa này sinh ra hầu hết một cation lớn là alkaloid với một anion lớn thường là anion phức hợp của thuốc thử [4,25]. Thuốc thử Mayer (K2HgI4 - kalitetraodomercurat): cho tủa trắng hay màu vàng nhạt [25]. Thuốc thử Bouchardat (Iodo - Iodid): cho tủa nâu [25]. 2.2.2.9. Phương pháp định tính anthraquinon Các hợp chất anthraquinone khi tác dụng với kiềm (amoniac, natrihydroxyd hoặc kaki hydroxyd) sẽ tạo các dẫn chất phenolat có màu đỏ sim tan trong nước. Dựa vào tính chất này, định tính anthraquinone dựa trên phản ứng Borntrager [4]. Định tính dạng tự do: lấy 1 ml dịch chiết thêm 1 ml dd amoniac 10% và 2ml chloroform, sau đó lắc nhẹ, lớp nước sẽ có màu đỏ sim. Nếu lớp chloroform có màu vàng chứng tỏ trong dược liệu chứa acid chrysophanic. Thêm tiếp từng giọt dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ. Lớp dung môi hữu cơ có màu vàng, còn lớp nước đỏ thẫm hơn lúc ban đầu [2]. Định tính anthraquinon toàn phần (cả dạng glycoside và dạng tự do): lấy 1ml dịch chiết, thêm 1 ml dung dịch amoniac, lắc nhẹ, lớp nước sẽ có màu đỏ sim. Nếu lớp chloroform có màu vàng thì tiếp tục nhỏ từng giọt dung dịch NH3 10%, lắc nhẹ, lớp chloroform sẽ mất màu còn lớp nước thì có màu đỏ đậm hơn [2]. 15
24. 2.2.2.10. Phương pháp định tính đường khử Phương pháp này dựa trên cơ sở trong môi trường kiềm (glucose, fructose, maltose ) có thể dễ dàng khử đồng (II) oxid thành đồng (I) oxid có màu đỏ gạch, qua đó ta định tính được đường khử. Định tính đường khử ta sử dụng thuốc thử Fehling 1 (chứa CuSO4) và 2 ( là hỗn dịch của NaOH với muối tartrate của Na và K có công thức NaOOC-CHOH-CHOH- COOK (trong đó -OOC-CHOH-CHOH-COO- là gốc tartrate) [3]. 2.2.3. Phương pháp định tính bằng sắc ký lớp mỏng Định tính các nhóm chất bằng phương pháp TLC: Tiến hành thăm dò trên các hệ dung môi để chọn ra các hệ cho kết quả tách tốt nhất [11]. Mẫu nghiên cứu: Lá mơ lông được thu mua tại chợ Bưởi Hà Nội vào tháng 9 năm 2018. Dịch chấm sắc ký: chuẩn bị dịch chiết toàn phần (ngâm dược liệu trong EtOH rồi cô quay chân không lấy cao, thu được dịch chiết tổng). Hòa tan dịch chiết tổng vào MeOH, sau đó lọc, thu được dịch chấm sắc ký. Điều kiện sắc ký: - Pha tĩnh: Bản mỏng TLC Silicagel pha đảo GF254 (Merck), kích thước 3×10 cm đã hoạt hóa. - Pha động: Khảo sát các hệ dung môi sau: . Hệ 1: MeOH-H2O (2:1). . Hệ 2: MeOH-H2O (1:1). . Hệ 3: MeOH-H2O (1:2) Chấm mẫu: - Thể tích chấm: 5 µl. - Các vết chấm dài 0,8 cm, cách cạnh bên và cạnh dưới 1cm, chấm 3 vết cách nhau khoảng 1 cm. - Triển khai: Bão hòa cốc đựng dung môi triển khai trong 30 phút bằng 10 ml dung môi pha động. Đặt cốc ở nơi kín gió và đậy kín. Sau khi khai triển xong, lấy bản mỏng ra, để bay hơi hết dung môi trong tủ hút. - Phát hiện: Phun thuốc thử H2SO4, sấy khô và quan sát bản mỏng bằng mắt thường dưới ánh sáng tự nhiên. 16
25. 2.2.4. Phương pháp định tính bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC sử dụng hệ thống Agilent 1260 Series Infinity của Agilent Technologies, Hoa Kỳ với đầu dò DAD và bộ phận bơm mẫu tự động. Pha mẫu cao với các nồng độ lần lượt là: 20; 50; 100 mg/ml. Siêu âm trong vòng 10 phút, ly tâm với tốc độ 8000 vòng/phút, thu lấy dịch để chạy HPLC. Chương trình chạy sắc ký: Pha động: Acetonitril và acid acetic 0,05%. Bước sóng: 230 nm. Thể tích tiêm mẫu: 10 µl. Tốc độ dòng: 1 ml/phút. Thời gian chạy máy cho 1 mẫu: 60 phút. Sau khi thu được sắc ký đồ, dựa vào hình ảnh phổ UV của từng chất, ta có thể sơ bộ xác định chất đó thuốc nhóm hợp chất hữu cơ nào. 2.2.5. Phương pháp định lượng iridoid toàn phần Phương pháp đường chuẩn Pha dãy chất chuẩn iridoid với các nồng độ lần lượt là: 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,0625 mg/ml. Đo độ hấp thụ quang của các mẫu tại bước sóng 609 nm và lập đồ thị biểu thị sự phụ thuộc của A theo C [6,14]. Pha mẫu cao lá mơ với nồng độ 12,5; 25; 40 mg/ml. Đo độ hấp thụ quang của mẫu thử tại bước sóng 609 nm và dựa vào đường chuẩn đã dựng được, ta xác định được nồng độ iridoid có trong mẫu thử Cx [6,14]. Quá trình thực nghiệm sử dụng thuốc thử Trim – Hill (10 ml acid acetic + 1 ml CuSO4 0,2% + 0,5 ml HCl 1%) để đo độ hấp thụ quang [14]. 17
26. CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 3.1. Chiết xuất - Khối lượng dược liệu tươi: 2000 g. - Khối lượng dược liệu khô: 253,18 g. - Giá trị hàm ẩm của dược liệu khô: 10,81%. - Khối lượng cao thu được: 29,22 g. - Hiệu suất chiết: 12,94%. - Hiệu suất chiết được tính theo theo công thức: ∗100∗100 H= ∗(100− ) Trong đó: a: Khối lượng cao. b: Khối lượng dược liệu khô. x: Giá trị hàm ẩm (10,81%) 3.2. Phân tích định tính các nhóm chất hữu cơ có trong cao lá mơ 3.2.1. Kết quả phân tích định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học Sử dụng các phản ứng thông thường để định tính các nhóm chất hữu cơ được trình bày trong các tài liệu [2,4], được kết quả trình bày ở bảng 3.1. 18
27. Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp trong mẫu cao lá mơ bằng phản ứng hóa học STT Nhóm chất Phản ứng Kết quả Nhận xét 1 Iridoid Thuốc thử Trim -Hill ++ Có Phản ứng Cyanidin - 2 Flavonoid Tác dụng với FeCl3 - Không Tác dụng với kiềm - 3 Saponin Phản ứng tạo bọt - Không 4 Tanin Phản ứng với FeCl3 + Có 5 Steroid Phản ứng Libermann-Burchardt - Không 6 Tinh dầu Phản ứng với kiềm + Có 7 Đường khử Phản ứng với thuốc thử Fehling - Không 8 Terpennoid Phản ứng Salkowski ++ Có 9 Alkaloid Phản ứng với thuốc thử Mayer + Có 10 Anthraquinon Phản ứng với NaOH + Có Ghi chú: (-): phản ứng âm tính, (+): phản ứng dương tính, (++): phản ứng dương tính rõ. Nhận xét: Dựa vào phương pháp định tính bằng các phản ứng hóa học, ta có thể sơ bộ kết luận trong lá mơ lông có chứa các nhóm chất: Iridoid, tanin, tinh dầu, terpennoid, alkaloid, anthraquinon; không phát hiện sự có mặt của các nhóm chất: Flavonoid, saponin, steroid, đường khử. 19
28. 3.2.2. Kết quả phân tích định tính iridoid bằng sắc ký lớp mỏng Hình 3.1. Sắc ký đồ pha đảo của mẫu cao lá mơ với hệ dung môi MeOH-H2O ở các tỷ lệ lần lượt là 1:2 (A), 2:1 (B), 1:1 (C) Nhận xét: Dựa vào hình ảnh sắc ký đồ ở trên, ta chọn được hệ dung môi MeOH-H2O (1:2) cho kết quả tách các chất tốt nhất. Hình 3.2. Sắc ký đồ pha đảo của cao tổng với hệ dung môi MeOH-H2O (1:2) 20
29. Nhận xét: Sau khi phun thuốc thử H2SO4 rồi hơ nóng bản mỏng, thấy xuất hiện màu xanh dương và màu nâu, đặc trưng cho thành phần iridoid [4]. 3.2.3. Kết quả phân tích định tính bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Ta có hình ảnh sắc ký đồ HPLC của mẫu cao Hình 3.3. Sắc ký đồ HPLC của mẫu cao lá mơ Nhận xét: Hình ảnh sắc ký đồ cho tín hiệu rõ nét, các chất có trong mẫu cao được tách riêng rẽ. Hình ảnh này cho thấy tính đặc hiệu của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Ta có một số hình ảnh về phổ UV của từng chất: 21
30. Hình 3.4. Phổ UV của chất có thời gian lưu 6,099 phút Chất này hấp thụ tia UV cực đại ở bước sóng khoảng 325 nm, có thể sơ bộ xác định chất này thuộc nhóm chất flavonoid [4,13]. Hình 3.5. Phổ UV của chất có thời gian lưu 10,212 phút Chất này hấp thụ tia tử ngoại cực đại ở bước sóng khoảng 325 nm, có thể sơ bộ kết luận chất này thuộc nhóm chất flavonoid [4,13]. 22
31. Hình 3.6. Phổ UV của chất có thời gian lưu 11,146 phút Chất này hấp thụ tia UV cực đại ở bước sóng khoảng 325 nm, có thể sơ bộ kết luận chất này thuộc nhóm chất flavonoid [4,13]. Hình 3.7. Phổ UV của chất có thời gian lưu 15,039 phút Chất này hấp thụ tia UV cực đại ở bước sóng khoảng 235 nm, có thể sơ bộ kết luận chất này thuộc nhóm chất iridoid [4,19] 23
32. Hình 3.8. Phổ UV của chất có thời gian lưu 15,872 phút. Chất này hấp thụ tia UV cực đại ở bước sóng khoảng 260 nm, có thể sơ bộ xác định chất này thuộc nhóm chất anthraquinon [4]. Hình 3.9. Phổ UV của chất có thơi gian lưu 16,532 phút. Chất này hấp thụ tia UV cực đại ở bước sóng khoảng 265 nm, có thể sơ bộ xác định chất này thuộc nhóm chất anthraquinon [4]. 24
33. Hình 3.10. Phổ UV của chất có thời gian lưu 17,012 phút Chất này hấp thụ tia UV cực đại ở bước sóng khoảng 235 nm, có thể sơ bộ xác định chất này thuộc nhóm chất iridoid [4,19] Hình 3.11. Phổ UV của chất có thời gian lưu 18,539 phút Chất này hấp thụ tia UV cực đại ở bước sóng khoảng 330 nm, có thể sơ bộ xác định chất này thuộc nhóm chất flavonoid [4,13]. Nhận xét: Dựa vào phổ UV của các chất ứng với từng thời gian lưu, sơ bộ xác định được mẫu cao có chứa các chất thuộc các nhóm anthraquinon, flavonoid, iridoid. 3.3. Định lượng iridoid toàn phần có trong mẫu cao lá mơ Ta có kết quả dựng đường chuẩn của mẫu iridoid như bảng 3.2 và hình 3.11: 25
34. Bảng 3.2. Nồng độ và giá trị độ hấp thụ quang tương ứng của mẫu chuẩn iridoid Nồng độ 1 0,5 0,25 0,125 0,0625 (mg/ml) Giá trị A 0,76 0,37 0,196 0,09 0,04 Đồ thị đường chuẩn của iridoid 0.8 0.7 y = 0.7631x - 0.0045 R² = 0.9995 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 Độ hấp quang hấp Độ thụ 0.1 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Nồng độ (mg/ml) Hình 3.12. Đồ thi miêu tả tương quan tuyến tính giữa độ hấp thụ quang và nồng độ của mẫu chuẩn iridoid Ta có phương trình hồi quy tuyến tính của iridoid toàn phần giữa độ hấp thụ quang tại bước sóng 609 nm và nồng độ dung dịch là: y = 0,7631x – 0,0045 với hệ số R2 = 0,9995. Dựa vào mật độ quang đo được của mẫu thử và dữ liệu đường chuẩn ở trên, tính được nồng độ của iridoid trong mẫu thử và hàm lượng iridoid trong mẫu cao đặc, được kết quả trình bày ở Bảng 3.3. 26
35. Bảng 3.3. Hàm lượng iridoid trong mẫu cao tính được dựa vào độ hấp thụ quang của mẫu thử Nồng độ iridoid Hàm lượng iridoid Nồng độ mẫu thử Giá trị A trong mẫu thử trong mẫu cao (mg/ml) (Abs) (mg/ml) (%) 12,5 0,237 0,316 2,52 25 0,473 0,625 2,5 40 0,754 0,994 2,48 Hàm lượng iridoid trong mẫu cao được tính theo công thức: X = × 100 Trong đó: a: Nồng độ iridoid trong mẫu thử tính được dựa vào phương trình đường chuẩn. b: Nồng độ dung dịch mẫu thử X: Hàm lượng iridoid trong mẫu cao (%) Nhận xét: Như vậy hàm lượng iridoid trong mẫu cao lá mơ được xác định khoảng 2,5%. 3.4. Bàn luận 3.4.1. Về chiết xuất cao toàn phần từ mẫu lá mơ Từ mẫu lá mơ lông được thu mua tại chợ Bưởi, Hà Nội, đã tiến hành sấy khô và sử dụng phương pháp chiết lạnh để chiết xuất và cô lấy cao đặc. Mẫu được đem chiết 3 lần bằng cồn 80 độ, mỗi lần chiết trong vòng 1 ngày. Phương pháp này có ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện, thiết bị rẻ tiền tuy nhiên hiệu suất chiết chưa cao. Kết quả, từ 2000 g mẫu tươi, sấy khô thu được 253,18 g mẫu khô, đem chiết xuất và thu được 29,22 g cao đặc. Lượng cao đặc đạt tỉ lệ 11,54% so với lượng mẫu khô và hiệu suất chiết đạt 12,94%. 3.4.2. Về định tính mẫu cao lá mơ Khóa luận đã tiến hành định tính mẫu cao lá mơ dựa theo phương pháp hóa học được trình bày trong các tài liệu Dược liệu học và Thực tập dược liệu. Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản, dễ thực hiện, cho kết quả nhanh tuy nhiên kết quả của 27
36. phản ứng có thể bị ảnh hưởng bởi chất lượng hóa chất, độ nhạy của phản ứng cũng như thao tác thực nghiệm. Kết quả của phép định tính thống nhất với các tài liệu trong và ngoài nước về cây mơ tam thể khi chỉ ra sự có mặt của các nhóm chất iridoid, anthraquinon, alkaloid, terpennoid, tinh dầu. Nhóm cũng đã sử dụng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng để xác định sự có mặt của nhóm chất iridoid trong mẫu cao. Ngoài ra, nhóm nghiên cứu cũng đã tiến hành định tính mẫu cao bằng việc sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Kết quả cho thấy, ngoài các chất thuộc nhóm iridoid và anthraquinon, còn phát hiện được thêm các chất thuộc nhóm flavonoid. Đây là một phát hiện rất quan trọng nhưng cần phải có thêm những kỹ thuật khác để thẩm định tính chính xác của kết quả này. So với những nghiên cứu trước đây của PGS.TS Lê Ngọc Quang cùng cộng sự về cây mơ lông, việc sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định tính mẫu cao cũng là một điểm mới của đề tài khóa luận này. Tuy nhiên cần sử dụng thêm các chất chuẩn vào phương pháp này để định tính cũng như định lượng các chất cụ thể có trong mẫu cao. 3.4.3. Về định lượng iridoid toàn phần Về định lượng, nhóm đã sử dụng phương pháp đường chuẩn để định lượng iridoid toàn phần trong mẫu cao lá mơ. Đây cũng là một điểm mới của đề tài. Trước đó, ở Việt Nam vẫn chưa có nghiên cứu nào đi vào định lượng các thành phần hóa học có trong cây mơ lông. Phương pháp này được thực hiện khá nhanh và đơn giản nhưng kết quả cũng bị ảnh hưởng bởi thao tác thực nghiệm và tính chính xác của máy đo độ hấp thụ quang. Hàm lượng iridoid trong mẫu cao được xác định khoảng 2,5%. Để định lượng chính xác hàm lượng của nhóm chất iridoid có trong mẫu lá mơ lông, cần phải tách và sử dụng chất chuẩn để định lượng được hàm lượng của từng chất riêng biệt trong nhóm chất này. 28
37. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua thời gian nghiên cứu đề tài, nhóm nghiên cứu đã thu được một số kết quả phù hợp với mục đích nghiên cứu ban đầu như sau: Đã thu mẫu lá mơ lông và sử dụng phương pháp chiết lạnh để tiến hành chiết xuất mẫu khô và thu lấy cao đặc. Kết quả từ 2000 g mẫu tươi, thu được 253,18 g mẫu khô và 22,29 g cao đặc. Lượng cao đặc chiếm 11,54% so với lượng mẫu khô và hiệu suất chiết đạt 12,94%. Đã định tính được sơ bộ các nhóm chất có trong cây mơ lông bằng việc sử dụng các phản ứng hóa học, kỹ thuật sắc ký lớp mỏng. Kết quả của phép định tính phù hợp với các tài liệu tham khảo nói về cây mơ tam thể khi chỉ ra sự có mặt của các nhóm chất chất iridoid, anthraquinon, alkaloid, terpennoid, tinh dầu. Ngoài ra còn phát hiện thêm sự có mặt của nhóm chất flavonoid khi định tính bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao. Đã định lượng được hàm lượng iridoid toàn phần có trong cây mơ lông bằng phương pháp đường chuẩn. Kết quả, hàm lượng iridoid trong mẫu cao được xác định khoảng 2,5%. Tuy nhiên, do điều kiện thời gian thực hiện nghiên cứu còn ngắn, phương pháp nghiên cứu còn tương đối đơn giản, thao tác thực nghiệm đôi khi chưa thật chuẩn xác cùng một số yếu tố khách quan khác, kết quả nghiên cứu vẫn còn một số hạn chế nhất định. Có thể kể đến như: Do sử dụng phương pháp chiết xuất đơn giản nên hiệu suất chiết chưa cao. Các phép định tính mới chỉ phát hiện được các nhóm chất chung chứ chưa đưa ra được các chất cụ thể. Đã phát hiện và định lượng được hàm lượng iridoid toàn phần có trong mẫu cao nhưng chưa tách cũng như định lượng được các chất cụ thể trong nhóm chất này. Kiến nghị Trên đây là những kết quả nghiên cứu đầu tiên trong nội dung nghiên cứu thành phần hóa học của cây mơ tam thể. Ngoài những kết quả đã có được, nghiên cứu vẫn còn khá nhiều hạn chế. Để khắc phục những hạn chế này, đề tài cần tiếp tục: Tiếp tục nghiên cứu tối ưu quy trình chiết hoặc sử dụng phương pháp chiết khác nhằm nâng cao hiệu suất chiết. 29
38. Tiến hành chiết xuất phân đoạn mẫu cao toàn phần đã có được với các dung môi như ethyl acetat, butanol, n-hexan để nghiên cứu cụ thể hơn các thành phần hóa học của mẫu. Sử dụng kỹ thuật sắc ký cột, sắc ký khối phổ để tiến hành phân lập ra các hợp chất tinh khiết. Sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để định lượng một số chất cụ thể thuộc nhóm chất iridoid có mẫu lá mơ. Xây dựng một số mô hình sinh học để đánh giá thêm về tác dụng dược lý của lá mơ lông. 30
39. TÀI LIỆU THAM KHẢO A. Tài liệu tiếng Việt 1. Nguyễn Tiến Bân chủ biên (2003), Danh mục các loài thực vật Việt Nam, Tập II, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 1063-1093. 2. Bộ môn Dược liệu (2010), Thực tập Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội. 3. Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Hà Nội. 4. Bộ Y tế (2011), Dược liệu học, tập 1 và 2, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 5. Bộ Y tế, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2007), Đảm bảo chất lượng thuốc và một số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, tr. 107 – 113, tr. 216-250. 6. Bộ Y tế, Vụ khoa học và đào tạo (2005), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản Y học, tr. 75-76. 7. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hoá học cây thuốc, Nhà xuất bản Y học, tr. 8-99, 162-196, 234-242. 8. Trần Ngọc Ninh (1987), “Góp phần vào việc thống kê những loài thực vật có ích thuộc họ cà phê (Rubiaceae Juss) ở Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, 9(2), 40- 44. 9. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập chất hữu cơ, Nhà xuất bản ĐHQG TP HCM, tr. 151-451. 10. Trần Nhật Phương (2008), Học phần kỹ thuật Công Nghệ Sinh Học Proteomic- Sắc ký, tr. 12. 11. Trường Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn hoá phân tích (2006), Hoá phân tích II, tr. 17, 99-146, tr. 173-222. 12. Viện Dược liệu (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, tr. 199 – 222; 493 – 685. B. Tài liệu tiếng Anh 13. Ann E. Stapleton, Virginia Walbot (2008), “Flavonoids Can Protect Maize DNA from the Induction of Ultraviolet Radiation Damage”, Plant Physiology, 105(3), 881-889. 14. Brison Guiide, Ch. Erdenechimeg, B. Dejidmaa (2017), “Total phenolic, flavonoid, alkaloid and iridoid content and preventive effect of Lider-7-tang on lipopolysaccsaride-induced acute lung injury in rats”, Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 50, 591-595.
40. 15. Dang Ngoc Quang and Le Huy Nguyen (2009), “Anthraquinones andcumarin from the roots of Paederia scandens”, Journal of Chemistry(Vietnam), 47, 428. 16. Dang Ngoc Quang (2009), “Anthraquinones from the roots of Paederiascandens”, Journal of Chemistry (Vietnam), 47, 95-98. 17. Dang Ngoc Quang, Toshihiro Hashimoto, Masami Tanaka, NguyenXuan Dung, Yoshinori Asakawa (2002), “Iridoid glucosides from roots of Vietnamese Paederia scandens”, Phytochemistry, 60, 505-514. 18. Goevarts R, M Ruhsam, L Andersson, E Robbrecht, D Bridson, A Davis, I Schanzer, B Sonke (2006), “World checklist of Rubiaceae”, Royal Botanic Gardens, 25(3), 52-55. 19. Jefferson Rocha de Andrade, Ana Claudia Fernandes (2007), “Quantitative determination by HPLC of iridoids in the bark and latex of Himatanthus sucuuba”, ACTA AMAZONICA, 37, 119-122. 20. Inouye H., Shimokawa, N. and Okigawa, M., (1969), “Studieson monoterpene glucosides”, Chemical Pharmaceutical Bulletin, 17, 1942-1948. 21. Inouye, H., Okigawa, M. and Shimokawa (1969), “Studies on monoterpeneglucosides - Artefacts formed during extraction of asperuloside andpaederoside” Chemical Pharmaceutical Bulletin, 17, 1949-1954. 22. Inouye, Saito, S., Taguchi, H. and Endo (1969), “Zwei neueiridoidglucoside aus gardenia jasminoides: gardenosid und geniposid” Tetrahedron Letters, 28, 2347-2350. 23. Kapadia G., Shukla, Y. N., Bose, A. K., Fujiwara, H. and Lloyd, H.A (1979), “Revised structure of paederoside, a novel monoterpene Smethyl thiocarbonate”, Tetrahedron Letters, 22, 1937-1938. 24. Rajesh Kumar Soni, Raghuveer Irchhaiya, Vihangesh Dixit (2017), “Paederia foetida linn: phytochemistry, pharmacological and traditional uses”, Interational journal of pharmaceutical sciences and research, 4, 4525-4530. 25. Sasidharan S, Chen Y, Saravanan D, Sundram KM, Latha Y (2011), “Extraction, isolation and characterization of bioactive compounds from plants extracts”, Afr J Tradit Complement Altern Med, 8, 1-10. 26. Shukla Y., Lloyd, H. A., Morton, J. F. and Kapadia, G. J. (1976) “Iridoid glucosides and other constituents of Paederia foetida”, Phytochemistry, 1989. 27. Takhtajan A.L (1997), “Diversity and Classification of Flowering Plants, Columbia University Press”, New York, USA.