›

Khóa luận Bước đầu khảo sát quy trình chiết xuất cao giàu alcaloid từ vỏ cây thừng mực lá to (Holarrhena antidysenterica (L.) Wall.)

pdf 45 trang thiennha21 18/04/2022 2690
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Bước đầu khảo sát quy trình chiết xuất cao giàu alcaloid từ vỏ cây thừng mực lá to (Holarrhena antidysenterica (L.) Wall.)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_buoc_dau_khao_sat_quy_trinh_chiet_xuat_cao_giau_al.pdf

Nội dung text: Khóa luận Bước đầu khảo sát quy trình chiết xuất cao giàu alcaloid từ vỏ cây thừng mực lá to (Holarrhena antidysenterica (L.) Wall.)

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC  TRẦN NGỌC ÁNH BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO GIÀU ALCALOID TỪ VỎ CÂY THỪNG MỰC LÁ TO (Holarrhena antidysenterica (L.) Wall.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2021
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC  TRẦN NGỌC ÁNH BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO GIÀU ALCALOID TỪ VỎ CÂY THỪNG MỰC LÁ TO (Holarrhena antidysenterica (L.) Wall.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: QH2016.Y NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. NGUYỄN VĂN TÀI ThS. LÊ ANH TUẤN HÀ NỘI - 2021
  3. LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thành tại khoa Hóa Thực vật - Viện Dược liệu Trung Ương. Với tấm lòng biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Trường Đại Học Y Dược - Đại Học Quốc Gia Hà Nội và Viện Dược liệu đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho em được thực hiện khóa luận tại đây. Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến TS. Nguyễn Văn Tài và ThS. Lê Anh Tuấn đã định hướng, quan tâm giúp đỡ em hoàn thành đề tài này. Đồng thời em cũng chân thành cảm ơn TS. Lê Thành Nghị, CN. Phùng Như Hoa và tất cả các thầy cô, anh chị và các bạn ở Khoa Hóa Thực Vật - Viện Dược liệu đã tận tình giúp đỡ, động viên, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu trong quá trình xây dựng, triển khai các bước và phân tích kết quả trong suốt quá trình em thực hiện đề tài tại đơn vị. Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt 5 năm theo học tại trường. Những kiến thức này không chỉ giúp em có kiến thức hoàn thành khóa luận mà còn là hành trang cho em vững bước trong chặng đường tương lai. Cuối cùng em xin gửi lời biết ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn động viên khích lệ em trong học tập và cuộc sống. Em xin chân thành cảm cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2021 Sinh viên Trần Ngọc Ánh
  4. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng Anh Diễn giải ACN Acetonitril Acetonitril oC Độ Celcius DM/DL Dung môi : dược liệu EtOAc Ethyl Acetat Ethyl Acetat EtOH Ethanol Ethanol MeOH Methanol Methanol HPLC High Perfomance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography SKĐ Sắc kí đồ tt:tt Thể tích : thể tích kl:tt Thin layer chromatography Khối lượng : thể tích TLC Sắ c ký lớ p mỏng TLTK Tài liệu tham khảo
  5. MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan về Thừng mực lá to 2 1.1.1. Tổng quan về thực vật học 2 1.1.1.1. Vị trí phân loại 2 1.1.1.2. Phân bố 2 1.1.2. Thành phần hóa học của Thừng mực lá to 3 1.1.2.1. Alcaloid 4 1.1.2.2. Chất nhựa 5 1.1.2.3. Chất gôm 5 1.1.2.4. Các chất vô cơ 5 1.1.3. Tác dụng dược lý của Thừng mực lá to 6 1.1.3.1. Tác dụng chống tiêu chảy 6 1.1.3.2. Tác dụng kháng khuẩn 6 1.1.3.3. Tác dụng điều trị tiểu đường 6 1.1.3.4. Tác dụng khác 7 1.1.4 Một số sản phẩm của Thừng mực lá to 7 1.2. Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế, định tính, định lượng Conessin từ dược liệu 8 1.2.1. Chiết xuất alcaloid toàn phần từ vỏ thân cây Thừng mực lá to 8 1.2.2. Phân lập Conessin từ alcaloid toàn phần 9 1.2.3. Một số phương pháp định tính, định lượng Conessin 10 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1. Đối tượng, nguyên liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 12 2.1.1. Đối tượng 12 2.1.2. Nguyên vật liệu, dụng cụ, thiết bị 12 2.1.3. Hóa chất, dung môi 12
  6. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 13 2.2.1. Khảo sát quy trình chiết xuất, làm giàu alcaloid từ vỏ cây Thừng mực lá to. 13 2.2.1.1. Khảo sát quy trình chiết xuất cao tổng. 13 2.2.1.2. Khảo sát quy trình làm giàu alcaloid từ cao tổng 15 2.2.2. Định lượng alcaloid bằng phương pháp HPLC. 15 2.2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng alcaloid và xác định tạp chất bằng phương pháp HPLC 15 2.2.2.2. Thẩm định phương pháp phân tích 16 2.2.2.3. Xây dựng đường chuẩn và công thức 16 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 17 3.1. Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 17 3.2. Khảo sát phương pháp chiết và số lần chiết 20 3.3. Khảo sát loại dung môi chiết 23 3.4. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ DM/DL 28 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO
  7. DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực lá to với dược liệu không làm ẩm bằng NH3 19 Bảng 2. Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực lá to với dược liệu có làm ẩm bằng NH3 19 Bảng 3. Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực lá to (PP1). 21 Bảng 4. Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực lá to (PP2) 22 Bảng 5. Phần trăm khối lượng cao tổng 23 Bảng 6. Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực lá to với phương pháp chiết PPA 25 Bảng 7. Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực lá to với phương pháp chiết PPB 26 Bảng 8. Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực lá to với phương pháp chiết PPC 26 Bảng 9. Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực lá to với phương pháp chiết PPD 27 Bảng 10. So sánh hiệu suất trung bình chiết xuất cao tổng của 4 phương pháp 27 Bảng 11. Hiệu suất chiết với tỷ lệ MD/DL: 30/1; 24/1; 24/1 30 Bảng 12. Hiệu suất chiết với tỷ lệ MD/DL: 10/1; 8/1; 8/1 31 Bảng 13. Hiệu suất chiết với tỷ lệ MD/DL: 7/; 5/1; 5/1 31 Bảng 14. So sánh hiệu suất chiết của 3 tỷ lệ MD/DL 31
  8. DANH MỤC HÌNH Hình 1. Ảnh cây Thừng mực lá to lúc ra hoa. 3 Hình 2. Ảnh cành mang hoa của cây Thừng mực lá to. 3 Hình 3. Conessin 4 Hình 4. Isoconessimin 4 Hình 5. Holadysenterin 5 Hình 6. Kurchessin 5 Hình 7. Sản phẩm chứa cao vỏ thân Thừng mực lá to 7 Hình 8. Ảnh TLC so sánh alcaloid từ dịch chiết MeOH và chất chuẩn Conessin 17 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1. Sơ đồ chiết xuất cao tổng . 33
  9. MỞ ĐẦU Với vị trí địa lý gần vành đai nhiệt đới, Việt Nam có hệ sinh thái thực vật phong phú. Theo một số tài liệu nghiên cứu: nước ta có 12.000 loài thực vật bậc cao thuộc hơn 2.500 chi và 300 họ. Trong đó có hơn 4.000 loài thực vật được sử dụng làm thuốc chữa bệnh [1]. Trải qua hàng ngàn năm tồn tại và phát triển của loài người. Nhân dân Việt Nam cũng như nhân dân nhiều nước khác nhau trên thế giới đã tích lũy, lưu truyền những kinh nghiệm phòng, chữa bệnh bằng cây cỏ. Tuy nhiên những bài thuốc này phần lớn còn phụ thuộc vào kinh nghiệm dân gian mà chưa được nghiên cứu kỹ để có cơ sở khoa học trong việc sử dụng chúng. Xu hướng sử dụng thuốc có nguồn gốc thảo dược ngày càng tăng ở Việt Nam và các nước khác trên thế giới. Hướng nghiên cứu tìm ra các hợp chất, làm giàu các hợp chất có hoạt tính sinh học từ dược liệu được nhiều nhà khoa học quan tâm. Cây Thừng mực lá to mọc hoang ven triền núi nhiều nơi ở nước ta và một số nước trong khu vực Đông Nam Á. Từ lâu đã được nhân dân sử dụng vỏ cây để chữa lỵ amip. Tuy nhiên, các sản phẩm từ dược liệu thường có chất lượng không ổn định. Vì vậy nên việc điều chế ra cao chiết có chất lượng đảm bảo và đánh giá hàm lượng hoạt chất trong cao là rất cần thiết để bào chế các thuốc có hiệu quả. Với mong muốn góp phần xác định hàm lượng thành phần hợp chất alcaloid trong vỏ thân Thừng mực lá to và kiểm soát được chất lượng sản phẩm chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Bước đầu khảo sát nghiên cứu quy trình chiết xuất cao giàu alcaloid từ vỏ cây Thừng mực lá to’’ với mục tiêu: - Xây dựng được quy trình chiết xuất cao giàu alcaloid từ vỏ cây Thừng mực lá to. - Xác định được hàm lượng alcaloid trong cao. 1
  10. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về Thừng mực lá to 1.1.1. Tổng quan về thực vật học 1.1.1.1. Vị trí phân loại Tên khoa học: Holarrhena antidysenterica (L.) Wall., thuộc họ Trúc đào - Apocynaceae. Tên thông thường: Thừng mực lá to Tên khác: Mức hoa trắng, Mộc hoa trắng, Sừng trâu, Mộc vài (Tày), Xi chào (K’ Ho), Hồ liên. Tên nước ngoài: Coneru (Anh), Vatsaka (Sanskrit) [21] 1.1.1.2. Phân bố Thừng mực lá to phân bố rải ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của Châu Á và Châu Phi. Cây được tìm thấy ở Myanmar, Malaysia, Nam Trung Quốc, Việt Nam, Srilanka, Pakistan, Nepal Ở nước ta Thừng mực lá to mọc hoang ở các tỉnh miền núi và trung du như Cao Bằng, Bắc Giang, Yên Bái, Lạng Sơn, Hòa Bình, Gia Lai, Kon Tum, nhưng tập trung nhiều nhất ở Đắk Lắk và Nghệ An [3,4,7,8,10]. 1.1.1.3. Đặc điểm thực vật Thừng mực lá to là cây thân gỗ, có chiều cao lên đến 13m và chu vi thân lên đến 1,1m. Cành non hơi dẹt, nhẵn bóng. Cành già tròn nhẵn, màu nâu nhạt, có nốt sần nhỏ màu trắng. Lá mọc đối xứng, có cuống ngắn, không có lá mọc kèm, hình bầu dục đầu tù hay nhọn, đáy lá tròn hoặc nhọn, dài 12 - 15 cm, rộng 4 - 8 cm, mặt lá bóng, màu xanh lục nhạt, mặt dưới có lông nhỏ rất mịn và gân nổi rõ. Hoa màu trắng, rất thơm, mọc ở kẽ lá hay đầu cành, dài 5 -10 cm; đài 5 răng, có lông ở lưng; tràng 5 cánh tròn đầu, ống tràng dài 1 cm, hơi thắt ở họng, nhị 5 đính gần phía gốc ống tràng, chỉ nhị có lông, bao phấn hẹp, vòi nhụy hơi dày. 2
  11. Quả đại, mọc từng đôi thành cung trông như sừng trâu. Mỗi đài màu nâu có vân dọc, dài 15 – 30 cm, rộng 5 - 7 mm. Hạt nhiều, dài 1 - 2 cm, rộng 0,2 - 0,25 cm, màu nâu nhạt, đầu hơi dẹp, lõm một mặt. Lá gấp nếp nhiều lần, toàn cây có nhựa mủ trắng. Mùa hoa nở: tháng 3 -7, Mùa quả: tháng 6 - 12. Hình 1: Ảnh cây Thừng mực lá to lúc ra hoa Hình 2: Ảnh cành mang hoa của Thừng mực lá to 1.1.2. Thành phần hóa học của cây Thừng mực lá to Vỏ Thường mực lá to chứa alcaloid 0,4%, gôm 9,56%, nhựa 0,2%, tanin 1,14%. [7,10] Hạt Thường mực lá to chứa alcaloid 0,025%, dầu 36 - 40%, chất nhựa, tanin. [3,10] 3
  12. Lá, vỏ, hạt, vỏ thân Thường mực lá to đều chứa alcaloid. Vỏ chứa 2,82 - 3,217% alcaloid toàn phần, lá chứa 0,60% alcaloid toàn phần. [11] 1.1.2.1. Alcaloid Từ vỏ cây Thừng mực lá to người ta đã chiết xuất được các alcaloid sau: [7,10,16,19]. - Conessine C24H40N2 - Isoconessimin C23H38N2 - Holadysenterin C23H38N2O3 - Kurchessin C25H44N2 v. v Trong đó, alcaloid chủ yếu là Conessine. Chất Conessine có tinh thể 0 0 hình lăng trụ (Kết tinh trong aceton) điểm chảy 125 , [α]D = -1,9 (trong 0 CHCl3) hoặc 21 6 (trong C2H5OH). Muối chlohydrat, bromhydrat và oxalat của conessin tồn tại dưới dạng tinh thể [9,10,19]. Hình 3: Conessin [10] Hình 4: Isoconessimin [10] 4
  13. Hình 5: Holadysenterin [10] Hình 6: Kurchessin [10] 1.1.2.2. Chất nhựa [10]. Thành phần chất nhựa trong cây Thừng mực lá to gồm có: chất nhựa mủ (nước và chất tan trong nước) chiếm (57,91%), chất cao su chiếm (1,5- 9,7%), chất tủa keo cao su chiếm (15-22,8%), chất nhựa chiếm (74,1- 82,8%), các chất không tan khác chiếm (0,9-5,9%) Hai chất alcol nhựa (resinol) được tách từ nhựa mủ là: 0 - Lettoresinol A (C28H50O5): độ chảy 227- 228 C. 0 - Lettoresinol B (C28H56O2): độ chảy 136 -137 C. Các chất nhựa khác được tìm thấy trong nhựa mủ: trierpen alcol, lupcol và β-sitosterol. 1.1.2.3. Chất gôm [7,10]. Chất gôm được tìm thấy trong Thừng mực lá to có màu nâu, vị đắng, tỷ trọng 1,092, chỉ số acid 65,28, chỉ số ester 106, chỉ số xà phòng 171,42 và chỉ số acetyl là 150,52. 1.1.2.4. Các chất vô cơ [10]. Thành phần các chất vô cơ trong mẫu tro từ gỗ cây Thừng mực lá to gồm các chất sau: K2CO3 (10,82%), KCl (4,2%), K2SO4 (2,48%) và chất tro không tan chiếm 80,24%. 5
  14. 1.1.3. Tác dụng dược lý của Thừng mực lá to 1.1.3.1. Tác dụng chống tiêu chảy Conessin là có tác dụng diệt amip, có tác dụng cả đối với kén và amip. Thí nghiệm ngoài cơ thể nồng độ có hiệu quả đối với Entamoeba histolytica của conesssin là: 1:71000 - 1:45000. Trên lâm sàng, người ta dùng conessin chlohydrat hay bromhydrat chữa lỵ amip. Conessin có tác dụng diệt cả Trichomonas vaginalis và Trichomonas intestinalis. [7,10,21] 1.1.3.2. Tác dụng kháng khuẩn Đối với hoạt tính kháng khuẩn, nghiên cứu quan sát vùng ức chế sự tăng trưởng (tính bằng mm) trên 3 loại vi khuẩn (Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium và Escherchia coli). Dịch chiết từ vỏ cây Thừng mực lá to cho kết quả vùng ức chế 10,05 mm cho thấy hoạt tính kháng khuẩn cao nhất đối với Staphylococcus trong khi đối với Salmonella và E.coli, vùng ức chế chỉ tương ứng là 6,65 mm và 2,7 mm Dịch chiết từ hạt Thừng mực lá to với nồng độ 100% cũng cho thấy hoạt tính kháng khuẩn chống lại Staphylococcus. Dịch chiết từ lá với nồng độ 100% cho thấy vùng ức chế đối với Staphylococcus là 4 mm, vùng ức chế đối với E.coli là 3,1 mm. Kết quả thu được trong nghiên cứu cho thấy dịch chiết (lá, vỏ thân, hạt) của Thừng mực lá to có hoạt tính kháng khuẩn tiềm năng chống lại Staphylococcus, Salmonella và E. coli [13,21] 1.1.3.3. Tác dụng điều trị tiểu đường Dịch chiết ethanol từ hạt Thừng mực lá to có tác dụng làm giảm mức đường huyết đáng kể sau ½ giờ khi dùng ở chuột tăng huyết áp. Những con chuột mắc bệnh tiểu đường cho thấy trọng lượng cơ thể giảm trong thời gian thử nghiệm điều trị bằng dịch chiết ethanol từ hạt Thừng mực lá to. Nhóm chuột bị tiểu đường được điều trị bằng glibenclamide cho thấy trọng lượng tăng lên đáng kể. Mức đường huyết giảm ở nhóm được điều trị bằng dịch chiết Thừng mực lá to làm giảm cholesterol toàn phần, triglycerid, AST, 6
  15. ALT, urê và creatinin huyết thanh [23] Dịch chiết methanol cũng cho kết quả tương tự ở chuột mắc bệnh tiểu đường. [21] 1.1.3.4. Tác dụng khác Ngoài ra alcaloid chiết xuất từ Thừng mực lá to còn có các tác dụng sau: tác dụng chống ung thư, hoạt động bảo vệ thần kinh, hoạt động chống chứng hay quên, tác dụng hạ huyết áp, làm chậm nhịp tim, chống co thắt [7,10,21]. 1.1.4. Một số sản phẩm chứa cao vỏ thân Thừng mực lá to - Viên nén Holanin: Viện Dược liệu - Viên Hipolten: công ty cổ phần dược vật tư y tế Hải Dương - Viên nang Mộc Hoa Trắng: công ty cổ phần dược phẩm Hà Nội - Viên nén bao phim Mộc Hoa Trắng HT: công ty dược phẩm và thiết bị Y tế Hà Tĩnh. Hình 7: Sản phẩm chứa cao vỏ thân Thừng mực lá to 7
  16. 1.2. Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế, định tính, định lượng Conessin từ dược liệu 1.2.1. Chiết xuất alcaloid toàn phần từ vỏ thân cây Thừng mực lá to - Conessin là một alcaloid, theo nguyên tắc có thể sử dụng một trong hai phương pháp sau: A. Chiết bằng acid loãng trong cồn hoặc nước [2]. B. Chiết bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm [2,22]. - Kumar N. và cộng sự [19] đã chiết xuất alcaloid toàn phần từ vỏ thân cây Holarrhena antidysenterica ở Pragpur, Ấn Độ theo qui trình như sau: 1kg vỏ thân cây được sấy, nghiền mịn sau đó chiết bằng dung môi MeOH 5x2500ml, điều kiện nhiệt độ phòng. Gộp dịch, cô quay thu hồi dung môi, thu được 307,8g dịch chiết tổng MeOH. Sau đó chiết dịch chiết tổng với HCl 3M 3x200ml bằng phương pháp ngâm lạnh trong thời gian 24 giờ. Tiếp theo gộp dịch chiết acid, chiết tiếp bằng dung môi CHCl3 4x400ml để loại tạp. Kiềm hóa dịch chiết bằng NH4OH 30% đến pH 8,5. Chiết tiếp dịch chiết đã kiềm hóa bằng CHCl3 5x400ml. Gộp dịch chiết, cô quay thu hồi dung môi, thu được 11,9 g cắn alcaloid toàn phần (hiệu suất chiết đạt 1,19%). - Phí Tùng Lâm [6] đã chiết xuất alcaloid toàn phần trong vỏ thân cây Thừng mực lá to thu hái ở Hải Dương theo qui trình như sau: cân 50g dược liệu, làm ẩm bằng NH4OH trong vòng 12 giờ, sau đó chiết Soxhlet bằng với dung môi cloroform đến kiệt alcaloid. Gộp dịch, cô quay thu hồi dung môi thu được 0,471g cắn alcaloid base (hiệu suất chiết đạt 0,942%). - Chakraborty A. và cộng sự [14] chiết alcaloid toàn phần trong vỏ thân cây Holarrhena pubescens bằng dung môi MeOH, qui trình không được nêu cụ thể. 8
  17. Bàn luận: Cả 3 phương pháp chiết nêu trên hiệu suất chiết còn thấp và thay đổi khác nhau tùy phương pháp. Đặc biệt qui trình chiết không được nêu rõ cụ thể. Vì vậy chúng tôi mong muốn xây dựng qui trình chiết xuất alcaloid tổng số với hiệu suất cao hơn, quy trình cụ thể hơn. Một mặt khác, quy trình khảo sát được cần đảm bảo các yêu cầu về tính khả thi, an toàn và kinh tế khi nâng cấp và triển khai ứng dụng. 1.2.2. Phân lập Conessin từ alcaloid toàn phần - Kumar N. [19] phân lập Conessin từ cắn alcaloid toàn phần ở trên bằng sắc kí cột theo qui trình sau: Sử cột có pha tĩnh là alumina, pha động là hỗn hợp benzen dầu hỏa (60 - 80 0C) : EtOAc với tỉ lệ EtOAc tăng dần. Nạp vào cột 11,9g cắn alcaloid tiến hành sắc kí. Kiểm tra các phân đoạn bằng TLC. Phân đoạn từ ống 19 - 23, có tỉ lệ dung môi là benzen dầu hỏa : EtOAc (95 : 5) cho 1 vết trên SKĐ, được xác định là Conessin - Phạm Thanh Kỳ và cộng sự [8] phân lập Conessin và Norconessin trong alaloid toàn phần chiết xuất từ vỏ thân cây Thừng mực lá to bằng sắc kí cột theo qui trình sau: Sử dụng cột sắc kí kích thước 2 cm x 50 cm, lắp thẳng đứng trên giá. Nhồi cột bằng silica gel đã được ngâm trong cloroform. Cuối cùng đặt một lớp bông mỏng trên miếng giấy lọc. Mở khóa cho dung môi chảy nhiều lần, ổn định cột trong thời gian 12 giờ. Khi cột đã ổn định, tiến hành sắc kí. Mở khóa cột đến khi cloroform vừa đến bề mặt của bông thì khóa cột. Hòa tan 0,471g cắn alcaloid toàn phần trong lượng tối thiểu cloroform vào cốc mỏ. Đổ từ từ dịch cloroform vào cột. Pha động là hỗn hợp cloroform và methanol có độ phân cực tăng dần: i) CHCl3 (99,5 ml) : MeOH (0,5 ml), ii) CHCl3 (99 ml) : MeOH (1 ml), iii) CHCl3 (98,5 ml) : MeOH (1,5 ml), iiii) CHCl3 (98 ml) : MeOH (2,0 ml). Hứng dịch rửa giải vào các ống nghiệm, mỗi ống 2 ml. Kiểm tra dịch rửa giải bằng TLC, thu được các phân đoạn tinh khiết chỉ cho 1 vết trên SKĐ, từ ống 33 - 36 được xác định là Conessin, từ ống 85 - 98 được xác định là Norconessin. 9
  18. Bàn luận: Hai qui trình phân lập, làm giàu alcaloid trên sử dụng hệ dung môi rửa giải độc hại, chi phí cao do đó rất khó để áp dụng trong quy mô sản xuất lớn. Vì vậy chúng tôi muốn xây dựng qui trình làm giàu alcaloid với hệ dung môi phù hợp trong sản xuất công nghiệp mà vẫn đảm bảo hiệu suất cao. 1.2.3. Một số phương pháp định tính, định lượng Conessin - Định tính và định lượng Conessin trong dịch chiết dược liệu bằng GC [17]: Sử dụng máy sắc kí Shimadzu GC-8A, detector FID, cột nhồi silica gel WHP 100 - 120 mesh, pha động là khí N2 30 mL/phút, phân tách ở 250 0C, thời gian lưu Rt = 11,5 phút, khoảng tuyến tính 0,08 - 0,2% kl/tt (trong MeOH). - Định tính và định lượng Conessin trong dịch chiết dược liệu bằng HPTLC [17]: Sử dụng máy sắc kí Chromoscan 200 với pha động ethyl acetat : hexan : diethylamin (75 : 25 : 5), được phát hiện vết bằng thuốc thử Dragendorff, sau đó phun dung dịch NaNO2 10% kl/tt để cho độ nhạy tốt nhất, Rf = 0,66, khoảng tuyến tính 0,01 - 0,1% kl/tt (pha trong dung dịch chuẩn nội), đo độ hấp thụ ở bước sóng 520 nm. - Định tính và định lượng Conessin trong dịch chiết dược liệu và chế phẩm bằng HPTLC [18]: Sử dụng máy sắc kí Camag TLC Scanner III với pha động Toluen : ethyl acetat : diethylamine (6,5 : 2,5 : 1, tt/tt/tt), điều kiện nhiệt độ phòng (25 ± 2 0C), được phát hiện vết bằng thuốc thử Dragendorff, Rf = 0,82, với khoảng tuyến tính 1- 10 µg/vết, đo độ hấp thụ ở bước sóng 520 nm. - Định tính và định lượng Conessin trong dịch chiết dược liệu bằng HPTLC [120]: Sử dụng máy sắc kí Camag Linomat I với pha động benzen : ethyl acetat : diethylamin (6 : 3 : 1), khoảng cách khai triển 90 mm, thời gian khai triển 20 phút, điều kiện nhiệt độ phòng (25 ± 2 0C), được phát hiện vết bằng thuốc thử Dragendorff, bước sóng phát hiện 254 nm. 10
  19. - Định lượng Conessin trong chế phẩm bằng HPLC [15]: Sử dụng máy sắc kí Waters (Milford, MA, USA), cột C18 (kích thước 250 x 4,6 mm x 5 µm), với pha động Methanol : nước (95 : 5), tốc độ dòng 0,8 ml/phút, detector chỉ số khúc xạ. - Định lượng Conessin trong chế phẩm bằng HPLC- MS [21]: Sử dụng myáy sắc kí Waters HPLC-MS với pha động Acetonitril : nước (cả hai dung môi đều chứa acid acetic 0,1%), tốc độ dòng 1,0 ml/phút, detector ZQ, máy khối phổ LCQ. Bàn luận: Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kĩ thuật tách chất hiện đại và đa năng. Đây là phương pháp có nhiều ưu điểm như độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy bởi nhiệt. Do đó chúng tôi muốn hướng đến xây dựng qui trình định lượng bằng phương pháp HPLC với điều kiện trong phòng thí nghiệm hiện có. 11
  20. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, nguyên liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng Mẫu vỏ thân cây Thừng mực lá to được thu hái và giám định tên khoa học là Hollarena antidysenterica (L.) Wall. bởi khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu. Mẫu thực vật được phơi khô, thái lát, nghiền nhỏ trước khi đem chiết. 2.1.2. Nguyên vật liệu, dụng cụ, thiết bị - Cột thủy tinh kích thước: 2,5 cm x 30 cm; 4,5 cm x 30 cm; 4,5 cm x 50 cm; 9,3 cm x 50 cm. - Sắc ký cột: sử dụng chất hấp phụ là Silicagel Merck cỡ hạt 40-63 µm để phân lập từng phân đoạn có chứa các chất cần thiết. - Sắc ký lớp mỏng (SKLM/TLC): TLC sử dụng bản mỏng pha thuận tráng sẵn DC - Alufolien 60 F254 (Merck), các vết chất hiện màu với thuốc thử Dragendorff - Bộ dụng cụ chiết hồi lưu, tủ sấy Memmert - Đức, tủ sấy chân không, bếp cách thủy Memmert, cồn kế, bình nón, bình cầu, bát sứ, giấy lọc. - Vial, bơm tiêm, màng lọc 0,45 µm, bình định mức, pipet Pasteur thủy tinh. - Cân phân tích Precisa XT 220A, độ chính xác 0,0001g. - Cân kĩ thuật, độ chính xác 0,01g. - Máy xác định độ ẩm Precisa - Máy rung siêu âm Power Sonic 405. - Hệ thống máy sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) Shimadzu bao gồm: Hệ bơm binary LC-20AD, detector SPD-20A UV, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL-20A HT, bộ phận ổn định nhiệt CTO-10AS của Shimadzu. Phần mềm điều khiển Labsolution. 2.1.3. Hóa chất, dung môi 12
  21. - Hóa chất chiết và định mức: Ethanol 96%, MeOH CN - Dung môi rửa giải sắc ký cột (CC): Methanol (MeOH), Dicloromethan (DCM), Trietylamin (C3H9N), đạt độ tinh khiết thích hợp sử dụng trong chiết xuất, phân lập các chất. - Dung môi khai triển sắc ký lớp mỏng (TLC): Toluen (C7H8), Ethyl Acetat (EtOAc), Triethylamin (C3H9N) , - Hóa chất phân tích HPLC: + Chất chuẩn Conessin (C24H40N2) độ tinh khiết 98% của Trung Quốc. + Acetonitril, MeOH đảm bảo tiêu chuẩn HPLC. + H3PO4, H2O đảm bảo tiêu chuẩn HPLC. 2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Khảo sát quy trình chiết xuất, làm giàu alcaloid từ vỏ cây Thừng mực lá to. Các thông số đầu vào: phương pháp xử lý mẫu, phương pháp chiết, loại dung môi chiết, số lần chiết, tỷ lệ DM/DL; thông số đầu ra là hàm lượng cao tổng chiết được từ dược liệu tính bằng công thức sau: n X% = m(1 - ha) x100 Trong đó: X: hàm lượng cao tổng trong dược mẫu dược liệu n: khối lượng cao tổng chiết xuất được m: khối lượng dược liệu đem chiết ha: hàm ẩm của dược liệu đem chiết 2.2.1.1. Khảo sát quy trình chiết xuất cao tổng  Khảo sát phương pháp xử lý mẫu So sánh khối lượng cao tổng thu được khi chiết 2 mẫu dược liệu có cùng một khoảng khối lượng. 13
  22. - Mẫu 1: Cân chính xác 2g dược liệu đã được sấy khô, xay nhỏ, độ ẩm 4,95%. - Mẫu 2: Cân chính xác 2g dược liệu đã được sấy khô, xay nhỏ, độ ẩm 4,95%, làm ẩm bằng NH3 rồi dàn tơi. Sử dụng phương pháp chiết siêu âm 2 mẫu trong cùng một điều kiện, khối lượng cao tổng được xác định bằng phương pháp cân. So sánh lượng cao tổng thu được, đánh giá và đưa ra kết luận về phương pháp xử lý mẫu.  Khảo sát phương pháp chiết Chúng tôi tiến hành chiết mẫu dược liệu bằng 2 phương pháp chiết; chiết siêu âm và chiết hồi lưu. Khối lượng cao tổng được xác định bằng phương pháp cân. So sánh lượng cao tổng thu được, đánh giá và đưa ra kết luận về phương pháp xử lý mẫu.  Khảo sát số lần chiết Chúng tôi tiến hành chiết mẫu dược liệu nhiều lần, sử dụng thuốc thử Dragendorff để nhận biết lúc nào dịch chiết thu được không xuất hiện alcaliod thì dừng lại. Khối lượng cắn thu được mỗi lần được tách riêng và xác định bằng phương pháp cân. Tính phần trăm khối lượng cắn thu được sau mỗi lần lần so với tổng khối lượng cắn thu được để xác định được số lần chiết thích hợp.  Khảo sát dung môi chiết Chúng tôi tiến hành chiết xuất mẫu dược liệu trong cùng một điều kiện nhưng với các dung môi chiết khác nhau: MeOH, EtOH 70%, EtOH 50%, H2O. Khối lượng cao tổng được xác định bằng phương pháp cân. So sánh lượng cao tổng thu được, đánh giá và lựa chọn dung môi chiết thích hợp.  Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ DM/DL 14
  23. Chúng tôi tiến hành chiết xuất mẫu dược liệu trong cùng một điều kiện, cùng dung môi chiết, nhưng tỉ lệ DM/DL là khác nhau. Khối lượng cao tổng được xác định bằng phương pháp cân. So sánh lượng cao tổng thu được, đánh giá và lựa chọn tỉ lệ DM/DL thích hợp. 2.2.1.2. Khảo sát quy trình làm giàu alcaloid từ cao tổng Nếu cần thiết, có thể sử dụng sắc kí cột với các loại pha tĩnh hấp phụ (silica gel), phân bố pha đảo (C18), thấm qua gel (Sephadex LH-20). Tùy theo từng chất mà chọn pha tĩnh thích hợp hoặc phải kết hợp sử dụng các pha tĩnh khác nhau. Khảo sát lựa chọn dung môi rửa giải bằng TLC [24]. 2.2.2. Định lượng alcaloid bằng phương pháp HPLC 2.2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng alcaloid và xác định tạp chất bằng phương pháp HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kĩ thuật tách chất hiện đại và đa năng. Đây là phương pháp có nhiều ưu điểm như độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy bởi nhiệt. Dựa trên công thức phân tử và cấu trúc hóa học của Conessin để dự đoán, thử nghiệm nhằm tìm ra các điều kiện sắc kí phù hợp như: - Pha tĩnh: lựa chọn cột phù hợp - Pha động: khảo sát thành phần, tỉ lệ pha đảo - Bước sóng phát hiện: Detector tử ngoại khả kiến UV-VIS loại PDA có thể quét phổ. Dựa vào bước sóng theo tài liệu tham khảo hoặc quét phổ để tìm bước sóng thích hợp - Tốc độ dòng: xác định tốc độ dòng thích hợp - Thể tích tiêm mẫu: xác định thể tích tiêm mẫu thích hợp - Nồng độ dung dịch thử: Khảo sát nồng độ thích hợp trong khoảng tuyến tính. 15
  24. - Dung môi pha mẫu: Khảo sát từ 2 - 4 pha động để lựa chọn pha động phù hợp nhất. 2.2.2.2. Thẩm định phương pháp phân tích - Tính thích hợp của hệ thống sắc kí: Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn đã chuẩn bị ở trên, ghi lại các giá trị về thời gian lưu, diện tích pic. Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của diện tích pic. - Tính đặc hiệu: Khảo sát xem hệ HPLC có đặc hiệu với chất phân tích hay không - Độ chính xác: Lặp lại 6 lần tiêm dung dịch thử ở nồng độ khảo sát để khảo sát độ chính xác. - Tính tuyến tính: Tiêm dung dịch chuẩn trong khoảng nồng độ khảo sát vào hệ thống sắc kí để khảo sát độ tuyến tính. - Độ đúng: Thêm một lượng chính xác dung dịch chuẩn vào dung dịch thử, sao cho tổng nồng độ sau khi thêm vẫn nằm trong khoảng tuyến tính của phương pháp. Tiến hành phân tích sắc kí để khảo sát độ đúng. 2.2.2.3. Xây dựng đường chuẩn và công thức - Xây dựng phương trình đường chuẩn của Conessin dựa vào sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích pic. - Phương trình đường chuẩn Conessin có dạng y = ax + b - Tổng hàm lượng alcaloid trong cao được tính theo hàm lượng Conessin 16
  25. CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát quy trình chiết xuất cao tổng từ vỏ thân Thừng mực lá to Chuẩn bị nguyên liệu: - Vỏ thân Thừng mực lá to được thái lát, sấy khô ở nhiệt độ dưới 60 0C trong tủ sấy, nghiền thành bột thô rồi tiến hành khảo sát. - Các mẫu được xác định độ ẩm: 4,95 ± 0,02%. - Kiểm tra sơ bộ trên TLC: So sánh dịch chiết từ dược liệu và Conessin chuẩn. Hệ dung môi khai triển: Toluen/Ethyl Acetat/Triethylamin = 6,5/2,5/0,5 Hiện màu với thuốc thử Dragendorff Hình 8: Ảnh TLC so sánh alcaloid từ dịch chiết MeOH và chất chuẩn Conessin 3.1. Khảo sát phương pháp xử lý mẫu Alcaloid nói chung là các base yếu, trong cây nó có thể tồn tại dưới tự do hoặc dạng muối, hoặc đồng thời cả hai dạng. Vì vậy, thông thường có thể dùng các dung dịch kiềm trung bình hoặc kiềm mạnh để giải phóng hợp chất ra khỏi muối trước khi chiết xuất, phân lập nhằm thu được hiệu suất chiết tối đa. [22] 17
  26. Trong điều kiện giới hạn về thời gian, nên thí nghiệm này chúng tôi chỉ sử dụng phương pháp chiết hồi lưu để khảo sát. Phương pháp chiết hồi lưu hay được sử dụng nhất do đảm bảo các yếu tố như: đơn giản về thiết bị, chiết nóng nên thu được nhiều chất và nhóm hợp chất hơn, thời gian ngắn hơn. Chúng tôi đã thiết kế thí nghiệm để so sánh kết quả khối lượng cao tổng thu được khi chiết dược liệu bằng 2 phương pháp xử lý mẫu khác nhau. Các điều kiện chiết của 2 phương pháp như nhau.  Dược liệu không làm ẩm bằng NH3 - Nguyên liệu: Cân chính xác khoảng 2g dược liệu đã xay nhỏ dưới dạng bột thô, độ ẩm 4,95 ± 0,02%. - Dung môi: 84ml MeOH - Tỷ lệ dung môi/dược liệu: 10/1; 8/1; 8/1; 8/1; 8/1 (ml/g) tương ứng cho lần chiết thứ 1, thứ 2, thứ 3, thứ 4 và thứ 5 - Điều kiện: nhiệt độ 85 0C trong thời gian tương ứng là 2 giờ; 2 giờ; 2 giờ; 2 giờ và 2 giờ. - Lọc riêng từng dịch chiết, bỏ phần bã đem cô quay ở áp suất giảm và sấy ở tủ sấy hút chân không đến khi khối lượng không đổi.  Dược liệu được làm ẩm bằng NH3 - Nguyên liệu: Cân chính xác khoảng 2g dược liệu đã xay nhỏ dưới dạng bột thô, độ ẩm 4,95 ± 0,02% làm ẩm bằng NH3, sau đó dàn tơi và làm khô. - Dung môi: 84ml MeOH - Tỷ lệ dung môi/dược liệu: 10/1; 8/1; 8/1; 8/1; 8/1 (ml/g) tương ứng cho lần chiết thứ nhất, thứ hai, thứ 3, thứ 4 và thứ 5 - Điều kiện: nhiệt độ 85 0C trong thời gian tương ứng là 2 giờ; 2 giờ; 2 giờ; 2 giờ và 2 giờ. - Lọc riêng từng dịch chiết, bỏ phần bã đem cô quay ở áp suất giảm và sấy ở tủ sấy hút chân không đến khi khối lượng không đổi. 18
  27. Với mỗi phương pháp thực hiện chiết xuất 3 lần, mỗi lần với 2 g dược liệu được xay nhỏ và sấy khô. Xác định lượng cao tổng thu được bằng phương pháp cân. Tính hiệu suất chiết của mỗi phương pháp. Bảng 1: Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực lá to với dược liệu không làm ẩm bằng NH3 Khối lượng Dược liệu không làm ẩm bằng NH3 STT dược liệu Khối lượng cao tổng (g) Hiệu suất (%) đem chiết (g) 1 2,05 0,429 22,01 2 2,02 0,410 21,35 3 2,01 0,392 21,52 Trung bình 21,62 ± 0,02% Bảng 2: Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực lá to với dược liệu có làm ẩm bằng NH3 Khối lượng Dược liệu có làm ẩm bằng NH3 STT dược liệu Khối lượng cao tổng (g) Hiệu suất (%) đem chiết (g) 1 2,06 0,481 24,56 2 2,01 0,460 24,08 3 2,03 0,485 25,14 Trung bình 24,59 ± 0,03% Bàn luận: - Dược liệu không làm ẩm bằng NH3: 19
  28. Phương pháp này thu được lượng cao tổng với hiệu suất trung bình là 21,62 ± 0,02% - Dược liệu có làm ẩm bằng NH3: Phương pháp này thu được lượng cao tổng với hiệu suất trung bình là 24,59 ± 0,03%. Hiệu suất chiết cao hơn (cao hơn 2,97%) so với phương pháp Dược liệu không làm ẩm bằng NH3. Kết luận: Phương pháp Dược liệu có làm ẩm bằng NH3 lượng cao tổng với hiệu suất cao hơn. Do đó phương pháp này được sử dụng để khảo sát các điều kiện tiếp theo. 3.2. Khảo sát phương pháp chiết và số lần chiết  Khảo sát phương pháp chiết Chiết hồi lưu với dung môi MeOH (PP1) - Nguyên liệu: Cân chính xác khoảng 2g dược liệu đã xay nhỏ dưới dạng bột thô, độ ẩm 4,95 ± 0,02 %, làm ẩm bằng NH3, sau đó dàn tơi và làm khô. - Dung môi: 84ml MeOH - Tỷ lệ dung môi/dược liệu: 10/1; 8/1; 8/1; 8/1; 8/1 (ml/g) tương ứng cho lần chiết thứ nhất, thứ hai, thứ 3, thứ 4 và thứ 5 - Điều kiện: nhiệt độ 85 0C trong thời gian tương ứng là 2 giờ; 2 giờ; 2 giờ; 2 giờ và 2 giờ. - Lọc riêng từng dịch chiết, bỏ phần bã đem cô quay ở áp suất giảm và sấy ở tủ sấy hút chân không đến khi khối lượng không đổi. Chiết siêu âm với dung môi MeOH (PP2) - Nguyên liệu: Cân chính xác khoảng 2g dược liệu đã xay nhỏ dưới dạng bột thô, độ ẩm 4,95 ± 0,02 %, làm ẩm bằng NH3, sau đó dàn tơi và làm khô. - Dung môi: 84ml MeOH 20
  29. - Tỷ lệ dung môi/dược liệu: 10/1; 8/1; 8/1; 8/1; 8/1 (ml/g) tương ứng cho lần chiết thứ nhất, thứ hai, thứ 3, thứ 4 và thứ 5 - Điều kiện: thời gian mỗi lần chiết là 30 phút - Lọc riêng từng dịch chiết, bỏ phần bã đem cô quay ở áp suất giảm và sấy ở tủ sấy hút chân không đến khi khối lượng không đổi. Với mỗi phương pháp thực hiện chiết xuất 3 lần, mỗi lần với 2g dược liệu được xay nhỏ và sấy khô. Xác định lượng cao tổng thu được bằng phương pháp cân. Tính hiệu suất thu được từ từng lần chiết của mỗi phương phá. Bảng 3: Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực lá to ( PP1) S PP1 S Lượng Khối Khối Khối Khối Khối Khối Hiệu suất T dược lượng lượng lượng lượng lượng lượng (%) T liệu cao lần cao lần cao lần cao lần cao lần cao tổng đem 1 (g) 2 (g) 3 (g) 4 (g) 5 (g) (g) chiết (g) 1 2,06 0,248 0,124 0,062 0,030 0,017 0,481 24,56 2 2,01 0,236 0,120 0,059 0,031 0,014 0,460 24,08 3 2,03 0,250 0,127 0,062 0,029 0,017 0,485 25,14 Trung bình 24,59 ± 0,03% 21
  30. Bảng 4: Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực lá to (PP2) S PP2 S Lượng Khối Khối Khối Khối Khối Khối Hiệu suất T dược lượng lượng lượng lượng lượng lượng (%) T liệu cao lần cao lần cao lần cao lần cao lần cao đem 1 (g 2 (g) 3 (g) 4 (g) 5 (g) tổng chiết (g) (g) 1 2,01 0,130 0,085 0,050 0,038 0,021 0,324 16,96 2 2,05 0,131 0,081 0,053 0,033 0,019 0,317 16,27 3 2,08 0,129 0,079 0,056 0,031 0,023 0,318 16,08 Trung bình 16,44 ± 0,01% Bàn luận: - Chiết hồi lưu với dung môi MeOH: Phương pháp này thu được lượng cao tổng với hiệu suất trung bình là 24,59 ± 0,03%. - Chiết siêu âm với dung môi MeOH: Phương pháp này thu được cao giàu tổng với hiệu suất trung bình là 16,44 ± 0,01%. Phương pháp chiết siêu âm có ưu điểm nhanh, đơn giản, dễ sử dụng nhưng phương pháp này có nhược điểm là hiệu suất chiết thấp hơn so với phương pháp chiết hồi lưu (thấp hơn 8,15%) Kết luận: Từ kết quả khảo sát trên, phương pháp chiết xuất phù hợp là chiết hồi lưu.  Khảo sát số lần chiết 22
  31. Khối lượng cao thu được ở PP1 khảo sát trên được thống kê dưới bảng sau: Bảng 5: Phần trăm khối lượng cao tổng S Chiết hồi lưu với dung môi MeOH S Lượng Khối lượng Phần Khối lượng Phần Khối lượng Phần T dược cao tổng sau trăm cao tổng sau trăm cao tổng sau trăm T liệu 1 lần chiết (%) 2 lần chiết (%) 3 lần chiết (%) đem (g) (g) (g) chiết (g) 1 2,06 0,248 51,56 0,372 77,34 0,434 90,23 2 2,01 0,236 51,30 0,356 77,39 0,415 90,21 3 2,03 0,250 51,54 0,377 77,73 0,439 90,52 Trung bình 0,245 51,47 0,368 77,48 0,429 90,32 Bàn luận: Số liệu từ bảng 4 cho thấy tổng khối lượng cao tổng trung bình sau 3 lần chiết là 0,429g, chiếm 90,32 ± 0,03% so với khối lượng cao thu được sau 5 lần chiết. Khảo sát bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC) (Hình 8) cho thấy lượng alcaloid ở lần 4 và lần 5 không đáng kể. Kết luận: Từ kết quả khảo sát trên, số lần chiết xuất phù hợp là 3 lần liên tiếp. 3.3. Khảo sát loại dung môi chiết Dung môi có ảnh hưởng rất lớn tới hàm lượng hoạt chất chiết được, do đó việc khảo sát loại dung môi chiết là rất quan trọng. Hiện nay có thể sử dụng MeOH hoặc hỗn hợp EtOH - H2O trong sản xuất.  Chiết hồi lưu với dung môi MeOH (PPA) 23
  32. - Nguyên liệu: Cân chính xác khoảng 2g dược liệu đã xay nhỏ dưới dạng bột thô, độ ẩm 4,95 ± 0,02 % làm ẩm bằng NH3, sau đó dàn tơi và làm khô. - Dung môi: 52ml MeOH - Tỷ lệ dung môi/dược liệu: 10/1; 8/1; 8/1 (ml/g) tương ứng cho lần chiết thứ nhất, thứ hai và lần thứ 3 - Điều kiện: nhiệt độ 85 oC trong thời gian tương ứng là 2 giờ; 2 giờ và 2 giờ. - Lọc dịch chiết, bỏ phần bã. Gộp dịch chiết, đem cô quay ở áp suất giảm và sấy ở tủ sấy hút chân không đến khi khối lượng không đổi.  Chiết hồi lưu với dung môi Ethanol 70% (PPB) - Nguyên liệu: Cân chính xác khoảng 2g dược liệu đã xay nhỏ dưới dạng bột thô, độ ẩm 4,95 ± 0,02 % làm ẩm bằng NH3, sau đó dàn tơi và làm khô. - Dung môi: 52ml Ethanol 70% - Tỷ lệ dung môi/dược liệu: 10/1; 8/1; 8/1 (ml/g) tương ứng cho lần chiết thứ nhất, thứ hai và lần thứ 3 - Điều kiện: nhiệt độ 85 oC trong thời gian tương ứng là 2 giờ; 2 giờ và 2 giờ. - Lọc dịch chiết, bỏ phần bã. Gộp dịch chiết, đem cô quay ở áp suất giảm và sấy ở tủ sấy hút chân không đến khi khối lượng không đổi.  Chiết hồi lưu với dung môi Ethanol 50% (PPC) - Nguyên liệu: Cân chính xác khoảng 2g dược liệu đã xay nhỏ dưới dạng bột thô, độ ẩm 4,95 ± 0,02 % làm ẩm bằng NH3, sau đó dàn tơi và làm khô. - Dung môi: 52ml Ethanol 50% - Tỷ lệ dung môi/dược liệu: 10/1; 8/1; 8/1 (ml/g) tương ứng cho lần chiết thứ nhất, thứ hai và lần thứ 3 24
  33. - Điều kiện: nhiệt độ 85 oC trong thời gian tương ứng là 2 giờ; 2 giờ và 2 giờ. - Lọc dịch chiết, bỏ phần bã. Gộp dịch chiết, đem cô quay ở áp suất giảm và sấy ở tủ sấy hút chân không đến khi khối lượng không đổi.  Chiết hồi lưu với nước (PPD) - Nguyên liệu: Cân chính xác khoảng 2g dược liệu đã xay nhỏ dưới dạng bột thô, độ ẩm 4,95 ± 0,02 %. - Dung môi: 104ml nước - Tỉ lệ dung môi/dược liệu: 20/1; 16/1; 16/1 (ml/g) tương ứng cho lần chiết thứ nhất, thứ hai và lần thứ 3 - Điều kiện: nhiệt độ 85 0C trong thời gian tương ứng là 2 giờ; 2 giờ và 2 giờ. - Lọc dịch chiết, bỏ phần bã. Gộp dịch chiết, đem cô quay ở áp suất giảm và sấy ở tủ sấy hút chân không đến khi khối lượng không đổi. Với mỗi phương pháp thực hiện chiết xuất 3 lần, mỗi lần với 2g dược liệu được xay nhỏ và sấy khô. Xác định lượng cao tổng thu được bằng phương pháp cân. Tính hiệu suất thu của mỗi phương pháp Bảng 6: Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực lá to với phương pháp chiết PPA Khối lượng PPA STT dược liệu Khối lượng cao tổng (g) Hiệu suất (%) đem chiết (g) 1 2,06 0,434 22,16 2 2,01 0,415 21,72 3 2,03 0,439 22,75 Trung bình 22,21 ± 0,01 25
  34. Bảng 7: Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực lá to với phương pháp chiết PPB Khối lượng PPB STT dược liệu Khối lượng cao tổng (g) Hiệu suất (%) đem chiết (g) 1 2,02 0,421 24,68 2 2,01 0,465 24,33 3 2,06 0,458 23,40 Trung bình 24,13 ± 0,02 Bảng 8: Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực lá to với phương pháp chiết PPC Khối lượng PPC STT dược liệu Khối lượng cao tổng (g) Hiệu suất (%) đem chiết (g) 1 2,03 0,432 22,39 2 2,07 0,451 22,92 3 2,04 0,427 22,02 Trung bình 22,44 ± 0,03 26
  35. Bảng 9: Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực lá to với phương pháp chiết PPD Khối lượng PPD STT dược liệu Khối lượng cao tổng (g) Hiệu suất (%) đem chiết (g) 1 2,02 0,459 23,90 2 2,05 0,450 23,09 3 2,07 0,461 23,43 Trung bình 23,47 ± 0,02 Bảng 10: So sánh hiệu suất trung bình chiết xuất cao tổng của 4 phương pháp STT Phương pháp Hiệu suất trung bình (%) 1 PPA 22,21 ± 0,01 2 PPB 24,13 ± 0,02 3 PPC 22,44 ± 0,03 4 PPD 23,47 ± 0,02 Bàn luận: Thông thường, EtOH và MeOH được cho là 2 dung môi có khả năng chiết kiệt nhất hàm lượng các chất trong dược liệu. Tuy nhiên trên quy mô lớn, MeOH ít được ứng dụng nhiều do độc hại. EtOH là dung môi thông dụng rẻ tiền và ít độc hại nên thường được sử dụng. Các dung môi EtOH 70%, EtOH 50% thậm chí H2O cũng hay được sử dụng trong công nghiệp tùy theo mục đích và nhu cầu cụ thể. Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát thêm các dung môi này để so sánh. - Chiết hồi lưu với dung môi MeOH (PPA): 27
  36. Phương pháp này thu được cao tổng với hiệu suất trung bình là 22,21 ± 0,01%. Là phương pháp có hiệu suất chiết tương đối cao, hàm lượng Conessin khảo sát bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC) lớn. Tuy nhiên, lượng tạp nhiều, gây khó khăn cho bước phân lập tiếp theo. - Chiết hồi lưu với dung môi Ethanol 70% (PPB): Phương pháp này thu được cao tổng với hiệu suất trung bình là 24,13 ± 0,02%. Là phương pháp có hiệu suất chiết cao nhất, lượng Conessin khảo sát bằng phương pháp sắc kí bản mỏng (TLC) lớn. - Chiết hồi lưu với dung môi Ethanol 50% (PPC): Phương pháp này thu được cao tổng với hiệu suất trung bình là 22,44 ± 0,03%. Hiệu suất chiết cao, hàm lượng Conessin khảo sát bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC) thấp. Mặc dù đây là dung môi có giá thành thấp hơn, tuy nhiên hiệu quả chiết xuất không cao. - Chiết hồi lưu với nước (PPD): Phương pháp này thu được lượng cao tổng với hiệu suất trung bình là 23,47 ± 0,02%. Khảo sát bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC) cho thấy lượng tạp nhiều. Mặc dù tỷ lệ DM/DL đã gấp 2 lần so với các phương pháp trên nhưng hiệu suất trung bình không cao hơn nhiều (cao hơn 1,26% so với chiết bằng MeOH). Kết luận: Từ các kết quả trên đấy ta thấy Ethanol 70% là dung môi thích hợp để lựa chọn chiết cả về mặt kinh tế, khả năng thu hồi, tái sử dụng và hiệu suất chiết. Dung môi này được dùng cho các khảo sát tiếp theo. 3.4. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ DM/DL (ml/g) Tỷ lệ DM/DL (ml/g) cũng ảnh hưởng lớn đến hiệu suất chiết. Nếu sử dụng quá ít dung môi sẽ không chiết kiệt hoạt chất. Tuy nhiên sử dụng quá nhiều dung môi sẽ lãng phí và kéo dài thời gian thu hồi dung môi, thời gian sấy cao. 28
  37. Do đó cần lựa chọn tỷ lệ DM/DL thích hợp Chúng tôi đã thiết kế thí nghiệm để so sánh kết quả khối lượng cao tổng thu được khi chiết dược liệu bằng phương pháp chiết hồi lưu với tỷ DM/DL khác nhau:  Tỷ lệ DM/DL: 30/1; 24/1; 24/1 - Nguyên liệu: Cân chính xác khoảng 2g dược liệu đã xay nhỏ dưới dạng bột thô, độ ẩm 4,95 ± 0,02 % làm ẩm bằng NH3, sau đó dàn tơi và làm khô. - Dung môi: 156 ml Ethanol 70% - Tỷ lệ dung môi/dược liệu: 30/1; 24/1; 24/1 (ml/g) tương ứng cho lần chiết thứ nhất, thứ hai và lần thứ 3 - Điều kiện: nhiệt độ 85 0C trong thời gian tương ứng là 2 giờ; 2 giờ và 2 giờ. - Lọc dịch chiết, bỏ phần bã. Gộp dịch chiết, đem cô quay ở áp suất giảm và sấy ở tủ sấy hút chân không đến khi khối lượng không đổi.  Tỷ lệ DM/DL: 10/1; 8/1; 8/1. - Nguyên liệu: Cân chính xác khoảng 2g dược liệu đã xay nhỏ dưới dạng bột thô, độ ẩm 4,95 ± 0,02 % làm ẩm bằng NH3, sau đó dàn tơi và làm khô. - Dung môi: 52 ml Ethanol 70% - Tỷ lệ dung môi/dược liệu: 10/1; 8/1; 8/1 (ml/g) tương ứng cho lần chiết thứ nhất, thứ hai và lần thứ 3 - Điều kiện: nhiệt độ 85 0C trong thời gian tương ứng là 2 giờ; 2 giờ và 2 giờ. - Lọc dịch chiết, bỏ phần bã. Gộp dịch chiết, đem cô quay ở áp suất giảm và sấy ở tủ sấy hút chân không đến khi khối lượng không đổi.  Tỷ lệ DM/DL: 7/1; 5/1; 5/1. 29
  38. - Nguyên liệu: Cân chính xác khoảng 2g dược liệu đã xay nhỏ dưới dạng bột thô, độ ẩm 4,95 ± 0,021% làm ẩm bằng NH3, sau đó dàn tơi và làm khô. - Dung môi: 34 ml Ethanol 70% - Tỷ lệ dung môi/dược liệu: 7/1; 5/1; 5/1 (ml/g) tương ứng cho lần chiết thứ nhất, thứ hai và lần thứ 3 - Điều kiện: nhiệt độ 85 0C trong thời gian tương ứng là 2 giờ; 2 giờ và 2 giờ. - Lọc dịch chiết, bỏ phần bã. Gộp dịch chiết, đem cô quay ở áp suất giảm và sấy ở tủ sấy hút chân không đến khi khối lượng không đổi. Với mỗi phương pháp thực hiện chiết xuất 3 lần, mỗi lần với 2g dược liệu được xay nhỏ và sấy khô. Xác định lượng cao tổng thu được bằng phương pháp cân. Tính hiệu suất của mỗi phương pháp. Bảng 11: Hiệu suất chiết với tỷ lệ MD/DL: 30/1; 24/1; 24/1 Khối lượng Tỷ lệ DM/DL: 30/1; 24/1; 24/1 STT dược liệu Khối lượng cao tổng (g) Hiệu suất (%) đem chiết (g) 1 2,03 0,484 25,08 2 2,07 0,479 24,34 3 2,03 0,473 24,51 Trung bình 24,64 ± 0,03 30
  39. Bảng 12: Hiệu suất chiết với tỷ lệ MD/DL: 10/1; 8/1; 8/1 Khối lượng Tỷ lệ DM/DL = 10/1; 8/1; 8/1 STT dược liệu Khối lượng cao tổng (g) Hiệu suất (%) đem chiết (g) 1 2,02 0,421 24,68 2 2,01 0,465 24,33 3 2,06 0,458 23,40 Trung bình 24,13 ± 0,02 Bảng 13: Hiệu suất chiết với tỷ lệ MD/DL: 7/; 5/1; 5/1 Khối lượng Tỷ lệ DM/DL: 7/; 5/1; 5/1 STT dược liệu Khối lượng cao tổng (g) Hiệu suất (%) đem chiết (g) 1 2,08 0,269 13,60 2 2,04 0,257 13,25 3 2,03 0,271 14,05 Trung bình 13,63 ± 0,01 Bảng 14: So sánh hiệu suất chiết của 3 tỷ lệ DM/DL STT Tỷ lệ DM/DL Hiệu suất trung bình (%) 1 30/1; 24/1; 24/1 24,64 ± 0,03 2 10/1; 8/1; 8/1 24,13 ± 0,02 3 7/; 5/1; 5/1 13,63 ± 0,01 31
  40. Bàn luận: Khi chiết dược liệu với tỷ lệ DM/DL tăng thì hiệu suất chiết tăng. Tuy nhiên khi tăng tỷ lệ DM/DL: 30/1; 24/1; 24/1 tức gấp 3 lần so với tỷ lệ DM/DL: 10/1; 8/1; 8/1 thì hiệu suất vẫn không tăng đáng kể (chỉ tăng 0,51%). Kết luận: Vì vậy tỷ lệ DM/DL được chúng tôi lựa chọn là DM/DL: 10/1; 8/1; 8/1. 32
  41. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận: Sau khi thực hiện đề tài: “Bước đầu khảo sát nghiên cứu quy trình chiết xuất cao giàu alcaloid từ vỏ cây Thừng mực lá to’’, chúng tôi đã cơ bản tìm được quy trình chiết xuất cao tổng từ vỏ cây Thừng mực lá to bằng phương pháp đánh giá khối lượng cắn thu được (bằng phương pháp cân) và sơ bộ bán định lượng alcaloid (bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC)): - Kích thước dược liệu: xay nhỏ dạng bột thô (1 - 2 mm) - Xử lý dược liệu: làm ẩm bằng NH3 - Dung môi chiết: EtOH 70% - Tỷ lệ DM/DL (ml/g): 10/1; 8/1; 8/1. - Thời gian chiết của 3 lần chiết liên tiếp của một mẫu dược liệu là: 2h; 2h; 2h. - Nhiệt độ chiết: 850C - Hiệu suất trung bình: 24,13 ± 0,02% Sơ đồ 1: Quy trình chiết xuất cao tổng 33
  42. Đề xuất: - Tiếp tục nghiên cứu quy trình định lượng alcaloid bằng phương pháp HPLC - Tiếp tục nghiên cứu quy trình làm giàu alcaloid từ cao tổng. - Khảo sát tính ổn định khi triển khai ở quy mô lớn. 34
  43. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Như, Nguyễn Tập & Trần Toàn; (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 2. Bộ Y tế (2007), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, Tập 1, Nxb. Y học, Hà Nội, 146-199. 3. Võ Văn Chi (2001), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Khoa học và Công nghệ, Hà Nội. 4. Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt nam. Nhà xuất bản Trẻ tập II, Tr. 683-692. 5. Phạm Thanh Kỳ, Chu Đình Kính, Phí Tùng Lâm (2006), “Phân lập và nhận dạng conessin và norconessin trong vỏ cây Mức hoa trắng thu hái ở Hải Dương”, Tạp chí dược liệu, 11 (1), 6-8. 6. Phí Tùng Lâm (2005), Nghiên cứu dược liệu Mức hoa trắng thu hái ở Chí Linh, Hải Dương, Luận văn Thạc sĩ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội. 7. Đỗ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, Tr. 182-184. 8. Trần Huy Thái, Phùng Tuyết Hồng, Nguyễn Quang Hưng (2007), “Một số kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái, sinh thái và khả năng nhân giống, phát triển của cây Mộc hoa trắng (Holarrhena pubescens Wall.ex G.Don) ở Việt Nam”, Tạp chí Dược học, 373, 19-23.
  44. 9. Trần Huy Thái, Nguyễn Quang Hưng, Phan Văn Kiệm, Châu Văn Minh, Nguyễn Hải Đăng, Nguyễn Xuân Cường (2006), “Các hợp chất alcaloid steroid từ vỏ cây Mộc hoa trắng (Holarrhena pubescens Buch. Harm) Wall.ex.G.Don”, Tạp chí Dược học, 362, 24-27. 10. Viện dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam tập II, Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật, HN, Tr. 325 - 329, 721 - 726. 11. Lưu Minh Xư (1973), Nghiên cứu thuốc chữa lỵ amip Holamin, khoá luận tốt nghiệp dược sĩ đại học. Tiếng Anh 12. Akhtar P., et al (2011), “Development of Quality Standards of Holarrhenaantidysenterica (Linn.) Bark”, Recent Research in Science and Technology, 3 (1), 73-80. 13. Ali KM, Chatterjeea K, Dea D, Janaa K, Beraa TK, Ghosha D. Inhibitory effect of hydro-methanolic extract of seed of Holarrhena Antidysenterica on alpha-glucosidase activity and postprandial blood glucose level in normoglycemic rat. Journal of Ethnopharmacology.2011; 135: 194–196 14. Chakraborty A., Brantner A. H. (1999), “Antibacterial steroid alkaloids from the stem bark of Holarrhena pubescens”, J. Ethnopharmacol., 68 (1-3), 339-344. 15. Garg S., Bhutani K.K. (2008), “Chromatographic Analysis of Kutajarista – an Ayurvedic Polyherbal Formulation”, Phytochemical Analysis, 19, 323 - 328. 16. Gopal V., Chauhan M. G., “Suppliment to Cultivation and Utilization of Medicinal Plants,” ed. by Handa S. S., Kaul M. K., Regional Research Laboratory, Jammu-Tawi, 2006.
  45. 17. Houghton P. J., Dias Diogo M. L. (1996), “The conessine content of Holarrhena pubescens from Malawi”, Pharmaceutical Biology, 4 (34), 305-307. 18. Kaur A.D., Ravichandran V., Jain P.K., Agrawal R.K. (2008), “Highperformance thin layer chromatography method for estimation of conessine in herbal extract and pharmaceutical dosage formulations”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 46, 391 - 394. 19. Kuma N., Singh B., Bhandari P., Gupta A. P., Kaul V. K. (2007), “Steroidal Alkaloids from Holarrhena antidysenterica (L.), Wall”, Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 55 (6), 912 - 914. 20. Lalla J. K., Hamrapurkar P. D., Parikh M. K. (2002), “Simple and Rapid TLC Method for Identification of Holarrhena antidysenterica Wall. Bark and its substituent Wrightia tinctoria R. P Bark”, Journal of Planar Chromatography - Modern TLC, 3 (15), 226 - 229. 21. Mrinal, N. S. (2018). A Review on Pharmacological Aspects of Holarrhena antidysenterica. Scholars Academic Journal of Pharmacy, 7 (12), 488-492. 22. Sarker S.D., Latif Z., Gray A.I. (2006), Natural Products Isolation, Second Edition, Humana Press, New Jersey, 27-46, 77-117, 275-297. 23. Umashanker KPd, Chandra S, Sharma J. Antidiabetic Efficacy Of Ethanolic Extract of Holarrhena Antidysenterica Seeds in Streptozotocin - Induced Diabetic Rats and Its influence on certain Biochemical Parameters. Journal of Drug Delivery & Therapeutics. 2012; 2(4); 159- 162 24. Waksmundzka H. M., Sherma J., Kowalska T. (2008), Thin Layer Chromatography in Phytochemistry, CRC Press, Florida, 3-15.