›

Khóa luận Phân tích ca lâm sàng tăng thân nhiệt ác tính trong phẫu thuật tim khi sử dụng thuốc gây mê dạng hít sevoflurane

pdf 77 trang thiennha21 18/04/2022 3390
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Phân tích ca lâm sàng tăng thân nhiệt ác tính trong phẫu thuật tim khi sử dụng thuốc gây mê dạng hít sevoflurane", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_phan_tich_ca_lam_sang_tang_than_nhiet_ac_tinh_tron.pdf

Nội dung text: Khóa luận Phân tích ca lâm sàng tăng thân nhiệt ác tính trong phẫu thuật tim khi sử dụng thuốc gây mê dạng hít sevoflurane

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC VŨ THỊ THU HẰNG PHÂN TÍCH CA LÂM SÀNG TĂNG THÂN NHIỆT ÁC TÍNH TRONG PHẪU THUẬT TIM KHI SỬ DỤNG THUỐC GÂY MÊ DẠNG HÍT SEVOFLURANE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2020
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC Người thực hiện: Vũ Thị Thu Hằng PHÂN TÍCH CA LÂM SÀNG TĂNG THÂN NHIỆT ÁC TÍNH TRONG PHẪU THUẬT TIM KHI SỬ DỤNG THUỐC GÂY MÊ DẠNG HÍT SEVOFLURANE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.Y.2015 Người hướng dẫn: 1. TS. Vũ Thị Thơm 2. ThS.BS. Nguyễn Thị Thúy Mậu Hà Nội – 2020
  3. LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận, tôi đã học hỏi được rất nhiều kiến thức bổ ích và nhận được sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô, nhà trường, bệnh viện, gia đình và bạn bè. Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể Ban chủ nhiệm Khoa Y dược – Đại học Quốc gia Hà Nội và Bộ môn Y dược học cơ sở đã tạo điều kiện cho tôi được thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong khoa đã giảng dạy, giúp đỡ tôi hoàn thành chương trình học tập trong 5 năm qua. Tôi xin bày tỏ lòng thành kính và biết ơn sâu sắc đến TS. Vũ Thị Thơm và ThS.BS. Nguyễn Thị Thúy Mậu – những người thầy, người hướng dẫn khoa học đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt kiến thức cùng những kinh nghiệm quý báu, tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Bộ môn Y dược học cơ sở đã quan tâm, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài khóa luận. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các bác sĩ và nhân viên Trung tâm Tim mạch, Bệnh viện E đã giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện đề tài một cách thuận lợi. Tôi xin gửi lời cảm ơn và tình yêu thương sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè, những người đã luôn quan tâm, cổ vũ, động viên và giúp đỡ tôi trong những năm tháng học tập và nghiên cứu dưới mái trường đại học. Cuối cùng, tôi xin gửi lời tri ân đến bệnh nhân đã tham gia vào nghiên cứu. Sự đóng góp của bệnh nhân đã giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Hà Nội, ngày 10 tháng 06 năm 2020 Sinh viên Vũ Thị Thu Hằng
  4. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Giải nghĩa AMPA Thụ thể -amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid APTT Thời gian thromboplastin một phần hoạt hóa (Activated partial thromboplastin time) ATP Adenosine triphosphate Ca2+ Ion canxi CAv1.1 Tiểu đơn vị alpha – 1S CCD Bệnh cơ lõi trung tâm (Central core disease) cDNA DNA bổ sung (Complementary DNA) CK Creatine kinase CK – MB Xét nghiệm Creatine kinase - MB Cl- Ion clorua CNS Hệ thần kinh trung ương (Central nervous system) CYP2E1 Cytochrome P – 450 2E1 ddNTP Dideoxy nucleoside triphosphate DHPR Thụ thể dihydropyridine DNA Acid deoxyribonucleic dNTP Deoxy nucleoside triphosphate
  5. ĐPQH Đồng phân quang học EC Cặp kích thích – co cơ (excitation – contraction) EMHG Hội tăng thân nhiệt ác tính châu Âu (European malignant hyperthermia group) emPCR PCR nhũ tương ETCO2 Áp lực (nồng độ) CO2 cuối kỳ thở ra FRC Dung tích cặn chức năng (Functional residual capacity) F- Ion florua GABAA Thụ thể g – aminobutyric acid loại A Glu Glucose Hb Hemoglobin Hct Hematocrit HGMD Hệ dữ liệu đột biến gen người (Database of human gene mutation data) INDEL Đột biến thêm bớt (Insertion – deletion) INR Xét nghiệm đánh giá mức độ hình thành cục máu đông (International normalized ratio) K+ Ion Kali Lac Lactose MAC Nồng độ thuốc tối thiểu trong phế nang (Minimum alveolar concentration)
  6. Mg2+ Ion magie MmCD Bệnh multi – minicore Na+ Ion natri NAMHG Hội tăng thân nhiệt ác tính Bắc Mỹ (North American malignant hyperthermia group) NGS Giải trình tự gen thế hệ tiếp theo (Next Generation Sequencing) NMDA Thụ thể N – methyl – D – aspartate N2O Nitơ oxit NYHA Hội Tim mạch Hoa Kỳ (New York Heart Association Functional Classification) PaCO2 Áp lực riêng phần của khí CO2 trong máu động mạch (pCO2) PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain reaction) PharmGKB The pharmacogenomics knowledge base pO2 Áp lực riêng phần của khí O2 trong máu động mạch PT Thời gian prothrombin (Prothrombin time) Qphred Điểm chất lượng Phred (Phred quality score) RNA Acid ribonucleic RyR1 Thụ thể ryanodine SBS Giải trình tự bằng phương pháp tổng hợp (Sequencing by synthesis)
  7. SMRT Giải trình tự gen tức thời đơn phân tử (Single Molecule Real Time) SNP Đa hình đơn nucleotide (Single – nucleotide polymorphism) SO2 Khí lưu huỳnh dioxit SR Hệ võng nội bào (Sarcoplasmic reticulum) TKTW Thần kinh trung ương TTNAT Tăng thân nhiệt ác tính
  8. DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên Bảng Trang Bảng 1.1 Cấu trúc hóa học, tính chất hóa lý của một số thuốc gây 4 mê đường hô hấp. Bảng 1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nồng độ thuốc gây mê đường 6 hô hấp trong phế nang và khả năng hấp thu thuốc từ phế nang vào máu. Bảng 1.3 Ảnh hưởng của thuốc gây mê đường hô hấp trên một số 10 cơ quan và hệ cơ quan. Bảng 1.4 Một số đặc điểm dược lý đặc trưng của thuốc gây mê 11 đường hô hấp. Bảng 1.5 Độc tính cấp tính và mạn tính của thuốc gây mê đường 12 hô hấp. Bảng 1.6 Các tiêu chí được dùng trong thang điểm lâm sàng cho 18 bệnh TTNAT. Bảng 1.7 Xét nghiệm di truyền phân tử dùng trong chẩn đoán 20 TTNAT. Bảng 1.8 Điều trị nguyên nhân và điều trị triệu chứng trong đợt 21 TTNAT cấp. Bảng 1.9 Cấu trúc hóa học và đặc tính dược động học của 22 dantrolene. Bảng 1.10 Một số kỹ thuật giải trình tự bằng phương pháp tổng hợp 27 (SBS). Bảng 2.1 Mối liên hệ giữa điểm chất lượng Phred với khả năng 32 mắc lỗi đọc bazơ và tính chính xác của các lần đọc.
  9. Bảng 3.1 Giá trị một số chỉ số cận lâm sàng bất thường của bệnh 33 nhân trong ngày nhập viện. Bảng 3.2 Kết quả xét nghiệm khí máu động mạch và điện giải của 35 bệnh nhân tại thời điểm bắt đầu xảy ra phản ứng TTNAT. Bảng 3.3 Các biến thể RYR1 xuất hiện hơn 1 lần trong 770 gia đình 44 nghiên cứu ở Anh. Bảng 3.4 Các miền cấu trúc của thụ thể Ryanodine được phân tích 46 theo phương pháp đông lạnh mẫu thử dùng trong kính hiển vi điện tử (Cryo – EM). Bảng 3.5 Các biến thể của CACNA1S có ý nghĩa lâm sàng đối với 48 bệnh TTNAT. Bảng 3.6 Các biến thể của STAC3 có ý nghĩa lâm sàng đối với bệnh 50 TTNAT.
  10. DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên Hình Trang Hình 1.1 Quá trình phóng thích và bắt lại Ca2+ giữa võng nội bào 16 và tương bào cơ vân. Hình 1.2 Biểu hiện lâm sàng đặc trưng của bệnh TTNAT. 17 Hình 1.3 Quy trình giải trình tự Sanger. 26 Hình 3.1 Phẫu thuật thay van tim của bệnh nhân. 34 Hình 3.2 A: Điểm đột biến (c7048G >A, p.Ala2350Thr) trong gen 38 RYR1 của bệnh nhân được xác định bằng trình tự Sanger. B: So sánh cấu trúc bậc 1 của phân tử protein RyR1 giữa các loài: con người (XM011527205), bò (NM001206777), lợn (NM001001534), thỏ (NM001101718) và chuột (AY268935). Hình 3.3 Cấu trúc thụ thể Ryanodine. 47 Hình 3.4 Biểu diễn tuyến tính chuỗi acid amin của protein 47 ryanodine với các đột biến đã biết liên quan đến một số bệnh về cơ xương.
  11. MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Thuốc gây mê đường hô hấp dùng trong phẫu thuật 3 1.1.1. Lịch sử ra đời của thuốc gây mê đường hô hấp 3 1.1.2. Định nghĩa, phân loại và vai trò của thuốc gây mê đường hô hấp 3 1.1.3. Đặc điểm các thuốc gây mê đường hô hấp 4 1.2. Phản ứng tăng thân nhiệt ác tính 13 1.2.1. Định nghĩa 13 1.2.2. Đặc điểm dịch tễ học phản ứng tăng thân nhiệt ác tính 14 1.2.3. Sinh lý bệnh tăng thân nhiệt ác tính 15 1.2.4. Biểu hiện lâm sàng, chẩn đoán và điều trị tăng thân nhiệt ác tính 17 1.3. Phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) 23 1.3.1. Lịch sử phát triển 23 1.3.2. Khái niệm và ứng dụng của công nghệ giải trình tự tiếp theo 24 1.3.3. NGS qua các thế hệ 25 1.3.4. Hạn chế của NGS 30 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1. Đối tượng nghiên cứu 31 2.2. Phương pháp nghiên cứu 31 2.2.1. Phương pháp thu thập dữ liệu lâm sàng, cận lâm sàng 31 2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA 31 2.2.3. Phương pháp giải trình tự gen 31 2.2.4. Đạo đức nghiên cứu 32
  12. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33 3.1. Kết quả lâm sàng, cận lâm sàng của bệnh nhân 33 3.2. Kết quả phân tích gen của bệnh nhân 37 3.3. Bàn luận 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56
  13. ĐẶT VẤN ĐỀ Thuốc gây mê đường hô hấp là một loại thuốc cơ bản được sử dụng trong gây mê cân bằng hiện đại, gây mê phẫu thuật và giảm đau [32, 42]. Các thuốc gây mê đường hô hấp halogen được kể đến như halothane, enflurane, isoflurane, sevoflurane và desflurane. Hầu hết các thuốc này đều có tác dụng mạnh với chỉ số điều trị dao động từ 2 đến 4, chính vì vậy, việc sử dụng thuốc đòi hỏi kiến thức về tính chất hóa lý, dược động học và tác dụng của thuốc trên các cơ quan và hệ cơ quan khác nhau nhằm ngăn ngừa tác dụng phụ. Các tác dụng phụ có thể xảy ra trên hệ thần kinh trung ương, hệ hô hấp, tim mạch, tác động trên cơ, gây ra nhiều hội chứng bệnh lý khác nhau, trong đó có Tăng thân nhiệt ác tính – một tác dụng phụ rất hiếm gặp trên gây mê toàn thân [32]. Tăng thân nhiệt ác tính (TTNAT) là một rối loạn gen liên quan đến thuốc (pharmacogenetic) của hệ cơ xương liên quan đến tăng chuyển hóa mất kiểm soát, xảy ra trong quá trình phẫu thuật hoặc sau phẫu thuật ở những bệnh nhân nhạy cảm với thuốc gây mê đường hô hấp và/hoặc thuốc giãn cơ [25, 26]. Được mô tả lần đầu tiên vào năm 1960, TTNAT đã trở thành một trong những nguyên nhân gây tử vong do gây mê kể từ những năm đầu thế kỷ 20 cho đến nay. Phản ứng TTNAT hiếm xảy ra với tỉ lệ dao động từ 1:15000 – 1:75000 ở bất kì dân tộc nào trên thế giới, tuy nhiên, tỉ lệ mắc các bất thường về mặt di truyền là một trong 400 cá thể [23, 25]. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng phản ứng này liên quan đến các biến thể gây bệnh trong gen RYR1, CACNA1S hoặc STAC3, được xác định bằng các xét nghiệm di truyền phân tử với công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới. Từ đó cho phép sàng lọc nhanh chóng và hiệu quả các nhóm bệnh nhân cho các biến thể liên quan đến TTNAT đồng thời làm cơ sở cho chẩn đoán [6, 23]. Tại Việt Nam, ca lâm sàng trong nghiên cứu của chúng tôi là trường hợp TTNAT đầu tiên và duy nhất xảy ra trong vòng mười năm qua. Thuốc gây mê đường hô hấp halogen và suxamethonium làm giãn cơ gây ra phản ứng TTNAT, làm tăng tốc độ chuyển hóa cơ và hoạt động co bóp tạo ra nhiệt, từ đó dẫn đến thiếu oxy máu, nhiễm toan chuyển hóa, tiêu cơ vân và tăng 1
  14. nhiệt độ cơ thể nhanh chóng. Các tiến triển xấu của TTNAT có thể kể đến như suy thận cấp, loạn nhịp tim, đông máu nội mạch lan tỏa, nếu không được kiểm soát và điều trị kịp thời có thể gây tử vong ở bệnh nhân [67]. Chính bởi mức độ nguy hiểm của phản ứng này, việc chẩn đoán và điều trị TTNAT là rất cần thiết trong gây mê phẫu thuật ở những bệnh nhân có biểu hiện TTNAT, đặc biệt nếu có báo cáo về tiền sử TTNAT của gia đình. Hiện nay, thuốc dantrolene là thuốc đặc trị duy nhất được đưa vào phác đồ điều trị phản ứng TTNAT bên cạnh các biện pháp hỗ trợ điều trị khác. Tuy nhiên, không phải tất cả các bệnh nhân xuất hiện phản ứng TTNAT đều được điều trị kịp thời bằng thuốc dantrolene. Điều này có thể xảy ra ở các vùng nông thôn, vùng đang phát triển thiếu điều kiện chăm sóc y tế hoặc ở các quốc gia không có sẵn thuốc dantrolene. Chính vì vậy, các kinh nghiệm điều trị phản ứng TTNAT không sử dụng dantrolene là rất cần thiết. Bên cạnh đó, việc tiến hành các xét nghiệm di truyền phân tử như phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới đóng vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán TTNAT nhằm phát hiện các biến thể di truyền có liên quan đến phản ứng này. Với mục đích đưa công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới ứng dụng trong phân tích gen ở bệnh nhân xuất hiện phản ứng TTNAT, chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân tích ca lâm sàng tăng thân nhiệt ác tính trong phẫu thuật tim khi sử dụng thuốc gây mê dạng hít sevoflurane” với hai mục tiêu như sau: 1. Tổng quan được nguyên nhân, cơ chế của bệnh lý tăng thân nhiệt ác tính trong phẫu thuật thay van hai lá sử dụng thuốc gây mê đường hô hấp. 2. Ứng dụng được giải trình tự gen thế hệ mới và đánh giá được kết quả ở bệnh nhân tăng thân nhiệt ác tính. 2
  15. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Thuốc gây mê đường hô hấp dùng trong phẫu thuật 1.1.1. Lịch sử ra đời của thuốc gây mê đường hô hấp Câu chuyện về thuốc gây mê đường hô hấp bắt đầu khi ether được tổng hợp lần đầu tiên vào năm 1540, sau đó là nitơ oxit (N2O – khí cười) được ghi nhận có khả năng gây mê [37, 40]. Mặc dù vậy, cả N2O và ether đều không được sử dụng trong gây mê phẫu thuật cho đến giữa thế kỷ 19, nhờ William Morton chứng minh tính chất gây mê của diethyl ether vào năm 1846 [32, 37]. Lần lượt các thuốc gây mê bao gồm ether, N2O, chloroform, ethylene, cyclopropane, trichloroethylene và divinyl ether được đưa vào thực hành lâm sàng. Tuy nhiên, một số thuốc này đã bị ngừng sử dụng do có mùi khó chịu, dễ cháy nổ, biên độ an toàn hẹp và gây ra nhiều tác dụng phụ [3, 40]. Vào những năm 1950, fluroxene – tác nhân flo hóa đầu tiên được đưa vào thử nghiệm lâm sàng. Fluroxene có khả năng gây mê tốt trên động vật thí nghiệm nhưng đã bị thu hồi vào năm 1974 do nguy cơ gây cháy nổ của thuốc. Theo sau đó, các thuốc gây mê gồm halothane, methoxyflurane, enflurane, isoflurane, sevoflurane và desflurane lần lượt được tổng hợp, mở ra cuộc cách mạng của các thuốc gây mê halogen hóa [32, 37]. Hiện nay, vai trò của nitơ oxit trong gây mê cân bằng hiện đại vẫn gây tranh cãi [32]. Các thuốc gây mê halogen được sử dụng phổ biến hiện nay là isoflurane, sevoflurane, desflurane. Ngoài ra, xenon – một loại khí gây mê lý tưởng đã được nghiên cứu thử nghiệm vào năm 1951. Tuy nhiên, do chi phí sản xuất lớn nên việc sử dụng thuốc còn hạn chế [3, 43]. 1.1.2. Định nghĩa, phân loại và vai trò của thuốc gây mê đường hô hấp Thuốc gây mê đường hô hấp là một loại thuốc cơ bản được sử dụng trong gây mê cân bằng hiện đại, gây mê phẫu thuật và giảm đau [32, 42]. Thuốc gây mê đường hô hấp có hai loại: thể khí (N2O, xenon) và thể lỏng hóa hơi (halothane, enflurane, isoflurane, sevoflurane, desflurane). Lợi ích rõ ràng của thuốc gây mê là làm cho bệnh nhân mất cảm giác hoặc nhận thức về cơn đau, giãn cơ mà vẫn 3
  16. duy trì được các chức năng sống (tuần hoàn, hô hấp, chuyển hóa, bài tiết ). Trước và trong quá trình phẫu thuật, bác sĩ gây mê sẽ kiểm soát liên tục chức năng hô hấp và đường thở của bệnh nhân. Điều này cho phép bác sĩ thực hiện phẫu thuật mà không gây đau đớn hoặc chấn thương tinh thần ở bệnh nhân. Nhiều ca phẫu thuật không thể thực hiện được nếu bệnh nhân không được gây mê như phẫu thuật tim, ghép tạng và thay khớp [68]. 1.1.3. Đặc điểm các thuốc gây mê đường hô hấp 1.1.3.1. Cấu trúc hóa học, đặc tính vật lý Mỗi thuốc gây mê đường hô hấp đều có đặc tính hóa học như cấu trúc hóa học, trọng lượng phân tử và một số tính chất vật lý đặc trưng riêng cho từng loại như điểm sôi, tỷ trọng chất lỏng, áp suất hơi. Bảng 1.1 tổng hợp đặc tính hóa học và vật lý của một số thuốc gây mê đường hô hấp như halothane, enflurane, isoflurane, desflurane, sevoflurane và nitơ oxit. Bảng 1.1. Cấu trúc hóa học, tính chất hóa lý của một số thuốc gây mê đường hô hấp [1, 32]. Tên thuốc Cấu trúc hóa Trọng Điểm sôi Tỷ trọng Áp suất hơi học lượng °C ( ở 760 chất (mmHg) phân mmHg) lỏng (g/ ở 24/ ở tử mL) 25°C 20°C (25°C/ 4°C) Halothane 197,5 49 – 51 1,86 288 243 Enflurane 184,5 56,5 1,52 218 175 4
  17. Isoflurane 184,5 48,5 1,50 295 238 Desflurane 168,04 22,8 1,50 798 669 Sevoflurane 200,05 58,6 1,53 197 157 Nitơ oxit N2O 44,02 -88,5 44,8 39,8 Thuốc gây mê dễ bay hơi (halothane, enflurane, isoflurane, desflurane, sevoflurane) có áp suất hơi thấp, điểm sôi cao, dễ hóa lỏng ở nhiệt độ phòng (20°C). Thuốc gây mê dạng khí (N2O, xenon) có áp suất hơi cao, nhiệt độ sôi thấp và tồn tại ở dạng khí khi ở nhiệt độ phòng [68]. Áp suất riêng phần của isoflurane và sevoflurane ở nhiệt độ môi trường đủ để đạt được nồng độ thích hợp cho sử dụng lâm sàng với bình xịt thông thường. Áp suất riêng phần của desflurane cao (Bảng 1.1), đòi hỏi sử dụng máy hóa hơi riêng mà trong máy hóa hơi này, desflurane được làm nóng để đạt được áp suất hơi 1400 mmHg và áp suất hơi được điều chỉnh bởi hai điện trở biến thiên. N2O tồn tại ở thể khí ở áp suất và nhiệt độ môi trường, có thể phân phối qua đồng hồ lưu lượng [32]. Bên cạnh áp suất hơi và nhiệt độ sôi, độ hòa tan là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến dược động học của thuốc gây mê đường hô hấp. Desflurane có cấu trúc hóa học khác với isoflurane là trên gốc carbon - ethyl gắn với flo thay cho clo. Tương tự sevoflurane cũng được halogen hóa chỉ với flo. Chính sự thay thế này làm độ hòa tan trong máu của desflurane và sevoflurane thấp hơn isoflurane, gần bằng độ hòa tan của N2O [10]. Như vậy, các đặc tính hóa lý của một thuốc gây mê dạng hít quyết định hiệu quả lâm sàng và cách thức sử dụng của chúng, cụ thể là việc đạt được nồng độ 5
  18. điều trị tại mô trong CNS. Nồng độ tại vị trí ảnh hưởng có liên quan đến áp suất riêng phần của các tác nhân gây mê trong CNS, được biểu thị ở trạng thái cân bằng bởi nồng độ tại phế nang. Ngoài ra còn liên quan đến khả năng hấp thu thuốc từ phổi với độ hòa tan là đặc tính cơ bản và quan trọng trong động học của các thuốc gây mê đường hô hấp [32, 66]. 1.1.3.2. Đặc điểm dược động học Yếu tố ảnh hưởng đến hấp thu và giải phóng thuốc gây mê đường hô hấp Các thuốc gây mê đường hô hấp được đưa vào cơ thể qua trao đổi khí trong phế nang của phổi. Sự hấp thu thuốc từ phế nang vào máu và phân phối vào các vị trí cảm ứng trong CNS là những yếu tố quan trọng quyết định dược động học của các thuốc này. Về bản chất, sự hấp thu và giải phóng thuốc gây mê dạng hít phụ thuộc vào nồng độ thuốc trong phế nang và khả năng hấp thu của thuốc từ phế nang vào máu bởi tuần hoàn phổi. Hai yếu tố này được trình bày trong Bảng 1.2 [42, 43]. Bảng 1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến nồng độ thuốc gây mê đường hô hấp trong phế nang và khả năng hấp thu thuốc từ phế nang vào máu [43]. Nồng độ thuốc trong Khả năng hấp thu thuốc từ phế nang vào máu phế nang (1) Nồng độ hít vào của (1) Độ hòa tan (hệ số phân bố máu/ khí): Hệ số phân bố máu/ thuốc: Nồng độ khí () phản ánh độ hòa tan của thuốc mê dễ bay hơi thuốc gây mê trong trong máu.  là tỉ lệ nồng độ thuốc trong máu và khí khi phế nang (FA) thay áp suất riêng phần của chúng ở trạng thái cân bằng.  đổi phụ thuộc vào càng lớn, độ hòa tan của thuốc trong máu càng cao, dẫn nồng độ thuốc hít đến sự tăng hấp thu thuốc từ phế nang vào máu bởi tuần vào (FI). FI càng lớn, hoàn phổi. Nồng độ thuốc trong máu tăng mà áp suất FA càng tăng nhanh riêng phần của thuốc trong phế nang tăng chậm hơn, dẫn đến kéo dài thời gian gây mê và hồi phục sau gây mê.  6
  19. và khởi mê càng phụ thuộc vào nồng độ của các thành phần trong huyết nhanh. thanh như: albumin, globulin, triglyceride và cholesterol. (2) Thông khí phế nang: Các phân tử này liên kết với các phân tử thuốc gây mê, Tăng thông khí phế làm tăng độ hòa tan của thuốc trong máu. nang làm tăng áp (2) Lưu lượng máu qua phổi (cung lượng tim): Nếu không suất riêng phần của có shunt, lưu lượng máu qua phổi bằng cung lượng tim. thuốc trong phế Cung lượng tim cao dẫn đến khả năng hấp thu thuốc gây nang, dẫn đến gia mê từ phế nang vào máu lớn hơn và phân phối nhanh hơn tăng FA, tỉ lệ FA/ FI đến các mô bao gồm cả hệ TKTW. tăng nhanh (~ 1) và (3) Chênh lệch áp suất riêng phần của thuốc gây mê trong tốc độ khởi mê phế nang và tĩnh mạch: Sự hấp thu thuốc gây mê ở mô nhanh. gây ra sự khác biệt của áp suất riêng phần của thuốc trong (3) Dung tích cặn chức phế nang và tĩnh mạch. Sự chênh lệch này càng lớn, thời năng (FRC): Một gian khởi mê càng chậm. phần FRC làm loãng (4) Hiệu ứng thuốc thứ hai: Khi phối hợp N2O và thuốc gây nồng độ thuốc hít mê đường hô hấp khác, do khả năng hấp thu từ phế nang vào, áp suất riêng vào máu của N2O cao, làm tăng áp suất riêng phần của phần của thuốc thuốc sử dụng đồng thời. Tỉ lệ FA/ FI tăng làm tốc độ khởi giảm, dẫn đến tốc độ mê tăng. khởi mê chậm. Phân bố Sự hấp thu thuốc gây mê ở mô phụ thuộc vào các yếu tố sau: Lưu lượng máu ở mô, khả năng hòa tan của thuốc ở mô và chênh lệch áp suất riêng phần của thuốc gây mê trong máu động mạch và mô. Ở mô não, sự chênh lệch áp suất này cân bằng nhanh do được tưới máu nhiều. Mô mỡ có mức độ tưới máu thấp nên cần thời gian dài hơn để cân bằng áp suất. Ngoài ra, sự hấp thu cao và giải phóng chậm các phân tử thuốc gây mê từ mô mỡ dẫn đến tốc độ khởi mê chậm ở những bệnh nhân có khoang mỡ lớn. Khả năng hòa tan của thuốc gây mê trong mô khác với trong máu, phụ thuộc vào ái lực với lipid của thuốc. Tất cả các thuốc gây mê đường hô hấp hòa tan tốt trong mô mỡ và ít hòa tan trong các mô khác [32]. 7
  20. Desflurane hòa tan trong máu và mô kém hơn so với halothane, isoflurane, sevoflurane (hệ số phân bố mô/máu thấp). Chính vì vậy, nồng độ desflurane trong máu tăng nhanh trong quá trình gây mê và giảm nhanh trong phế nang khi đào thải. Ngoài ra, sự cân bằng nồng độ của desflurane ở mô và máu diễn ra nhanh hơn giúp kiểm soát nồng độ thuốc tại phế nang chính xác hơn trong quá trình duy trì gây mê [10]. Chuyển hóa Thuốc gây mê đường hô hấp được loại bỏ chủ yếu bằng thông khí, chỉ chuyển hóa ở mức độ rất nhỏ. Chính vì vậy, sự trao đổi chất của các thuốc này không đóng vai trò quan trọng trong việc ngừng tác dụng của thuốc mà liên quan tới độc tính thuốc gây ra. Chuyển hóa ở gan nhờ hệ thống CYP2E1 góp phần loại bỏ một số thuốc mê bay hơi, như halothane được thải trừ nhanh hơn so với enflurane trong quá trình hồi phục. Về mức độ chuyển hóa ở gan, thứ tự sắp xếp của các thuốc như sau: halothane > enflurane > sevoflurane > isoflurane > desflurane > N2O (Bảng 1.4) [43]. Thải trừ Ngược lại với quá trình hấp thu ban đầu, sau khi ngừng gây mê, áp lực riêng phần của thuốc gây mê ở phế nang và mô giảm. Thuốc mê sẽ được thải trừ chủ yếu qua đường hô hấp (thở ra) và cơ thể bước vào giai đoạn hồi phục sau gây mê. Thời gian hồi phục sau gây mê phụ thuộc vào tốc độ loại bỏ thuốc ra khỏi não. Tốc độ thải trừ của halothane và isoflurane chậm hơn so với N2O, desflurane và sevoflurane do halothane hòa tan gấp đôi trong mô não và tan trong máu gấp năm lần so với N2O và desflurane. Sự tăng tích lũy halothane hoặc isoflurane ở cơ, da và mỡ trong gây mê kéo dài (đặc biệt ở bệnh nhân béo phì) làm quá trình hồi phục sau gây mê chậm hơn [43, 68]. 1.1.3.3. Đặc điểm dược lực học Cơ chế tác dụng 8
  21. Trong quá trình nghiên cứu cách thức hoạt động của các thuốc gây mê halogen hóa, các nhà nghiên cứu đã đưa ra giả thuyết rằng các thụ thể của tế bào thần kinh đóng vai trò quan trọng trong cơ chế tác dụng của các thuốc này [29]. Trải qua vài thập kỉ, cơ chế hoạt động của thuốc gây mê dễ bay hơi tại các thụ thể g – aminobutyric loại A (GABAA) và các khí gây mê (N2O, xenon) ức chế tại các thụ thể N – methyl – D – aspartate đã được xác định. Ngoài ra, một số thuốc gây mê dạng hít khác gây tác dụng bằng cách ức chế các kênh ion kích thích, các thụ thể nicotinic và glutamate thần kinh [43, 66]. Cụ thể, thuốc gây mê đường hô hấp ức chế hoạt động kích thích của kênh trước synap, thông qua các thụ thể nicotinic, serotonergics và glutaminergic. Đồng thời, các phân tử thuốc làm tăng hoạt động ức chế của kênh sau synap qua thụ thể GABAA, glycine, AMPD và NMDA, gây ảnh hưởng đến việc giải phóng các chất dẫn truyền thần kinh, gây giảm dẫn truyền thần kinh qua các khớp thần kinh [66]. Kênh kali hai lỗ trong hệ TKTW cũng đóng vai trò nhất định trong cơ chế gây mê của thuốc gây mê đường hô hấp. Các kênh này phân phối rộng rãi trong CNS, tồn tại ở cả trước và sau synap. Halothane, isoflurane, sevoflurane và desflurane đã được xác định làm tăng cường hoạt động của các kênh này, dẫn đến sự siêu phân cực của màng tế bào, gây ảnh hưởng đến khả năng tạo ra hoạt động thần kinh và góp phần giải thích được hiệu quả gây mê của các thuốc trên [43]. Ảnh hưởng của thuốc gây mê dạng hít trên các cơ quan và hệ cơ quan Hiệu lực gây mê của thuốc gây mê đường hô hấp được mô tả bằng nồng độ thuốc tối thiểu trong phế nang (MAC). MAC là nồng độ tối thiểu trong phế nang của thuốc gây mê dạng hít đo ở áp suất 1 atm, ngăn cản đáp ứng vận động với các kích thích phẫu thuật ở 50% bệnh nhân [43]. Giá trị MAC thay đổi phụ thuộc vào tác nhân gây mê và độ tuổi của bệnh nhân. Ở trẻ sơ sinh, MAC của sevoflurane xấp xỉ 3,3% trong khi ở người trưởng thành (40 – 50 tuổi) là 2% [42]. Giá trị MAC của một số thuốc gây mê dạng hít được trình bày trong Bảng 1.4. Ảnh hưởng của thuốc gây mê đường hô hấp gây ra trên hệ thần kinh trung ương, hệ tim mạch, hệ hô hấp, trên thận, gan và cơ được tổng hợp trong Bảng 1.3. 9
  22. Bảng 1.3. Ảnh hưởng của thuốc gây mê đường hô hấp trên một số cơ quan và hệ cơ quan [43, 68]. Cơ quan và Ảnh hưởng của thuốc gây mê đường hô hấp hệ cơ quan Hệ TKTW Với giá trị MAC thấp (0,2 – 0,4), thuốc gây ức chế thần kinh gây bất động, mất trí nhớ, ngăn chặn sự hình thành ý thức ở vỏ não, đồi thị và hệ thống kích hoạt dạng lưới. Ngoài ra, các thuốc gây mê halogen làm giảm tốc độ trao đổi chất của não (CMR). Lưu lượng máu não (CBF) có thể tăng, giảm hoặc không đổi (phụ thuộc vào MAC). Ngoại trừ halothane, một số thuốc gây mê halogen khác có tác dụng giảm đau. Hệ tim mạch Thuốc làm giảm cung lượng tim và khả năng co bóp tim bình thường; gây giảm áp lực trung bình máu động mạch phụ thuộc liều và gây giãn mạch hệ thống. Nhìn chung các thuốc này có thể gây kích thích hệ thần kinh tự chủ gây tăng nhịp tim, nhưng halothane, enflurane, sevoflurane ít ảnh hưởng đến nhịp tim còn desflurane, isoflurane làm tăng nhịp tim đáng kể. Hệ hô hấp Thuốc làm giảm thông khí dẫn đến tăng áp lực CO2 máu động mạch (PaCO2), có thể dẫn đến suy hô hấp. Isoflurane và desflurane gây kích thích đường thở (ho hoặc khó thở) nên không sử dụng ở bệnh nhân bị co thắt phế quản. Gan, thận và Ở thận, thuốc làm giảm tốc độ lọc cầu thận (GFR) và lưu lượng cơ nước tiểu không đáng kể, thường hồi phục sau gây mê. Ở gan, thuốc gây mê dễ bay hơi có thể làm giảm tưới máu gan, đặc biệt khi sử dụng halothane nhiều lần gây tăng men gan liên tục, nhiễm độc gan. 10
  23. Thuốc gây mê đường hô hấp gây ra giảm trương lực cơ phụ thuộc liều, các thuốc gây mê halogen làm giãn cơ tử cung mạnh Bảng 1.4 trình bày những đặc điểm dược lý đặc trưng của một số thuốc gây mê dạng hít. Hầu hết các thuốc này đều có tác dụng mạnh với chỉ số điều trị dao động từ 2 đến 4, chính vì vậy, việc sử dụng chúng đòi hỏi kiến thức về tính chất hóa lý, dược động học và dược lực học của chúng trên các hệ thống khác nhau để phát huy tác dụng chính và ngăn ngừa các tác dụng phụ [32]. Bảng 1.4. Một số đặc điểm dược lý đặc trưng của thuốc gây mê đường hô hấp [3]. Tên thuốc Hệ số Hệ số MAC Chuyển Đặc điểm đặc trưng phân phân (%)2 hóa bố bố máu/ não/ khí máu N2O 0,47 1,1 > 100 Thường dùng phối hợp với thuốc gây mê đường hô hấp mạnh hơn để đạt hiệu ứng khí thứ 2. Khởi phát và phục hồi nhanh chóng. Halothane 2,35 1,9 0,75 > 40% Tốc độ khởi phát và phục hồi trung bình. Enflurane 1,91 1,3 1,7 8% Tốc độ khởi phát và phục hồi trung bình. Isoflurane 1,4 1,6 1,40 < 2% Tác dụng mạnh nhất trong các thuốc gây mê halogen. Khởi 11
  24. phát và phục hồi tương đối chậm. Desflurane 0,42 1,3 6 – 7 < 0,05% Khởi phát và phục hồi nhanh. Mùi hăng gây kích thích đường thở nên không thích hợp để gây mê. Sevoflurane 0,63 1,7 2,0 2 – 5% Thuốc gây mê đường hô hấp (fluoride) được sử dụng phổ biến nhất. Khởi phát và phục hồi nhanh chóng. Không có mùi hăng nên thích hợp để gây mê. Tác dụng phụ và độc tính của thuốc gây mê dạng hít Tác dụng phụ và độc tính của thuốc gây mê đường hô hấp bao gồm nhiễm độc thận, nhiễm độc gan, nhiễm độc thần kinh, tình trạng sốc gây mê, rối loạn nhịp tim, hạ huyết áp, buồn nôn và nôn sau phẫu thuật (PONV), ức chế hoặc kích thích hô hấp, tăng thân nhiệt ác tính, kích thích sau sinh, dị ứng và sốc phản vệ [27]. Các biến cố này có thể xảy ra trong thời gian phẫu thuật hoặc sau khi kết thúc phẫu thuật. Độc tính cấp tính và mạn tính của các thuốc gây mê đường hô hấp được trình bày trong Bảng 1.5. Bảng 1.5. Độc tính cấp tính và mạn tính của thuốc gây mê đường hô hấp [68]. Độc tính cấp tính Độc tính mạn tính (1) Nhiễm độc thận: Quá trình chuyển hóa của (1) Gây đột biến, quái thai, ảnh enflurane và sevoflurane có thể tạo ra các hợp chất hưởng đến sinh sản: Tính gây gây độc cho thận. Khi tiếp xúc với enflurane kéo đột biến, quái thai của thuốc dài, các ion florua được giải phóng gây nhiễm độc mê dạng hít đã xảy ra ở động thận. Sevoflurane có thể bị phân hủy bới chất hấp vật, chưa xuất hiện ở con 12
  25. phụ CO2 trong máy gây mê, tạo thành hợp chất người. Tuy nhiên, một số vinyl ether (hợp chất A). Hợp chất này gây hoại trường hợp sử dụng thuốc gây tử ống thận ở chuột, chưa có báo cáo ở người. mê trong phẫu thuật không (2) Nhiễm độc máu: Tiếp xúc kéo dài với N2O làm liên quan đến thai nhi ở phụ giảm tổng hợp methionine, gây thiếu máu nữ có thai có thể làm tăng megoloblastic. Ngoài ra, tương tác giữa thuốc gây nguy cơ phá thai. mê dạng hít (desflurane) với các chất hấp phụ CO2 (2) Gây ung thư: Các nghiên cứu khô tạo ra khí CO. CO liên kết với hemoglobin dịch tễ đã chỉ ra tỉ lệ mắc bệnh làm giảm cung cấp O2 tới các mô trong cơ thể. ung thư gia tăng ở các nhân (3) Nhiễm độc gan: Tỉ lệ nhiễm độc gan nặng sau khi viên phẫu thuật, người tiếp tiếp xúc với halothane được ước tính nằm trong xúc với thuốc gây mê. Tuy khoảng 1:20000 – 35000 với cơ chế chưa rõ ràng. nhiên, hiện nay không có (4) Tăng thân nhiệt ác tính. nghiên cứu nào giải thích được sự gia tăng này. Đa số các thuốc gây mê đường hô hấp tương đối lành tính đối với bệnh nhân xảy ra phản ứng bất lợi cấp tính, ngoại trừ phản ứng TTNAT. Trước đây, halothane là tác nhân phổ biến nhất gây ra phản ứng này. Tuy nhiên hiện nay, các báo cáo đã cho thấy tất cả các thuốc gây mê lỏng dễ bay hơi đều gây ra phản ứng TTNAT, được trình bày cụ thể trong phần tiếp theo [6]. 1.2. Phản ứng tăng thân nhiệt ác tính 1.2.1. Định nghĩa Tăng thân nhiệt ác tính là một rối loạn gen liên quan đến thuốc (pharmacogenetic) của hệ cơ xương liên quan đến tăng chuyển hóa mất kiểm soát, có thể gây tử vong. TTNAT xuất hiện ở những người nhạy cảm với một số thuốc gây mê đường hô hấp (halothane, isoflurane, sevoflurane, desflurane), thuốc giãn cơ succinylcholine nhất định hoặc do catecholamine sinh ra trong trường hợp căng thẳng. Phần lớn bệnh nhân mắc bệnh cơ lõi trung tâm (CCD), bệnh multi – minicore (MmCD) và hội chứng King – Denborough dễ xuất hiện phản ứng 13
  26. TTNAT. Ngoài ra, một số nghiên cứu đã chỉ ra bệnh nhược cơ của người Mỹ bản địa (Native American myopathy) liên quan đến tính nhạy cảm với TTNAT [25]. 1.2.2. Đặc điểm dịch tễ học phản ứng tăng thân nhiệt ác tính 1.2.2.1. Tình hình phản ứng tăng thân nhiệt ác tính trên thế giới Phản ứng TTNAT hiếm xảy ra với tỉ lệ dao động từ 1:15000 – 1:75000, có thể xuất hiện ngay lần đầu tiên bệnh nhân tiếp xúc với các tác nhân gây mê. TTNAT xuất hiện ở nam giới thường xuyên hơn so với nữ giới với tỉ lệ xấp xỉ 2:1. Số liệu thu thập được tại đơn vị TTNAT ở Leeds từ năm 1990 – 2014 đã chỉ ra kết quả xét nghiệm dương tính với TTNAT ở nam giới (42%) cao hơn so với nữ (37%). Điều này có thể là ngẫu nhiên do nam giới cần can thiệp phẫu thuật nhiều hơn nữ giới hoặc do can thiệp trên lâm sàng ở nam nhạy cảm với TTNAT hơn ở nữ [23, 25]. Tính nhạy cảm với TTNAT xuất hiện ở các cá nhân đến từ tất cả các nhóm dân tộc trên thế giới (Châu Á, Châu Âu, Trung Đông và Châu Phi) với mọi lứa tuổi khác nhau (từ sáu tháng tuổi đến 78 tuổi). Tỷ lệ mắc bệnh cao nhất ở người trẻ tuổi với độ tuổi trung bình của các bệnh nhân trải qua phản ứng TTNAT là 18,3 tuổi. Trong đó, trẻ em dưới 15 tuổi chiếm 52,1% trong các trường hợp. Vào cuối những năm 1970, sau khi giới thiệu thuốc đặc trị TTNAT (dantrolene), tỷ lệ tử vong do TTNAT đã giảm từ 80% xuống dưới 5%. Tuy nhiên, trong thập kỷ đầu tiên của thế kỷ 21, tỷ lệ tử vong đã tăng lên 14% [23, 25]. Mặc dù tỉ lệ xuất hiện TTNAT là rất thấp nhưng tỉ lệ mắc các bất thường về mặt di truyền liên quan đến tính nhạy cảm với TTNAT khoảng 1:2000 – 1:3000 [23, 80], với ước tính gần đây là một trong 400 cá thể [11]. Các báo cáo đã chỉ ra rằng TTNAT không chỉ xảy ra ở người, mà còn được mô tả ở một số loài động vật khác như lợn, ngựa, chó [25]. 1.2.2.2. Tình hình phản ứng tăng thân nhiệt ác tính tại Việt Nam 14
  27. Tại Việt Nam, trong vòng 10 năm qua đã ghi nhận ca lâm sàng đầu tiên về phản ứng TTNAT được phát hiện và điều trị tại Bệnh viện E, được trình bày và phân tích ở Chương II và Chương III. 1.2.3. Sinh lý bệnh tăng thân nhiệt ác tính Bệnh nhân nhạy cảm với TTNAT có bất thường di truyền thụ thể ở cơ xương, gây tăng nồng độ cấp tính Ca2+ nội bào cơ vân khi tiếp xúc với một số tác nhân gây mê. Cơ chế gây ra phản ứng TTNAT của thuốc gây mê tương tác với các thụ thể bất thường này chưa được xác định, tuy nhiên có thể liên quan đến rối loạn vận chuyển Ca2+ qua thụ thể ryanodine (RyR1) mà nguyên nhân chính là do chức năng bất thường của cặp kích thích – co cơ (excitation – contraction) (EC) [7, 19]. Phức hợp EC bao gồm hai thành phần: Thành phần thứ nhất là hệ thống ống T với thụ thể dihydropyridine (DHPR) nằm trên bề mặt màng hệ thống ống T, được mã hóa bởi gen CACNA1S và rất nhạy cảm với sự thay đổi điện thế của màng bao cơ. Các DHPR có cấu trúc giống với kênh canxi loại L, nhưng không có chức năng như kênh canxi mà hoạt động như một bộ phận cảm ứng điện thế. Thành phần còn lại của EC là màng lưới nội chất của tế bào cơ có chứa các thụ thể RyR1 – kênh phóng thích Ca2+ của hệ võng nội bào (sarcoplasmic reticulum – SR). Khi điện thế động truyền đến các cảm biến điện áp trong ống T (DHPR) gây ra thay đổi hình dạng của thụ thể này. Các DHPR tương tác với RyR1 làm thay đổi hình dạng của RyR1, Ca2+ được giải phóng vào tương bào cơ vân theo sự chênh lệch nồng độ, dẫn đến sự co cơ bằng cách bắt đầu liên kết ngang của các siêu sợi actin và myosin (Hình 1.1) [9, 18, 81]. 15
  28. Hình 1.1. Quá trình phóng thích và bắt lại Ca2+ giữa võng nội bào và tương bào cơ vân [81]. Trong giai đoạn đầu của TTNAT, sự tăng phóng thích Ca2+ được bù trừ bằng cách tăng bắt lại Ca2+ vào SR nhằm duy trì cân bằng nội môi. Tuy nhiên, hoạt động tái hấp thu Ca2+ này thông qua một bơm phụ thuộc ATP (Ca2+- ATPase). Điều này làm tăng nhu cầu chuyển hóa glucose để cô lập Ca2+, gây ra sự tăng sản sinh CO2 và tiêu thụ O2. CO2 tăng làm tăng thân nhiệt, kích thích hệ thần kinh giao cảm dẫn đến kích thích tim – hô hấp. Khi sự giải phóng Ca2+ không thể kiểm soát, nồng độ Ca2+ nội bào tăng gây hoạt hóa các sợi cơ và sự co cơ. Sự gắn kết liên tục actin và myosin trong co cơ cần sự thoái giáng ATP dẫn đến chuyển hóa ngày càng tăng, quá trình sinh nhiệt tăng, độ cứng cơ tiến triển và tăng ly giải cơ vân. Rối loạn ban đầu là nhiễm toan hô hấp. Ly giải cơ vân dẫn đến tăng kali máu, giải phóng creatine kinase (CK) và myoglobin gây loạn nhịp tim và suy thận cấp. Tăng 16
  29. thân nhiệt và tiêu cơ vân có xu hướng gây đông máu nội mạch lan tỏa (DIC) [25, 39, 81]. 1.2.4. Biểu hiện lâm sàng, chẩn đoán và điều trị tăng thân nhiệt ác tính 1.2.4.1. Biểu hiện lâm sàng TTNAT có thể xảy ra bất cứ thời điểm nào trong quá trình gây mê hoặc trong vòng 1 giờ hay lâu hơn sau khi chấm dứt quá trình gây mê. Dấu hiệu sớm nhất là nhịp tim nhanh, tăng nồng độ CO2 cuối kỳ thở ra (ETCO2) kèm theo cứng cơ. Nếu succinylcholine được sử dụng trong quá trình gây mê thì các biểu hiện lâm sàng diễn ra nhanh chóng hơn, tăng huyết áp, tăng nhiệt độ rõ rệt và rối loạn nhịp tim diễn ra trong vòng 5 đến 10 phút [25]. Trong hầu hết các trường hợp, các biểu hiện đầu tiên của TTNAT thường xảy ra trong phòng mổ. Dấu hiệu ban đầu điển hình thường là ETCO2 tăng, nhịp tim nhanh, sau đó huyết áp có thể tăng thường liên quan đến rối loạn nhịp thất gây ra bởi kích thích hệ thống thần kinh giao cảm từ việc tăng nồng độ CO2 trong máu, nhiễm toan chuyển hóa. Sau đó, bệnh nhân có biểu hiện cứng cơ, tăng trương lực cơ và nhiệt độ cơ thể có thể tăng 1-2o cứ sau 5 phút. Nếu không được điều trị kịp thời, thiếu máu cơ tim và tiêu cơ vân dẫn đến tăng K+ máu, myoglobin niệu có thể dẫn đến suy thận cấp biểu hiện bằng nước tiểu màu cola và DIC [23, 25]. Một số rối loạn trên lâm sàng phổ biến được tổng kết trong Hình 1.2. Tăng nồng độ Ca2+ nội bào trong cơ vân Tăng chuyển hóa Tiêu cơ vân Tăng huyết áp Tăng nồng độ CK và K+ trong huyết thanh Giảm oxy máu Loạn nhịp tim Nhịp tim nhanh Thiếu máu cục bộ Toan chuyển hóa Suy thận Cạn kiệt ATP Tăng thân nhiệt Hình 1.2. Biểu hiện lâm sàng đặc trưng của bệnh TTNAT [26]. 17
  30. 1.2.4.2. Tiêu chuẩn chẩn đoán Việc chẩn đoán TTNAT được dựa trên các biểu hiện lâm sàng hoặc các thử nghiệm trong phòng thí nghiệm. Những đặc trưng quan trọng trong chẩn đoán TTNAT là sự gia tăng không giải thích được của nồng độ ETCO2, cứng cơ, nhịp tim nhanh, toan chuyển hóa, tăng thân nhiệt và tăng K+ máu. Sự thay đổi trong thứ tự và thời điểm xuất hiện các biểu hiện làm cho chẩn đoán lâm sàng khó khăn hơn [25]. Thang điểm lâm sàng Thang điểm lâm sàng được xây dựng bởi Larach và cộng sự để hỗ trợ cho chẩn đoán lâm sàng. Các yếu tố được liệt kê trong Bảng 1.6. Mỗi yếu tố được cho một số điểm khác nhau. Tuy nhiên, thang điểm thiếu độ nhạy do không phải yếu tố nào cũng được kiểm tra trong mỗi ca bệnh [25]. Tổng cộng 50 điểm hầu như chắc chắn là TTNAT, tổng cộng từ 35-49 thì rất có thể là TTNAT. Bảng 1.6. Các tiêu chí được dùng trong thang điểm lâm sàng cho bệnh TTNAT [46]. Quá trình Biểu hiện Điểm 1. Độ a. Cứng cơ tổng quát (không có rung mình do hạ thân nhiệt, trong 15 cứng hoặc ngay sau khi dùng thuốc gây mê dạng hít) b. Co thắt Masseter ngay sau khi dùng succinylcholine 15 2. Suy a. Tăng CK > 20000 IU sau khi dùng thuốc mê có 15 nhược cơ succinylcholine bắp b. Tăng CK > 10000 IU sau khi dùng thuốc mê không có 15 succinylcholine c. Nước tiểu màu cola trong giai đoạn phẫu thuật 10 d. Myoglobin trong nước tiểu > 60 μg/L 5 e. Myoglobin huyết thanh > 170 μg/L 5 18
  31. f. K+ trong máu /huyết tương/huyết thanh > 6 mEq/L (không có 3 suy thận) 3. Nhiễm a. PETCO2 > 55 mmHg với sự lọc máu bằng dưỡng khí được kiểm 15 toan hô soát tốt hấp b. PaCO2 động mạch > 60 mmHg với sự lọc máu bằng dưỡng khí 15 được kiểm soát tốt c. PETCO2 > 60 mmHg với sự lọc máu bằng dưỡng khí tự phát 15 d. PaCO2động mạch > 65 mmHg với sự lọc máu bằng dưỡng khí 15 tự phát e. Tăng CO2 máu bất thường 15 f. Thở nhanh bất thường 10 4. Tăng a. Tăng thân nhiệt nhanh bất thường 15 thân nhiệt b. Tăng thân nhiệt bất thường > 38,8°C (101,8°F) trong giai đoạn 10 phẫu thuật 5. Liên a. Nhịp xoang nhanh bất thường 3 quan tim b. Nhịp tim nhanh hoặc rung tâm thất 3 Phương pháp chẩn đoán trong phòng thí nghiệm Thí nghiệm co rút Tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán TTNAT hiện nay là thí nghiệm co rút in vitro, dựa vào sự co rút của các sợi cơ trong sự xuất hiện của halothane hoặc caffeine. Hai dạng của thí nghiệm này đã được phát triển là IVCT do Hội tăng thân nhiệt ác tính châu Âu (EMHG) và CHCT do Hội tăng thân nhiệt ác tính Bắc Mỹ (NAMHG). Theo protocol của EMHG, một người được cho là nhạy cảm với TTNAT khi cả kết quả của thí nghiệm với halothane và caffeine đều dương tính. Một người được cho là không nhạy cảm với TTNAT khi kết quả của cả 2 thí nghiệm đều âm tính. Một người cũng được chẩn đoán là nhạy cảm với TTNAT 19
  32. khi kết quả của 1 trong 2 thí nghiệm là dương tính và được biểu thị là MHS(h) hoặc MHS(c). Protocol của NAMHG cũng tương tự nhưng có sự khác biệt ở nồng độ sử dụng và một số thông số. Protocol của EMHG đạt độ nhạy 99% và độ đặc hiệu 94%; trong khi của NAMHG lần lượt là 97% và 78%. Độ đặc hiệu của thí nghiệm này có thể bị ảnh hưởng bởi các rối loạn thần kinh cơ không liên quan đến TTNAT [25]. IVCT rất đắt đỏ, chỉ được thực hiện ở các trung tâm thử nghiệm chuyên biệt và có thể thu được kết quả dương tính giả hoặc âm tính giả [25]. Xét nghiệm di truyền phân tử Giải trình tự DNA mang đến phương án thay thế cho IVCT, chỉ yêu cầu mẫu máu. Trong khi giải trình tự DNA truyền thống tốn nhiều thời gian và công sức, sự xuất hiện của giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) cung cấp một công cụ nhanh, năng suất cao với chi phí hiệu quả cho chẩn đoán và tìm kiếm các biến thể. Bảng 1.7. Xét nghiệm di truyền phân tử dùng trong chẩn đoán TTNAT [26]. Gen Tỷ lệ TTNAT Tỷ lệ các biến thể gây bệnh được phát hiện được quy cho các bằng phương pháp biến thể gây bệnh Phân tích trình tự Phân tích sự xóa/sao trong gen chép gen đích CACNA1S ~1% ~100% Chưa biết RYR1 50%-60% ~100% 2 họ STAC3 <1% ~100% Chưa biết Chưa biết Tới 40% Chưa có dữ liệu Việc xác định các biến thể không có ý nghĩa lâm sàng rất quan trọng trong việc chẩn đoán TTNAT theo xét nghiệm di truyền phân tử do kích thước lớn của gen RYR1 cùng số lượng lớn các biến thể chưa được biết gây khó khăn trong phân tích kết quả. Chính vì vậy, giải trình tự toàn bộ exon theo phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới đã và đang được sử dụng phổ biến trong chẩn đoán lâm sàng, 20
  33. nhằm phát hiện biến thể liên quan đến TTNAT, hỗ trợ trong chẩn đoán và phòng ngừa các đợt TTNAT [25]. 1.2.4.3. Biện pháp điều trị và thuốc dantrolene Biện pháp điều trị Điều trị TTNAT được thực hiện bằng cách sử dụng kịp thời dantrolene, làm mát cơ thể bệnh nhân đến nhiệt độ không quá 38,50C, giảm thông khí và các biện pháp hỗ trợ khác (Bảng 1.8). Bảng 1.8. Điều trị nguyên nhân và điều trị triệu chứng trong đợt TTNAT cấp [23, 81]. Điều trị nguyên nhân Điều trị triệu chứng Dừng tác nhân gây TTNAT Thông báo cho bác sĩ phẫu thuật để kết thúc phẫu thuật (thuốc gây mê dễ bay hơi càng sớm càng tốt. Nếu phẫu thuật không thể dừng lại, và succinylcholine), ngắt sử dụng gây mê đường tĩnh mạch. kết nối với máy hóa hơi. Tăng thể tích hô hấp mỗi Ổn định huyết động học và bắt đầu liệu pháp chống phút 2-4 lần với oxy 100% loạn nhịp tim nếu cần thiết. Rối loạn nhịp tim có thể ít nhất 10 L/phút ở luồng điều trị bằng 10 – 30 mg/kg CaCl2 tiêm tĩnh mạch hoặc khí cao nhất. các thuốc chống loạn nhịp tiêu chuẩn như amiodadrone 150 – 300 mg cho người lớn. Bắt đầu sử dụng dantrolene Hạ nhiệt bên trong và bên ngoài. Làm mát bề mặt cơ 2,5 mg/kg. thể bằng quạt, tấm ướt , túi nước đá đặt ở nách và háng . Tiếp tục gây mê với thuốc Mở rộng theo dõi huyết động, chèn động mạch và tĩnh không có tác nhân gây mạch chủ nếu cần. TTNAT. Tiếp tục sử dụng Điều trị toan chuyển hóa, tăng K+ máu bằng dantrolene sau 5 đến 10 bicarbonate và/ hoặc glucose và insulin tiêm tĩnh mạch 21
  34. phút cho tới khi trạng thái (10 đơn vị insulin trong 50 ml glucose 50% được chuẩn lâm sàng ổn định. độ tới mức nồng độ K+). Ngăn ngừa suy thận cấp bằng cách hydrat hóa và/ hoặc sử dụng mannitol, thuốc lợi tiểu (furosemide). Khi bệnh nhân ổn định huyết động, chuyển đến phòng chăm sóc đặc biệt trong ít nhất 24 giờ. Các chỉ số của sự ổn định bao gồm: ETCO2 giảm hoặc bình thường; không có rối loạn nhịp tim, tăng thân nhiệt và cứng cơ [23, 81]. Dantrolene Dantrolene là một chất ức chế giải phóng Ca2+ từ SR trong cơ xương, là thuốc duy nhất hiện có được sử dụng trong lâm sàng để điều trị TTNAT hiệu quả [7, 52]. Các nghiên cứu đã xác định thụ thể RyR1 của SR là một vị trí gắn kết dantrolene, gây ức chế trực tiếp hoặc gián tiếp thụ thể này, dẫn đến giảm nồng độ Ca2+ nội bào cơ xương. Dantrolene không chỉ được sử dụng để điều trị TTNAT, mà còn trong điều trị hội chứng ác tính thần kinh, co cứng và nhiễm độc thuốc lắc. Cấu trúc hóa học và một số đặc tính dược động học của dantrolene được trình bày trong Bảng 1.9. Nhược điểm chính của dantrolene là khả năng hòa tan trong nước kém, gây khó khăn trong việc chuẩn bị thuốc để tiêm tĩnh mạch trong tình huống khẩn cấp [7]. Tác dụng bất lợi của dantrolene trong điều trị ngắn hạn không đáng kể, bao gồm viêm tĩnh mạch khoảng 9% các trường hợp, yếu cơ tạm thời khoảng 21%, rối loạn tiêu hóa 4% và tổn thương hô hấp ở bệnh nhân rối loạn cơ từ trước [16]. Bảng 1.9. Cấu trúc hóa học và đặc tính dược động học của dantrolene [16]. Cấu trúc hóa học 22
  35. Đặc Hấp Đường uống: 70% liều dantrolene được hấp thu. Nồng độ tính thu, dantrolene trong huyết tương đạt cực đại khoảng 6 giờ. dược phân Đường tiêm tĩnh mạch: Nồng độ dantrolene trong huyết tương động bố là 4,2 g/ml với liều 2,4 mg/kg. học T1/2= 12 giờ. Chuyển Được chuyển hóa bởi microsome gan tạo thành 5 – hóa hydroxydantrolene, hoạt động như một chất giãn cơ xương hoặc chuyển hóa thành dẫn xuất acetyl hóa khử của dantrolene. Thải Dantrolene và các chất chuyển hóa của thuốc được thải trừ chủ trừ yếu qua nước tiểu và mật. Hiện nay có hai chế phẩm dantrolene có sẵn. Phiên bản thông thường Dantrium®, có sẵn trong các lọ 20 mg với độ hòa tan kém, mỗi lọ cần 60ml nước vô trùng để pha loãng. Do đó, cần sử dụng 8 – 10 ống để điều trị TTNAT ở người trưởng thành. Ryanodex® là một chế phẩm thay thế mới được FDA phê chuẩn với độ hòa tan đã được cải thiện, có sẵn trong ống 250 mg chỉ cần 5 ml dung dịch nước vô trùng để pha lại. Chính vì vậy, điều trị ban đầu đạt được chỉ với một ống [25]. Một chất tương tự dantrolene – azumolene có tiềm năng trong việc giãn cơ trong một trường hợp TTNAT ở lợn. Tuy nhiên, bởi những cân nhắc về kinh tế nên không được đưa vào thực hành lâm sàng [16]. 1.3. Phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) 1.3.1. Lịch sử phát triển Khởi đầu với phát hiện cơ bản đầu tiên về cấu trúc của DNA vào năm 1953 [60], các phương pháp nhằm phát hiện trình tự DNA được phát triển và hoàn thiện theo thời gian. Vào những năm 1970, Sanger và cộng sự [56], Maxam và Gilbert [49] đã phát triển các phương pháp giải trình tự DNA nhằm cung cấp công cụ để giải mã hoàn chỉnh các gen và toàn bộ hệ gen. Trong đó, kỹ thuật giải trình tự Sanger yêu cầu xử lý ít hóa chất độc hại và đồng vị phóng xạ hơn phương pháp của Maxam và Gilbert, nên đã trở thành phương pháp giải trình tự DNA phổ biến 23
  36. trong 30 năm sau [8, 71]. Đồng thời, những đổi mới về hóa chất và thiết bị đã hỗ trợ cho sự khởi đầu của Dự án bộ gen người với bản thảo đầu tiên được đưa ra vào năm 2001 và hoàn thiện vào năm 2004 [15, 17, 33]. Tuy nhiên, Dự án bộ gen người đòi hỏi không chỉ thời gian, nguồn lực, mà cần công nghệ nhanh hơn, lưu lượng xử lý cao hơn và giá thành rẻ hơn ở thời điểm bấy giờ. Chính vì vậy, năm 2004, Viện nghiên cứu bộ gen người quốc gia (National Human Genome Research Institute – NHGRI) đã khởi xướng một chương trình tài trợ với mục tiêu giảm chi phí giải trình tự bộ gen người xuống 1000$ trong vòng 10 năm. Điều này đã kích thích sự phát triển và thương mại hóa các công nghệ giải trình tự tiếp theo (Next Generation Sequencing – NGS) [8]. Kể từ đó, hàng chục công ty và công nghệ giải trình tự thế hệ tiếp theo được tạo ra vào giữa những năm 2000, cùng với lĩnh vực tin sinh học, đã bùng nổ như một ngành khoa học và đào tạo chính [2, 71]. 1.3.2. Khái niệm và ứng dụng của công nghệ giải trình tự tiếp theo 1.3.2.1. Khái niệm Giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS) là phương pháp giải trình tự đồng thời hàng triệu đoạn DNA (hoặc DNA bổ sung), được áp dụng phổ biến trong phòng thí nghiệm lâm sàng bởi khả năng phân tích đồng thời một số gen hoặc vùng gen với thử nghiệm đơn so với các phương pháp truyền thống đã biết [85]. Với NGS, toàn bộ bộ gen của con người có thể được giải trình tự trong vòng một ngày. Ngược lại, sử dụng công nghệ giải trình tự Sanger trước đây phải cần hơn một thập kỷ để đưa ra kết quả cuối cùng [71]. Những phương pháp giải trình tự mới này đưa đến ba cải thiện chính: Thứ nhất, thay vì yêu cầu nhân bản các đoạn DNA của vi khuẩn, các thư viện DNA được chuẩn bị trong một hệ thống không có sự có mặt của tế bào. Thứ hai, thay vì hàng trăm thì hàng ngàn đến hàng triệu phản ứng được tạo ra song song. Thứ ba, đầu ra giải trình tự được phát hiện trực tiếp mà không cần điện di; đồng thời thẩm vấn cơ sở dữ liệu được thực hiện song song và theo chu kỳ. Số lượt đọc khổng lồ do NGS tạo ra đã cho phép giải trình tự toàn bộ bộ gen với tốc độ nhanh chóng [8]. 24
  37. 1.3.2.2. Ứng dụng Với sự phát triển nhanh chóng và ứng dụng rộng rãi của các phương pháp NGS, thông tin giải trình tự bộ gen được cung cấp cho các nghiên cứu quy mô lớn như exomics, di truyền học sinh thái (metagenomics), di truyền học biểu sinh (epigenomics) và nghiên cứu ở mức độ phiên mã gen (transcriptomics). Giải trình tự bộ gen không chỉ cung cấp kiến thức cho các nghiên cứu cơ bản, mà còn hỗ trợ nhằm đạt được mục tiêu giải mã bí ẩn của cuộc sống, tạo ra cây trồng và vật nuôi phát triển tốt hơn, năng suất cao hơn; cải thiện chẩn đoán, tiên lượng phương pháp điều trị ung thư và các bệnh phức tạp khác, nâng cao chất lượng cuộc sống con người. Các ứng dụng của NGS có thể kể đến như: giải trình tự de novo, mate – pair, giải trình tự RNA, giải mã hệ phiên mã, xác định đa hình trình tự hệ gen hoặc vùng gen đích, di truyền học biểu sinh và di truyền học sinh thái [47]. 1.3.3. NGS qua các thế hệ 1.3.3.1. Giải trình tự thế hệ thứ nhất Các phương pháp đầu tiên được sáng lập nhằm giải trình tự DNA gồm phương pháp giải trình tự Sanger [56] và phương pháp phân tách hóa học của Maxam và Gilbert [49]. Phương pháp của Maxam và Gilbert dựa trên sự biến đổi hóa học của DNA và sự phân cắt mạch chính DNA tại các vị trí liền kề với các nucleotide đã biến đổi. Giải trình tự Sanger sử dụng các nucleotide chấm dứt chuỗi (dideoxy nucleotide – ddNTPs) thiếu nhóm 3’ – OH để dừng ngẫu nhiên phản ứng tổng hợp chuỗi DNA do ngăn chặn sự hình thành liên kết phosphodiester bởi enzyme DNA polymerase. Kết quả tạo ra các đoạn DNA bổ sung với độ dài ngắn khác nhau. Các ddNTP được gắn phóng xạ hoặc huỳnh quang để phát hiện sản phầm cuối cùng trên các bản gel điện di, hoặc bằng các máy giải trình tự tự động để xác định trình tự gen (Hình 1.3). Mặc dù giải trình tự gen bằng phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert đã được sửa đổi nhằm loại bỏ hóa chất và thuốc thử độc hại, phương pháp giải trình tự Sanger vẫn phổ biến hơn và trở thành tiêu chuẩn giải trình tự với nhiều ứng dụng cho đến nay [82]. 25
  38. Hình 1.3. Quy trình giải trình tự Sanger. Được công bố vào năm 1977, mặc dù phương pháp giải trình tự Sanger tương đối chậm so với các tiêu chuẩn NGS hiện nay, nhưng với những cải tiến trong phương pháp chấm dứt chuỗi, tự động hóa và thương mại hóa, phương pháp này vẫn được sử dụng trong thí nghiệm lâm sàng. Những đổi mới quan trọng nhất trong giải trình tự Sanger được kể đến như: sự phát triển của thuốc nhuộm huỳnh quang, sử dụng trình tự chu trình nhiệt để giảm số lượng DNA đầu vào và ổn định polymerase để kết hợp và kết thúc chính xác bằng cách nhuộm huỳnh quang vào các chuỗi DNA đang tổng hợp, phát triển phần mềm để phân tích các trình tự [82]. 1.3.3.2. Giải trình tự thế hệ thứ hai Sau phương pháp Sanger, thuật ngữ giải trình tự thế hệ thứ hai, thứ ba, được sử dụng cho các công nghệ giải trình tự DNA tiếp theo. Các phương pháp giải trình tự thế hệ thứ hai được chia thành hai nhóm chính: giải trình tự bằng cách lai và giải trình tự bằng phương pháp tổng hợp (Sequencing by synthesis – SBS). Giải trình tự bằng cách lai Được phát triển vào những năm 1980, phương pháp này sử dụng các oligonucleotide DNA (đầu dò) được sắp xếp theo trình tự đã biết trên các bộ lọc, lai với các đoạn DNA chứa các dấu ấn sinh học. Sau khi lai, các DNA không nhắm 26
  39. đích bị rửa trôi và mẫu được làm giàu để rửa giải và giải trình tự. Giải trình tự bằng phương pháp lai phần lớn đã chuyển sang các công nghệ phụ thuộc vào việc thăm dò cụ thể để thẩm vấn các trình tự, như các ứng dụng chẩn đoán để xác định đa hình đơn nucleotide (SNPs) trong gen hoặc xác định các bất thường NST (sắp xếp lại, xóa, nhân đôi, sao chép các biến thể số) [38]. Giải trình tự bằng phương pháp tổng hợp (SBS) Các phương pháp SBS là sự phát triển tiếp theo của trình tự Sanger với đặc điểm không có các đầu tận cùng dideoxy, các chu trình tổng hợp, hình ảnh và phương pháp lặp đi lặp lại để kết hợp các nucleotide bổ sung trên mạch đang được tổng hợp. Thoạt nhìn, các phương pháp này có vẻ tốn kém chi phí, nhưng những phản ứng thường chạy song song ở các thể tích nanolit, picolit hoặc zeptolit trong buồng nhỏ. Do đó, chi phí giải trình tự cho mỗi cặp bazơ không quá tốn kém. Các phương pháp SBS được trình bày trong Bảng 1.10. Bảng 1.10. Một số kỹ thuật giải trình tự bằng phương pháp tổng hợp (SBS) [2, 82]. Tên kỹ Khái niệm Tóm tắt quy trình thuật 454 Là phương pháp giải Các đoạn DNA riêng lẻ (400 – 700bp) được gắn pyrose- trình tự thế hệ thứ vào các adapter tạo ra thư viện sst – DNA mạch quenci- hai lần đầu tiên được đơn. Các adapter làm trình tự mồi cho emPCR ng đưa ra thị trường, trong phản ứng khuếch đại PCR nhũ tương. Sau dựa trên sự phát hiện đó, tiến hành giải trình tự các đoạn DNA bằng pyrophosphate (PPi) phát hiện hóa học các phản ứng tổng hợp DNA với giải phóng khi dNTP sự tham gia của dNTP, PPi giải phóng được đo được thêm vào chuỗi bằng máy ảnh và nguồn sáng, xảy ra trong buồng DNA đang tổng hợp. kích thước picolit. Ion Là kĩ thuật giải trình Sau khi tạo ra thư viện DNA và khuếch đại bằng Torrent tự thông qua việc PCR nhũ tương, các đoạn DNA được giải trình tự 27
  40. Sequen- phát hiện tín hiệu theo nguyên lý ion semiconductor. Trong phản cing điện do ion H+ giải ứng tổng hợp DNA, dNTP được bổ sung vào phóng ra trong quá chuỗi DNA sẽ giải phóng PPi và ion H+. Ion H+ trình tổng hợp DNA làm thay đổi độ pH của dung dịch và tín hiệu điện bằng máy đo pH siêu hóa tạo ra được ghi lại trực tiếp và nhanh chóng nhỏ gắn vào chip bởi phần mềm máy tính. bán dẫn. Illumina Là kỹ thuật giải trình Giải trình tự Illumina dựa trên kỹ thuật khuyếch (Solexa) tự đóng vai trò chính đại cầu nối, trong đó các phân tử DNA (~ 500bp) trong lĩnh vực giải với các adaptor thích hợp được gắn ở mỗi đầu trình tự thể hệ thứ được sử dụng làm chất nền cho các phản ứng tổng hai, sử dụng công hợp khuếch đại, lặp lại trên một tấm kính với các nghê được phát triển giếng chứa trình tự oligonucleotide bổ sung với đầu tiên bởi Solexa các adaptor. và Lynx Trong phản ứng tổng hợp, các nucleotide biến đổi Therapeutics. tương ứng với 4 bazơ được gắn huỳnh quang khác nhau, được kết hợp và sau đó được phát hiện. Các nucleotide cũng đóng vai trò là chất kết thúc tổng hợp cho mỗi phản ứng. Trong ba kỹ thuật giải trình tự bằng phương pháp SBS, Illumina Seq được sử dụng phổ biến, nhưng có giá thành cao nhất, tiếp theo là 454 pyrosequencing. Ion Torrent có giá thành rẻ nhất nhưng vẫn cao hơn so với phương pháp Sanger. Ngoài ra, thời gian giải trình tự của phương pháp Ion Torrent nhanh nhất (khoảng 2 – 3 giờ) trong khi thời gian giải trình tự Illumina khá lâu (khoảng 23 giờ) để phân tích hệ gen người [82]. 1.3.3.3. Giải trình tự thế hệ thứ ba Phương pháp giải trình tự thế hệ thứ ba có hai hệ thống giải trình tự được thương mại hóa bởi Pacific Bioscatics (PacBio), là mô hình RSII ban đầu và Sequel™. Giải trình tự PacBio hay giải trình tự gen tức thời đơn phân tử (Single 28
  41. Molecule Real Time – SMRT) nhằm mục đích giải trình tự các phân tử DNA (và RNA) dài lên đến 30 – 50kb. Phản ứng được thực hiện trong một lỗ nhỏ kích thước nano (ZNW: Zero – mode waveguide): Tín hiệu hình ảnh thu được (tính bằng ms) ở dưới cùng của ZNW – nơi DNA polymerase liên kết với DNA, kết hợp với một trong bốn nucleotide (A, T, G, X) được dán nhãn huỳnh quang trong chuỗi DNA đang tổng hợp. Giải trình tự SMRT đem lại một số lợi thế so với phương pháp giải trình tự trước đó: Cung cấp bộ đọc dài cho các bộ gen, xác định nhanh các vị trí methyl hóa cho các nghiên cứu di truyền học biểu sinh. Tuy nhiên, SMRT cho tỉ lệ lỗi cao, chủ yếu là các lỗi ngẫu nhiên thay vì lỗi hệ thống [82]. 1.3.3.4. Giải trình tự thế hệ thứ tư Phương pháp giải trình tự thứ tư là phương pháp sử dụng dòng điện để vận chuyển các phân tử DNA dài thông qua các lỗ có đường kính nhỏ (nanopore) và đo độ lớn của cường độ dòng điện mỗi khi nucleotide đi qua bề mặt nanopore [48]. Hiện nay có hai hệ thống nanopore được sử dụng để giải trình tự DNA là hệ thống màng sinh học và công nghệ cảm biến trạng thái rắn. Giải trình nanopore từ hệ thống màng sinh học phụ thuộc vào việc sử dụng protein xuyên màng gắn lên màng lipid không dẫn điện để tạo ra lỗ nhỏ kích thước nano. Hai protein nanopore được nghiên cứu rộng rãi là alpha hemolysin ( HL) và Mycobacterium smegmatis porin A (MspA). Các DNA có thể di chuyển qua các lỗ nano với tốc độ không đổi, các nucleotide được tháo gỡ và gắn kết cho hàng chục ngàn nucleotide. Công nghệ cảm biến trạng thái rắn sử dụng các chất nền kim loại hoặc hợp kim khác nhau với các lỗ kích thước nm cho phép DNA và RNA đi qua [2, 82]. Giải trình tự nanopore được thương mại hóa bởi Oxford Nanopore Technologies (ONT) với ba loại thiết bị: MinION flow cell (kích cỡ bỏ túi, chứa 512 nanopore); GridION để bàn (5 minION) và PromethION (chứa 48 flow cell, mỗi cell có 3000 nanopore) [13]. Công nghệ nanopore được sử dụng trong nghiên cứu di truyền học sinh thái nhằm xác định các chủng vi khuẩn, virus, đồng thời cung cấp giải trình tự DNA, RNA trực tiếp với chi phí tương đối thấp. Ngoài ra, 29
  42. kỹ thuật này có thể xác định sự sửa đổi các bazơ (tương tự PacBio) và xác định các sự kiện di truyền học biểu sinh, giám sát môi trường và kiểu gen [82]. 1.3.4. Hạn chế của NGS Nhược điểm chính của NGS trong hệ thống xét nghiệm lâm sàng là việc thiết lập cơ sở hạ tầng cần thiết (dung lượng và lưu trữ máy tính) cùng nhân sự với chuyên môn cao để phân tích và giải thích toàn diện dữ liệu đầu ra. Chi phí giải trình tự thực tế của NGS là không đáng kể. Tuy nhiên, để NGS có hiệu quả về mặt chi phí, các nhà chuyên môn phải chạy các lô mẫu lớn yêu cầu tập trung cao từ các khu vực, cung cấp dịch vụ ở quy mô quốc gia nhằm đem lại lợi ích kinh tế bên cạnh những cải tiến trong chăm sóc bệnh nhân [64]. 30
  43. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu ca lâm sàng của bệnh nhân được tài trợ bởi Bệnh viện E, Việt Nam (Dự án KH05 – 2018). 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp thu thập dữ liệu lâm sàng, cận lâm sàng Dữ liệu lâm sàng, cận lâm sàng của bệnh nhân được thu thập tại Trung tâm Tim mạch – Bệnh viện E. 2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA Mẫu máu của bệnh nhân được xử lý để giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa protein – exon bằng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới, nhằm mục đích phát hiện các biến thể gen liên quan đến phản ứng TTNAT và phục vụ trong chẩn đoán. DNA tổng số được tách chiết từ máu toàn phần của bệnh nhân theo các bước như sau: Đầu tiên, phá màng tế bào và màng nhân bằng cách ủ mẫu bệnh phẩm trong một dung dịch gồm chất tẩy mạnh (như sarcosyl) và enzyme phân hủy protein. Tiếp theo, sử dụng dung dịch phenol/chloroform để biến tính protein, làm tủa protein để dễ dàng loại bỏ ra khỏi hỗn dịch. Cuối cùng, sử dụng cồn làm kết tủa DNA trong điều kiện lạnh và thu nhận lại DNA bằng ly tâm. DNA được hòa lại trong nước để khử enzyme nucleaza. 2.2.3. Phương pháp giải trình tự gen Các bước giải trình tự gen được tiến hành như sau: Đầu tiên, DNA tổng số được giải trình tự trên máy giải trình tự thế hệ mới nhằm thu được dữ liệu thô đầu tiên. Dữ liệu thô này được kiểm định chất lượng bằng thuật toán Phred để xác định điểm chất lượng (Phred quality score) nhằm kiểm soát tính chính xác của các lần đọc và phát hiện các lỗi đọc bazơ. Điểm chất lượng càng cao thì độ chính xác càng cao (Bảng 2.1). Tiếp theo, thư viện DNA được chuẩn bị để thu được các đoạn DNA tinh sạch, đạt yêu cầu về chất lượng, sau đó được giải trình tự trên máy giải trình tự gen thế hệ mới. Dữ liệu trình tự thu được được sắp xếp và so sánh với 31
  44. ngân hàng gen người và loại bỏ vị trí phân tử trùng lặp. Dữ liệu sau đó tiếp tục được phân tích nhằm tìm ra tất cả các vị trí có sự thay đổi alen với tần số thống kê cao, các biến thể như các đa hình đơn nucleotide (SNPs), đột biến thêm bớt (INDEL). Tiếp theo, dữ liệu được chọn lọc để tìm ra những biến thể tiềm năng có khả năng gây bệnh bằng công cụ SIFT và Polyphen2. Với SIFT, các nhà nghiên cứu có thể dự đoán chức năng của protein có thể bị ảnh hưởng bởi sự thay thế amino acid hay không, dựa trên chỉ số tỉ lệ amino acid được thay thế và dự đoán tính dung nạp hoặc gây hại của chúng (chỉ số < 0,05 được coi là gây hại và ngược lại là dung nạp). Polyphen2 là một công cụ dự đoán tác động có thể có của sự thay thế các acid amin lên cấu trúc và chức năng của protein người dựa trên thang điểm đánh giá. Các tác động này được chia làm ba mức theo điểm đánh giá: an toàn (B: 0 – 0,452), có thể gây hại (P: 0,453 – 0,956) và có hại (D: 0,957 – 1). Sau khi xác định được biến thể tiềm năng có liên quan đến bệnh, xác định điểm đột biến bằng phương pháp giải trình tự Sanger rồi tiến hành phân tích các kết quả thu được. Bảng 2.1. Mối liên hệ giữa điểm chất lượng Phred với khả năng mắc lỗi đọc bazơ và tính chính xác của các lần đọc. Điểm chất lượng Phred Khả năng mắc lỗi đọc bazơ Độ chính xác của các lần đọc 10 1:10 90% 20 1:100 99% 30 1:1000 99,9% 40 1:10000 99,99% 50 1:100000 99,999% 60 1: 1000000 99,9999% 2.2.4. Đạo đức nghiên cứu Nghiên cứu nhận được sự cho phép của Hội đồng Khoa học và Đạo đức Bệnh viện E để công bố thông tin bệnh nhân dưới dạng văn bản. 32
  45. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả lâm sàng, cận lâm sàng của bệnh nhân 3.1.1. Thông tin chung và kết quả cận lâm sàng của bệnh nhân Bệnh nhân A, giới tính nam, 59 tuổi, nặng 52 kg, có tiền sử phẫu thuật mổ tách van hai lá 22 năm trước. Bệnh nhân nhập viện do đau ngực trái âm ỉ, thở cấp II được NYHA (2016) phân loại với triệu chứng khó thở nhẹ trong vòng một tháng. Vào ngày nhập viện, bệnh nhân tỉnh, huyết động ổn định, nhịp tim bình thường, mạch đập 83 lần/phút, huyết áp 160/100, nhịp thở 18 lần/phút, nhiệt độ 36oC. Giá trị một số chỉ số cận lâm sàng (sinh hóa máu, huyết học, đông máu) bất thường của bệnh nhân được thể hiện trong Bảng 3.1, các chỉ số khác nằm trong giới hạn bình thường. Bảng 3.1. Giá trị một số chỉ số cận lâm sàng bất thường của bệnh nhân trong ngày nhập viện. Tên xét nghiệm (đơn vị) Kết quả Giá trị bình thường Sinh hóa máu Ure (mmol/L) 8,3 2,8 – 7,2 Protein TP (g/L) 61,6 66 – 83 Albumine (g/L) 33,0 35 – 52 Đông máu PT% (%) 27,4 70 - 140 PTs (giây) 29,4 8,5 – 15 INR 2,63 0,75 – 1,19 APTTs (giây) 48,4 21,3 – 40 APTT ( R) (Bệnh/chứng) 1,44 0,85 – 1,2 Huyết học Số lượng HC (x 1012/L) 4,32 4,5 – 5,9 Huyết sắc tố (%) 13,2 13,5 – 17,5 33
  46. Đoạn ưa acid (%) 7,8 1 – 5 Máu lắng 1 h bằng máy tự 9,4 5 - 7 động (mm/1h) Kết quả siêu âm Doppler tim của bệnh nhân cho thấy huyết khối trong buồng nhĩ trái và van hai lá hẹp khít cần được tiến hành phẫu thuật (Hình 3.1), chức năng tâm thu thất trái trong giới hạn bình thường. Hình 3.1. Phẫu thuật thay van tim của bệnh nhân. A: Vị trí phẫu thuật tim. B: Cắt van hai lá. 3.1.2. Kết quả lâm sàng của bệnh nhân Bệnh nhân được gây mê toàn thân bằng thuốc gây mê đường tiêm tĩnh mạch Esmeron 50 mg nhằm hỗ trợ gây mê để đặt nội khí quản và thuốc gây mê đường hô hấp bao gồm Isoflurane 250 mg, Sevoflurane 250 mg; duy trì gây mê bằng Diprivan (propofol) 100 mg – 50 mg – 30 mg, Fentanyl 0,25 mg – 0,2 mg – 0,1 mg. Sau khi gây mê, tiến hành đặt sonde dạ dày, lấy máu động mạch của bệnh nhân làm xét nghiệm khí máu và đặt đầu dò đo nhiệt độ thực quản. Trong suốt quá trình phẫu thuật, bệnh nhân được theo dõi thán đồ, nhiệt độ, khí máu, đo huyết áp không xâm lấn. Cuộc phẫu thuật kéo dài 5 giờ với tổng liều thuốc mê đã dùng như sau: Propofol (180 mg); Fentanyl (0,95 mg); Esmeron (150 mg); Sevoflurane (250 mg (35 ml)); Isoflurane (250 mg (40 ml)). Sau 280 phút phẫu thuật, sau khi đã lấy được huyết khối trong buồng nhĩ trái, cắt bỏ van hai lá thay bằng van sinh học Hancock số 29, bệnh nhân có biểu hiện tăng thân nhiệt đột ngột (39,50C), huyết áp tụt (90/50 mmHg), vã mồ hôi 34
  47. nhiều, đồng tử giãn 1 mm hai bên, phản xạ ánh sáng dương tính, các chỉ số khí máu và điện giải bất thường (Bảng 3.2). Kiểm tra thông khí ở bệnh nhân không thấy dấu hiệu co thắt và chảy máu. Kết quả xét nghiệm khí máu động mạch tại thời điểm này cho thấy áp lực riêng phần của CO2 trong máu động mạch (pCO2) tăng lên đến 68,3 mmHg (Bảng 3.2). Các bác sĩ phẫu thuật cho rằng đây là phản ứng tăng thân nhiệt ác tính. Do đó bệnh nhân được xử lý theo hướng điều trị của phản ứng này. Bảng 3.2. Kết quả xét nghiệm khí máu động mạch và điện giải của bệnh nhân tại thời điểm bắt đầu xảy ra phản ứng TTNAT. Chú thích: ↓ giảm; ↑ tăng. Tên XN Đơn vị Kết quả Giá trị BT Nhận xét pH 7,062 7,35 – 7,45 ↓ pCO2 mmHg 68,3 35 – 45 ↑ pO2 mmHg 121,6 80 – 100 ↑ SO2 % 95,8 75,0 – 99,0 Hct % 41 35 – 50 Hb g/dL 13,8 11,5 – 17,4 Na+ mmol/L 141,6 136 – 146 K+ mmol/L 5,96 3,5 – 4,5 ↑ Ca2+ mmol/L 1,51 2,2 – 2,6 ↓ Glu mmol/L 13,5 4,0 – 5,9 ↑ Lac mmol/L 8,9 0,4 – 0,8 ↑ 35
  48. Tiến hành điều trị theo hướng tăng thân nhiệt ác tính bằng cách thở máy có kiểm soát với FiO2 60 – 100%, sử dụng Cefuroxim 250 mg, Dobutamine 250 mg, Ephedrine, Fentanyl duy trì 100 g/giờ; làm mát tích cực bằng nước đá và rửa nước muối lạnh thông thường qua sonde dạ dày cho đến khi nhiệt độ cơ thể bệnh nhân giảm xuống; thuốc lợi tiểu Furosemide 20 mg (1 ống) được sử dụng nhằm duy trì lượng nước tiểu lớn hơn 2 ml/kg/giờ, ngăn ngừa suy thận cấp; sử dụng Natri bicarbonate 4,2% (2 chai), Insuline, Glucose 5% để điểu trị nhiễm toan + chuyển hóa và tăng K máu; CaCl2 0,5 g chống rối loạn nhịp tim; dung dịch tiêm tĩnh mạch natri clorua (NaCl) 0,9%, thiết lập đường tĩnh mạch trung tâm, đo huyết áp động mạch không xâm lấn; hai đơn vị máu được truyền để tăng thể tích máu nội mạch và cải thiện khả năng oxy kết hợp hemoglobin của bệnh nhân; tiến hành làm xét nghiệm khí máu, xét nghiệm đông máu sau mỗi 4 giờ. Dantrolene không có sẵn tại thời điểm này do đó bệnh nhân không được điều trị bằng thuốc đặc trị TTNAT. Sau một vài giờ được điều trị tích cực, bệnh nhân có dấu hiệu hồi phục, thân nhiệt đạt đỉnh 42oC giảm xuống còn 40,6oC. Vào những thời điểm tiếp theo trong ngày, nhiệt độ bệnh nhân giảm dần và trở lại bình thường (37oC). Kết quả xét + 2+ nghiệm khí máu động mạch cho thấy pCO2, nồng độ K và Ca trong máu giảm dần. Hai ngày sau ngày phẫu thuật đầu tiên, tiến hành ca phẫu thuật tiếp theo cho bệnh nhân do chảy máu sau phẫu thuật thay van hai lá. Một tháng sau, ca phẫu thuật thứ ba của bệnh nhân được tiến hành do máu cục màng tim sau mổ thay van hai lá. Cả hai ca phẫu thuật đều không thực hiện gây mê bằng thuốc gây mê đường hô hấp sevoflurane mà sử dụng thuốc gây mê đường tiêm tĩnh mạch (propofol và fentanyl). Bệnh nhân không biểu hiện bất kỳ triệu chứng nào của phản ứng tăng thân nhiệt ác tính. Vào ngày tiến hành phẫu thuật thứ hai, thân nhiệt bệnh nhân đạt 36,3oC và không xuất hiện bất thường trong những ngày sau. Quá trình tiêu cơ vân do TTNAT dẫn đến chỉ số creatine kinase tăng tối đa (7715 U/L), creatine đạt đỉnh ở 240,1 mol/L sau ngày phẫu thuật lần thứ hai, sau đó giảm dần và trở lại bình 36
  49. thường; chỉ số CK – MB đạt đỉnh ở 110 U/L sau đó giảm dần vào những ngày tiếp theo. Nồng độ K+ trong máu cao nhất vào sau ngày phẫu thuật lần thứ hai (5,9 mmol/L) và trở lại bình thường trong những ngày tiếp theo. Sau hai tháng kể từ thời điểm nhập viện, phẫu thuật và điều trị, kết quả siêu âm Doppler tim của bệnh nhân cho kết quả: Van hai lá sinh học đúng vị trí, hoạt động bình thường; tuy nhiên van động mạch chủ hở nhẹ, chức năng tâm thu thất trái giảm nhẹ. Bằng cách tiến hành các biện pháp điều trị tích cực, phản ứng TTANT xảy ra ở bệnh nhân đã được đẩy lùi. Bệnh nhân tiếp tục được theo dõi và trải qua hai ca phẫu thuật tiếp theo trên tim tại bệnh viện E. Cả hai ca phẫu thuật đều diễn ra thuận lợi và không xảy ra phản ứng TTNAT do không sử dụng thuốc gây mê đường hô hấp. Sau hai tháng theo dõi và điều trị kể từ thời điểm nhập viện, kết quả siêu âm Doppler tim cho thấy van hai lá sinh học đúng vị trí, hoạt động bình thường. Với sự đồng ý của bệnh nhân và gia đình, bệnh nhân đã được lấy mẫu máu để tiến hành giải trình tự toàn bộ hệ gen theo phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) nhằm phát hiện các điểm thay đổi trên gen có liên quan đến phản ứng tăng thân nhiệt ác tính. 3.2. Kết quả phân tích gen của bệnh nhân Bằng cách sử dụng phương pháp giải trình tự thế hệ tiếp theo, hơn 169 triệu lượt đọc của 150 cặp base trên phân tử DNA đã được giải trình tự trên toàn bộ mẫu với 99,9% số lần đọc đã được ánh xạ thành công vào bộ gen người, bao gồm 10 429 171 492 base. Lọc về chất lượng của chuỗi và điểm ánh xạ cho thấy tỉ lệ phần trăm cơ sở có điểm chất lượng Phred (Qphred) cao hơn 20 hoặc 30 chứng tỏ độ chính xác của các lần đọc lớn hơn 99,9% (Bảng 2.1). Kết quả chúng tôi đã xác định được 96 286 đa hình đơn nucleotide (SNP) gồm 11 705 biến thể synonymous, 11 388 biến thể sai nghĩa, 106 đột biến điểm dừng đạt (stop gained) và 89 đột biến điểm dừng mất (stop lost). Tổng cộng có 13 692 đột biến thêm bớt (INDEL) được phát hiện bao gồm 321 biến thể frameshift, 178 đột biến chèn nucleotide trong khung và 207 đột biến xóa nucleotide trong khung. SNP và INDEL đã được phát 37
  50. hiện trên bộ gen mã hóa của bệnh nhân với tỉ lệ kiểu gen biến đổi dị hợp tử với kiểu gen biến đổi đồng hợp tử (Het/Hom) là 1,3. Kết quả phân tích của bệnh nhân nhắm tới mục tiêu là các gen liên quan đến phản ứng TTNAT, cho thấy phát hiện 18 điểm thay đổi trên gen RYR1, trong đó có 07 điểm synonymous, 10 điểm trên intron, 01 đột biến điểm đã được công bố là gây bệnh (codon 2350, c7048G >A, p.Ala2350Thr, polyphen 2 đánh giá thang điểm gây bệnh 0,999, SIFT 0,001) ở dạng dị hợp tử; ngoài ra còn phát hiện được 15 điểm thay đổi trên gen CACNA1S trong đó có 07 điểm trên intron, 04 điểm synonymous, 03 điểm splice, 01 điểm upstream; 02 điểm thay đổi trên gen STAC3 trong đó có 01 trên intron, 01 trên vùng 3 prime UTR. Đột biến sai nghĩa c7048G >A, p.Ala2350Thr được xác nhận bởi trình tự Sanger, được trình bày trong Hình 3.2. Đây là một trong những đột biến đã được công bố trong các nghiên cứu trước đây ( Hình 3.2 cho thấy đột biến p.Ala2350Thr nằm ở vùng chứa trình tự được bảo tồn (conservative region) qua các loài của gen RYR1 nên sự thay thế này gây ảnh hưởng đến chức năng của protein RyR1. Hình 3.2. A: Điểm đột biến (c7048G >A, p.Ala2350Thr) trong gen RYR1 của bệnh nhân được xác định bằng trình tự Sanger. B: So sánh cấu trúc bậc 1 của phân tử protein RyR1 giữa các loài: con người (XM011527205), bò (NM001206777), lợn (NM001001534), thỏ (NM001101718) và chuột (AY268935). 38
  51. 3.3. Bàn luận Tăng thân nhiệt ác tính là một rối loạn dược lý mang tính tự phát và các đột biến trên gen RYR1, CACNA1S và STAC3 đã được chứng minh có liên quan đến phản ứng này [80]. Hiện nay, các biến thể trên các gen RYR1, CACNA1S và STAC3 đã được công bố liên quan đến TTNAT, ứng dụng trong tư vấn chẩn đoán và điều trị. Trong đó, khoảng 37-86% các trường hợp được báo cáo mang đột biến trong gen RYR1 [74], khoảng 1% mang đột biến trong gen CACNA1S [36]. Đột biến trong gen STAC3 được xác định có liên quan đến bệnh nhược cơ bẩm sinh của người Mỹ bản địa, có xu hướng xuất hiện phản ứng TTNAT [34]. Hiện tại, trong các gen đáp ứng liên quan đến thuốc được báo cáo, hơn 200 biến thể RYR1 được tìm thấy cùng với phản ứng TTNAT, nhưng chỉ có 35 biến thể RYR1 và 2 biến thể CACNA1S được công nhận là đủ đặc điểm chức năng (www.emhg.org) để sử dụng trong xét nghiệm di truyền chẩn đoán cho TTNAT [80]. Phân tích các gen này được các nhà nghiên cứu khuyến cáo nên được đưa vào công việc chẩn đoán ở bệnh nhân thuộc bất kì dân tộc nào có biểu hiện TTNAT, đặc biệt nếu có báo cáo về tiền sử TTNAT của gia đình [34]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, bệnh nhân A đã được giải trình tự toàn bộ exome bằng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới, thu được kết quả được trình bày ở trên. Từ những kết quả này chúng tôi có những bàn luận dưới đây: 3.3.1. Đặc điểm ca lâm sàng tăng thân nhiệt ác tính của bệnh nhân Tại Việt Nam, nghiên cứu của chúng tôi là trường hợp báo cáo TTNAT trong phẫu thuật tim khi sử dụng thuốc gây mê đường hô hấp đầu tiên và duy nhất trong mười năm qua. Bệnh nhân A, 59 tuổi, giới tính nam với tiền sử cá nhân và gia đình không có tình trạng mẫn cảm với TTNAT. Tất cả các dấu hiệu điển hình o như tăng thân nhiệt đột ngột (39,5 C), nhiễm toan hô hấp (pH giảm 7,062, pCO2 tăng 68,3), tăng nồng độ K+ trong máu (5,96 meq/l), tăng CK (7715 U/L) phù hợp với các tiêu chuẩn chẩn đoán của phản ứng TTNAT. Bệnh nhân được điều trị tích cực bằng các biện pháp như làm mát bề mặt nhằm giảm nhiệt độ cơ thể, sử dụng thuốc phòng và điều trị các tiến triển xấu của TTNAT như nhiễm toan chuyển hóa, 39
  52. rối loạn nhịp tim, suy thận cấp, DIC. Việc kiểm soát sớm nhiệt độ và nồng độ K+ trong máu rất quan trọng, tuy nhiên sau khi nhiệt độ cơ thể trở lại bình thường cần tiếp tục làm mát bề mặt cơ thể bệnh nhân, tránh để mất kiểm soát nhiệt độ dẫn đến tình trạng hạ thân nhiệt đột ngột. Để bù đắp cho lượng lớn O2 bị tiêu thụ do tăng chuyển hóa và lượng CO2 tăng do quá trình giảm thông khí, bệnh nhân được thiết lập thở máy có kiểm soát với FiO2 60 – 100% trong suốt quá trình điều trị. Dantrolene tiêm tĩnh mạch không có sẵn tại thời điểm diễn ra phản ứng nên bệnh nhân không được điều trị bằng thuốc đặc trị TTNAT. Chính vì vậy, trường hợp TTNAT này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc phán đoán sớm TTNAT dựa trên dấu hiệu lâm sàng, điều trị triệu chứng tích cực và liên tục, ngừng sử dụng thuốc gây mê đường hô hấp và theo dõi nghiêm ngặt tình trạng bệnh nhân khi các xét nghiệm chẩn đoán và thuốc đặc trị dantrolene không thể có mặt kịp thời. Trường hợp này có thể xảy ra ở các vùng nông thôn, vùng đang phát triển thiếu điều kiện chăm sóc y tế. Một trường hợp TTNAT tương tự ở Trung Quốc được báo cáo bởi Liu và cộng sự: Bệnh nhân nam 14 tuổi được điều trị thành công mà không sử dụng thuốc đặc trị dantrolene do không có sẵn [72]. Điều này khẳng định rằng những kinh nghiệm điều trị TTNAT không sử dụng dantrolene rất cần thiết, đặc biệt đối với các quốc gia không có sẵn loại thuốc này. 3.3.2. Đặc điểm của thuốc gây mê sử dụng trong phẫu thuật thay van hai lá ở bệnh nhân Trong quá trình phẫu thuật tách van hai lá và loại bỏ huyết khối buồng nhĩ trái xảy ra phản ứng TTNAT, bệnh nhân đã được gây mê toàn thân bằng thuốc gây mê đường hô hấp (Isoflurane 250 mg, Sevoflurane 250 mg) và thuốc gây mê đường tiêm tĩnh mạch (Esmeron 50 mg (Rocuronium bromide), Diprivan 100 mg – 50 mg – 30 mg (Propofol), Fentanyl 0,25 mg – 0,2 mg – 0,1 mg). Các thuốc gây mê này đều chuyển hóa trong cơ thể chủ yếu qua gan tạo thành chất chuyển hóa có hoạt tính hoặc không có hoạt tính, sau đó được thải trừ qua thận hoặc ở gan. Trong đó, các liên kết giữa carbon (C) và halogen trong sevoflurane và isoflurane được chuyển hóa bởi enzyme gan CYP2E1, giải phóng các ion halogen (F-, Cl-): 3 – 5% sevoflurane chuyển hóa thành hexafluoroisopropanol và ion F- vô cơ có 40
  53. thể gây độc thận, isoflurane chuyển hóa ít (0,2%) và không gây độc [86]. Propofol được chuyển hóa nhanh chóng ở gan bằng cách kết hợp với glucuronide và sulphate, tạo ra các hợp chất hòa tan trong nước được đào thải qua thận [87]. Rocuronium và fentanyl được chuyển hóa thành chất chuyển hóa ít hoạt tính và không hoạt tính. Sau đó, rocuronium được đào thải chủ yếu bởi gan, còn fentanyl được bài tiết qua nước tiểu hoặc phân [88, 89]. Trong phẫu thuật tim hiện đại, việc tiến hành gây mê phải đảm bảo duy trì và bảo vệ chức năng các cơ quan, đặc biệt là tim và não. Nghiên cứu của Schraag đã chỉ ra các lợi ích của thuốc gây mê đường tĩnh mạch, bao gồm khả năng bảo vệ các cơ quan và tăng cường quá trình hồi phục ở bệnh nhân sau phẫu thuật tim mạch [4]. Các nghiên cứu khác cũng cho thấy isoflurane và sevoflurane an toàn đối với tim mạch trong phẫu thuật tim, cải thiện thông số huyết động và khả năng phục hồi sau phẫu thuật tương đương nhau ở bệnh nhân trải qua phẫu thuật van tim [5, 70]. Tuy nhiên, việc gây mê bằng sevoflurane thuận lợi hơn isoflurane do không gây kích thích đường hô hấp, tốc độ khởi mê nhanh hơn, không làm tăng nhịp tim ở nồng độ sử dụng trong khi isoflurane làm tăng nhịp tim rõ rệt [65]. Trong các thuốc gây mê toàn thân được sử dụng hiện nay, thuốc gây mê dạng hít là tác nhân chính kích hoạt phản ứng TTNAT. Nghiên cứu của Sumitani và cộng sự tại Nhật Bản đã chỉ ra tỉ lệ mắc TTNAT tương đối cao ở bệnh nhân dùng sevoflurane mà không tìm thấy ý nghĩa thống kê ở bệnh nhân dùng thuốc gây mê tĩnh mạch rocuronium và propofol [59]. Trong những năm 1970, phần lớn các trường hợp TTNAT gây ra bởi halothane. Tuy nhiên, vào những năm 2009 – 2011, sevoflurane và isoflurane là các tác nhân phổ biến nhất gây TTNAT [41]. Nghiên cứu của Migita và cộng sự đã chỉ ra mức độ nghiêm trọng của phản ứng TTNAT gây ra bởi sevoflurane so với isoflurane trên lâm sàng là tương đương nhau, được khuyến cáo không nên sử dụng ở những người mang yếu tố nguy cơ mắc TTNAT [20]. Mặc dù nên tránh gây mê bằng thuốc gây mê đường hô hấp ở những người nhạy cảm với TTNAT, nhưng đối với những người không nhạy cảm với TTNAT, gây mê toàn thân bằng đường tĩnh mạch cũng không được khuyến cáo sử dụng. Điều này là do các thiết bị cần thiết cho gây mê tĩnh mạch không có sẵn tại các 41
  54. nước đang phát triển, đồng thời gây mê tĩnh mạch có nguy cơ ảnh hưởng đến nhận thức cao hơn 5 – 10 lần so với gây mê đường hô hấp. Chính vì vậy, gây mê đường hô hấp vẫn được ưu tiên sử dụng trong các trường hợp bệnh nhân không nhạy cảm với TTNAT bởi tốc độ gây mê nhanh, không đau và không cần tiêm tĩnh mạch [25]. Nguyên nhân gây kích thích phản ứng TTNAT của các thuốc gây mê đường hô hấp có liên quan đến các biến thể đột biến trên một số gen. Vì vậy cần lựa chọn thuốc gây mê phù hợp với tình trạng, tiền sử bệnh nhân và gia đình nhằm phòng tránh các phản ứng cấp tính trên lâm sàng. Nghiên cứu sâu hơn về dược động học và dược lực học của thuốc gây mê đường hô hấp có thể giúp đưa ra loại thuốc phù hợp với bệnh nhân. Đây là một chặng đường dài bởi cơ chế hoạt động của thuốc gây mê đường hô hấp rất phức tạp. Hiện nay, phân tích các đồng phân đối quang (chirality) là nghiên cứu đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển thuốc mới, đồng thời góp phần giải thích cơ chế tác dụng của các thuốc gây mê. Chirality là một thuộc tính hình học của phân tử và ion, trong đó một cấu trúc hóa học có thể có hai hình ảnh ở bên phải và bên trái, chúng được gọi là các đồng phân đối quang (enantiomer). Chirality phụ thuộc vào sự hiện diện của một trung tâm bất đối xứng (thường là một nguyên tử C gắn liền với bốn nguyên tử hoặc nhóm khác nhau) trong cấu trúc hóa học của thuốc. Chirality có liên quan đến các thuốc gây mê do phần lớn các chất được sử dụng trong gây mê lâm sàng là thuốc chứa dược chất đối quang (chiral drug) [75]. Hầu hết các thuốc này đều tồn tại dưới dạng hỗn hợp tỉ lệ 1:1 của các ĐPQH (hữu tuyền và tả tuyền), được gọi là hỗn hợp racemic. Các thuốc có chứa dược chất đối quang là thuốc gây mê đường hô hấp như halothane, isoflurane, enflurane, desflurane (trừ sevoflurane); thuốc gây mê đường tĩnh mạch như etomidate, thiopental. Trong đó, etomidate là thuốc duy nhất được sử dụng dưới dạng đồng phân R (+) tinh khiết trong các thuốc gây mê tĩnh mạch. Đồng phân S (-) của thiopental có hoạt tính mạnh gấp đôi so với đồng phân R (+) tại các thụ thể GABAA [61]. Các ĐPQH của isoflurane thể hiện tính lập thể dựa vào hoạt tính trên lâm sàng: Đồng phân S – isoflurane có hiệu lực gây mê mạnh gấp hai lần 42
  55. so với R – isoflurane. Tuy nhiên, một số nghiên cứu đã chỉ ra những bất lợi trong việc sử dụng S – isoflurane và một số thuốc gây mê chứa dược chất đối quang khác trong lâm sàng [76]. Vì vậy, các ĐPQH của isoflurane vẫn là mối quan tâm của các nhà nghiên cứu cho đến nay [61]. 3.3.3. Đặc điểm của các gen liên quan đến phản ứng TTNAT 3.3.3.1. Gen RYR1 Gen RYR1 là gen mã hóa thụ thể ryanodine – kênh giải phóng Ca2+ của lưới cơ tương trong cơ vân. Đây được cho là gen chính liên quan đến TTNAT với 189 biến thể được xác định (www.emhg.org truy cập lần cuối ngày 31 tháng 12 năm 2016) [24, 80]. Gen RYR1 đã được giải trình tự và nhân bản vào năm 1990, gen này nằm trên nhiễm sắc thể 19q13.2, chứa 106 exon và mã hóa cho một protein dài 5038 acid amin [35, 55]. Đây là một gen lớn với nhiều biến thể có liên quan đến tính nhạy cảm với TTNAT, tuy nhiên, chỉ một số ít trong số các biến thể của RYR1 được chứng minh là gây bệnh. Chính vì vây, Hội TTNAT Châu Âu (EMHG) đã thiết lập một bộ tiêu chí đối với các biến thể di truyền liên quan đến TTNAT được đưa vào chẩn đoán di truyền cho TTNAT. Kết quả là chỉ có 34 biến thể được đưa vào chẩn đoán trong 189 biến thể được báo cáo (www.emhg.org) [14, 73, 74]. Trong một nghiên cứu của Miller và cộng sự trên 770 gia đình được xác nhận nhạy cảm với TTNAT tại Anh thông qua đánh giá IVCT dương tính. Các mẫu DNA được cung cấp từ ít nhất một thành viên trong 697 gia đình. Các biến thể RYR1 có liên quan đến TTNAT đã được xác định thông qua giải trình tự gen thế hệ mới trong 25 gia đình. Ngoài 31 biến thể trước đó đã được sử dụng trong chẩn đoán TTNAT (www.emhg.org), hơn 29 trong 147 biến thể RYR1 có khả năng gây bệnh được tìm thấy trong ít nhất một gia đình (Bảng 3.3). Trong đó, 25 biến thể được đề xuất sử dụng trong chẩn đoán di truyền. Tất cả các biến thể này được tìm thấy ở trạng thái dị hợp tử ngoại trừ p.Arg3772Gln. Thêm vào đó, nghiên cứu của Merrit và cộng sự đã công bố thêm 5 biến thể khác (p.Arg2336His, p. Arg2355Trp, p. Glu3014Lys, p.Gly3990Val và p.Val4849Ile) được sử dụng trong chẩn đoán di truyền xác định nhạy cảm với TTNAT [73]. Trong nghiên cứu mới công bố năm 43
  56. 2019, nhóm nhà khoa học tại Đại học Quốc gia Hà Nội đã chỉ ra vai trò của đa hình c.7048G > A (p.Ala2350Thr) gen RYR1 trên một ca lâm sàng tăng thân nhiệt ác tính sau phẫu thuật thay van tim [51]. Bảng 3.3. Các biến thể RYR1 xuất hiện hơn 1 lần trong 770 gia đình nghiên cứu ở Anh [74]. Thay đổi nucleotide Thay đổi amino acid Số gia đình Giá trị P c.479A>G p.Glu160Gly 2 T p.Arg177Cys 10 T p.Thr214Met 4 T p.Arg401His 2 A p.Arg533His 2 G p.Phe539Val 2 C p.Asp1056His 2 0,0012 c.4763C>T p.Pro1588Leu 2 0,0061 c.5024T>C p.Leu1675Pro 3 T p.Ser1728Phe 8 G p.His2204Gln 5 G p.Ile2321Val 3 0,031 c.7084G>A p.Glu2362Lys 2 G p.Cys2363Trp 2 G p.Phe2364Val 2 T p. Asp2431Tyr 3 A p.Val2627Met 5 < 10-7 44
  57. c.8026C>T p.Arg2676Trp 3 A p.Arg3051His 2 0,048 c.10252A>G p.Asn3418Asp 2 A p.Arg3903Gln 2 A p.Arg3772Gln 7 (2 đồng hợp tử) G p.Asp3986Glu 6 A p.Ser4050Tyr 2 T p.Val4234Leu 5 A p.Arg4737Gln 7 C p.Leu4824Pro 3 A p.Arg4893Gln 3 T p.Pro4973Leu 3 < 10-7 Ngoài phản ứng TTNAT, đột biến trên gen RYR1 có liên quan đến một số bệnh khác như bệnh cơ lõi trung tâm (CCD), tiêu cơ vân do nhiệt/hoạt động thể dục, bệnh cơ multiminicore, loạn dưỡng cơ Myotonic và hội chứng King – Denborough [26]. Các thụ thể Ryanodine do gen RYR1 mã hóa được cấu tạo bởi bốn monomer, mỗi monomer được chia thành 10 miền (Hình 3.3 và Bảng 3.4): Miền đầu N (NTD) tương tác với tế bào chất, miền SPRY1, mối nối solenoid (Jsol) và cấu nối solenoid (Bsol) có vùng tận cùng chứa các vị trí phosphoryl hóa protein kinase II (CaMKII) và Ca2+/CaM – con đường dẫn điện thế cho Ca2+ và miền đầu C (CTD) tạo thành lỗ rỗng dẫn ion Ca2+. Các miền tạo thành một phần của vùng kích hoạt Ca2+, ATP và caffeine [50]. Cho đến nay các điểm đột biến trên gen RYR1 xảy ra chủ yếu tại ba điểm nằm trên đầu N (exon 1 – 17), miền trung tâm (exon 39 – 46), miền đầu C (exon 90 – 104). Đột biến tại miền đầu N và miền trung tâm được báo cáo chủ yếu liên quan đến TTNAT, miền đầu C chứa điểm đột biến gây ra bệnh CCD [55]. Ngoài ra, ít nhất 42 đột biến sai nghĩa trong khu vực 45
  58. mã hóa monomer protein của cDNA trên gen RYR1 đã được mô tả liên quan đến TTNAT và/hoặc bệnh CCD trước đó [30]. Với dữ liệu được thu thập từ HGMD cho đến năm 2006, UniProt 2007 – 2009, Vukcevic và cộng sự đã trình bày chuỗi acid amin của protein ryanodine với các đột biến đã biết liên quan đến một số bệnh về cơ xương (Hình 3.4) [45]. Ngoài ra, nghiên cứu của Vladutiu và cộng sự đã chỉ ra rằng các biến thể trong gen RYR1 còn có thể góp phần vào nguy cơ di truyền tiềm ẩn đối với bệnh cơ không do thuốc gây mê, chẳng hạn như bệnh cơ do nhóm thuốc statin gây ra [83]. Bảng 3.4. Các miền cấu trúc của thụ thể Ryanodine được phân tích theo phương pháp đông lạnh mẫu thử dùng trong kính hiển vi điện tử (Cryo – EM) [50]. Tên miền Tên thay thế Trình tự a Miền đầu N NTD 1– 627 SPRY1 628 – 849 RY1 và 2 P1 850 – 1,054 SPRY2 và 3 1,055 – 1,656 Jsol Handle 1,657 – 2,144 Bsol HD1&2 2,145 – 3,613 RY3 và 4 P2 2,735 – 2,938 Csol Miền trung tâm 3,667 – 4,174 TaF 4,175 – 4,253 Miền xuyên màng 4,541 – 4,956 Miền đầu C CTD 4,957 – 5,037 Chú thích: a theo des Georges và cộng sự. 46
  59. Hình 3.3. Cấu trúc thụ thể Ryanodine [50]. Hình 3.4. Biểu diễn tuyến tính chuỗi acid amin của protein ryanodine với các đột biến đã biết liên quan đến một số bệnh về cơ xương [45]. Chú thích: Các đột biến thụ thể RyR1 liên quan đến TTNAT (151 đột biến), CCD (63 đột biến) và MmD (6 đột biến) hoặc các bệnh cơ khác (MP (Myopathy), 4 đột biến). 3.3.3.2. Gen CACNA1S 47
  60. CACNA1S là gen thứ hai có đa hình gây bệnh liên quan đến nhạy cảm TTNAT. Đây là gen nằm trên nhiễm sắc thể 1q [67], mã hóa tiểu đơn vị alpha – 1S (CAv1.1) của thụ thể DHPR nằm trên hệ thống ống T. Tiểu đơn vị CAv1.1 tạo thành kênh ion, chứa vị trí liên kết với phối tử và các miền phân tử tương tác với các tiểu đơn vị khác, đóng vai trò rất quan trọng đối với cảm biến điện thế dẫn đến giải phóng Ca2+ [79, 80]. Khoảng 1% các trường hợp TTNAT được báo cáo mang đột biến về gen CACNA1S. Hiện tại, sáu đột biến CACNA1S có ý nghĩa lâm sàng liên quan với TTNAT đã được xác định (Bảng 3.5). Ngoài ra, các biến thể CACNA1S khác có thể đơn độc hoặc kết hợp với các gen khác gây ảnh hưởng đến cân bằng nội môi, liên quan đến TTNAT [36]. Bảng 3.5. Các biến thể của CACNA1S có ý nghĩa lâm sàng đối với bệnh TTNAT [36]. Biến thể trên Biến thể Vị trí Đa hình đơn Tác động của alen đột protein trên cDNA nucleotite biến. mã (tần số alen CACNA1S đột biến) p.Arg174Trp c.520C>T Phân rs772226819 Alen T trội hoàn hoàn và (CGG>TGG) đoạn cảm (chưa biết) gây bệnh so với Alen C. biến điện thế IS4 p.Arg1086Cys c.3256C>T Vùng nội rs80338782 Alen T trên sợi mã hóa có (CGT>TGT bào liên (0,0002) thể là tác nhân gây bệnh CGC>TGC) kết vùng so với Alen C. III và IV p.Arg1086Ser c.3256C>A Vùng nội rs80338782 Alen A trên sợi mã hóa là (CGT>AGT bào liên (0,0002) trội hoàn hoàn và gây CGC>AGC) kết vùng bệnh so với Alen C. III và IV 48
  61. p.Arg1086His c.3257G>A Vùng nội rs1800559 Alen A trên sợi mã hóa là (CGC>CAC bào liên (chưa biết) trội hoàn hoàn và gây CGU>CAU) kết vùng bệnh so với Alen G. III và IV p.Arg1086Leu c.3257G>T Vùng nội rs1800559 Alen T trên sợi mã hóa là (CGt > CTT bào liên (chưa biết) trội hoàn hoàn và gây kết vùng bệnh so với Alen G. CGC>CTC III và IV CGA>CTA CGG>CTG) p.Thr1354Ser c.4060A>T Vùng rs145910245 Alen T trên sợi mã hóa có (ACA>AGT) ngoại bào (0,00080) thể là tác nhân gây bệnh IV so với Alen A; biến thể S5- vùng Alen T lành tính trong lõi S6 mất cân bằng liên kết với một biến thể gây bệnh không bị phát hiện. Dữ liệu hệ gen dược lý PharmGKB đã chỉ định mức độ 3 về khả năng gây TTNAT cho rs1800559 (p.Arg1086His) sau khi sử dụng thuốc gây mê đường hô hấp và succinylcholine [36, 84]. Monnier và cộng sự đã chỉ ra biến thể p.Arg1086His trong gen CACNA1S có liên quan đến TTNAT. Nghiên cứu này được tiến hành trên một gia đình người Pháp gồm 12 cá nhân được chẩn đoán nhạy cảm với TTNAT và 6 người bình thường [77]. Trong một nghiên cứu ở Bắc Mỹ trên 154 người bình thường và 112 người nhạy cảm với TTNAT, đột biến p.Arg1086His không xuất hiện ở nhóm người bình thường và được tìm thấy ở 2 cá thể có quan hệ huyết thống trong nhóm TTNAT [28]. PharmGKB cũng chỉ ra bằng chứng gây bệnh cấp độ 3 của rs772226819 (p.Arg174Trp) liên quan đến việc sử dụng halothane hoặc succinylcholine [36]. Đột biến p.Arg174Trp được xác định có liên quan đến TTNAT bởi Carpenter và cộng sự khi tiến hành nghiên cứu 49
  62. trên 50 bệnh nhân TTNAT. Sự biến đổi p.Arg174Trp đã gây ra sự thay đổi điện tích của acid amin thành dạng không phân cực. Acid amin này nằm trong miền phân đoạn S4 của dihydropyridine, do đó sự thay đổi điện tích làm thay đổi cơ chế cảm biến điện thế, dẫn đến phá vỡ sự cân bằng canxi nội bào [67]. Mặc dù không được chú thích trong PharmGKB, p.Arg1086Cys và p.Arg1086Ser đột biến (rs80338782) có thể liên quan đến TTNAT. Toppin và cộng sự đã báo cáo trường hợp của một bệnh nhân TTNAT có kiểu gen đồng hợp tử đột biến p.Arg1086Ser [31]. Nhiều nghiên cứu đã cung cấp các bằng chứng về mối liên quan giữa các biến thể gen CACNA1S với TTNAT khi sử dụng thuốc gây mê đường hô hấp hoặc thuốc succinylcholine. Dựa trên những thông tin này, việc sử dụng thuốc gây mê halogen và/hoặc succinylcholine chống chỉ định ở những bệnh nhân mẫn cảm với TTNAT mang bất kỳ đột biến nào trong sáu đột biến CACNA1S gây bệnh (Bảng 3.5) [36]. 3.3.3.3. Gen STAC3 Horstick và cộng sự đã chỉ ra một đột biến ở gen STAC3 (p.Trp284Ser) là cơ sở di truyền của bệnh nhược cơ của người Mỹ bản địa và liên quan với tính nhạy cảm TTNAT [69, 80]. Bệnh nhược cơ là một rối loạn tự phát đặc trưng bởi yếu cơ bẩm sinh, chậm phát triển vận động, mẫn cảm với TTNAT, co rút nhiều khớp và các đặc điểm bất thường trên khuôn mặt như vòm miệng, khuôn mặt dài và hẹp [58]. Hoạt động bình thường của protein chứa SH3 và miền giàu cysteine 3 mã hóa bởi gen STAC3 là cần thiết cho sự phối hợp hiệu quả của thụ thể DHPR và thụ thể RyR1 [34, 80]. Gần đây, các nhà nghiên cứu đã chứng minh rằng STAC3 tương tác với vùng Cav1.1 II-III của thụ thể DHPR [31, 54, 62, 84], có vai trò quan trọng đối với liên kết với RYR1 và ECC [12, 22]. Bảng 3.6. Các biến thể của STAC3 có ý nghĩa lâm sàng đối với bệnh TTNAT. Biến thể trên Biến thể trên cDNA Đa hình Tác động của alen đột protein mã CACNA1S đơn biến 50
  63. p.Trp284Ser c.851G>C rs140291094 Đột biến nhầm nghĩa, tác động tới kênh canxi liên quan tới bệnh lý TTNAT và bệnh cơ tim bẩm sinh. p.Lys288Ter c.862A>T rs371720347 Đột biến vô nghĩa làm biến đổi vùng SH3 thứ nhất của protein STAC3 ở bệnh nhân cơ tim bẩm sinh. - c.432+4A>T rs751033943 Xảy ra ở vùng cắt nối trên intron 4 trên gen tạo ra sản phẩm mARN bất thường, qua đó tạo ra protein bất thường liên quan tới bệnh cơ tim bẩm sinh. p.Leu255fs c.761_762delCTCT rs773050511 Đột biến xóa một vài nucleotide dẫn tới ảnh hưởng cấu trúc STAC3 trong bệnh TTNAT và bệnh cơ tim. Ile333-Val334- c.997-1G>T - Xảy ra ở exon 12 của gen Val335-Gln336 ảnh hưởng vùng SH3 thứ hai của protein STAC3 và tới hoạt động của kênh canxi liên quan tới bệnh lý TTNAT và bệnh cơ tim bẩm sinh. Nghiên cứu của Zaharieva và cộng sự trên 18 bệnh nhân mang biến thể p.Trp284Ser từ 12 gia đình gốc Phi, Trung Đông, Afro- Caribean, Comorian và 51
  64. Nam Mỹ báo cáo phản ứng TTNAT với thuốc gây mê ở 10 bệnh nhân sau khi gây mê toàn thân. Giải trình tự toàn bộ exon cho thấy xuất hiện phức hợp đột biến c.851G > C và c.997-1G > T [34]. Đa hình c.851G > C dẫn đến thay thế acid amin Tryptophan (Trp) ở vị trí 284 bằng Serine (Ser). Trp284 nằm trong miền SH3 của protein STAC3, nơi chứa vị trí liên kết đóng vai trò trung gian cho sự hình thành phức hợp protein [21, 34]. Vùng liên kết này nằm trong vùng kỵ nước chứa các acid amin có vòng thơm. Các acid amin này đóng vai trò quan trọng trong liên kết với các acid min của SH3 [63]. Nghiên cứu của Zaharieva và cộng sự chỉ ra Trp284Ser không làm phá vỡ cấu trúc protein STAC3 nhưng có thể làm suy yếu hoạt tính của protein. Tương tự, c.997-1G > T dẫn đến mất bốn acid amin Ile333- Val334-Val335-Gln336 trong miền SH3 thứ 2 của protein STAC3, làm ảnh hưởng đến cấu trúc của miền SH3 thứ 2 và cấu trúc của protein STAC3. Các nghiên cứu ở bệnh nhân là người Mỹ bản địa cũng như trên các quốc gia khác đã chứng minh bệnh nhược cơ bẩm sinh liên quan đến gen STAC3. Chính vì vậy, phân tích gen STAC3 nên được đưa vào công việc chẩn đoán bệnh nhân thuộc bất kì dân tộc nào có biểu hiện bệnh cơ bẩm sinh, đặc biệt nếu có báo cáo về tiền sử TTNAT [34]. Các đột biến chủ yếu của gen STAC3 liên quan tới cơ chế bệnh sinh TTNAT và bệnh cơ tim bẩm sinh được tổng hợp trong Bảng 3.6. 3.3.4. Mối liên hệ giữa thuốc gây mê đường hô hấp và các gen liên quan Tồn tại nhiều đột biến khác nhau trên toàn bộ vùng mã hóa của gen RYR1, tạo ra cùng một kiểu hình thụ thể RyR1 giống nhau. Hiện nay, các báo cáo đã chứng minh rằng tương tác giữa thuốc gây mê đường hô hấp với thụ thể này là một trong những nguyên nhân gây ra phản ứng TTNAT. Về cơ chế, thuốc gây mê dễ bay hơi gây ra sự giải phóng Ca2+ từ hệ võng nội bào (SR), cụ thể là kích thích hoạt động của kênh Ca2+- ATPase đồng thời ức chế sự tái hấp thu Ca2+ vào SR. Mặc dù trình tự acid amin và cấu trúc không gian của thụ thể RyR1 đã được công bố nhưng vị trí tương tác với các thuốc gây mê dễ bay hơi vẫn chưa được làm rõ. Nghiên cứu của Kunst và cộng sự đã chỉ ra các thuốc gây mê halothane, sevoflurane và isoflurane có vị trí tương tác khác nhau với kênh giải phóng Ca2+ RyR1, dẫn đến mức độ ảnh hưởng của chúng lên độ nhạy của thụ thể này cũng 52
  65. khác nhau [44]. Ngoài ra, các thuốc gây mê dạng hít làm giảm tác dụng ức chế của Mg2+ trên thụ thể RyR1, gây kích hoạt co cơ và phản ứng TTNAT. Ở trạng thái nghỉ, Mg2+ ức chế mở kênh Ca2+ và tương tác giữa thụ thể DHPR với thụ thể RyR1 làm bất hoạt tác dụng của Mg2+, gây co cơ trong điều kiện sinh lý. Tác dụng trên của halothane và sevoflurane đã được xác nhận ở mô người. Tuy nhiên, việc tăng nồng độ Mg2+ nội bào nhằm ức chế tác dụng của thuốc gây mê đường hô hấp không phải là biện pháp điều trị khả thi [41]. Ngoài đột biến của gen RYR1 mã hóa thụ thể RyR1, các đột biến gen khác cũng ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa và thải trừ của thuốc gây mê đường hô hấp. Các thuốc gây mê đường hô hấp được sử dụng phổ biến hiện nay (isoflurane, sevoflurane, desflurane) trải qua quá trình thải trừ không đáng kể thông qua họ enzyme cytochrome CYP2E1, nên ảnh hưởng của các biến thể di truyền trong CYP2E1 đối với dược động học của thuốc gây mê đường hô hấp không có nhiều ý nghĩa lâm sàng [78]. Park và cộng sự đã chỉ ra khả năng đa hình di truyền GABAA gây phát sinh biến cố khi gây mê bằng sevoflurane trong giai đoạn hậu phẫu ở bệnh nhân nhi. Tuy nhiên, tính đa hình này chưa được nghiên cứu ở người trưởng thành [53]. Nghiên cứu của Shouroki và cộng sự đã chỉ ra khả năng gây đột biến gen của thuốc gây mê đường hô hấp (N2O, isoflurane và sevoflurane) đối với nhân viên phòng mổ, đồng thời tính đa hình của gen GST (GSTM1, GSTT1 và GSTP1) có thể điều chỉnh tác động này của các thuốc gây mê trên [57]. Điều này một lần nữa khẳng định tầm quan trọng của việc thực hiện các xét nghiệm di truyền và việc nắm bắt các thông tin dược động học, dược lực học của thuốc gây mê đường hô hấp trong chẩn đoán và phòng ngừa các phản ứng bất lợi của thuốc có thể xảy ra trên lâm sàng. 53
  66. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết quả nghiên cứu ca lâm sàng, chúng tôi rút ra một số kết luận theo hai mục tiêu đã đề ra như sau: 4.1. Xác định được nguyên nhân và vai trò quan trọng của yếu tố di truyền mã hóa cho thụ thể RyR1 trong cơ chế bệnh sinh của bệnh lý tăng thân nhiệt ác tính trong phẫu thuật thay van hai lá sử dụng thuốc gây mê đường hô hấp. 4.2. Ứng dụng được giải trình tự gen thế hệ mới và đánh giá được kết quả phân tích toàn bộ exon ở bệnh nhân tăng thân nhiệt ác tính. o Kết quả cho thấy có 18 điểm thay đổi trên gen RYR1, 15 điểm thay đổi trên gen CACNA1S và 02 điểm thay đổi trên gen STAC3. o Trong trường hợp TTNAT ở bệnh nhân A, kết quả thu được một đột biến sai nghĩa trên gen RYR1 (codon 2350, c7048G >A, p.Ala2350Thr, polyphen 2 đánh giá thang điểm gây bệnh 0.999, SIFT 0.001 ) nằm ở vùng Bsol của thụ thể RyR1 (Hình 3.2 B). Đột biến này có thể ảnh hưởng đến vị trí tương tác phosphoryl hóa với protein kinase II phụ thuộc Ca2+/CaM (CaMKII), gây ảnh hưởng đến chức năng của protein RyR1. Đây có thể là lý do để giải thích cho phản ứng TTNAT xảy ra ở bệnh nhân được kích hoạt bằng cả thuốc gây mê đường tĩnh mạch và thuốc gây mê đường hô hấp. KIẾN NGHỊ Phân tích ca lâm sàng trong nghiên cứu của chúng tôi đã khẳng định việc thực hiện các biện pháp phòng ngừa TTNAT trong gây mê phẫu thuật là rất cần thiết. Các biện pháp phòng ngừa bao gồm: Đánh giá bệnh nhân trước phẫu thuật, xác định yếu tố di truyền và theo dõi bệnh nhân có tiền sử nghi ngờ nhạy cảm với TTNAT cho đến khi các xét nghiệm được thực hiện. Danh sách bệnh nhân nhạy cảm với TTNAT trong cộng đồng và các thuốc gây mê liên quan đến tính nhạy cảm TTNAT cần được thiết lập. Ngoài ra, việc ghi nhãn hồ sơ bệnh viện cùng giáo 54
  67. dục y tế gia đình cũng cần được thực hiện. Bên cạnh đó, tất cả các bệnh nhân sử dụng nhiều hơn một loại thuốc gây mê nên được theo dõi nhiệt độ trong quá trình phẫu thuật. Không nên dùng succinylcholine trên bệnh nhân mắc bất kỳ dạng rối loạn cơ nào và thận trọng khi sử dụng thuốc gây mê dạng hít ở bệnh nhân có các rối loạn cơ đặc biệt như loạn dưỡng cơ, CCD, liệt tuần hoàn, hạ kali máu hoặc Duchenne. 55
  68. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bùi Ích Kim (2006). Dược lý học lâm sàng các thuốc mê hô hấp. Bài giảng gây mê hồi sức Tập 1. Việt Nam. 2. (2018). Công Nghệ Giải Trình Tự Gen Thế Hệ Mới - Next Generation Sequencing. Sinh Học Online, , accessed: 24/02/2020. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 3. Deile M., Damm M., và Heller A.R. (2013). [Inhaled anesthetics]. Anaesthesist, 62(6), 493–504. 4. Schraag S. (2015). The Current Role of Total Intravenous Anesthesia in Cardiac Surgery: Total Intravenous Anesthesia and Cardiopulmonary Bypass. Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia, 29, S27–S30. 5. Bennett S.R. và Griffin S.C. (2001). Sevoflurane versus isoflurane in patients undergoing valvular cardiac surgery. J Cardiothorac Vasc Anesth, 15(2), 175–178. 6. Clar D.T. và Richards J.R. (2020). Anesthetic Gases. StatPearls. StatPearls Publishing, Treasure Island (FL). 7. Cully T.R., Choi R.H., Bjorksten A.R. và cộng sự. (2018). Junctional membrane Ca2+ dynamics in human muscle fibers are altered by malignant hyperthermia causative RyR mutation. Proc Natl Acad Sci USA, 115(32), 8215–8220. 8. van Dijk E.L., Auger H., Jaszczyszyn Y. và cộng sự. (2014). Ten years of next-generation sequencing technology. Trends Genet, 30(9), 418–426. 9. Dulhunty A.F. (1992). The voltage-activation of contraction in skeletal muscle. Prog Biophys Mol Biol, 57(3), 181–223. 10. Eger E.I. (1994). New inhaled anesthetics. Anesthesiology, 80(4), 906–922.
  69. 11. Gonsalves S.G., Ng D., Johnston J.J. và cộng sự. (2013). Using exome data to identify malignant hyperthermia susceptibility mutations. Anesthesiology, 119(5), 1043–1053. 12. Grabner M., Dirksen R.T., Suda N. và cộng sự. (1999). The II-III loop of the skeletal muscle dihydropyridine receptor is responsible for the Bi- directional coupling with the ryanodine receptor. J Biol Chem, 274(31), 21913–21919. 13. Greninger A.L., Naccache S.N., Federman S. và cộng sự. (2015). Rapid metagenomic identification of viral pathogens in clinical samples by real- time nanopore sequencing analysis. Genome Med, 7, 99. 14. Hopkins P.M., Rüffert H., Snoeck M.M. và cộng sự. (2015). European Malignant Hyperthermia Group guidelines for investigation of malignant hyperthermia susceptibility. Br J Anaesth, 115(4), 531–539. 15. International Human Genome Sequencing Consortium (2004). Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature, 431(7011), 931– 945. 16. Krause T., Gerbershagen M.U., Fiege M. và cộng sự. (2004). Dantrolene a review of its pharmacology, therapeutic use and new developments. Anaesthesia, 59(4), 364–373. 17. Lander E.S., Linton L.M., Birren B. và cộng sự. (2001). Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature, 409(6822), 860–921. 18. MacLennan D.H., Abu-Abed M., và Kang C. (2002). Structure-function relationships in Ca(2+) cycling proteins. J Mol Cell Cardiol, 34(8), 897– 918. 19. Maclennan D.H. và Zvaritch E. (2011). Mechanistic models for muscle diseases and disorders originating in the sarcoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta, 1813(5), 948–964.