Khóa luận Phân lập một số hợp chất từ loài sao biển gai Acanthaster planci ở vùng biển Việt Nam

Nội dung text: Khóa luận Phân lập một số hợp chất từ loài sao biển gai Acanthaster planci ở vùng biển Việt Nam

1. TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HÓA HỌC  ĐĂNG THỊ MAI NHI PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ LOÀI SAO BIỂN GAI ACANTHASTER PLANCI Ở VÙNG BIỂN VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa học Hữu cơ Ngƣời hƣớng dẫn khoa học GV: Nguyễn Anh Hƣng HÀ NỘI - 2017
2. Khóa luận tốt nghiệp Đại học LỜI CẢM ƠN Em xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài khóa luận tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy Nguyễn Anh Hƣng, cùng các anh (chị) phòng Hóa sinh hữu cơ - Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên đã giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong khoa Hóa học- trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã đào tạo và trang bị cho em những kiến thức cơ bản giúp em thực hiện khóa luận này. Đồng thời, em xin bày tỏ lòng cảm ơn tới gia đình, bạn bè, những ngƣời đã động viên, khuyến khích, tạo mọi điều kiện để em có thể thực hiện khóa luận thành công. Trong quá trình thực hiện khóa luận, em không tránh khỏi những thiếu sót, kính mong các thầy cô và các bạn nhiệt tình đóng góp ý kiến để đề tài của em đƣợc hoàn thiện hơn nữa. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 5 năm 2017 Sinh viên Đăng Thị Mai Nhi Đăng Thị Mai Nhi Lớp: K39D - Hóa học
3. Khóa luận tốt nghiệp Đại học LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài: “Phân lập một số hợp chất từ loài sao biển gai Acanthaster planci ở vùng biển Việt Nam” là công trình nghiên cứu của riêng tôi và đƣợc sự hƣớng dẫn khoa học của thầy giáo Nguyễn Anh Hƣng. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chƣa công bố dƣới bất kỳ hình thức nào trƣớc đây. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá đƣợc chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo. Ngoài ra, trong khóa luận còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng nhƣ số liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc. Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung khóa luận của mình. Hà Nội, tháng 5 năm 2017 Sinh viên Đăng Thị Mai Nhi Đăng Thị Mai Nhi Lớp: K39D - Hóa học
4. Khóa luận tốt nghiệp Đại học DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 13C NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân cacbon 13 Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 1H - NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton Proton Magnetic Resonance Spectroscopy 2D-NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hai chiều Two-Dimensional NMR CC Sắc ký cột column chromatography DEPT Distortionless Enhancement by polarisation Transfer HMBC Heteronuclear Multiple Quantum coherence Me Nhóm Metyl MS Phổ khối lƣợng Mass Spectroscopy TLC Sắc ký lớp mỏng Thin Layer chromatography Đăng Thị Mai Nhi Lớp: K39D - Hóa học
5. Khóa luận tốt nghiệp Đại học MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Đặc điểm sinh học và phân bố của sao biển gai Acathaster Planci 3 1.2. Thành phần hóa học các loài thuộc lớp sao biển Asteroidea 4 1.2.1. Các hợp chất steroid 4 1.2.2. Nhóm hợp chất ceramide 8 1.2.3 Lipid, axit amin 10 1.2.4 Một số hợp chất khác 13 CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM 14 2.1. Nguyên liệu 14 2.2. Phƣơng pháp phân tích, phân lập các hợp chất từ dịch chiết 14 2.3. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hoá học các chất phân lập đƣợc 14 2.4. Dụng cụ, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 15 2.4.1. Dụng cụ, hóa chất 15 2.4.2.Thiết bị nghiên cứu 15 2.5. Phƣơng pháp xử lý mẫu 15 2.5. Dữ liệu phổ của các chất phân lập đƣợc 17 CHƢƠNG 3: THẢO LUẬN KẾT QUẢ 19 3.1. Cấu trúc 5α-cholestan-3α-ol. 19 3.2. Cấu trúc AC2: tyramine 24 KẾT LUẬN 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO 28 Đăng Thị Mai Nhi Lớp: K39D - Hóa học
6. Khóa luận tốt nghiệp Đại học DANH MỤC BẢNG, HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Bảng 3.1: Dữ liệu phổ của hợp chất AC1 23 Hình 2.1. Sao biển Acanthaster planci 14 Hình 3.1. Phổ 1H NMR của hợp chất AC1 20 Hình 3.2 Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất AC1 21 Hình 3.3 Phổ HSQC và HMBC của hợp chất AC1 22 Hình 3.4. Phổ 1H-NMR của hợp chất AC2 25 Hình 3.5. Phổ 13C-NMR của hợp chất AC2 26 Sơ đồ. Ngâm chiết mẫu sao biển Acanthaster Planci 17 Đăng Thị Mai Nhi Lớp: K39D - Hóa học
7. Khóa luận tốt nghiệp Đại học MỞ ĐẦU Việt Nam nằm trong khu vực Thái Bình Dƣơng và chịu ảnh hƣởng của khí hậu nhiệt đới gió mùa. Đƣờng bờ biển nƣớc ta dài và thay đổi theo vĩ tuyến, kết hợp với hình thái thềm lục địa đa dạng, đã tạo nên những nét đặc trƣng của hệ sinh thái giữa các vùng biển ở Việt Nam. Tuy nhiên từ trƣớc đến nay, trong phát triển kinh tế biển, chúng ta chủ yếu chỉ quan tâm tới những loài sinh vật biển có giá trị thực phẩm hoặc xuất khẩu, ít quan tâm tới giá trị cung cấp dƣợc liệu và các chất có hoạt tính sinh học cao cho ngành hóa dƣợc. Ngày nay, nhờ sự hỗ trợ của các kỹ thuật tiên tiến, rất nhiều hợp chất từ sinh vật biển đã đƣợc phân lập, xác định cấu trúc và thử hoạt tính sinh học. Trong số đó, nhiều hợp chất thể hiện các hoạt tính sinh học phong phú, có thể tạo ra hoặc cung cấp mẫu hình cho các thế hệ thuốc mới, cũng nhƣ các sản phẩm khác phục vụ cho cuộc sống. Từ đầu những năm 90 của thế kỷ trƣớc, các nhà khoa học biển đã có mối quan tâm đó là khám phá nguồn tài nguyên sinh vật vô cùng phong phú dƣới đáy đại dƣơng. Tuy nhiên, so với nguồn tiềm năng sinh vật biển ở nƣớc ta thì đến nay những công trình nghiên cứu trong nƣớc vẫn còn quá ít và tản mát, đƣợc biệt là những nghiên cứu về lớp sao biển (Asteroidea). Lớp Asteroidea có khoảng 1800 loài sao biển sống trên hành tinh, phân bố ở tất cả các đại dƣơng trên thế giới gồm cả Thái Bình Dƣơng, Đại Tây Dƣơng, Ấn Độ Dƣơng, Bắc Cực và các vùng đại dƣơng phía Nam. Nhƣng mới chỉ có 80 loài đƣợc nghiên cứu về thành phần hóa học cũng nhƣ hoạt tính sinh học. Có rất nhiều hợp chất đƣợc phân lập từ sao biển có cấu trúc hóa học đa dạng và thể hiện hoạt tính sinh học thú vị khác nhau nhƣ: kháng viêm, giảm đau, giảm huyết áp, gây độc tế bào, kháng khuẩn, kháng nấm, chống tăng đƣờng huyết và kháng một số dòng tế bào ung thƣ, kháng vius nhƣ virus HIV, HSV, CoxB, VSV Đăng Thị Mai Nhi 1 Lớp: K39D - Hóa học
8. Khóa luận tốt nghiệp Đại học Cho đến nay ngƣời ta phát hiện ra loài sao biển gai có tên khoa học là Acanthaster Planci có xuất hiện ở nhiều vùng biển Việt Nam và tàn phá rất nhiều các rạn san hô lớn ở Việt Nam gây ra rối loạn hệ sinh thái ở khu bảo tồn biển. Vì vậy, đã có rất nhiều cuộc phát động diệt sao biển gai để bảo vệ san hô. Do đó, chúng tôi sử dụng loài sao biển này để tiến hành đề tài “Phân lập một số hợp chất từ loài sao biển gai Acanthaster planci ở vùng biển Việt Nam”. Đăng Thị Mai Nhi 2 Lớp: K39D - Hóa học
9. Khóa luận tốt nghiệp Đại học CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Đặc điểm sinh học và phân bố của sao biển gai Acathaster Planci Sao biển Acanthaster Planci thuộc chi Acanthaster, họ Acanthasterridea, lớp. Asteroidea, ngành Echinodermata (động vật da gai) A.planci phân bố rộng khắp Ấn Độ Dƣơng - Thái Bình Dƣơng. Nó xuất hiện ở các vĩ độ nhiết đới và cận nhiệt đới từ Biển Đỏ và đông bờ biển Châu Phi qua Thái Bình Dƣơng, qua Ấn Độ Dƣơng đến bờ tây Trung Mỹ. Sao biển gai thƣờng đƣợc tìm thấy ở các vỉa san hô ngầm hay các cộng đồng san hô cứng trong khu vực độ sâu từ 5m đến 20m. Ở Việt Nam đƣợc phát hiện ở vùng biển Quảng Ninh, Quảng Trị, Quảng Nam, khu vực Nha Trang, Bà Rịa Vũng Tàu, Kiên Giang, Sao biển gai (Acanthaster planci) là loài sao biển có kích thƣớc cơ thể lớn với đƣờng kính có thể đạt tới 0.5m. Miệng nằm ở mặt bụng, hậu môn nằm ở mặt lƣng. Cơ thể chúng đƣợc bao phủ bởi các gai nhọn có chiều dài xấp xỉ 5cm nhằm bảo vệ, chống lại các đe dọa từ địch hại bao gồm cả con ngƣời. Sao biển gai có khoảng 13 đến 16 cánh mở rộng tỏa tròn từ trung tâm cơ thể. Chúng có sự khác biệt về màu sắc cơ thể, màu sắc đa dạng khác với các phần còn lại của cơ thể. Sao biển gai di chuyển chậm, tốc độ di chuyển nhanh nhất chỉ đạt 10,3 m/ngày, có thể đi lùi, quay vòng, cử động một tay độc lập với phần còn lại của cơ thể, có khả năng tái sinh các cánh tay bị gãy. Thức ăn ƣa thích của loài sao biển gai là các loài san hô thuộc giống Acropora. Chúng thƣờng ăn một mình về đêm và luôn giữ một khoảng cách nhất định với các con sao biển gai khác. Cách ăn san hô của sao biển gai rất đặc biệt: chúng đẩy dạ dày ra bao lấy san hô, tiết enzyme và hấp thụ các dịch lỏng của san hô. Đăng Thị Mai Nhi 3 Lớp: K39D - Hóa học
10. Khóa luận tốt nghiệp Đại học 1.2. Thành phần hóa học các loài thuộc lớp sao biển Asteroidea Cho đến nay nhiều loài sao biển đã đƣợc nghiên cứu hóa học, phân lập và nhận dạng đƣợc nhiều chất, thuộc các nhóm chất khác nhau. Thành phần hóa học chính của các loài thuộc lớp sao biển này chủ yếu là các steroid và hợp chất của nitơ (ceramide, cerebroside, alkaloid, nucleoside ). Ngoài ra, còn chƣa các thánh phần khác nhƣ: carboxylic acid, trierpenoid 1.2.1. Các hợp chất steroid Steroid là lớp chất chính có trong thành phần hóa học ở sao biển. các steroid phân cực thƣờng đƣợc chia làm 4 loại: polyhydroxy steroid, steroid sulfate, glycoside polyhydroxy steroid và các asterosaponine. Trƣớc năm 2000 đã có một số công bố về nhóm chất polyhydroxy steroid từ sao biển. Trong vài năm gần đây, khoảng 50 hợp chất polyhydroxy steroid mới đã đƣợc phân lập từ nguồn tài nguyên này. Năm 2003, từ loài sao biển Certonardoa semiregularis thu thập đƣợc ở gần đảo Komun, Hàn quốc học đã phân lập đƣợc 13 hợp chất polyhydroxysteroid mới đặt tên là certonardpsterol A-M (1-13) [1]. Mạch nhánh của các hợp chất (9), (10) lần đầu tiên đƣợc tìm thấy trong các hợp chất sterol bị oxi hóa trong tự nhiên. Năm 2004, tiếp tục nghiên cứu về loài sao biển Certonardoa semiregularis nhóm nghiên cứu này đã tách đƣợc thêm 11 hợp chất polyhydroxysteroid mới (14-24). Trong đó, năm hợp chất (14), (15), (19-24) thuộc nhóm tetrol, một nhóm hợp chất rất hiếm khi phân lập đƣợc từ các loài sao biển đã đƣợc nghiên cứu trƣớc đây [2]. Đăng Thị Mai Nhi 4 Lớp: K39D - Hóa học
11. Khóa luận tốt nghiệp Đại học Đăng Thị Mai Nhi 5 Lớp: K39D - Hóa học
12. Khóa luận tốt nghiệp Đại học Năm 2005 từ loài sao biển Certonardoa semiregularis đã phân lập đƣợc 10 hợp chất glycoside mới, kí hiệu là certonardosides A-J (25-29) [3]. Năm 2005, nhóm nghiên cứu Phạm Quốc Long và cộng sự đã bƣớc đầu nghiên cứu về thành phần hóa học loài sao biển Anthenea pentagonula phân lập đƣợc hai hợp chất steroid là 5α-cholestan-3α-ol (30); 5α-cholest-7-en-3β- ol (31) và một cụm phân tử cerebroside [4]. Đăng Thị Mai Nhi 6 Lớp: K39D - Hóa học
13. Khóa luận tốt nghiệp Đại học 5α-cholestan-3α-ol 5α-cholest-7-en-3β-ol Nhóm nghiên cứu Phạm Quốc Long và cộng sự kết hợp các phƣơng pháp sắc ký nghiên cứu các hợp chất steroid glycoside từ sao biển Acanthaster planci đã phân lập đƣợc 4 hợp chất polyhydroxysteroid glycoside mới đặt tên là planciside A-D (33-36). Từ loài sao biển Culcita novaeguineae, Iorizzi và cộng sự đã phân lập đƣợc 11 polyhydroxysteroid glycoside trong đó có 5 hợp chất mới là culcitoside C4, C5, C6, C7, C8. (37-41), các hợp chất này đều chứa 2 phân tử đƣờng ở mạch nhánh [6]. 37 39 41 38 40 Năm 2014, từ loài sao biển Leptasterias ochotensis, Timofey và cộng sự đã phân lập đƣợc 6 asterosaponin mới leptasterioside A-F (42-47) trong đó các hợp chất (44-47) có cùng chuỗi phân tử đƣờng D-fucopyranosyl-(1 2)- Đăng Thị Mai Nhi 7 Lớp: K39D - Hóa học
14. Khóa luận tốt nghiệp Đại học β-D-fucopyranosyl-(1 4)-[β-D-quinovopyranosyl-(1 2)]-β-D- glucopyranosyl-(1 3)-β-D-quinovopyranosyl. Đây là chuỗi cacbohydrat đầu tiên đƣợc phân lập từ sao biển [7]. 44 45 42 43 46 47 1.2.2. Nhóm hợp chất ceramide Có hơn 90 dẫn xuất ceramide đã đƣợc phân lập và xác định từ 16 loài sao biển. Ceramide là dạng đơn giản nhất của các sphingolipid. Các ceramide là một họ lipid có cấu tạo bởi một axit béo mạch dài gắn với các aminoancol kiểu sphingosine qua các liên kết amit, một trong những thành phần cơ bản cấu thành sphingomyelin ở lớp lipid kép ở màng tế bào. Cerebroside là glycosphingolipid – thành phần quan trọng trong cơ động vất và màng tế bào thần kinh. Chúng đƣợc cấu tạo bởi một ceramide gắn với một hoặc hai đƣờng tại C-1. Hợp phần đƣờng có thể là glucose hoặc galactose và vì thế hai loại cerebroside chính đƣợc gọi là glucocerebroside và galactocerebroside. Glucocerebroside là cerebroside chính đƣợc tìm thấy ở sao biển còn galactocerebroside thì rất hiếm khi có mặt. một số lƣợng lớn các glucocerebroside đƣợc phân lập và nghiên cứu hoạt tính từ sao biển trong số đó có các chất có hoạt tính gây độc tế bào. Năm 1994, từ loài sao biển Ophidiaster ophidianus, Jin và cộng sự đã phân lập đƣợc 5 glycosphingolipid là ophidiacerebroside A-E (48-52) [8]. Đăng Thị Mai Nhi 8 Lớp: K39D - Hóa học
15. Khóa luận tốt nghiệp Đại học Từ loài sao biển Oreaster reticulates thu thập tại đảo Grand Bahama (Bahamas), đã có 12 hợp chất đƣợc phân lập, trong đó 9 hợp chất mới là oreacerebroside A-I (53-61) và 3 hợp chất đã biết ophidiacerebroside C-E (50-52) [toàn văn 56]. Các hợp chất oreacerebroside D-I là các galactocerebroside lần dầu tiên đƣợc phân lập từ sao biển, trƣớc đó nó mới chỉ đƣợc tìm thấy từ các loài sao biển Culcita novaeguineae [9]. 48 50 53 56 51 54 57 49 52 55 58 59 60 61 Hai hợp chất ceramide lactoside là acathactoside A, B (62,63) đã đƣợc phân lập từ loài sao biển Acanthaster Planci [11]. Bốn ceramide lactoside luidialactoside A-D (64) cũng đƣợc phân lập từ loài Luidia maculate [10]. Đăng Thị Mai Nhi 9 Lớp: K39D - Hóa học
16. Khóa luận tốt nghiệp Đại học 62 63 64 66 65 67 Năm 2006, từ loài sao biển Luidia maculate, Masanori và cộng sự đã phân lập đƣợc các hợp chất ceramide: LM Cer-1-1 (68); LM Cer-2-1 (69); LM Cer-2-6 (70); LM Cer-2-7 (71). Trong đó hợp chất (68) lần dầu tiên đƣợc phân lập từ loài sao biển này [12]. 68 69 70 71 1.2.3 Lipid, axit amin * Lipid Lipid là thành phần quan trọng trong cơ thể sống, nó có chức năng là chất dự trữ năng lƣợng, khi oxy hóa. Một gam lipid có thể thu đƣợc 9,3Kcal, trong khi đó 1 gam gluxit hoặc protein chuyển hóa chỉ cho 4 Kcal. Trong màng sinh học, lipid ở trạng thái liên kết với protein tạo thành hợp chất Đăng Thị Mai Nhi 10 Lớp: K39D - Hóa học
17. Khóa luận tốt nghiệp Đại học lipoproteid cấu tạo nên màng tế bào. Chính nhờ các tính chất của hợp chất này đã tapoj cho màng sinh vật có đƣợc tính thẩm thấu chọn lọc, tính cách điện. ngoài ra, lipid còn có thể liên kết với nhiều chất đơn giản khác thành những hợp chất có tính chất sinh học khác nhau. Những phức hợp đó có vai trò quan trọng trong các hoạt động thần kinh và bắp thịt. Lipid không tan với nƣớc, nhƣng chúng có khả năng hòa tan nhiều loại vitamin quan trọng nhƣ: A, K, D, E và giúp ruột hấp thụ tốt hơn các loại vitamin này. Năm 2003, nhóm nghiên cứu của GS.TS Phạm Quốc Long và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu hàm lƣợng lipid tổng của 3 loài sao biển: sao biển Linckia laevigata, sao biển Culcita novaeguineae, sao biển Protoraester nodosus thu đƣợc ở vùng biển Quảng Ninh cho hàm lƣợng lipid tổng khá cao lần lƣợt là 2.32%, 1,59%, 1,85%. * Axit amin Axit amin hay amino axit là hợp chất hữu cơ có chứa nhóm cacboxyl (- COOH) và nhóm amin (NH2), vừa có tính axit, vừa có tính bazo. Theo quan điểm dinh dƣỡng ngƣời ta chia axit amin thành 2 nhóm: axit amin không thay thế và axit amin thay thế. Động vật và con ngƣời không có khả năng tổng hợp một số axit amin mà phải lấy qua thức ăn, đó là các axit amin cần thiết hoặc không thay thế đƣợc nhƣ: arginine, methionine, phenyl alanine, Các axit amin này tham dự vào nhiều quá trình chuyển hóa trong cơ thể nhƣ tổng hợp các chất dẫn truyền thần kinh, đổi mới các sợi cơ bắp, Do vậy, nhu cầu cho cơ thể bao giờ cũng chỉ đáp ứng đủ, thừa hoặc thiếu đều gây nên bất lợi cho cơ thể. Một số axit amin có trong các loài sao biển nhƣ axit amin glutamic (6,25-7,85%), α-amino propionic (2,24-3,62%), glycine (7,3-10,4%), glysine (0,29-9,87%), phenyl alanine (0,17-3,82%), tuy nhiên cũng thấy rằng thành phần hàm lƣợng là có khác biệt. Đăng Thị Mai Nhi 11 Lớp: K39D - Hóa học
18. Khóa luận tốt nghiệp Đại học * Axit béo Axit béo là hiđrocacbon no hoặc không no liên kết với một hoặc nhiều nhóm chức acid (-COOH). Phân tử tồn tại ở dạng mạch thẳng, mạch nhánh hay mạch vòng, có phân tử lƣợng lớn. Axit béo thƣờng gặp là những axit béo có số C chẵn, mạch thẳng, có thể no hoặc không no. Ngoài nhóm chức axit, nó còn liên kết với một số nhóm chức khác nhƣ: rƣợu, xeton Trong tế bào sống, các axit béo thƣờng không tồn tại ở dạng tự do mà hầu hết ở dạng kết hợp trong các lipit khác nhau nhƣ: triaxiglixerol, sáp, steric, các lipid phức tạp khác nhau. Khi nghiên cứu sao biển Culcita novaeguineae thu đƣợc tại vùng biển Nha Trang và sao biển Archaster typicus thu đƣợc tại vùng biển Quảng Ninh, nhóm nghiên cứu GS. TS. Phạm Quốc Long đã xác định thành phần axit palmitic (72) với hàm lƣợng khá cao tƣơng ứng là 13,814% và 13,014%. Tuy nhiên, cùng loài sao biển đỏ trên thu đƣợc tại vùng biển Quảng Ninh lại cho hàm lƣợng axit palmitic thấp hơn nhiều (2,535 %). 72 Thành phần axit stearic (73) của 3 loại sao biển: sao biển Archaster typicus, sao biển đỏ Protoraester nodosus và sao biển Anthenea asper, thu đƣợc tại vùng biển Quảng Ninh, đƣợc nghiên cứu bởi nhóm nghiên cứu GS. TS. Phạm Quốc Long và cộng sự năm 2010 cho kết quả lần lƣợt là: 8,851%, 7,780% và 7,330%. 73 Đăng Thị Mai Nhi 12 Lớp: K39D - Hóa học
19. Khóa luận tốt nghiệp Đại học Thành phần axit oleic (74) của sao biển Linckia larvigata và sao biển Culcita novaeguineae thu đƣợc tại vùng biển Quảng Ninh, đƣợc nghiên cứu bởi nhóm nghiên cứu GS. TS Phạm Quốc Long và cộng sự năm 2010 cho kết quả lần lƣợt nhƣ sau: 19,044% và 18,113%. 74 1.2.4 Một số hợp chất khác Theo những nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài sao biển cho thấy ngoài các steroid, ceramide và cerebroside thì còn có thể tìm thấy các hợp chất thứ cấp khác nhƣ dẫn xuất mycosporine, alkaloid, isoquinoline alkaloid, glycolipid, icosanoid, dẫn xuất taurine, dipeptide, anthraquinone, xanthosine, pyrrol và dẫn xuất triterpenoid Năm 1957, từ loài sao biển Asterina pectinifera, Wickberg và cộng sự đã phân lập đƣợc hợp chất 2-amino-3-hydroxy-1-propanesulfonic axit (72) và asterina 330 (palythine-3-N-(2-hydroxyethyl) (73) [13]. 75 76 Đăng Thị Mai Nhi 13 Lớp: K39D - Hóa học
20. Khóa luận tốt nghiệp Đại học CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Nguyên liệu Nguyên liệu để nghiên cứu là loài sao biển Acanthaster planci. Mẫu tƣơi đƣợc thu thập tại khu vực Bái Tử Long, Quảng Ninh vào tháng 04/2015 và đƣợc PGS.TS. Đỗ Công Thung - Viện Tài nguyên và Môi trƣờng biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam xác định tên khoa học là Acanthaster Planci. Tiêu bản đƣợc lƣu giữ tại Viện hóa sinh biển và Viện tài nguyên và môi trƣờng biển. Hình 2.1. Sao biển Acanthaster planci 2.2. Phƣơng pháp phân tích, phân lập các hợp chất từ dịch chiết Sắc ký lớp mỏng. Sắc ký cột thƣờng 2.3. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hoá học các chất phân lập đƣợc Cấu trúc của chất phân lập ra đƣợc xác định bằng sự kết hợp của nhiều phƣơng pháp khác nhau: phổ khối va chạm electron (ESI-MS), các phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR), phổ cộng Đăng Thị Mai Nhi 14 Lớp: K39D - Hóa học
21. Khóa luận tốt nghiệp Đại học hƣởng từ hạt nhân hai chiều ( COSY, NOESY, HSQC, HMQC), phƣơng pháp xác định điểm nóng chảy 2.4. Dụng cụ, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 2.4.1. Dụng cụ, hóa chất Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình nghiên cứu đƣợc mua của các hãng Merck, Sigma-Aldrich và Xilong. Dung môi chạy sắc ký đƣợc cất lại và làm khan trƣớc khi sử dụng. 2.4.2.Thiết bị nghiên cứu 4 Phổ NMR đƣợc đo trong dung môi CDCl3 hoặc MeOD d tại nhiệt độ phòng trên máy Bruker AV 500, tại 500 MHz cho 1H NMR và 125 MHz cho 13C NMR. Chất chuẩn nội là TMS. Phổ MS đƣợc đo trên máy Agilent (USA) 1100 LC-MSD Trap. Điểm nóng chảy đƣợc đo trên máy Kofler microhot stage Sắc ký lớp mỏng (TLC) đƣợc thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC Alufolien 60 F254 (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại 2 bƣớc sóng 254 nm và 365 nm, hoặc dùng thuốc thử là CeSO4/H2SO4, KMnO4, Dragendorff, N-inhydrin, Iot. Sắc ký cột đƣợc thực hiện với chất hấp phụ là siliga gel pha thƣờng (Merck) cỡ hạt 0,04- 0,063 mm. 2.5. Phƣơng pháp xử lý mẫu Mẫu tƣơi đã cắt miếng nhỏ, cho vào bình ngâm chiết ba lần với methanol trong thiết bị siêu âm siêu âm ở nhiệt độ 40 ºC. Dịch tổng thu đƣợc đƣợc cất kiệt dung môi dƣới áp suất giảm, nhiệt độ < 50 ºC thu đƣợc cặn chiết tổng metanol. Cặn chiết này đƣợc chiết phân đoạn lần lƣợt bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexane, ethyl acetate). Sau đó đuổi kiệt dung môi và chiết cặn còn lại bằng metanol thu đƣợc 3 cặn tƣơng ứng lần lƣợt là n- hexane (APH), ethyl acetate (APE) và methanol (APM). Đăng Thị Mai Nhi 15 Lớp: K39D - Hóa học
22. Khóa luận tốt nghiệp Đại học Để phân lập các chất sạch từ hỗn hợp các chất có trong từng loại cặn dịch chiết, các phƣơng pháp sắc ký (sắc ký lớp mỏng (SKLM), sắc ký cột thƣờng silica gel Merck 63-200 nm, với các dung môi và hệ dung môi thích hợp) đã đƣợc sử dụng phối hợp cùng các phƣơng pháp kết tinh phân đoạn và kết tinh lại. Quá trình nghiên cứu sẽ nêu chi tiết ở phần thực nghiệm. Các phân đoạn dịch chiết nói trên đƣợc làm khan bằng Na2SO4, lọc qua giấy lọc rồi cất kiệt dung môi dƣới áp suất giảm, cặn đƣợc sấy khô và cân đến khối lƣợng không đổi. Nhƣ vậy, từ loài sao biển Acanthaster planci thu đƣợc 3 loại cặn chiết đƣợc ký hiệu lần lƣợt là: APH, APE và APM Ở đó: APH: Cặn chiết n-hexane của loài Sao biển Acanthaster planci APE: Cặn chiết ethyl acetate của loài Sao biển Acanthaster planci APM: Cặn chiết methanol của loài Sao biển Acanthaster planci Đăng Thị Mai Nhi 16 Lớp: K39D - Hóa học
23. Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sơ đồ. Ngâm chiết mẫu sao biển Acanthaster Planci Mẫu Acanthaster planci (10kg) 1. 5x6l MeOH 2.Đuổi dung môi Cặn MeOH (330g) 1.+ H 2 O 2.5x1l Hexan Đu ổ i dung môi Cặn hexan 160g (APH) Dịch cái 5x1l EtOAc Đuổi dung môi EEtOAC Cặn EtOAc 100g (APE) Dịch cái 1. Cô khô 2.3x1l MeOH Loại bã Cặn MeOH Đuổi dung môi Cặn khô 59g (APM) Kết quả thu nhận các dịch chiết từ loài sao biển Acanthaster planci tại Quảng Ninh 2.5. Dữ liệu phổ của các chất phân lập đƣợc AC1: Đăng Thị Mai Nhi 17 Lớp: K39D - Hóa học
24. Khóa luận tốt nghiệp Đại học 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3),  (ppm): 4,03 (1H, br, H-3); 1,96 (1H, dt, H-12); 1,86 (2H, m, H-16); 1,67 (1H, m, H-7); 1,69/1,62 (2H, m, H-2); 1,52 (1H, m, H-5); 1,45 (1H, m, H-1); 1,51 (1H, m, H-25); 1,09 (1H, m, H-17); 0,65 (3H, s, H-18); 0,78 (3H, s, H-19); 0,90 (3H, d, J = 6,4 Hz, H-21); 0,86 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-26); 0,87 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-27). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3),  (ppm): 32,2 (t, C-1); 29,1 (t, C-2); 66,6 (d, C-3); 35,9 (t, C-4); 39,2 (d, C-5); 28,6 (t, C-6); 32,0 (t, C-7); 35,5 (d, C-8); 54,4 (d, C-9); 36,1 (s, C-10); 20,8 (t, C-11); 40,0 (t, C-12); 42,6 (s, C-13); 56,6 (d, C-14); 24,2 (t, C-15); 28,3 (t, C-16); 56,3 (d, C-17); 12,1 (q, C-18); 11,2 (q, C-19); 35,8 (d, C-20); 18,7 (q, C-21); 36,2 (t, C-22); 23,8 (t, C-23); 39,5 (t, C-24) ; 28,0 (d, C-25); 22,8 (q, C-26) ; 22,6 (q, C-27). AC2: bột màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 164-165 0C 1 H NMR (500 MHz, CD3OD)  (ppm): 7,11 (d, 2H, J = 8,5 Hz, H-2, H- 6); 6,79 (d, 2H, J = 8,5 Hz, H-3, H-5); 3,13 (dd, 2H, J = 8,0; 7,0 Hz, H-8), 2,88 (dd, 2H, J = 8,0; 7,0 Hz, H-7). 13 C NMR (125 MHz, CD3OD)  (ppm): 157,7 (C-4); 130,8 (C-2, C-6); 128,5 (C-1); 116,7 (C-3, C-5); 42,3 (C-8); 34,0 (C-7). Đăng Thị Mai Nhi 18 Lớp: K39D - Hóa học
25. Khóa luận tốt nghiệp Đại học CHƢƠNG 3: THẢO LUẬN KẾT QUẢ 3.1. Cấu trúc 5α-cholestan-3α-ol. AC1: Trong các phổ 1H-NMR và 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT đã cho biết trong phân tử của chất AC1 có 27 nguyên tử cacbon trong đó có 05 nhóm CH3, 12 nhóm methylen (CH2), 8 nhóm metilen (CH) và 2 nguyên tử cacbon bậc 4. Phổ khối lƣợng ESI-MS cho [M]+ 388 amu. Các dữ liệu phổ 13C-NMR và ESI-MS cho phép xác định công thức phân tử chất này là C27H48O. Đây là một hợp chất thuộc khung cholestan. Trên phổ 1H-NMR quan sát đƣợc cho tín hiệu của proton thuộc cacbon methin có liên kết với nhóm hydroxyl (OH) tại H 4,03 (H-3), cùng với proton methin tại H 0,99 (1H, H-14) và 1,09 (1H, H-15). Ngoài ra trên phổ của hợp chất này cũng quan sát đƣợc tín hiệu của cacproton thuộc 5 nhóm methyl, trong đó có 2 tín hiệu ở dạng singlet tại H 0,65 (H-18); 0,78 (H-19) và tín hiệu của 3 nhóm methyl còn lại đều ở dạng doublet tại H 0,90 (3H, d, H-21), 0,86 (3H, d, H-26); và 0,87 (3H, d, H-27). Đăng Thị Mai Nhi 19 Lớp: K39D - Hóa học
26. Khóa luận tốt nghiệp Đại học Hình 3.1. Phổ 1H NMR của hợp chất AC1 Trên phổ 13C-NMR và DEPT cho biết ở vùng trƣờng thấp có tín hiệu cộng hƣởng cacbon methin C 66,6 ppm (C-3) tƣơng ứng với proton tại H 4,03 ppm (H-3). Hơn nữa cũng thấy rõ đặc trƣng của 5 cacbon methyl tại C 12,1 (q, C-18); 11,2 (q, C-19); 22,8 (q, C-26) ; 22,6 (q, C-27) tƣơng ứng với phổ 1H-NMR chỉ ra tín hiệu của 5 nhóm methyl. Đăng Thị Mai Nhi 20 Lớp: K39D - Hóa học
27. Khóa luận tốt nghiệp Đại học Hình 3.2 Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất AC1 Phân tích phổ HSQC và HMBC của AC1 chỉ ra một số tƣơng tác đặc trƣng: H-18 tƣơng tác với cacbon tại ví trí C-12, C-13 và C-14, H-19 có tƣơng tác với C-1, C-10, và C-9, H-1 tƣơng tác với C-2, C-19, và C-10. Đăng Thị Mai Nhi 21 Lớp: K39D - Hóa học
28. Khóa luận tốt nghiệp Đại học Hình 3.3 Phổ HSQC và HMBC của hợp chất AC1 Đăng Thị Mai Nhi 22 Lớp: K39D - Hóa học
29. Khóa luận tốt nghiệp Đại học Kết hợp các dữ liệu phổ thu đƣợc với tài liệu tham khảo đã cho phép khẳng định cấu trúc của chất AC1 hoàn toàn phù hợp với cấu trúc hoá học của 5α-cholestan-3α-ol. Bảng 3.1: Dữ liệu phổ của hợp chất AC1 CC δc ppm δc ppm δH (SBI-5)(J, Hz) C δc ppm δc ppm δH (SBI-5) SBI-5 (TLTK) (SBI-5) (TLTK) (J, Hz) 1 1 32,2 (t) 32,2 (t) 1.45 (m)/1.29 (m) 15 24,2 (t) 24,2 (t) 1.01 * 22 29,1 (t) 29,1 (t) 1.62 (m)/1.69 (m) 16 28,3 (t) 28,2 (t) 1,86 (2H,m) 33 66,6 (d) 66,5 (d) 4,03 (1H, br, s) 17 56,3 (d) 56,3 (d) 1,09 (1H) 44 35,9 (t) 35,9 (t) 1,49* 18 12,1 (q) 12,1 (q) 0,65 (3H, s) 55 39,2 (d) 39,1 (d) 1,52 (1H, m) 19 11,2 (q) 11,2 (q) 0,78 (3H, s) 66 28,6 (t) 28,6 (t) 1,21* 20 35,8 (d) 35,8 (d) 1.50* Đăng Thị Mai Nhi 23 Lớp: K39D - Hóa học
30. Khóa luận tốt nghiệp Đại học 77 32,0 (t) 32,0 (t) 1.67 (m)/1.48 ( m) 21 18,7 (q) 18,7 (q) 0,90(3H, d,6.4Hz) 88 35,5 (d) 35,5 (d) 1,35* 22 36,2 (t) 36,2 (t) 1.39 (m)/0.98 (m) 99 54,4 (d) 54,3 (d) 0,74* 23 23,8 (t) 23,9 (t) 1.16 (m) /1.33 (m) 110 36,1 (s) 36,1 (s) - 24 39,5(t) 39,5 (t) 1,13 (2H) 111 20,8 (t) 20,8 (t) 1.55* 25 28,0 (d) 28,0 (d) 1,51 (1H,m) 112 40,1 (t) 40,1 (t) 1.96 (dt) 26 22,8 (q) 22,8 (q) 0,86 (3H,d, 6Hz) 113 42,6 (s) 42,6 (s) - 27 22,6 (q) 22,5 (q) 0,87 (3H,d,6H z) 114 56,6 (d) 56,5 (d) 0,99 (1H, m) 3.2. Cấu trúc AC2: tyramine Hợp chất AC2 là chất bột màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 165ºC. Phổ 1H-NMR của hợp chất AC2 cho biết có tín hiệu của 5 proton thuộc vòng 13 thơm, 2 nhóm CH2 trong đó có một nhóm gắn với N. Kết hợp với các phổ C NMR, và MS có thể xác định cấu trúc của hợp chất AC2 hoàn toàn phù hợp với cấu trúc hoá học của chất tyramine. Đăng Thị Mai Nhi 24 Lớp: K39D - Hóa học
31. Khóa luận tốt nghiệp Đại học Hình 3.4. Phổ 1H-NMR của hợp chất AC2 Đăng Thị Mai Nhi 25 Lớp: K39D - Hóa học
32. Khóa luận tốt nghiệp Đại học Hình 3.5. Phổ 13C-NMR của hợp chất AC2 Hợp chất AC2 thu đƣợc có cấu trúc nhƣ sau: Đăng Thị Mai Nhi 26 Lớp: K39D - Hóa học
33. Khóa luận tốt nghiệp Đại học KẾT LUẬN 1. Đã phân lập đƣợc 2 hợp chất là 5α-cholest-7-en-3β-ol và tyramine từ cặn hexan loài sao biển Acanthaster planci. 2. Cấu trúc của các hợp chất này đƣợc xác định nhờ vào các phƣơng pháp phổ hiện đại nhƣ phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13 C-NMR, DEPT 135 và DEPT 90), hai chiều (HSQC, HMBC) và tài liệu tham khảo. Đăng Thị Mai Nhi 27 Lớp: K39D - Hóa học
34. Khóa luận tốt nghiệp Đại học TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Wang W, Li F, Park Y, Hong J, Lee Ch-O, Kong JY, Snin S, Im KS, Jung JH., “Bioactive sterols from the starfish Certonardoa semiregularis”, Journal of Natural Products, (2003) 66, 384-391 2. Wang W, Jang H, Hong J, Lee Ch-O, Im KS, Bae S-I, Jung JH., “Additional cytotoxic sterols and saponins from the starfish Certonardoa semiregularis”, Journal of Natural Products, (2004), 67, 1654-1660. 3. Wang W, Jang H, Hong J, Lee CO, Bae SI, Shinm S, Jung JH, “New cytotoxic sulfates saponins from the starfish Certonardoa semiragularis”, Archives of Pharmacal Research, (2005) 28, 285-289. 4. E. Kho, D.K. Imagawa, M. Rohmer, Y. Kashman, C. Djerassi, Sterols in marine invertebrates. 22. Isolation and structure elucidation of conicasterol and theonellasterol, two new 4-methylene sterols from the red sea sponges Theonella conica and Theonella swinhoei, The Journal of Organic Chemistry, 46 (1981) 1836-1839. 5. T.V. Malyarenko, A.A. Kicha, N.V. Ivanchina, A.I. Kalinovsky, R.S. Popov, O.S. Vishchuk, V.A. Stonik, Asterosaponins from the Far Eastern starfish Leptasterias ochotensis and their anticancer activity, Steroids, 87 (2014) 119-127. 6. W. Jin, K.L. Rinehart, E.A. Jares-Erijman, Ophidiacerebrosides: cytotoxic glycosphingolipids containing a novel sphingosine from a sea star, The Journal of Organic Chemistry, 59 (1994) 144-147. 7. M. Inagaki, T. Nakata, R. Higuchi, Isolation and structure of agalactocerebroside molecular species from the starfish Culcita novaeguineae, Chemical & pharmaceutical bulletin, 54 (2006) 260-261. Đăng Thị Mai Nhi 28 Lớp: K39D - Hóa học
35. Khóa luận tốt nghiệp Đại học 8. M. Inagaki, K. Nakamura, S. Kawatake, R. Higuchi, Isolation and structural determination of four new ceramide lactosides from the starfish Luidia maculata, European Journal of Organic Chemistry, 2003, 325-331. 9. Y. Kawano, R. Higuchi, R. Isobe, T. Komori, Biologically active glycosides from asteroidea, XVII. Glycosphingolipids from the starfish Acanthaster planci, 3. Isolation and structure of two new ceramide lactosides, Liebigs Annalen der Chemie, 1988 (1988) 1181-1183. 10. Masanori Inagaki, Yuriko Ikeda, Satoshi Kawatake, Kazufumi Nakamura, Miyuki Tanaka, Eriki Misawa, Muneo Yamada, Ryuichi Higuchi, “Isolation and structure of four new ceramides from the starfish Luidia maculate”, (2006), 1647-1649. Đăng Thị Mai Nhi 29 Lớp: K39D - Hóa học