›

Khóa luận Nhận xét đặc điểm đột biến EGFR huyết tương ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ tại Bệnh viện Bạch Mai năm 2017 - 2018

pdf 65 trang thiennha21 18/04/2022 5681
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nhận xét đặc điểm đột biến EGFR huyết tương ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ tại Bệnh viện Bạch Mai năm 2017 - 2018", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfnhan_xet_dac_diem_dot_bien_egfr_huyet_tuong_o_benh_nhan_ung.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nhận xét đặc điểm đột biến EGFR huyết tương ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ tại Bệnh viện Bạch Mai năm 2017 - 2018

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN HỮU THẮNG NHẬN XÉT ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN EGFR HUYẾT TƯƠNG Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ TẠI BỆNH VIỆN BẠCH MAI NĂM 2017 – 2018 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA Hà Nội – 2019
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN HỮU THẮNG NHẬN XÉT ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN EGFR HUYẾT TƯƠNG Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ TẠI BỆNH VIỆN BẠCH MAI NĂM 2017 – 2018 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA KHÓA QH.2013.Y NGƯỜI HƯỚNG DẪN 1: PGS.TS. PHẠM CẨM PHƯƠNG NGƯỜI HƯỚNG DẪN 2: PGS.TS. LÊ THỊ LUYẾN Hà Nội – 2019 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  3. LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin bày tỏ lòng tri ơn sâu sắc tới PGS.TS. Phạm Cẩm Phương và PGS.TS. Lê Thị Luyến, là những người thầy, người hướng dẫn khoa học, đã tận tình giúp đỡ, động viên em trong suốt quá trình học tập, trực tiếp hướng dẫn em thực hiện nghiên cứu, góp ý và sửa chữa khóa luận tốt nghiệp. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy, cô giáo Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, là những người đã tận tình truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm quý báu đồng thời tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành khóa luận này. Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến những thầy cô, đồng nghiệp, những người đã tạo mọi điều kiện, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận: GS.TS. Mai Trọng Khoa, PGS.TS. Trần Đình Hà (Trung tâm Y học hạt nhân và Ung bướu, Bệnh Viện Bạch Mai), TS. Nguyễn Thuận Lợi, ThS. Nguyễn Tiến Lung, cùng toàn thể các bác sỹ, điều dưỡng, kỹ thuật viên Đơn vị Gen – Tế bào gốc, Trung tâm Y học hạt nhân và Ung bướu, Bệnh Viện Bạch Mai đã giúp đỡ em trong quá trình thu thập số liệu phục vụ cho nghiên cứu. Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, gia đình, bạn bè đã giúp đỡ và ủng hộ em trong quá trình học tập. Tuy nhiên vì kiến thức chuyên môn còn hạn chế và bản thân còn thiếu nhiều kinh nghiệm thực tiễn nên nội dung của khóa luận không tránh khỏi thiếu sót, em rất mong nhận sự góp ý để khóa luận này được hoàn thiện hơn Hà Nội, tháng 05 năm 2019 Nguyễn Hữu Thắng @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  4. DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Ký hiệu/từ Viết đầy đủ / ý nghĩa viết tắt American Joint Committee on Cancer (Uỷ ban liên hiệp AJCC Ung thư Hoa Kỳ) ATP Adenosine triphosphate CEA Carcinoembryonic Antigen ctDNA Circulating tumor DNA (DNA khối u trong máu) DNA Deoxyribonucleic acid Epidermal Growth Factor Receptor (Thụ thể yếu tố tăng EGFR trưởng biểu bì) Epithelial-mesenchymal transitions (Chuyển dạng biểu mô- EMT trung mô) Food and Drug Administration (Cơ quan thực phẩm và FDA dược phẩm Hoa Kỳ) kDa KiloDalton OS Overall survival (Thời gian sống thêm toàn bộ) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi) Positron Emission Tomography (Chụp cắt lớp phát xạ PET-CT positron) Progression-free survival (Thời gian sống bệnh không tiến PFS triển) PI3K Phosphatidylinositol-3-kinase RR Relative risk (Nguy cơ tương đối) SCC Squamos Cell Carcinoma (Ung thư biểu mô vảy) Single-photon Emission Computed Tomography (Chụp cắt SPECT lớp điện toán bức xạ đơn photon) TKI Tyrosine kinase inhibitor (Ức chế tyrosine kinase) TNM T: tumor; N: lymph node; M: metastasis UTPKTBN Ung thư phổi không tế bào nhỏ WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU i
  5. MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1 –TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ (UTPKTBN) 3 1.1.1. Dịch tễ học 3 1.1.2. Yếu tố nguy cơ 3 1.1.3. Triệu chứng 3 1.1.4. Chẩn đoán 5 1.2. THỤ THỂ YẾU TỐ TĂNG TRƯỞNG BIỂU BÌ (EGFR) 8 1.2.1. Cấu trúc và sự hoạt hoá của EGFR 8 1.2.2. Đột biến EGFR 10 1.2.3. Điều trị UTPKTBN bằng thuốc ức chế tyrosine kinase (TKIs) phân tử nhỏ 12 1.2.4. Sự kháng thuốc ức chế tyrosine kinase (TKIs) 13 1.2.5. Phương pháp lấy mẫu, xác định đột biến gen EGFR mẫu huyết tương trong UTPKTBN 16 1.2.6. Tình hình nghiên cứu đột biến EGFR huyết tương ở bệnh nhân UTPKTBN 21 CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 24 2.1.1. Tiêu chuẩn chọn lựa 24 2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ 24 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu 24 2.2.2. Cỡ mẫu 24 2.2.3. Các biến số, chỉ số trong nghiên cứu 24 2.2.4. Thời gian nghiên cứu 24 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU ii
  6. 2.2.5. Địa điểm nghiên cứu 25 2.2.6. Các bước thực hiện 25 2.3. VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 26 CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27 3.1. ĐẶC ĐIỂM ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 27 3.1.1. Đặc điểm lâm sàng 27 3.1.2. Đặc điểm mô bệnh học và giai đoạn bệnh 27 3.2.KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN EGFR HUYẾT TƯƠNG . 28 3.3. MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN TRẠNG THÁI ĐỘT BIẾN EGFR HUYẾT TƯƠNG. 29 3.3.1. Mối liên quan giữa đột biến EGFR huyết tương với đặc điểm bệnh nhân 29 3.3.2. Mối liên quan giữa đột biến EGFR huyết tương với mô bệnh học và giai đoạn bệnh 30 3.3.3. Đột biến T790M và một số yếu tố liên quan 31 CHƯƠNG 4 – BÀN LUẬN 34 4.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 34 4.1.1. Đặc điểm lâm sàng 34 4.1.2. Đặc điểm mô bệnh học – giai đoạn bệnh 35 4.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN EGFR HUYẾT TƯƠNG 35 4.3. MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN TRẠNG THÁI ĐỘT BIẾN EGFR HUYẾT TƯƠNG 36 4.3.1. Mối liên quan giữa tình trạng dột biến EGFR với đặc điểm bệnh nhân. 36 4.3.2. Mối liên quan giữa đột biến EGFR huyết tương với mô bệnh học – giai đoạn bệnh 38 4.3.3. Đột biến T790M và một số yếu tố liên quan 38 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU iii
  7. KẾT LUẬN 41 KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC - 1 - PHỤ LỤC 1. QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM ĐỘT BIẾN GEN EGFR HUYẾT TƯƠNG - 1 - PHỤ LỤC 2. PHIẾU THÔNG TIN BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU - 4 - PHỤ LỤC 3. DANH SÁCH BỆNH NHÂN - 6 - @ School of Medicine and Pharmacy, VNU iv
  8. DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Mô hình cấu trúc và hoạt động của EGFR 8 Hình 1.2. Các con đường truyền tín hiệu nội bào khởi nguồn từ EGFR 10 Hình 1.3. Các dạng đột biến gen EGFR quyết định tính đáp ứng với TKIs 11 Hình 1.4. Phân bố một số cơ chế kháng thuốc ức chế tyrosine kinase thế hệ I,II 14 Hình 1.5. Biểu đồ khuếch đại của phản ứng real-time PCR 18 Hình 1.6. Biểu đồ chuẩn của phản ứng real-time PCR 19 Hình 2.1. Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu 25 Hình 3.1. Đặc điểm giai đoạn bệnh của đối tượng nghiên cứu 28 Hình 3.2. Tỷ lệ các loại đột biến trên exon 18-21 của gen EGFR 29 Hình 3.3. Ví dụ về đột biến kháng thuốc thứ phát T790M 32 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại giai đoạn UTPKTBN theo AJCC 2010 7 Bảng 3.1. Đặc điểm lâm sàng của đối tượng nghiên cứu 27 Bảng 3.2. Đặc điểm mô bệnh học của đối tượng nghiên cứu 28 Bảng 3.3. Tỷ lệ bệnh nhân đột biến EGFR huyết tương 28 Bảng 3.4. Mối liên quan giữa đột biến EGFR huyết tương với đặc điểm bệnh nhân 30 Bảng 3.5. Mối liên quan giữa đột biến EGFR huyết tương với mô bệnh học và giai đoạn bệnh 30 Bảng 3.6. Mối liên quan giữa đột biến T790M và đặc điểm bệnh nhân 31 Bảng 3.7. Mối liên quan giữa đột biến T790M với mô bệnh học – giai đoạn bệnh 32 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU v
  9. ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư phế quản phổi nguyên phát là ung thư xuất phát từ niêm mạc phế quản, phế nang. Dựa vào mô bệnh học, ung thư phế quản phổi chia thành hai thể bệnh chính: ung thư phổi không tế bào nhỏ và ung thư phổi tế bào nhỏ, trong đó ung thư phổi không tế bào nhỏ chiếm 85%. Ung thư phế quản phổi chẩn đoán sớm thường khó khăn và tốn kém. Phần lớn được chẩn đoán ở giai đoạn muộn. Chẩn đoán ung thư phế quản phổi cần phối hợp nhiều phương pháp: Lâm sàng, X – quang, chụp cắt lớp vi tính, nội soi, xét nghiệm tế bào, mô bệnh học. Có nhiều phương pháp điều trị ung thư phổi như phẫu thuật, hoá trị, xạ trị, điều trị đích; trong đó nhiều nghiên cứu đã chứng minh các thuốc ức chế tyrosine kinase (tyrosine kinase inhibitor – TKI) có thể giúp trì hoãn bệnh tiến triển và cải thiện chất lượng sống tốt hơn so với hoá trị ở những bệnh nhân có đột biến EGFR [3]. Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (Epidermal Growth Factor Receptor – EGFR) là một yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của ung thư, trong đó có ung thư phổi. Đột biến trên vùng tyrosine kinase của EGFR là rất quan trọng cho việc xác định độ nhạy thuốc ức chế tyrosine kinase (TKIs). Hiện nay, kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA dựa trên mẫu mô ung thư được xem là tiêu chuẩn vàng trong phát hiện đột biến gen EGFR. Tuy nhiên, phương pháp này không khả thi trong một số trường hợp không đủ điều kiện cho phép sinh thiết, hoặc mẫu sinh thiết quá nhỏ, không đủ để giải trình tự gen, hoặc cần kiểm tra lại bằng mẫu huyết tương khi tín hiệu đột biến thấp. Phương pháp phát hiện đột biến gen EGFR bằng cách sử dụng ctDNA (circulating tumor DNA) có trong huyết tương bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ (mẫu “sinh thiết lỏng” – Liquid Biopsy) có nhiều ưu điểm vượt trội [23, 30]. Điều này cho phép bệnh nhân có thêm cơ hội để làm xét nghiệm chẩn đoán, đồng thời có thể làm xét nghiệm lặp lại nhiều lần để theo dõi điều trị mà không cần can thiệp sâu như sinh thiết. Bên cạnh đó, phương pháp này khá đơn giản, dễ thực hiện, giảm được chi phí, thời gian cho bệnh nhân và không gây biến chứng [8]. Như vậy, việc phân tích đánh giá tình trạng đột biến EGFR mẫu huyết tương rất cần thiết giúp các bác sĩ trong việc điều trị nhằm kéo dài thời gian sống và nâng cao chất lượng sống @của bSchoolệnh nhân. Doof đó, Medicine đề tài nghiên andcứu Pharmacy, VNU 1
  10. “Nhận xét đặc điểm đột biến EGFR huyết tương ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ tại Bệnh viện Bạch Mai năm 2017 – 2018” được thực hiện với mục tiêu sau: Mô tả được tình trạng đột biến EGFR phát hiện ở mẫu huyết tương và phân tích được một số yếu tố liên quan trên bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ tại Bệnh viện Bạch Mai năm 2017 – 2018. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 2
  11. CHƯƠNG 1 –TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ (UTPKTBN) 1.1.1. Dịch tễ học Ung thư phổi là một trong những loại ung thư phổ biến nhất thế giới trong nhiều thập kỷ qua. Theo thống kê của GLOBOCAN năm 2018, trên thế giới có 2,094 triệu trường hợp mới mắc (chiếm 11,6% tổng số bệnh nhân ung thư), trong đó nam giới phổ biến hơn với 1,369 triệu ca mới mắc (chiếm 14,5% tổng số ung thư ở nam giới). Ung thư phổi cũng là nguyên nhân phổ biến gây tử vong do ung thư trên toàn thế giới, ước tính chiếm khoảng 18,4% các trường hợp tử vong do ung thư hàng năm (1,761 triệu người chết) [56]. Tại Việt Nam, theo thống kê của GLOBOCAN năm 2018, ung thư phổi là loại ung thư phổ biến thứ hai với 23,7 nghìn trường hợp mới mắc (chiếm 14,4% tổng số bệnh nhân ung thư) trong đó nam giới chiếm 16,7 nghìn ca (chiếm 18,4% tổng số ung thư). Số lượng người chết vì ung thư phổi hằng năm cũng rất cao với 20,7 nghìn người (chiếm 18% tổng số người chết vì ung thư) [56]. 1.1.2. Yếu tố nguy cơ Thuốc lá là yếu tố nguy cơ quan trọng nhất. Gặp hơn 90% trường hợp ung thư phổi ở nam giới có nghiện thuốc lá, khoảng 80% trường hợp mắc ở nữ giới có liên quan đến thuốc lá. Yếu tố môi trường khi tiếp xúc với nhiều khí độc như amiăng, những chất gây ung thư như 3-4 benzopyren, hydrocarbon thơm nhiều vòng hay những chất phóng xạ cũng làm tăng nguy cơ mắc ung thư phổi. Ngoài ra, các yếu tố về di truyền như bệnh u nguyên bào võng mạc, đột biến gen p53, đột biến gen EGFR cũng liên quan đến bệnh [3]. 1.1.3. Triệu chứng 1.1.3.1. Triệu chứng lâm sàng Ở giai đoạn sớm, bệnh phát triển âm thầm, triệu chứng thường nghèo nàn hoặc không có triệu chứng. Dấu hiệu gợi ý ở giai đoạn này thường là nam giới trên 40 tuổi, nghiện thuốc lá, thuốc lào, ho khan kéo dài, có thể lẫn đờm @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 3
  12. lẫn máu, điều trị kháng sinh không có kết quả. Ở giai đoạn tiến triển, triệu chứng đa dạng hơn tuỳ theo vị trí u, mức độ lan rộng tổn thương với toàn thân có thể mệt mỏi, gầy sút, sốt. Các triệu chứng hô hấp thường gặp như đau ngực dai dẳng, cố định 1 vị trí, khó thở, hoặc có hội chứng trung thất với các triệu chứng như phù áo khoác, khó nuốt hay nuốt đau, khàn tiếng Các dấu hiệu do di căn: hạch (thượng đòn, nách), di căn não, gan, xương, phổi đối bên. Các hội chứng cận ung thư: thường gặp trong ung thư phổi không tế bào nhỏ. Bao gồm: ngón tay dùi trống, đái tháo nhạt, hội chứng Cushing, tăng Canxi máu, vú to, giọng cao, teo tinh hoàn, hội chứng giả nhược cơ, hội chứng da liễu: viêm da cơ [4]. 1.1.3.2. Cận lâm sàng + Chẩn đoán hình ảnh: Chụp X – quang lồng ngực thẳng và nghiêng: phát hiện đám mờ, hình ảnh tràn dịch màng phổi. Giúp xác định vị trí, hình thái, kích thước tổn thương. Chụp cắt lớp vi tính: Cho phép đánh giá hình ảnh khối u và hạch trung thất, xác định chính xác vị trí, kích thước và mức độ lan rộng tổn thương ở cả hai phổi. Siêu âm ổ bụng: phát hiện các tổn thương di căn. Chụp cộng hưởng từ sọ não: khi nghi ngờ có di căn não. Xạ hình xương bằng máy SPECT: phát hiện di căn xương từ rất sớm so với chụp X – quang thông thường. Chụp PET/CT: là phương pháp tốt nhất với ung thư phổi trong phát hiện di căn xa ngoài não [4]. + Nội soi chẩn đoán: Nội soi phế quản: thường chỉ định trong các trường hợp u trung tâm, giúp xác định tổn thương và sinh thiết làm mô bệnh học. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 4
  13. Nội soi màng phổi: chỉ định trong trường hợp theo dõi di căn màng phổi. Nội soi trung thất: chỉ định trong trường hợp có hạch trung thất bất thường, kết hợp làm sinh thiết hạch [3]. + Mô bệnh học: Không những cho phép chẩn đoán xác định bệnh mà còn xác định thể mô bệnh học, độ mô học giúp cho lựa chọn điều trị và tiên lượng bệnh. Bệnh phẩm có thể được lấy qua sinh thiết xuyên thành ngực hoặc qua nội soi phế quản, sinh thiết tổn thương di căn (hạch thượng đòn) [3]. Các tiêu chuẩn chẩn đoán và phân loại của các type mô học UTPKTBN theo WHO 2015 bao gồm: ung thư biểu mô vảy, ung thư biểu mô tuyến, ung thư biểu mô tuyến vảy, ung thư biểu mô tế bào lớn, ung thư biểu mô tế bào sáng, ung thư biểu mô tế bào khổng lồ [54] + Các xét nghiệm khác [3]: Các chất chỉ điểm khối u: Cyfra 21-1, CEA với ung thư biểu mô tuyến; SCC với ung thư biểu mô vảy. Tuy nhiên chỉ điểm u trong ung thư phổi ít có giá trị. Xét nghiệm gen: hiện nay, kỹ thuật giải trình tự gen dựa trên bệnh phẩm mô bệnh học giúp xác định đột biến gen EGFR trong các trường hợp ung thư biểu mô tuyến giúp chỉ dịnh thuốc điều trị đích. Test chức năng hô hấp: đánh giá chức năng hô hấp trước khi phẫu thuật. Các xét nghiệm huyết học và sinh hoá máu: giúp đánh giá toàn trạng trước, trong và sau điều trị. Ngoài ra các xét nghiệm này còn giúp phát hiện một số hội chứng cận ung thư gặp trong ung thư phổi. 1.1.4. Chẩn đoán 1.1.4.1. Chẩn đoán xác định Chẩn đoán xác định dựa trên lâm sàng (các triệu chứng hô hấp, hội chứng trung thất ), chẩn đoán hình ảnh (X – quang, CT ngực ), kết quả mô bệnh học. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 5
  14. 1.1.4.2. Chẩn đoán phân biệt [4] Viểm phổi: chụp X – quang phổi kiểm tra lại sau điều trị kháng sinh 1 tháng. Áp xe phổi: dựa vào hội chứng nhiễm trùng, chụp X – quang: hình hang, đáp ứng với điều trị kháng sinh. Tràn dịch màng phổi: nếu là ung thư phổi thì sau khi chọc hết dịch chụp X – quang lại có hình ảnh khối u. 1.1.4.3. Chẩn đoán giai đoạn Chẩn đoán giai đoạn TNM của UTPKTBN theo AJCC (American Joint Committee on Cancer) năm 2010 . Phân loại về u nguyên phát (ký hiệu: T) + Tx: U nguyên phát không thể đánh giá, hoặc có tế bào ác tính trong đờm hay dịch rửa phế quản nhưng không thấy trên hình ảnh hoặc nội soi phế quản. + T0: Không có bằng chứng về u nguyên phát. + Tis: Ung thư biểu mô tại chỗ. + T1: Kích thước lớn nhất của khối u ≤ 3cm, được bao quanh bởi nhu mô phổi hoặc lá tạng màng phổi, không có bằng chứng về xâm lấn vượt quá đoạn gần của phế quản thuỳ; gồm T1a (kích thước lớn nhất ≤ 2cm) và T1b (kích thước lớn nhất 2-3 cm). + T2: Với 3 7cm hoặc xâm lấn một trong các thành phần: thành ngực (bao gồm cả khối u rãnh liên thuỳ trên), cơ hoành, thần kinh hoành, màng phổi trung thất, màng ngoài tim hoặc xâm lấn phế quản gốc, cách carina < 2cm nhưng chưa tới carina hoặc gây ra xẹp phổi, viêm phổi do tắc nghẽn trên toàn bộ phổi hoặc có các nốt riêng biệt trên cùng 1 thuỳ phổi. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 6
  15. + T4: Khối u kích thước bất kỳ nhưng xâm lấn: trung thất, tim, mạch máu lớn, khí quản, thần kinh quặt ngược thanh quản, thực quản, thân đốt sống, carina, các nốt khối u khác ở thuỳ phổi khác cùng bên. Phân loại về hạch vùng (ký hiệu : N) + N0: Không có hạch di căn vùng. + N1: Di căn hạch cạnh phế quản và hoặc hạch trong phổi, hạch rốn phổi cùng bên, bao gồm cả sự xâm lấn trực tiếp. + N2: Di căn hạch trung thất cùng bên và hạch dưới carina. + N3: Di căn hạch rốn phổi đối bên, hạch trung thất đối bên, hạch cơ bậc thang cùng hoặc đối bên, hạch thượng đòn. Phân loại về di căn xa (ký hiệu: M) + M0: Không có di căn xa. + M1: Di căn xa, gồm M1a (có kèm theo các nốt khối u ở phổi đối bên, tràn dịch màng phổi hoặc màng tim ác tính) và M1b (di căn xa). Bảng 1.1. Phân loại giai đoạn UTPKTBN theo AJCC 2010 Giai đoạn Tiêu chuẩn Giai đoạn 0 Tis N0 M0 Giai đoạn IA T1 N0 M0 Giai đoạn IB T2a N0 M0 T2b N0 M0 Giai đoạn IIA T1 N1 M0 T2a N1 M0 T2b N1 M0 Giai đoạn IIB T3 N0 M0 T1-2 N2 M0 Giai đoạn IIIA T3 N1-2 M0 T4 N0-1 M0 T1-3 N3 M0 Giai đoạn IIIB T4 N2-3 M0 Giai đoạn IV T bất kỳ N bất kỳ M1 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 7
  16. 1.2. THỤ THỂ YẾU TỐ TĂNG TRƯỞNG BIỂU BÌ (EGFR) 1.2.1. Cấu trúc và sự hoạt hoá của EGFR Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (Epidermal growth factor receptor – EGFR) là một nhóm protein chức năng thụ thể màng có trọng lượng phân tử 170kDalton (kDa) ở các tế bào có nguồn gốc biểu mô, trung mô và thần kinh, được Carpenter và cộng sự nghiên cứu phát hiện vào năm 1978 [16]. Trong gia đình thụ thể yếu tố phát triển biểu bì gồm có bốn thành viên: HER1 (EGFR, ErbB1), HER2 (neu, ErbB2), HER3 (ErbB3) và HER4 (ErbB4). Các protein này đóng vai trò quan trọng trong việc điều hoà các quá trình sinh trưởng, phát triển, trao đổi chất và sinh lý của tế bào [9, 27]. Hình 1.1. Mô hình cấu trúc và hoạt động của EGFR (A) Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì(EGFR): Vùng ngoại bào chứa miền tương tác với các yếu tố tăng trưởng, vùng xuyên màng tế bào và vùng nội bào chứa miền tyrosine kinase. (B) Hoạt động của EGFR: khi yếu tố tăng trưởng liên kết vào phần ngoại bào của thụ thể EGFR, hai phân tử EGFR kết hợp với nhau (dimer hoá) từ đó hoạt hoá vùng tyrosine kinase tự phosphoryl hoá giúp EGFR kết hợp được với các phân tử tín hiệu ở giai đoạn sau của con đường tín hiệu [23]. Cấu trúc của phân tử EGFR gồm 3 phần: phần liên kết ngoài màng, phần xuyên màng đặc hiệu và phần trong bào tương có hoạt tính tyrosine kinase [9]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 8
  17. + Phần ngoài màng của EGFR (vùng ngoại bào) có trọng lượng khoảng 100kDa, với hai vùng giàu cystein là nơi để gắn kết các phối tử của EGFR. Vùng gắn kết các yếu tố hoạt hoá hay ức chế các thụ thể, để đẫn truyền tín hiệu vào trong tế bào, làm tế bào có thể phát triển bình thường hoặc trở nên ác tính. + Phần xuyên màng tế bào: có trọng lượng nhỏ 3kDa, tập trung tại vùng phân cực phospholipid màng. + Phần trong tế bào (vùng nội bào): có trọng lượng khoảng 60kDa là protein kinase với đuôi tận cùng carboxyl nơi xảy ra phản ứng tự phosphoryl hoá của EGFR. Protein EGFR mang hoạt tính tyrosine kinase, là khởi nguồn của con đường tín hiệu tyrosine kinase trong tế bào. Hoạt tính tyrosine nội bào của EGFR được hoạt hoá khi EGFR liên kết với các phối tử như EGF hoặc yếu tố chuyển dạng (transforming gowth factor α: TGFα). Hai con đường tín hiệu chính được kích hoạt bởi EGFR là RAS/RAF/MEK/ERK và PI3K/AKT, ngoài ra còn có Src tyrosine kinase, PLCγ, PKC và STAT. Ngay sau khi được hoạt hoá, vùng nội bào của EGFR sẽ tự phosphoryl hoá, khởi đầu một dòng thác tín hiệu lan toả khắp tế bào gây kích hoạt: con đường PI3K/AKT (kích thích sự tăng sinh mạch máu, di căn và ức chế quá trình chết theo chương trình), tín hiệu RAS/RAF (kích thích phân bào và các con đường dẫn truyền tín hiệu phiên mã) [1, 9, 27] Trong các tế bào khoẻ mạnh, con đường tín hiệu nội bào trên được kiểm soát một cách nhịp nhàng và chặt chẽ, đảm bảo sự phát triển bình thường của tế bào. Trong các tế bào ung thư, hoạt tính tyrosine kinase của EGFR bị rối loạn bởi các cơ chế phát sinh ung thư, bao gồm đột biến EGFR, tăng số lượng bản sao gen EGFR hoặc biểu hiện quá mức protein EGFR [17]. Việc hoạt hoá sai chức năng tyrosine kinase của EGFR làm tăng tỷ lệ phát sinh, tốc độ phát triển, khả năng xâm lấn và di căn của các tế bào ung thư [1]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 9
  18. Hình 1.2. Các con đường truyền tín hiệu nội bào khởi nguồn từ EGFR EGFR tiếp nhận tín hiệu từ yếu tố tăng trưởng, truyền qua các con đường JAK/STAT, PI3K/Akt, Ras/raf/MEK/ERK vào nhân tế bào, kích thích tế bào biệt hoá, tăng sinh, sống sót, tạo u, sinh mạch [57]. 1.2.2. Đột biến EGFR Gen EGFR, nằm trên cánh ngắn NST số 7, dài 110kb, chia 28 exon và được xếp vào nhóm gen tiền sinh ung thư (proto-oncogen) [1]. Đột biến gen EGFR xảy ra ở giai đoạn rất sớm và chiếm tỷ lệ cao ở nhóm người không hút thuốc lá, ở nhóm ung thư biểu mô tuyến so với các phân nhóm mô bệnh học khác của UTPKTBN, ở nữ giới so với nam giới và ở nhóm bệnh nhân Đông Á so với các chủng tộc khác [45, 48]. Tất cả các đột biến gây hoạt hoá EGFR đều thuộc vùng bám adenosine triphosphate (ATP) của thụ thể tyrosine kinase, cũng đồng thời là vị trí tương tác của các loại thuốc ức chế tyrosine kinase của EGFR (EGFR TKIs – EGFR tyrosine kinase inhibitors) [31, 44]. Các đột biến gen EGFR thuộc bốn exon 18-21, mã hoá vùng tyrosine kinase, khiến cho protein EGFR luôn trong trạng thái hoạt hoá không phụ thuộc vào phối tử, có tác dụng tăng sự nhạy cảm của khối u hoặc giúp kháng lại các EGFR TKIs. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 10
  19. Những đột biến này được chia làm ba nhóm, trong đó, các đột biến làm tăng tính nhạy cảm của khối u với EGFR TKIs chủ yếu thuộc hai nhóm I và II. + Nhóm I gồm các đột biến xoá đoạn ở exon 19, phổ biến nhất (khoảng 44%) là kiểu đột biến xoá từ vị trí acid amin vị trí 747-leucine (L), 748-arginine (R), 749-glutamate (E), 750-alanine (A) (đột biến LREA). + Nhóm II gồm các đột biến thay thế một nucleotid làm thay đổi aicd amin ở exon 18 và 21. Đột biến điểm thường gặp nhất (khoảng 41%) là đột biến ở exon 21 thay leucine bằng arginine tại codon 858 (đột biến L858R). Một số đột biến khác như đột biến thay thế glycine ở codon 719 thành serine (G719S), thành alanine (G719A) hoặc thành cysteine (G719C) chiếm 4%; một số đột biến vô nghĩa khác chiếm 6%. + Nhóm III (5%) gồm các đột biến lặp đoạn, thêm đoạn và đột biến điểm tại exon 20 gen EGFR. Exon 20 chứa hầu hết là các đột biến làm cho tế bào ung thư phổi kháng lại với thuốc điều trị đích như đột biến điểm T790M, V769L, S768I và các đột biến thêm đoạn. Tuy nhiên, gần đây các nhà khoa học đã phát hiện ra một ngoại lệ, một đột biến thêm 4 acid amin tại exon 20, đột biến A736_Y764insFQEA, lại làm tăng tính nhạy cảm của tế bào ung thư phổi với thuốc điều trị đích [60]. Hình 1.3. Các dạng đột biến gen EGFR quyết định tính đáp ứng với TKIs @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 11
  20. Các đột biến gen EGFR trên exon 18-21 mã hoá vùng tyrosine kinase của thụ thể, đồng thời là vị trí tương tác của các loại thuốc TKIs[47]. Cho đến nay, đã có nhiều bằng chứng cho thấy trạng thái cân bằng “tắt- mở” của hoạt tính tyrosine kinase-EGFR bị ảnh hưởng mạnh mẽ bởi đột biến gen. Những phân tích động học đã chứng minh đột biến thuộc hai nhóm I và II làm tăng hệ số phân li Km của ATP với EGFR và giảm hệ số phân li Km của EGFR TKIs so với khi thụ thể ở trạng thái bình thường. Những đột biến này khiến EGFR giảm mạnh ái lực với ATP, giúp các thuốc TKI không phải cạnh tranh tại vị trí tương tác với thụ thể, thụ thể trở nên nhạy cảm một cách đặc biệt với các thuốc này [15, 24]. Khoảng 10-60% bệnh nhân UTPKTBN có đột biến ở exon 18-21 của gen EGFR. Các đột biến này tạo ra protein EGFR có ái lực mạnh với thuốc điều trị đích, do đó, bệnh nhân UTPKTBN mang đột biến gen EGFR thường đáp ứng tốt với thuốc điều trị đích [35]. 1.2.3. Điều trị UTPKTBN bằng thuốc ức chế tyrosine kinase (TKIs) phân tử nhỏ Ngày nay, xu hướng điều trị cá thể trong ung thư phổi ngày càng phát triển với các tác nhân điều trị trúng đích (Targeted Therapy) đã mở ra hướng đi mới trong điều trị ung thư phổi. Bước đầu các nghiên cứu cho thấy có hiệu quả trong kéo dài thời gian sống thêm và nâng cao chất lượng sống cho các bệnh nhân ung thư phổi giai đoạn muộn [38]. Các thuốc TKIs có trọng lượng phân tử nhỏ, cạnh tranh với ATP ở vùng tyrosine kinase, làm ức chế mạnh sự phosphoryl hoá nội tế bào của EGFR dẫn đến ức chế quá trình dẫn truyền tín hiệu nội bào. Kết quả là ức chế các quá trình: bám dính, xâm lấn, di căn, tăng sinh mạch, tăng sinh tế bào và tăng quá trình chết tế bào theo chương trình và tăng nhạy cảm với hoá trị. Các thuốc TKIs được sử dụng gồm Gefitinib (Iressa) và Erlotinib (Tarceva) [5]. Erlotinib là một chất ức chế tyrosine kinase dùng đường uống, với liều 150mg hàng ngày là một tiêu chuẩn được chấp thuận để điều trị cho bệnh nhân UTPKTBN [37]. Vai trò của Erlotinib đã được chứng minh trong các nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng về điều trị bước 2,3 (sau thất bại với hoá @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 12
  21. chất), điều trị duy trì (sau khi điều trị hoá chất ổn định) và điều trị bước 1 trong UTPKTBN giai đoạn tiến triển có đột biến EGFR [1, 39]. Tương tự như thế, Gefitinib hiện được chấp thuận cho việc điều trị bước 1,2 ở những bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn tiến triển hoặc di căn có kết quả xét nghiệm gen dương tính với đột biến EGFR [39]. Nghiên cứu của Nguyễn Minh Hà và cộng sự về hiệu quả điều trị trúng đích trên bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn muộn có và không có đột biến gen EGFR cho thấy ở 80 bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn IIIB/IV được điều trị bằng Erlotinib có sự cải thiện có ý nghĩa thống kê ở cả PFS và OS ở nhóm dương tính với đột biến EGFR. Trung vị PFS ở nhóm đột biến EGFR (+) so với nhóm đột biến EGFR (-) lần lượt là 7,5 tháng và 4,25 tháng (p = 0,015). Tương tự, trung vị OS ở nhóm đột biến EGFR (+) so với nhóm đột biến EGFR (-) lần lượt là 13 tháng và 8 tháng (p = 0,041) [7]. Một số thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên pha III như EURTAC ở Châu Âu hay thử nghiệm OPTIMAL được thực hiện tại Trung Quốc so sánh việc điều trị bằng Erlotinib so với hoá trị liệu ở những bệnh nhân mắc UTPKTBN có dương tính với đột biến EGFR, đã cho kết quả khả quan về tỷ lệ đáp ứng (RR) cũng như thời gian sống thêm bệnh không tiến triển (PFS) [39]. Trong nghiên cứu EURTAC đã chứng minh lợi ích của Erlotinib khi kéo dài đáng kể PFS thêm 4,5 tháng so với hoá trị (9,7 tháng so với 5,2 tháng, p < 0,0001) [39, 43]. Tương tự, trong nghiên cứu OPTIMAL, PFS ở người sử dụng Erlotinib được kéo dài thêm 8,5 tháng so với hoá trị liệu (13,1 tháng so với 4,6 tháng, p < 0,0001) [39, 67]. 1.2.4. Sự kháng thuốc ức chế tyrosine kinase (TKIs) Mặc dù nhiều nghiên cứu cho thấy bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn muộn mang đột biến gen EGFR làm tăng tính nhạy cảm với các thuốc TKIs và có tỷ lệ đáp ứng với thuốc TKIs rất cao, trên 60% và kéo dài được thời gian sống bệnh không tiến triển (PFS) trung bình trên 9 tháng [33]. Tuy nhiên, dưới áp lực chọn lọc của các tế bào khối u với thuốc, sau khoảng 10-20 tháng điều trị, bệnh tiến triển trở lại ở hầu hết các bệnh nhân có đáp ứng tốt ban đầu, thể hiện tình trạng “trơ” của tế bào khối u với thuốc [32]. Y học đã ghi nhận @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 13
  22. một số cơ chế gây nên tình trạng kháng thuốc TKIs, các nguyên nhân này được chia làm 3 loại chính: xuất hiện đột biến mới tại gen đích, hoạt hoá con đường tín hiệu mới và chuyển dạng mô bệnh học [58]. Hình 1.4. Phân bố một số cơ chế kháng thuốc ức chế tyrosine kinase thế hệ I,II [58] 1.2.4.1. Cơ chế kháng thuốc TKIs do xuất hiện đột biến mới tại gen đích Cơ chế kháng thuốc đầu tiên ở bệnh nhân UTPKTBN được chứng minh là sự xuất hiện đột biến điểm T790M tại exon 20 gen EGFR. Phát hiện này được công bố bởi hai nhóm nghiên cứu độc lập của Kobayashi và Pao năm 2005 [26, 36]. So sánh với trình tự gen EGFR lành tính, đột biến T790M là đột biến thứ phát thay thế acid amin Threonine trên phân tử EGFR (được mã hoá bởi codon 790 trên exon 20) bằng Methionine. Đây là nguyên nhân phổ biến nhất, chiếm khoảng 50% các trường hợp [19, 46]. Chức năng của Threonine 790 như một “người gác cổng” trong phân tử EGFR, một yếu tố quan trọng quyết định tính đặc hiệu của các chất ức chế gắn vào vùng bám ATP của thụ thể tyrosine kinase. Sự biến đổi cấu trúc protein EGFR tại vị trí đột biến T790M không tạo ra sự phong toả về vị trí không gian đối với thuốc TKIs mà nó làm hồi sinh ái lực của EGFR với ATP, đối kháng lại cơ chế ức chế kinase theo kiểu cạnh tranh ATP của TKIs [62]. Theo đó, các TKIs ức chế thuận nghịch như Erlotinib hoặc Gefitinib có hiệu quả rất giới hạn với thể đột biến T790M. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 14
  23. Osimertinib (Tagrisso) là thuốc TKIs mới thuộc thế hệ thứ 3 chống lại đột biến T790M, được FDA chấp thuận vào 11/2015 và ở thời điểm đó chỉ được điều trị bước 2 sau khi bệnh tiến triển với TKIs thế hệ I cho bệnh nhân UTPKTBN có đột biến EGFR và mang đột biến T790M. Sau đó, hiệu quả của Osimertinib tiếp tục được khẳng định qua nghiên cứu AURA 3 là một nghiên cứu nhãn mở, pha 3 đa trung tâm với trên 400 bệnh nhân UTPKTBN có đột biến EGFR và mang đột biến T790M sau khi đã tiến triển với TKIs bước 1. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng Osimertinib có hiệu quả cao hơn đáng kể so với liệu pháp hoá trị Platinum kết hợp với Pemetrexed ở những bệnh nhân UTPKTBN có đột biến T790M (PFS 10,1 so với 4,4 tháng) [22, 40]. Mới cách đây không lâu vào tháng 4/2018 bằng kết quả nghiên cứu FLAURA thì thuốc TKIs thế hệ 3 này đã được FDA chấp thuận sử dụng cho bệnh nhân có đột biến EGFR ở exon 19 và 21 (không đề cập đến có hay không đột biến T790M). Kết quả nghiên cứu FLAURA cho thấy hiệu quả ưu việt, mang đến thời gian sống thêm lâu hơn ở những bệnh nhân sử dụng Osimertinib (PFS ở nhóm bệnh nhân sử dụng Osimertinib là 18,9 tháng so với 10,2 tháng ở những bệnh nhân sử dụng nhóm TKIs thế hệ 1) [49]. Các đột biến điểm thứ hai khác, chẳng hạn như D761Y [13], T854A [14] hoặc L747S [59] cũng kèm theo sự kháng lại các thuốc TKIs mặc dù cơ chế vẫn chưa rõ ràng [58]. 1.2.4.2. Cơ chế kháng TKIs bằng cách kích hoạt các con đường thay thế Các con đường kích hoạt khác hay đường vòng cũng có thể gây ra sự kháng thuốc TKIs. Thông qua việc kích hoạt các con đường vòng, các tế bào ung thư có thể tồn tại và sinh sôi nảy nở ngay cả khi bị ức chế bởi con đường điều khiển ban đầu. Con đường kích hoạt thay thế phổ biến nhất là sự khuếch đại cMET chiếm 5-10% các trường hợp có khả năng kháng với các thuốc TKIs [19, 61]. Khuếch đại cMET có thể kích hoạt tín hiệu đường dẫn truyền PI3K-AKT độc lập với EGFR thông qua việc điều khiển tín hiệu và điều khiển quá trình nhị trùng phân ERBB3 [19]. Tuy nhiên, ngưỡng khuếch đại của cMET mà ở đó gây ra sự kháng TKIs còn chưa được làm rõ [20]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 15
  24. Việc kích hoạt các con đường thay thế khác, bao gồm khuếch đại HER2 [52], đột biến PIK3CA [46], đột biến BRAF và tăng biểu hiện của thụ thể tyrosine kinase AXL cũng đã được báo cáo là thúc đẩy khả năng kháng với các thuốc TKIs [65]. 1.2.4.3. Cơ chế kháng TKIs bằng việc chuyển dạng mô bệnh học Khoảng 5% bệnh nhân bị biến đổi từ ung tư biểu mô tuyến thành ung thư phổi tế bào nhỏ sau khi có được sự đề kháng với TKIs [46]; quá trình này được mô tả lần đầu tiên vào năm 2006 ở một phụ nữ 45 tuổi mắc ung thư biểu mô tuyến có đột biến EGFR và chưa bao giờ hút thuốc [63]. Một giả thiết khác cho quan sát này là bệnh nhân có khối u với mô bệnh học có sự kết hợp của cả UTPKTBN và ung thư phổi tế bào nhỏ, không rõ ràng trên sinh thiết chẩn đoán, và sau đó thành phần ung thư phổi tế bào nhỏ trở nên chiếm ưu thế khi thành phần UTPKTBN được điều trị có đáp ứng bằng TKIs. Tuy nhiên, quá trình lâm sàng của các trường hợp được báo cáo thường không phù hợp với giả thuyết này [34]. Ngoài ra còn có sự chuyển dạng biểu mô – trung mô (EMT) thúc đẩy sự xâm lấn hơn của khối u, di căn và kháng thuốc TKIs [53]. EMT đã được báo cáo trong 2 trường hợp (5%) của 37 bệnh nhân [46]. Về mặt hình thái, các tế bào ung thư bị mất các đặc điểm biểu mô và biến đổi thành các tế bào trung mô [50]. 1.2.5. Phương pháp lấy mẫu, xác định đột biến gen EGFR mẫu huyết tương trong UTPKTBN 1.2.5.1. Vai trò của sinh thiết lỏng trong xác định đột biến EGFR mẫu huyết tương Hiện nay kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA dựa trên mẫu mô ung thư được xem là tiêu chuẩn vàng trong phát hiện đột biến gen EGFR. Tuy nhiên có một số khó khăn khi xét nghiệm từ mẫu sinh thiết như bệnh nhân già yếu, không đủ sức khoẻ để sinh thiết, vị trí u không thể sinh thiết, bệnh nhân không còn u sau một thời gian điều trị hoặc bệnh nhân không đồng ý sinh thiết. Mặt khác, quy trình lấy mẫu sinh thiết khối u có thể làm tăng nguy cơ mắc bệnh ung thư, gieo rắc mầm bệnh ung thư vào vị trí khác [42]. Vì vậy, @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 16
  25. cần phải tìm kiếm một mẫu thay thế khác để phát hiện đột biến EGFR. Huyết tương chứa DNA có nguồn gốc từ tế bào ung thư chết, hoại tử giải phóng các mảnh DNA vào máu gọi là các ctDNA (circulating tumor DNA). Nồng độ ctDNA cao hơn ở những bệnh nhân có ung thư di căn. Các DNA này có khả năng đại diện cho toàn bộ bộ gen của khối u [28]. Vậy việc phân tích và xét nghiệm ctDNA sẽ giúp tìm ra các đột biến có liên hệ trực tiếp với sự phát triển tình trạng khối u. Sinh thiết lỏng là biện pháp cho phép xác định bệnh nhân có khối u có đột biến đặc hiệu theo cách xâm lấn tối thiểu và tốn ít thời gian hơn; ngoài ra sinh thiết lỏng cũng giúp ích trong việc theo dõi tiến triển bệnh và kịp thời đưa ra phương pháp điều trị mới [18]. Cho đến nay, nhiều kỹ thuật đã được thử nghiệm để phát hiện đột biến EGFR bằng cách sử dụng mẫu huyết tương. Và một số nghiên cứu đã chứng minh rằng các đột biến được phát hiện trong huyết tương rất phù hợp (thường là 60%-90%) với những đột biến được phát hiện trong mô khối u ở bệnh nhân UTPKTBN [18]. Ví dụ trong nghiên cứu ASSESS năm 2016, sự phù hợp tổng thể của tình trạng đột biến là 89% [41]. 1.2.5.2. Phương pháp phát hiện đột biến gen EGFR mẫu huyết tương Real-time PCR Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị được ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, chính vì vậy nên còn được gọi là PCR thời gian thực, và do đặc điểm này nên với real-time PCR người làm thí nghiệm không cần thiết phải làm tiếp các thí nghiệm để đọc và phân tích kết quả xác định có sản phẩm khuếch đại đích hay không vì kết quả cuối cùng của phản ứng khuếch đại cũng được hiển thị ngay sau khi hoàn tất phản ứng khuếch đại [11]. Trong real-time PCR, hiển thị cơ bản để người làm thí nghiệm có thể quan sát được trong quá trình nhân bản DNA của các ống phản ứng là một biểu đồ khuếch đại (amplification graph) [11]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 17
  26. Hình 1.5. Biểu đồ khuếch đại của phản ứng real-time PCR Biểu đồ một đường biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận được ánh sáng kích thích vào mỗi chu kỳ nhiệt [11]. Real-time PCR có khả năng xác định được chính xác số lượng bản đích ban đầu có trong mẫu thử bằng cách thực hiện real-time PCR các mẫu thử chứa các số lượng bản DNA đích ban đầu cần xác định số lượng cùng lúc với các mẫu chuẩn chứa số lượng DNA đích ban đầu đã biết rõ số lượng [11]. Đường biểu diễn vẽ lên mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng với số lượng bản DNA đích ban đầu có trong các mẫu chuẩn được gọi là đường biểu diễn chuẩn (standard curve) [11]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 18
  27. Hình 1.6. Biểu đồ chuẩn của phản ứng real-time PCR Biểu đồ chuẩn vẽ lên đường biểu diễn chuẩn về mối quan hệ giữa số lượng bản DNA đích có trong các mẫu chuẩn và chu kỳ ngưỡng tương ứng. Trong hình ở trên, E2-E4-E7 là các ống phản ứng chứa các mẫu chuẩn còn B4 là ống phản ứng chứa mẫu thử [11]. Chất huỳnh quang sử dụng trong real-time PCR để xác định các đột biến EGFR huyết tương là các probe (đoạn dò), đó là những đoạn oligonucleotides sợi đơn trình tự có thể bắt cặp bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích. Có nhiều loại probe, và thậm chí cả primers cũng được sử dụng làm chất phát huỳnh quang cho real-time PCR. Đã có 2 kit xét nghiệm đột biến EGFR được FDA chấp thuận: therascreen EGFR RGQ Plasma PCR Kit (Quiagen) phát triển bởi Quiagen và AstraZeneca được FDA chấp thuận vào tháng 01/2015 để sử dụng Iressa, kit này sử dụng đầu dò Beacon [21]; cobas® EGFR Mutation Test v2 (Roche) được FDA chấp thuận tháng 10/2015, sử dụng đầu dò TaqMan [21]. ddPCR (Droplet digital PCR) PCR vi giọt kỹ thuật số (ddPCR) là phản ứng dựa trên sự khuếch đại cô lập của hàng ngàn phân tử DNA riêng lẻ đồng thời, với mỗi phân tử được ngăn cách trong một giọt riêng biệt. Sự hiện diện của sản phẩm được khuếch đại trong mỗi giọt được biểu thị bằng tín hiệu huỳnh quang và tỷ lệ các giọt @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 19
  28. dương tính có thể cho phép định lượng chính xác các acid nucleic trong một mẫu. Các phản ứng PCR thông thường bao gồm những phản ứng khuếch đại của nhiều phân tử DNA trong một ống duy nhất. Ngược lại, PCR vi giọt kĩ thuật số phân chia các phân tử DNA riêng lẻ thành nhiều phản ứng song song bằng cách trộn một mẫu DNA với hỗn hợp dầu-nước trong điều kiện thích hợp. Điều này tạo ra hàng ngàn giọt khác nhau, trong mỗi giọt có thể không chứa, chứa một hoặc nhiều hơn một phân tử DNA. Mỗi giọt là một phản ứng độc lập có thể được khuếch đại đồng thời trong một ống và chỉ những giọt ban đầu chứa ít nhất một phân tử DNA có thể chứa sản phẩm mục tiêu để phát hiện [55]. Chất phát huỳnh quang sử dụng để phát hiện đột biến có thể là các đầu dò (Taqman) hoặc thuốc nhuộm gắn với dsDNA như EvaGreen [55]. Giải trình tự gen Phương pháp giải trình tự DNA (phương pháp dideoxy) hiện nay đều dựa trên phương pháp được Sanger và cộng sự công bố năm 1977. Nguyên tắc của phương pháp dideoxy dựa trên việc bổ sung các dẫn xuất tương ứng của các dNTP là dideoxynucleotide (ddNTP) vào thành phần phản ứng tổng hợp DNA trong ống nghiệm. Do ddNTP bị thiếu nhóm C3’-OH, nên một khi nó được gắn vào mạch DNA đang tổng hợp, thì quá trình tổng hợp DNA sẽ dừng lại [2]. Phản ứng giải mã trình tự được chia làm 4 ống nghiệm tách biệt, mỗi ống có DNA khuôn, DNA mồi, enzym DNA polymerase (thường là Taq polymerase), 4 loại dNTP thông thường (một trong những loại dNTP này được đánh dấu phóng xạ để phát hiện mạch mới đang tổng hợp); ngoài ra, từng loại trong 4 loại ddNTP (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP) sẽ được bổ sung lần lượt tương ứng vào mỗi ống nghiệm nêu trên với nồng độ bằng 1/10 so với nồng dộ loại dNTP tương ứng. Với thành phần phản ứng như vậy, trong phần lớn trường hợp, dNTP sẽ liên kết vào mạch DNA đang tổng hợp, nhưng ddNTP (ở nồng độ thấp) cũng sẽ liên kết vào một số mạch DNA đang tổng hợp và làm kết thúc quá trình sao chép. Do có nhiều phân tử DNA được tổng hợp đồng thời nên quá trình này dẫn đến sự hình thành của một hỗn hợp @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 20
  29. nhiều phân tử DNA được sao chép không hoàn chỉnh giống nhau ở đầu 5’ được đánh dấu và khác nhau ở đầu 3’ về chiều dài và loại nucleotide kết thúc chuỗi. Các sản phẩm này sau đó được phân tách trên gel polyacrylamide và đọc trình tự theo thứ tự các băng xuất hiện trên bản điện di theo chiều từ cực dương sang cực âm [2]. Phương pháp này giúp xác định các đột biến đã biết và đột biến mới. 1.2.6. Tình hình nghiên cứu đột biến EGFR huyết tương ở bệnh nhân UTPKTBN Trên thế giới Năm 2009, Bai Hua và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu đánh giá tình trạng đột biến EGFR trong mẫu huyết tương ở những bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn IIIB-IV sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High- performance liquid chromatography, HPLC). Kết quả cho thấy trong 230 bệnh nhân nghiên cứu, phát hiện 81 đột biến EGFR trong 79 mẫu huyết tương (tỷ lệ 34,3%), bao gồm 56 đột biến xoá đoạn ở exon 19, 25 đột biến ở exon 21, có 2 mẫu huyết tương có 2 đột biến ở cả exon 19 và 21 [12]. Năm 2012, Zhen Huang và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu trên 882 bệnh nhân có mẫu mô và huyết tương phù hợp để khảo sát tình trạng đột biến EGFR và sự tương đồng giữa xét nghiệm mẫu mô và huyết tương, sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Kết quả cho thấy trong 882 bệnh nhân xét nghiệm EGFR huyết tương, phát hiện 270 bệnh nhân (32,1%) có đột biến, trong đó vị trí exon 19 chiếm 20,3% với 167 bệnh nhân, exon 21 chiếm 15,1% với 124 bệnh nhân, bao gồm 21 bệnh nhân (2,83%) cùng tồn tại cả hai đột biến exon 19 và 21 [25]. Một nghiên cứu khác của Xiao Zhao và cộng sự năm 2013 nhằm so sánh tình trạng đột biến EGFR ở mẫu mô và huyết tương của bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn I-IV. Kết quả cho thấy trong 111 mẫu huyết tương phát hiện tỷ lệ đột biến EGFR là 17,1% trong đó 55% là đột biến xoá đoạn trên exon 19, 45% là đột biến L858R trên exon 21 [66]. Năm 2014, theo nghiên cứu của Xuefei Li và cộng sự nhằm phân tích và theo dõi tình trạng đột biến EGFR @ đSchoolể dự đoán hi ofệu quMedicineả và theo dõi tìnhand Pharmacy, VNU 21
  30. trạng kháng thuốc trong quá trình điều trị bằng TKIs. Mẫu huyết tương xét nghiệm sử dụng phương pháp ARMS. Kết quả cho thấy trong 141 mẫu huyết tương nghiên cứu tỷ lệ đột biến EGFR là 25,5% (36 mẫu đột biến), bao gồm 17 mẫu chứa đột biến xoá đoạn trên exon 19, 12 mẫu chứa đột biến L858R trên exon 21, 1 mẫu chứa đột biến T790M, 4 mẫu chứa đột biến kép T790M và đột biến xoá đoạn trên exon 19, 1 mẫu chứa đột biến kép T790M và đột biến L858R trên exon 21, 1 mẫu chứa đột biến kép xoá đoạn trên exon 19 và đột biến L858R [29]. Năm 2015, Một nghiên cứu nhằm đánh giá tình trạng thực sự của mối tương quan giữa phát hiện đột biến EGFR mẫu mô và huyết tương được tiến hành bởi Kai Guo và cộng sự trên 198 bệnh nhân UTPKTBN trong đó giai đoạn I đến giai đoạn IIIA chiếm 92,4%. Phương pháp được sử dụng là Scorpion – ARMS. Kết quả cho thấy 34/198 (17,2%) có đột biến EGFR huyết tương trong đó đột biến xoá đoạn trên exon 19 chiếm 22,5% (23 bệnh nhân), đột biến L858R trên exon 21 chiếm 7% (5 bệnh nhân) và có 2 đột biến kép (xoá đoạn exon 19 + đột biến điểm L858R exon 21; xoá đoạn exon 19 + đột biến điểm L861Q exon 21) [23]. Năm 2016, Takayuki Takahama và cộng sự tiến hành đánh giá tình trạng đột biến EGFR mẫu huyết tương ở những bệnh nhân UTPKTBN vùng phía Tây Nhật Bản bằng phương pháp PCR vi giọt kỹ thuật số (ddPCR). Kết quả trong tổng số 260 bệnh nhân (độ tuổi trung bình 68) phát hiện 120 bệnh nhân có đột biến nhạy với TKIs (46,2%), và 75 bệnh nhân có đột biến kháng thuốc T790M (28,8%). Trong số 120 bệnh nhân đột biến nhạy với TKIs, số lượng bệnh nhân nam so với nữ là 40/80, số người không hút thuốc so với số người hút thuốc là 82/36 (còn 2 người chưa xác định được); trong số 75 bệnh nhân phát hiện đột biến kháng thuốc T790M, số lượng bệnh nhân nam so với nữ là 27/48, số người không hút thuốc so với người hút thuốc là 52/21 (còn 2 người chưa xác định được). Từ đó đưa ra kết luận rằng việc xét nghiệm đột biến EGFR trong mẫu huyết tương bằng kỹ thuật ddPCR là một cách tiếp cận đầy hứa hẹn để phát hiện đột biến gen trong quá trình điều trị bằng thuốc TKIs [51]. Một nghiên cứu của Shirong @Zhang School và cộng s ựof năm Medicine 2018 đã tiến hành and Pharmacy, VNU 22
  31. khảo sát tỷ lệ đột biến EGFR trong mẫu huyết tương của 1001 bệnh nhân giai đoạn III-IV ở 65 bệnh viện tại Trung Quốc. Kết quả đột biến EGFR được phát hiện ở 251 bệnh nhân trong tổng 1001 bệnh nhân (25,1%) trong đó 189 bệnh nhân phát hiện đột biến nhạy thuốc đơn độc (18,9%), 3 bệnh nhân phát hiện đột biến nhạy thuốc kết hợp (0,3%), 28 bệnh nhân có đột biến kháng thuốc (2,8%), 31 bệnh nhân có đột biến kết hợp các đột biến nhạy và kháng thuốc (3,1%). Kết luận rằng xét nghiệm đột biến EGFR huyết tương là khả thi và có thể thay thế khi sinh thiết mô không khả thi [64]. Tại Việt Nam Năm 2017, Phan Thanh Thăng và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu nhằm đánh giá khả năng phát hiện đột biến EGFR trong mẫu huyết tương của bệnh nhân UTPKTBN so với phương pháp mẫu mô bằng cách sử dụng 42 cặp mẫu máu và mô sinh thiết của 42 bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn IIIB-IV tại bệnh viện Chợ Rẫy. Phát hiện đột biến EGFR trong mẫu huyết tương bằng kỹ thuật Scorpions ARMS (kết hợp giữa công nghệ khuếch đại alen đột biến và công nghệ scorpions sử dụng các cặp mồi thông minh trong phản ứng PCR để phát hiện các đột biến gen khi alen đột biến chiếm tỉ lệ rất nhỏ). Kết quả có 17 trường hợp có đột biến EGFR trong huyết tương (40,5%) và 19 trường hợp có đột biến EGFR mẫu mô (45,2%). Tỷ lệ đột biến trong mẫu huyết tương thấp hơn so với trong mẫu mô khoảng 5% nhưng không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Theo giới tính, đột biến EGFR mẫu huyết tương xảy ra với tỷ lệ cao ở nữ hơn so với nam (p 60 tuổi, giữa nhóm thuộc ung thư biểu mô tuyến so với dạng mô học khác (p > 0,05) [8]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 23
  32. CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu là 136 bệnh nhân UTPKTBN có chỉ định xét nghiệm đột biến gen EGFR huyết tương tại Trung tâm Y học hạt nhân và Ung bướu, Bệnh viện Bạch Mai năm 2017-2018 đáp ứng các tiêu chuẩn chọn lựa và tiêu chuẩn loại trừ. 2.1.1. Tiêu chuẩn chọn lựa + Bệnh nhân đã được chẩn đoán xác định UTPKTBN dựa vào kết quả mô bệnh học và hoá mô miễn dịch. + Bệnh nhân có đầy đủ hồ sơ bệnh án bao gồm thông tin hành chính, kết quả mô bệnh học, giai đoạn bệnh. + Bệnh nhân được chỉ định xét nghiệm EGFR huyết tương. 2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ + Không xác định được đột biến EGFR huyết tương do chất lượng mẫu kém. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu mô tả hồi cứu 2.2.2. Mẫu nghiên cứu Mẫu nghiên cứu được chọn theo phương pháp chọn mẫu thuận tiện. 2.2.3. Các biến số, chỉ số trong nghiên cứu + Thông tin chung của đối tượng nghiên cứu: - Tuổi, giới, địa chỉ, tiền sử hút thuốc lá, tiền sử điều trị thuốc đích. - Kết quả xét nghiệm mô bệnh học, giai đoạn bệnh. + Kết quả xét nghiệm đột biến gen EGFR huyết tương: - Kết quả có hay không có đột biến, loại đột biến, vị trí đột biến. 2.2.4. Thời gian nghiên cứu Từ tháng 5 năm 2017 đến tháng 8 năm 2018 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 24
  33. 2.2.5. Địa điểm nghiên cứu Đơn vị Gen – Tế bào gốc, Trung tâm Y học Hạt nhân và Ung bướu, Bệnh viện Bạch Mai 2.2.6. Các bước thực hiện Lựa chọn bệnh +Thu thập nhân: thông tin +Nhập số liệu +Tiêu chuẩn nghiên cứu vào Excel Kết lựa chọn +Xét nghiệm +Phân tích số luận +Tiêu chuẩn đột biến EGFR liệu bằng SPSS loại trừ huyết tương Hình 2.1. Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu Thu thập thông tin bệnh nhân Hồi cứu trên hồ sơ bệnh án kết hợp phỏng vấn bệnh nhân các thông tin về hành chính, tiền sử hút thuốc lá, tiền sử điều trị thuốc TKIs, giai đoạn bệnh. Các thông tin của bệnh nhân được thu thập theo mẫu thống nhất. Phương pháp xét nghiệm đột biến EGFR huyết tương + Mẫu huyết tương: lấy máu tĩnh mạch, thu thập trong ống EDTA, ly tâm để tách huyết tương. Lưu trữ huyết tương trong nhiệt độ thích hợp đến khi sử dụng. + Phân tích: Tách DNA: bằng cách ly giải tế bào, loại bỏ tạp chất và các thành phần khác, thu lại mẫu DNA sau khi đã tinh sạch. Khuếch đại DNA và phân tích kết quả: Sản phẩm DNA được khuếch @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 25
  34. đại và phân tích kết quả bằng phương pháp Real-time PCR. + Quy trình xét nghiệm chi tiết trong Phụ lục 1. Nhập và phân tích dữ liệu Số liệu được thu thập, nhập và mã hoá bằng phần mềm Excel. Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm SPSS với các test thống kê y học: Chi bình phương các yếu tố liên quan đến đột biến gen EGFR có ý nghĩa khi giá trị p < 0.05. Kết luận: tỷ lệ đột biến gen EGFR huyết tương và một số yếu tố liên quan. 2.3. VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU + Nghiên cứu được sự đồng ý của Ban Giám Đốc Trung tâm và Bệnh viện. + Nghiên cứu không gây khó khăn cho bệnh nhân, tất cả các thông tin chỉ phục vụ mục đích nghiên cứu, được mã hóa và bảo mật. + Số liệu thu thập đầy đủ, khách quan, trung thực, kết quả đảm bảo tính khoa học, tin cậy và chính xác. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 26
  35. CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. ĐẶC ĐIỂM ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 3.1.1. Đặc điểm lâm sàng Bảng 3.1. Đặc điểm lâm sàng của đối tượng nghiên cứu Đặc điểm Số lượng (n) Tỷ lệ (%) Nam 77 56,6 Giới tính Nữ 59 43,4 <60 47 34,6 Tuổi ≥60 89 65,4 Chưa từng 77 56,6 Tiền sử hút thuốc lá Đã hoặc đang 59 43,4 Chưa từng 48 35,3 Tiền sử điều trị TKIs Đã hoặc đang 88 64,7 Trong tổng số 136 đối tượng nghiên cứu, số lượng nam chiếm 77 tương ứng với tỷ lệ 56,6%, cao hơn so với nữ chiếm 59 (43,4%). Độ tuổi chủ yếu của đối tượng nghiên cứu: trên 60 tuổi (chiếm 89 bệnh nhân tương ứng tỷ lệ 65,4%), trong khi đó độ tuổi dưới 60 tuổi chiếm 47 bệnh nhân (34,6%). Hơn một nửa đối tượng nghiên cứu là người không hút thuốc lá (77 đối tượng, chiếm 56,6%); trong khi đó số lượng đối tượng hút thuốc lá là 59 (43,4%). Đa số bệnh nhân trong nghiên cứu đã và đang điều trị thuốc TKIs (88 đối tượng, chiếm 64,7%); số lượng đối tượng chưa từng điều trị thuốc TKIs là 48 (35,3%). 3.1.2. Đặc điểm mô bệnh học và giai đoạn bệnh 3.1.2.1. Đặc điểm mô bệnh học Phân loại mô bệnh học được trình bày theo Bảng 3.2: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 27
  36. Bảng 3.2. Đặc điểm mô bệnh học của đối tượng nghiên cứu Đặc điểm Số lượng (n) Tỷ lệ (%) Ung thư biểu mô tuyến 131 96,3 Kết quả mô bệnh học Ung thư biểu mô vảy 5 3,7 Ung thư biểu mô tuyến chiếm đa số với số lượng 131 (96,3%), còn lại là ung thư biểu mô vảy với số lượng 5 (3,7%). 3.1.2.2. Đặc điểm giai đoạn bệnh 1,5% 1,5% 15,4% Giai đoạn I Giai đoạn II 81,6% Giai đoạn III Giai đoạn IV Hình 3.1. Đặc điểm giai đoạn bệnh của đối tượng nghiên cứu Đa số đối tượng nghiên cứu ở giai đoạn IV (số lượng 111, 81,6%), giai đoạn III chiếm 21 (15,4%), còn lại là giai đoạn II và I cùng chiếm 1,5%. 3.2.KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN EGFR HUYẾT TƯƠNG Kết quả phân tích đột biến gen EGFR huyết tương của 136 bệnh nhân được trình bày theo Bảng 3.3: Bảng 3.3. Tỷ lệ bệnh nhân đột biến EGFR huyết tương Đặc điểm Số lượng (n) Tỷ lệ (%) Trạng thái đột biến Có 56 41,2 EGFR Không 80 58,8 Tổng 136 100 Một đột biến 37 27,2 Số lượng đột biến Hai đột biến 19 14,0 Tổng 56 41,2 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 28
  37. Trong số 136 bệnh nhân nghiên cứu, có 56/136 bệnh nhân mang đột biến gen EGFR huyết tương (chiếm 41,2%), tỷ lệ bệnh nhân mang 1 đột biến là 27,2%, trong khi đó tỷ lệ bệnh nhân mang đột biến kép là 14%. Đột biến kép gặp ở 19 bệnh nhân, trong đó có 1 trường hợp mang đồng thời 2 đột biến nhạy cảm thuốc, 18 trường hợp mang đồng thời một đột biến nhạy cảm và một đột biến kháng thuốc T790M. 45 41,4% 40 35 29,3% 30 24,0% 25 20 15 10 5 2,7% 1,3% 1,3% 0 xoá đoạn L858R trên T790M trên G719X trên S768I trên L861Q trên trên exon 19 exon 21 exon 20 exon 18 exon 20 exon 21 Hình 3.2. Tỷ lệ các loại đột biến trên exon 18-21 của gen EGFR Trong 75 đột biến được phát hiện, đột biến xoá đoạn trên exon 19 chiếm đa số với 41,3% số đột biến, đột biến điểm L858R trên exon 21 chiếm 29,3%, đột biến điểm T790M trên exon 20 chiếm 24,0%, đột biến điểm trên exon 18 chiếm 2,7%, các đột biến còn lại trên exon 20,21 đều chiếm 1,3%. 3.3. MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN TRẠNG THÁI ĐỘT BIẾN EGFR HUYẾT TƯƠNG. 3.3.1. Mối liên quan giữa đột biến EGFR huyết tương với đặc điểm bệnh nhân @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 29
  38. Bảng 3.4. Mối liên quan giữa đột biến EGFR huyết tương với đặc điểm bệnh nhân Phát hiện đột biến Đặc điểm N P n % < 60 47 17 36,2 Nhóm tuổi 0,389 ≥ 60 89 39 43,8 Nam 77 26 33,8 Giới tính 0,045 Nữ 59 30 50,8 Chưa từng 77 38 49,4 Tiền sử hút thuốc lá 0,027 Đã/ đang 59 18 30,5 Chưa từng 48 6 12,5 Tiền sử điều trị TKIs <0,001 Đã/ đang 88 50 56,8 Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ đột biến EGFR huyết tương theo nhóm tuổi. Tỷ lệ đột biến gen ở bệnh nhân nữ cao hơn bệnh nhân nam (50,8% so với 33,8%); ở người không hút thuốc lá cao hơn người hút thuốc lá (49,4% so với 30,5%) và ở người đã hoặc đang điều trị bằng TKIs cao hơn người chưa từng điều trị (56,8% so với 12,5%). 3.3.2. Mối liên quan giữa đột biến EGFR huyết tương với mô bệnh học và giai đoạn bệnh Bảng 3.5. Mối liên quan giữa đột biến EGFR huyết tương với mô bệnh học và giai đoạn bệnh Phát hiện đột biến Đặc điểm N P n % Mô bệnh Ung thư biểu mô tuyến 131 56 42,7 0,057 học Ung thư biểu mô vảy 5 0 0,0 I 2 0 0,0 II 2 0 0,0 Giai đoạn 0,003 III 21 2 9,5 IV @ School111 54 of Medicine48,6 and Pharmacy, VNU 30
  39. Hầu hết bệnh nhân trong nghiên cứu là Ung thư biểu mô tuyến và tất cả những bệnh nhân có đột biến đều nằm trong nhóm ung thư này, không phát hiện trường hợp nào đột biến ở 5 trường hợp ung thư biểu mô vảy. Tỷ lệ bệnh nhân đột biến gen ở giai đoạn IV chiếm tỷ lệ cao hơn giai đoạn III (48,6% so với 9,5%), trong khi không có bệnh nhân đột biến gen ở giai đoạn I và II. 3.3.3. Đột biến T790M và một số yếu tố liên quan 3.3.3.1. Mối liên quan giữa đột biến T790M và đặc điểm bệnh nhân Trong số 136 bệnh nhân, có 18 bệnh nhân mang đột biến kháng thuốc T790M (13,2%). Mối liên quan của đột biến T790M với đặc điểm bệnh nhân được trình bày như bảng 3.6: Bảng 3.6. Mối liên quan giữa đột biến T790M và đặc điểm bệnh nhân Đột biến T790M Đặc điểm N P n % < 60 47 4 8,5 Nhóm tuổi 0,237 ≥ 60 89 14 15,7 Nam 77 9 11,7 Giới tính 0,543 Nữ 59 9 15,3 Chưa từng 77 10 13,0 Tiền sử hút thuốc lá 0,922 Đã/ đang 59 8 13,6 Chưa từng 48 0 0,0 Tiền sử điều trị TKIs 0,001 Đã/ đang 88 18 20,5 Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ đột biến T790M theo nhóm tuổi, giới tính, tiền sử hút thuốc lá. Ở những bệnh nhân đã hoặc đang điều trị bằng TKIs thì tỷ lệ đột biến T790M chiếm 20,5%, trong khi đó những bệnh nhân chưa từng điều trị TKIs thì không có bệnh nhân đột biến T790M (p = 0,001). Dưới đây là 1 ví dụ tiêu biểu về việc phát hiện đột biến kháng thuốc T790M ở bệnh nhân A đã được điều trị bằng TKIs trước đó; cùng với đó sự @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 31
  40. tiến triển của bệnh được quan sát thông qua chỉ số bán định lượng SQI. 9,4 6 tháng sau 15,17 T790M xoá đoạn exon 19 Thời gian 0,0 lần đầu 11,02 0 5 10 15 20 Chỉ số SQI Hình 3.3. Ví dụ về đột biến kháng thuốc thứ phát T790M Trong trường hợp của bệnh nhân A, lần đầu xét nghiệm đột biến EGFR huyết tương thì phát hiện đột biến xoá đoạn trên exon 19 với chỉ số SQI 11,02. Lần thứ 2 xét nghiệm xuất hiện thêm 1 đột biến T790M với chỉ số SQI 9,4 và đột biến xoá đoạn trên exon 19 có chỉ số SQI tăng lên 15,17. 3.3.3.2. Mối liên quan giữa đột biến T790M và mô bệnh học – giai đoạn bệnh Bảng 3.7. Mối liên quan giữa đột biến T790M với mô bệnh học – giai đoạn bệnh Đột biến T790M Đặc điểm N P n % Mô bệnh Ung thư biểu mô tuyến 131 18 13,7 0,374 học Ung thư biểu mô vảy 5 0 0,0 I 2 0 0,0 II 2 0 0,0 Giai đoạn 0,505 III 21 1 4,8 IV 111 17 15,3 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 32
  41. Tỷ lệ đột biến T790M ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến cao hơn ung thư biểu mô vảy và bệnh nhân ở giai đoạn IV cao hơn các giai đoạn I,I,III nhưng những sự khác biệt về tỷ lệ này không có ý nghĩa thống kê với p lần lượt là 0,374 và 0,505. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 33
  42. CHƯƠNG 4 – BÀN LUẬN 4.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 4.1.1. Đặc điểm lâm sàng Trong 136 bệnh nhân được nghiên cứu, độ tuổi trung bình là 61,96 ± 10,35. Trong đó, độ tuổi từ 60 trở lên chiếm 65,4%. Đây là độ tuổi có nguy cơ tiếp xúc và tích luỹ với các yếu tố sinh bệnh cao hơn so với các lứa tuổi khác. Kết quả này cũng phù hợp với một số nghiên cứu của Xiao Zhao (2013) và nghiên cứu của Shirong Zhang (2018) cho thấy độ tuổi trung bình của bệnh nhân UTPKTBN là 59 và 68 [64, 66]. Nghiên cứu này cũng gần tương tự như một số nghiên cứu trong nước: theo Nguyễn Thị Lan Anh (2017) nghiên cứu 152 bệnh nhân ung thư phổi biểu mô tuyến ở độ tuổi trung bình 59,6 ± 9,9 [1]; còn theo Nguyễn Văn Tình (2018) nghiên cứu 245 bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến ở độ tuổi trung bình 60,2 ± 10,4 [10]. Xét về giới tính, tỷ lệ giới tính nam 56,6% (77 bệnh nhân) so với tỷ lệ giới tính nữ 43,4% (59 bệnh nhân), tỷ lệ nam/nữ khoảng 1,3/1. Tỷ lệ này trong nghiên cứu của Phan Thanh Thăng và cộng sự (2017) là 2/1 nhưng chỉ nghiên cứu trên 42 bệnh nhân [8], nghiên cứu của Shirong Zhang và cộng sự (2018) cho thấy tỷ lệ này là 1,4/1 [64]. Có thể thấy xu hướng ung thư phổi ngày càng tăng ở nữ giới. Thuốc lá là yếu tố nguy cơ quan trọng nhất dẫn đến ung thư phổi. Tuy nhiên, kết quả phân tích cho thấy trong tổng số bệnh nhân nghiên cứu, tỷ lệ bệnh nhân chưa từng hút thuốc lá là 56,6% cao hơn tỷ lệ bệnh nhân hút thuốc (43,4%). Nghiên cứu của Takayuki Takahama (2016) cũng cho tỷ lệ bệnh nhân chưa từng hút thuốc cao hơn nhưng với tỷ lệ 71,5% [51], điều này có thể giải thích rằng trong nghiên cứu này số lượng bệnh nhân nữ nhiều hơn nam (182 so với 78) còn trong nghiên cứu của chúng tôi thì tỷ lệ nam/nữ là 1,3/1. Nghiên cứu của Xuefei Li và cộng sự (2014) cho thấy tỷ lệ bệnh nhân chưa từng hút thuốc lá cao hơn tỷ lệ bệnh nhân đã hoặc đang hút thuốc (51,2 so với 48,8) [29]. Điều này có thể cho thấy ở những bệnh nhân có đột biến EGFR thì thuốc lá không phải là một trong những yếu tố nguy cơ chính. Kết quả khác cho thấy tỷ lệ bệnh nhân trong nghiên cứu đã hoặc đang @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 34
  43. điều trị bằng TKIs là 64,7%. Tỷ lệ này phù hợp với nghiên cứu của Takayuki Takahama (2016) với tỷ lệ bệnh nhân đã được điều trị với Gefinitib như một liệu pháp đầu tay là 78,8% [51]. 4.1.2. Đặc điểm mô bệnh học – giai đoạn bệnh Dựa trên kết quả mô bệnh học cho thấy tỷ lệ bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến chiếm phần lớn 96,3% . Các nghiên cứu khác cũng cho thấy tỷ lệ ung thư biểu mô tuyến lớn nhất: nghiên cứu của Mai Trọng Khoa và cộng sự (2016) cho thấy tỷ lệ ung thư biểu mô tuyến là 93,9% [6]; nghiên cứu của Hua Bai và cộng sự (2009) trên 230 bệnh nhân UTPKTBN cho thấy 74,3% bệnh nhân là ung thư biểu mô tuyến [12]. Sự chênh lệch về tỷ lệ giữa 2 nghiên cứu có thể do chênh lệch cỡ mẫu của nghiên cứu (136 so với 230) và tiêu chuẩn chọn lựa bệnh nhân khác nhau. Hình 3.1 cho thấy hầu hết bệnh nhân trong nghiên cứu ở giai đoạn IV của bệnh, chiếm tỷ lệ 81,6%, giai đoạn III ít hơn với 15,4%, còn lại là giai đoạn I,II. Kết quả này tương đối phù hợp với các nghiên cứu khác: nghiên cứu của Hua Bai và cộng sự (2009) trên 230 bệnh nhân ở giai đoạn IIIB/IV thấy tỷ lệ bệnh nhân giai đoạn IV là 65,2% [12]; nghiên cứu của Xuefei Li và cộng sự (2014) cũng trên bệnh nhân giai đoạn IIIB/IV thấy tỷ lệ bệnh nhân giai đoạn IV là 79,9% [29]. Từ một số kết quả so sánh này có thể khẳng định UTPKTBN thường được phát hiện ở giai đoạn muộn, do đó ảnh hưởng đến tiên lượng và điều trị. 4.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN EGFR HUYẾT TƯƠNG Kết quả phân tích đột biến EGFR huyết tương ở 136 bệnh nhân cho thấy 56/136 bệnh nhân mang đột biến gen (41,2%). Kết quả này phù hợp với một số nghiên cứu đã có: nghiên cứu của Phan Thanh Thăng và cộng sự (2017) tỷ lệ này là 40,5% (17/42) [8]; nghiên cứu của Hua Bai và cộng sự (2009) cho thấy tỷ lệ đột biến EGFR huyết tương là 34,3% [12]; nghiên cứu của Zhen Huang và cộng sự (2012) thì tỷ lệ đột biến EGFR huyết tương là 32,1%. Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy tỷ lệ đột biến EGFR thấp hơn so với nghiên cứu của chúng tôi: nghiên cứu của Xuefei Li và cộng sự (2014) cho thấy tỷ lệ đột biến EGFR trong huyết tương là 25,5% [29]; nghiên cứu @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 35
  44. của Kai Guo và cộng sự (2015) có tỷ lệ phát hiện đột biến EGFR huyết tương là 17,2% [23]; nghiên cứu của Shirong Zhang và cộng sự (2018) tỷ lệ đột biến EGFR huyết tương là 25,1% [64]. Sự khác biệt này có thể là do tiêu chuẩn chọn lựa đối tượng nghiên cứu và phương pháp tiến hành xét nghiệm đột biến EGFR huyết tương. Theo các nghiên cứu trên thế giới, mặc dù có khoảng 40 dạng đột biến gen EGFR đóng vai trò bệnh sinh và đáp ứng hiệu quả của điều trị đích trong ung thư phổi biểu mô tuyến, nhưng trong đó đột biến xoá đoạn trên exon 19 và đột biến điểm L858R trên exon 21 là hai dạng thường gặp nhất (khoảng 85-90%) trong số các đột biến gen EGFR liên quan đến tình trạng đáp ứng với TKIs, các đột biến này làm tăng tính nhạy thuốc đối với TKIs [17]. Theo nghiên cứu của chúng tôi, trong 75 đột biến được phát hiện thì đột biến xoá đoạn trên exon 19 chiếm đa số với 41,3%, đột biến L858R trên exon 21 chiếm 29,3%, tỷ lệ đột biến kháng thuốc T790M chiếm 24,0%. Sự xuất hiện tỷ lệ cao của đột biến kháng thuốc T790M có thể được lý giải bằng việc trong đối tượng nghiên cứu của chúng tôi có một số lượng lớn bệnh nhân đã được điều trị bằng TKIs từ trước đó, dẫn đến sự kháng thuốc thứ phát. 4.3. MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN TRẠNG THÁI ĐỘT BIẾN EGFR HUYẾT TƯƠNG 4.3.1. Mối liên quan giữa tình trạng dột biến EGFR với đặc điểm bệnh nhân. Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ đột biến EGFR huyết tương cho thấy trong nhóm người lớn hơn 60 tuổi tỷ lệ đột biến chiếm 43,8%, ở những người dưới 60 tuổi tỷ lệ đột biến là 36,2% nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê với p = 0,389 (> 0,05). Kết quả của chúng tôi khác so với nghiên cứu của Kai Guo và cộng sự (2015) nghiên cứu trên 198 bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn từ I – IIIA cho thấy tỷ lệ đột biến EGFR huyết tương ở nhóm người lớn hơn 60 tuổi là 13,6%, nhóm người dưới 60 tuổi là 20% (p=0,238, không có ý nghĩa thống kê) [23]. Sở dĩ có sự khác biệt này do tiêu chuẩn chọn lựa của nghiên cứu. Trong nghiên cứu của chúng tôi tỷ lệ bệnh nhân ở giai đoạn IV là 81,6%, mà các nghiên cứu đã cho thấy nồng độ ctDNA càng cao ở những @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 36
  45. bệnh nhân ở giai đoạn tiến triển nên sẽ càng tăng khả năng phát hiện đột biến EGFR huyết tương ở những bệnh nhân này. Nghiên cứu của Phan Thanh Thăng và cộng sự (2017) cũng đã cho thấy một tỷ lệ đột biến EGFR huyết tương tương tự với nghiên cứu của chúng tôi: tỷ lệ đột biến EGFR huyết tương ở người trên 60 tuổi là 35,0%, người nhỏ hơn 60 tuổi là 45,5% nhưng cũng không có ý nghĩa thống kê (p = 0,49) [8]. Do vậy khi chẩn đoán đột biến gen EGFR cần tiến hành khảo sát tất cả các lứa tuổi nhằm đảm bảo không bỏ sót bệnh nhân có đột biến, nhằm nâng cao chất lượng điều trị. Về đặc điểm giới tính, tỷ lệ đột biến EGFR huyết tương ở giới nữ cao hơn nam (50,8% so với 33,8%) có ý nghĩa thống kê (p = 0,045). Một số nghiên cứu khác cũng cho kết quả tương tự: Nghiên cứu của Phan Thanh Thăng và cộng sự (2017) cho thấy tỷ lệ đột biến EGFR huyết tương ở nữ giới cao hơn nam giới (64,3% so với 28,3%; p = 0,03) [8]. Nghiên cứu của Xiao Zhao và cộng sư (2013) cũng cho thấy tỷ lệ đột biến ở nữ nhiều hơn nam (50% so với 24%) nhưng không có ý nghĩa thống kê với p= 0,07 [66]. Điều này phù hợp với nhận định đột biến gen EGFR thường gặp ở nữ nhiều hơn nam [45]. Kết quả về tỷ lệ hút thuốc cho thấy trong những bệnh nhân chưa từng hút thuốc thì tỷ lệ đột biến EGFR huyết tương là 49,4%, ở những người đã hút thuốc thì tỷ lệ này là 30,5%; sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p = 0,027. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Xuefei Li và cộng sự (2014) cho một tỷ lệ cao hơn ở những bệnh nhân không hút thuốc (30,7% so với 19,7%) nhưng không có ý nghĩa thống kê với p = 0,136 [29]. Tương tự, nghiên cứu của Zhen Huang và cộng sự (2012) cũng cho thấy tỷ lệ đột biến cao hơn ở những bệnh nhân không hút thuốc lá (35% so với 31,3%) [25]. Điều này có thể cho thấy đột biến EGFR là một yếu tố nguy cơ chính ở những bệnh nhân UTPKTBN không hút thuốc lá, ngược lại ở nhóm bệnh nhân có tiền sử hút thuốc lá đột biến EGFR không đóng vai trò quan trọng nhất trong sinh bệnh học. Kết quả khác về tiền sử điều trị thuốc TKIs cho thấy trong những bệnh nhân đã điều trị thuốc TKIs thì tỷ lệ đột biến EGFR huyết tương là 56,8%, ở những bệnh nhân chưa từng điều trị thuốc TKIs thì tỷ lệ đột biến EGFR huyết tương là 12,5%. Sự khác biệt này có@ ý nghĩaSchool thống kêof v ớMedicinei p < 0,001. Nghiên and Pharmacy, VNU 37
  46. cứu của Takayuki Takahama và cộng sự (2016) cho thấy tỷ lệ bệnh nhân có đột biến EGFR nhạy thuốc ở những bệnh nhân đã điều trị bằng TKIs trước đó là 61,7% (p = 0,7758), còn tỷ lệ đột biến kháng thuốc T790M ở những bệnh nhân này là 62,7% (p = 0,8203) nhưng kết quả này không có ý nghĩa thống kê [51]. 4.3.2. Mối liên quan giữa đột biến EGFR huyết tương với mô bệnh học – giai đoạn bệnh Tỷ lệ đột biến EGFR huyết tương ở những bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến là 42,7%, trong khi đó không có bệnh nhân nào bị đột biến ở những người ung thư biểu mô vảy. Sự chênh lệch này không có ý nghĩa thống kê với p = 0,057. Kết quả này tương tự với một số nghiên cứu trước đó: nghiên cứu của Xuefei Li và cộng sự (2014) cho thấy tỷ lệ đột biến EGFR ở những bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến là 30,0% (p = 0,052) [29]. Kết quả này chưa phù hợp với nhận định đột biến gen EGFR gặp nhiều hơn ở Ung thư biểu mô tuyến so với các dạng khác do trong nghiên cứu của chúng tôi, số lượng bệnh nhân Ung thư biểu mô vảy rất ít (3,7%) nên sự khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê. Xét về giai đoạn bệnh, tỷ lệ đột biến EGFR huyết tương ở những bệnh nhân được chẩn đoán giai đoạn IV là 48,6%, khá chênh lệch so với tỷ lệ những bệnh nhân đột biến ở giai đoạn III là 9,5%, trong khi đó không có bệnh nhân nào được phát hiện đột biến ở giai đoạn I, II (p = 0,003). Nghiên cứu cho kết quả tương đương của Xiao Zhao và cộng sự (2013) tỷ lệ đột biến EGFR huyết tương ở bệnh nhân giai đoạn IIIB-IV là 56%, giai đoạn I-IIIA là 10% (p = 0,0014) [66]. Kết quả nghiên cứu phù hợp với nhận định chung ung thư phổi thường phát hiện ở giai đoạn muộn. Hơn nữa, đối với những bệnh nhân ở giai đoạn tiến triển, tỷ lệ ctDNA lưu hành trong máu càng cao nên dễ dàng hơn trong việc phát hiện đột biến huyết tương ở những đối tượng này. 4.3.3. Đột biến T790M và một số yếu tố liên quan 4.3.3.1. Mối liên quan giữa đột biến T790M và đặc điểm bệnh nhân Bảng 3.6 cho thấy tỷ lệ đột biến kháng thuốc T790M dựa trên các đặc điểm về nhóm tuổi, giới tính, tiền sử hút thuốc lá và tiền sử điều trị thuốc @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 38
  47. TKIs. Trong 136 bệnh nhân nghiên cứu, 18 bệnh nhân mang đột biến T790M (13,2%). Kết quả này thấp hơn so với nghiên cứu của Takayuki Takahama và cộng sự (2016) (28,8%) [51], và cũng thấp hơn nghiên cứu của Phan Thanh Thăng và cộng sự (2017) (21,4%) [8]. Điều này có thể lý giải do tiêu chuẩn chọn lựa đối tượng nghiên cứu và phương pháp tiến hành nghiên cứu khác nhau. Xét về nhóm tuổi, nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tỷ lệ đột biến T790M cao hơn ở những bệnh nhân lớn hơn 60 tuổi (15,7%) trong khi đó tỷ lệ đột biến T790M ở những bệnh nhân dưới 60 tuổi chỉ là 8,5%, nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p = 0,237). Xét về yếu tố giới tính, có sự chênh lệch về tỷ lệ đột biến T790M ở nữ và nam (15,3% so với 11,7%) nhưng sự chênh lệch không nhiều và không có ý nghĩa thống kê (p = 0,543). Trong nghiên cứu của Takayuki Takahama và cộng sự (2016) sự chênh lệch là khá lớn giữa tỷ lệ đột biến T790M cuả 2 nhóm (26,4% so với 34,6%) nhưng sự chênh lệch này cũng không có ý nghĩa thống kê (p = 0,3262). Thuốc lá là nguyên nhân lớn nhất dẫn đến ung thư phổi nhưng ở những bệnh nhân có đột biến EGFR thì thường xảy ra ở những người không hút thuốc hơn là những người hút thuốc lá. Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa tỷ lệ đột biến T790M ở những người chưa từng hút thuốc lá và những người đã hoặc đang hút thuốc (p = 0,922). Nghiên cứu của Takayuki Takahama (2016) cũng cho tỷ lệ đột biến không có giá trị thống kê (p = 0,6242) [51]. Điều này có thể cho thấy đột biến kháng thuốc T790M không phụ thuộc vào các yếu tố nhóm tuổi, giới tính, tiền sử hút thuốc lá. Điều trị bằng thuốc TKIs cũng là một trong những nguyên nhân dẫn đến tình trạng kháng thuốc thứ phát và trong nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ đột biến kháng thuốc T790M ở những bệnh nhân đã hoặc đang điều trị bằng TKIs là 20,5% trong khi đó với những bệnh nhân chưa từng điều trị bằng TKIs thì không phát hiện bệnh nhân nào có đột biến T790M. Sự khác biệt về tỷ lệ này có ý nghĩa thống kê với p = 0,001. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng đột biến thứ phát T790M chiếm khoảng 50% trong số bệnh nhân kháng thuốc mắc phải [19, 46]. Sự khác biệt giữa tỷ lệ đột biến T790M của chúng tôi so @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 39
  48. với các nghiên cứu khác là do sự phân loại bệnh nhân theo nhóm khác nhau. Hình 3.3 cho thấy một ví dụ điển hình về sự xuất hiện đột biến kháng thuốc T790M trên bệnh nhân UTPKTBN đã được điều trị bằng TKIs trước đó. Trong trường hợp của bệnh nhân A, lần đầu làm xét nghiệm đột biến EGFR huyết tương phát hiện đột biến xoá đoạn trên exon 19 với chỉ số SQI 11,02. Bệnh nhân được chỉ định dùng thuốc TKIs thế hệ I Erlotinib. Trong khoảng thời gian dùng thuốc, các triệu chứng về lâm sàng của bệnh đã thuyên giảm. Nhưng ở lần xét nghiệm thứ 2 sau 6 tháng điều trị, xuất hiện thêm 1 đột biến kháng thuốc T790M với chỉ số SQI 9,4 và đột biến xoá đoạn trên exon 19 với SQI cao hơn lần đầu tiên (15,17) nhưng trên lâm sàng bệnh nhân vẫn ổn định, chưa có biểu hiện của việc tình trạng bệnh ngày càng nặng lên. Điều này cho thấy xét nghiệm đột biến EGFR huyết tương có thể phát hiện được đột biến kháng thuốc trước khi những triệu chứng lâm sàng xuất hiện. Vì vậy trong thực hành lâm sàng, đối với những bệnh nhân được chỉ định điều trị đích bằng TKIs cần dược làm xét nghiệm đột biến EGFR huyết tương một cách thường xuyên nhằm theo dõi tình trạng bệnh để sớm đưa ra phác đồ điều trị thích hợp. Như trường hợp của bệnh nhân A, Osimertinib là một giải pháp tốt đối với những người mắc đột biến T790M. 4.3.3.2. Mối liên quan giữa đột biến T790M và mô bệnh học – giai đoạn bệnh Bảng 3.7 cho thấy mối liên quan giữa đột biến T790M và mô bệnh học, giai đoạn bệnh. Tỷ lệ đột biến T790M ở những bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến là 13,7% trong khi không có bệnh nhân nào xuất hiện đột biến T790M ở những bệnh nhân ung thư vảy, nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p = 0,374). Xét về giai đoạn bệnh, tỷ lệ xuất hiện đột biến T790M ở những bệnh nhân giai đoạn IV là 15,3% cao hơn giai đoạn III (4,8%), không có bệnh nhân đột biến T790M ở giai đoạn I,II, sự khác biệt tỷ lệ này cũng không có ý nghĩa thống kê (p = 0,505). Điều này cho thấy đột biến T790M không phụ thuộc vào yếu tố mô bệnh học và giai đoạn bệnh. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 40
  49. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Nghiên cứu thực hiện trên 136 bệnh nhân UTPKTBN tại Trung tâm Y học hạt nhân và Ung bướu Bệnh viện Bạch Mai từ tháng 5 năm 2017 đến tháng 8 năm 2018 cho thấy: 1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu: độ tuổi trung bình 61,96 ± 10,35 trong đó ≥ 60 tuổi chiếm 65,4%; bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến là chủ yếu (96,3%) và phần lớn ở giai đoạn IV (81,6%). 2. Tỷ lệ bệnh nhân phát hiện đột biến EGFR huyết tương 56/136 (41,2%), chỉ phát hiện ở nhóm bệnh nhân Ung thư biểu mô tuyến. Tỷ lệ mang 2 đột biến là 27,2%. Trong các đột biến kép hầu hết là 1 đột biến kháng thuốc đi kèm 1 đột biến nhạy thuốc (94,7%). 3. Phân bố các đột biến chủ yếu là đột biến xoá đoạn trên exon 19 (41,3%), đột biến L858R trên exon 21(29,3%) và đột biến T790M trên exon 20 (24%). 4. Tỷ lệ đột biến EGFR huyết tương ở nhóm bệnh nhân nữ cao hơn nam, nhóm không hút thuốc lá cao hơn nhóm hút thuốc lá, nhóm đã hoặc đang điều trị bằng TKIs cao hơn nhóm chưa từng điều trị, bệnh nhân giai đoạn IV cao hơn các giai đoạn I,II,III. 5. Tỷ lệ đột biến T790M là 13,2% tổng số bệnh nhân và chỉ gặp ở nhóm Ung thư biểu mô tuyến, đột biến ở nhóm đã hoặc đang điều trị TKIs cao hơn nhóm chưa từng điều trị. Chưa thấy mối liên quan về nhóm tuổi, giới tính, tiền sử hút thuốc lá với đột biến T790M . KIẾN NGHỊ + Đối với những bệnh nhân UTPKTBN đang trong giai đoạn tiến triển, có thể xét nghiệm EGFR huyết tương để phát hiện đột biến. + Đối với những bệnh nhân được chỉ định điều trị đích bằng TKIs cần thường xuyên xét nghiệm EGFR huyết tương để theo dõi tình trạng bệnh. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 41
  50. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Nguyễn Thị Lan Anh (2017), Nghiên cứu đặc điểm đột biến gen EGFR và mối liên quan với lâm sàng, cận lâm sàng ở bệnh nhân ung thư phổi biểu mô tuyến,Luận án Tiến sĩ Y học, Học viện Quân Y. 2. Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2009), Cơ sở di truyền học phân tử và tế bào, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội. 3. Nguyễn Văn Hiếu (2015), Ung thư học, Nhà xuất bản Y học. 4. Mai Trọng Khoa (2013), Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị một số bệnh ung thư, Nhà xuất bản Y học. 5. Mai Trọng Khoa (2016), Kháng thể đơn dòng và phân tử nhỏ trong điều trị ung thư, Nhà xuất bản Y học. 6. Mai Trọng Khoa, Trần Đình Hà, Phạm Cẩm Phương và cộng sự (2016), "Xác định đột biến gen EGFR trên bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ tại Bệnh viện Bạch Mai", Tạp chí Ung thư học Việt Nam, 3, 271-277. 7. Nguyễn Minh Hà, Trần Văn Khánh và cộng sự (2014), "Hiệu quả điều trị trúng đích trên bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ giai đoạn muộn có và không có đột biến EGFR", Tạp chí nghiên cứu Y học, 87(2), 6-14. 8. Phan Thanh Thăng, Nguyễn Thị Lan Hương, Hồ Trọng Toàn và cộng sự (2017), "Phát hiện đột biến gen EGFR trong mẫu huyết tương bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ tại bệnh viện Chợ Rẫy", Thời sự Y học, 82-88. 9. Tạ Văn Thành (2010), Con đường tín hiệu tế bào và dấu ấn sinh học trong chẩn đoán, Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật. 10. Nguyễn Văn Tình (2018), Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và ứng dụng phân loại mô bệnh học ung thư biểu mô tuyến phế quản theo hiệp hội nghiên cứu ung thư phổi quốc tế 2011, Đại học Y Hà Nội. 11. Phạm Hùng Vân (2009), PCR và real-time PCR Các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp, Nhà xuất bản Y học. 12. Bai H, Mao L, Wang HS, et al (2009), "Epidermal Growth Factor Receptor Mutations in Plasma DNA Samples Predict Tumor Response in Chinese Patients With Stages IIIB to IV Non–Small-Cell Lung Cancer", Journal of Clinical Oncology, 27(16), 2653-2659. 13. Balak MN, Gong Y, Riely GJ, et al (2006), "Novel D761Y and common secondary T790M mutations in epidermal growth factor receptor-mutant lung adenocarcinomas with acquired resistance to kinase inhibitors", Clin Cancer Res, 12(21), 6494-501. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  51. 14. Bean J, Riely GJ, Balak M, et al (2008), "Acquired resistance to epidermal growth factor receptor kinase inhibitors associated with a novel T854A mutation in a patient with EGFR-mutant lung adenocarcinoma", Clin Cancer Res, 14(22), 7519-25. 15. Carey KD, Garton AJ, Romeo MS, et al (2006), "Kinetic analysis of epidermal growth factor receptor somatic mutant proteins shows increased sensitivity to the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, erlotinib", Cancer Res, 66(16), 8163-71. 16. Carpenter G, King L Jr, and Cohen S (1978), "Epidermal growth factor stimulates phosphorylation in membrane preparations in vitro", Nature, 276(5686), 409-410. 17. Ciardiello F, Tortora G (2008), "EGFR Antagonists in Cancer Treatment", New England Journal of Medicine, 358(11), 1160-1174. 18. Kwapisz D (2017), "The first liquid biopsy test approved. Is it a new era of mutation testing for non-small cell lung cancer?", Annals of Translational Medicine, 5(3). 19. Engelman JA, Zejnullahu K,Mitsudomi T (2007), "MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling", Science, 316(5827), 1039-43. 20. Fan W, Tang Z, Yin L, et al (2011), "MET-independent lung cancer cells evading EGFR kinase inhibitors are therapeutically susceptible to BH3 mimetic agents", Cancer Res, 71(13), 4494-505. 21. FDA. "List of Cleared or Approved Companion Diagnostic Devices (In Vitro and Imaging Tools)", from 22. Mountzios G (2018), "Making progress in epidermal growth factor receptor (EGFR)-mutant non-small cell lung cancer by surpassing resistance: third-generation EGFR tyrosine kinase inhibitors (EGFR- TKIs)", Annals of translational medicine, 6(8), 140-140. 23. Guo K, Zhang Z, Han L, et al (2015), "Detection of epidermal growth factor receptor mutation in plasma as a biomarker in Chinese patients with early-stage non-small cell lung cancer", OncoTargets and therapy, 8, 3289-3296. 24. Heist RS, Christiani D (2009), "EGFR-targeted therapies in lung cancer: predictors of response and toxicity", Pharmacogenomics, 10(1), 59-68. 25. Huang Z, Wang Z, Bai H, et al (2012), "The detection of EGFR mutation status in plasma is reproducible and can dynamically predict the efficacy of EGFR-TKI", Thorac Cancer, 3(4), 334-340. 26. Kobayashi S, Boggon TJ, DayAram T, et al (2005), "EGFR Mutation and Resistance of Non–Small-Cell Lung Cancer to Gefitinib", New England Journal of Medicine, 352(8), 786-792. 27. Kumar A, Petri ET, Halmos B, et al (2008), "Structure and clinical relevance of the epidermal growth factor receptor in human cancer", @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  52. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology, 26(10), 1742-1751. 28. Leon SA, Shapiro B, Sklaroff DM, et al (1977), "Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy", Cancer Res, 37(3), 646-50. 29. Li X, Ren R, Ren S, et al (2014), "Peripheral blood for epidermal growth factor receptor mutation detection in non-small cell lung cancer patients", Translational oncology, 7(3), 341-348. 30. Luo J, Shen L, and Zheng D (2014), "Diagnostic value of circulating free DNA for the detection of EGFR mutation status in NSCLC: a systematic review and meta-analysis", Scientific reports, 4, 6269-6269. 31. Marmor MD, Skaria KB, and Yarden Y (2004), "Signal transduction and oncogenesis by ErbB/HER receptors", International Journal of Radiation Oncology*Biology*Physics, 58(3), 903-913. 32. Nurwidya F, Takahashi F, Murakami A, et al (2014), "Acquired resistance of non-small cell lung cancer to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors", Respiratory Investigation, 52(2), 82-91. 33. Ohashi K, Maruvka YE, Michor F, et al (2013), "Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Kinase Inhibitor–Resistant Disease", Journal of Clinical Oncology, 31(8), 1070-1080. 34. Oser MG, Niederst MJ, Sequist LV (2015), "Transformation from non- small-cell lung cancer to small-cell lung cancer: molecular drivers and cells of origin", The Lancet. Oncology, 16(4), e165-e172. 35. Pao W, Miller VA (2005), "Epidermal growth factor receptor mutations, small-molecule kinase inhibitors, and non-small-cell lung cancer: current knowledge and future directions", J Clin Oncol, 23(11), 2556- 68. 36. Pao W, Miller VA, Politi KA, et al (2005), "Acquired Resistance of Lung Adenocarcinomas to Gefitinib or Erlotinib Is Associated with a Second Mutation in the EGFR Kinase Domain", PLOS Medicine, 2(3), e73. 37. Piperdi B, Perez-Soler R (2012), "Role of erlotinib in the treatment of non-small cell lung cancer: clinical outcomes in wild-type epidermal growth factor receptor patients", Drugs, 72 Suppl 1(0 1), 11-19. 38. Pirker R, Filipits M (2016), "Personalized treatment of advanced non- small-cell lung cancer in routine clinical practice", Cancer and Metastasis Reviews, 35(1), 141-150. 39. Pirker R (2015), "What is the best strategy for targeting EGF receptors in non-small-cell lung cancer?", Future Oncol, 11(1), 153-67. 40. Ramalingam SS, Yang JC, Lee CK, et al (2015), "AZD9291, a mutant- selective EGFR inhibitor, as first-line treatment for EGFR mutation- @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  53. positive advanced non-small cell lung cancer (NSCLC): Results from a phase 1 expansion cohort", Journal of Clinical Oncology, 33(15_suppl), 8000-8000. 41. Reck M, Hagiwara K, Han B, et al (2016), "ctDNA Determination of EGFR Mutation Status in European and Japanese Patients with Advanced NSCLC: The ASSESS Study", J Thorac Oncol, 11(10), 1682-9. 42. Robertson EG, Baxter G (2011), "Tumour seeding following percutaneous needle biopsy: the real story!", Clin Radiol, 66(11), 1007- 14. 43. Rosell R, Carcereny E, GERvais R, et al (2012), "Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase 3 trial", The Lancet Oncology, 13(3), 239-246. 44. Sakuma Y, Matsukuma S, Yoshihara M, et al (2007), "Epidermal growth factor receptor gene mutations in atypical adenomatous hyperplasias of the lung", Modern Pathology, 20, 967. 45. Sequist LV, Bell DW, Lynch TJ, et al (2007), "Molecular predictors of response to epidermal growth factor receptor antagonists in non-small- cell lung cancer", J Clin Oncol, 25(5), 587-95. 46. Sequist LV, Waltman BA, Dias-Santagata D, et al (2011), "Genotypic and Histological Evolution of Lung Cancers Acquiring Resistance to EGFR Inhibitors", Science Translational Medicine, 3(75), 75-26. 47. Sharma SV, Bell DW, Settleman J, et al (2007), "Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer", Nature Reviews Cancer, 7, 169. 48. Shigematsu H, Lin L, Takahashi T, et al (2005), "Clinical and biological features associated with epidermal growth factor receptor gene mutations in lung cancers", J Natl Cancer Inst, 97(5), 339-46. 49. Soria JC, Ohe Y, Vansteenkiste J, et al (2018), "Osimertinib in Untreated EGFR-Mutated Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer", N Engl J Med, 378(2), 113-125. 50. Suda K, Tomizawa K, Fujii M, et al (2011), "Epithelial to mesenchymal transition in an epidermal growth factor receptor-mutant lung cancer cell line with acquired resistance to erlotinib", J Thorac Oncol, 6(7), 1152-61. 51. Takahama T, Sakai K, Takeda M, et al (2016), "Detection of the T790M mutation of EGFR in plasma of advanced non-small cell lung cancer patients with acquired resistance to tyrosine kinase inhibitors (West Japan oncology group 8014LTR study)", Oncotarget, 7(36), 58492-58499. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  54. 52. Takezawa K, Pirazzoli V, Arcila ME, et al (2012), "HER2 amplification: a potential mechanism of acquired resistance to EGFR inhibition in EGFR-mutant lung cancers that lack the second-site EGFRT790M mutation", Cancer Discov, 2(10), 33-922. 53. Thiery JP, Acloque H, Huang RY, et al (2009), "Epithelial- mesenchymal transitions in development and disease", Cell, 139(5), 90- 871. 54. Travis WD, Brambilla E, Nicholson AG, et al (2015), "The 2015 World Health Organization Classification of Lung Tumors: Impact of Genetic, Clinical and Radiologic Advances Since the 2004 Classification", Journal of Thoracic Oncology, 10(9), 1243-1260. 55. Vossen RH, White SJ (2017), "Quantitative DNA Analysis Using Droplet Digital PCR", Methods Mol Biol, 1492, 167-177. 56. WHO (2018). "GLOBOCAN 2018 Estimated cancer incidence, mortality and prevalence worldwide in 2018", from 57. Wislez M, Kurie JM (2012), The intersection of EGFR and the Ras signaling pathway. Cancer drug discovery and development: EGFR signaling networks in cancer therapy. 89-95. 58. Wu SG, Shih JY (2018), "Management of acquired resistance to EGFR TKI–targeted therapy in advanced non-small cell lung cancer", Molecular Cancer, 17(1), 38. 59. Yamaguchi F, Fukuchi K, Yamazaki Y, et al (2014), "Acquired resistance L747S mutation in an epidermal growth factor receptor- tyrosine kinase inhibitor-naive patient: A report of three cases", Oncol Lett, 7(2), 357-360. 60. Yasuda H, Park E, Yun CH, et al (2013), "Structural, Biochemical, and Clinical Characterization of Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) Exon 20 Insertion Mutations in Lung Cancer", Science Translational Medicine, 5(216), 177-216. 61. Yu HA, Arcila ME, Rekhtman N, et al (2013), "Analysis of tumor specimens at the time of acquired resistance to EGFR-TKI therapy in 155 patients with EGFR-mutant lung cancers", Clin Cancer Res, 19(8), 7-2240. 62. Yun CH, Mengwasser KE, Toms AV, et al (2008), "The T790M mutation in EGFR kinase causes drug resistance by increasing the affinity for ATP", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 105(6), 2070-2075. 63. Zakowski MF, Ladanyi M, and Kris MG (2006), "EGFR mutations in small-cell lung cancers in patients who have never smoked", N Engl J Med, 355(2), 5-213. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  55. 64. Zhang S, Zhu L, and Chen X (2018), "ctDNA assessment of EGFR mutation status in Chinese patients with advanced non-small cell lung cancer in real-world setting", Journal of thoracic disease, 10(7), 4169- 4177. 65. Zhang Z, Lee JC, Lin L, et al (2012), "Activation of the AXL kinase causes resistance to EGFR-targeted therapy in lung cancer", Nat Genet, 44(8), 852-60. 66. Zhao X, Han RB,Zhao J, et al (2013), "Comparison of Epidermal Growth Factor Receptor Mutation Statuses in Tissue and Plasma in Stage I–IV Non-Small Cell Lung Cancer Patients", Respiration, 85(2), 119-125. 67. Zhou C, Wu YL, Chen G, et al (2011), "Erlotinib versus chemotherapy as first-line treatment for patients with advanced EGFR mutation- positive non-small-cell lung cancer (OPTIMAL, CTONG-0802): a multicentre, open-label, randomised, phase 3 study", The Lancet Oncology, 12(8), 735-742. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  56. PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1. QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM ĐỘT BIẾN GEN EGFR HUYẾT TƯƠNG Trong việc kiểm tra đột biến EGFR huyết tương, chúng ta sử dụng bộ kit cobas® Sample Preparation (Roche) để tách DNA và bộ kit cobas® EGFR mutation Test v2 để khuếch đại DNA và phát hiện đột biến. + Chuẩn bị Để xét nghiệm đột biến EGFR trong mẫu huyết tương, cần chuẩn bị 5ml mẫu máu của bệnh nhân được thu thập trong ống EDTA, sau đó ly tâm ở 4000xg trong 10 phút để tách huyết tương ra khỏi máu, khoảng 2ml huyết tương đã được thu thập phải được lưu trữ trong nhiệt độ -80oC cho đến khi xử lý thêm hoặc sử dụng ngay. Thử nghiệm bao gồm 2 giai đoạn chính: Tách DNA và khuếch đại DNA. + Tách DNA Chuẩn bị các ống falcon 15ml có dán nhãn dành cho mẫu huyết tương và chứng âm (dùng nước). Vortex các mẫu huyết tương sau đó chuyển 2ml (thể tích nhỏ nhất) huyết tương và chứng âm sang ống falcon 15ml có dán nhãn tương ứng. Tiến hành loại bỏ protein bằng cách bổ sung 250 µl Protein Kinase (PK) vào mỗi ống để phân giải các protein, đồng thời thêm 2ml DNA PBB vào mỗi ống nhằm tăng khả năng bám dính và tăng tương tác của các DNA với cột lọc. Trộn ống falcon 3-5 lần bằng cách đảo ngược rồi ủ ở nhiệt độ phòng 15-30oC trong 30 phút. Trong quá trình ủ chuẩn bị số lượng cột lọc HPEA FT (HPEA filter tube) có dán nhãn trên nắp cột và các cột thu (CT – collection tube) đủ dùng cho mẫu và chứng âm. Mỗi mẫu cần 1 HPEA FT, 3 CT và 2 elution tube (ống 1,5 ml). Sau 30 phút ủ, tiến hành tủa và thu DNA. Bổ sung 500 µl Isopropanol để kết tủa các DNA, trộn ống falcon 3-5 lần bằng cách đảo ngược. Sau đó chuyển toàn bộ dung dịch trong ống qua HPEA FT và ly tâm 4000×g trong 5 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU - 1 -
  57. phút. Ly tâm xong tiến hành lấy HPEA ra khỏi FT, loại bỏ phần dung dịch bên dưới đã chảy qua HPEA FT và đặt các FT vào các ống CT. Thêm 500 µl WBI (Wash Buffer I) đã pha ethenol vào FT rồi ly tâm 8000×g trong 1 phút để rửa tủa, loại bỏ muối, tạp chất. Sau đó tiếp tục đặt các FT vào các ống CT mới và rửa lần 2 bằng WBII đã pha ethanol, ly tâm 8000×g trong 1 phút. Lại đặt các FT vào CT mới, ly tâm 16000-20000×g/1 phút để làm khô màng lọc và làm bay hơi ethanol vì ethanol có thể làm hạn chế mồi Taqman trong phản ứng real-time PCR. Tiến hành thu DNA bằng cách đặt FT vào các elution tube, sau đó hoà tan tủa bằng cách cho thêm 100 µl DNA EB (elution buffer) vào FT sao cho không đụng vào màng FT và ủ ở 15oC đến 30oC/15 phút. Ly tâm 8000×g/1 phút. Loại bỏ FT, thu dung dịch DNA stock bằng cách hút chậm 80µl từ ống DNA stock sang một ống elution tube thứ 2. Hút cẩn thận để tránh hút lên pellet. Dung dịch trong ống sẵn sàng cho phản ứng PCR. Chú ý: nếu hút phải pellet chúng ta sẽ hút DNA stock ngược trở lại ống elution tube đầu tiên. Ly tâm 8000×g/1 phút. Sau đó làm lại bước chuyển 80µl sang ống thứ 2. + Phát hiện và khuếch đại DNA Vortex các ống hoá chất trong 5 giây (dùng pipette) Chuẩn bị 3 ống PCR, dán nhãn tương ứng với 3 MMX1, MMX2, MMX3, pha các loại Master mix như công thức: tổng thể tích của mẫu = (tổng số mẫu +2 mẫu chứng +1) × 20µl. Công thức tính thể tích của MgAc cho mỗi MMX được tính theo công thức sau: thể tích của MgAc cần thiết = (tổng số mẫu + 2 mẫu chứng + 1) × 5µl. Trộn mỗi thể tích của MMX1,2,3 với mỗi thể tích của MgAc để được 3 mẫu MMX hoạt động. Thêm 25µl của MMX, chứng âm và dương, mẫu theo bảng sau: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU - 2 -
  58. Hàng/ 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 Cột A PC PC PC S7 S7 S7 S15 S15 S15 S23 S23 S23 MMX1 MMX2 MMX3 MMX1 MMX2 MMX3 MMX1 MMX2 MMX3 MMX1 MMX2 MMX3 B NC NC NC S8 S8 S8 S16 S16 S16 S24 S24 S24 MMX1 MMX2 MMX3 MMX1 MMX2 MMX3 MMX1 MMX2 MMX3 MMX1 MMX2 MMX3 C S1 S1 S1 S9 S9 S9 S17 S17 S17 S25 S25 S25 MMX1 MMX2 MMX3 MMX1 MMX2 MMX3 MMX1 MMX2 MMX3 MMX1 MMX2 MMX3 D S2 S2 S2 S10 S10 S10 S18 S18 S18 S26 S26 S26 MMX1 MMX2 MMX3 MMX1 MMX2 MMX3 MMX1 MMX2 MMX3 MMX1 MMX2 MMX3 E S3 S3 S3 S11 S11 S11 S19 S19 S19 S27 S27 S27 MMX1 MMX2 MMX3 MMX1 MMX2 MMX3 MMX1 MMX2 MMX3 MMX1 MMX2 MMX3 F S4 S4 S4 S12 S12 S12 S20 S20 S20 S28 S28 S28 MMX1 MMX2 MMX3 MMX1 MMX2 MMX3 MMX1 MMX2 MMX3 MMX1 MMX2 MMX3 G S5 S5 S5 S13 S13 S13 S21 S21 S21 S29 S29 S29 MMX1 MMX2 MMX3 MMX1 MMX2 MMX3 MMX1 MMX2 MMX3 MMX1 MMX2 MMX3 H S6 S6 S6 S14 S14 S14 S22 S22 S22 S30 S30 S30 MMX1 MMX2 MMX3 MMX1 MMX2 MMX3 MMX1 MMX2 MMX3 MMX1 MMX2 MMX3 PC: posive control: chứng dương; NC: negative control: chứng âm, S#: Sample #: mẫu #. Sau khi hoàn thành việc thêm mẫu vào đĩa theo hướng dẫn, đĩa được dán lại Thiết lập máy phân tích cobas z và khởi động PCR. Việc kiểm tra và xác nhận mẫu được chạy bởi phần mềm cobas® 4800. Việc khuếch đại DNA được thực hiện bằng cách sử dụng realtime PCR vì nó có nhiều ưu điểm so với PCR thông thường. Realtime PCR nhạy hơn, chính xác hơn, tốn ít thời gian hơn và đòi hỏi ít công sức hơn so với PCR truyền thống. Ngoài ra, realtime PCR hiển thị dữ liệu sau mỗi chu kỳ trong khi PCR thông thường chỉ cho kết quả khi kết thúc phản ứng. Nhưng tính năng quan trọng nhất của realtime PCR đối với thực nghiệm này là đo lường định lượng của sản phẩm. Tính năng nhất định này giúp xác định chỉ số bán định lượng (SQI) của mỗi đột biến. SQI là phép đo bán định lượng ctDNA (DNA khối u lưu hành trong máu) có thể được sử dụng để theo dõi sự hiện diện của các đột biến EGFR theo thời gian. Theo dõi chỉ số đột biến của EGFR là rất quan trọng để quan sát tiến triển bệnh của bệnh nhân và xác định hướng điều trị trong tương lai. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU - 3 -
  59. PHỤ LỤC 2. PHIẾU THÔNG TIN BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU I. THÔNG TIN CHUNG 1. Họ và tên bệnh nhân: 2. Mã số bệnh nhân: 3. Tuổi: 4. Giới tính: □ Nam □ Nữ 5. Lý do vào viện: □ Triệu chứng hô hấp □ Nổi hạch □ Triệu chứng của cơ quan di căn □ Triệu chứng toàn thân □ Khám sức khoẻ phát hiện u phổi 6. Tiền sử hút thuốc lá: □ Không □ Đã và đang hút thuốc lá. Số lượng thuốc lá: (bao.năm) 7. Tiền sử điều trị thuốc đích TKIs □ Không □ Đã hoặc đang điều trị bằng thuốc TKIs. Nếu có, ghi rõ loại thuốc: II. ĐẶC ĐIỂM KHỐI U PHỔI VÀ DI CĂN 1. Mô bệnh học: □ Ung thư biểu mô tuyến □ Ung thư biểu mô vảy □ Khác 2. Giai đoạn T: □ Tx □ T1 □ T2 □ T3 □ T4 3. Giai đoạn N: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU - 4 -
  60. □ Nx □ N1 □ N2 □ N3 4. Di căn: □ Có □ Không Nếu có, ghi rõ vị trí di căn: 5. Kết quả đột biến gen mẫu mô: □ Có □ Không Nếu có, ghi rõ vị trí đột biến: III. XÉT NGHIỆM ĐỘT BIẾN GEN EGFR HUYẾT TƯƠNG 1. Kết quả đột biến EGFR huyết tương: □ Có □ Không 2. Vị trí đột biến: 3. Chỉ số SQI: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU - 5 -
  61. PHỤ LỤC 3. DANH SÁCH BỆNH NHÂN STT Mã bệnh án Họ và tên Tuổi Giới tính 1 170046645 Đinh Thị C. 65 Nữ 2 180001820 Nguyễn Sỹ N. 57 Nam 3 180003249 Lê Văn T. 57 Nam 4 170014106 Nguyễn Thị Bích L. 58 Nữ 5 170022573 Trần Văn Đ. 62 Nam 6 180000319 Nguyễn Thị T. 67 Nữ 7 170050340 Nguyễn Công L. 39 Nữ 8 180000772 Vũ Tiến M. 61 Nam 9 170050081 Hoàng Quốc H. 63 Nam 10 180008338 Nguyễn Văn T. 54 Nam 11 170231665 Lương Đức H. 64 Nam 12 170046209 Lê Anh H. 71 Nam 13 180010923 Nguyễn Thị Bích H. 71 Nữ 14 170046522 Phạm Vũ H. 37 Nữ 15 180011830 Lô Thị D. 46 Nữ 16 180001265 Hoàng Thị T. 74 Nữ 17 170040322 Nguyễn Thị U. 76 Nữ 18 160041384 Ngô Văn M. 63 Nam 19 160039627 Đỗ Hiển V. 70 Nam 20 160043968 Vũ Hữu L. 83 Nam 21 170237483 Nguyễn Văn M. 68 Nam 22 180001509 Đoàn Quốc T. 66 Nam 23 180000558 Lê Đình T. 47 Nam 24 170050081 Hoàng Quốc H. 63 Nam 25 170004455 Nguyễn Đình Q. 58 Nam 26 170023344 Bùi Gia H. 54 Nam 27 170021757 Bùi Thị M. 72 Nữ 28 170239991 Đỗ Viết T. 58 Nam @ School of Medicine and Pharmacy, VNU - 6 -
  62. 29 170237480 Nguyễn Thị H. 57 Nữ 30 170050165 Nguyễn Thị M. 59 Nữ 31 170046755 Nguyễn Đình Q. 57 Nam 32 170046693 Lê Đình T. 65 Nam 33 170046664 Lê Thị Thu H. 52 Nữ 34 180002056 Nguyễn Thị T. 71 Nữ 35 180003120 Nguyễn Thị T. 63 Nữ 36 180000084 Lê Thị X. 59 Nữ 37 180000438 Lâm Thị A. 74 Nữ 38 180000556 Nguyễn Vũ P. 67 Nam 39 180000504 Nguyễn Thị T. 69 Nữ 40 180000110 Lê Thị Kim X. 69 Nữ 41 170050026 Trịnh Tiến L. 77 Nam 42 180000429 Nguyễn Tiến N. 61 Nam 43 170204492 Hà Thị Q. 81 Nữ 44 170015096 Lê Thị B. 68 Nữ 45 170006551 Trương Quốc T. 65 Nam 46 180002150 Hoàng Lệ H. 42 Nữ 47 180000013 Nguyễn Thị M. 71 Nữ 48 180041789 Nguyễn Văn T. 61 Nam 49 180001820 Nguyễn Sỹ N. 58 Nam 50 180000155 Phan Lê Đ. 48 Nam 51 180001512 Nguyễn Thị D. 60 Nữ 52 170027234 Đặng Ngọc B. 64 Nam 53 180049858 Nguyễn Trung T. 50 Nam 54 180000743 Tống Quang S. 69 Nam 55 180011854 Nguyễn Thị L. 66 Nữ 56 180000450 Trần Quốc L. 48 Nam 57 180004844 Hoàng Ngọc K. 73 Nam 58 180011220 Đặng Văn K. 56 Nam @ School of Medicine and Pharmacy, VNU - 7 -
  63. 59 170050081 Hoàng Quốc H. 64 Nam 60 180002926 Phan Xuân T. 62 Nam 61 180239963 Nguyễn Thị Đ. 60 Nữ 62 180001936 Nguyễn Minh H. 60 Nam 63 180008153 Hà Văn N. 75 Nam 64 180001241 Phạm Quang C. 58 Nam 65 180014987 Đinh Quang M. 59 Nam 66 180001011 Khuất Quang L. 64 Nam 67 180007378 Ngô Xuân Đ. 62 Nam 68 180006551 Nguyễn Trọng Đ. 62 Nam 69 180000190 Vũ Ngọc B. 47 Nam 70 180003738 Nguyễn Trung V. 66 Nam 71 180008333 Bùi Tiến D. 59 Nam 72 180011096 Đặng Văn R. 70 Nam 73 180204493 Trương Thị T. 84 Nữ 74 180010529 Nguyễn Văn T. 47 Nam 75 180002439 Nguyễn Thị A. 62 Nữ 76 180007147 Ngô Thanh L. 60 Nam 77 180008867 Tạ Đình Ch. 63 Nam 78 180013556 Phạm Văn S. 57 Nam 79 180001509 Đoàn Quốc T. 67 Nam 80 180012129 Đỗ Thị D. 61 Nữ 81 180002900 Phạm Xuân H. 69 Nam 82 180013519 Phan Thị M. 61 Nữ 83 180046759 Trần Thị Thu T. 60 Nữ 84 180017635 Hoàng Xuân H. 67 Nam 85 180012200 Lương Tuấn T. 56 Nam 86 180005565 Nguyễn Văn M. 82 Nam 87 180002056 Nguyễn Thị T. 72 Nữ 88 180305827 Trần Thị Thanh H. 44 Nữ @ School of Medicine and Pharmacy, VNU - 8 -
  64. 89 180011830 Lô Thị D. 47 Nữ 90 180015201 Đặng Văn P. 56 Nam 91 180018222 Trịnh Minh T. 53 Nam 92 180010721 Trần Thị H. 45 Nữ 93 1803008900 Nguyễn Thị B. 81 Nữ 94 180039647 Nguyễn Hồ T. 69 Nam 95 180023348 Phùng Thị V. 62 Nữ 96 180008608 Nguyễn Thị H. 43 Nữ 97 180011688 Dỗ Văn C. 55 Nam 98 180012456 Lê Đức H. 60 Nam 99 180004844 Hoàng Ngọc K. 73 Nam 100 180019674 Nguyễn Thị Bích H. 72 Nữ 101 180001512 Nguyễn Quang T. 30 Nam 102 180019834 Nguyễn Văn H. 58 Nam 103 180004399 Cù Xuân B. 62 Nam 104 180010850 Lê Thị C. 69 Nữ 105 180043948 Lê Thị B. 68 Nữ 106 180000556 Nguyễn Vũ P. 67 Nam 107 180040862 Ngô Thị V. 56 Nữ 108 180019550 Phan Thị Bạch M. 67 Nữ 109 180002825 Nguyễn Văn C. 64 Nam 110 180000637 Nguyễn Thị N. 40 Nữ 111 180011236 Nguyễn Văn Q. 64 Nam 112 180001619 Trương Như T. 62 Nam 113 180021335 Phùng Hồng Q. 66 Nữ 114 180020865 Trần Thị H. 88 Nữ 115 180018800 Nguyễn Thị D. 59 Nữ 116 180003217 Nguyễn Thị Thanh T. 55 Nữ 117 180016397 Vũ Ngọc N. 68 Nam 118 180046822 Nguyễn Quang T. 30 Nam @ School of Medicine and Pharmacy, VNU - 9 -
  65. 119 180046310 Lương Văn L. 70 Nam 120 180231865 Nguyễn Thị V. 46 Nữ 121 180050452 Nguyễn Thị D. 61 Nữ 122 180046649 Nguyễn Hứu V. 62 Nam 123 180014106 Nguyễn Thị T. 71 Nữ 124 180031464 Nguyễn Thị M. 71 Nữ 125 180002872 Hà Thị Q. 80 Nữ 126 180002991 Đào Thị H. 62 Nữ 127 180000192 Lê Xuân Đ. 69 Nam 128 180200482 Nguyễn Thị H. 70 Nữ 129 180006680 Phan Lê Đ. 48 Nam 130 180000013 Trương Thị N. 70 Nữ 131 180014987 Phạm Ngọc T. 55 Nam 132 180027360 Nguyễn Thị L. 66 Nữ 133 180010721 Nguyễn Thị S. 75 Nữ 134 180002970 Đỗ Thị T. 51 Nữ 135 180010923 Nguyễn Văn V. 60 Nam 136 180008333 Đoàn Quốc T. 67 Nam @ School of Medicine and Pharmacy, VNU - 10 -