Khóa luận Nghiên cứu thành phần hóa học cây Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) thu hái tại Thanh Hóa

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu thành phần hóa học cây Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) thu hái tại Thanh Hóa

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  NGUYỄN NAM PHƯƠNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY LAN KIM TUYẾN (Anoectochilus setaceus Blume) THU HÁI TẠI THANH HÓA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2019 1
2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  Người thực hiện: NGUYỄN NAM PHƯƠNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY LAN KIM TUYẾN (Anoectochilus setaceus Blume) THU HÁI TẠI THANH HÓA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa : QH.2014.Y Người hướng dẫn: PGS.TS. Lê Quang Huấn ThS. Hà Thị Thanh Hương Hà Nội – 2019
3. LỜI CẢM ƠN Qua 5 năm học tập và rèn luyện tại Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội, với sự chỉ bảo và giảng dạy nhiệt tình của Thầy Cô đã giúp cho em tiếp thu được những kiến thức về lý thuyết và thực hành vô cùng hữu ích. Khóa luận này là kết quả của việc tiếp thu, vận dụng những kiến thức đã được học cũng như sự cố gắng nỗ lực của bản thân em tại Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội và phòng Công nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ sinh học trực thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS. Lê Quang Huấn – phòng Công nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ sinh học trực thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và ThS. Hà Thị Thanh Hương – Nghiên cứu viên Bộ môn Dược liệu – Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ, quan tâm tạo điều kiện thuận lợi để em có thể nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này. Em xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội, Bộ môn Dược liệu – Dược học cổ truyền và các anh chị nghiên cứu viên trong phòng Công nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện giúp đỡ em thực hiện Khóa luận tốt nghiệp. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã luôn theo sát động viên, quan tâm và tạo điều kiện trong thời gian em thực hiện khóa luận. Trong quá trình nghiên cứu đề tài khó tránh khỏi thiếu sót. Em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của Thầy Cô để bài luận văn của em được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 02 năm 2019 Sinh viên Nguyễn Nam Phương i
4. MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH v ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 2 1. Vài nét về chi Anoectochilus 2 1.1. Đặc điểm hình thái 2 1.2.Phân bố 2 1.3. Công dụng và tác dụng 2 2. Tổng quan về cây Lan kim tuyến 3 2.1.Vị trí phân loại 3 2.2.Đặc điểm hình thái 4 2.3.Sinh học và sinh thái 5 2.4.Phân bố và tình trạng 5 2.5.Thành phần hóa học 5 2.6.Công dụng 10 2.7.Tác dụng sinh học của một số hợp chất trong cây Lan kim tuyến 10 2.7.1.Quercetin 10 2.7.2.Isorhamnetin 11 2.7.3.Acid ferulic 12 2.7.4.Các bài thuốc và sản phẩm được biết đến 13 2.8.Vấn đề cần giải quyết 13 CHƯƠNG II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1.Nguyên liệu, hóa chất 14 ii
5. 2.2.Phương tiện nghiên cứu 14 2.3.Phương pháp nghiên cứu 14 2.3.1.Phương pháp chiết xuất cao Lan kim tuyến 14 2.3.2.Phương pháp định tính 17 .3.3.Phương pháp định lượng 17 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ 20 3.1.Kết quả định tính Quercetin, Isorhamnetin, Acid ferulic 20 3.2.Định lượng Quercetin, Isorhamnetin, Acid ferulic 21 3.2.1.Định lượng Quercetin, Isorhamnetin trong dịch chiết bằng HPLC 21 3.2.1.1.Điều kiện sắc ký 21 3.2.1.2.Kiểm tra độ thích hợp của hệ thống 21 3.2.1.3.Định lượng Quercetin, Isorhamnetin 22 3.2.1.4.Kết quả định lượng Quercetin, Isorhamnetin 25 3.2.2.Định lượng Acid ferulic trong dịch chiết bằng HPLC 26 3.2.2.1.Điều kiện sắc ký 26 3.2.2.2.Kiểm tra độ thích hợp của hệ thống 27 3.2.2.3.Định lượng Acid ferulic 28 3.2.2.4.Kết quả định lượng Acid ferulic 30 BÀN LUẬN 31 KẾT LUẬN 33 KIẾN NGHỊ 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 PHỤ LỤC iii
6. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dd Dung dịch ACN Acetonitril MeOH Methanol PBS Muối đệm phosphate IC50 Nồng độ ức chế 50% RLAR Enzyme Lens Aldose Reductase (NH4)2SO4 Amoni sunfat KH2PO4 Kali đihiđrophotphat MgSO4.7H2O Magie sulfat CaCl2.2H2O Calcium Chloride NaCl Natri clorua C Nồng độ CV Giá trị nồng độ UV Tử ngoại Vis Khả kiến STT Số thứ tự TB Trung bình Area Diện tích píc RT Thời gian lưu Tailling factor Hệ số kéo đuôi iv
7. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Cấu trúc hóa học các hợp chất đã phân lập được từ cây Lan kim tuyến 6 Bảng 3.1. Kết quả sắc ký dung dịch chuẩn 21 Bảng 3.2. Số liệu pha đường chuẩn 22 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc của Quercetin 23 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc của Isorhamnetin 24 Bảng 3.5. Kết quả định lượng Quercetin 25 Bảng 3.6. Kết quả định lượng Isorhamnetin 26 Bảng 3.7. Kết quả kiểm tra độ thích hợp của hệ thống 27 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát mối tương quan giữa nồng độ các dung dịch 28 Bảng 3.9. Kết quả khảo sát mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc của Acid ferulic 29 Bảng 3.10. Kết quả xác định nồng độ Acid ferulic trong mẫu thử 30 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cây Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) 4 Hình 1.2. Công thức cấu tạo Quercetin, C15H10O7 11 Hình 1.3. Công thức cấu tạo Isorhamnetin, C16H12O7 12 Hình 1.4. Công thức cấu tạo Acid ferulic, C10H10O4 12 Hình 2.1. Phổ hấp thụ của Quercetin 17 Hình 2.2. Phổ hấp thụ của Isorhamnetin 18 Hình 2.3. Phổ hấp thụ của Acid ferulic 18 Hình 3.1. Phổ hấp thụ UV-Vis của mẫu cao lên men Lan kim tuyến 20 Hình 3.2. Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ Quercetin 23 Hình 3.3. Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ Isorhamnetin 24 Hình 3.4. Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ Acid ferulic 29 v
8. ĐẶT VẤN ĐỀ Theo thống kê của Viện Dược liệu, đến nay Việt Nam đã ghi nhận trên 5000 loài thực vật và nấm, 408 loài động vật và 75 loại khoáng vật có công dụng làm thuốc. Với hệ sinh thái phong phú, Việt Nam được đánh giá là quốc gia có tiềm năng lớn về việc nuôi dưỡng và phát triển các cây thuốc quý. Do đó xu hướng nghiên cứu và tìm kiếm các hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao từ các loài thực vật làm dược phẩm chữa bệnh đang ngày càng phát triển mạnh với những ưu điểm nổi bật của dược liệu là độc tính thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể. Họ Lan (Orchidaceae) là họ thực vật đa dạng nhất của Việt Nam, với tổng số 865 loài thuộc 154 chi. Thông thường Lan được sử dụng làm cảnh. Ngoài ra, có nhiều loài Lan còn được sử dụng làm thuốc. Chi Lan kim tuyến Anoectochilus ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài, trong đó có loài Lan kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume được biết đến nhiều không những bởi giá trị làm cảnh mà bởi giá trị làm thuốc của nó [1]. Do bị thu hái nhiều để bán làm thuốc từ rất lâu nên loài Lan kim tuyến đang bị đe doạ nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên nếu chúng ta không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Hiện nay, Lan kim tuyến được xếp trong nhóm IA của Nghị định 32/2006/NĐ-CP, nghiêm cấm khai thác vì mục đích thương mại và nhóm thực vật đang nguy cấp EN A1a,c,d trong sách đỏ Việt Nam năm 2007, phần thực vật [2,3]. Nhằm bảo tồn và phát triển nguồn tài nguyên quý này, nhiều đơn vị nghiên cứu trong cả nước đã tập trung vào việc nhân giống và nuôi trồng Lan kim tuyến. Khóa luận này được thực hiện nhằm mục đích tìm hiểu về thành phần hóa học của cây Lan kim tuyến. Từ đó, định hướng về ứng dụng của loại dược liệu này góp phần vào công cuộc bảo tồn và nâng cao hơn giá trị sử dụng. Khóa luận được thực hiện với đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học cây Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) thu hái tại Thanh Hóa” với mục tiêu: 1. Chiết xuất cao Lan kim tuyến. 2. Định tính một số hợp chất trong mẫu. 3. Xác định được hàm lượng của một số hợp chất trong mẫu cao bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 1
9. CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 1. Vài nét về chi Anoectochilus 1.1. Đặc điểm hình thái Chi Lan kim tuyến (Anoectochilus) là một chi thực vật có hoa thuộc họ Lan (Orchidaceae) và phân họ cùng tên (Orchidoideae). Cái tên "Lan kim tuyến" hay "Lan kim hoàn” bắt nguồn từ những đường gân rất đẹp trên phiến lá của các loài lan này. Phần lớn chúng là các thực vật sinh sống trên nền đất có kích thước nhỏ, tuy nhiên một vài loài sinh sống trên các bờ đá, với bộ lá màu xanh lục hoặc mang các màu sắc khác (tùy theo loài), có bề mặt mịn như nhung và mang một mạng lưới gân lá phức tạp. Cụm hoa ở ngọn trung tâm mang một vài hoa mọc chúc xuống đất và bao phủ bởi lông với một cánh môi rất lớn và nổi bật. Tràng hoa cùng với đài hoa ở mặt lưng tạo thành một cấu trúc giống như chiếc mũ trùm đầu. Mỗi hoa có hai nhụy và hai nhị [25]. 1.2. Phân bố Chi Anoectochilus (Orchidaceae), bao gồm hơn 40 loài, phổ biến khắp các vùng nhiệt đới, từ Ấn Độ, Himalayas, Đông Nam Á đến Hawaii. Trong số các loài thực vật này, A. formosanus và A. koshunensis chỉ phân bố ở Đài Loan (Trung Quốc) và Okinawa (Nhật Bản). Anoectochilus roxburghii, phân bố ở miền nam Trung Quốc, Nhật Bản, Sri Lanka, Ấn Độ và Nepal [17]. 1.3. Công dụng và tác dụng Một số loài thuộc chi này được sử dụng trong các loại thuốc dân gian Trung Quốc, chẳng hạn như A. formosanus Hayata, A. koshunensis Hayata, và A. roxburghii (Wall.) Lindl. Theo y học cổ truyền Đài Loan, A. formosanus Hayata tươi hoặc khô nấu nước uống trị các chứng bệnh đau ngực, đau bụng, tiểu đường, viêm thận, sốt, huyết áp cao, liệt dương, rối loạn gan, lá lách và chứng đau nhói ngực. Người Trung Quốc cho rằng uống trà làm từ A. formosanus Hayata chữa các chứng bệnh gan và phổi [23,30]. Đại học ông nghệ Y dược và ao đẳng Y học Quốc gia Dương Minh Đài Loan đã sử dụng A. formosanus Hayata làm thuốc kháng viêm, hạ sốt, giảm suy nhược cơ @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 2
10. thể và kháng virus c m A. Nhiều nghiên cứu đã phát hiện A. formosanus Hayata chứa hợp chất chuyển hoá arachidonic acid liên quan đến chức năng tim mạch. Dịch chiết A. formosanus Hayata có khả năng kháng virus, kháng sưng viêm và bảo vệ gan. Chiết xuất của cây A. formosanus khô có chứa 4-hydroxycinnamic acid, β-sitosterol, β-D-glucopyranosyloxy và butanoid glucosides acid [28]. Gần đây, một hợp chất 3(R)- 3- β-D-glucopyranosyloxy butanolide tên là thương mại kinsenoside được chiết xuất từ A. formosanus và A. koshunensis chống tăng huyết áp hiệu quả [29]. Anoectochilus roxburghii, còn được gọi là "Vua thảo dược" để điều trị sốt, bệnh về phổi, viêm màng phổi, bệnh về gan, tăng huyết áp và trẻ em suy dinh dưỡng ở Trung Quốc (Viện Y học cổ truyền Trung Quốc Phúc Kiến 1982). Tuy nhiên, thông tin khoa học về hoạt tính sinh học, chức năng sinh lý và hiệu quả lâm sàng cụ thể của cây lan thảo dược này còn hạn chế. Không có báo cáo nghiên cứu về các thành phần hóa học của A. roxburghii và có rất ít hồ sơ dược lý (Li et al. 1995) bởi vì các nguồn tự nhiên của A. roxburghii phần lớn đã cạn kiệt. 2. Tổng quan về cây Lan kim tuyến 2.1. Vị trí phân loại Lan Kim Tuyến có tên khoa học là Anoectochilus setaceus Blume Tên đồng nghĩa Chrysobaphus roxburghii Wall. 1826 Anoectochilus roxburghii (Wall.) Wall. ex Lindl. 1840 Anoectochilus regalis Blume. 1858 Bộ: Asparagales Họ: Phong lan Orchidaceae Phân họ: Orchidoidea Chi: kim tuyến (Anoectochilus) Loài: A. setaceus Tên gọi khác: kim cương, kim tuyến, kim tuyến tơ, lan gấm, mộc sơn, thạch tùng @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 3
11. 2.2. Đặc điểm hình thái Lan kim tuyến là cây thảo, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài, thân trên đất mọng nước và có nhiều lông mềm, mang 2 - 4 lá mọc xòe sát đất. Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, chóp hơi nhọn và có mũi ngắn, cỡ 3 - 4 x 2 - 3 cm, có màu khác nhau với mạng gân thường nhạt hơn (màu lục sẫm với mạng gân màu lục nhạt hay màu nâu, đỏ với mạng gân màu vàng, lục hay hồng). Cuống lá dài 2 - 3 cm. Cụm hoa dài 10 - 15 cm, mang 4 - 10 hoa mọc thưa. Lá bắc hình trứng, chóp nhọn, dài 8 - 10 mm, màu hồng. Hoa thường màu trắng, dài 2,5 - 3 cm. Các mảnh bao hoa dài khoảng 6 mm, môi dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc mang 6 - 8 dải hẹp, chóp phiến rộng, chẻ hai sâu, hốc chứa mật dài 7 mm, bầu dài 1,3 cm, màu lục, có nhiều lông mềm [2]. Hình 1.1. Cây Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) [19] @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 4
12. 2.3. Sinh học và sinh thái Mùa hoa của cây là tháng 2 đến tháng 4. Tái sinh bằng chồi từ thân rễ và hạt, ít và sinh trưởng rất chậm. Mọc dưới tán rừng nguyên sinh, hầu hết là nguyên thủy, rậm. Chúng sinh sống trên sườn n i đá granit, riôlit, phiến sét, ở độ cao 500 - 1600 m, rải rác thành từng nhóm, vài ba cây trên đất ẩm, rất giàu mùn và lá cây rụng [2]. 2.4. Phân bố và tình trạng Thế giới: Ấn Độ, Nepan, Butan, Trung Quốc, Mianma, Thái Lan, Lào, ampuchia, Malaixia, Inđônêxia. Trong nước Lào Cai: núi Phan Xi Păng, xã Liêm Phú. Kon Tum: núi Ngọc Linh, Vườn Quốc gia hư Mom Ray. Đắk Lắk: Vườn Quốc gia hư Yang Sin. Lâm Đồng: Vườn Quốc gia Bidoup - Núi Bà. Phú Thọ: Vườn Quốc gia Xuân Sơn. Sơn La: Khu Bảo tồn Thiên nhiên Tà Sùa. Hà Nội: Vườn Quốc gia Ba Vì. Thanh Hóa: Khu Bảo tồn Thiên nhiên Xuân Liên, Pù Luông. Tình trạng Loài có khu phân bố rộng nhưng với số lượng cá thể không nhiều, tái sinh chậm và đòi hỏi điều kiện sống ngặt nghèo ngày càng hiếm. Chúng đã bị khai thác liên tục trong nhiều năm, hiện đã trở nên giảm sút rõ rệt và có nguy cơ bị tuyệt chủng. Do đó, Lan kim tuyến đã được xếp trong nhóm IA của Nghị định 32/2006/NĐ-CP, nghiêm cấm khai thác vì mục đích thương mại và nhóm thực vật đang nguy cấp EN A1a,c,d trong sách đỏ Việt Nam năm 2007, phần thực vật [2,3]. 2.5. Thành phần hóa học Từ các phân đoạn ethyl acetate và phân đoạn n-butanol của dịch chiết ethanol của toàn bộ cây Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl. (Orchidaceae) đã phân lập được nhiều hợp chất. Trên cơ sở phương pháp quang phổ, cấu trúc của các hợp chất này đã được làm sáng tỏ là cirsilineol (1), quercetin (2), quercetin 7-O-β-D-glucopyranoside (3), quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside (4), isorhamnetin (5), isorhamnetin-7-O-β-D- glucopyranoside (6), isorhamnetin-3-O-β-D-glucopyranoside (7), kaempferol-3-O-β– @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 5
13. D-glucopyranoside (8), kaempferol-7-O-β-D-glucopyranoside (9), isorhamnetin-3-O- β-D-rutinoside (10) [10,12,16,17]. Ferulic acid (11) [16], p-coumaric acid (12) [10], sorghumol (13), friedelin (14) [18], sitosterol (15), stigmasterol (16), campesterol (17), daucosterol (18), succinic acid (19) và tinh dầu [14,16,18]. Năm 2008, He và cộng sự đã phân lập được hai loại sorghumol acyl este mới đó là Sorghumol 3-O-Z-p-coumarate và sorghumol 3-O-E-p-coumarate, một alkaloid mới là anoectochine (20) và một chất đã được biết đến từ trước sorghumol [15]. Cụ thể các hoạt chất được xác định có công thức cấu tạo hóa học như sau. Bảng 1.1: Cấu trúc hóa học các hợp chất đã phân lập được từ cây Lan kim tuyến OCH3 OH OH OH H3CO O HO O H3CO OH OH O OH O (1) cirsilineol (2) quercetin OH OH OH OH OH HO O O HO O OH O HO OH O O OH O OH O HO OH HO OH (3) quercetin 7-O-β-D-glucopyranoside (4) quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 6
14. OCH3 OH OH HO O O O HO OH OH O HO (5) isorhamnetin (6) isorhamnetin-7-O-β-D-glucopyranoside OCH3 OH OH HO O HO O O O OH O OH O OH O OH O OH OH OH OH OH OH (7) isorhamnetin-3-O-β-D-glucopyranoside (8) kaempferol-3-O-β–D-glucopyranoside OH OH HO O O O HO OH OH O HO (9) kaempferol-7-O-β-D-glucopyranoside @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 7
15. OCH3 OH HO O O OH O OH O OH O OH O O OH HO OH O OH OH (10) isorhamnetin-3-O- β-D-rutinoside (11) Ferulic acid O OH HO HO (12) p-coumaric acid (13) sorghumol O HO (14) friedelin (15) sitosterol @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 8
16. HO HO (16) stigmasterol (17) campesterol HO HO O HO O OH (18) daucosterol O OH O HO OH NH O N H (19) succinic acid (20) anoectochine @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 9
17. 2.6. Công dụng Các nghiên cứu gần đây cho thấy: Lan kim tuyến có thể chữa các bệnh như: trị lao phổi, ho do viêm phế quản, chấn thương, viêm dạ dày mãn tính, viêm gan mãn tính, suy nhược thần kinh, gi p tăng cường sức khỏe và làm khí huyết lưu thông, có tính kháng khuẩn, đau bụng, đau ngực, tiểu đường, viêm thận, sốt cao, liệt dương, rối loạn gan [8,17,22]. Những người dân tộc miền n i thường dùng Lan kim tuyến sắc uống, giúp chữa trị đau bụng, đau ruột, sốt cao hoặc đắp bên ngoài chỗ vết thương bị rắn cắn, các chỗ sưng. Lan kim tuyến là cây dược liệu dân gian quý, toàn thân cây thuốc có công dụng tăng cường sức khỏe, bổ máu, giải nhiệt, chủ trị bệnh phổi, di tinh, yếu gan, yếu tỳ, xuất tinh sớm. Cây Lan kim tuyến dùng cả cây tươi hoặc khô sắc uống. Liều dùng trong ngày khoảng 20 g tươi hoặc 5 g khô. Dùng ngoài: cả cây tươi giã nát đắp chỗ vết thương sưng đau [4,5]. 2.7. Tác dụng sinh học của một số hợp chất trong cây Lan kim tuyến Y học hiện đại đã phân tích và xác định được Anoectochilus chứa các thành phần hoạt chất có dược tính cực kì quan trọng bao gồm: flavonoid (quercetin, isorhamnetin), steroid (24 ~ isopropenyl cholesterol, sterol, ergosrol, stigmasterol, campesterol, sitosterol β-), trierpenoids (friedelin, acid succinic, acid coumaric, acid ferulic, daocosterol, acid palmitic, acid aleanolic, acid bearberry), đường (Polysaccharides 13,32%, Oligosacharides 11,24% và đường đơn 9,73%), alkaloid, glycoside tim mạch, este, taurine, acid amin, nguyên tố vi lượng và các loại khoáng chất khác [8,17,20,24]. 2.7.1. Quercetin Quercetin là một flavonoid có tác dụng làm tăng tuổi thọ và cải thiện sức khỏe tim mạch, làm giảm cholesterol xấu và làm tăng cholesterol tốt. Nó cũng làm giảm mảng bám trong động mạch và loại bỏ các cholesterol xấu. Quercetin gi p tránh bị đột quỵ và đau tim [22]. Quercetin cũng là hợp chất rất tốt đối với bệnh nhân tiểu đường, bệnh cao huyết áp. Không một lavonoid nào có thể t ố@t hơn School so với quercetin of Medicine trong khả năng and chống Pharmacy, VNU 10
18. viêm và chống oxy hóa, chống lão hóa, làm bền thành mạch tránh tai biến mạch máu [8,13]. Quercetin cũng có thể được sử dụng để ngăn ngừa các bệnh ung thư. ũng giống như tất cả các chất flavonoid khác, nó sẽ loại bỏ tất cả các gốc tự do trong cơ thể, trung hòa chúng giúp tránh được bệnh ung thư. Vì vậy, việc xác định (định tính và định lượng) được Quercetin trong cao Lan kim tuyến là rất quan trọng vì nó góp phần khẳng định vai trò chữa bệnh của cao Lan kim tuyến [32]. OH OH HO O OH OH O Hình 1.2. Công thức cấu tạo Quercetin, C15H10O7 2.7.2. Isorhamnetin Isorhamnetin thể hiện một sự ức chế mạnh mẽ đối với hoạt tính enzyme Lens Aldose Reductase ở chuột (RLAR) in vitro, IC50 được xác định là 1,4 mM và có tác dụng ức chế tích tụ sorbitol. Isorhamnetin ngăn ngừa rối loạn chức năng nội mạc, sản xuất superoxide và sự biểu hiện quá mức của p47phox (tiểu đơn vị tế bào học 47 kilodalton của phức hợp đa protein được tìm thấy trong bạch cầu trung tính) gây ra bởi angiotensin II. Isorhamnetin ngăn ngừa các tổn thương tế bào trong cơ thể và hoạt động chống oxi hóa. Do vậy, isorhamnetin dường như là một loại thuốc mạnh chống lại ung thư thực quản do khả năng không chỉ ức chế sự tăng sinh mà còn gây ra apoptosis của tế bào. Đây là hợp chất có tiềm năng lớn để bào chế một loại thuốc mới có tác dụng phòng ngừa và/hoặc điều trị bệnh tiểu đường và các biến chứng của bệnh tiểu đường [8], [9], [13], [22]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 11
19. Hình 1.3. Công thức cấu tạo Isorhamnetin, C16H12O7 2.7.3. Acid ferulic Acid ferulic, giống như nhiều hợp chất phenol tự nhiên khác, được sử dụng như là thuốc chống viêm, giảm đau, bức xạ tia cực tím, chống tắc nghẽn động mạch (antithrombotic), trung hòa các gốc tự do (anti- reeradical) và tăng cường sức đề kháng của cơ thể con người. Ở trong lâm sàng, nó được sử dụng để điều trị các bệnh như bệnh tim mạch vành, tai biến mạch máu não, viêm mạch máu, giảm bạch cầu và giảm tiểu cầu. Nó cũng được sử dụng trong thực phẩm, mỹ phẩm với tác dụng như một chất chống oxy hoá [22]. Xu và cộng sự (2015) đã chứng minh Acid ferulic có tác dụng phòng chống xơ gan. Đây là minh chứng về tác dụng bảo vệ gan của cây Lan kim tuyến. Do vậy, một trong các nội dung nghiên cứu của đề tài là xác định (định tính và định lượng) Acid ferulic trong cao chiết từ Lan kim tuyến [31]. O OH O OH Hình 1.4. Công thức cấu tạo Acid ferulic, C10H10O4 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 12
20. 2.7.4. Các bài thuốc và sản phẩm được biết đến Bài thuốc chữa thần kinh suy nhược, mất ngủ: 25 g lan gấm, 12 g hoa nhài, 10 g hoa thiên lý, 8 g tâm sen, 8 g ngưu tất, 15 g mạch môn, 10 g huyền sâm, 20 g quyết minh tử, 8 g cam thảo đất, 12 g hoài sơn, sắc uống. Mỗi ngày sắc 1 thang, chia làm 3 lần trong ngày, dùng 3 – 5 thang. Bài thuốc chữa kém ăn: 25 g lan gấm, 8 g liên nhục, 6 g sơn tra, 5 g trần bì, 20 g huyền sâm, 5 g quyết minh tử, 10 g hoài sơn, sắc uống. Mỗi ngày sắc 1 thang, chia làm 3 lần trong ngày, dùng 5 – 7 thang. Bài thuốc chữa ho khạc ra máu: 30 g lan gấm, 15 g ngưu tất, 15 g quyết minh tử, 20 g hoài sơn, 20 g huyền sâm, 25 g mạch môn, sắc uống. Mỗi ngày sắc 1 thang, chia làm 3 lần trong ngày, dùng 5 – 7 thang [6]. Hiện nay, các sản phẩm từ cây Lan kim tuyến đã bắt đầu được sản xuất dưới dạng thực phẩm bảo vệ sức khỏe và giới thiệu ra thị trường như “Langambian G” của Công ty cổ phần cây thuốc và hương liệu Việt gồm các thành phần thảo dược quý như Lan kim tuyến, Vạn Thọ, Linh Chi, Cucurmin có tác dụng giúp chống oxy hóa, bảo vệ tăng cường chức năng gan trong các trường hợp viêm gan virus, xơ gan, gan nhiễm mỡ, giải độc gan, hạn chế tổn thương gan do rượu bia hóa chất, hóa trị, xạ trị. Một sản phẩm khác từ Lan kim tuyến là “Lamgambian M” (cũng là sản phẩm của Công ty cổ phần cây thuốc và hương liệu Việt) dành cho người bị mỡ trong máu cao, người bị xơ vữa mạch máu, người có sức đề kháng kém, người hóa trị, xạ trị gồm các thành phần từ một số thảo dược quý như Lan kim tuyến, Allicin, Rutin. 2.8. Vấn đề cần giải quyết Ở nước ta, hiện chưa có một công trình nghiên cứu chính thức nào về công dụng làm thuốc của cây Lan kim tuyến mà chỉ biết nó theo dạng đồn thổi, thiếu tính kiểm chứng. Do đó, công dụng chữa “bách bệnh” của loại cây này cũng mới chỉ là dư luận, thiếu tính khoa học, cần được nghiên cứu rõ. Một trong những mục tiêu nghiên cứu của khóa luận này chính là định tính và định lượng một số hợp chất có tác dụng chữa bệnh có trong cao Lan kim tuyến. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 13
21. CHƯƠNG II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu, hóa chất Toàn bộ cây Lan kim tuyến được thu hái từ vùng núi thuộc huyện Nông Cống tỉnh Thanh Hóa. Mẫu được cho vào trong túi bảo quản có chứa hạt hút ẩm silicagel, tại phòng thí nghiệm được bảo quản ở -20o trước khi mang tách chiết. Dược liệu được phơi, sấy khô, cắt và tán nhỏ tới độ mịn khoảng 3-4 mm để tăng khả năng khuếch tán của dung môi. Nấm men là chủng lên men nổi Sacchromyces cerevisiae. Môi trường nuôi cấy men Sacchromyces cerevisiae: (NH4)2SO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, CaCl2.2H2O, NaCl, cao nấm men, glucoza, nước, đệm PBS. Dung môi công nghiệp dùng trong chiết xuất: methanol, ethanol, ACN. 2.2. Phương tiện nghiên cứu Thiết bị, máy móc, dụng cụ: que cấy, đèn cồn, đĩa petri, màng lọc, giấy lọc, giấy bao gói, bông không thấm nước, bông y tế. Các dụng cụ cần thiết dùng trong quá trình thực nghiệm: bình tam giác, ống đong, ống nghiệm, pipet, cốc thủy tinh, phễu thủy tinh các kích thước Thiết bị đo phổ hấp thụ NanoDrop-1000 (USA). Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu. Máy ly tâm. Tủ lạnh. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp chiết xuất cao Lan kim tuyến Công nghệ lên men là công nghệ mới được sử dụng trong nghiên cứu này để thu nhận cao có các hoạt chất quý, có tác dụng chữa bệnh từ cây Lan kim tuyến. Trong công nghệ lên men ứng dụng trong đề tài nghiên cứu này sẽ sử dụng chủng nấm Saccharomyces cerevisiae để thu nhận cao thay cho công nghệ tách chiết truyền thống @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 14
22. bằng nước hoặc bằng cồn nhằm tăng hiệu quả tách chiết và tăng tính đa dạng các chất có hoạt tính sinh học trong sản phẩm chiết xuất. Nấm men là các loài nấm đơn bào. Kích thước đường kính mỗi tế bào men chỉ vào khoảng 1/100 mm. Chúng phân bố rộng rãi trong thiên nhiên, đặc biệt chúng có nhiều ở vùng đất trồng nho và các nơi trồng hoa quả. Nhiều loài nấm men có khả năng lên men rượu bia. Từ lâu người ta đã biết sử dụng nấm men để sản xuất rượu bia. Nấm men sinh sôi nhanh, tế bào lại chứa nhiều vitamin, acid amin không thay thế, hàm lượng protein chiếm tới 50% trọng lượng khô của tế bào nên nhiều loại nấm men còn được sử dụng để sản xuất protein. Ngoài ra nấm men còn được sử dụng trong công nghệ sản xuất bánh mì. Tuy nhiên, cũng có nhiều loại nấm men có hại gây bệnh cho người và gia s c, làm hư hại lương thực, thực phẩm. Nấm men dùng trong sản xuất bia thường là các chủng thuộc giống Saccharomyces. Chúng có khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng trong môi trường nước mạch nha như các loại đường hoà tan, các hợp chất nitơ (các acid amin, peptit), vitamin và các nguyên tố vi lượng qua màng tế bào. Nấm men được sử dụng là chủng lên men nổi Sacchromyces cerevisiae. Đặc điềm hình thái: Sacchromyces cerevisiae sinh trưởng và phát triển ở nhiệt độ cao, lơ lửng trên bề mặt là chủ yếu, nhiệt độ lên men từ 10 – 25oC. Môi trường nuôi cấy men Sacchromyces cerevisiae Môi trường nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae cụ thể như sau: (NH4)2SO4: 5 g KH2PO4: 1 g MgSO4.7H2O: 0,5 g CaCl2.2H2O: 0,1 g NaCl: 0,1 g Cao nấm men: 1 g Glucoza: 30 g Nước: 1000 g Sau thời gian nuôi cấy ở 25-30oC trong ba tuần thì ly tâm 300 vòng/ph t để thu sinh khối tế bào. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 15
23. Sinh khối tế bào thu được rửa 2 lần với đệm PBS, pH=7,5 trước khi sử dụng. Quy trình chiết xuất cao Nguyên liệu Lan kim tuyến tươi Cắt, nghiền nhỏ nguyên liệu Bổ sung nước cất vào nguyên liệu theo tỉ lệ: 5 phần nước: 1 phần nguyên liệu Bổ sung nấm men, đường vào hỗn hợp Đậy kín nắp bình lên men, lắc đều và để ở nhiệt độ phòng 5-7 ngày. Thỉnh thoảng lắc nhẹ và xả bớt khí. Lọc lấy dịch lên men và đun đến lên 70 oC. Ly tâm 10 000 vòng/phút, thời gian 10 phút. Loại bỏ cặn ly tâm. Thu dịch ly tâm và cô thành cao. Chiết với methanol, định tính và định lượng bằng phương pháp đo phổ hấp thụ UV và phân tích HPLC. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 16
24. 2.3.2. Phương pháp định tính Sử dụng phổ hấp thụ UV (sử dụng thiết bị đo phổ hấp thụ là NanoDrop-1000 (USA)) để định tính các hoạt chất Quercetin, Acid ferulic và Isorhamnetin trong mẫu cao Lan kim tuyến. Quercetin có đỉnh hấp thụ cực đại ở 268 nm và 412 nm. Isorhamnetin có đỉnh hấp thụ cực đại ở 265 nm và 375 nm. Acid erulic có đỉnh hấp thụ cực đại ở 320 nm. Kết quả định tính các hợp chất trong Lan kim tuyến theo phương pháp phổ hấp thụ UV đã được công bố được trình bày tại các hình sau: [7,11,21,26,27]. Quercetin (Hình 2.1), Isorhamnetin (hình 2.2) và Acid ferulic (hình 2.3) Hình 2.1. Phổ hấp thụ của Quercetin @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 17
25. Hình 2.2. Phổ hấp thụ của Isorhamnetin Hình 2.3. Phổ hấp thụ của Acid Ferulic @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 18
26. 2.3.3. Phương pháp định lượng Định lượng các hợp chất Quercetin, Isorhamnetin và Axit ferulic trong cao Lan kim tuyến bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với thiết bị HPLC Shimadzu. ác pha động thường được sử dụng bao gồm sự kết hợp có thể trộn lẫn của nước với dung mỗi hữu cơ khác nhau (phổ biến nhất là acetonitrile và methanol). Một số kỹ thuật HPLC sử dụng dung môi không nước. Thành phần nước trong pha động có thể có axit (axit formic, photphoric hay trifluoroacetic) hoặc muối để hỗ trợ sự phân tách các thành phần mẫu. Thành phần pha động có thể được giữ cố định (rửa giải đẳng dòng) hoặc thay đổi (rửa giải gradient) trong quá trình phân tích sắc ký. Rửa giải đẳng dòng đặc biệt hiệu quả trong phân tách những thành phần mẫu không khác nhau nhiều về ái lực của chúng với pha động. Với rửa giải gradient thành phần của pha động được thay đổi từ thấp tới cao để tăng sức rủa giải. Sức rửa giải của pha động được phản ánh bằng thời gian lưu của mẫu, sức rửa giải cao thì thời gian lưu của mẫu ngắn. Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại cho píc trên sắc ký đồ. Thời gian lưu được đo trong những điều kiện đặc trưng và được xem là đặc điểm nhận biệt của chất đem phân tích. Quá trình sắc ký xảy ra do các cơ chế: hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc rây phân tử. Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 19
27. CHƯƠNG III. KẾT QUẢ 3.1. Kết quả định tính Quercetin, Isorhamnetin, Acid ferulic Phổ hấp thụ UV của mẫu cao Lan kim tuyến mà đề tài đã thực hiện được trình bày tại hình 3.1. Trong đó: Trục tung: absorbance: độ hấp thụ Trục hoành: wavelength: bước sóng Kết quả trên hình 3.1, cho thấy trong cao lên men Lan kim tuyến có các đỉnh hấp thụ cực đại đặc trưng cho Quercetin, Isorhamnetin và Axit Ferulic. Hình 3.1. Phổ hấp thụ UV-Vis của mẫu cao lên men Lan kim tuyến @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 20
28. 3.2. Định lượng Quercetin, Isorhamnetin, Acid ferulic 3.2.1. Định lượng Quercetin, Isorhamnetin trong dịch chiết bằng HPLC 3.2.1.1. Điều kiện sắc ký Thiết bị: HPLC Shimadzu Cột Rp18; 250 x 4,6 mm; 5µm. Seri cột: H16-248657 Bảo vệ cột: Rp18; 4 x 3 mm Nhiệt độ cột: 400C Detector: PDA, λ = 370 nm Tốc độ dòng: 1,5mL/phút Autosampler: 40C Thể tích tiêm: 50 µL Pha động: ACN : 0.5% phosphoric acid = 72:28 (%) 3.2.1.2. Kiểm tra độ thích hợp của hệ thống Tiến hành sắc ký 6 lần trên cùng một dung dịch chuẩn có nồng độ Quercetin 6 µg/mL + Isorhamnetin 1 µg/mL theo điều kiện trên. Kết quả được trình bày trong bảng 3.1: Bảng 3.1. Kết quả sắc ký dung dịch chuẩn Area RT Tailing factor Quercetin Isorhamnetin Quercetin Isorhamnetin Quercetin Isorhamnetin 1989319 159635 10.468 20.227 0.712 0.702 2996851 155802 10.442 20.183 0.723 0.717 3988101 158037 10.355 20.012 0.710 0.682 4989629 154855 10.370 20.049 0.705 0.693 5993409 155532 10.390 20.089 0.711 0.702 6982313 153933 10.430 20.184 0.707 0.687 TB 989937 156299 10.409 20.124 0.711 0.697 Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu chứng tỏ hệ thống có tính thích hợp cao @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 21
29. 3.2.1.3. Định lượng Quercetin, Isorhamnetin Cách pha đường chuẩn Quercetin: Pha dãy dung dịch chuẩn Quercetin có nồng độ 1,5 – 15 µg/mL. Tiến hành sắc ký, lấy đáp ứng píc tại mỗi nồng độ. Dựng phương trình hồi quy tuyến tính. Hoà tan chính xác 25 mg chất chuẩn Quercetin vào bình định mức 50mL, hòa tan và thêm vừa đủ thể tích bằng MeOH để thu được dung dịch có nồng độ Quercetin khoảng 500 µg/mL => thu được dd (1). Hút 1,2mL dd (1) hòa tan trong 20 mL MeOH (~ 30 µg/mL)(WS Quercetin) Cách pha đường chuẩn Isorhamnetin: Pha dãy dung dịch chuẩn Isorhamnetin có nồng độ 0,2 – 2 µg/mL. Tiến hành sắc ký, lấy đáp ứng píc tại mỗi nồng độ. Dựng phương trình hồi quy tuyến tính. Hoà tan chính xác 5 mg chất chuẩn Isorhamnetin vào bình định mức 10mL, hòa tan và thêm vừa đủ thể tích bằng MeOH để thu được dung dịch có nồng độ Isorhamnetin khoảng 1000 µg/mL => thu được dd (2) Hút 1mL dd (2) hòa tan trong bình 25mL MeOH (40 µg/mL) => thu được dd (3) Hút 1mL dd (3) hòa tan trong bình 10mL MeOH (4 µg/mL) (WS Isorhamnetin) Bảng 3.2. Số liệu pha đường chuẩn Mẫu S1 S2 S3 S4 S5 Nồng độ Quercetin (µg/mL) 1.5 3 6 12 15 Thể tích WS Quercetin (µL) 50 100 200 400 500 Nồng độ Isorhamnetin (µg/mL) 0.2 0.5 1.0 1.5 2.0 Thể tích WS Isorhamnetin (µL) 50 125 250 375 500 Thể tích MeOH (µL) 900 775 550 225 0 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 22
30. Bảng 3.3. Kết quả khảo sát mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc của Quercetin Mẫu S1 S2 S3 S4 S5 Nồng độ (µg/mL) 1.5 3 6 12 15 Area 225255 496074 978191 1971054 2483795 Phương trình hồi quy Y = 132610.6333X – 21443.7500 (R2 = 0.9999) 2500000 y = 132610.6333x - 21443.7500 R² = 0.9999 2000000 1500000 Area 1000000 500000 0 0.000 5.000 10.000 15.000 20.000 Nồng độ (µg/mL) Hình 3.2. Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ Quercetin @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 23
31. Bảng 3.4. Kết quả khảo sát mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc của Isorhamnetin Mẫu S1 S2 S3 S4 S5 Nồng độ (µg/mL) 0.2 0.5 1.0 1.5 2.0 Area 21944 78732 160507 279643 373492 Phương trình hồi quy Y = 109835.7880X – 7507.2195 (R2 = 0,9983) 400000 350000 y = 109835.7880x – 7507.2195 R2 = 0,9983 300000 250000 Area 200000 150000 100000 50000 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 Nồng độ (µg/mL) Hình 3.3. Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ Isorhamnetin @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 24
32. 3.2.1.4. Kết quả định lượng Quercetin, Isorhamnetin Lọc mẫu thử qua màng lọc 0,45 µm, tiêm sắc ký. Tiến hành trên 3 mẫu độc lập. Công thức tính kết quả Quercetin Nồng độ Quercetin trong dung dịch mẫu tiêm sắc ký (mẫu thử ban đầu) C1 (µg/mL) = St: Diện tích píc của Quercetin của dung dịch tiêm sắc ký C(g/mL) = % Quercetin trong dịch mẫu thử = Khối lượng Quercetin (g) có trong 100 mL dung dịch mẫu thử % Quercetin = C x 100 Bảng 3.5. Kết quả định lượng Quercetin Quercetin Mẫu Nồng độ mẫu tiêm SK Nồng độ ban đầu Area % Quercetin (µg/mL) (g/mL) T1 641976 5.003 0.00000500 0.000500 T2 699912 5.440 0.00000544 0.000544 T3 698433 5.428 0.00000543 0.000543 TB 680107 5.290 0.00000529 0.000529 CV(%) 4.9 4.7 4.7 4.7 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 25
33. Isorhamnetin Nồng độ Isorhamnetin trong dung dịch mẫu tiêm sắc ký (mẫu thử ban đầu) C1 (µg/mL) = St: Diện tích píc của Isorhamnetin của dung dịch tiêm sắc ký C(g/mL) = % Isorhamnetin trong dịch mẫu thử = Khối lượng Isorhamnetin (g) có trong 100 mL dung dịch mẫu thử % Isorhamnetin = C x 100 Bảng 3.6. Kết quả định lượng Isorhamnetin Isorhamnetin Mẫu Nồng độ mẫu tiêm Nồng độ ban đầu Area % Isorhamnetin SK (µg/mL) (g/mL) T1 130282 1.255 0.00000125 0.000125 T2 134040 1.289 0.00000129 0.000129 T3 134871 1.296 0.00000130 0.000130 TB 133064 1.280 0.00000128 0.000128 CV(%) 1.8 1.7 1.7 1.7 3.2.2. Định lượng Acid ferulic trong dịch chiết bằng HPLC 3.2.2.1. Điều kiện sắc ký Thiết bị: HPLC Shimadzu Cột Rp18; 250 x 4,6 mm; 5µm. Seri cột: H16-248657 Bảo vệ cột: Rp18; 4 x 3 mm Nhiệt độ cột: 400C @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 26
34. Detector: PDA, λ = 313 nm Tốc độ dòng: 1,5mL/phút Autosampler: 40C Thể tích tiêm: 20 µL Pha động: A N : Đệm CH3COONa 0,05M pH 4,0 = 12:88 (%) 3.2.2.2. Kiểm tra độ thích hợp của hệ thống Tiến hành sắc ký 6 lần trên cùng một dung dịch chuẩn có nồng độ Acid ferulic 3 µg/mL theo điều kiện trên. Kết quả được trình bày trong bảng 4.7 Bảng 3.7. Kết quả kiểm tra độ thích hợp của hệ thống STT RT Area Tailing factor 1 22.989 212878 1.023 2 23.025 212035 1.106 3 23.289 214355 1.071 4 23.289 217426 1.125 5 23.505 214443 1.086 6 23.561 216413 1.069 TB 23.276 214592 1.080 CV% 1.0 1.0 3.3 Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu chứng tỏ hệ thống có tính thích hợp cao. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 27
35. 3.2.2.3. Định lượng Acid ferulic Pha dãy dung dịch chuẩn Acid ferulic có nồng độ 1,0 – 5,0 µg/mL. Tiến hành sắc ký, lấy đáp ứng píc tại mỗi nồng độ. Dựng phương trình hồi quy tuyến tính. Cách pha đường chuẩn Acid ferulic Hoà tan chính xác 20 mg chất chuẩn Acid erulic vào bình định mức 20mL, hòa tan và thêm vừa đủ thể tích bằng MeOH để thu được dung dịch có nồng độ Acid ferulic khoảng 1000 µg/mL => thu được dd (1) Hút 1,0mL dd (1)/ hòa tan trong 10mL MeOH (~ 100 µg/mL) (WS1) Hút 1,0mL dd (WS1) vào bình 10mL, bổ sung MeOH vừa đủ (~ 10 µg/mL) (WS2) Pha dãy dung dịch chuẩn Acid ferulic có nồng độ 1,0 – 5,0 µg/mL. Tiến hành sắc ký, lấy đáp ứng píc tại mỗi nồng độ. Dựng phương trình hồi quy tuyến tính. Bảng 3.8: Kết quả khảo sát mối tương quan giữa nồng độ các dung dịch Mẫu S1 S2 S3 S4 S5 Nồng độ Acid ferulic 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 (µg/mL) Thể tích WS2 (µL) 100 200 300 400 500 Thể tích MeOH (µL) 900 800 700 600 500 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 28
36. Bảng 3.9: Kết quả khảo sát mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc của Acid ferulic Mẫu S1 S2 S3 S4 S5 Nồng độ (µg/mL) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 Area 67544 139350 210907 279505 366017 Phương trình hồi quy Y = 72272X – 5278 (R2 = 0.999) 400000 y = 72272x - 5278.8 R² = 0.9996 320000 240000 Area 160000 80000 0 0 1 2 3 4 5 6 Nồng độ (µg/mL) Hình 3.4. Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ Acid ferulic @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 29
37. 3.2.2.4. Kết quả định lượng Acid ferulic Lọc mẫu thử qua màng lọc 0.45 µm, tiêm sắc ký. Tiến hành trên 3 mẫu độc lập. Công thức tính kết quả Nồng độ Acid ferulic trong dung dịch mẫu tiêm sắc ký (mẫu thử ban đầu) C1 (µg/mL) = St: Diện tích píc của Acid ferulic của dung dịch tiêm sắc ký C (g/mL) = % Quercetin trong dịch mẫu thử = Khối lượng Acid ferulic (g) có trong 100 mL dung dịch mẫu thử % Acid ferulic = C x 100 Bảng 3.10: Kết quả xác định nồng độ Acid ferulic trong mẫu thử Acid ferulic Mẫu Nồng độ mẫu tiêm Nồng độ ban đầu Area % Acid ferulic SK (µg/mL) (g/mL) T1 180197 51.3 0.0010265 0.1027 T2 189895 54.0 0.0010802 0.1080 T3 177179 50.5 0.0010098 0.1010 TB 182424 51.9 0.0010389 0.1039 CV(%) 3.6 3.5 3.5 3.5 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 30
38. BÀN LUẬN Chiết xuất cao Lan kim tuyến Công nghệ mới được sử dụng trong nghiên cứu này để thu nhận cao có các hoạt chất quý, có tác dụng chữa bệnh từ cây Lan kim tuyến là công nghệ lên men. Trong công nghệ lên men ứng dụng trong đề tài nghiên cứu này đã sử dụng các chủng nấm để thu nhận các chất thay cho công nghệ tách chiết truyền thống bằng nước hoặc bằng cồn nhằm tăng hiệu quả tách chiết và tăng tính đa dạng các chất có hoạt tính sinh học trong sản phẩm chiết xuất. Theo công nghệ truyền thống việc chiết xuất các hoạt chất từ thảo dược được thực hiện bằng công nghệ chiết sử dụng nước hoặc sử dụng cồn. Khi sử dụng nước: dịch chiết thu được chứa chủ yếu các chất ưa nước (các chất hòa tan trong nước), còn khi sử dụng cồn lại chủ yếu thu được các chất ít hoặc không hòa tan trong nước. Vì vậy, việc sử dụng công nghệ lên men được xem là công nghệ có thể khắc phục được những hạn chế nêu trên. Công nghệ lên men hiện nay đang được nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước ứng dụng để tạo ra những sản phẩm có giá trị kinh tế và chữa bệnh đồng thời tiết kiệm được nguồn nguyên liệu do khả năng chiết xuất gần như tối đa các hợp chất quý trong nguyên liệu ban đầu. Để đạt hiệu quả trong tách chiết và tạo cao chứa các hợp chất có tác dụng chữa bệnh từ cây Lan kim tuyến, cần khảo sát để lựa chọn các điều kiện lên men tối ưu (như nhiệt độ, nồng độ chủng giống, cách xử lý nguyên liệu ban đầu trước khi lên men, thời gian lên men, thu nhận sản phẩm sau khi lên men, ) để thu nhận cao từ Lan kim tuyến đạt yêu cầu về chất lượng. Quy trình thu nhận cao ổn định có thể áp dụng vào sản xuất. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 31
39. Định tính và định lượng hợp chất có hoạt tính sinh học trong dịch lên men cây Lan kim tuyến Có thể sử dụng phổ hấp thụ UV-Vis để sơ bộ xác định các hợp chất quan trọng trong mẫu cao Lan kim tuyến. Phổ hấp thụ của mẫu cao Lan kim tuyến cho thấy các đỉnh hấp thụ rõ ràng, tập trung ở các bước sóng <500 nm, không nhiều các đỉnh hấp thụ. Điều này có nghĩa rằng sản phẩm cao Lan kim tuyến khá sạch, ít chứa các tạp chất. Có thể định lượng các hoạt chất Quercetin, Isorhamnetin và Acid ferulic trong cao Lan kim tuyến bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPL ). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 32
40. KẾT LUẬN 1. Đã chiết xuất được cao Lan kim tuyến bằng cách sử dụng chủng Sacchromyces cerevisiae và điều kiện lên men thích hợp trong điều kiện phòng thí nghiệm. 2. Sơ bộ xác định được trong cao Lan kim tuyến có chứa một số hợp chất cần quan tâm là Quercetin, Acid ferulic và Isorhamnetin bằng phương pháp đo phổ hấp thụ UV-Vis trên máy NanoDrop-1000. 3. Hàm lượng của 3 chất quan tâm trong dung dịch lên men đã được tinh sạch và định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPL ) cho kết quả cụ thể: Quercetin là 4,7%, Acid ferulic là 3,5% và Isorhamnetin là 1,7%. KIẾN NGHỊ Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên kết quả của khóa luận chưa thể nêu hết về thành phần cũng như ứng dụng của cây Lan kim tuyến. Nhằm tìm hiểu đầy đủ hơn về loại dược liệu này, em xin đưa ra một số đề xuất sau: Tiến hành thử nghiệm tác dụng dược lý của 3 hoạt chất Quercetin, Acid ferulic và Isorhamnetin trong cây Lan kim tuyến. Nghiên cứu phát triển các sản phẩm dược phẩm hoặc thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ cây Lan kim tuyến nói riêng và chi Anoectochilus nói chung. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 33
41. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Nguyễn Tiến Bân (2005) Danh lục các loài thực vật Việt Nam Tập III, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. 2. Bộ Khoa học và Công nghệ (2007) Sách đỏ Việt Nam (phần thực vật), NXB Khoa học tự nhiên & Công nghệ, Hà Nội, 409. 3. Chính Phủ Nước Cộng Hoà Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam (2006) Nghị định số 32/2006/NĐ-CP. 4. Phạm Hoàng Hộ (2000) Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, TP Hồ Chí Minh, 3: 474- 475. 5. Hội dược liệu Việt Nam (2013) Tạp chí cây thuốc quý toàn tập, NXB Hiệp hội dược liệu Việt Nam, tr.13-15. Website 6. Website Nhà thuốc Gia truyền Thọ Xuân Đường, Công dụng chữa bệnh của Lan kim tuyến, accessed, from, tuyen cong-dung-chua-benh-cua-lan-kim-tuyen/vi-VN-10365-67.aspx Tiếng Anh 7. Maria Buchweitz, Paul A Kroon, Gillian T Rich, Peter J Wilde (2016) "Quercetin solubilisation in bile salts: A comparison with sodium dodecyl sulphate". Food chemistry, 211, 356-364. 8.Phatcharaporn Budluang, Pornsiri Pitchakarn, Pisamai Ting, Piya Temviriyanukul, Ariyaphong Wongnoppawich, Arisa Imsumran (2017) "Anti inflammatory and anti insulin resistance activities of aqueous extract from Anoectochilus burmannicus". Food science & nutrition, 5 (3), 486-496. 9. CC Chan, CL Hou, CH Chung, WT Liu (1994) "Evaluation of an in vitro virus culture system for anti-virus study of the Chinese herb". J. Food Drug Anal, 2 (2), 123-132. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 34
42. 10. He Chun-nian, Chun-lan WANG, Shun-xing GUO, Jun-shan YANG, Pei-gen XIAO (2005) "Study on chemical constituents of Anoectochilus roxburghii [J]". Chinese Pharmaceutical Journal, 8. 11. Torben Daeneke, Tae-Hyuk Kwon, Andrew B Holmes, Noel W Duffy, Udo Bach, Leone Spiccia (2011) "High-efficiency dye-sensitized solar cells with ferrocene- based electrolytes". Nature chemistry, 3 (3), 211. 12. Jing Guan, Chunlan Wang, Shunxing Guo (1994) "Isolation and structural elucidation of flavonoids from Ancecotochilus roxburghii". Chinese Traditional and Herbal Drugs, (10). 13. Mari Hämäläinen, Riina Nieminen, Pia Vuorela, Marina Heinonen, Eeva Moilanen (2007) "Anti-inflammatory effects of flavonoids: genistein, kaempferol, quercetin, and daidzein inhibit STAT-1 and NF-κB activations, whereas lavone, isorhamnetin, naringenin, and pelargonidin inhibit only NF-κB activation along with their inhibitory effect on iNOS expression and NO production in activated macrophages". Mediators of inflammation, 2007. 14. M Han, X Yang, Y Jin (2006) "Chemical constituents of the essential oil from the whole plants of Anoectochilus roxburghii (Wall) Lindl". Natural Product Research and Development, 18 (1), 65. 15. Mei Hua Han, Xiu Wei Yang, Yan Ping Jin (2008) "Novel triterpenoid acyl esters and alkaloids from Anoectochilus roxburghii". Phytochemical analysis, 19 (5), 438-443. 16. Chun-Nian He, Chun-Lan Wang, Shun-Xing Guo, Jun-Shan Yang, Pei-Gen Xiao (2005) "Study on chemical constituents in herbs of Anoectochilus roxburghii II". Zhongguo Zhong yao za zhi= Zhongguo zhongyao zazhi= China journal of Chinese materia medica, 30 (10), 761-763. 17. Chun Nian He, Chun Lan Wang, Shun Xing Guo, Jun Shan Yang, Pei Gen Xiao (2006) "A novel flavonoid glucoside from Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl". Journal of Integrative Plant Biology, 48 (3), 359-363. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 35
43. 18. Chunnian He, Chunlan Wang, Shunxing Guo, Junshan Yang, Peigen Xiao (2005) "Study on chemical constituents of Anoectochilus roxburghii ". Natural Product Research and Development, 17 (3), 259-262. 19. W Botting Hemsley (1915) "Walter Hood Fitch, Botanical Artist, 1817-1892". Bulletin of Miscellaneous Information (Royal Botanic Gardens, Kew), 1915 (6), 277-284. 20. Shiu-Ying Hu (1971) "The Orchidaceae of China Pt. 3 in Quart". Journ. Taiwan Mus, 24, 41-67. 21. Nilgun Kahraman, Recep Karadag (2017) "Characterization of Sixteenth to Nineteenth Century Ottoman Silk Brocades by Scanning Electron Microscopy– Energy Dispersive X-Ray Spectroscopy and High-Performance Liquid Chromatography". Analytical Letters, 50 (10), 1553-1567. 22. Jer-Min Lin, Chun-Ching Lin, Hui-Fen Chiu, Jenq-Jer Yang, Shing-Ginn Lee (1993) "Evaluation of the anti-inflammatory and liver-protective effects of anoectochilus formosanus, ganoderma lucidum and gynostemma pentaphyllum in rats". The American journal of Chinese medicine, 21 (01), 59-69. 23. WC Lin (2007) "Study of health keeping effects of Anoectochilus formosana Hayata". Agriculture World, 288, 8-13. 24. Oi Tong Mak, Dinq Ding Huang, Rocky Chau Sing Law (1990) "Anoectochilus formosanus Hay. contains substances that affect arachidonic acid metabolism". Phytotherapy Research, 4 (2), 45-48. 25. Paul Ormerod (2005) "Notulae Goodyerinae (II)". Taiwania, 50 (1), 1-10. 26. George X Pan, Cameron I Thomson, Gordon J Leary (2002) "UV–vis. spectroscopic characteristics of ferulic acid and related compounds". Journal of wood chemistry and technology, 22 (2-3), 137-146. 27. V Patil, S Angadi, S Devdhe (2015) "Determination of quercetin by uv spectroscopy as quality control parameter in herbal plant: Cocculus hirsutus". J Chem Pharm Res, 7 (1), 99-104. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 36
44. 28. S Takatsuki, JD Wang, T Narui, T Okuyama (1992) "Studies on the components o crude drug “Kim-soan-lian”". J. Jap. Botany, 67, 121-123. 29. T Takeshita, H Tago, M Nakamura, S Muraoka, T Yoshizawa (1993) "Blood sugar regulator and lipid metabolism-improving agent". Japanese Patent Appl, (05246311). 30. KB Wu (2007) "The use and potential for Anoectochilus formosanus Hayata". Agriculture World, 288, 14-19. 31. Tianjiao Xu, Zhi Pan, Miaoxian Dong, Chunlei Yu, Yingcai Niu (2015) "Ferulic acid suppresses activation of hepatic stellate cells through ERK1/2 and Smad signaling pathways in vitro". Biochemical pharmacology, 93 (1), 49-58. 32. Fu-sheng Zhang, Ya-li Lv, Yue Zhao, Shun-xing Guo (2013) "Promoting role of an endophyte on the growth and contents of kinsenosides and flavonoids of Anoectochilus formosanus Hayata, a rare and threatened medicinal Orchidaceae plant". Journal of Zhejiang University SCIENCE B, 14 (9), 785-792. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 37
45. PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ CỦA QUERCETIN, ISORHAMNETIN, ACID FERULIC @ School of Medicine and Pharmacy, VNU