›

Khóa luận Đánh giá hoạt tính chống đông máu và chống ngưng tập tiểu cầu in vitro của một số hợp chất phân lập từ cây Ngải hoa (C. generalis Bail.)

pdf 53 trang thiennha21 18/04/2022 3020
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Đánh giá hoạt tính chống đông máu và chống ngưng tập tiểu cầu in vitro của một số hợp chất phân lập từ cây Ngải hoa (C. generalis Bail.)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_danh_gia_hoat_tinh_chong_dong_mau_va_chong_ngung_t.pdf

Nội dung text: Khóa luận Đánh giá hoạt tính chống đông máu và chống ngưng tập tiểu cầu in vitro của một số hợp chất phân lập từ cây Ngải hoa (C. generalis Bail.)

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN THỊ THANH HOA ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỐNG ĐÔNG MÁU VÀ CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU IN VITRO CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY NGẢI HOA (Canna generalis Bail.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2021
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN THỊ THANH HOA ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỐNG ĐÔNG MÁU VÀ CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU IN VITRO CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY NGẢI HOA (Canna generalis Bail.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2016.Y Người hướng dẫn: 1. TS. Nguyễn Thị Vân Anh 2. ThS. Nguyễn Xuân Tùng Hà Nội – 2021
  3. LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm các thầy cô giáo đang công tác tại trường Đại học Y Dược - Đại học Quốc Gia Hà Nội đã dìu dắt, giúp đỡ em hoàn thành chương trình học tập trong suốt 5 năm qua, cũng như đã tạo điều kiện cho em được thực hiện khóa luận tốt nghiệp này. Em xin bày tỏ sự tri ân và lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Thị Vân Anh - Trường Đại học Khoa học và Công nghệ Hà Nội (USTH) và ThS. Nguyễn Xuân Tùng – Trường Đại học Y Dược - Đại học Quốc Gia Hà Nội. Thầy cô luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, kiên nhẫn chỉ dạy cũng như động viên em thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Em xin cảm ơn Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia Việt Nam (NAFOSTED) đã tài trợ cho dự án: “Nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số loài thuộc chi Canna, định hướng phát triển cây thuốc chủ lực chữa bệnh tim mạch”, mã số: 106.02-2018.334 để em có thể hoàn thành nghiên cứu này. Em cũng xin cảm ơn Khoa xét nghiệm Huyết Học - Bệnh viện Bạch Mai và Khoa Đông máu - Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương đã tạo điều kiện cho em thực hiện các thí nghiệm. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến bố mẹ vì sự động viên, hỗ trợ và quan tâm không ngừng. Đồng thời là lời cảm ơn đến những người bạn, và những người đã hỗ trợ em trong thời gian hoàn thành đề tài này. Trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận, dù đã rất cố gắng nhưng khó có thể tránh khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cô để khóa luận được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 5 năm 2021 Sinh viên Nguyễn Thị Thanh Hoa
  4. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Giải nghĩa ADP Adenosin diphosphat AMP Adenosin monophosphate Thời gian thromboplastin từng phần hoạt hóa APTT (Activated Partial Thromboplastin Time) AT III Antithrombin III AUC Diện tích dưới đường cong CGE2 3-methoxybenzaldehyde CGE3 2-methoxynaphthalene CGE4 4-Ketopinoresinol CHD Bệnh tim mạch vành COX-1 Cyclooxygenase-1 CVDs Các bệnh tim mạch DVT Huyết khối tĩnh mạch sâu EtOAc Ethyl acetate GP Glycoprotein Liều ức chế 50 % đối tượng thử IC50 (Inhibitory concentration 50%) IHD Bệnh tim thiếu máu cục bộ IR Quang phổ hồng ngoại LMWH Heparin trọng lượng phân tử thấp MeOH Methanol MI Nhồi máu cơ tim MS Khối phổ NMR Cộng hưởng từ hạt nhân n-BuOH n-Butanol PCI Can thiệp mạch vành qua da PE Thuyên tắc phổi PPP Huyết tương nghèo tiểu cầu PRP Huyết tương giàu tiểu cầu PT Thời gian Prothrombin (Prothrombin Time) S (Slope) Độ dốc của đường cong ngưng tập tiểu cầu TT Thời gian thrombin (Thrombine Time) TXA2 Thromboxane A2 VTE Huyết khối tĩnh mạch %I Phần trăm ức chế
  5. DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang Mười yếu tố nguy cơ gây tử vong liên quan đến Hình 1.1 5 CVDs (phần nghìn). Minh họa tác dụng của các thuốc chống ngưng Hình 1.2 7 tập tiểu cầu. Hình 1.3 Tác dụng của dẫn xuất coumarin. 9 Hình ảnh cây Canna indica (a) và quả (b), hạt Hình 1.4 12 giống (c), thân rễ (d) của cây Canna indica. Công thức hóa học của Betulinic acid (a), Hình 1.5 13 Oleonolic acid (b), và Traraxer-14-en-3-one (c). Hình 1.6 Một số hợp chất phenolic từ Canna edulis Ker. 14 Hình 1.7 Các dẫn xuất phenylpropanoid từ Canna edulis 15 Hình 1.8 Cây Ngải hoa 16 Hình 1.9 Hoa cây Ngải hoa 16 Các công thức hóa học thuộc nhóm Hình 1.10 phytoconstituent đã được xác định có trong 17 CGE. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn dịch chiết cây Hình 2.1 20 Ngải hoa. Công thức hóa học của CGE2 (A), CGE3 (B), Hình 2.2 20 CGE4 (C). Hình 2.3 Máy ACL-TOP 500. 22 Hình 2.4 Máy CHRONO-LOG 530 VS. 22 Mẫu máu sau khi ly tâm 500 vòng/phút trong 10 Hình 2.5 23 phút. Mẫu PRP (bên trái) và PPP (bên phải) thu được Hình 2.6 23 sau khi ly tâm. Phần trăm ức chế ngưng tập tiểu cầu của hợp Hình 3.1 chất sạch từ cây Ngải hoa khi sử dụng chất kích 26 tập collagen. Phần trăm ức chế ngưng tập tiểu cầu của hợp Hình 3.2 chất sạch từ cây Ngải hoa khi sử dụng chất kích 29 tập ADP.
  6. DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Diện tích dưới đường cong (AUC) của thí Bảng 3.1 nghiệm ngưng tập tiểu cầu với chất kích tập 27 collagen của các hợp chất từ cây Ngải hoa. Độ dốc (S) của thí nghiệm ngưng tập tiểu cầu với Bảng 3.2 chất kích tập collagen của các hợp chất từ cây 28 Ngải hoa. Diện tích dưới đường cong (AUC) của thí Bảng 3.3 nghiệm ngưng tập tiểu cầu với chất kích tập ADP 30 của các hợp chất từ cây Ngải hoa. Độ dốc (S) của thí nghiệm ngưng tập tiểu cầu với Bảng 3.4 chất kích tập ADP của các hợp chất từ cây Ngải 31 hoa. Bảng 3.5 Ảnh hưởng của các hợp chất từ cây Ngải hoa lên 32 các thông số PT, APTT và TT.
  7. MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về bệnh tim mạch 3 1.1.1. Giới thiệu chung về bệnh tim mạch 3 1.1.2. Các yếu tố gây ra bệnh tim mạch 4 1.2. Thuốc chống ngưng tập tiểu cầu và thuốc chống đông máu trong điều trị bệnh tim mạch 5 1.2.1. Vai trò của thuốc chống ngưng tập tiểu cầu và thuốc chống đông máu trong điều trị các bệnh tim mạch 5 1.2.2. Các thuốc chống ngưng tập tiểu cầu và các thuốc chống đông máu 6 1.3. Hạn chế của một số thuốc chống ngưng tập tiểu cầu và thuốc chống đông máu 9 1.3.1. Hạn chế của thuốc chống ngưng tập tiểu cầu 10 1.3.2. Hạn chế của thuốc chống đông máu 11 1.4. Tổng quan về chi Canna và cây Ngải hoa 11 1.4.1. Giới thiệu chung về chi Canna 11 1.4.2. Vài nét sơ lược về cây Ngải hoa 15 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. Nguyên liệu, đối tượng nghiên cứu 19 2.2. Phương pháp nghiên cứu 23 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ 26
  8. 3.1. Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của các hợp chất từ cây Ngải hoa 26 3.1.1. Ảnh hưởng của các hợp chất khác nhau từ cây Ngải hoa đối với sự ngưng tập tiểu cầu khi sử dụng chất kích tập collagen 26 3.1.2. Ảnh hưởng của các hợp chất khác nhau từ cây Ngải hoa đối với sự ngưng tập tiểu cầu khi sử dụng chất kích tập ADP 29 3.2. Tác dụng chống đông máu của các hợp chất từ cây Ngải hoa 32 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 34 4.1. Mô hình nghiên cứu 34 4.2. Kết quả nghiên cứu 36 4.3. Hạn chế nghiên cứu 36 KẾT LUẬN 38 ĐỀ XUẤT 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO
  9. ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, bệnh tim mạch là một trong những nguyên nhân gây tử vong cao nhất trên thế giới [54,55]. Những nghiên cứu gần đây cho thấy để phòng ngừa và điều trị bệnh huyết khối tắc mạch, thuốc chống ngưng tập tiểu cầu và thuốc chống đông máu được coi là liệu pháp lý tưởng. Một số thuốc kháng tiểu cầu hiện có như: aspirin, clopidogrel, prasugrel, và dipyridamol được sử dụng rộng rãi trong dự phòng và điều trị huyết khối, bên cạnh những lợi ích, thuốc chống ngưng tập tiểu cầu và thuốc chống đông máu còn một số tác dụng phụ như: gây chảy máu, loét dạ dày, giảm tiểu cầu. Vì vậy, việc nghiên cứu thuốc chống ngưng tập tiểu cầu và thuốc chống đông máu mới có tác dụng tốt hơn và ít tác dụng phụ hơn được chú trọng. Bên cạnh các thuốc tổng hợp, các thuốc có nguồn gốc từ thảo dược cũng là đối tượng được quan tâm nghiên cứu. Canna là chi duy nhất trong họ Cannaceae với mười chín loài thực vật có hoa, nhưng các nghiên cứu về thành phần hóa học và dược tính của chúng vẫn còn hạn chế và chỉ tập trung vào C. edulis và C. indica. Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng hàm lượng phenol và flavonoid của C. edulis có tác dụng chống ung thư, chống oxy hóa và chống viêm [37,48]; trong khi các nghiên cứu dược lý chỉ ra rằng C. indica có tiềm năng kháng khuẩn, kháng vi rút, tẩy giun sán, diệt nhuyễn thể, chống viêm, chống oxy hóa, độc tế bào, cầm máu, bảo vệ gan, chống tiêu chảy, giảm đau, giảm co thắt và các tác dụng khác [12,32]. Hiện nay, theo danh mục thực vật Việt Nam có 5 loài: C. edulis Ker-Gawl, C. generalis Bail., C. glauca L., C. indica L, C. sylvestris Rosc. Một số loài Canna đã được dân gian sử dụng để chữa bệnh viêm loét dạ dày, đau nhức xương, tức ngực và đặc biệt rất hiệu quả trong việc điều trị các bệnh tim mạch [5,6,10]. Theo định hướng nghiên cứu đó, nhiều đề tài nghiên cứu về tác dụng chống đông máu và ức chế ngưng tập tiểu cầu của một số loài Canna đã được công bố. Năm 2018, TS. Nguyễn Thị Vân Anh và cộng sự nhận định rằng dịch chiết ethyl acetat từ phần trên của C. warzewiczii có tác dụng ức chế đông máu tốt hơn so với dịch chiết từ thân rễ. Những chất chiết xuất này có thể là các chất chống đông máu và chống huyết khối tiềm năng và có thể được sử dụng để điều trị và phòng ngừa các rối loạn huyết khối [38]. Năm 2019, ThS. Trần Quốc Hùng một lần nữa khẳng định thêm kết quả của TS. Nguyễn Thị Vân Anh và 1
  10. cộng sự. Ngoài ra, còn phát hiện thêm rằng các phân đoạn etyl axetat của C. waszewiczii cho thấy các hoạt tính chống oxy hóa rất tốt [50]. Hướng đến việc ứng dụng các hợp chất thiên nhiên có nguồn gốc từ cây Ngải hoa (C. generalis Bail.) trong phòng và điều trị các bệnh tim mạch và huyết khối, chúng tôi tiến hành đề tài: “Đánh giá hoạt tính chống đông máu và chống ngưng tập tiểu cầu in vitro của một số hợp chất phân lập từ cây Ngải hoa (C. generalis Bail.)” với các mục tiêu cụ thể như sau: 1. Đánh giá tác dụng chống đông máu của các hợp chất phân lập từ cây Ngải hoa trên in vitro. 2. Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của các hợp chất phân lập từ cây Ngải hoa trên in vitro. 2
  11. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về bệnh tim mạch 1.1.1. Giới thiệu chung về bệnh tim mạch Các bệnh tim mạch (CVDs) là nguyên nhân gây ra hơn 17,3 triệu ca tử vong mỗi năm và chiếm 31% tổng số ca tử vong trên toàn cầu. Theo thống kê, CVDs là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới, và hơn 3/4 số ca tử vong do CVDs xảy ra ở các nước có thu nhập thấp và trung bình [54,55]. Định nghĩa: CVDs là một nhóm các rối loạn của tim và mạch máu [55], bao gồm: Bệnh mạch vành - bệnh của các mạch máu cung cấp máu cho cơ tim; Bệnh mạch máu não - bệnh của các mạch máu cung cấp máu cho não; Bệnh động mạch ngoại biên - bệnh của các mạch máu cung cấp máu cho cánh tay và chân; Bệnh thấp tim - tổn thương cơ tim và van tim do sốt thấp khớp, do vi khuẩn liên cầu gây ra; Bệnh tim bẩm sinh - dị tật cấu trúc tim tồn tại khi sinh; Huyết khối tĩnh mạch sâu và thuyên tắc phổi - cục máu đông trong tĩnh mạch chân, có thể bong ra và di chuyển đến tim và phổi. Bệnh mạch vành (CHD) là tên của một nhóm bệnh lý liên quan đến mạch vành – mạch máu duy nhất đến nuôi dưỡng cho cơ tim. Bệnh mạch vành thường bao gồm dạng bệnh lý như: bệnh tim thiếu máu cục bộ (IHD) và nhồi máu cơ tim cấp tính thuộc về thực thể [44]. Các bệnh mạch máu não được chia thành các bệnh thiếu máu cục bộ và các bệnh xuất huyết. Tai biến mạch máu não là một thuật ngữ không chuyên ngành được sử dụng rộng rãi để chỉ một nhóm bệnh mạch máu não khởi phát đột ngột gây tổn thương thần kinh. Khoảng 85% các ca đột quỵ là do lưu lượng máu đến não không đủ, tức là đột quỵ do thiếu máu cục bộ. Đột quỵ do xuất huyết được chia thành xuất huyết vào mô não và xuất huyết vào khoang dưới nhện [44]. 3
  12. Bệnh động mạch ngoại biên là bệnh lý tắc nghẽn mạch máu ngoại biên, do các mảng xơ vữa và huyết khối. Các động mạch đó không bao gồm mạch máu nuôi tim và não. Bệnh lý đại diện chính cho bệnh động mạch ngoại biên là tăng huyết áp [44]. Bệnh xơ vữa động mạch là quá trình bệnh tiềm ẩn trong mạch máu dẫn đến bệnh mạch vành (đau tim) và bệnh mạch máu não (đột quỵ). Xơ vữa động mạch là một quá trình bệnh lý phức tạp ở thành mạch máu phát triển trong nhiều năm. Trong bệnh xơ vữa động mạch, chất béo và cholesterol được lắng đọng bên trong lòng mạch của các mạch máu có kích thước vừa và lớn. Những chất lắng đọng (mảng) này làm cho bề mặt bên trong của mạch máu trở nên bất thường và lòng mạch trở nên hẹp, khiến máu khó lưu thông hơn. Do đó, các mạch máu cũng trở nên kém dẻo dai hơn. Cuối cùng, mảng bám có thể bị vỡ, gây ra sự hình thành cục máu đông. Nếu cục máu đông phát triển trong động mạch vành, nó có thể gây ra cơn đau tim; nếu nó phát triển trong não, nó có thể gây ra đột quỵ [55]. 1.1.2. Các yếu tố gây ra bệnh tim mạch Các yếu tố nguy cơ gây ra bệnh tim mạch bao gồm [55]: - Các yếu tố rủi ro về hành vi (sử dụng thuốc lá, không hoạt động thể chất, chế độ ăn uống không lành mạnh giàu muối, chất béo và calo, sử dụng rượu bia có hại), - Các yếu tố nguy cơ chuyển hóa (tăng huyết áp, tăng lượng đường trong máu, tăng lipid máu, thừa cân béo phì), - Các yếu tố rủi ro khác (nghèo đói và tình trạng giáo dục thấp, tuổi cao, giới tính, di truyền, các yếu tố tâm lý). Các nghiên cứu dịch tễ học đã chứng minh mối liên quan rõ rệt giữa các yếu tố nguy cơ và sự phát triển của CVDs. Các yếu tố này bao gồm tăng cholesterol trong máu, tăng huyết áp, tiểu đường, béo phì, các yếu tố viêm nhiễm, chế độ ăn uống gây xơ vữa và stress oxy hóa liên quan đến các yếu tố như quá nhiều gốc tự do trong máu. Ngoài ra, lười vận động, chế độ ăn uống không lành mạnh, hút thuốc lá và sử dụng nhiều bia rượu là những yếu tố nguy cơ chính về hành vi gây ra CVDs [55]. 4
  13. Hình 1.1. Mười yếu tố nguy cơ gây tử vong liên quan đến CVDs (phần nghìn) [55]. 1.2. Thuốc chống ngưng tập tiểu cầu và thuốc chống đông máu trong điều trị bệnh tim mạch 1.2.1. Vai trò của thuốc chống ngưng tập tiểu cầu và thuốc chống đông máu trong điều trị các bệnh tim mạch Huyết khối động mạch và tĩnh mạch là nguyên nhân chính gây ra bệnh tật và tử vong. Huyết khối động mạch là nguyên nhân cơ bản của hầu hết các biến cố tim mạch, bao gồm nhồi máu cơ tim, đột quỵ và thiếu máu cục bộ động mạch ngoại biên; trong khi huyết khối tĩnh mạch là bệnh lý mạch máu thường gặp nhất sau nhồi máu cơ tim cấp tính và đột quỵ. Huyết khối tĩnh mạch (VTE) được biểu hiện bằng hai biến cố lâm sàng chính: huyết khối tĩnh mạch sâu (DVT), có thể phức tạp do hội chứng sau huyết khối; và thuyên tắc phổi (PE), có thể gây tử vong hoặc có thể dẫn đến tăng huyết áp động mạch phổi mạn tính huyết khối tắc mạch [42,53]. Để phòng ngừa và điều trị bệnh huyết khối tắc mạch, thuốc chống ngưng tập tiểu cầu và thuốc chống đông máu được coi là liệu pháp lý tưởng [53]. Huyết khối động mạch được hình thành do sự kết dính và ngưng tập của tiểu cầu bằng một lượng nhỏ fibrin trong điều kiện dòng máu chảy cao khi tế bào nội mạc mạch máu bị tổn thương. Với sự có mặt rộng rãi của tiểu cầu, thuốc chống ngưng tập tiểu cầu được coi là giải pháp hữu hiệu để ức chế sự hình thành huyết khối động mạch. Trong khi đó, thuốc chống đông máu là phương pháp chính để phòng ngừa các biến cố tim mạch ở bệnh nhân rung nhĩ hoặc 5
  14. bệnh nhân có các bệnh liên quan đến van tim cơ học. Thuốc tiêu sợi huyết được sử dụng để phục hồi nhanh dòng máu ngược dòng ở bệnh nhân nhồi máu cơ tim không trải qua can thiệp mạch vành qua da nguyên phát (PCI) và điều trị đột quỵ do thiếu máu cục bộ cấp tính [53]. Huyết khối tĩnh mạch hình thành dưới sự kết dính và ngưng tập của tiểu cầu bằng một lượng nhỏ fibrin cùng với các tế bào hồng cầu bị mắc kẹt trong điều kiện dòng máu chảy thấp khi tế bào nội mạc mạch máu bị tổn thương. Khác với huyết khối động mạch, huyết khối tĩnh mạch chứa tương đối ít tiểu cầu. Thuốc chống đông máu là giải pháp chính để phòng ngừa và điều trị VTE do sự xuất hiện của số lượng lớn fibrin trong huyết khối tĩnh mạch. Để điều trị và kiểm soát các bệnh nhân bị thuyên tắc phổi thể trung bình, có thể sử dụng liệu pháp tiêu sợi huyết toàn thân hoặc dùng ống thông. Hơn nữa, liệu pháp tiêu sợi huyết thực hiện qua ống thông cũng được áp dụng cho những bệnh nhân bị DVT lồng ngực mở rộng [53]. 1.2.2. Các thuốc chống ngưng tập tiểu cầu và các thuốc chống đông máu Các thuốc chống ngưng tập tiểu cầu Thuốc kháng tiểu cầu là thuốc ức chế các quá trình kết dính, hoạt hóa, ngưng tập và liên kết với viêm của tiểu cầu [8]. Điều trị chống ngưng tập tiểu cầu có thể tấn công lên các mục tiêu trên con đường của quá trình ngưng tập tiểu cầu và đó là các đích tác dụng của các thuốc kháng tiểu cầu như: Cyclooxygenase (COX): COX-1 tiểu cầu; thụ thể ADP; glycoprotein kết dính tiểu cầu như: GP Ib, GP Ia/IIa, GP VI, ; thrombin; sản phẩm AMP vòng; thụ thể Gp IIb/IIIa trên bề mặt tiểu cầu, [11]. Hiện nay, một số thuốc chống ngưng tập tiểu cầu chính được sử dụng rộng rãi trong lâm sàng gồm: aspirin, dipyridamol, ticlopidin, các tác nhân ức chế receptor GP IIb/IIIa tiểu cầu, [2].  Aspirin Cơ chế tác dụng: Aspirin ức chế không hồi phục quá trình chuyển acid arachidonic thành prostaglandin và thromboxan A2 (một trong những tác nhân gây ngưng tập tiểu cầu mạnh mẽ nhất bởi ức chế men cyclooxygenase) [2]. 6
  15. Hình 1.2. Minh họa tác dụng của các thuốc chống ngưng tập tiểu cầu [2]. Xuất phát từ tác dụng chính của aspirin là ức chế ngưng tập tiểu cầu, thuốc có hiệu quả cao trong ngăn ngừa và điều trị những tình trạng tăng đông gây tắc mạch mà ở đó sự hoạt hóa tiểu cầu đóng vai trò quan trọng hơn cả: bệnh lý động mạch vành tim (nhồi máu cơ tim, đau thắt ngực không ổn định ) [2].  Ticlopidin Cơ chế tác dụng: Ticlopidin tương tác với glycoprotein IIb/IIIa receptor của fibrinogen làm ức chế sự gắn fibrinogen vào tiểu cầu hoạt hóa, ngăn cản sự kết dính tiểu cầu. Ngoài ra, thuốc còn làm tăng prostaglandin D2 và E2 góp phần chống đông vón tiểu cầu và tăng thời gian chảy máu [7].  Dipyridamol Cơ chế tác dụng: Dipyridamol làm tăng nồng độ AMP vòng của tiểu cầu dẫn đến ức chế thromboxan A2, đồng thời gián tiếp tăng nồng độ adenosin. Thuốc có tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu nhưng không kéo dài thời gian chảy máu [8].  Clopidogrel Cơ chế tác dụng: Clopidogrel ức chế chọn lọc thụ thể ADP của tiểu cầu, ngăn cản sự hoạt hóa glycoprotein IIb/IIIa của fibrinogen trên tiểu cầu, làm giảm gắn fibrinogen vào tiểu cầu [7]. 7
  16.  Các chất ức chế glycoprotein IIb/IIIa receptor: Bao gồm một số thuốc như Abcimab, Eptifibatid, Tirofiban, [7] Các thuốc chống đông máu  Thuốc chống đông heparin Cơ chế tác dụng: Heparin gắn với AT III làm tăng tác dụng ức chế đông máu của AT III lên rất nhiều lần [2]. Một số dạng thường được sử dụng trong lâm sàng của heparin gồm heparin chuẩn và heparin trọng lượng phân tử thấp. Heparin thường được chỉ định trong các tình trạng bệnh lý tăng đông máu gây tắc tĩnh mạch vì trong những trường hợp này, sự tăng cường hoạt hóa các yếu tố đông máu đóng vai trò chính trong tăng đông, ngoài ra heparin cũng được chỉ định trong những tình trạng tắc mạch cấp tính khác như nhồi máu cơ tim, tắc mạch phổi [2]. Thường thì việc điều trị heparin cho hiệu quả tốt nhất và an toàn nhất khi mà liều heparin làm cho APTT kéo dài gấp khoảng 1,5 đến 2 lần so với trước khi điều trị [2].  Thuốc chống đông dạng coumarin (chống đông đường uống, kháng vitamin K) Cơ chế tác dụng: Vitamin K có tác dụng carboxy hóa các yếu tố đông máu II, VII, IX, X, protein S, protein C và nhờ vậy, các yếu tố này mới gắn được Ca++ và có hoạt tính đông máu. Dẫn xuất coumarin ức chế sự khử của vitamin K oxy hóa, làm giảm chức năng của vitamin K; do đó làm các yếu tố đông máu phụ thuộc vitamin K không có hoạt tính đông máu [2]. 8
  17. Hình 1.3. Tác dụng của dẫn xuất coumarin [2]. Dẫn xuất coumarin thường được chỉ định điều trị thay thế heparin khi hết giai đoạn cấp tính và bắt đầu điều trị trong khi bệnh nhân còn điều trị heparin do dẫn xuất coumarin tác dụng chậm. Thời gian này được gọi là “thời gian điều trị gối đầu”, kéo dài trong khoảng 3 ngày. PT là xét nghiệm thường được sử dụng để theo dõi, đánh giá hiệu quả điều trị dẫn xuất coumarin vì xét nghiệm này nhạy với những thay đổi của các yếu tố II, VII, X (là những yếu tố phụ thuộc vitamin K và bị ức chế bởi các dẫn xuất coumarin). Các thử nghiệm lâm sàng cho thấy khi kết quả của PT tính bằng chỉ số INR (International Nomlalized Ratio) nằm trong khoảng 2,0 đến 3,0 cho hiệu quả điều trị tốt nhất [2]. 1.3. Hạn chế của một số thuốc chống ngưng tập tiểu cầu và thuốc chống đông máu Việc sử dụng thuốc chống ngưng tập tiểu cầu và thuốc chống đông máu trong phòng ngừa và điều trị bệnh huyết khối đã được chú ý đến bởi hiệu quả mà chúng mang lại. Tuy nhiên, các phương pháp này vẫn còn nhiều mặt hạn chế. 9
  18. 1.3.1. Hạn chế của thuốc chống ngưng tập tiểu cầu Thuốc đối kháng glycoprotein IIb/IIIa IV có vai trò ở bệnh nhân đang điều trị PCI, nhưng nhu cầu về các thuốc này đã giảm do sự phát triển của các loại thuốc chống ngưng tập tiểu cầu đường uống mạnh hơn [53]. Thuốc chống ngưng tập tiểu cầu đường uống hiện có bao gồm aspirin, clopidogrel, prasugrel và dipyridamol. Hiệu quả của aspirin và clopidogrel đã được thiết lập rõ ràng trên cyclooxygenase -1 (một enzym quan trọng trong tổng hợp thromboxan 2) và 푃2푌12 (thụ thể adenosine diphosphat (ADP) chính trên tiểu cầu), là mục tiêu quan trọng của thuốc chống ngưng tập tiểu cầu [53]. Đối với aspirin, mặc dù lợi ích của aspirin trong việc phòng ngừa thứ phát các biến cố tim mạch do huyết khối xơ vữa rõ ràng lớn hơn nguy cơ chảy máu, nhưng aspirin chỉ hữu ích trong việc phòng ngừa ban đầu, kể cả phòng ngừa ban đầu ở bệnh nhân đái tháo đường týp II. Ngoài ra, aspirin có thể gây kích ứng dạ dày và trong một số trường hợp có thể gây chảy máu, tiêu chảy, giảm bạch cầu trung tính, thiếu máu bất sản và ban xuất huyết giảm tiểu cầu huyết khối [36]. Những vấn đề trên nêu bật những hạn chế của aspirin. Riêng clopidogrel đã được chứng minh là chỉ hiệu quả hơn aspirin một chút. Phối hợp aspirin với clopidogrel ưu việt hơn việc dùng aspirin đơn độc ở những bệnh nhân có nguy cơ cao về các biến cố tim mạch. Tuy nhiên, việc điều trị phối hợp có liên quan đến nguy cơ chảy máu đáng kể và đã mang lại kết quả đáng thất vọng ở những bệnh nhân có bệnh tim mạch ổn định. Cách phối hợp aspirin với dipyridamol cũng vượt trội hơn sử dụng aspirin đơn thuần trong dự phòng thứ phát ở bệnh nhân mắc bệnh mạch máu não, và hiệu quả của phối hợp này tương tự như clopidogrel [53]. Những hạn chế của các loại thuốc chống ngưng tập tiểu cầu hiện nay là do khả năng chỉ làm giảm duy nhất một con đường kích hoạt tiểu cầu. Trong khi đó, tiểu cầu có thể được kích hoạt thông qua nhiều con đường, nên tác dụng ức chế của các loại thuốc này vẫn có khả năng thất bại rất cao khi có một tác nhân kích thích mạnh kích hoạt tiểu cầu. Do đó, không có gì đáng ngạc nhiên khi xảy ra các biến cố tim. [53] 10
  19. 1.3.2. Hạn chế của thuốc chống đông máu Sự ra đời của heparin trọng lượng phân tử thấp (LMWH) và fondaparinux (thuốc chống đông tổng hợp dựa trên trình tự pentasaccharide của heparin, có tác dụng ức chế chọn lọc yếu tố Xa) đã đơn giản hóa việc xử trí ban đầu bệnh huyết khối động mạch hoặc tĩnh mạch vì các tác nhân của chúng có thể được tiêm dưới da mà không cần theo dõi đông máu [20]. Hơn nữa, nguy cơ giảm tiểu cầu do heparin gây ra với LMWH thấp hơn so với heparin và không tồn tại với fondaparinux. Tuy nhiên, nhu cầu tiêm dưới da hàng ngày hạn chế việc sử dụng lâu dài LMWH hoặc fondaparinux. Các nhược điểm khác bao gồm khả năng tích tụ của chúng ở bệnh nhân suy thận, thiếu thuốc giải độc và nguy cơ huyết khối ống thông khi các thuốc này được sử dụng làm thuốc chống đông máu ở bệnh nhân trải qua PCI; đặc biệt đối với fondaparinux do thời gian bán hủy dài của nó [20]. Ngoài ra, các thuốc chống đông máu hiện nay có một số hạn chế khác như tác dụng chậm, yêu cầu thay đổi liều lượng, đa hình di truyền phổ biến ảnh hưởng đến sự chuyển hóa của chúng, sự khác biệt trong chế độ ăn uống vitamin K và nhiều tương tác thuốc - thuốc làm tăng hoặc giảm tác dụng chống đông máu của chúng (ví dụ: Warfarin) [20]. Hơn nữa, một số chất chống đông máu như heparin không phân đoạn có thể làm tăng nguy cơ biến chứng huyết khối và chảy máu [30]. Do những hạn chế của một số thuốc chống đông máu và thuốc chống ngưng tập tiểu cầu hiện nay, trong những năm gần đây, các nhà khoa học trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng đã tập trung vào việc tìm kiếm và phát triển các hợp chất mới có nguồn gốc từ dược liệu, với hiệu quả cao và ít tác dụng phụ trong điều trị CVDs. Một số nghiên cứu đã được tiến hành để xem xét khả năng chống ngưng tập tiểu cầu, chống đông máu cũng như các đặc tính chống oxy hóa của cây thuốc và thu được một số kết quả khả quan [39,51]. 1.4. Tổng quan về chi Canna và cây Ngải hoa 1.4.1. Giới thiệu chung về chi Canna 11
  20. Đặc điểm thực vật và phân bố Canna (hay canna lily, mặc dù không phải là hoa huệ thực sự) là chi duy nhất trong họ Cannaceae với mười chín loài thực vật có hoa. Đã có 2 lần sửa đổi về chi Canna bởi các nhà thực vật học trong những năm gần đây, thứ nhất là của Maas (ở Hà Lan), và thứ hai là của Tanaka (ở Nhật Bản) [47]. Phân loại thực vật Giới: Plantae Phân giới: Tracheobiont Liên ngành: Spermatophyta Ngành: Magnoliophyta Lớp: Liliopsida Phân lớp: Zingiberidae Bộ: Zingiberales Hình 1.4. Hình ảnh cây Canna indica Họ: Cannaceae (a) và quả (b), hạt giống (c), thân rễ (d) Chi: Canna của cây Canna indica. Canna là cây thân rễ, không có lông, là loại thảo mộc lớn. Thân cây thô, cao từ 90 cm đến 3 mét. Cây mọc từ một gốc ghép lớn dưới đất. Lá hình mác hoặc hình trứng dài 10 – 30 cm, rộng 10 – 20 cm với phiến lá lớn dài đến 60 cm. Lá màu xanh đậm với mép và gân lá màu nâu tía. Các lá hình thuôn dài có cuống lá kéo dài xuống dưới tạo thành một bẹ bao quanh thân. Hoa có màu đỏ, cam, vàng, tím, hoặc trắng, và thường mọc thẳng. Lá đài mọc thẳng, hình từ tam giác hẹp đến hình trứng hẹp, từ nhọn đến tù. Cánh hoa chủ yếu hình tam giác, hình trứng hẹp hoặc hình bầu dục. Quả thường có màu xanh lục; khi chín có màu nâu, hình elíp đến hình trứng; vỏ có các nốt sần mềm, gai dài 1 – 2 mm. Hạt có màu đen đến nâu sẫm, hình cầu đến hình elíp và rất cứng [27]. Canna phân bố khắp vùng Trung và Nam Mỹ, từ Virginia ở Hoa Kỳ đến miền bắc Argentina [27]. 12
  21. Thành phần hóa học Mặc dù đã phát hiện ra 19 loài Canna, các nghiên cứu về thành phần hóa học của chúng vẫn còn hạn chế và chỉ tập trung vào Canna indica và Canna edulis. Phân tích thành phần hóa học của hoa Canna indica L. cho thấy chúng chứa nhiều chất thành phần khác nhau, bao gồm: alkaloid, carbohydrate, protein, flavonoid, terpenoids, glycoside tim, steroid, tannin, saponin và phlobatinin [14]. Hình 1.5. Công thức hóa học của Betulinic acid (a), Oleonolic acid (b), và Traraxer-14-en-3-one (c). Phân tích hóa học các bộ phận của Canna indica cho thấy sự hiện diện của axit betulinic, axit oleonolic và traraxer-14-en-3-one (Hình 1.5) [15]. Năm 2005, Jidapha Tinoi và cộng sự đã phát hiện ra hoa của Canna indica chứa nhiều flavonoid, phenol, lutein, β-caroten, violaxanthin, lutein, Zeaxanthin, β-cryptoxanthin, tecpen, hydrocacbon parafin, và một loại dầu đỏ độc hại được gọi là cannabinol [49]. Nghiên cứu khác của Srivastava J và Vankar PS đã phân lập được các anthocyanin từ hoa của Canna indica và xác định cấu trúc của chúng gồm: malvidin 3-O-(6-O-acetyl-beta-d-glucopyranoside)-5-O-beta-d- glucopyranoside; malvidin 3,5-O-beta-d diglucopyranoside; cyanidin-3-O-(6 ''- O-alpha-rhamnopyranosyl-β-glucopyranoside; cyanidin-3-O-(6''-O-alpha- rhamnopyranosyl)-β-galactopyranoside; cyanidin-3-O-beta-glucopyranoside và cyanidin-O-beta-galactopyranoside bằng phương pháp HPLC-PDA [45]. Thân rễ Canna indica chứa alkaloid, flavonoid, phenol, sterol, saponin, gôm, chất béo và tinh bột. Nghiên cứu của Kolhe NM và Nirmal SA xác định từ chiết xuất ete của thân rễ Canna indica chứa các hợp chất không phân cực 13
  22. như 5,8-henicosdiene (3,27%), 7-henicosyne (3,70%), 3,15-dihydroxy-2- octadecene (45,12%), 6-hydroxyeicosan (5,18%), tricosan (2,40%) và tetracosan (1,89%) [46]. Rễ Canna indica chứa cannagenin; gốc ghép chứa các enzym, triacontanal và hỗn hợp stigmasterol, β-sitosterol, campesterol và β- lectin [21]. Hàm lượng flavonoid trong chiết xuất methanolic từ hạt Canna indica là 4,76 µg/g, polyphenol là 13,79 µg/g [40]. Tinh dầu của thân rễ Canna indica (giống hoa vàng) đã được phân lập bằng phương pháp chưng cất hydro và phân tích được bốn mươi ba hợp chất đại diện cho 95,32% lượng tinh dầu đã được xác định [24]. Trong năm 2010, sử dụng chất thu hồi gốc tự do 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH) làm thí nghiệm, Zhang và cộng sự đã tách từ dịch chiết tan trong nước của Canna edulis Ker. và được tinh chế qua sắc ký cột khác nhau một hợp chất mới là 4-(3-(3,4-dihydroxyphenyl) acryloyl)-6-hydroxy-1- metoxy-1,2,3,4-tetrahydronaphthalene-2-cacboxylic cùng với mười hợp chất đã biết gồm: axit rosmarinic, axit salvianolic B, axit ferulic, axit caffeic, axit 1- caffeoylquinic, axit 3-caffeoylquinic, axit 4-caffeoylquinic, axit 5- caffeoylquinic, axit salicylic và axit gallic [58]. Hình 1.6. Một số hợp chất phenolic từ Canna edulis Ker. Năm 2004, nhóm nghiên cứu của YoungSook Yun phân lập được từ cặn không tan trong ethyl acetat của dịch chiết methanol có nguồn gốc từ thân rễ 14
  23. khô của Canna edulis hai este sacaroza phenylpropanoid: 3-O-p-coumaroyl-6- O-feruloyl-b-D-fructofuranosyl 6-O-axetyl-a-D-glucopyranoside và 3,6-di-O- p-coumaroyl-b-D-fructofuranosyl 6-O-acetyl-a-D-glucopyranoside. Ngoài ra còn có thêm một este và bốn phenylpropanoids đã biết là axit caffeic, axit rosmarinic, caffeoyl - 4 axit O-hydroxyphenyllactic và axit salvianolic B [57]. Hình 1.7. Các dẫn xuất phenylpropanoid từ Canna edulis. Tác dụng dược lý Hiện nay các nghiên cứu dược lý về chi Canna chỉ tập trung chủ yếu vào Canna indica. Theo đó, Canna indica có tác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn [15], chống tiêu chảy [26], cầm máu [33], bảo vệ gan [56], kháng khuẩn [24], chống đái tháo đường [43], chống viêm [21] và các tác dụng khác. 1.4.2. Vài nét sơ lược về cây Ngải hoa Đặc điểm thực vật Ngải hoa, còn được gọi là Chuối hoa lai. Tên khoa học: Canna generalis Bail. [19]. Ngải hoa là một loại cây thân thảo, phát triển thành bụi, có đốt ngắn, không phân nhánh và mọc thẳng đứng; có rễ mọc ngầm. Cây cao 0,6 – 1,5 m, thân thô to, thường màu xanh; có phấn trắng như sáp ở phần cụm hoa; có lá xếp dày sít. Phiến lá hình trứng hoặc thuôn dạng trứng, thường màu xanh với các dải màu vàng dọc theo gân lá hoặc nguyên bản màu xanh lục đậm. Cuống dạng 15
  24. bẹ ôm sát thân. Lá dài từ 20 – 60 cm, rộng từ 10 – 30 cm. Lá đơn mọc chia theo lớp từ gốc lên ngọn, vành mép nguyên, phiến trơn và nhiều đường gân sóng. Cụm hoa mọc thẳng, vượt lên trên lá. Lá bắc màu đỏ. Hoa thường màu cam, vàng, đỏ, hồng hoặc các màu có thể pha lẫn nhau. Cánh hoa rộng, xếp thành chùm; hoa lớn, phân thành 6 – 20 bông ở đầu các cành hoa. Quả có màu xanh lục, chuyển sang màu nâu khi chín, có gai, khô, mở ra chứa hạt cứng màu đen [19,29]. Hình 1.8. Cây Ngải hoa. Hình 1.9. Hoa cây Ngải hoa. Thực trạng và phân bố Ngải hoa thường được tìm thấy ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của Bắc Mỹ, Nam Mỹ và Ấn Độ và được trồng ở một số nước khác làm cây cảnh. Ở Việt Nam, cây Ngải hoa được trồng nhiều ở Thái Nguyên. Thành phần hóa học Năm 2006, Myun Ho Bang và cộng sự đã tiến hành phân lập và xác định lipid từ rễ của cây Ngải hoa. Thực hiện chiết xuất Canna generalis Bail. với 80% methanol trong nước, và dịch chiết cô đặc được phân tách lần lượt bằng EtOAc, n-BuOH và H2O. Từ các phân đoạn EtOAc và n-BuOH, bốn hợp chất 16
  25. được phân lập thông qua các phương pháp sắc ký cột ODS và silica gel lặp đi lặp lại. Phân tích từ các kết quả của dữ liệu hóa lý bao gồm NMR, MS và IR, xác định được cấu trúc hóa học của các hợp chất, bao gồm: β-sitosterol, linoleic acid methyl ester, 1-O-oleoyl-2-O-linoleoyl-3-O-β-D-galactopyranosyl-sn- glycerol và daucosterol [16]. Mới đây, năm 2021, Toka N. Mahmoud và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu về các thành phần có trong dịch chiết ethanol của rễ cây Ngải hoa. Các thành phần chính được xác định là flavonoid, axit phenolic, phytosterol. Bên cạnh đó, nhóm phytoconstituent đã được phân lập, gồm: β-sitosterol, triacontanol fatty alcohol, β-sitosterol-3-O-β-glucoside, axit rosmarinic và 6- O-p-coumaroyl-β-D-fructofuranosyl α-D-glucopyranoside [35]. Phần trăm hàm lượng phenolic, flavonoid và steroid trong dịch chiết tương đương lần lượt với 20,55 µg axit gallic; 6,74 µg quercetin và 98,09 µg β-sitosterol trong 1 mg dịch chiết [35]. Hình 1.10. Các công thức hóa học thuộc nhóm phytoconstituent đã được xác định có trong CGE. (A: R=H: β-sitosterol, R=Glc: daucosterol; B: β-sitosterol-3-O-β-glucoside; C: Axit rosmarinic, D: 6-O-p-coumaroyl-β-D-fructofuranosyl α-D- glucopyranoside; E: Triacontanol fatty alcohol; F: 1-O-oleoyl-2-O-linoleoyl- 3-O-β-D-galactopyranosyl-sn-glycerol) Công dụng và tác dụng dược lý Trong y học dân gian 17
  26. Chi Canna được sử dụng làm thuốc giảm đau, tiêu độc, hạ sốt, nhuận tràng nhẹ và trong điều trị rối loạn tiêu hóa. Theo kiến thức dân gian, Canna generalis Bail. được sử dụng làm thuốc chống viêm, giảm đau và hạ sốt. Bên cạnh đó, Canna generalis Bail. được sử dụng trong các chế phẩm của y học Ayurvedic và điều trị nhọt, vết thương và áp xe. Tuy nhiên, tác dụng chống viêm của nó đối với viêm loét đại tràng vẫn chưa được nghiên cứu [35]. Năm 2019, bài báo “Cây thuốc dân gian được bộ tộc Subanen sử dụng trong 2 ngôi làng tại thành phố Ozamis, Mindanao, Philippines” trình bày nghiên cứu về các cây thuốc dân gian cũng như các phương pháp chăm sóc sức khỏe truyền thống đã được sử dụng. Bài báo đề cập đến tác dụng của thân cây Canna generalis Bail. trong điều trị nhọt, vết thương hở và áp xe [13]. Nghiên cứu y học hiện đại Năm 2020, Toka N. Mahmoud và cộng sự đã công bố một nghiên cứu trên chuột và đã cung cấp bằng chứng về tiềm năng điều trị của dịch chiết ethanol của rễ cây Ngải hoa trong bệnh viêm loét đại tràng. Nó khôi phục tính toàn vẹn của hàng rào niêm mạc ruột, giảm thiểu phản ứng viêm, ức chế stress oxy hóa, duy trì chức năng hàng rào niêm mạc và cấu trúc của các mô ruột kết, cũng như ức chế sự kích hoạt các tín hiệu trong các mô ruột kết. Đáng chú ý, ở liều 200 mg/kg, dịch chiết ethanol của rễ cây Ngải hoa có hiệu quả hơn trong việc cải thiện viêm loét đại tràng do dextran sulfate sodium gây ra so với sulfasalazine ở cùng liều lượng [35]. 18
  27. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu, đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Cây Ngải hoa được thu thập tại tỉnh Thái Nguyên, Việt Nam và được xác định bởi Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST). Sau khi được giám định, cây được chia thành hai phần: phần trên mặt đất và phần rễ. Sau đó, rửa sạch phần trên mặt đất để loại bỏ hết bùn đất, cắt thành từng đoạn nhỏ rồi phơi dưới ánh nắng mặt trời trong bảy ngày. Tiếp theo, sấy mẫu dược liệu trong tủ sấy tĩnh ở nhiệt độ 40C đến khi đạt yêu cầu về độ ẩm của dược liệu (không quá 12%), sau đó nghiền thành bột thô. Bảo quản bột thô trong thùng kín và để ở nơi mát, tối và khô cho đến khi thực nghiệm. Bột thô được ngâm với ethanol 96% ba lần theo tỷ lệ dung môi : dược liệu là 5 : 1 ở nhiệt độ phòng. Sau đó, lọc để thu được dịch chiết và chưng cất trong bình cầu đáy tròn với thiết bị cô quay ở 45C. Dịch chiết ethanol thô được trộn với khoảng 200 mL đến 300 mL nước cất ở 40C và được chiết phân đoạn với các dung môi phân cực tăng lên bao gồm n-hexan, ethyl acetat và nước; sau đó làm bay hơi dung môi để thu được các phân đoạn khác nhau. Trong các nghiên cứu trước được thực hiện bởi nhóm nghiên cứu của Trường đại học Khoa học và Công nghệ Hà Nội, phân đoạn dịch chiết ethyl acetat thể hiện hoạt tính chống đông máu và chống ngưng tập tiểu cầu tốt nhất [38,50]. Do đó, phân đoạn dịch chiết ethyl acetat được dùng để phân lập các hợp chất tinh khiết bằng phương pháp sắc ký cột. Ba hợp chất tinh khiết được phân lập từ phân đoạn dịch chiết ethyl acetat gồm: 3-methoxybenzaldehyde (CGE2), 2- methoxynaphthalene (CGE3), 4-Ketopinoresinol (CGE4) (Hình 2.2). Các hợp chất tinh khiết được tiến hành phân lập, định danh và cung cấp bởi viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam. 19
  28. Bột của cây Ngải hoa Ngâm trong ethanol 96% Dịch chiết ethanol thô 1. Loại bỏ ethanol 2. Bổ sung H2O 3. Chiết xuất bằng n-hexan Phần hòa tan trong n-hexan Phần nước Chiết xuất bằng ethyl acetate Phần hòa tan trong ethyl acetate Phần nước CGE2 CGE3 CGE4 Hình 2.1. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn dịch chiết cây Ngải hoa. (CGE2: 3-methoxybenzaldehyde; CGE3: 2-methoxynaphthalene; CGE4: 4-Ketopinoresinol) 3- methoxybenzaldehyde (CGE2) 2-methoxynaphtalene (CGE3) 4-Ketopinoresinol (CGE4) Hình 2.2. Cấu trúc hóa học của CGE2, CGE3, CGE4 Hình 2.2. Công thức hóa học của CGE2 (A), CGE3 (B), CGE4 (C). 20
  29. Nguyên liệu, vật liệu nghiên cứu Chất sạch: Các hợp chất CGE2, CGE3, CGE4 do viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam cung cấp. Dung môi hữu cơ: Nước cất, dimethyl sulfoxide nguyên chất (DMSO 100%), Polyvinyl alcohol 1% (PVA 1%), Polyethylene glycol 3000 1% (PEG 3000 1%), Saline. Thuốc thử: Heparin 5000 IU/mL, thuốc thử PT (Thuốc thử Thromborel® S), thuốc thử APTT (Dade Actin® P), thuốc thử TT (Thuốc thử Thromboclotin®), Collagen, ADP. Dụng cụ: Ống đựng máu không chứa chất chống đông và giá để ống đựng máu. Xylanh 10 mL, 20 mL, kim lấy máu 20G. Ống falcon và giá để ống falcon. Ống eppendorf thể tích 1,5 mL và giá để ống eppendorf. Micropipet thể tích 1-10 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL; đầu côn tương ứng và giá để pipet. Bút dạ, giấy parafilm, găng tay, khẩu trang y tế. Cốc đựng đầu côn bẩn. Thiết bị: Máy đo thời gian PT, TT và APTT: Máy ACL-TOP 500 của hãng IL (Instrumentation Laboratory - Mỹ). Máy đo thời gian ngưng tập tiểu cầu: Máy CHRONO-LOG 530 VS Máy siêu âm 21
  30. Hình 2.3. Máy ACL-TOP 500. Hình 2.4. Máy CHRONO-LOG 530 VS. Thu thập mẫu Để thực hiện được nghiên cứu in vitro, đề tài cần tiến hành lấy mẫu máu của người tình nguyện khỏe mạnh. Do đó, cần tuân thủ theo hiệp ước Helsinki và hướng dẫn quốc gia về khía cạnh đạo đức trong nghiên cứu y sinh học trên đối tượng nghiên cứu là con người. Sau khi được sự đồng ý và chấp thuận của hội đồng đạo đức, chúng tôi đã tiến hành thu thập máu lấy từ người tình nguyện khỏe mạnh. Người tham gia nghiên cứu cần được biết về lý do, mục đích của nghiên cứu, các lợi ích, cũng như rủi ro của nghiên cứu, và ký đồng thuận tham gia nghiên cứu. Người tình nguyện có quyền từ chối tham gia và rút lui khỏi nghiên cứu mà không chịu sự ràng buộc nào. Người tình nguyện cần đáp ứng tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ sau: Tiêu chuẩn lựa chọn: Người tình nguyện khoẻ mạnh, 20 – 25 tuổi, không hút thuốc lá, không có tiền sử các bệnh về máu, không sử dụng ma túy, và không đang sử dụng các thuốc tác dụng trên quá trình đông máu, tiêu fibrin. Tiêu chuẩn loại trừ: Có bất thường về số lượng tiểu cầu tại thời điểm nghiên cứu, mẫu máu thu nhận bị vỡ hồng cầu, người mới cho máu với lượng lớn hơn 450 mL trong vòng 28 ngày trước. Yêu cầu: Các tình nguyện viên được lấy máu vào buổi sáng và nhịn ăn 12 giờ trước khi lấy máu. Máu tĩnh mạch toàn phần được lấy bằng kim tiêm cỡ 20 gauge. 22
  31. 2.2. Phương pháp nghiên cứu Chuẩn bị mẫu Máu tĩnh mạch được thu thập và đưa vào ống EDTA, sau đó xét nghiệm công thức máu hoàn chỉnh để kiểm tra số lượng và tình trạng tế bào máu. Phần máu còn lại được cho vào các các ống natri citrat (3,2%), ly tâm với tốc độ 500 vòng/phút trong 10 phút để lấy huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) và 3000 vòng/phút trong 10 phút để thu huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP). Hình 2.5. Mẫu máu sau khi ly tâm Hình 2.6. Mẫu PRP (bên trái) và 500 vòng/phút trong 10 phút. PPP (bên phải) thu được sau khi ly tâm. Các hợp chất tinh khiết được hòa tan trong dung môi DMSO 0,1%, sử dụng nồng độ nghiên cứu: 0,4; 0,2 và 0,1 mg/mL. Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của các hợp chất từ cây Ngải hoa. Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp đo quang của Born (1962) để đo độ ngưng tập tiểu cầu trên máy CHRONO-LOG 530 VS [17]. Tiến hành: Chia 450 µL PRP vào cuvet thuỷ tinh chứa khuấy từ. Thêm lần lượt vào mỗi cuvet 50µl hóa chất gồm DMSO 0,1%, aspirin (0,1 mg/mL), các nồng độ của các hợp chất sạch (0,4; 0,2; 0,1 mg/mL) và ủ trong 3 phút ở 37C. Sau đó, cho thêm vào cuvet 5 µL ADP (5 µM) hoặc 1 µL collagen (2 µg/mL) để kích 23
  32. thích sự ngưng tập tiểu cầu. Aspirin (0,1 mg/mL) và DMSO 0,1% lần lượt được sử dụng làm chứng dương và chứng âm. Tính phần trăm ngưng tập tiểu cầu ở các ống PRP bằng cách so sánh lượng ánh sáng truyền qua các ống này so với ống chứng PPP (lượng ánh sáng truyền qua ống chứng PPP được coi là 100%). Lặp lại thí nghiệm 3 lần ở mỗi nồng độ. Đánh giá kết quả Phần trăm ngưng tập tiểu cầu (%I) được tính theo công thức sau: X − Y %I = × 100% X Trong đó: X: Sự ngưng tập tiểu cầu của chứng âm; Y: Sự ngưng tập tiểu cầu của chất thử. Bên cạnh phần trăm ngưng tập tiểu cầu, tốc độ thay đổi trong một phút (Slope) và chỉ số diện tích dưới đường cong (AUC) cũng được đánh giá. Đánh giá tác dụng chống đông máu của các hợp chất từ cây Ngải hoa. Nguyên tắc: Thời gian đông máu in vitro được đo bằng máy ACL-TOP 500 theo nguyên lý đo quang (phương thức phát hiện ánh sáng tán xạ), dựa theo mô hình của Li C. và cộng sự 2013 [32] . Tiến hành: Chia 450 µL PPP vào mỗi ống máu đã được loại sạch chất chống đông. Thêm 50 µL hóa chất gồm DMSO 0,1%, heparin 0,2 UI/mL và các nồng độ của các hợp chất tinh khiết (0,4; 0,2; 0,1 mg/mL) vào mỗi ống theo thứ tự sau và ủ ở 37C trong vòng 5 phút: Ống 1: 450 µL PPP và 50 µL dung dịch DMSO 0,1% (chứng âm). Ống 2: 450 µL PPP và 50 µL dung dịch Heparin 0,2 UI/mL (chứng dương). Ống 3: 450 µL PPP và 50 µL chất thử nồng độ 0,4 mg/mL. Ống 4: 450 µL PPP và 50 µL chất thử nồng độ 0,2 mg/mL. Ống 5: 450 µL PPP và 50 µL chất thử nồng độ 0,1 mg/mL. 24
  33. Tiến hành đo các chỉ số PT, APTT và TT bằng máy ALC-TOP 500. Lặp lại thí nghiệm 3 lần ở mỗi nồng độ. Phương pháp phân tích số liệu Dữ liệu thu thập được sẽ được biểu diễn ở dạng giá trị trung bình ± SD (SD: Độ lệch chuẩn). Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS 23.0, sử dụng Test one-way ANOVA, dùng hậu kiểm Tukey. Sự khác biệt giữa các nhóm được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05. Và hệ số tương quan Pearson (Pearson correlation coefficient, ký hiệu r) được sử dụng để kiểm tra, đo lường mức độ tương quan tuyến tính giữa hai biến. 25
  34. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ 3.1. Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của các hợp chất từ cây Ngải hoa 3.1.1. Ảnh hưởng của các hợp chất khác nhau từ cây Ngải hoa đối với sự ngưng tập tiểu cầu khi sử dụng chất kích tập collagen Phần trăm ức chế (% I) ngưng tập tiểu cầu của các hợp chất COLLAGEN 100 90 80 70 60 50 40 * 30 * * 20 Phần Phần trăm chế ức(%I) * * * * * 10 * 0 CGE2 CGE3 CGE4 Aspirin * 0,1 mg/mL 0,2 mg/mL 0,4 mg/mL Hình 3.1. Phần trăm ức chế ngưng tập tiểu cầu của hợp chất sạch từ cây Ngải hoa khi sử dụng chất kích tập collagen. (Aspirin 0,1 mg/mL được sử dụng làm chứng dương, *: p < 0,05 khi so sánh với aspirin). Kết quả trong hình 3.1 cho thấy ba hợp chất của cây Ngải hoa có hoạt tính chống ngưng tập tiểu cầu với chất chủ vận collagen tăng lên khi nồng độ chất tăng từ 0,1 đến 0,4 mg/mL. Hệ số tương quan Pearson cũng xác nhận rằng nồng độ chất và khả năng ức chế ngưng tập tiểu cầu có tương quan thuận chiều (hệ số tương quan Pearson, r = 0,960 đối với CGE2, r = 0,986 đối với CGE3 và r = 0,994 đối với CGE4). 26
  35. CGE4 ở nồng độ 0,4 mg/mL cho thấy hoạt tính chống ngưng tập tiểu cầu tốt nhất nhưng vẫn thấp hơn đáng kể so với chứng dương là aspirin (p < 0,05), với %I của CGE4 0,4 mg/mL và aspirin 0,1 mg/mL lần lượt là: 35,08% và 99,01%. Trong khi đó, CGE4 ở nồng độ 0,2 mg/mL và 0,1 mg/mL có tác dụng ức chế kém hơn CGE3 ở nồng độ tương tự (p < 0,05). Dữ liệu cũng chỉ ra rằng CGE3 có hoạt tính chống ngưng tập tiểu cầu tốt hơn CGE2 ở tất cả các nồng độ thử (p < 0,05). Diện tích dưới đường cong (AUC) và độ dốc (S) của đường cong ngưng tập tiểu cầu của các hợp chất Bảng 3.1. Diện tích dưới đường cong (AUC) của thí nghiệm ngưng tập tiểu cầu với chất kích tập collagen của các hợp chất từ cây Ngải hoa. (Aspirin 0,1 mg/mL và DMSO 0,1% lần lượt được sử dụng làm chứng dương và chứng âm). Hợp Nồng độ p so với p so với AUC (%.min) chất (mg/mL) Aspirin DMSO 0,4 149,00 ± 6,56 < 0,05 < 0,05 CGE2 0,2 256,00 ± 6,00 < 0,05 < 0,05 0,1 285,00 ± 5,00 < 0,05 < 0,05 0,4 136,67 ± 7,64 < 0,05 < 0,05 CGE3 0,2 186,67 ± 5,86 < 0,05 < 0,05 0,1 259,33 ± 4,04 < 0,05 < 0,05 0,4 125,33 ± 5,51 < 0,05 < 0,05 CGE4 0,2 155,67 ± 5,03 < 0,05 < 0,05 0,1 298,67 ± 3,21 < 0,05 < 0,05 Aspirin 0,1 0,77 ± 0,25 DMSO 0,1% 324,33 ± 6,03 Dữ liệu từ bảng 3.1 chỉ ra rằng giá trị AUC của ba chất giảm khi nồng độ tăng từ 0,1 đến 0,4 mg/mL (hệ số tương quan Pearson, r = - 0,992 đối với 27
  36. CGE2, r = - 0,956 đối với CGE3 và r = - 0,853 đối với CGE4). So với chứng dương (aspirin 0,1 mg/mL), ba chất cho thấy AUC cao hơn rất nhiều (p 0,05 0,4 81,00±3,61 0,05 so với DMSO 0,1%). 28
  37. 3.1.2. Ảnh hưởng của các hợp chất khác nhau từ cây Ngải hoa đối với sự ngưng tập tiểu cầu khi sử dụng chất kích tập ADP Phần trăm ức chế (% I) ngưng tập tiểu cầu của các hợp chất ADP 45 40 35 30 25 * * 20 * * 15 10 * * Phần Phần trăm chế ức(%I) * 5 0 * * CGE2 CGE3 CGE4 Aspirin 0,1 mg/mL 0,2 mg/mL 0,4 mg/mL Hình 3.2. Phần trăm ức chế ngưng tập tiểu cầu của hợp chất sạch từ cây Ngải hoa khi sử dụng chất kích tập ADP. (Aspirin 0,1 mg/mL được sử dụng làm chứng dương, *: p 0,05). Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của CGE2 kém hơn CGE3 và đều kém hơn CGE4 ở tất cả nồng độ thử tương ứng. 29
  38. Diện tích dưới đường cong AUC và độ dốc (S) của đường cong ngưng tập tiểu cầu của các hợp chất Bảng 3.3. Diện tích dưới đường cong (AUC) của thí nghiệm ngưng tập tiểu cầu với chất kích tập ADP của các hợp chất từ cây Ngải hoa. (Aspirin 0,1 mg/mL và DMSO 0,1% lần lượt được sử dụng làm chứng dương và chứng âm). Hợp Nồng độ p so với p so với AUC (%.min) chất (mg/mL) Aspirin DMSO 0,4 303,33±5,03 0,05 0,4 275,00±5,00 0,05 0,4 150,67±4,04 > 0,05 0,05)), và các dữ liệu này có giá trị thấp hơn so với chứng âm (DMSO 0,1%) (p < 0,05). 30
  39. Bảng 3.4. Độ dốc (S) của thí nghiệm ngưng tập tiểu cầu với chất kích tập ADP của các hợp chất từ cây Ngải hoa. (Aspirin 0,1 mg/mL và DMSO 0,1% lần lượt được sử dụng làm chứng dương và chứng âm). Hợp Nồng độ p so với p so với S (%/min) chất (mg/mL) Aspirin DMSO 0,4 88,00±6,24 0,05 0,4 65,33±5,51 > 0,05 0,05)), và các dữ liệu này có giá trị thấp hơn so với chứng âm (DMSO 0,1%) (p 0,05). Giá trị độ dốc theo thứ tự CGE2, CGE3, CGE4 có xu hướng giảm dần khi so sánh các nồng độ tương ứng và tăng dần khi giảm nồng độ chất thử. 31
  40. 3.2. Tác dụng chống đông máu của các hợp chất từ cây Ngải hoa Bảng 3.5. Ảnh hưởng của các hợp chất từ cây Ngải hoa lên các thông số PT, APTT và TT. (DMSO 0,1%, Heparin 0,2 IU/mL lần lượt được sử dụng làm chứng âm và chứng dương; *: p < 0,05 khi so sánh với heparin; * *: p < 0,05 khi so sánh với DMSO; r: Hệ số tương quan Pearson). Nồng Hợp độ PT(s) r APTT(s) r TT(s) r chất (mg/ mL) 33,70±0,61 17,03±0,15 0,4 12,13±0,15 (*) (*) 32,83±0,76 16,90±0,36 CGE2 0,2 11,27±0,21 0,955 0,973 0 (*) (*) 31,83±0,76 17,07±0,15 0,1 11,23±0,25 (*) (*) 34,50±1,32 17,10±0,26 0,4 11,83±0,25 (*) (*) 31,17±1,88 17,23±0,15 CGE3 0,2 11,43±0,40 0,980 0,781 0,143 (*) (*) 32,30±0,72 17,03±0,21 0,1 11,37±0,31 (*) (*) 38,50±0,50 17,33±0,42 0,4 11,47±0,25 (*) ( ) (*) 11,03±0,25 34,50±0,50 17,40±0,46 CGE4 0,2 0,688 0,979 0,249 (*) (*) ( ) (*) 33,83±0,76 17,28±0,33 0,1 11,23±0,35 (*) (*) DMSO 0,1% 11,28±0,55 33,00±0,50 17,10±0,36 0,2 Heparin IU/ 11,80±0,40 60,00±5,00 32,33±1,04 mL 32
  41. Nhìn chung, dữ liệu cho thấy mối tương quan thuận giữa nồng độ chất với các chỉ số đông máu PT, APTT. Điều đó có nghĩa là nồng độ chất tăng lên dẫn đến tăng thời gian đông máu (Bảng 3.5). Trong thử nghiệm PT, chỉ có CGE2 ở nồng độ 0,4 mg/mL kéo dài thời gian đông máu, với giá trị cao hơn so với chứng dương và chứng âm (p > 0,05). Trong khi đó, các chất khác không có sự khác biệt có ý nghĩa (p > 0,05). Trong thử nghiệm APTT, hầu hết các chất cho giá trị thấp hơn đáng kể so với chứng dương (p 0,05; trừ CGE4 ở nồng độ 0,4 mg/mL và 0,2 mg/mL có p 0,05), và cũng cho các giá trị thấp hơn đáng kể so với chứng dương (p < 0,05). 33
  42. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1. Mô hình nghiên cứu Thử nghiệm chống ngưng tập tiểu cầu Đề tài đã sử dụng phương pháp quang học để đo độ ngưng tập tiểu cầu (Light Transmission Aggregometry - LTA) là phương pháp được phát triển bởi Born năm 1962. Đây được coi là tiêu chuẩn vàng đánh giá chức năng ngưng tập tiểu cầu và được sử dụng phổ biến hiện nay [25,34]. Nguyên lí của phương pháp là khi cho chất kích tập như: adenosin diphosphat (ADP), acid arachidonic, collagen, thrombin, epinephrine vào huyết tương giàu tiểu cầu sẽ xảy ra hiện tượng các tiểu cầu ngưng tập với nhau tạo thành đám; vì vậy làm tăng độ dẫn truyền ánh sáng qua huyết tương. Độ dẫn truyền ánh sáng phản ánh mức độ ngưng tập tiểu cầu [9]. Trong các thử nghiệm được thực hiện trong nghiên cứu này, ADP và collagen là tác nhân kích hoạt quá trình ngưng tập tiểu cầu. ADP là chất chủ vận đầu tiên được biết đến và là chất chủ vận quan trọng để ngưng tập tiểu cầu. ADP không chỉ gây ra sự ngưng tập chính của tiểu cầu mà ADP và các chất chủ vận khác còn là nguyên nhân gây ra sự ngưng tập thứ cấp [41]. Ngoài ra, ADP cũng tham gia vào nhiều phản ứng khác ở tiểu cầu như làm thay đổi hình dạng, bài tiết, tạo thromboxan A2, hoạt hóa GP IIb/IIIa. ADP có trong hạt đặc của tiểu cầu và được bài tiết khi tiểu cầu trở nên hoạt hóa [4]. Collagen liên kết với Gp VI tham gia vào quá trình truyền tín hiệu tiểu cầu và tạo thành thromboxan A2. Collagen cũng liên kết với thụ thể Gp Ia/IIa có liên quan đến sự kết dính tiểu cầu [50]. Aspirin là thuốc kháng tiểu cầu được sử dụng phổ biến trên lâm sàng hiện nay [3]. Aspirin gắn vào gốc Serin ở vị trí 529 của men Cyclooxygenase- 1 (COX-1) của tiểu cầu; do đó ức chế không hồi phục COX-1 và ngăn không cho acid arachidonic chuyển thành thromboxan A2. Tác dụng của aspirin làm giảm sản xuất thromboxan A2 (chất làm co mạch mạnh và kích thích gây ngưng tập tiểu cầu). Aspirin cũng ảnh hưởng đến chức năng tiểu cầu bằng cách bất hoạt chức năng hoạt hoá tiểu cầu của bạch cầu trung tính [28]. Aspirin tác động một phần đối với ngưng tập tiểu cầu do tác động của ADP, thrombin, collagen 34
  43. [18,22]. Aspirin làm giảm ngưng tập với ADP ở những bệnh nhân sử dụng aspirin [1]. Việc sử dụng thêm chứng âm (dung dịch DMSO 0,1%) nhằm kiểm tra và loại bỏ ảnh hưởng của dung môi chiết đến kết quả nghiên cứu. Ảnh hưởng của các hợp chất lên chức năng tiểu cầu được đánh giá với ba thông số được báo cáo: tỷ lệ phần trăm ức chế tiểu cầu (% I) thể hiện khả năng ức chế ngưng tập tiểu cầu, diện tích dưới đường cong ngưng tập tiểu cầu (AUC) ước tính tổng thể ngưng tập tiểu cầu; và độ dốc đường cong ngưng tập (S) cho biết vận tốc ngưng tập của tiểu cầu theo thời gian. Hiện nay, ba thông số này luôn được các nhà nghiên cứu quan tâm trong việc đánh giá chức năng tiểu cầu của người bệnh và rất có giá trị trong việc phân loại các bệnh liên quan đến tiểu cầu. Thử nghiệm chống đông máu Ba xét nghiệm in vitro: thời gian prothrombin (PT), thời gian thromboplastin được hoạt hóa một phần (APTT) và thời gian thrombin (TT) - đo khoảng thời gian giữa các thời điểm khác nhau từ khi bắt đầu quá trình đông máu đến khi hình thành fibrin, được sử dụng để đánh giá khả năng chống đông máu của C. generalis. PT kiểm tra các yếu tố góp phần vào con đường đông máu ngoại sinh như II, V, VII, X, fibrinogen với mức bình thường từ 12 đến 15 giây; trong khi APTT đánh giá các yếu tố như VIII, IX, XI, XII, II, X, fibrinogen là các yếu tố có mặt trong con đường đông máu nội sinh, với khoảng tham chiếu dưới 30 đến 35 giây [52]. TT đánh giá thời gian cần thiết để hình thành fibrin từ fibrinogen (con đường đông máu chung), với phạm vi tham chiếu từ 14 đến 16 giây [23]. Thời gian đông máu gấp 1,5 – 2,5 lần giá trị bình thường được coi là khoảng điều trị cho liệu pháp chống đông máu. Heparin là thuốc chống đông máu ức chế yếu tố X và thrombin, đồng thời kích hoạt anti-thrombin. Trong nghiên cứu này, heparin được sử dụng làm chứng dương với nồng độ 0,2 IU/mL. Việc lựa chọn heparin là phù hợp và giống với mô hình của Li C., et al. 2013 [32] và Lau A. J., et al. 2009 [31]. DMSO 0,1% được sử dụng làm chứng âm nhằm kiểm tra và loại bỏ ảnh hưởng của dung môi chiết đến kết quả nghiên cứu. 35
  44. 4.2. Kết quả nghiên cứu Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của các hợp chất từ cây Ngải hoa Khi nhìn vào các số liệu %I của các hợp chất, có thể thấy rằng các hợp chất từ cây Ngải hoa thể hiện tác dụng phụ thuộc vào liều, cụ thể tác dụng chất ở nồng độ 0,4 mg/mL cao hơn hẳn so với 0,2 mg/mL và đều cao hơn 0,1 mg/mL; và cũng nhận thấy tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của CGE4 tốt hơn so với CGE3 và CGE2 ở cùng nồng độ với cùng chất kích tập (ADP hoặc collagen). Ngoài ra, tác dụng của các chất trong chống ngưng tập tiểu cầu với chất kích tập ADP cao hơn so với collagen khi so sánh trong cùng một chất với nồng độ thử tương ứng. Nhưng phần trăm ức chế (%I) ngưng tập tiểu cầu của các chất này lại thấp hơn nhiều so với chứng dương (aspirin 0,1 mg/mL), ngoại trừ CGE4 0,4 mg/mL có giá trị %I là 36,11%, tương tự chứng dương (%I = 35,62%) trong thí nghiệm ngưng tập tiểu với chất kích tập ADP (p > 0,05). Đối với chỉ số AUC và độ dốc (S), các chất có tác dụng làm giảm AUC so với chứng âm (DMSO 0,1%) nhưng không đáng kể và giá trị AUC còn cao hơn rất nhiều so với chứng dương (aspirin 0,1 mg/mL). Điều này cho thấy tác dụng không đáng kể của các chất này đối với sự ngưng tập tiểu cầu tối đa, cũng như quá trình ngưng tập tiểu cầu tổng thể và tốc độ ngưng tập. Có thể kết luận rằng hợp chất CGE4 từ cây Ngải hoa có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu; nhưng đây mới chỉ là kết quả thử nghiệm in vitro ban đầu và cần có các nghiên cứu sâu hơn để khẳng định kết quả trên cũng như cơ chế tác dụng của hợp chất này. Tác dụng chống đông máu của các hợp chất từ cây Ngải hoa Bằng cách so sánh các số liệu thu được, có thể thấy rằng các hợp chất CGE4, CGE3, CGE2 được chiết xuất từ cây Ngải hoa hầu như không có tác dụng chống đông máu trên con đường đông máu ngoại sinh, nội sinh cũng như con đường đông máu chung. 4.3. Hạn chế nghiên cứu Hạn chế về cỡ mẫu và lượng huyết tương thu nhận trên một lần lấy mẫu. Việc cho thuốc thử ủ với máu toàn phần của các tình nguyện viên, sau đó làm tổng phân tích tế bào máu ngoại vi để xem ảnh hưởng của thuốc đến 36
  45. hồng cầu, tiểu cầu và các chỉ số liên quan đến tiểu cầu như thể tích tiểu cầu, phân bố tiểu cầu, cùng với việc quan sát xem tiểu cầu có những bất thường như kết dính tiểu cầu, hay các tế bào máu, vón tiểu cầu, vỡ tiểu cầu chưa được thực hiện. Chính vì vậy, nghiên cứu còn hạn chế về đánh giá tác dụng không mong muốn in vitro của các hợp chất. Nghiên cứu này bước đầu chỉ dừng lại ở mức khảo sát, cần có các nghiên cứu chuyên sâu hơn để có thể khẳng định được tác dụng, hiệu quả của các hợp chất từ cây Ngải hoa. Thành phần hóa học trong các phân đoạn dịch chiết chưa được nghiên cứu đầy đủ, gây khó khăn trong việc biện luận kết quả nghiên cứu. Nghiên cứu chưa tiến hành cho thuốc thử ủ với máu toàn phần của các tình nguyện viên sau đó làm tổng phân tích tế bào máu ngoại vi để xem ảnh hưởng của thuốc đến các chỉ số huyết học và chưa đánh giá được giá trị IC50. 37
  46. KẾT LUẬN Nghiên cứu là một cơ sở để khẳng định về đặc tính chống ngưng tập tiểu cầu, chống đông máu của các hợp chất tinh khiết phân lập từ cây Ngải hoa. Trong khi, các chỉ số trong thử nghiệm chống đông máu cho thấy tác dụng không tốt của các hợp chất thử trên con đường đông máu ngoại sinh, nội sinh cũng như con đường đông máu chung không tốt; thì tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của các hợp chất trong nghiên cứu này được khẳng định rõ qua các số liệu thu được. Vì vậy, cây Ngải hoa có thể được coi là một nguồn dược liệu đầy hứa hẹn với các hợp chất có hoạt tính sinh học để quản lý và điều trị các bệnh tim mạch. Nghiên cứu sâu hơn là cần thiết để phát hiện các chất có hoạt tính, cũng như cơ chế hoạt động của chúng. 38
  47. ĐỀ XUẤT Đổi với thử nghiệm chống ngưng tập tiểu cầu Tiến hành nghiên cứu tiếp theo trên các chất kích tập tiểu cầu khác như acid arachidonic, ristocetin để đánh giá rõ hơn và đầy đủ hơn các đích tác dụng của các hợp chất từ cây Ngải hoa. Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của các hợp chất đang thử tương đối thấp nên có thể cân nhắc tăng nồng độ chất trong nghiên cứu tiếp theo. Tiến hành nghiên cứu in vivo trên mô hình gây huyết khối để đánh giá hiệu quả chống ngưng tập tiểu cầu cũng như tính an toàn của các hợp chất từ cây Ngải hoa. Đối với thử nghiệm chống đông máu Nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn để xác định tính đúng đắn của kết quả nghiên cứu. Nghiên cứu thử nghiệm ủ chất thử với máu toàn phần sau đó làm tổng phân tích tế bào máu ngoại vi để xem ảnh hưởng của chất thử đến hồng cầu, tiểu cầu, thời gian đông máu. Tiến hành nghiên cứu in vivo trên mô hình gây huyết khối để đánh giá hiệu quả chống đông máu cũng như tính an toàn của các hợp chất từ cây Ngải hoa. 39
  48. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1. Bệnh viện Trung ương quân đội 108 (2016), Các xét nghiệm đánh giá chức năng cầm – đông máu. 2. Bộ môn huyết học truyền máu - Trường đại học Y Hà Nội (2006), Bài giảng huyết học truyền máu - Sau đại học, Nhà xuất bản Y học, tr. 267- 270. 3. Bộ Y tế (2015), Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị một số bệnh lí huyết học, tr. 132-133. 4. Nguyễn Thị Nữ (2005), Nghiên cứu ngưng tập tiểu cầu và một số yếu tố đông máu ở bệnh nhân tăng huyết áp có rối loạn lipid máu, Luận văn Tiến sỹ Y học, Đại học Y Hà Nội, tr. 4-6. 5. Hoàng Sầm (2008), Nghiên cứu dịch chiết cây Dong riềng đỏ trong điều trị bệnh cơ tim thiếu máu cục bộ, Đề tài nghiên cứu số B2005- 04-46TĐ. 6. Hoàng Sầm và cộng sự (2007), "Nghiên cứu chiết xuất cây Dong riềng đỏ trên vật thể và bệnh nhân thiếu máu cục bộ", Y học thực hành, pp. 7. Mai Tất Tố, Vũ Thị Trâm (2012), Dược lí học, NXB Y học, Tập 2, tr. 122-124. 8. Nguyễn Anh Trí (2008), Đông máu ứng dụng trong lâm sàng, NXB Y học, tr. 7-64. 9. Quách Hữu Trung (2014), Nghiên cứu tình trạng kháng aspirin ở bệnh nhân có yếu tố nguy cơ tim mạch cao, Luận án tiến sĩ y học, Viện Nghiên Cứu Khoa Học Y Dược Lâm Sàng 108 - Bộ Quốc Phòng, tr. 49-50. 10. Nguyễn Xuân Trường, Hoàng Văn Sầm (2017), "Nghiên cứu tác dụng giãn mạch và co bóp cơ tim của bốn đoạn cao c hiết Dong riềng đỏ (Canna sp.) Trên tim thỏ cô lập", Tạp chí Dược học, 490, pp. tr. 39-42. 11. Trần Văn Tú (2009), Bài giảng Điều trị chống tiểu cầu, thankinh.edu.vn. Tài liệu Tiếng Anh
  49. 12. Al-Snafi Ali Esmail (2015), "Bioactive components and pharmacological effects of Canna indica- An overview", International Journal of Pharmacology & Toxicology, 5(2), pp. 71-75. 13. Alduhisa Gema U., Demayo Cesar G. (2019), "Ethnomedicinal plants used by the subanen tribe in two villages in ozamis city mindanao philippine", Pharmacophore, 10(4), pp. 28-42. 14. Ali Esmail Al-Snafi (2015), "Bioactive components and pharmacological effects of Canna indica – An overview", International Journal of Pharmaclology & Toxicology, 5(2), pp. 71-75. 15. Bachheti R. K., Joshi Archana, Rawat Gs (2013), "Phytochemical Investigation Of Aerial Parts Of Canna indica Collected From Uttarakhand India", International Journal of PharmTech Research, 5(2), pp. 974-4304. 16. Bang Myun-Ho, Song Myoung-Chong, Lee Dea-Young, et al (2006), "Isolatation and identification of lipids from the roots of Canna generalis", J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem, 49(4), pp. 339-342. 17. Born G. V. R. (1962), "Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal", Nature, 194(4832), pp. 927-929. 18. D Varon, G Spectre (2009), "Antiplatelet agents", Hematology, 1, pp. 267-272. 19. Edward F. Gilman (1999), Canna x generalis, Fact Sheet FPS-103, University of Florida. 20. Eikelboom John W., Weitz Jeffrey I. (2010), "New anticoagulants", Circulation, 121, pp. 1523-1532. 21. Heng Jung Chen, Cheng-Nan Chen, Mao-Lin Sung (2013), "Canna indica L. attenuates high-glucose- and lipopolysaccharideinduced inflammatory mediators in monocyte/macrophage", J Ethnopharmacol, 148(1), pp. 317-321. 22. HM Van Beusekom, PW Serruys, WJ van der Giessen (1994), "Coronary stent coatings", Coron Artery Dis, 5(7), pp. 590-600. 23. Hoffbrand Victor (2002), Essential haematology, Wiley-Blackwell, pp. 248.
  50. 24. Indrayan A. K., Bhojak Narendar (2011), "Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oil from the rhizome of Canna indica Linn", Indian Journal of Chemistry, pp. 1136-1139. 25. JAVA clinical Research (2011), "Principles of platelet aggregation in clinical trials", pp. 26. Josephine O. Ofeimun, Josephine Owolabi Omonkhelin, Cosmos Oluyole Taye (2013), "Evaluation of the antidiarrhoea activity of the methanolic extract of Canna indica leaf (Cannaceae)", International journal of pharmaceutical and chemical sciences, 2(2), pp. 669-674. 27. Kamer Maas-van de, Maas P. J. M. (2008), "The Cannaceae of the World", Blumea Journal of Plant Taxonomy and Plant Geography, 53(2), pp. 247-318. 28. Karsten Schrör (2009), Acetylsalicylic Acid, Wiley - Blackwell, Weinheim. 29. Khoshoo T. N., Mukherjee IVA (1970), "Genetic-Evolutionary Studies on Cultivated Cannas", Theoretical and Applied Genetics 40, pp. 204- 217. 30. Krishnaswamy Amar, Lincoff A Michael, Cannon Christopher P (2010), "The use and limitation of unfractionated heparin", Crit Pathw Cardiol, 9(1), pp. 35-40. 31. Lau A. J., Ding F. T. et al (2009), "Antiplatelet and anticoagulant effects of Panax notoginseng: comparison of raw and steamed Panax notoginseng with Panax ginseng and Panax quinquefolium", Journal of ethnopharmacology 125(3), pp. 380-386. 32. Li C. et al (2013), "A comparative study on anticoagulant activities of three Chinese herbal medicines from the genus Panax and anticoagulant activities of ginsenosides Rg1 and Rg2", Pharmaceutical biology, 51(8), pp. 1077-1080. 33. Lin ZL, Bai'e Z (2011), "Hemostatic Effect of Canna Indica L.", Journal of Dali University, 10(12), pp. 24-26. 34. M. Cattaneo (2009), "Results of a Worldwide Survey on the Assessment of Platelet Function by Light Transmission Aggregometry: a Report from the Platelet Physiology Subcommittee of the Scientific and
  51. Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis", J Thromb Haemost, 7(6), pp. 1029. 35. Mahmoud Toka N., El-Maadawy Walaa H., Zeinab A. Kandil et al (2020), "Canna x generalis L.H. Bailey rhizome extract ameliorates dextran sulphate sodiuminduced colitis via modulating intestinal mucosal dysfunction, oxidative stress, inflammation, and TLR4/ NF-ҡB and NLRP3 inflammasome pathways", Journal of Ethnopharmacology, 269, pp. 1-56. 36. Matteo Nicola Dario Di Minno et al (2011), "Overcoming limitations of current antiplatelet drugs: A concerted effort for more profitable strategies of intervention", Annals of Medicine, 43(7), pp. 531-544. 37. Mukhtar H, Katiyar SK, Agarwal R (1994), "Green tea and skin- anticarcinogenic effects", J Invest Dermatol, 102(1), pp. 3-7. 38. Nguyen Thi Van Anh, Vu Thi Thom (2018), "Novel finding on anticoagulant activity of Canna warszewiczii extracts", Asian Journal of Pharmacognosy, 2(2), pp. 30-31. 39. Olas Beata, Brys Magdalena (2018), "Is it safe to use Acorus calamus as a source of promising bioactive compounds in prevention and treatment of cardiovascular diseases?", Chemico-Biological Interactions, 218, pp. 32-36. 40. Omar M. Atrooz (2007), "The incorporation effects of methanolic extracts of some plant seeds on the stability of phosphatidylcholine liposomes", Pakistan Journal of Biological Sciences, 10(10), pp. 1643- 1648. 41. Packham M. A., Rand M. L. (2011), "Historical perspective on ADP- induced platelet activation", Purinergic Signal, 7(4), pp. 283–292. 42. Previtali Emanuele, Bucciarelli Paolo, Passamonti Serena M., Martinelli Ida (2011), "Risk factors for venous and arterial thrombosis", Blood Transfus, 9(2), pp. 120-138. 43. Purintrapiban Juntipa, Suttajit Maitree, Neil E Forsberg (2006), "Differential activation of glucose transport in cultured muscle cells by polyphenolic compounds from Canna indica L. Root", Biol Pharm Bull, 29 (10), pp. 1995-1998.
  52. 44. Sjögren Bengt, Bigert Carolina, Gustavsson Per (2015), Handbook on the Toxicology of Metals, pp. 313-331. 45. Srivastava Jyoti, Padma S. Vankar (2010), "Canna indica flower: New source of anthocyanins. , 2010. 48(12): p. 1015-9.", Plant Physiol Biochem, 48(12), pp. 1015-1019. 46. Sunil A. Nirmal, Kolhe N.M. (2008), "Nonpolar compounds from Canna indica rhizomes.", 6(1), pp. 141-144. 47. Tanaka N. (2001), "Taxonomic revision of the family Cannaceae in the New World and Asia", Biology, pp. 1-74. 48. Tanmayee Mishra, Arvind K Goyal, Sushil K Middha (2011), "Antioxidative properties of Canna edulis Ker-Gawl", Indian Journal of Natural Products and Resources, 2(3), pp. 315-321. 49. Tinoi Jidapha, Rakariyatham Nuansri, Richard L. Deming (2006), "Determination of major carotenoid constituents in petal extracts of eight selected flowering plants in the north of Thailand", Changmai Journal of science, 33(2), pp. 327-334. 50. Tran Quoc Hung (2019), Investigation of phytochemicals and bioactivities of Canna plants, extraction and isolation of pure compounds from Canna warszewiczii, Intership report, Paris Descartes University. 51. Vu Thi Thom et al (2018), "Antithrombotic activity and saponin composition of the roots of Panax bipinnatifidus Seem. growing in Vietnam", Pharmacognosy Research, 10(4), pp. 333-338. 52. Walker H Kenneth, Hall W Dallas, Hurst J Willis (1990), Clinical Methods: The History, Physical, and Laboratory Examinations., Boston: Butterworths. 53. Weitz Jeffrey I., Eikelboom John W., Samama Meyer Michel (2012), "New antithrombotic drugs", Chest, 141(2 Suppl), pp. e120S-e151S. 54. World Health Organization (2008), Causes of death, Geneva. 55. World Health Organization (2011), Global Atlas on cardiovascular disease prevention and control, pp. 2-18.
  53. 56. Yadunath M. Joshi et al (2009), "Investigation of Hepatoprotective activity of Aerial Parts of Canna indica L. on carbon tetrachloride treated rats", Journal of Pharmacy Reasearch, 2(12), pp. 1879-1882. 57. Yun Young Sook, Satake Motoyoshi, Katsuki Shigeki (2004), "Phenylpropanoid derivatives from edible canna, Canna edulis", Phytochemistry, 65(14), pp. 2167-2171. 58. Zhang Juan, Wang Zheng-Wu, Mi Qin (2011), "Phenolic compounds from Canna edulis Ker residue and their antioxidant activity", LWT - Food science and technology, 44(10), pp. 2091-2096.