›

Khóa luận Nghiên cứu thành phần flavonoid glycoside từ lá cây đu đủ (Carica papaya)

pdf 50 trang thiennha21 15/04/2022 4410
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu thành phần flavonoid glycoside từ lá cây đu đủ (Carica papaya)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_nghien_cuu_thanh_phan_flavonoid_glycoside_tu_la_ca.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu thành phần flavonoid glycoside từ lá cây đu đủ (Carica papaya)

  1. TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HOÁ HỌC ==== NGUYỄN THỊ HUYỀN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN FLAVONOID GLYCOSIDE TỪ LÁ CÂY ĐU ĐỦ (CARICA PAPAYA) KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa hữu cơ HÀ NỘI - 2018
  2. TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HOÁ HỌC ==== NGUYỄN THỊ HUYỀN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN FLAVONOID GLYCOSIDE TỪ LÁ CÂY ĐU ĐỦ (CARICA PAPAYA) KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Ngƣời hƣớng dẫn khoa học PGS. TS. NGUYỄN VĂN BẰNG HÀ NỘI - 2018
  3. LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực hiện khóa luận này, em đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các quý thầy cô, anh chị và bạn bè. Cảm ơn các anh chị trong phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ và truyền đạt kiến thức, kiến thức trong suốt thời gian em thực tập. Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để em thực tập tại Viện. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn đến thầy giáo PGS.TS. Nguyễn Văn Bằng, người thầy đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Và các thầy cô giáo trong Khoa Hóa học- trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện giúp đỡ, dạy bảo em trong suốt 4 năm em học tập tại trường. Cảm ơn anh chị và bạn bè đã bên cạnh giúp đỡ em trong suốt thời gian vừa qua. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình em, những người thân luôn bên em, hết lòng ủng hộ em về cả tinh thần và vật chất trong suốt quá trình học tập. Cuối cùng em xin kính chúc các thầy cô trong Khoa Hóa học- trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, các thầy cô cùng các anh chị trong phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh biển- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam thật dồi dào sức khỏe và thành công trong công việc. Em xin chân thành cảm ơn! Sinh viên NGUYỄN THỊ HUYỀN
  4. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu, số liệu được trình bày trong khóa luận: “Nghiên cứu thành phần flavonoid glycoside từ lá cây đu đủ (Carica papaya)”. Dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Văn Bằng là hoàn toàn trung thực và không trùng với kết quả của tác giả khác. Sinh viên NGUYỄN THỊ HUYỀN
  5. MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1 Nghiên cứu tổng quan 3 1.1.1 Thực vật học 3 1.1.2 Phân bố và sinh thái 4 1.1.3 Tính vị và công dụng của cây đu đủ 4 1.1.4. Thành phần hóa học 5 1.1.5. Hoạt tính sinh học 6 1.2 Phương pháp chiết mẫu thực vật 9 1.2.1 Chọn dung môi chiết 9 1.2.2 Quá trình chiết 10 1.2.3 Các yếu tố ảnh ưởng tới quá trình chiết 11 1.3 Các phương pháp sắc kí trong quá trình phân lập các hợp chất hữu cơ 11 1.3.1 Đặc điểm chung phương pháp sắc kí 11 1.3.2 Cơ sở phương pháp sắc ký 12 1.3.3 Phân loại phương pháp sắc ký 12 1.4. Một số phương pháp hóa lí xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ 16 1.4.1. Phổ IR 16 1.4.2 Phổ khối lượng 17 1.4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 18 CHƢƠNG 2. MẪU THỰC VẬT VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. Mẫu thực vật 22 2.2. Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1. Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất 22
  6. 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất 22 2.3. Dụng cụ và thiết bị 24 2.3.1 Dụng cụ và thiết bị tách chiết 24 2.3.2 Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 24 2.4 Hóa chất 24 CHƢƠNG 3 : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 25 3.1. Phân lập các hợp chất từ lá đu đủ đực 25 3.2. Hằng số vật lý và dự kiện phổ các hợp chất 27 3.2.1. Hợp chất 1 (Quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside) 27 3.2.2. Hợp chất 2 (Quercetin-3- -L-arabinofuranoside) 28 CHƢƠNG 4: THẢO LUẬN KẾT QUẢ 29 4.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1 (Quercetin-3-O-α-L- rhamnopyranoside) 29 4.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2(Quercetin-3- -L- arabinofuranoside) 33 KẾT LUẬN 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39
  7. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ BẢNG BIỂU DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Các dạng sắc ký 13 Bảng 4.1: Số liệu phổ của hợp chất 1 32 Bảng 4.2: Số liệu phổ của hợp chất 2 36 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình ảnh của cây, hoa, quả cây Đu đủ 4 Hình 1.2: Flavan (2-phenyl chromen ) 8 Hình 1.3: Sambunigrin 9 Hình 1.4: Prunasin 9 Hình 3.1: Sơ đồ chiết các phân đoạn dịch chiết metahnol từ lá đu đủ 25 Hình 3.2: Sơ đồ phân lập phân đoạn cây Đu đủ 27 Hình 4.1.1:Phổ 1H của hợp chất 1 29 Hình 4.1.2 :Phổ 13C của hợp chất 1 30 Hình 4.1.3:Phổ 13C và DEPTcủa hợp chất 1 31 Hình 4.1.4: Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 34 Hình 4.2.1 :Phổ 1H của hợp chất 2 33 Hình 4.2.2: Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 34 Hình 4.2.3 :Phổ 13C của hợp chất 2 34 Hình 4.2.4: Phổ 2 chiều HSQC của hợp chất 2 35 Hình 4.2.5: Phổ 2 chiều HMBC của hợp chất 2 35 Hình 4.2.6 : Các tương tác HMBC chính (H C) của hợp chất 2 36
  8. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TÁT 13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13 Carbon-13NuclearMagneticResonance Spectroscopy 1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-1H COSY 1H-1H Chemical Shift Corelation Spectroscopy 2D-NMR Phổcộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Two-Dimensional NMR CC Sắc kí cột Column Chromatography DEPT Distortionless Enhancement By Polarization Transfer EI-MS Phổ khối lượng va chạm electron Electron Impact Mas Spectroscopy FAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh Fast Atom Bombardment MasSpectrometry HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivit HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence IR Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy ME Nhóm metyl MS Phổ khối lượng Mass Spectroscopy NOESY Nucler Overhauser Effect Spectroscopy TLC Sắc kí lớp mỏng Thin Layer Chromatography
  9. MỞ ĐẦU Việt Nam là quốc gia nằm ở vùng nhiệt đới, có điều kiện thuận lợi cho các sinh vật phát triển và tạo ra sự phong phú của nhiều loài động thực vật và nhiều hệ sinh thái khác nhau. Thiên nhiên thuận lợi là điều kiện cho sự phát triển đa dạng của hệ thực vật. Từ xưa đến nay, cây cỏ đã xuất hiện trong các bài thuốc dân gian và trong đời sống của con người. Việc nghiên cứu, tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên là nhiệm vụ quan trọng đã và đang được các nhà khoa học cả trong nước và thế giới quan tâm với mục đích phục vụ, đáp ứng nhu cầu về y tế, nông nghiệp và các mục đích khác nhau trong sinh hoạt của con người. Thiên nhiên là nguồn cung cấp các “bài thuốc” quý hiếm và là nơi lưu trữ các chất dẫn đường để tổng hợp những bài thuốc mới. Trong quá trình nghiên cứu các chất phân lập từ thiên nhiên, các nhà khoa học đã chế tạo ra những bài thuốc có khả năng phòng, chữa bệnh. Trong đó có cây đu đủ - Loại thực vật được sử dụng phổ biến có tác dụng chống oxi hóa, kích sữa, chữa tiêu chảy, giảm sưng do xuất huyết, là một dược liệu trong bài thuốc dân gian nên cần được nghiên cứu để giải thích tác dụng chữa bệnh của cây và tạo cơ sở để tìm kiếm phương thuốc điều trị bệnh. Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn nên tôi chọn đề tài cho khóa luận tốt nghiệp: “Nghiên cứu thành phần flavonoid glycoside từ lá cây đu đủ (Carica papaya)” Với mục đích nghiên cứu thành phần flavonoid glycoside từ lá cây đu đủ và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập. Từ đó tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm các bài thuốc mới cũng như giải thích được tác dụng chữa bệnh của các cây thuốc cổ truyền Việt Nam. 1
  10. Nhiệm vụ chính của đề tài là: 1. Thu mẫu lá cây đu đủ (Carica papaya), xử lý mẫu và tạo dịch chiết. 2. Phân lập một số hợp chất từ lá cây đu đủ (Carica papaya). 3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được. 2
  11. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Nghiên cứu tổng quan 1.1.1 Thực vật học Giới thiệu về thực vật học Tên thực vật: Carica papaya L. Tên thường gọi: Đu đủ Tên khác: Thù đủ, phiên mộc, cà lào, phiên qua, phan qua thụ, lô. Phân loại khoa học Chi Carica Họ Caricaceae hay Papayae Mô tả thực vật Đu đủ mọc thuộc loại thân mềm tự nhiên hằng năm. Cây nhỏ hoặc cây nhỡ, cao 2 - 4 m. Thân thẳng không phân nhánh, mang nhiều vết sẹo do cuống lá rụng để lại. Lá: to, mọc so le, tập trung ở ngọn, cướng rất dài, xẻ 5 - 7 thùy sâu, gốc hình tim, đầu nhọn, mỗi thùy lại chia tiếp thành những thùy nhỏ không đều, gân lá hình chân vịt, hai mặt nhẵn. Hoa: màu vàng lục nhạt, mọc ở kẽ lá; hoa đực và hoa cái cùng gốc hoặc khác gốc; cụm hoa đực dài, phân nhánh thành chùy xim, đài hợp có 5 răng ngắn, tràng 5 cánh hàn liền hình phễu, nhị xếp thành 2 vòng trên ống tràng, nhụy tiêu giảm; cụm hoa cái có 2 - 3 hoa, đài và tràng gồm những bộ phận hơi dính nhau ở gốc, không có nhị lép, bầu 1 ô, nhiều lá noãn. Quả: mọng to, hình trứng ngược hoặc thuôn dài, khi chín màu vàng đỏ; hạt nhiều màu đen. 3
  12. Hình 1.1: Hình ảnh của cây, hoa, quả cây Đu đủ 1.1.2 Phân bố và sinh thái Chi Đu đủ (Carica) có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới của Châu Mỹ, có lẽ từ vùng Nam Mexico và một số các nước láng giềng ở Trung Mỹ. Ở vùng núi cao (1500 - 3000 m), từ Panama đến Bolivia, có loài đu đủ mọc tự nhiên ( C. pubescens Linné & K. Koch) quả ăn được. Vào thế kỉ 16, người Tây Ba Nha đã đưa đu đủ vào trồng ở vùng Caribe và một số nước Đông Á. Từ các địa điểm này cây tiếp tục được trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Srilanca, châu Đại Dương và châu Phi. Đu đủ cần nhiệt độ ấm áp khoảng 25oC với lượng mưa 100mm/tháng. Cây trồng nơi đủ ánh sáng, không bị ngập úng, đất không nhiễm phèn. Đu đủ có khả năng trổ hoa và đậu trái quanh năm, tuy nhiên hạn chế sâu bệnh, có thể bố trí trồng đu đủ vào đầu mùa mưa (tháng 4- 5). Những vùng chủ động tưới tiêu trồng vào cuối mùa mưa (tháng 10-11). [11] 1.1.3 Tính vị và công dụng của cây đu đủ Tính vị: tính hàn, vị ngọt, mùi hơi hắc. Công dụng: Lá cây đu đủ: có tác dụng chữa tiêu chảy, giảm sưng do xuất huyết, phân hủy protein gluten và tiêu hóa tốt hơn, chống ung thư, loại bỏ cơn nghiện đường, loại bỏ mụn trứng cá, các bệnh liên quan đến tuyến tiền liệt, nhuận tràng, chống lão hóa. 4
  13. Quả cây đu đủ: có vị ngọt ,chống oxi hóa, giảm mỡ máu, tiêu hóa tốt, tăng cường đề kháng chống viêm nhiễm, kích thích sữa, tiêu đờm. Hạt đu đủ: chữa gai cột sống, hỗ trợ tiêu hóa, bảo vệ thận. Rễ đu đủ: chữa hôi chân. Nhựa đu đủ được dùng làm thuốc giun. Hoa đu đủ đực tươi hoặc phơi khô hấp với đường phèn dùng chữa bệnh ho, viêm cuống phổi, khàn tiếng hoặc mất tiếng ở người lớn,nhất là ở trẻ em. [32] 1.1.4. Thành phần hóa học Lá cây đu đủ chứa chứa khá nhiều hợp chất như: * Các enzym (enzymes): nhựa chứa khá nhiều enzym như papain, chymopapain, papaya glutamine cyclotransferase, glutaminyl-peptide-cyclo transferase, chitanase, papaya peptidase A và B, alpha-D-mannosidase và N- acetyl-beta-D-glucosaminidase. Quả chứa beta-galactosidase I, II và III, và1- amino cyclopropane-1-carboxylase (ACC) oxidase, phenol-D- glucosyltransferase. *Carotenoid: Trong đu đủ chín có 19 loại carotenoid chủ yếu là cryptoxanthin (48%), beta caroten (30%), và cryptoflavin (13%), violaxanthin và zeanxanthin. * Ankaloid: Lá chứa carpinin và carpain; ruột thân có pseudo carpain. * Monoterpenoid: Quả chứa 4-terpineol, linalool và linalool oxid. * Flavonoid: Chồi non chứa quercetin, mycicetin và kaempferol. * Các khoáng chất và vitamin: calcium,sắt, magiê, phốt pho, kali, natri, kém, đồng, mangan, thiamine (B1), beta caroten ( tiền vitamin A), riboflavine (B2), niacin (B3), pantothenic Acid (B5), ascorbic Acid , vitamin E, riêng chồi còn có alpha tocopherol * Glucositolat: Trong hạt có benzyl isothiocyanat. 5
  14. * Dầu béo của hạt chín chứa 16,97% acid béo bão hòa (gồm 11,38% palmitic, 5,25% stearic, 0,31% arachidic) và 78,63% acid béo chưa bão hòa ( 76,5% oleic và 2,13% linoleic).[28] 1.1.5. Hoạt tính sinh học Các phương pháp nghiên cứu về hoạt tính sinh học, dược lý của thực vậy được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm [2, 3, 16, 27]. Hoạt tính sinh học của các bộ phận của cấy đu đủ như lá, quả, nhựa được các nhà khoa học trên thế giới công bố khá phong phú. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung (2006) công bố nghiên cứu cao lá đu đủ có tác dụng kháng khuẩn đối với Typhimurium mentagrophytes, T. rubrum và Staphylococcus aureus. Cao chiết từ vỏ và hạt có tác dụng kháng khuẩn đối với Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Shigella flexneri. Benzyl isothiocyanate phân lập từ đu đủ, ức chế sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn gram dương, gram âm như Escherichia coli, Penicillium notatum và Shigella. Rễ đu đủ có tác dụng kháng khuẩn yếu [1]. Năm 2014, Hồ Thị Hà đã chứng minh hợp chất pseudocarpaine có khả năng kháng vi khuẩn gram dương Staphylococcus aureus với IC50 = 80 µg/ml, không thể hiện hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn gram dương, gram âm và nấm khác ở nồng độ chất thử cao nhất là 128 µg/ml (với IC50 > 128 µg/ml) [5]. Năm 2001, Tác giả Phạm Kim Mãn và cộng sự đã chứng minh cao chiết với cồn từ lá đu đủ có tác dụng ức chế sự phát triển u báng gây bởi tế bào ung thư Sarcoma TG -180 ở chuột nhắt trắng. Làm giảm thể tích u, giảm mật độ tế bào ung thư, giảm sự tăng sinh khối u [8]. Theo Đỗ Thị Thảo (năm 2006), cặn chiết methanol của lá đu đủ chỉ có tác dụng gây độc tế bào ung thư phổi LU với IC50 = 19,2 μg/ml, và không có 6
  15. tác dụng gây độc các dòng tế bào ung thư khác như ung thư biểu mô KB, ung thư vú MCF-7, ung thư máu cấp tính HL-60, ung thư tiền liệt tuyến LNCaP, ung thư gan Hepa1c1c7. Đồng thời cặn chiết methanol cũng không gây độc với tế bào gốc tách từ phôi chuột [12]. Năm 2014, Hồ Thị Hà đã xác định được phân đoạn cặn chiết CH2Cl2 của lá đu đủ có khả năng gây độc tế bào ung thư biểu mô KB (IC50 = 18,44 µg/ml), ung thư phổi LU-1 (IC50 = 18,21 µg/ml) và ung thư vú MCF-7 (IC50 = 19,16 µg/ml). Đồng thời hai hợp chất carpaine và pseudocarpaine phân lập từ cặn CH2Cl2 của lá đu đủ lần đầu tiên được chứng minh có hoạt tính gây độc mạnh trên cả bốn dòng tế bào ung thư người: ung thư biểu mô KB, ung thư máu HL-60, ung thư phổi LU-1, ung thư vú MCF-7 (IC50 từ 1,13 đến 3,49 µg/ml) [5]. Ngoài những hoạt tính sinh học trên, các bộ phận khác nhau của cây đu đủ cũng đã được chứng minh có tác dụng như kháng virus sốt xuất huyết, tác dụng giảm thời gian đông máu, kháng viêm Năm 2008, Bamidele V và cộng sự đã công bố hoạt tính kháng viêm của dịch chiết cồn từ lá cây đu đủ [19]. Năm 2014, Hồ Thị Hà lần đầu tiên được chứng minh khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hai hợp chất carpaine và pseudocarpaine (tương ứng là 386,5 và 778 RFU) ở nồng độ thử nghiệm cao nhất (tương ứng 20 và 30 µg/ml) nhưng không mạnh khi so với chất đối chứng là tamoxifen (là 3100 RFU ở nồng độ thử 20 µg/ml) [5]. Lá đu đủ được sử dụng làm mền thịt khi nấu. Nhận xét chung: Như vậy, hoạt tính dược lý và thành phần hóa học của cây đu đủ đã được nghiên cứu. Tuy nhiên các công trình nghiên cứu chủ yếu là lá và quả đu đủ, các công trình nghiên cứu hoa đu đủ đực hầu như chưa công bố. 7
  16. 1.1.5.1. Các hợp chất Flavonoids Flavonoid xuất hiện cách đây 280 triệu năm ở hai loại tảo, vòng. Sự tiến hóa của Flavonoid liên quan đến quá trình yiến hóa của thực vật. Từ các loài có gỗ sơ khai đến các laoì cây bụi dẫ phát triển dẫn đến 3 sự thay đổi quan trọng về mặt cấu trức của Flavonoid: - Sự biến mất Proantoxianidin trong lá. - Sự biến mất 3 nhóm OH ở vòng benzen. - Sự thay thế Flavonol (Quercetin) bởi Flavon (Luteonin). Flavonoid là một nhóm hợp chất poliphenol, đa dạng về cấu trúc hóa học và tác dụng sinh học. Chúng có mặt hầu hết ở các bộ phận của cây, đặc biệt trong các tế bào thực vật, là hợp chất được cấu tạo gồm hai vòng benzen A,B được kết nối bởi một dị vòng C với khung cacbon C6-C3-C6. Tại các vòng có đính một hay nhiều nhóm hydroxy tự do hay đã thay thế một phần. Vì vậy về bản chất chúng là các poliphenol có tính axit. Các polipphenol có thể phản ứng lẫn nhau qua các nhóm hydrõy để tạo thành các phân tử ohức tạp hơn hay có thể liên kết với các hợp chất khác có trong cây như các Oza (dạng glycozit) hay protein. Các flavonoid là các dẫn xuất của 2-phenyl chromen (flavan). 3’ 2’ B 4’ A 8 1’ 9 5’ 7 2 6’ 6 10 3 5 4 C Hình 1.2: Flavan (2-phenyl chromen) 8
  17. 1.1.5.2 Hợp chất glycoside Năm 2002, David và cộng sự đã xác định được glycosid là prunasin và sambunigrin trong lá và thân đu đủ [21]. Hình 1.3: Sambunigrin Hình 1.4: Prunasin 1.2 Phƣơng pháp chiết mẫu thực vật Sau khi tiến hành thu hái và xử lý làm khô mẫu, tùy thuộc vào các chất có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân cực trung bình, ) để người ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau. 1.2.1 Chọn dung môi chiết Dung môi để chiết phải đảm bảo các yêu cầu sau: - Không hòa lẫn với dung môi cũ (thường dùng là nước), nghĩa là có tỉ khối khác nhiều so với dung môi cũ. - Dung môi này phải không tương tác hóa học với chất được chiết và có nhiệt độ sôi tương đối thấp. Các dung môi hay được sử dụng - Những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây (lá, thân, rễ, hoa, quả, củ ) chủ yếu là clorofoc, metylen clorit và methanol. - Người ta sử dụng dung dịch nước của methanol thay vì dùng nước để chiết dịch thô từ cây. - Dietylete hiếm khi được dùng cho quá trình chiết thực vật vì nó rất dễ bay hơi, dễ bốc cháy và độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit dễ 9
  18. nổ. Peroxit của dietylete dễ gây phản ứng oxi hóa với những hợp chất không có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid. - Axeton có thể tạo thành axetonit nếu 1,2- cis- diol có mặt trong môi trường axit. Quá chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lí các dịch chiết bằng axit, bazơ để tạo ra những sản phẩm mong muốn. Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 30 - 40ºC với một vài hóa chất chịu nhiệt để có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn. 1.2.2 Quá trình chiết Các quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau: - Chiết ngâm - Chiết sử dụng bình chiết Xoclet - Chiết sắc với dung môi nước - Chiết lôi cuốn theo hơi nước Chiết ngâm được sử dụng rộng rãi. Thông thường bình chiết ngâm không sử dụng như phương pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong bình chiết khoảng 24 giờ sau đó mới lấy chất chiết ra. Cần lưu ý, sau một quá trình chiết 3 lần dung môi, cặn thu được sẽ không chứa những chất giá trị nữa. Việc kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một số cách như sau: Ví dụ: - Với các ankaloit, có thể kiểm tra sự xuất hiện của các loại hợp chất này bằng phản ứng tạo kết tủa với các tác nhân đặc trưng như: Dragendorff, Mayer, - Với các flavonoid thường là những hợp chất màu nên khi dịch chảy ra mà không có màu có nghĩa là đã rửa hết chất này trong quá trình chiết. 10
  19. - Với các chất béo, nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự xuất hiện của cặn tiếp sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết. - Với các lacton của sesquitecpen và các glicozit trợ tim, phản ứng kedde có thể sử dụng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc sử dụng phản ứng với aniline axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hidrat cacbon. Từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc. Như vậy, tùy thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi phù hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lí để đạt hiệu quả cao. 1.2.3 Các yếu tố ảnh ưởng tới quá trình chiết - Ảnh hưởng của pH - Vai trò của sựu tạo phức. - Ảnh hưởng của sự tạo rhành hợp chất ít tan. 1.3 Các phương pháp sắc kí trong quá trình phân lập các hợp chất hữu cơ Sắc ký là phương pháp phổ biến được sử dụng rất trong việc phân lập các hợp chât hữu cơ nói chung hay hợp chât thiên nhiên nói riêng. 1.3.1 Đặc điểm chung phương pháp sắc kí Sắc ký là kĩ thuật phân tích chất khai thác sự khác biệt trong phân bố giữa pha động và pha tĩnh để tách các thành phần trong hỗn hợp. Các thành phần của hỗn hợp có thể tương tác với pha tĩnh dựa trên điện tích, độ tan tương đối và tính hấp phụ. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan, ). Trong hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ thống sắc ký. Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ. 11
  20. Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn pha này. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký. 1.3.2 Cơ sở phương pháp sắc ký Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha động và tĩnh. Có nhiều nguyên nhân đưa đến sự phân bố khác nhau của các chất, nhưng chính sự lặp đi lặp lại hiện tượng hấp phụ - phản hấp phụ của các chất khi dòng pha động chuyển động qua pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của việc tách sắc ký. Ta có định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh có nồng độ n1∞ (nồng độ của dung dịch) khi nhiệt độ không đổi N∞ .b.C n = 1+b.C n: Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh. N∞: Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên chất hấp phụ nào đó. b: Hằng số. C: Nồng độ của chất bị hấp phụ. 1.3.3 Phân loại phương pháp sắc ký Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc khí thành hai nhóm lớn: sắc ký khí và sắc ký lỏng. Dựa vào cách tiến hành sắc ký, người ta chia thành các phương pháp sau: 12
  21. Bảng 1.1: Các dạng sắc ký Dạng sắc ký Pha động Pha tĩnh Các bố trí Cơ chế trao pha tĩnh đổi chất Khí Khí - Hấp phụ Khí Rắn Cột Hấp phụ Khí - Lỏng Khí Lỏng Cột Phân bố Lỏng Lỏng - Rắn Lỏng Rắn Cột Hấp phụ Lỏng - Lỏng Lỏng Lỏng Cột Phân bố Lỏng - Nhựa Lỏng Rắn Cột Trao đổi ion trao đổi Lớp mỏng Lỏng Rắn Lớp mỏng Hấp phụ Giấy Lỏng Lỏng Giấy sắc ký Phân bố Rây phân tử Lỏng Lỏng Cột Theo kích ( Sắc ký gel) thước phân tử 1.3.3.1 Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography - TLC) là một kĩ thuật sắc ký được dùng để tách các chất trong hỗn hợp. Phương pháp sắc ký lớp mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp phụ, thường là silica gel, aluminium oxit, hoặc cellulose được phủ trên một mặt phẳng chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc ký bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch. Một vệt nhỏ dung dịch chứa mẫu thử được thấm lên bản sắc ký, khoảng 1 cm từ dưới lên. Bản sắc ký sau đó được nhúng vào một dung môi thích hợp, như ethanol hoặc nước, và được đặt vào trong một vật chứa có nắp. Dung môi 13
  22. di chuyển lên bản sắc ký bởi mao dẫn, gặp phải mẫu thử và dịch chuyển mẫu thử lên bản sắc ký. Các hợp chất khác nhau trong hỗn hợp mẫu thử dịch chuyển với tốc độ khác nhau do chúng có sức hút khác nhau đối với pha tĩnh, và độ tan khác nhau trong dung môi. Có thể phát hiện chất trên bảng mỏng bằng đèn tử ngoại, bằn chất hiện màu đặc trưng cho tùng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%. Các hợp chất được tách ra dựa trên sự cạnh tranh của chất tan và pha động để có được chỗ liên kết với pha tĩnh Sắc ký lớp mỏng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: - Xét nghiệm độ tinh khiết của các hóa chất phóng xạ trong dược khoa - Xác định các sắc tố trong tế bào thực vật - Phát hiện thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng trong thức ăn, hoặc - Nhận biết những hóa chất trong một chất cho sẵn - Giám sát các phản ứng hữu cơ 1.3.3.2 Sắc ký cột Đây là phương pháp sắc ký được sử dụng nhiều nhất. Sắc ký côt là phương pháp sắc ký mà pha tĩnh được nhồi trong một cột hình trụ hở 2 đầu hoặc được tráng trong lòng một mao quản có đường kính trong rất hẹp. Theo nghĩa rộng, sắc ký cột bao gồm cả sắc ký cột cổ điển dùng trong điều chế các chất và sắc ký cột hiện đại thường dùng trong phân tích như HPLC, GC Ở đây chỉ trình bày các kỹ thuật sắc ký cột cổ điển. Với kích thước cột lớn, sắc ký cột cổ điển chủ yếu được dùng trong việc chiết tách và phân lập các chất. Trong sắc ký cột cổ điển, người ta thường dùng các cột thủy tinh đường kính 1 - 5cm dài 30 - 100cm để nhồi pha tĩnh. Chất nhồi cột có kích thước từ 15 - 300µm. Kích thước hạt càng lớn, dung môi qua cột càng dễ dàng nhưng hiệu năng tách kém. Với vật liệu nhồi cột là Silica gel dùng cho sắc ký cột, người ta 14
  23. thường phân ra làm 3 loại là loại mịn (15 - 40µm), loại vừa (40 - 63µm) và loại thô (63 - 200µm). Lượng mẫu nạp lên cột thay đổi tùy theo tính chất phức tạp của mẫu và khả năng tách của hệ thống. Tỉ lệ mẫu / pha tĩnh thường là 1/30 - 1/100 hay hơn. Trong 1 vài kỹ thuật, tỉ lệ này có thể tăng tới 1/10. Cột sẽ được triển khai bằng dung môi thích hợp. Dung môi có các chất được tách ra sẽ đi ra khỏi cột và được hứng thành từng phân đoạn, bằng tay hay bằng bộ phận hứng phân đoạn. Các phân đoạn được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng và những phân đoạn giống nhau được gộp chung, loại dung môi để thu được chất tinh khiết. Trong trường hợp sắc ký cột khô hay cột ngược, các băng chất được tách ra không được rửa giải ra khỏi cột mà được cắt thành các “khoang” và giải hấp bằng dung môi để thu các chất. Trong sắc ký cột cổ điển, áp lực đẩy dòng dung môi qua cột là áp suất thủy tĩnh. Với cột dài và chất nhồi cột mịn, tốc độ dòng dung môi giảm có thể ảnh hưởng tới kết quả sắc ký do hiện tượng khuyếch tán. Thời gian khai triển cũng rất dài, có khi là nhiều ngày hay hơn. Để khắc phục phần nào nhược điểm này, một số kỹ thuật sắc ký cột cải tiến đã được sử dụng giúp giảm thời gian phân tách. Tuy nhiên, hiệu lực tách của cột cũng có thể giảm. Khi ấy người ta thường thu các phân đoạn đơn giản để tiếp tục phân tách trên các cột sắc ký khác. Hai kỹ thuật hay sử dụng là sắc ký cột nhanh (flash chromatography, FC) và sắc ký cột chân không (vacuum liquid chromatography, VLC). Cả hai đều sử dụng cột ngắn và đường kính lớn để tăng tốc độ dòng và tăng lượng mẫu. FC sử dụng áp suất dương thấp trên đầu cột còn VLC sử dụng áp suất âm ở cuối cột. Việc nhồi cột bằng chất hấp phụ cũng hết sức quan trọng, có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột: + Nhồi cột khô: Chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm gõ nhẹ lên thành cột để chấp hấp phụ sắp xếp chặt trong cột. Tiếp theo, dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt. 15
  24. + Nhồi cột ướt: Chất hấp phụ được hòa tan trong dung môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu. Sau đó đưa dần vào cột đến khi đủ lượng cần thiết. Lưu ý: Khi nhồi cột không được có bọt khí bên trong. Vì nếu có bọt khí sẽ gây nên hiện tượng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách. Tốc độ chảy của dung môi phải đảm bảo liên tục và vừa phải. Nếu tốc độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Còn nếu tốc độ dòng chảy quá thấp sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc.  Ưu điểm: - Chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích - Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng điều kiện phân tích. - Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng. 1.4. Một số phương pháp hóa lí xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ 1.4.1. Phổ IR Phương pháp phân tích theo phổ hồng ngoại là một trong những kĩ thuật phân tích rất hiệu quả. Kĩ thuật này dựa trên hiệu ứng đơn giản là: các hợp chất hóa học có khả năng hấp thụ chọn lọc bức xạ hồng ngoại. Sau khi hấp thụ các bức xạ hồng ngoại, các phân tử của các hợp chất hóa học dao động với nhiều vận tốc dao động và xuất hiện dải phổ hấp thụ gọi là phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại. Các đám phổ khác nhau có mặt trong phổ hồng ngoại tương ứng với các nhóm chức đặc trưng và các liên kết có trong phân tử hợp chất hóa học. Ví dụ: dao động hóa trị của nhóm cacbonyl C=O trong andehyt/xeton là 1650 - 1800 cm-1, trong anhydrit là 1750 - 1870 cm-1; nhóm C=C của anken là 1600 16
  25. - 1650 cm-1; nhóm C≡C của ankin là 3150 cm-1; nhóm OH tự do trong các hydroxyl là 2500 - 3500 cm-1; nhom C-O-C là 1150 - 1250 cm-1. Bởi vậy phổ hồng ngoại của một hợp chất hóa học coi như “ dấu vân tay’’, có thể căn cứ vào đó để nhận dạng chúng. Hiện nay, thông tin chung thu được từ phổ hồng ngoại không nhiều, lượng chất cần cho phép đo là 2-3 mg và khó thu hồi lại. Do đó, với lượng chất thu được ít từ các hợp chất thiên nhiên thì phổ hồng ngoại thường được đo sau khi hoàn chỉnh các phép đo khác. 1.4.2 Phổ khối lượng Cơ sở của phương pháp phổ khổi lượng đối với các hợp chất hữu cơ là sự bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích dương hoặc phá vỡ thành các mảnh ion, các gốc bằng các phần tử mang năng lượng cao. Sau đó, phân tách các ion này theo số khối và ghi nhận thu được phổ khối lượng. Dựa vào phổ khối này có thể xác định được phân tử khối và cấu tạo phân tử của chất nghiên cứu. Khi ion hóa mẫu theo các phương pháp khác nhau sẽ thu được các phổ khối lượng các nhau. Một số phương pháp thường được sử dụng:  Phổ EI - MS (Electron Impact Ionization mass spectroscopy) phương pháp va chạm electron. Sử dụng chùm electron để “bắn phá’’ phân tử mẫu ở trạng thái hơi. Electron va chạm với các phân tử trung hòa làm bật ra electron và phá vỡ phân tử thành các mảnh ion, mảnh gốc hay phân tử trung hòa nhỏ. Điều kiện chuẩn để thực hiện EI là 70 eV.  Phổ ESI - MS (Electron Sprayt Ionization mass spectroscopy) phổ phun điện tử. Phổ này thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều phổ EI - MS. Dung dịch mẫu sẽ được phun thành những hạt nhỏ vào một buồng chân không dưới điện trường. Các giọt dung dịch bị tích điện và bay hơi dung môi sẽ vỡ giọt thành các hạt nhỏ hơn và cuối cùng thành các ion. 17
  26. Các phân tử bị “vỡ’’ nhẹ nhàng hơn tạo ra ít mảnh phân tử và có cường độ lớn hơn. Phổ thu được chủ yếu là các pic ion phân tử và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp.  Phổ FAB - MS (Fast Atom Bombing mass spectroscopy) phương pháp bắn phá nhanh bằng nguyên tử ở năng lượng thấp, do đó phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử.  Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution mass spectroscopy) cũng cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao. Ngoài ra, hiện nay còn sử dụng các phương pháp sắc kí kết hợp với khối phổ như: GC - MS (sắc kí khí - khối phổ) dùng cho các chất dễ bay hơi như tinh dầu trên cơ sở ghép máy sắc ký khí với máy phổ khối lượng, toàn bồ hệ thống GC - MS được nối với máy tính để tự động điều khiển hoạt động của hệ, lưu trữ và xử lí số liệu; LC - MS (sắc kí lỏng - khối phổ) cho các hợp chất khác. Các phương pháp này rất hiệu quả khi phân tích thành phần hỗn hợp chất. 1.4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp vật lí hiện đại nghiên cứu cấu tạo của các hợp chất hữu cơ. Phương pháp NMR nghiên cứu cấu trúc phân tử dựa vào sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hóa học. Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling). Các hạt nhân này là một phần của nguyên tử và các nguyên tử lại tập hợp thành phân tử. Vì vậy, phổ NMR có thể cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc phân tử mà khó có phương pháp nào có thể nhận biết được. Có nhiều hạt nhân có thể nghiên cứu bằng NMR, song Hidro và Cacbon là phổ biến nhất. Có nhiều kĩ thuật xác định NMR khác nhau được áp dụng nhưng mỗi kĩ thuật dùng để xác định những đặc tính cộng hưởng từ nhất định của hạt nhân. 18
  27. Tùy vào mục đích và mức độ phức tạp của cấu trúc người ta có thể đo một hay nhiều loại phổ khác nhau. Người ta có thể xác định phổ của cùng một loại hạt nhân (1H và 13C) trong các phổ một chiều (1H - NMR, 13C - NMR, DEPT), hay trong các mối tương quan giữa các loại hạt nhân trong các phổ hai chiều (COSY, HETCOR, Long - range HETCOR, NOESY)  Phổ 1H - NMR: Phổ 1H-NMR cho biết môi trường hóa học của proton trong phân tử. Các proton có môi trường hóa học khác nhau sẽ có độ dịch chuyển khác nhau. Ví dụ: các proton liên kết với cacbon thơm hay liên hợp thường chuyển dịch trong vùng 6-8 ppm; các proton trong ankan thường chuyển dịch trong vùng 0-2 ppm Trong phổ 1H-NMR độ dịch chuyển hóa học (δ) của các proton được xác định trong thang ppm từ 0 ppm đến 14 ppm tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phân tử. Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hóa học cũng như tương tác spin coupling mà người ta có thể xác định được cấu trúc hóa học của hợp chất.  Phổ 13C-NMR: Phổ 13C-NMR cung cấp các thông tin về môi trường hóa học của cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau. Ví dụ: cacbon lai hóa sp3 không liên kết với dị tố chuyển dịch trong khoảng 0-60 ppm; cacbon liên kết với oxi (alcol, ether) chuyển dịch trong khoảng 45-85 ppm. Thang đo cho phổ 13C-NMR cũng được tính bằng ppm và với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ 0 ppm đến 240 ppm).  Phổ DEPT: Phổ này cho ta những tín hiệu phổ phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên phổ DEPT, tín hiệu của cacbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu phổ của CH, 0 CH3 nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 135 . Còn ở trên phổ DEPT 900 thì chỉ xuất hiện tín hiệu của các CH. 19
  28.  Phổ 2D - NMR Đây là các kĩ thuật phổ cho phép xác định tương tác của của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kĩ thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau: Phổ 1H - 1H COSY (HOMOCOSY) (1H - 1H Chemical Shif Correlation Spectroscopy): đây là loại phổ cho biết mối tương quan giữa proton - proton với nhau như: proton gem (geminal, hai proton cùng gắn trên một cacbon); proton vic (vicinal, hai proton gắn trên hai cacbon kề nhau). Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau. Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence): kĩ thuật này sử dụng ngược lại với phổ HETCOR. Phổ HSQC khảo sát hạt nhân 1H trục hoành ghép cặp với 13C trục tung. Các tín hiệu trên phổ cũng như cách giải phổ tương tự phổ HETCOR. Các tương tác trực tiếp H - C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này. Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): đây là phổ biểu diễn tương tác xa của H và C trong phân tử. Được dùng để xác định các proton nhằm vào các tín hiệu tương tác qua hai và ba nối không xuất hiện tín hiệu qua một nối. Phổ giúp gián tiếp biết được các khung sườn các cacbon thông qua các tương tác proton. Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): biểu diễn các tương tác xa của các proton trong không gian chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Ngoài ra người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE defferences để xác định cấu trúc không gian của phân tử. Kỹ thuật này được tiến hành bằng việc đưa vào một xung đúng bằng từ trưởng cộng hưởng của một proton xác định, khi đó, các proton có cùng phía về không gian cũng như gần nhau về không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và có tín hiệu phổ có cường độ mạnh hơn. 20
  29. Như đã đề cập ở trên, để xác định chính xác cấu trúc hóa học của các hợp chất người ta cần sử dụng các phương pháp phổ kết hợp với các phương pháp chuyển hóa hóa học, so sánh, phân tích, Các phân tử càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp càng cao. Đặc biệt đối với các phân tử nhiều mạch nhánh dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều, khó xác định được chiều dài các mạch hay đối với phân tử có các đơn vị đường thì để xác định chính xác loại đường cần sử dụng phương pháp so sánh GC - MS (sắc kí khí - khối phổ) dùng cho các chất dễ bay hơi 21
  30. CHƢƠNG 2. MẪU THỰC VẬT VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mẫu thực vật Mẫu lá đu đủ ( Carica papaya L.) thu hái tại Lập Thạch, Vĩnh Phúc vào tháng 8/2017 và phơi khô, sau đó sấy bằng tủ sấy ở nhiệt độ 500C và được nghiền nhỏ thành bột thu được 2,5 kg bột khô. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất Để phân tích và phân tách các phần chiết của cây cũng như phân lập các hợp chất, các phương pháp sắc ký đã được sử dụng như: sắc ký lớp mỏng (TLC, dùng để khảo sát), sắc ký cột thường (CC), sắc ký cột pha đảo. Sắc ký lớp mỏng (TLC): Thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC- Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck); phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi làm nóng dần dần đến khi hiện màu. Sắc ký cột (CC): được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha đảo và pha thường. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040 - 0,063 mm (240 - 430 mesh). Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30 - 50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.). 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất Cấu trúc hóa học của các hoạt chất được xác định bằng các phương pháp phổ kết hợp như phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ tử ngoại (UV) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR). Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được ghi trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer của Viện Hoá học, 22
  31. Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chất nội chuẩn là TMS (Tetrametyl Silan) Phổ 1H-NMR: Trong phổ 1H-NMR, độ dịch chuyển hóa học (δ) của các proton được xác đinh trong thang ppm từ 0 ppm đến 14 ppm tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phân tử. Mỗi loại proton cộng hưởng ở một trường khác nhau và vì vậy chúng được biểu diễn bằng một độ dịch chuyển hóa học khác nhau. Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hóa học cũng như tương tác spin coupling mà người ta có thể xác định được cấu trúc hóa học của hợp chất. Phổ 13C-NMR: Phổ này cho tín hiệu vạch phổ của cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo cho phổ 13C-NMR cũng được tính bằng ppm và với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ o ppm đến 240 ppm). Phổ DEPT: Phổ này cho ta những tín hiệu phổ phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên các phổ DEPT, tín hiệu của cacbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu phổ của CH và CH3 nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 1350. Còn trên phổ DEPT 900 thì chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của các CH. Phổ C: Đây là phổ biểu diễn các tương tác xa của H và C trong phân tử. Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc. Phổ ES : Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa vào kết quả phổ này, có thể xác định được cấu trúc không gian của phân tử. Độ quay cực đo trên máy JASCO DIP -1000 KUY polarimeter. 23
  32. 2.3. Dụng cụ và thiết bị 2.3.1 Dụng cụ và thiết bị tách chiết Các dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch được sử dụng bao gồm: + Máy cô quay chân không + Bình chiết 30 lít + Phễu chiết 2 lít + Đèn từ ngoại với 2 bước sóng 254nm và 368nm + Tủ sấy chân không + Máy sấy + Micropipet + Bình sắc ký loại phân tích và điều chế + Dung dịch thuốc thử + Bếp điện + Cột sắc ký pha thường và pha ngược các loại đường kính 2.3.2 Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc hóa học của hợp chất Máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR AM500 FT-NMR spectromecter. 2.4 Hóa chất + Silica gel 60 (0,04 - 0.063 nm) Merck. + Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC RP18 (150 µm, FuJisilisa Chemical Ldt). +Bản mỏng tráng sẵn pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1.05715). + Bản mỏng tráng sẵn pha ngược RP18 F254s (Merck). + Bản mỏng điều chế pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck). + Các loại dung môi hữu cơ như metanol, etanol, etyl axetate, clorofo, hexan, axetone, v.v 24
  33. CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. Phân lập các hợp chất từ lá đu đủ đực Mẫu lá Đu đủ đực được nghiền thành bột (2,5 kg) được chiết bằng metanol (3 5 lít) kết hợp sử dụng thiết bị chiết siêu âm (50oC, 30 p). Dịch chiết được lọc qua giấy lọc, gom lại và loại bỏ dung môi thu được 152,0 g cao chiết metanol. Cao chiết này được hòa vào 1 lít nước cất và tiến hành chiết phân bố với dung môi n-hexan (3x1 lít), diclometan (3x1 lít) và etyl axetat (3x1 lít) Các dịch chiết này được cất để loại bỏ dung môi thu được các cặn dịch tương ứng n-hexan (50 g), diclometan ( 22 g), etyl axetat (30 g) và phân đoạn nước (18.0 g). Cặn MeOH (152 g) n- Hexan: nước 3/1 Lớp nước Bổ sung CHCl3 Cặn n-Hexan (50 g) CH2Cl2: nước 3/1 Lớp nước Cặn CH2Cl2 (22 g) EtOAc: nước 3/1 Lớp nước Cặn EtOAc (30 g) Lớp nước (18 g) Hình 3.1: Sơ đồ chiết các phân đoạn dịch chiết metahnol từ lá đu đủ Phần cặn etyl axetat (30 g) đưa qua sắc ký cột sillica gel rửa giải bằng hệ dung môi diclometan/metanol với độ phân cực tăng dần (diclometan/metanol, 25
  34. 50/1, 25/1, 10/1, 5/1, 1/1 v/v) thu được 5 phân đoạn tương ứng là CP-E1 (3,0 g); CP-E2 (5,2 g); CP-E3 (4,8 g); CP-E4 (6,1 g) và CP-E5 (8,2 g) Phân đoạn CP-E1 (3,0 g) được phân tách bằng cột silica gel pha đảo, rửa giải bằng hỗn hợp metanol/nước (3/2, v/v) thu được hợp chất CP1 (10 mg). Phân đoạn CP-E2 (5,2 g) được phân tách bằng cột silica gel pha đảo, rửa giải bằng hỗn hợp metanol/nước (1.3/1, v/v) thu được phân đoạn CP-E2A (30 mg) và CP-E2B (410 mg). Hợp chất CP2 (12 mg) được phân tách trên cột sephadex LH-20 với hệ dung môi rửa giải (metanol/nước: 1/1, v/v) từ phân đoạn CP-E2A (30 mg). 26
  35. Cặn etyl axetat (30 g) Sắc ký cột pha thường điclometan/metanol ( 0% đến 100% methanol) CP-E1 CP-E2 CP-E3 CP-E4 CP-E5 ( 3 g) (5,2 g) (4,8 g) (6,1 g) (8,2 g) Sắc ký cột pha đảo Sắc ký cột pha đảo Metanol/nước(3/2.v/v) Metanol/nước(1.3/1.v/v) Hợp chất 1 CP1 (10 mg) CP-E2A CP-E2B (30 mg) (410 mg) Sắc ký cột sephadex LH-20 Metanol/nước(1/1.v/v) Hợp chất 2 CP2 (12 mg) Hình 3.2: Sơ đồ phân lập phân đoạn cây Đu đủ 27
  36. 3.2. Hằng số vật lý và dự kiện phổ các hợp chất 3.2.1. Hợp chất 1 (Quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside) - Công thức phân tử: C21H20O11. - Khối lượng phân tử: 448.38 - Phổ proton 1H-NMR δH (500 MHz, DMSOd6; ppm): 6.20, d (J = 2.0 Hz, H-6); 6.41, d (J = 2.0 Hz, H-8); 7.48, sl (H-2’); 6.87, d (J = 8.4 Hz, H-5’); 7.25, dl (J = 8.4 Hz, H-6’ ); 5.24, sl (H-1’’); 0.81, d (J = 6.15 Hz, H-6’’); 12.62, s (5-OH).data: m/z 447.0937 (±2.2 ppm); - Phổ cacbon 13C-NMR δC (125 MHz, DMSO-d6; ppm): 157.0; 134.8; 178.2; 161.4; 99.2; 164.4; 94.3; 157.9; 104.6; 121.3; 116.1; 145.4; 148.7; 116.2; 121.8; 102.1 (C-1’’); 70.7 (C-2’’); 71.1 (C-3’’); 71.5 (C-4’’); 70.4 (C-5’’); 17.9 (C-6’’). 3.2.2. Hợp chất 2 (Quercetin-3- -L-arabinofuranoside) - Công thức phân tử C20H18O11 - Khối lượng phân tử M= 434 - Phổ proton 1H-NMR δH (400 MHz, DMSO-d6; in ppm): 6.11, d (J = 1.5 Hz, H-6’ ); 6.31, d (J = 1.5 Hz, H-8); 7.48, d (J = 2.0 Hz, H-2’ ); 6.84, d (J = 8.5 Hz, H-5’ ); 7.53, dd (J = 2.0 và 8.5Hz, H-6); 5.57, sl (H-1’’); 4.16, dd (J = 0.8 and 3.1 Hz, H-2’’); 3.71, m (H-3’’); 3.55, m (H-4’’); 3.33, dd (J = 3.9 and 12.0, H-5a’’); 3.28, dd (J = 5.0 and 12.0, H-5b’’). Phổ cacbon 13C-NMR δC (75 MHz, DMSO-d6; in ppm): 157.4; 133.8; 178.0; 161.3; 99.1; 164.5; 94.1; 156.8; 104.3; 121.4; 115.8; 145.3; 148.7; 115.9; 122.2; 108.2 (C-1’’); 82.3 (C-2’’); 77.2 (C-3’’); 86.6 (C-4’’); 60.9 (C- 5’’). 28
  37. CHƢƠNG 4: THẢO LUẬN KẾT QUẢ 4.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1 (Quercetin-3-O-α-L- rhamnopyranoside) Hợp chất CP1 được phân lập dưới dạng bột màu vàng cho thấy đây cũng là một hợp chất flavon. Phổ 1H-NMR của hợp chất CP1 xuất hiện 2 tín hiệu điển hình của hai proton C-6 và C-8 của vòng A tại δ 6,22 (brs) và 6,39 (brs). Ba tín hiệu proton của vòng thơm tương tác hệ ABX xuất hiện tại δ 7,36 (brs), 7,32 (d, J = 7,5 Hz) và 6,93 (d, J = 7,5 Hz) chứng tỏ vòng B đã thế các vị trí C-1′, C-3′, C-4′. Thêm vào đó, tín hiệu proton của đơn vị đường xuất hiện tại δ 5,37 (brs) và một nhóm methyl tại δ 0,96 (d, J = 6,0 Hz) gợi ý đây là một phân tử đường rhamnose. Như vậy, sơ bộ nhận định đây là hợp chất quercitrin. Hình 4.1.1:Phổ 1H của hợp chất 1 Trên phổ 13C-NMR và DEPT xuất hiện tín hiệu của 21 cacbon, ngoài 15 cacbon thuộc khung quercetin (bảng 1.3), còn lại 6 cacbon của phân tử 29
  38. đường rhamnozo tại C 103,5, 72,0, 72,1, 73,3, 71,9 và 17,6. Phân tích các dữ kiện phổ thu được và so sánh với tài liệu đã công bố cho hợp chất quercitrin [1], cùng với kết quả phổ khối lượng ESI-MS tại m/z 447.36 [M-H]- tương ứng với công thức phân tử C21H20O11 (M = 448), hợp chất CP1 được xác định là quercitrin (Quercetin 3-O- -L-rhamnopyranoside), một hợp chất khá phổ biến ở các loài thực vật. Hình 4.1.2 :Phổ 13C của hợp chất 1 30
  39. Hình 4.1.3:Phổ 13C và DEPTcủa hợp chất 1 Từ các số liệu nêu trên có thể xác định hợp chất 1 chính Quercitrin (Quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside), với công thức phân tử là C21H20O11 khối lượng phân tử: 448.38 Hình 4.1.4: Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 31
  40. Bảng 4.1: Số liệu phổ của hợp chất 1 ≠ a,b a, c Position C C DEPT H Mult (J= Hz) Aglycon 2 157.2 159.3 C - 3 134.2 136.2 C - 4 177.7 179.6 C - 5 161.3 163.2 C - 6 98.6 99.9 CH 6.22 (brs) 7 164.1 165.9 C - 8 93.6 94.8 CH 6.39 (brs) 9 156.4 158.5 C - 10 104.0 105.9 C - 1′ 120.7 123.0 C - 2′ 115.4 116.4 CH 7.36 (brs) 3′ 145.1 146.4 C - 4′ 148.4 149.8 C - 5′ 115.6 117.0 CH 6.93 (d, 7.5) 6′ 121.1 122.9 CH 7.32 (d, 7.5) 3-O-rham 1′′ 101.8 103.5 CH 5.37 (brs) 2′′ 70.3 72.0 CH 4.24 (brs) 3′′ 70.5 72.1 CH 3.77 (brd, 8.0) 4′′ 71.2 73.3 CH 3.36 (dd, 8.0, 9.5) 5′′ 70.0 71.9 CH 3.44 (m) 6′′ 17.4 17.6 CH3 0.96 (d, 6.0) a b c ≠ Measured in methanol-d4; 125 MHz, 500 MHz; C of quercetin-3-O- rhamnopyranoside [30] 32
  41. 4.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2(Quercetin-3- -L- arabinofuranoside) Hợp chất CP2 được phân lập dưới dạng bột màu vàng cho thấy đây cũng là một hợp chất flavon. Phổ 1H-NMR của hợp chất CP2 khá giống CP1 ngoại trừ các tín hiệu vùng đường. Trên phổ 1H-NMR của CP2 xuất hiện 2 tín hiệu điển hình của hai proton C-6 và C-8 của vòng A δ 6,20 (d, J = 2,0 Hz) và 6,40 (d, J = 2,0 Hz). Ba tín hiệu proton của vòng thơm tương tác hệ ABX xuất hiện tại δ 7,56 (dd, J = 2,0, 8,0 Hz), 6,84 (d, J = 8,0 Hz) và 7,48 (d, J = 2,0 Hz) chứng tỏ vòng B đã thế các vị trí C-1′, C-3′, C-4′. Thêm vào đó, các tín hiệu proton của đơn vị đường xuất hiện tại δ 5,58 (CH, s), 4,15 (CH, br s), 3,72 (CH, br s), 3,56 (CH) và 3,28 (CH2) gợi ý đây là một phân tử đường 5C. Tín hiệu tại  5,58 (1H, s) của proton anomeric với hằng số tương tác spin J = 0 Hz chứng tỏ rằng cấu hình của đường là . Hình 4.2.1 :Phổ 1H của hợp chất 2 Phổ 13C-NMR của CP2 xuất hiện tín hiệu 20 nguyên tử cacbon, ngoài 15 nguyên tử cacbon đặc trưng của khung flavon còn lại 5 nguyên tử cacbon của 1 phân tử đường: 15 cacbon của khung flavon tại  156,86 (C-2), 133,34 (C- 3), 177,65 (C-4), 161,16 (C-5), 98,59 (C-6), 164,14 (C-7), 93,48 (C-8), 33
  42. 156,29 (C-9), 103,91 (C-10), 120,91 (C-1′), 115,49 (C-2′), 145,01 (C-3′), 148,39 (C-4′), 115,49 (C-5′), 121,62 (C-6′) và 5 cacbon của đường tại  107,81(C-1′′), 82,05 (C-2′′), 76,93 (C-3′′), 85,83 (C-4′′) và 60,63 (C-5′′). So sánh số liệu phổ 13C-NMR của CP2 với hợp chất quercetin -3-O- -L- arabinofuranoside [3] ta thấy hoàn toàn phù hợp đặc biệt là số liệu của gốc đường arabinofuranosyl. OH 5' 1' HO O 3' 7 9 2 OH 10 5 4 O O 5'' 1'' OH OH O 3'' HO OH Hình 4.2.2: Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 Hình 4.2.3 :Phổ 13C của hợp chất 2 34
  43. Hình 4.2.4: Phổ 2 chiều HSQC của hợp chất 2 Hình 4.2.5: Phổ 2 chiều HMBC của hợp chất 2 35
  44. OH 5' 1' HO O 3' 7 9 2 OH 10 5 4 O O 5'' 1'' OH OH O 3'' HO OH Hình 4.2.6: Các tƣơng tác HMBC chính (H C) của hợp chất 2 Để khẳng định chính xác vị trí liên kết giữa khung quercetin và đường arabinofuranoside phổ hai chiều HSQC và HMBC đã được đo. Trên phổ HMBC tương tác giữa proton anomer của đường tại H 5,58 (H-1′′) với nguyên tử cacbon 133,34 (C-3) cho thấy gốc đường arabinofuranosyl liên kết với khung flavon tại vị trí C-3. Chi tiết các tương tác HMBC khác được liệt kê trong bảng 3 và hình 4.2.4 Bảng 4.2: Số liệu phổ của hợp chất 2  a,f HMBC * a,b a, e H C C [1] C mult. (J in Hz) (H C) 2 157.4 156.86 - 3 133.8 133.34 - 4 178.0 177.65 - 5 161.3 161.16 - 6 99.1 98.59 6.20 d (2.0) 5, 7, 8, 10 7 164.5 164.14 - 8 94.1 93.48 6.40 d (2.0) 6, 7, 9, 10 9 156.8 156.29 - 10 104.3 103.91 - 36
  45. 1′ 121.4 120.91 - 2′ 115.8 115.49 7.48 d (2.0) 2, 3′ 3′ 145.3 145.01 - 4′ 148.7 148.39 - 5′ 115.9 115.49 6.84 d (8.0) 1′, 3′ 6′ 122.2 121.62 7.56 dd (2.0. 8.0) 2, 2′, 4′, 5′ 1′′ 108.2 107.81 5.58 s 3, 2′′, 3′′, 4′′ 2′′ 82.3 82.05 4.15 brs 4′′ 3′′ 77.2 76.93 3.72 brs 2′′, 4′′, 1′′ 4′′ 86.6 85.83 3.56 * 3′′ 5′′ 60.9 60.63 3.28 * 4′′ a b e f * a,b đo trong DMSO; 75 MHz; 125 MH; 500 MHz; * tín hiệu bị chập; C số liệu phổ của quercetin-3- -L-arabinofuranoside [31] Như vậy, từ những dữ kiện phổ trên kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo [31] hợp chất CP2 được xác định là quercetin -3-O- -L- arabinofuranoside có cấu trúc như hình 4.2.6 37
  46. KẾT LUẬN Bằng các phương pháp chiết và sắc ký kết hợp như sắc ký cột nhồi silicagel pha đảo và sắc ký cột nhồi silicagel pha thường, sắc ký lớp mỏng điều chế đã phân lập được hai hợp chất sau: OH 5' 1' HO O 3' 7 9 2 OH 10 5 4 O O 5'' 1'' OH OH O 3'' HO OH Quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside Quercetin-3- -L-arabinofuranoside Cấu trúc của các hợp chất này được xác định nhờ vào các phương pháp phổ hiện đại như cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz), DEPT135, DEPT90), hai chiều (HSQC và HMBC), MS kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo. Dựa vào những ứng dụng thực tiễn, hoạt tính của các lớp chất có trong loài này và kết quả các phân đoạn nghiên cứu tôi mong muốn sẽ có những nghiên cứu sâu hơn về lá cây đu đủ. 38
  47. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1]. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung (2006) Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam. Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật, tập 1, pp 824-827. [2]. Nguyễn Văn Đàm, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, Nxb Y học, Hà Nội. [3]. Đỗ Trung Đàm (1996), Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc, Nxb Y học, Hà Nội. [4]. Trần Thanh Hà, Trịnh Thị Điệp (2012) Hai cycloratane triterpene lần đầu tiên phân lập từ lá đu đủ (carica papaya L.). Tạp chí hóa học, tập 50 (4A), pp 166-169. [5]. Hồ Thị Hà (2014) ghiên cứu hoạt tính sinh học của một số hợp chất chiết tách từ lá đu đủ Carica papaya inn . Luận án tiến sĩ. Đại học Bách khoa Hà nội. [6]. Giang Thị Kim Liên và Đỗ Thị Lệ Uyên. Khảo sát thành phần hoá học của một số dịch chiết từ hoa đu đủ đực thu hái tại Đà ng .Tạp chí Khoa học Công nghệ ĐHĐN; Số: Số 03(88) 2015; Trang 119. [7]. Đỗ Tất Lợi (1986), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội,Trang 360-362. [8]. Phạm Kim Mãn và cộng sự (2001) Nghiên cứu thuốc Panacrin ức chế u dùng trong điều trị ung thư. Tạp chí dược liệu, 6 (2+3), pp 58-62. [9]. Hà Thị Bích Ngọc, Trần Thị Huyền Nga, Nguyễn Văn Mùi (2007) Điều tra hợp chất carotenoid trong một số thực vật của Việt Nam. Tạp chí khoa học ĐHQGHN, khoa học tự nhiên và công nghệ, 23, pp 130-134. [10]. Nguyễn Xuân Phách và cs (1995), Toán thống kê và tin học ứng dụng trong Sinh - Y - Dược, Nxb Quân đội nhân dân, trang 146 - 149 39
  48. [11]. Trần Thế Tục, Đoàn Thế Lư (2004) Cây đu đủ và kỹ thuật trồng, Nhà xuất bản lao động xã hội. [12]. Đỗ Thị Thảo (2006) Nghiên cứu xác định khả năng phòng chống ung thư và bản chất hóa học của một số cây thuốc Việt Nam. Luận án tiến sĩ sinh học. [13]. Nguyễn Tường Vân, Đặng Hồng Vân, Phạm Gia Khôi, Trần Mạnh Bình, Phan Quốc Kinh (1983) Chiết xuất và xác định carpaine alkaloid của lá đu đủ, Tạp chí dược học số 4. Tiếng Anh [14]. Aravind G., Debjit Bhowmik, Duraivel. S., Harish G. (2013) Traditional and medicinal uses of carica papaya. Journal of medicinal plants studies, vol 1, Issue 1, pp 7-15. [15]. Asmah Rahmat, Rozita Rosli, Wan Nor I`zzah Wan Mohd. Zain, Susi Endrini and Huzaimah Abdullah Sani (2002).Antiproliferative Activity of Pure Lycopene Compared to Both Extracted Lycopene and Juices from Watermelon (Citrullus vulgaris) and Papaya (Caricapapaya) on Human Breast and Liver Cancer Cell Lines. Journal of Medical Sciences.vol 2.Isuae 2.page 55-58. [16]. Abrham W.B., (1978), Techniques of Animal and Clinical toxicology. Med. Pub. Chicago, p 55 - 68. [17]. Antonella Canini, Daniela Alesiani, Giuseppe D’Arcangelo, Pietro Tagliatesta (2007)Gas chromatography-mass spectrometry analysis of phenolic compounds from carica papaya L. leaf. Journal of food composition and analysis, vol 20, pp 584-590. [18]. Beverly A. Teicher, (1997), Anticancer drug development guide: Preclinical screening, clinical trials, and approval, Humana Press, Totowa, New Jersey. 40
  49. [19]. Bamidele V, Owoyele, Olubori M, Adebukola, Adeoye A, Funmilayo and Ayodele O, Soladoye (2008) Anti - inflammatory activities of ethanolic extract of Carica papaya leave. Inflammopharmacology, 16 (2008), pp 168 - 173. [20]. Chung-Shih Tang (1979) ew macrocyclic Δ1-piperideine alkaloids from papaya leaves: dehydrocarpaine I and II. Phytochemistry, 1979, vol 18, pp 651-652. [21]. David S., Seigler, Guido F., Pauli, Adolf Nahrstedt, Rosemary Leen (2002) Cyanogenic allosides and glucosides from passiflora edulis and carica papaya.Phytochemistry, vol 60, pp 873-882. [22]. Eno AE, Owo OI, Itam EH, Konya RS, (2000), Blood pressure depression by the fruit juice of Carica papaya (L.) in renal and DOCA- induced hypertension in the rat, Phytother Res, Jun;14(4):235-9. [23]. Gopalakrishnan M, Rajasekharasetty MR., (1978 ), Effect of papaya(Carica papaya Linn) on pregnancy and estrous cycle in albino rats of Wistar strain, Indian J Physiol Pharmacol, Jan-Mar;22(1):66-70. [24]. Giordani R., Cardenas M.L., Moulin-Traffort J., Regli P., (1996), Fungicidal activity of latex sap from Carica papaya and antifungal effect of D(+)-glucosamine on Candida albicans growth, Mycoses, 39, 103- 110. [25]. Govindachari T.R., Naga rajan K. and Viswanathan N. (1965) Carpaine and pseudocarpaine. Tetrahedron letters No 24, pp 1907-1916. [26]. Hewitt H, Whittle S, Lopez S, Bailey E, Weaver S,(2000), Topical use of papaya in chronic skin ulcer therapy in Jamaica, West Indian Med J. Mar; 49(1):32-3. 41
  50. [27]. John R., Van (1998), “ echanism of Action of on Stervidal Anti inflammatory Drug”, The American Jour. of Med. March 30, vol 104 (3A) p.2s -3s. [28]. Krishna K.L., Paridhavi M. and Jagruti A Patel (2008) Review on nutritional, medicinal and pharmacological properties of papaya (Carica papaya Linn.). Natural product radiance, vol 7(4), pp 364-373. [29]. Kermanshai R, McCarry BE, Rosenfeld J, Summers PS, Weretilnyk EA, Sorger GJ. (2001), Benzyl isothiocyanate is the chief or sole anthelmintic in papaya seed extracts. Phytochemistry, Jun; 57(3):427-35. [30]. Takehiko Fukunaga, Koichi Nishiya, Ikuko Kajikawa, Yoshikuni Watanabe, Nobuo Suzuki, Koichi Takeya and Hideji Itokawwa, Chemical studies on the constituents of Hyphear Tanakae Hosokawa from different host trees, Chem. Pharm. Bull. 36 (3) 1180-1184, 1988 [31]. Edilene Delphino Rodrigues, Denise Brenta da Silva, Dionéia Camilo Rodrigues de Oliveira and Gil Valdo José da Silva, DOSY NMR applied to analysis of flavonoid glycosides from Bidens sulphurea, Magnetic resonance in chemistry, 2009, Vol. 47, 1095-1100. Tài liệu internet [32]. chua-benh.html 42