›

Khóa luận Nghiên cứu thành phần hoá học lá Ô môi Cassia grandis L. họ Vang (Caesalpiniaceae)

pdf 72 trang thiennha21 15/04/2022 4080
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu thành phần hoá học lá Ô môi Cassia grandis L. họ Vang (Caesalpiniaceae)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_nghien_cuu_thanh_phan_hoa_hoc_la_o_moi_cassia_gran.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu thành phần hoá học lá Ô môi Cassia grandis L. họ Vang (Caesalpiniaceae)

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH KHOA HĨA HỌC  KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA CAO ETHYL ACETATE LÁ Ơ MƠI CASSIA GRANDIS L. HỌ VANG (CAESALPINIACEAE). KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HĨA HỌC CHUYÊN NGÀNH : HĨA HỮU CƠ Hướng dẫn khoa học: TS. LÊ TIẾN DŨNG Sinh viên thực hiện: TRƯƠNG THỊ THU THỦY TP. HỒ CHÍ MINH - 2012
  2. LỜI CẢM ƠN  Với tấm lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành giử lời cảm ơn đến:  TS. Lê Tiến Dũng, ThS.Phạm Thị Nhật Trinh - Phịng các hợp chất thiên nhiên cĩ hoạt tính sinh học, thầy (cơ) đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, cung cấp kiến thức, động viên, tạo mọi điều kiện giúp em hồn thành đề tài khĩa luận tốt nghiệp này.  TS. Mai Đình Trị-Phịng các hợp chất thiên nhiên cĩ hoạt tính sinh học-thầy đã giúp đỡ, cho em những ý kiến quí báu để em hồn thành đề tài của mình.  Thầy Cơ bộ mơn hĩa hữu cơ – Khoa hĩa – Trường đại học Sư Phạm thành phố Hồ Chí Minh và các Thầy Cơ của Viện Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ em hồn thành khĩa luận tốt nghiệp.  Chị Lưu Thị Ngọc Anh học viên cao học trường Đại học Cần Thơ truyền đạt những ý kinh nghiệm quý báu trong quá trình thực hiện đề tài.  Các anh chị khĩa trước và các bạn cùng khĩa làm cùng phịng 19, phịng 47- Cơng nghệ Việt Nam , các bạn lớp hĩa 4C, đã động viên giúp đỡ tơi trong quá trình thực hiện đề tài.  Các bạn cùng phịng trọ đã quan tâm, động viên, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện đề tài.  Con xin cảm ơn Bố Mẹ đã luơn động viên, hỗ trợ con về mọi mặt trong suốt quá trình học tập, thực hiện đề tài khĩa luận tốt nghiệp này. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2012 Sinh viên: Trương Thị Thu Thủy
  3. DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT brs Broad singlet Mũi đơn rộng 13C – NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance carbon 13 CTPT Cơng thức phân tử d Doublet Mũi đơi dd Double of doublet Mũi đơi đơi DMSO Dimethyl sulfoxide DMSO-d6 Dimethyl sulfoxide-d6 DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid ESI-MS Electron Spray Ionization Mass Phổ khối lượng phun mù điện tử Spectrum EtOAc Ethyl acetate EtOH Ethanol g Gram Hz Hertz H n-Hexane HMBC Heteronuclear Multiple Bond Phổ tương tác dị nhân qua Coherence nhiều liên kết HSQC Heteronuclear Single Quantum Phổ tương tác dị nhân qua Correlation một liên kết 1H – NMR Proton Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance proton J Coupling constant Hằng số ghép m Multiplet Mũi đa MDA Malonyldialdehyde MeOH Methanol mg Miligram
  4. MHz Mega Hertz MIC Minimum Inhibitory concentration mp Melting Point Điểm chảy ppm Part per million Một phần một triệu Rp18 Reversed Phase 18 Pha đảo C18 s Singlet Mũi đơn SKC Sắc ký cột SKLM Sắc ký lớp mỏng STT Số thứ tự t Triplet Mũi ba TMS Tetramethylsilane δ Chemical shift Độ dịch chuyển hố học
  5. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1 Kết quả sắc ký cột sephadex cao CGA5 (0.57g) 30 Bảng 2 Kết quả sắc ký cột sephadex cao CGA7 (25 g) 32 Bảng 3 Kết quả sắc ký cột cao CGA7.3(0.75 g) .33 Bảng 4: Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất CGAVII 39 Bảng 5: Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất CGAV 43 Bảng 6: Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất CGAVII 47 Bảng 7: Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất CGAIX 51
  6. DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1 Quy trình điều chế các cao thơ từ lá Ơ mơi 28 Sơ đồ 2 Quy trình điều chế các phân đoạn từ cao EtOAc 29 Sơ đồ 3 Quy trình điều chế CGAV từ phân đoạn CGA5 .32 Sơ đồ 4 Quy trình điều chế CGAVII từ phân đoạn CGA7.2.4 33 Sơ đồ 5 Quy trình điều chế CGAVIII từ phân đoạn CGA7.2.3 34 Sơ đồ 6 Quy trình điều chế CGAIX từ phân đoạn CGA7.2.2 35
  7. DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 Cây Ơ mơi 12 Hình 2 Lá Ơ mơi 12 Hình 3 Hoa Ơ mơi 13 Hình 4 Trái Ơ mơi 13 Hình 5 Lá Ơ mơi khơ 27 Hình 6 Tương quan HMBC trong vịng A của CGAVII 38 Hình 7: Tương quan HMBC trong vịng B của CGAVII 41 Hình 8 : Tương quan HMBC trong vịng A của CGAVA .42 Hình 9: Tương quan HMBC trong vịng A của CGAVIII 45 Hình 10: Tương quan HMBC trong vịng B của CGAVIII 46 Hình 11: Tương quan HMBC trong vịng Acủa CGAIX 49 Hình 12: Tương quan HMBC trong vịng Bcủa CGAIX 50
  8. MỤC LỤC Chương 1 12 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ THỰC VẬT 12 1.1.1 Đặc điểm cây Ơ mơi 12 1.1.1.1 Mơ tả cây Ơ mơi 1,5 12 1.1.1.2 Phân bố, thu hái và chế biến1,5: 14 1.1.2 Tác dụng dược lý của cây Ơ mơi 15 1.2 NHỮNG CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY Ơ MƠI 15 1.2.1 Thành phần hĩa học chung của cây Ơ mơi1,5 15 1.2.2 Các cơng trình nghiên cứu trên thế giới 16 1.2.2 Các cơng trình nghiên cứu ở Việt Nam 23 Chương 2 25 THỰC NGHIỆM 25 2.1 HĨA CHẤT-THIẾT BỊ-PHƯƠNG PHÁP 25 2.1.1 Hố chất 25 2.1.2 Thiết bị 25 2.1.3 Phương pháp tiến hành 26 2.1.3.1 Phương pháp cơ lập các hợp chất 26 2.1.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc hố học các hợp chất 26 2.2 NGUYÊN LIỆU 26 2.2.1 Thu hái nguyên liệu 26 2.2.2 Xử lý mẫu nguyên liệu 26 2.3 CƠ LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ CAO THƠ 27 2.3.1 Điều chế các cao thơ 27 2.3.2 Cơ lập các chất từ cao CGA5 30 2.3.2 Cơ lập các chất từ cao CGA7 (21 g) 32 2.3.2.1 Cơ lập các chất từ phân đoạn 7.3 (0.75 g) 32 2.3.2.1.1 Cơ lập các chất từ phân đoạn 7.2.4 33 2.3.2.1.2 Cơ lập các chất từ phân đoạn 7.2.3 33 2.3.2.1.3 Cơ lập các chất từ phân đoạn 7.2.2 34 Chương 3 36 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT 36 3.1.1 HỢP CHẤT CGAVII: 36
  9. 3.1.2 HỢP CHẤT CGAVA: 39 3.1.3 HỢP CHẤT CGAVIII: 44 3.1.4. HỢP CHẤT CGAIX 50 Chương 3 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 4.1 KẾT LUẬN 52 4.2 KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Error! Bookmark not defined. Tài liệu tiếng Việt 54 Tài liệu tiếng Anh 55
  10. MỞ ĐẦU  Từ thời xa xưa,con người đã biết dùng cây cỏ làm phương tiện phịng và chữa bệnh,phát triển nền y học dân gian và y học cổ truyền của mỗi dân tộc. Ngày nay,mặc dù hĩa học tổng hợp hữu cơ đạt được nhiều thành tựu quan trọng nhưng nhiều hợp chất cĩ hoạt tính sinh học vẫn cịn khĩ tổng hợp,hoặc nếu tổng hợp được thì chi phí cũng rất đắt. Ngồi ra cũng cĩ những tác dụng phụ khơng mong muốn. Cho nên,việc nghiên cứu và phát triển các nguồn dược phẩm mới từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên vẫn đang đĩng gĩp mạnh mẽ vào các lĩnh vực điều trị bao gồm chống ung thư, chống nhiễm khuẫn,chống viêm,điều chỉnh miễn dịch và các bệnh thần kinh theo thống kê, giữa những năm 2000- 2005,hơn 20 thuốc mới là sản phẩm thiên nhiên và dẫn xuất từ thiên nhiên16. Vốn là một nước được thiên nhiên ưu đãi,nằm trong vùng nhiệt đới giĩ mùa,Việt Nam cĩ một thảm thực vật vơ cùng phong phú và đa dạng với hơn 12.000 lồi thực vật bậc cao khác nhau và được xếp hạng thứ 16 trên thế giới về sự phong phú của các lồi thực vật. Đây là một lợi thế lớn trong việc nghiên cứu hĩa học các hợp chất thiên nhiên. Cây Ơ mơi cĩ tên khoa học là Cassia grandisL., thuộc họ Vang là loại cây rất quen thuộc với người dân miền Nam, chúng mọc hoang hoặc được trồng lấy quả. Quả Ơ mơi thường được dùng ngâm rượu làm thuốc bổ, hoặc nấu cao mềm để kích thích tiêu hĩa, nhuận tràng, trị bị cạp cắn, Ơ mơi khơng chỉ là một loại quả ngon độc đáo của vùng đồng bằng sơng Cửu Long mà cịn là một vị thuốc bổ được so sánh ngang với Canh-ki-na. Chính thứ cơm màu nâu đen đặc sền sệt chứa trong quả Ơ mơi này được người dân ta ngâm rượu làm thuốc bổ uống. Rượu Ơ mơi cĩ màu đỏ đẹp như màu rượu Canh-ki-na và cũng cĩ tác dụng như rượu canh-ki-na, nên Ơ mơi cịn được gọi là “Canh-ki-na Việt Nam”. Tuy nhiên, những cơng trình nghiên cứu về thành phần hố học cũng như hoạt tính sinh học về lồi này chưa được nghiên cứu nhiều ở trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Do vậy, đề tài “Nghiên cứu thành phần hố học lá Ơ mơi Cassia grandis L. họ Vang (Caesalpiniaceae)” làm cơ sở khoa học ban đầu cho những nghiên cứu tiếp theo, nhằm sớm đưa cây Ơ mơi thành một vị thuốc cĩ giá trị và đĩng gĩp thêm những hiểu biết về thành phần Hĩa-thực vật của lồi Cassia grandis L. mọc tại Đồng sơng Cửu Long, qua đĩ nâng cao giá trị sử dụng của lồi thực vật này.
  11. Mục tiêu của đề tài - Phân lập các chất tinh khiết từ lá cây ơ mơi. - Xác định cấu trúc các chất đã phân lập được.
  12. Chương 1 TỔNG QUAN  1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ THỰC VẬT 1.1.1 Đặc điểm cây Ơ mơi Tên khoa học: Cassia grandis L.1,5 Tên Việt Nam: cây Cốt khí, cây quả Canh-ki-na Việt Nam, Bị cạp đỏ.1,5 Tên nước ngồi: Anh (coral shower, apple blossom cassia, pink shower, liquorice tree, horse cassia, Cathartocarpus grandis (L.f.) Pers. 1805, Cassia brasiliana Lamk. 1785, Cathartocarpus brasiliana (Lamk.) Jacq. 1809); Pháp (bâton casse, casse du Brésil); Lào (brai xiêm, Sino-Tibetan, may khoum); Malaysia (kotek mamak); Tây Ban Nha (sandal, carao, carámano, cađafistula, cađadonga); Thái (kanpaphruek (Bangkok)), Campuchia (Sac phlê, krêête, rich chopeu).1,5,15 Họ: Vang (Caesalpiniaceae).1,5 1.1.1.1 Mơ tả cây Ơ mơi 1,5 Cây to cao 7 đến 15 m. Vỏ thân nhẵn, cành mọc ngang, cành non cĩ lơng màu rỉ sắt, cành già màu nâu đen (Hình 1).
  13. Hình 1 Cây Ơ mơi Lá cĩ kích thước lớn, kép lơng chim, màu xanh bĩng, gân rõ,gồm 5-16 đơi lá chét hình hơi quả trám, dài 7-12 cm, rộng 4-8 cm cĩ phủ lơng mịn (Hình 2). Hình 2 Lá Ơ mơi Cụm hoa mọc thành chùm thưa, thõng, dài 20-40 cm. Cụm hoa nở rộ khi lá rụng,màu hồng tươi (Hình 3).
  14. Hình 3 Hoa Ơ mơi Quả hình trụ cứng, cong lưỡi liềm, màu nâu đen nhạt, dài 20-60 cm, rộng 2-3 cm, cuống ngắn khơng mở, đầu cĩ mỏm nhọn, nhỏ (Hình 4). Quả được phân chia thành 50-60 ngăn nhỏ phân cách nhau bởi những lớp màng mỏng, màu trắng nhạt, trong chứa một thứ cơm mềm, đặc sền sệt, màu nâu đỏ hay nâu đen, vị ngọt, lúc tươi cĩ vị hơi chua, khi khơ cĩ màu sẫm. Trong mỗi ngăn cĩ chứa một hạt dẹp cứng màu nâu lợt. Khi chín khơ long ra, lúc lắc quả cĩ tiếng kêu đặc biệt. Mùa hoa quả vào tháng 5-10. Hình 4 Trái Ơ Mơi 1.1.1.2 Phân bố, thu hái và chế biến1,5: Cây cĩ nguồn gốc từ các nước Nam châu Mỹ, được gây trồng làm cây bĩng mát cho hoa đẹp ở nhiều nước trên thế giới. Ở Việt Nam, cây trồng chủ yếu ở các tỉnh phía Nam.
  15. Cây làm cảnh vì hoa đẹp, gây trồng bằng hạt, ươm gieo hạt vào đầu mùa mưa (sau khi rửa hết sạch cơm ở hạt). Đất bầu vườn ươm cần tơi xốp, đủ phân và tưới nước. Cây con chịu bĩng một phần. Sau 1 năm đem trồng nơi cố định. Gần đây, một số nơi ở miền Bắc thường hái quả chín về dùng với tên quả Canh-ki-na, vì thấy rượu ngâm quả này cĩ màu đỏ như màu rượu Canh-ki-na và cũng cĩ tác dụng như rượu Canh-ki-na. Mùa quả vào thu đơng, hái về bỏ vỏ, bỏ nhân, chỉ lấy cùi ngâm rượu, trung bình một quả Ơ mơi cĩ thể ngâm với một nửa lít rượu 25-30° trong 15-20 ngày là dùng được nhưng nếu càng để lâu thì càng tốt. 1.1.2 Tác dụng dược lý của cây Ơ mơi Những bài thuốc dân gian: Quả dùng sống chữa táo bĩn, với liều dùng 4-6 g (nhuận) hoặc 10-20 g (tẩy). Ngâm rượu uống làm thuốc tiêu, thuốc bổ giúp ăn ngon cơm, chữa đau lưng, đau người. Nếu nấu cơm và hạt (1 kg) với 1 lít nước rồi lọc và cơ cách thủy đến thành cao thì dùng để làm thuốc chữa đau lưng, đau người, nhuận tràng, tẩy hoặc chữa lỵ, tiêu chảy với liều dùng 5-15 g. Lá tươi giã nát vắt lấy nước xát vào nơi hắc lào, cĩ thể sắc uống chữa đau lưng, nhuận tràng. Ngày uống 15-20 g lá. Vỏ thân được dùng đắp lên nơi rắn cắn và bị cạp cắn. 1.2 NHỮNG CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY Ơ MƠI 1.2.1 Thành phần hĩa học chung của cây Ơ mơi 1,4 Trong cơm quả cĩ đường, chất nhầy, tannin, saponin, calcium oxalate, anthraglucoside, sáp, tinh dầu và chất nhựa. Trong hạt cĩ chứa chất béo. Trong lá cĩ anthraglucoside, flavonoid.
  16. 1.2.2 Các cơng trình nghiên cứu trên thế giới Chi Cassia chứa nhiều nhĩm chất anthraquinone, flavonoid, các cơng trình nghiên cứu về thành phần hố học trên chi Cassia đã được thực hiện từ rất lâu. Tuy nhiên những nghiên cứu trên lồi Cassia grandis L.hiện rất ít. Năm 1981, Y.S.Srivastava và P.C.Gupta đã cơ lập được flavonol glycoside mới, kaempferol-3-O-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-D-glucopyranoside (1) từ hạt của cây Cassia grandis L. (N.O.Leguminoseae).13 OH HO O CH2OH O CH2OH O H O H OH O H H OH H O OH OH H H OH OH H H H Kaempferol -3-O-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-D-glucopyranoside (1) Năm 1984, V.K. Mahesh và Rashmi Sharma, R.S. Singh đã tách được chrysophanol (2), rhein (3), kaempferol (4) và physcion (5) từ Cassia grandis L.14 OH H O OH O O O O O 12 13 8 9 1 5 10 43 11 14 OH O O O Chrysophanol (2) Rhein (3)
  17. OH O HO O O OH OH O OH O OH Kaempferol (4) Physcion (5) Năm 1984, V.K. Mahesh và Rashmi Sharma, R.S. Singh và , S.K. Upadhya phân lập được Rhein(6) từ lá Cassia grandis L., cĩ nhiệt độ nĩng chảy là 321-3220C.13 O O OH OH O OH Rhein (6) Năm 1993, Ibadur Rahman Siddiqui, Mithiles, Dipti Gupta và Jagdamba Singh đã phân lập được từ hạt Cassia grandis L. 4 anthraquinone mới là 1,2,4,8-tetrahydroxy-6-methoxy-3-methylanthraquinone-2-O-β-D-glucopyranoside (7), 1,3,4-hydroxy-6,8-dimethoxy-2-methylanthraquinone-3-O-β-D-glucopyranoside (8) và 1,3-dihydroxy-6,7,8-trimethoxyanthraquinone-3-O-β-D-glucopyranoside (9) và 3 - hydroxy-6, 8-dimethoxy-2- methyl anthraquinone - 3 - O-β -D –glucopyranoside(10)9
  18. H H OH O OH HO H O OH OH O H H H3CO OH O OH 1,2,4,8-Tetrahydroxy-6-methoxy-3-methylanthraquinone-2-O-β-D-glucopyranoside (7) OCH3 O OH H HO H H H3CO O OH H O O OH O H H HO 1,3,4 -Hydroxy-6,8-dimethoxy-2-methylanthraquinone-3-O-β-D-glucopyranoside (8) OCH3 O OH H3CO H H HO H H3CO O O OH OH O H OHH 1,3-Dihydroxy-6,7,8-trimethoxyanthraquinone-3-O-β-D-glucopyranoside (9)
  19. O H O O H O H H O O O H OH OH HO H 3 - hydroxy-6, 8-dimethoxy-2- methyl anthraquinone - 3 - O-β -D –glucopyranoside (10) Năm 1994, R.P.Verma và K.S.Sinha đã phân lập được 1,3,4-trihydroxy-6,7,8- trimethoxy-2-methylantharaquinone (11) và 1,3,4-trihydroxy-6,7,8-trimethoxy-2-methyl anthraquinone-3-O-ß-D-glucopyranoside(12)11 từ vỏ quả Cassia Grandis L. OCH3 O OH H3CO H3CO OH O OH 1,3,4-Trihydroxy-6,7,8-trimethoxy-2-methylanthraquinone (11) O OH H O O HO H O H O O OH O H OH OH HO H 1,3,4-trihydroxy-6,7,8-trimethoxy-2-methyl anthraquinone-3-O-β-D-glucopyranoside (12) Năm 1995, E. Valencia, A. Madinaveitia, J. Bermejo, A. G. Conzalez và M. P. Gupta đã chiết suất được kokusaginine (6,7-dimethoxyfuroquinoline) (13) và alkaloid mới 1,1′-bipiperidine (14) từ những phần trên mặt đất của cây Cassia grandis L.8
  20. OMe N MeO N MeO N O Kokusaginine (6,7-dimethoxyfuroquinoline) (13) 1,1′-Bipiperidine (14) Năm 1996, A. G. Gonzalez, j. Bermejo, và E. Valencia đã cơ lập được hợp chất mới trans-3-methoxy-4,5-methylene dioxycinamaldehyde (15), aloe emodin (16), centaureidin (17), (+)-catechin (18), myristicin (19), 2,4-dihydroxybenzaldehyde (20), 3,4,5-trimethoxybenzaldehyde (21), 2,4,6-trimethoxybenzaldehyde (22), và β-sitosterol (23).7 O O O H H3CO Trans-3-methoxy-4,5-methylene dioxycinamaldehyde (15) O OH OH O OH Aloe emodin (16)
  21. OH OH OCH3 H HO O O O OH OH H3CO OCH3 OH O OH Centaureidin (17) (+)-Catechin (18) H OH O O C 2 H O O HO CH3 Myristicin (19) 2,4-Dihydroxybenzaldehyde (20) O O H3CO OCH3 H3CO OCH3 OCH3 OCH3 3,4,5-Trimethoxybenzaldehyde (21) 2,4,6-Trimethoxybenzaldehyde (22)
  22. H H H H HO β-Sitosterol (23) Năm 1998, Meenarani, S. B Kalidhar đã phân lập được palmitic acid (21), β-sitosterol (24) và emodin (25).10 O 11 14 HO CH3 5 10 4 COOH 8 9 12 13 OH O OH Palmitic acid (24) Emodin (25) Năm 2010 Pino J.A. đã phân lập được linalool (26)11 HO Linalool (26)
  23. 1.2.2 Các cơng trình nghiên cứu ở Việt Nam Cĩ rất ít cơng trình trong nước nghiên cứu về thành phần hố học cũng như hoạt tính sinh học của Cassia grandis L Năm 2011 Đào Huy Phong 5 hợp chất đã phân lập được (-)-epicatechin (3,3’,4’,5,7- pentahydroxyflavan) (27), (-)-epiafzelechin (4’,5,7-trihydroxy flavanol ) (28), 2,3,6’-trihydroxy- 2’-methoxy-4’-hydroxymethylbenzophenone (29), quercitrin ( 3’,4’,5,7-tetrahydroxy-3-O-α-L- rhamnopyranosylflavonol)(30), iso quercitrin (31)4 . OH OH HO O OH H H OH (-)-epicatechin (3,3’,4’,5,7-pentahydroxyflavan) (27) OH HO O OH H H (-)-epiafzelechin (4’,5,7-trihydroxy flavanol ) (28) CH3 O OH HO OH O OH
  24. 2,3,6’-trihydroxy-2’-methoxy-4’-hydroxymethylbenzophenone (29) OH OH HO O O OH O OH HO OH O OH CH3 quercitrin [ 3’,4’,5,7-tetrahydroxy-3-O-α-L-rhamnopyranosylflavonol] (30) OH HO O OH OH HO O OH O CH OH OH O 2 iso quercitrin [ 3’,4’,5,7-tetrahydroxy-3-O-β-D-glucopyranosylflavonol] (31)
  25. Chương 2 THỰC NGHIỆM  2.1 HĨA CHẤT-THIẾT BỊ-PHƯƠNG PHÁP 2.1.1 Hố chất Hạt silica gel cỡ hạt 0.04-0.063 mm dùng cho pha thường của Scharlau, silica gel pha đảo ODS (0.040-0.063 mm), sephadex LH-20, bảng nhơm tráng sẵn với silica gel 60 F254 (Merck) dùng cho pha thường và Rp18 F254S (Merck) cho pha đảo. Dung mơi: n-Hexane, chloroform, ethyl acetate, acetone, methanol, ethanol 96°, nước cất. Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bản mỏng: dùng H2SO4/EtOH, FeCl3/EtOH. 2.1.2 Thiết bị Máy đo điểm chảy Büchi B545. Máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance. Máy cơ quay chân khơng Büchi-111. Máy sấy. Máy đánh siêu âm. Máy hút chân khơng. Đèn UV soi tử ngoại bước sĩng 254-365 nm hiệu UVITEC. Cân phân tích AB 265-S và cân kỹ thuật PB 602-S. Thiết bị gia nhiệt hồng ngoại hiệu SCHOTT. Dụng cụ thuỷ tinh: cột thủy tinh đường kính từ 2-5.5 cm, phễu lọc, bình sắc ký, ống nghiệm, ống đong, bình cơ quay loại 100 mL, 500 mL, 1000 mL,.
  26. 2.1.3 Phương pháp tiến hành 2.1.3.1 Phương pháp cơ lập các hợp chất Sử dụng các phương pháp chiết xuất trong phịng thí nghiệm hĩa học các hợp chất thiên nhiên để điều chế cao. Sử dụng kỹ thuật SKC silica gel pha thường, pha đảo Rp18, sắc ký lọc gel sephadex LH-20 kết hợp SKLM. Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sĩng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4/EtOH hay FeCl3/EtOH. 2.1.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc hố học các hợp chất Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS) được đo trên máy phổ Agilent 6410 Triple Quad GC/MS của Viện Hố học, Viện Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam. Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR): 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer với chất chuẩn nội là TMS, Viện Hĩa học, Viện Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam, số 18, Hồng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội. 2.2 NGUYÊN LIỆU 2.2.1 Thu hái nguyên liệu Mẫu thực vật được dùng trong nghiên cứu là lá Ơ mơi già được thu hái ở ấp Trường Lộc-xã An Mỹ-huyện Kế Sách-tỉnh Sĩc Trăng. Thời gian thu hái: tháng 10/2010. Mẫu lá cây Ơ mơi được ThS. Nguyễn Thị Kim Huê, bộ mơn Sinh học, khoa Khoa Học Tự Nhiên, đại học Cần Thơ giám định tên khoa học. 2.2.2 Xử lý mẫu nguyên liệu Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khơ trong bĩng râm, sau đĩ sấy lại ở nhiệt độ thấp (khoảng 50°C), rồi xay thành bột mịn. Đây là nguyên liệu dùng trong nghiên cứu.
  27. Hình 5 Lá Ơ mơi khơ 2.3 CƠ LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ CAO THƠ 2.3.1 Điều chế các cao thơ Bột lá Ơ mơi (2.9 kg) được tận trích với ethanol 96° bằng phương pháp ngâm dầm, lọc bỏ bã, phần dịch chiết được cơ loại dung mơi dưới áp suất kém thu được cao EtOH dạng sệt cĩ khối lượng là 500 g. Hịa cao sệt với một lượng tối thiểu ethanol và tẩm với silica gel, đuổi khơ dung mơi trong tủ sấy ở nhiệt độ khoảng 40°C cho đến khi thu được bột tơi. Trích pha rắn cao ethanol lần lượt với các dung mơi n-hexane, chloroform, ethyl acetate và methanol. Cơ đuổi dung mơi các dịch trích dưới áp suất kém thu được các cao tương ứng. Quá trình điều chế cao thơ được tĩm tắt theo Sơ đồ 1.
  28. Bột lá Ơ mơi (2.9 kg) - Tận trích bằng EtOH 96°. - Lọc bỏ bã, cơ giảm áp dịch chiết. Cao EtOH (1500 g) - Hồ với lượng nhỏ EtOH, tẩm silica gel, cơ đến bột tơi. - SKC silica gel với các dung mơi:H, CHCl , EtOAc, MeOH. 3 - Cơ quay dịch chiết. Cao H Cao CHCl3 Cao EtOA Cao MeOH (130 g) (51g) (330 g) (588 g) Sơ đồ 1 Quy trình điều chế các cao thơ từ lá Ơ mơi Trong luận văn này, chúng tơi chỉ khảo sát cao EtOAc. Thực hiện sắc ký cột cao EtOAc (330 g) trên cột sắc ký silica gel với hệ dung mơi rửa giải là hexane:ethyl acetate với độ phân cực tăng dần (3.2%-100% EtOAc), 100% MeOH. Theo dõi quá trình sắc ký cột bằng sắc ký lớp mỏng, các phân đoạn giống nhau trên SKLM được gom chung lại thành 9 phân đoạn, mã hĩa thành CGA1-9. Quá trình thực hiện được tĩm tắt trong Sơ đồ 2.
  29. Cao EtOAc (330 g) - Hồ với lượng nhỏ MeOH, tẩm silica gel, cơ đến bột tơi khơ. - SKC silica gel với hệ dung mơi H:EtOAc (3.2%-100% EtOAc), 100% MeOH. - Cơ cạn dịch trích. CGA1 CGA9 (0.4 g) (80 g) CGA8 CGA2 (1.3 g) (150 g) CGA7 CGA3 (40 g) (0.5 g) CGA4 CGA6 (0.12 g) (0.4 g) CGA5 (0.57 g) Sơ đồ 2 Quy trình điều chế các phân đoạn từ cao EtOAc
  30. 2.3.2 Cơ lập các chất từ cao CGA5 Cao CGA5 cĩ 0.57 g được SKC sephadex với dung mơi 100% MeOH, qua SKLM gom thành 3 phân đoạn (CGA51-3). Kết quả được tĩm tắt trong Bảng 1. Bảng 1 Kết quả sắc ký cột sephadex cao CGA5 (0.57g) Phân đoạn Tên mã hĩa SKLM Khối lượng (g) 1 CGA51 Diệp lục 0.129 2 CGA52 Vết vàng chính 0.3 3 CGA53 Vết dơ 0.12 Từ phân đoạn 5.2 tiếp tục SKC sephadex với dung mơi 100% MeOH nhiều lần, sau đĩ SKC silica gel pha đảo thu được CGAV tinh thề mảu vàng. Quá trình cơ lập được tĩm tắt theo sơ đồ 3 :
  31. CGA5 (570 mg) + Hịa với lượng nhỏ MeOH + SKC sephadex với hệ dung mơi 100% MeOH + Cơ cạn dịch trích CGA51 CGA52 CGA53 (129.2 mg) (300mg) (120.8 mg) + SKC sephadex (100% MeOH). + Cơ cạn dịch trích CGA521 CGA522 CGA523 CGA524 CGA525 (56 mg) (33,5 mg) (42 mg) (117.2 mg) (16 mg) + SKC sephadex (100% MeOH). + Cơ cạn dịch trích CGA5241 CGA5242 CGA5243 (20.3 mg) (65.6 mg) (17 mg)
  32. CGA5242 (65.6 mg) + SKC sephadex (100% MeOH). + Cơ cạn dịch trích CGA52421 CGA52422 CGA52423 (12.1 mg) ( 38.5mg) (8.7 mg) + SKC silica gel pha đảo (hệ MeOH:H2O = 1:1). + giải li hệ ET:EA = 3:2 CGAVA (7 mg) Sơ đồ 3 Quy trình điều chế CGAVA từ phân đoạn CGA5 2.3.2 Cơ lập các chất từ cao CGA7 (21 g) Cao CGA7 cĩ 21 g được SKC sephadex với dung mơi 100% MeOH, qua SKLM gom thành 3 phân đoạn (CGA71-3). Kết quả được tĩm tắt trong Bảng 2. Bảng 2 Kết quả sắc ký cột sephadex cao CGA7 (25g) Phân đoạn Tên mã hĩa SKLM Khối lượng (g) 1 CGA71 Nhiều vết 3 2 CGA72 Vết vàng 0.6 3 CGA73 Vết cam 7 2.3.2.1 Cơ lập các chất từ phân đoạn 7.3 (0.75 g) Phân đoạn 7.3 cĩ vết cam chính được SKC sephadex với dung mơi 100% MeOH, qua SKLM gom thành 4 phân đoạn (7.2.1-7.2.4). Kết quả được tĩm tắt theo Bảng 3
  33. Bảng 3 Kết quả sắc ký cột cao CGA7.3(0.75 g) Phân đoạn Tên mã hĩa SKLM Khối lượng (g) 1 CGA7.2.1 Nhiều vết 0.11 2 CGA7.2.2 Vết tím chính 0.2 3 CGA7.2.3 Vết cam cao chính 0.3 4 CGA7.2.4 Vết cam thấp chính 0.1 2.3.2.1.1 Cơ lập các chất từ phân đoạn 7.2.4 Phân đoạn 7.2.4 cĩ vết cam thấp chính tiếp tục được SKC sephadex với dung mơi 100% MeOH, qua SKLM gom thành 3 phân đoạn (7.2.4.1-7.2.4.3). Tiếp tục SKC sephadex nhiều lần ta thu được CGAVII, được tĩm tắt theo sơ đồ 4: CGA7.2.4 (100 mg) + SKC sephadex (100% MeOH). + Cơ cạn, trích li. CGA7.2.4.1 CGA7.2.4.2 CGA7.2.4.3 (12 mg) (53 mg) (32 mg) + SKC sephadex (100% MeOH) nhiều lần. + Cơ cạn, trích li. CGAVII (12,1 mg) Sơ đồ 4 Quy trình điều chế CGAVII từ phân đoạn CGA7.2.4 2.3.2.1.2 Cơ lập các chất từ phân đoạn 7.2.3 Phân đoạn 7.2.3 cĩ vết cam cao chính tiếp tục được SKC sephadex với dung mơi 100% MeOH, qua SKLM gom thành 2 phân đoạn (7.2.3.1 và 7.2.3.2). Tiếp tục SKC sephadex nhiều lần ta thu được CGAVII, được tĩm tắt theo sơ đồ 5:
  34. CGA7.2.3 (0.3 g) + SKC sephadex (100% MeOH). + Cơ cạn, trích li. CGA7.2.3.1 CGA7.2.3.2 (0,17 g) (0.12 g) + SKC sephadex (100% MeOH). + Cơ cạn, trích li. CGA7.2.3.1 CGA7.2.3.2 CGA7.2.3.3 (14 mg) (63 g) (29 mg) + SKC sephadex (100% MeOH) nhiều lần. + Cơ cạn, trích li. CGAVIII (11,4 mg) Sơ đồ 5 Quy trình điều chế CGAVIII từ phân đoạn CGA7.2.3 2.3.2.1.3 Cơ lập các chất từ phân đoạn 7.2.2 Phân đoạn CGA7.2.2 (0.8 g) cĩ vết tím chính tiếp tục được SKC sephadex với dung mơi 100% MeOH, qua SKLM gom thành 2 phân đoạn (7.2.2.1 và 7.2.2.2). Tiếp tục SKC sephadex nhiều lần ta thu được CGAIX, được tĩm tắt theo sơ đồ 6:
  35. CGA7.2.2 (0.2 g) CGA7.2.2.1 CGA7.2.2.2 (0.03 mg) (0.14g) + SKC sephadex (100% MeOH) nhiều lần. + Cơ cạn, trích li. CGA7.2.2.2.1 CGA7.2.2.2.2 CGA7.2.2.2.3 (32 mg) (27 mg) (16 mg) + SKC silica gel, hệ dung mơi ET:EA = 6:1. + Trích li, cơ cạn. CGAIX (3.8 mg) Sơ đồ 6 Quy trình điều chế CGAIX từ phân đoạn CGA7.2.2
  36. Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN  3.1 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT 3.1.1 HỢP CHẤT CGAVII: 13 Phổ C-NMR (125 MHz, acetone -d6) (phụ lục 2.2) hợp với phổ DEPT (phụ lục 2.3) cho thấy cĩ 15 carbon gồm : 4C nhĩm =CH- δC [ 94.1, 99.0, 116.0, 130.1] ; 11C tứ cấp : δC [104.0, 123.0, 136.2, 146.5, 156.5, 160.0, 162.0, 165.0] và 1 nhĩm >C=O tại δC (176.2). 1 Phổ H-NMR cĩ 6H thuộc vịng thơm δH [6.34 (d, 1H, J = 2), 6.52 (d, 1H, J = 2), 7.25(d, 2H, J = 7), 8.15 (d, 2H, J = 8.5)] và 1H cĩ tại δH = 12.20. Phổ 13C-NMR và phổ 1H-NMR cho phép dự đốn CGAVII là hợp chất cĩ khung flavon. 3' 2' 4' 1 B 8 1' 7 9 O 5' 2 6' A 6 10 3 5 4 O khung flavon.  Biện luận vịng B 1 Phổ H-NMR (500 MHz, ACETONE-d6) (phụ lục 2.1) Hai tín hiệu proton ghép ortho với cường độ gấp đơi δH 7.25, d, 2H, J = 7 và δH 8.15, d, 2H, J = 8.5 chứng tỏ 4 proton này phải thuộc một vịng benzene cĩ cấu trúc đối ’ xứng. Suy ra, đây là vịng B của khung flavon với vị trí C4 mang nhĩm thế -OH, δH 6.34 và δH 6.52 thuộc vịng A.
  37. Mặt khác H-2’/H-6’ ở vị trí meta, H-3’/H-5’ ở vị trí ortho so với C4’ nên H-2’/H-6’ cĩ ’ ’ ’ ’ δH 8.15 và H-3 /H-5 cĩ δH 7.25. Kết hợp với phổ HSQC (phụ lục 2.4) C-2 /C-6 và C- ’ ’ 3 /C-5 cộng hưởng lần lượt tại δC 130.1 và 116.0 ’ ’ ’ ’ H-2 /H-6 cĩ δH 8.15 và H-3 /H-5 cĩ δH =7.25 đều tương quan với C (δC = 160.0) ắt hẳn là C4. ’ ’ 2 ’ H-3 /H-5 tương quan với sp bậc 4 δC 123.0 suy ra đây là C1 . ’ ’ H-2 /H-6 tương quan với carbon bậc 3 mang oxy tại δC 146.5 ắt hằn là C2. H 3' H 2' OH 4' 1 6 O 1' 5' H 2 6' 5 3 H 4 OH O Hình 7: Tương quan HMBC trong vịng B của CGAVII.  Biện luận vịng A 1 Phổ H-NMR xuất hiện proton kiềm nối tại δH = 12.20 khẳng định vị trí C5 mang nhĩm thế -OH. Phổ HMBC (phụ lục 2.4) cho thấy: Proton kiềm nối tại δH = 12.20 tương quan HMBC với một carbon bậc 3, một carbon bậc ba mang oxy và một carbon bậc 4 lần lượt tại δC (99.0, 162.0, 104.0 ) xác nhận 3 carbon trên lần lượt là C-6, C-5, C-10. Từ phổ HSQC độ dịch chuyển hĩa học của H-6 là δH (6.30, 1H, d, J = 2). Vậy proton ghép meta với H-6 phải là H-8 tại δH (6.25, 1H, d, J = 2) đồng thời phổ HSQC khẳng định tín hiệu carbon tại δC 94.1 khẳng định là C-8. Như
  38. vậy vịng A phải mang nhĩm –OH tại C7. Proton của C-6 và C-8 đều tương quan với tín hiệu carbon tại δC = 165 khẳng định đây là tín hiệu của C7. Trên phổ HMBC, proton H-8 tương quan với tín hiệu carbon tại δC = 156.5 suy ra đây là C-9. Như vậy tín hiệu carbon cộng hưởng tại δC 136.2 là C-3. H 1 8 HO 7 9 O 2 6 H 10 3 OH 5 4 O O H Hình 6: Tương quan HMBC trong vịng A của CGAVII. Từ các phân tích phổ trên cĩ thể xác định được CGAVII là kaempferol [3,5,7- trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-chromen-4-one]. 3' OH 2' 4' 1 8 1' HO 7 9 O 5' 2 6' 6 10 3 OH 5 4 OH O Kaempferol [3,5,7- trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-chromen-4-one].
  39. Bảng 4: Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất CGAVII CGAVII STT ACETONE-d6 δH (pmm) 500 MHz δC (ppm) 125 MHz 2 146.5 3 136.0 4 176.2 5 162.0 6 6.3 (d, 1H, J = 2) 99.0 7 165.0 8 6.52 (d, 1H, J = 2) 94.1 9 157.0 10 104.0 1’ 123.0 2’/6’ 8.15 (d, 2H, J = 7) 130.0 3’/5’ 7.25 (d, 2H, J = 8.5) 116.0 4’ 160.0 3.1.2 HỢP CHẤT CGAVA Hợp chất thu được cĩ tinh thể màu vàng hình kim, nhiệt độ nĩng chảy 223- 2240C. 1 Phổ H-NMR (500 MHz, ACETONE-d6) (phụ lục 2.1) cĩ 9 proton với : 2 proton δH [4.71 (tù, rộng), 4.82 (s, 2H)]; 2 proton thuộc cùng vịng thơm ở vị trí meta với nhau δH [ (7.37, 1H, d, J = 1.5), (7.36, 1H, d, J = 1.5)]; 3 proton thuộc vịng thơm liền kề nhau δH [7.81(1H,d), 7.82(1H, d), 7.84 (1H, d)] và 1 proton của –OH kiềm nối tại δH = 12.s
  40. 13 Phổ C-NMR (125 MHz, acetone -d6) (phụ lục 1.2) hợp với phổ DEPT (phụ lục 1.3) cho thấy cĩ 15 carbon gồm 1C methylene tại δC = 60.4, 5C nhĩm =CH- tại δC [118.2, 120.5, 121.5, 138.4, 125.2 ], 9C tứ cấp trong đĩ 2 nhĩm (>C=O) cĩ độ dịch chuyển hĩa học là δC [182.2 và 194.6], và cĩ 7C khác tại δC [115.5, 117.1, 134.5, 135.7, 155.2, 163.2, 163.8]. Từ dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR cho phép dự đốn CGAVA là một anthraquinon với vịng A cĩ 3H liên tiếp ở vị trí 5, 6, 7. Vịng B cĩ 2 H ở vị trí 2, 4. Đồng thời C-1 và C-8 mang 2 nhĩm –OH. O 4 5 10 5a 4a 6 3 A B 7 2 8a 1a 8 9 1 O Khung anthraquinon  Biện luận vịng B : 13 Phổ C-NMR xuất hiện tín hiệu carbon tại δC = 194.6 (C-9) khẳng định sẽ cĩ 2 nhĩm thế -OH ở vị trí 1 và 8. Phổ HMBC (phụ lục 2.4) cho thấy: Proton tại δH = 7.37 tương quan với C-1 (δC 163.8) suy ra đây chính là tín hiệu của H-2 , Kết hợp với HSQC suy ra C-2, C-4 lần lượt cộng hưởng tại δC (121.5), δC (125.2). Proron của C-4 (δC 125.5) và C- 2 (δC 121.5) cùng tương đương với C (δC 115.5) suy ra đây là C-1a. Tín hiệu cộng hưởng của C-3 được xác nhận dựa trên tương quan HMBC giữa proton H-3’ (δH = 4.82) với carbon tứ cấp tại δC 155.2.
  41. O H 10 4 3' 4a 3 CH2OH 2 9 1a 1 H O OH Hình 7: tương quan HMBC trong vịng B của CGAVA  Biện luận vịng A: Phổ HMBC cĩ: Proton tại δH = 7.82 tương quan với C-10 (δC = 182.2 suy ra đây là H-5. vây C-5 cộng hưởng tại δC = 118.2. Tín hiệu proton tại δH = 7 84 tương quan với C-8 (δC = 163.2) hẳn là H-6, vậy C-6 cĩ độ dịch chuyển hĩa học là δC 138.8. Như vậy tín hiệu proton tại δH = 7 81 là H-7 và C-7 cĩ δC = 120.5. Hai proton H-7 (δH 7.81) và H-5 (δH 7.82) cùng tương quan với carbon bậc 4 δC 116.5 hẳn là C-8a. Hai proton H (δH = 7.81) và H (δH = 7.82) cùng tương quan với carbon bậc 4 C (δC = 116.5) suy ra δC = 116.5 là C-8a. Hai proton H-5 (δH = 7.82) và H-6 (δH = 7 84) cùng tương quan với carbon bậc 4 C (δC = 135.0) suy ra đây là C-5a. Vậy C-4a cĩ độ dịch chuyển hĩa học là δC = 134.5.
  42. H O H 5 10 4 H2 H 6 5a 3 C 4a OH 7 2 a H 8 1a H 8 9 1 OH O OH Hình 8 :Tương quan HMBC của CGAVA. Từ các phân tích phổ trên cĩ thể xác định được CGAVA là aloe –emodin O 3' 5 10 4 5a 4a 6 3 OH 7 2 8a 1a 8 9 1 OH O OH aloe – emodin
  43. Bảng 5: Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất CGAVA CGAVA STT AXETONE – d6 δH (pmm) 500Hz δC (ppm) 125 Hz 1 163.8 2 7.37 (d, 1H, J = 1.5) 121.5 3 155.2 4 7.36 (d, 1H, J = 1.5) 125.2 5 7.82 (d, 1H) 118.2 6 7.84 (d, 1H). 138.8 7 7.81 (d, 1H) 120.5 8 163.2 9 192 10 182 1a 115.5 3’ 4.82 (s, 2H) 60.8 4a 134.5 5a 135.0 8a 116.5
  44. 3.1.3 HỢP CHẤT CGAVIII: 1 Phổ H-NMR (500 MHz, acetone -d6) (phụ lục 3.1) cho thấy cĩ 6-H với 2 proton tại δH [(6.26, 1H, d, J = 1.5) và (6.52, 1H, s)] ở vị trí meta với nhau; 3 proton tại δH [(6.99, d, 1H, J = 8.5), (7.70, dd, J = 2), (7.85, d, J = 1.5)] và 1 proton của –OH kiềm nối tại δH 12.20. Phổ 13C-NMR kết hợp kỹ thuật DEPT cho thấy cĩ 15C trong đĩ cĩ 5 nhĩm =CH- tại δC [94.5, 99.2, 115.8, 116.2, 121.5] ; 10C tứ cấp với 9C tại δC [104.0, 123.8, 137, 146, 146.9, 148.5, 158.9, 162.5, 165] và 1C nhĩm >C=O tại δC 176.8. Các giá trị phổ 1H-NMR và phổ 13C-NMR cho phép dự đốn CGAVIII là hợp chất cĩ khung flavon. 3' 2' B 4' 1 8 1' 7 9 O 5' 2 6' A 6 10 3 5 4 O  Biện luận vịng A: 1 Phổ H-NMR (500 MHz, acetone -d6) cho thấy: Tín hiệu cộng hưởng tại δH 12.2 xác nhận –OH gắn vào C-5 của vịng A. Proton δH 6.26 (d, 1H, J = 1.5) và δH 6.52 (s, 1H) thuộc vịng A và H6 cĩ độ dịch chuyển hĩa học nhỏ hơn H-8 nên H-6 cĩ δH 6.26, H-8 cĩ δH 6.52. Kết hợp với phổ HSQC C-6, C-8 lần lượt cộng hưởng tại δC 99.2 và δC 94.5. Phổ HMBC Hai proton H-6 (δH = 6.26) và H-8 (δH = 6.52) cùng tương quan với một carbon tứ cấp mang oxy δC 165.2, một carbon tứ cấp δC = 104.0 xác định 2 carbon trên lần lượt là C-7 và C-10.
  45. Ngồi ra, proton H-6 (δH = 6.26) cho tương quan với carbon tứ cấp mang oxy δC = 162.5 suy ra đây là C-5. Proton H-8 (δH = 6.52) tương quan với tín hiệu carbon tại δC = 158.9 ắt hẳn là C-9. H 1 HO 8 O 7 9 2 6 H 10 3 OH 5 4 OH O Hình 9: Tương quan HMBC trong vịng A của CGAVIII.  Biện luận vịng B : 1 Phổ H-NMR : 3 proton tại δH [(7.00, d, 1H, J = 8.5), (7.70, dd, J = 2), (7.85, d, J = 1.5)] thuộc cùng một vịng benzen 3 lần thế 1’, 3’,4’ cả 3 cùng tương quan HMBC với carbon bậc 4 mang oxy δC 148.5 vậy đây là C-4’. Phổ HMBC : 2 proton tại δH [(7.70, dd, J = 2), (7.82, d, J = 1.5)] cùng tương quan ’ với tín hiệu tại δC = 159.9 suy ra đây là C3 ; 2 proton tại δH [6.99, 7.85] cùng tương quan ’ với carbon tứ cấp tại δC = 123.8 suy ra đây là C1 ; 2 proton δH [7.7, 7.85] cùng tương tác với carbon mang oxy δC = 146.9 suy ra đây là C2. Vậy C3 cộng hưởng tại δC = 137. OH 3' H 2' OH 4' 1 1' 9 O 2 5' H 6' 3 H 10 4 OH O Hình 10: Tương quan HMBC trong vịng B của CGAVIII.
  46. Từ các phân tích phổ trên hợp chất CGAVIII được xác định là: Quercetin [2–(3,4- dihydroxypheny)-3,5,7-trihydroxy-4H-chromen-4-one]. OH 3' OH 2' 4' 1 8 1' HO 7 9 O 5' 2 6' 6 10 3 OH 5 4 OH O Quercetin 2- 3 4-dih drox hen l -3 5 7-trih drox -4H-chromen-4-one [ ( , y yp y ) , , y y ] Bảng 6: Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất CGAVIII CGAVIII STT AXETONE – d6 δH (pmm) 500Hz δC (ppm) 125 Hz 2 147 3 137 4 176.8 5 162.5 6 6.26 (1H, d, J = 1.5) 99.2 7 165 8 6.52 (1H, s) 94.5 9 158
  47. 10 104 1’ 124 2’ 7.85 (1H, d, J = 8.5) 115.8 3’ 146 4’ 148.5 5’ 6.99 (1H, dd, J = 2.5, J = 116.2 8.5) 6’ 7.7 (1H, d, J = 1.5) 121.5 3.1.4 HỢP CHẤT CGAIX 1 Phổ H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) (phụ lục 4.1) ) cho thấy tín hiệu của hai nhĩm metoxi tại δH 3.82 (3H, s) và δH 3.89 (3H, s); 3 tín hiệu proton của vịng thơm thế 1,3,8-5 tại δH = 6.39 (1H, t, J = 2.5), δH = 6.90 (1H, dd, J = 1.5) và δH = 6.93 (1H, d, J = 2); δH = 7.02 (1H, d, J = 0.5) và δH = 7.09 (1H, d, J = 1) là 2H thuộc vịng benzen ở vị trí para với nhau, một proton olefin cơ lập δH = 7.13 (1H, s) và 3 proton δH [7.12 (1H, s), 8.55 (1H, s), 7.75 (1H, s)]. 13 Phổ C-NMR cho thấy cĩ 2 nhĩm –OCH3 tại δH [55.3,56.8], 6 nhĩm =CH- tại δC [98.5, 102, 102.1, 103, 103.3, 104.8], 10C tứ cấp trong đĩ cĩ hai tín hiệu trùng nhau δC [121.5, 134.5,146.3, 146.7, 150.8, 155.3, 159.8, 162.3]. Từ đây suy ra, hợp chất này vịng cĩ 2 nhĩm thế -OCH3, 3 nhĩm thế -OH . Kết hợp phổ 13C-NMR, phổ HSQC, phổ HMBC ta dự đốn hợp chất CGAIX là một flavonoid cĩ khung anthocyanidin. 3' 2' 4' 1 B 8 1' 9 O 5' 7 2 A 6' 6 3 10 H 4 O 5 Khung anthocyanidin.
  48.  Biện luận vịng B (cĩ 3 proton ở vị trí meta với nhau). Phổ HMBC cho biết proton δH = 6.39) tương quan với 2 carbon bậc 4 nối oxy tại δC = 162.3 và δC = 159.8 suy ra proton này là H-4’. Vậy C-4’ cĩ δC = 162.3. Ba proton H (δH = 6.93), H (δH = 6.39) và H (δH = 8.5) cùng tương quan với C bậc 4 mang oxy (δC = 159.8). Mặt khác phổ HSQC cho biết H (δH = 8.5) khơng tương quan với C nào suy ra C (δC = 159.8) là C5’, proton (δH = 6.93) là H-6’. Kết hợp với HSQC C-6’ cĩ δC = 104.8. Do đĩ C2’ là tín hiệu carbon xuất hiện tại δC = 102.0 proton H-4’ (δH = 6.39) và proton tại δH = 3.82 cùng tương quan với C bậc 4 mang oxy (δC = 162.3) suy ra đây là C3’ nối với nhĩm –OCH3. Hai proton (δH = 7.08) và (δH = 7.02) cùng tương quan HMBC với 2C mang oxy tại (δC = 146.7) và (δC = 150.8) suy ra hai carbon trên lần lượt là C-6 và C-7. Proton H-4 (δH = 7.12) tương quan với 2C bậc bốn mang oxy (δC = 146.3) và (δC = 150.8), vậy 2 carbon trên lần lượt là C-3 và C-6. Vậy C-4 là carbon cộng hưởng tại δC = 146.7. Proton (δH = 7.08) tương quan với carbon bậc 4 liên kết với oxy C (δC = 155.3) suy ra C này là C-9. Vậy C-10 cĩ độ dịch chuyển hĩa học tại δC = 121.5. OCH3 3' H 2' H 1 4' 5' O 1' 2 OH 9 6' 3 H 10 4 OH H Hình 11: Tương quan HMBC trong vịng B của CGAIX  Biện luận vịng A: (cĩ 2 proton vị trí para với nhau). Phổ HMBC cho biết:
  49. Proton (δH = 3.89) tương quan với C (δC = 146.7) xác nhận carbon này mangnhĩm thế – OCH3 proton tại (δH = 7.12) khơng thuộc vịng A và B chính là H-4 suy ra C-4 là C (δC = 103.3). Hai proton H (δH = 7.08), H (δH = 7.02) cùng tương quan HMBC với 2C mang oxy C (δC = 146.7) và C (δC = 150.8) suy ra hai carbon trên lần lượt là C-6 và C-7. Proton H-4 (δH = 7.12) tương quan với 2C bậc bốn mang oxy C (δC = 146.3) và C (δC = 150.8) suy ra 2C này lần lượt là C-3 và C-6. Vậy C-4 là carbon cộng hưởng tại δC = 146.7. Proton δH = 7.08 tương quan với carbon bậc 4 liên kết với oxy C (δC = 155.3) suy ra C này là C-9.Hai proton (δH = 7.08) và (δH = 7.02) cùng tương quan với carbon bậc 4 tại δC = 121.5 ắt hẳn đây là C-10. Vậy C-1’ cĩ độ dịch chuyển hĩa học δC = 133.5. H 8 H3CO 9 O 7 2 3 H 6 10 O 5 4 O H H H Hình 12:Tương quan HMBC trong vịng A của CGAIX Phổ ESI-MS xuất hiện đỉnh ion giả phân tử m/z 314 [M-H]- khẳng định khối lượng phân tử của hợp chất CGA IX là 315 amu. Từ các phân tích phổ trên cĩ thể xác định được CGAIX là 3,6- dihydroxy-2-(3- hydroxy-5-methoxyphenyl)-7-methoxychromenylium.
  50. OCH3 3' 2' 4' 1 8 1' H3CO 7 9 O 2 5' OH 6' 6 3 10 HO 5 4 OH 3 6-dih drox -2- 3-h drox -5-methox hen l -7-methox chromen lium , y y ( y y yp y ) y y Bảng 7: Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất CGAIX CGAIX STT ACETONE – d6 δH (pmm) 500Hz δC (ppm) 125 Hz 2 155.3 3 146.3 4 7.13 (1H, s) 103.3 5 7.02 (1H, d, J = 0.5) 98.5 6 150.8 7 146.7 8 7.09 (1H, d, J = 1) 103 9 155.3 10 121.5 1’ 133.5 2’ 6.90 (1H,dd, J = 1.5) 102.0 3’ 162.5
  51. 4’ 6.39 (1H, t, J = 2.5) 102.1 5’ 159.8 6’ 6.93 (1H, dd, J = 2) 104.8
  52. Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ  4.1 KẾT LUẬN Với mục tiêu đặt ra ban đầu, sau khi khảo sát hai phân đoạn CGA5 và CGA7 từ cao ethyl acetate lá ơ mơi, bằng các kỹ thuật SKC trên silica gel pha thường, pha đảo Rp 18 và SKC Sephadex LH-20 kết hợp với SKLM chúng tơi đã cơ lập được bốn hợp chất sạch. Dựa vào kết quả phân tích các hằng số vật lý và phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT 90 và 135, HSQC, HMBC, xác định được cơng thức hĩa học của bốn hợp chất đĩ lần lượt là 3' OH 2' 4' 1 8 1' HO 7 9 O 5' 2 6' 6 10 3 OH 5 4 OH O CAGVII - Kaempferol 3 5 7-trih drox -2- 4-h drox hen l -4H-chromen-4-one [ , , y y ( y yp y ) ]
  53. OH 3' OH 2' 4' 1 8 1' HO 7 9 O 5' 2 6' 6 10 3 OH 5 4 OH O CGAVIII - Quercetin 2- 3 4-dih drox hen l -3 5 7-trih drox -4H-chromen-4-one : [ ( , y yp y ) , , y y ] O 3' 5 10 4 5a 4a 6 3 OH 7 2 8a 1a 8 9 1 OH O OH CGAVA (Alo – emodine) OCH3 3' 2' 4' 1 8 1' H3CO 7 9 O 2 5' OH 6' 6 3 10 HO 5 4 OH CGAIX 3,6-dih drox -2- 3-h drox -5-methox hen l -7-methox chromen lium [ y y ( y y yp y ) y y ]
  54. 4.2 KIẾN NGHỊ Do hạn chế về thời gian nên cịn rất nhiều phân đoạn chúng tơi chưa nghiên cứu, vì vậy hướng nghiên cứu tiếp theo sẽ tập trung vào: - Nghiên cứu thành phần hĩa học trong cao n-hexane, chloroform, methanol ly trích từ lá Ơ mơi. - Đồng thời tiến hành thử hoạt tính sinh học đối với các loại cao và các hợp chất đã cơ lập được. Ngồi ra phần quả của cây Ơ mơi cũng thường được sử dụng để làm thuốc do đĩ cũng cĩ thê khảo sát thành phần hĩa học trên quả Ơ mơi nhằm cĩ một sự đánh giá tồn diện về cây Ơ mơi.
  55. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt (1) Võ Văn Chi (1999), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học. (2) Nguyễn Ngọc Hạnh (2002), Tách chiết và cơ lập các hợp chất tự nhiên, Giáo trình cao học. (3) Đỗ Tất Lợi ( 2004 ), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, 591. (4) Đào Huy Phong (2011),“Nghiên cứu thành phần hĩa học lá Ơ Mơi Cassia grandis L. Họ Vang (Caesalpiniaceae)”, Luận văn thạc sỹ hĩa học, Đại học Cần Thơ. (5) Nguyễn Kim Phi Phụng (2005), Phổ NMR sử dụng trong phân tích hữu cơ, Nhà Xuất Bản Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh. (6) Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cơ lập hợp chất hữu cơ, Nhà Xuất Bản Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh, 151-281. Tài liệu tiếng Anh (7) Brand-Williams, M. E. Cuvelier and C. Berset, Use of a Free Radical Method to Evaluate Antioxidant Activity, Lebensm. Wiss. u. Technol, 1995, Vol. 28, pp. 25- 30. (8) E. Valencia, A. Madinaveitia, J. Bermejo, A. G. Conzalez và M. P. Gupta, Alkaloids from Cassia grandis, Fitoterapia volume LXVI, 1995, No. 5. (9) Ibadur Rahman Siddiqui; Mithiles Singh; Dipti Gupta; Jagdamba Singh, Anthraquinone-O-β-D-Glucosides fromCassia Grandis, Natural Product Research, 1993, 7629220/title~db=all~content=t713398545~tab=issueslist~branches=2 - v222), 83-90. (10) M.K.Meena, KalpeshGaur, M.L.Kori, C.S.Sharma, R.K.Nema, A.K.Jain, C.P.Jain, In-vitro antioxidant properties of leaves of Cassia grandis Linn, Asian journal of pharmaceutical and clinical research, 2009, Volume 2, Issue 1, January- March. (11) Pino J. A. (2010), Volatile compounds of Cassia grandis L. f. Fruit from Cuba, The Journal of essential oil research, 22(6), pp. 599-601
  56. (12) R. P. Verma; K. S. Sinha, An Anthraquinone fromCassia grandisLinn, Natural ProductResearch,1994, 398545~tab=issueslist~branches=5 - v552),105-110. (13) Y.S.Srivastava and P.C.Gupta, A new flavonol glycoside from seeds of Cassia grandis L., journal of medicinal plant research, 1981, Vol. 41, pp. 400-402. (14) V.K. Mahesh và Rashmi Sharma, R.S. Singh, Anthraquinones and kaempferol from cassia species section fistula, Journal of Natural Products, 1984, Vol. 47, No. 4, pp. 733-731. Websize (15) worldagroforestry.org/treedb2/AFTPDFS/Cassia_grandis.pdf. (16) du.vn/jspui/bitstream/123456789/3961/1/Toan%2520van.doc+&hl=vi&gl=vn&pi d=bl&srcid=ADGEESiNpKrifYNRoN1f4BCKm8_-8ac7-MXIXUVf- A_i5ExYxKjaqrYkq5tLtiKGbnQHlIiToYUvDjz4vzUFVZFCc9W3i- rjqHcz61bOVciYTkBTixlXDKaPPyAaIuATsJ8pKLCLjyAB&sig=AHIEtbRGO2 ZI44ZNfGu7K8PRzOUA5JZcPA.
  57. 1 PHỤ LỤC 1.2: PHỔ H-NMR CỦA HỢP CHẤT CGAVII
  58. PHỤ LỤC 1.2: PHỔ 13C-NMR CỦA HỢP CHẤT CGAVII
  59. PHỤ LỤC 1.3: PHỔ DEPT CỦA HỢP CHẤT CGAVII
  60. PHỤ LỤC 1.4: PHỔ HMBCCỦA HỢP CHẤT CGAVII
  61. PHỤ LỤC 2.1:PHỤ PHỔ LỤC 1H-NMR 1.4: PHỔ CỦA HSQC HỢP CHẤTCỦA HỢP CGAVA CHẤT CGAVII
  62. PHỤ LỤC 2.3: PHỔ DEPT CỦA HỢP CHẤT CGAVA PHỤ LỤC 2.2: PHỔ 13C-NMR CỦA HỢP CHẤT CGAVA PHỤ LỤC 2.4: PHỔ HMBC CỦA HỢP CHẤT CGAVA
  63. PHỤ LỤC 2.5: PHỔ HSQC CỦA HỢP CHẤT CGAVA
  64. PHỤ LỤC 3.1: PHỔ 1H-NMR CỦA HỢP CHẤT CGAVIII
  65. PHỤ LỤC 3.5: PHỔ HSQC CỦA HỢP CHẤT CGAVIII
  66. PHỤ LỤC 4.1: PHỔ 1H-NMR CỦA HỢP CHẤT CGAIX PHỤ LỤC 3.5: PHỔ HMBC CỦA HỢP CHẤT CGAVIII
  67. PHỤ LỤC 4.2: PHỔ 13C-NMR CỦA HỢP CHẤT CGAIX
  68. PHỤ LỤC 3.3: PHỔ DEPT CỦA HỢP CHẤT CGAIX
  69. PHỤ LỤC 2.4: PHỔ HMBC CỦA HỢP CHẤT CGAIX