›

Khóa luận Nghiên cứu chiết xuất, phân lập một số thành phần hóa học của lá cây dâu tằm Morus alba L

pdf 52 trang thiennha21 18/04/2022 11102
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu chiết xuất, phân lập một số thành phần hóa học của lá cây dâu tằm Morus alba L", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_nghien_cuu_chiet_xuat_phan_lap_mot_so_thanh_phan_h.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu chiết xuất, phân lập một số thành phần hóa học của lá cây dâu tằm Morus alba L

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  TRỊNH TRỌNG MINH NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ LÁ CÂY DÂU TẰM (Morus alba L.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2018
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  TRỊNH TRỌNG MINH NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ LÁ CÂY DÂU TẰM (Morus alba L.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa QH.2013.Y Người hướng dẫn: 1. TS. VŨ ĐỨC LỢI 2. PSG. TS. NGUYỄN TIẾN VỮNG Hà Nội – 2018 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  3. LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS. Vũ Đức Lợi – Chủ nhiệm Bộ môn dược liệu – Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược - ĐHQGHN người đã trực tiếp hướng dẫn tận tình, chu đáo, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận, đồng thời góp ý kiến giúp em hoàn thành khóa luận này. Em xin cám ơn PGS.TS Nguyễn Tiến Vững – Viện Pháp y Quốc gia đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho em hoàn thành khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Dược liệu – Dược cổ truyền của Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giảng viên trong Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, bạn bè, người thân trong gia đình luôn dạy dỗ, trang bị kiến thức tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ, động viên em trong suốt 5 năm qua. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Sinh viên TRỊNH TRỌNG MINH @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  4. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt, ký hiệu Tên đầy đủ 1 CC Sắc ký cột 2 ESI- MS Phổ khối 3 EtOAc Ethylacetate 4 EtOH Ethanol 5 HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao 6 MeOH Methanol 7 Mp Điểm nóng chảy 8 NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 9 PL Phụ lục 10 pTLC Sắc ký lớp mỏng điều chế 11 TLC Sắc ký lớp mỏng 12 UV- VIS Phổ tử ngoại- khả kiến. 13 YMC Sắc ký cột pha đảo @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  5. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Hàm lượng khoáng chất có trong lá Dâu tằm tươi và Bảng 1.1 12 khô @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  6. DANH MỤC CÁC HÌNH Hình vẽ, đồ Tên hình vẽ, đồ thị Trang thị Hình 1.1 Một số hình ảnh của cây dâu tằm 2 Cấu trúc hoá học của morusalbols A (1) và Hình 1.2. 4 morusalbols B (2) Cấu trúc hoá học của Kaempferol-3-O-β-D- Hình 1.3 glucopyranoside (1) và kaempferitrin (2) 5 Hình 1.4 Cấu trúc của một số chất nhóm flavanoid 6 Hình 1.5 Cấu trúc một số chất thuộc nhóm flavon 7 Các cấu trúc hóa học của các hợp chất linoleiyl Hình 1.6 diglycosid (1), morusflavonyl palmitate (2) và 8 morusflavone (3). Hình 1.7 Cấu trúc của 1-deoxynojirimycin (DNJ) 9 Hình 1.8 Cấu trúc moracinfurol A (1) và moracinfurol B (2) 9 Hình 1.9 Cấu trúc của hai dẫn xuất chalcone 10 Hình 1.10 Cấu trúc của các hợp chất hóa học 11 Hình 1.11 Công thức cấu tạo của MA 11 Hình 2.1 Sơ đồ tách chiết phân đoạn 21 Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất lá Dâu tằm 24 Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các chất trong cắn ethylaceta 26 Cấu trúc hóa học của hợp chất Maesopsin-4-O- 27 Hình 3.3 glucosid Hình 3.4 Cấu trúc hóa học của hợp chất Leonuriside A 29 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  7. Hình 3.5 Cấu trúc hóa học của hợp chất Eriodictyol 30 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  8. MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 2 1.1. Vị trí phân loại chi Morus 2 1.2. Đặc điểm thực vật, phân bố của chi Morus 2 1.2.1. Đặc điểm thực vật 2 1.2.2. Phân bố và sinh thái 3 1.3. Thành phần hóa học của chi Morus 4 1.3.1. Flavonoid 4 1.3.2. Alcaloid 9 1.3.3. Một số thành phần khác 9 1.4. Tác dụng dược lý của chi Morus 13 1.4.1. Tác dụng chống oxy hóa 13 1.4.2. Tác dụng chống viêm 14 1.4.3. Tác dụng làm trắng da 15 1.4.4. Một số tác dụng khác 16 1.5. Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền 17 1.5.1 Tang diệp (lá cây dâu) 17 1.5.2 Tang bạch bì (vỏ rễ cây dâu) 18 1.5.3 Tang thầm (quả dâu chín) 18 1.5.4. Tang chi (cành dâu non) 18 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. Đối tượng và nguyên vật liệu nghiên cứu 20 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 20 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  9. 2.1.2. Hóa chất, trang thiết bị 20 2.2. Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1. Phương pháp chiết xuất và phân lập 21 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất 24 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất 25 3.2. Kết quả xác định cấu trúc hợp chất 29 3.2.1. Hợp chất 1: Maesopsin-4-O-glucosid 29 3.2.2. Hợp chất 2: Leonuriside A 30 3.2.3. Hợp chất 3: Eriodictyol 31 3.3. Bàn luận kết quả 33 3.3.1. Về chiết xuất cao toàn phần và chiết phân đoạn từng phần 33 3.3.2. Về phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  10. ĐẶT VẤN ĐỀ Từ xưa tới nay, người Việt luôn tự hào với nguồn dược liệu phong phú và đa dạng, phân bố khắp mọi miền Tổ quốc. Cũng chính vì thế mà các bài thuốc dân gian được ông cha ta sử dụng rất hiệu quả và cho tới ngày nay vẫn được sử dụng. Khi mà khoa học kỹ thuật ngày càng phát triển, con người quan tâm và nghiên cứu nhiều hơn về cây dược liệu. Và nhận thấy được tiềm năng to lớn mà cây dược liệu có thể đem lại cả về tác dụng đối với sức khoẻ hay là giá trị kinh tế có thể đem lại. Vì vậy, các nghiên cứu về thành phần hoá học, và tác dụng sinh học của các thành phần hoá học trong dược liệu ngày càng nhiều. Lá cây dâu tằm cũng đang được các nhà nghiên cứu quan tâm. Cây dâu tằm (Morus alba L.) trong sách cổ của Trung Quốc được coi là loài cây quý, bởi nó có rất nhiều công dụng đối với con người, vừa có thể làm thuốc trị bệnh, vừa có thể làm thực phẩm bồi bổ cơ thể. Trong đó, lá dâu tằm không chỉ được dùng để chữa các bệnh như tiểu đường, huyết áp cao, rối loạn lipid máu, viêm đường hô hấp, nhức đầu, mờ mắt mà còn được dùng với công dụng làm đẹp da, trắng da [3, 7]. Ngày nay, cùng với sự phát triển của xã hội, nhu cầu làm đẹp của con người tăng lên, đồng thời con người ngày càng có xu hướng tìm về với tự nhiên để tìm kiếm giải pháp làm đẹp an toàn, hiệu quả. Lá dâu được coi là một trong những nguồn nguyên liệu tự nhiên quý trong việc làm đẹp da, loại bỏ vết thâm nám, tàn nhang trên da. Cho đến nay, các công trình nghiên cứu đã công bố về thành phần hóa học cũng như tác dụng sinh học của lá cây dâu ở Việt Nam còn rất ít. Để góp phần cung cấp những cơ sở tiền đề cho việc ứng dụng nguyên liệu lá Dâu tằm trong chăm sóc sức khỏe, chúng tôi đã lựa chọn và tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chiết xuất, phân lập một số thành phần hóa học của lá cây dâu tằm Morus alba L” với những mục tiêu sau: 1. Chiết xuất, phân lập được một số hợp chất từ lá cây dâu tằm 2. Xác định được cấu trúc hoá học của hợp chất vừa phân lập ở trên 1 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  11. CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 1.1. Vị trí phân loại chi Morus Theo tài liệu [1], vị trí phân loại của chi Morus là: Giới: Plantae Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida) Bộ: Gai (Urticales) Họ: Dâu tằm (Moraceae) Chi: morus Loài: alba 1.2. Đặc điểm thực vật, phân bố của chi Morus 1.2.1. Đặc điểm thực vật Hình 1.1: Một số hình ảnh của cây dâu tằm 2 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  12. Họ dâu tằm (Moraceae) có dạng sống là cây gỗ hay bụi, ít khi là cây cò, leo. Có khi có rễ phụ. Các bộ phận có nhựa mủ trắng. Lá đơn, so le, có lá kèm bọc lấy chồi, rụng sớm và để lại sẹo dạng nhẫn trên thân (Ficus) hoặc là hai lá kèm rụng sớm để lại hai vết sẹo trên thân. Hoa nhỏ, đơn tính cùng gốc hay khác gốc hợp thành cụm hoa chùm, bông, tán, đầu hoặc các hoa cái phủ toàn bộ mặt trong của một đế cụm hoa lõm hình quả gioi. Hoa đực có bốn lá đài, không có cánh hoa, bốn nhị đứng đối diện với lá đài. Bộ nhụy của hoa cái có 2 lá noãn, bầu trên hoặc dưới 1 ô, đựng 1 noãn. Quả kép [2]. Chi Morus có đặc điểm cây gỗ nhỏ, lá hình tim hay 3 thùy, mép khía răng. Cây trồng lấy lá nuôi tằm, ăn quả. Các bộ phận: quả, lá, vỏ rễ, tầm gửi (tang ký sinh), tổ bọ ngựa trên cây (tang phiêu diêu) đều dùng làm thuốc [2]. Cây dâu có thể cao tới 15m, nhưng thường do trồng để hái lá nên chỉ cao 2-3m. Lá mọc so le, hình bầu dục, nguyên hoặc chia thành 3 thùy, có lá kèm đầu lá nhọn hoặc hơi tù, phía cuống hơi tròn hoặc hơi bằng, mép có răng cưa to. Từ cuống lá tỏ ra 3 gân rõ rệt. Quả bế bao bọc trong các lá đài, mọng nước thành một quả phức (quả kép) màu đỏ, sau đen sẫm. Quả có thể ăn được và làm thuốc (tang thẩm) [3]. 1.2.2. Phân bố và sinh thái Cây dâu tằm có nguồn gốc Trung Quốc. Đã được đi vào Việt Nam từ lâu, hiện nay được trồng ở khắp nơi để lấy lá nuôi tằm, một số bộ phận được khai thác dùng làm thuốc [3]. Việc phân loại các loài cây trong chi dâu tằm rất phức tạp và có rất nhiều bàn cãi. Có trên 150 tên loài nhưng chỉ có 10-16 tên là được chấp nhận. Dưới đây là tên một số loài thường gặp và khu vực phân bố: • Morus alba L. (Dâu trắng – White Mulberry; vùng Đông Á) • Morus australis (Chinese Mulberry; vùng Nam Á) • Morus celtidifolia (Mexico) 3 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  13. • Morus insignis (Nam Mỹ) • Morus mesozygia (African Mulberry; vùng Nam và Trung Phi) • Morus microphylla (Texas Mulberry; vùng Nam và Bắc Mỹ) • Morus nigra (Dâu đen – Black Mulberry; vùng Tây Nam Á) • Morus rubra (Dâu đỏ– Red Mulberry; vùng Đông Bắc Mỹ) [6]. Ở Việt Nam chỉ có loài dâu trắng tên khoa học là Morus alba L. [18]. 1.3. Thành phần hóa học của chi Morus 1.3.1. Flavonoid Flavonoid là nhóm thường xuyên có mặt trong chi Morus. Trong lá dâu có các flavonoid như quercetin, quercitrin (hình 1.1), moracetin, isoquercitrin, astragalin, quercetin3-O-(6’’-O-acetyl)-β-D-glucopyranosid, quercetin-3,7-di-O- β-D-glucopyranosid, kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosid, kaempferol 3-O-(6’’- acetyl)-β-D-gluco-pyranosid, roseosid, và các dẫn chất prenylflavan [5] Năm 2017, Li Gao và cộng sự bằng các phương pháp phân tích sâu rộng quang phổ xác định được hai prenylflavonoid là morusalbols A và morusalbols B (Hình 1.2) [20] 1 2 Hình 1.2: Cấu trúc hoá học của morusalbols A (1) và morusalbols B (2) Cùng năm 2017, Đỗ Thị Nghĩa Tình dưới sự hướng dẫn của TS. Vũ Đức Lợi Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã phân lập và xác định được 2 4 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  14. chất là Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside, Kaempferol-3,7-di-O-α-L- rhamnopyranosid (Hình 1.3) [5]. 1 2 Hình 1.3: Cấu trúc hoá học của Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside (1) và kaempferitrin (2) Ba glycosides flavonol [quercetin 3-(6-malonylglucosid), rutin (quercetin- 3-rutinosid) (hình 1.3) và isoquercitrin (quercetin-3-glucosid)] được xác định là các hợp chất chống oxy hóa LDL lớn bằng LC-MS và NMR. Những glycosides flavonol trong lá dâu tằm và trà lá dâu được xác định bằng HPLC. Kết quả của chúng tôi cho thấy quercetin 3- (6-malonylglucosid) và rutin, các glycosides flavonol chiếm ưu thế trong lá dâu tằm [29]. Một flavonoid prenylated, moralbanon, cùng với bảy hợp chất được biết đến (kuwanon S, mulberrosid C, cyclomorusin, eudraflavone B hydroperoxid, oxydihydromorusin, leachianon G và α-acetyl-amyrin) được phân lập từ vỏ rễ của Morus alba L. Leachianon G cho thấy hoạt tính kháng virus mạnh (IC 50 = 1,6 mg / ml), trong khi mulberrosid C cho thấy hoạt động yếu (IC 50 = 75,4 mg / ml) với herpes simplex loại 1 virus (HSV-1). Cấu trúc của chúng đã được làm sáng tỏ bằng phương pháp quang phổ (Hình 1.4) [17]. 5 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  15. 1 2 3 4 1. Quercetin 2. Quercitrin 3. Rutin 4. Moralbanon Hình 1.4: Cấu trúc của một số chất nhóm flavanoid Nhiều flavonoid và các dẫn xuất phenolic cô lập từ vỏ rễ M. alba (albanol B, C kuwanon, morusin, mulberrofuran G, sanggenon B, và sanggenon D) có tác dụng chống vi khuẩn, gây độc tế bào. Một số stilbenes cũng được phân lập từ cây này. Oxyresveratrol từ cành cây của M. alba cho thấy tác động ức chế tyrosinase. Mulberroside A, một dạng glycosyl hóa của oxyresveratrol là một hợp chất chính được tìm thấy trong các phần nước, không cho thấy tác dụng ức chế tyrosinase trừ khi glucoside được thủy phân [21]. -Flavon: Trong vỏ rễ cây dâu có hợp chất của flavon gồm mulberrin, mullberrochromen, xyclomulberrin, xyclomulberrochromen (Hình 1.5). 6 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  16. Hình 1.5: Cấu trúc một số chất thuộc nhóm flavon Nghiên cứu hiện tại được thiết kế để phân lập cấu trúc phytoconstituents từ vỏ thân của M alba. Phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu là: Các dịch chiết methanol của vỏ thân của M. alba đã thu được bằng quá trình chiết xuất nóng liên tục. Sự phân lập phytoconstituents được thực hiện bằng sắc ký cột silicagel. Phương pháp sắc ký lớp mỏng phân tích được sử dụng để kiểm tra sự đồng nhất của các phân đoạn. Cấu trúc của phytoconstituents cô lập được thành lập trên cơ sở phương pháp quang phổ và phản ứng hóa học. Kết quả đã phân lập được 3 hợp chất. Hợp chất 1, có tên là linoleiyl diglycosid, đã thu được dưới dạng bột vô định màu vàng nhạt từ dung môi chloroform-methanol (97:3). Hợp chất 2, được gọi là morusflavonyl palmitate, đã thu được dưới dạng một khối màu nâu từ dung môi cloroform-methanol (19: 1). Nó đã phản ứng tích cực 7 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  17. với thử nghiệm Shinoda và ferric chloride và cho thấy độ hấp thụ tia cực tím ở mức 269 và 314 nm đặc biệt đối với flavones. Hợp chất 3, được gọi là morusflavone, đã thu được dưới dạng một tinh thể màu vàng nhạt từ dung môi clo-metanol (19: 1). Nó phản ứng tích cực với thử nghiệm Shinoda của flavonoids. Phổ UV cho thấy sự hấp thụ tối đa ở các bước sóng 264 và 310 nm của dẫn xuất flavone [17]. Hình 1.6: Các cấu trúc hóa học của các hợp chất linoleiyl diglycosid (1), morusflavonyl palmitate (2) và morusflavone (3). 8 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  18. Một guibourtinidol glycosid, (2R, 3S) - guibourtinidol-3-α-d- apiofuranosyl-(1→6)-O-β-d-glucopyranosid, và ba hợp chất được biết đến, đó là: quercetin-7-O-β-d-glucopyranoside, syringaresinol-4-O-β-d-glucopyranosid và rượu dehydrodiconiferyl 4,9'-di-O-β-d-glucopyranosid, được phân lập từ vỏ rễ của Morus alba L. [25]. 1.3.2. Alcaloid Trong số các hợp chất alcaloid có trong lá dâu tằm thì 1-deoxynojirimycin (DNJ) có hàm lượng cao nhất và đây cũng là hợp chất quan trọng trong phòng ngừa và điều trị bệnh tiểu đường. Hình 1.7: Cấu trúc của 1-deoxynojirimycin (DNJ) Alcaloids sugar-mimic và alkaloids polyhydroxylated từ chiết xuất nước của rễ và lá M. alba cho thấy một hoạt động ức chế glucosidase từ yếu đến trung bình [21]. 1.3.3. Một số thành phần khác Đầu năm 2018, Xuewei Wu và cộng sự đã xác định được và phân lập được hai dẫn xuất 2-arylbenzofurnan mới từ lá của Morus alba là moracinfurol A và B (Hình 1.7) được xác định trên cơ sở phân tích quang phổ bao gồm 1D, 2D NMR và HR-ESI-MS [33]. 9 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  19. Hình 1.8: Cấu trúc moracinfurol A (1) và moracinfurol B (2) Mười ba axit béo đã được định lượng trong dịch chiết thu được bằng cách phân tích GC-FID. Tỷ lệ phần trăm của họ dao động từ 0,33% acid palmitoleic (C16: 1) đến 37,57% đối với acid α-linolenic (C18: 3 n3). Các axit béo chủ yếu là axit palmitic (C16: 0) (26,38 và 25,99%), acid α-linolenic (C18: 3 n3) (34,97 và 37,57%) và axít linoleic (C18: 2 n6c) (14,76 và 16,05%). Tổng số phenolic và flavonoid được xác định bằng phương pháp trắc quang, trong khi phenolic được xác định bằng phân tích HPLC-DAD. Các hoạt động chống oxy hóa và gây độc tế bào cũng được xác định. Hợp chất phenolic chính là axit caffeic. Rutin, các dẫn xuất của acid caffeic và quercetin cũng đã được trình bày với số lượng cao [22]. Trong lá dâu có chứa có chất cao su, chất caroten, tanin, rất ít tinh dầu, vitamin C, colin (cholin), adenin, trigonenlin (trigonellin). Ngoài ra còn có pentozan, đường, canxi malat và canxi cacbonat. Trong lá dâu có ecdysteron và inokosteron là những chất nội tiết cần cho sự đổi lốt của côn trùng [3]. Quả dâu có chứa 84,71% nước; 9,19% đường; 1,80% acid; 0,36% protit, tannin, vitamin C, caroten. Trong acid có acid malic, acid suxinic. Trong đường có glucoza, fructoza [3]. Hai dẫn xuất chalcone mới có tên morachalcones B và C (1 và 2) được phân lập từ lá của Morus alba L. [35]. 10 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  20. Hình 1.9: Cấu trúc của hai dẫn xuất chalcone Moracin M (1), Steppogenin-4'-O-β-D-glucosiade (2), Mullberroside A (3) được phân lập từ vỏ rễ của Morus alba L. và xác định bằng các chứng cứ phổ. Các hợp chất 1, 2 và 3 đã được nghiên cứu trong tác dụng hạ đường huyết trên chuột alloxan đái tháo đường. Kết quả cho thấy các hợp chất 1, 2 và 3 tác dụng hạ đường huyết [23]. Hình 1.10: Cấu trúc của các hợp chất hóa học Một thành phần có hoạt tính sinh học trong một chiết xuất ethanol từ vỏ của cây dâu tằm được phân lập bằng cách sử dụng cột nhựa macroporous. Các thành phần chính, được tinh chế bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với máy dò diode array (HPLC-DAD), được xác định là mulberroside A (MA). Kết quả nghiên cứu này cung cấp thông tin quan trọng liên quan đến các cơ chế ức chế của MA trên sự tổng hợp melanin, được sử dụng rộng rãi trong mỹ phẩm làm trắng [31]. 11 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  21. Hình 1.11: Công thức cấu tạo của MA Chi này chứa nhiều hợp chất phenolic bao gồm flavonoid isoprenylated, 2-arylbenzopyrans, stilbenes, coumarin, và hợp chất Diels-Alder adduct [40]. Các lá tươi có chứa chất dưỡng ẩm 71,13-76,68%, protein 4,72-9,96%, chất béo 0,64-1,51% và carbohydrate 8,01-13,42%. Trong khi ở dâu khô lá nội dung giảm độ ẩm và nó dao động 5,11-7,24%, 15,31-30,91% protein, 2,09- 4,93% cho chất béo và 9,70-29,64% carbohydrat, axit ascorbic được dao động 160-280 mg / 100 g dâu tươi lá. Trong khi sấy khô lá số lượng của nó giảm và dao động 100-200 mg / 100 g. Tương tự như vậy trong lá tươi β-carotene được tìm thấy trong khoảng 10,00-14,688 mg / 100 g, trong khi bột lá khô số lượng của nó cũng dao động trong khoảng 8,438-13,125 mg / 100 g. Các nội dung chất khoáng cũng khác nhau trong lá tươi và khô và thành phần của họ được tóm tắt trong bảng sau: Bảng 1.1. Hàm lượng khoáng chất có trong lá dâu tươi và khô [31]. Chất khoáng Lá tươi Lá khô Iron (mg/100) 19.00-35.72 4.70-10.36 Zinc (mg/100) 0.72-3.65 0.22-1.12 Calcium (mg/100) 786.66-2226.66 380-786 Tính chất lý hóa của cây dâu tằm nhanh chóng thay đổi sau giai đoạn giữa đến cuối. Trái chín giàu anthocyanins và cho thấy hoạt động chống oxy hóa cao. 12 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  22. Acid phenolic, 1-DNJ (1-deoxynojirimycin), GABA, các acid amin, khoáng chất giảm trong quá trình chín. Trái cây chưa chín có lợi thế về thành phần dinh dưỡng và chức năng [27]. Lá dâu tằm có chứa một lượng đáng kể protein dễ tiêu hóa, carbohydrate, vi sinh và chất dinh dưỡng, polyphenol, axit amin tự do, các axit hữu cơ. Sự đa dạng của các hoạt động sinh dược quan trọng của dung dịch nước và các chiết xuất dung môi hữu cơ phân cực từ dâu tằm lá - bao gồm đái tháo đường, kháng khuẩn, chống ung thư, tim mạch, hypolipidemic, chống oxy hóa, antiatherogenic, và chống viêm - đã được thảo luận nghiêm túc. Mục tiêu chính là để chứng minh các kết quả của nghiên cứu mới đây được công bố về các hoạt động sinh học của các chất trong lá dâu tằm ở các bệnh nhân có bệnh lý và sức khỏe khác nhau [8]. 1.4. Tác dụng dược lý của chi Morus Hầu như tất cả các bộ phận của Morus alba L. đã được sử dụng như y học cổ truyền Trung Quốc, vỏ rễ được gọi là "Sang-Bai-Pi" ở Trung Quốc, từ lâu đã được sử dụng để loại bỏ nhiệt từ phổi, làm giảm hen suyễn, và gây dieresis. Các loài khác của Morus đã được báo cáo là có tác dụng kháng khuẩn, chống oxy hóa, hạ huyết áp, hạ đường máu, hạ lipid máu và ức chế enzym aromatase [30]. 1.4.1. Tác dụng chống oxy hóa Chi Morus chứa nhiều các dẫn chất flavonoid có khả năng hủy các gốc tự do như HO-, ROO-. Các gốc này sinh ra trong tế bào bởi nhiều nguyên nhân và khi sinh ra cạnh ADN, các chất béo màng tế bào sẽ gây ra những ảnh hưởng nguy hại như gây biến dị, hủy hoại tế bào, gây ung thư và tăng nhanh sự lão hóa. Flavonoid cùng với acid ascorbic tham gia trong quá trình hoạt động của enzym oxy hóa – khử [6]. Lá dâu tằm (Morus alba L.) chứa hàm lượng tương đối cao của các hợp chất chống oxy hóa như quercetin. Hợp chất chính đóng vai trò trung tâm trong 13 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  23. các hoạt động chống oxy hóa trong lá dâu tằm là quercetin glycosides và axit chlorogenic [18]. 1.4.2. Tác dụng chống viêm Với chất flavonoid như là thành phần chủ yếu, lá dâu tằm có hoạt tính sinh học khác nhau, bao gồm chất chống oxy hóa, kháng khuẩn, da trắng, gây độc tế bào, chống đái tháo đường, ức chế glucosidase, chống hyperlipidemic, chống xơ vữa động mạch, chống béo phì, tim mạch, và các hoạt động nâng cao nhận thức. Giàu anthocyanins và ancaloit, trái cây dâu tằm có tính chất dược lý, chẳng hạn như chất chống oxy hóa, chống tiểu đường, chống xơ vữa động mạch, chống béo phì, và các hoạt động hepatoprotective. Các vỏ rễ dâu tằm, có chứa flavonoid, alcaloid và stilbenoids, có tính kháng khuẩn, da trắng, gây độc tế bào, chống viêm, và chống hyperlipidemic. Tính chất dược lý khác của M. alba bao gồm chống tiểu cầu, giải lo âu, chống hen suyễn, thuốc trừ giun sán, chống trầm cảm, bảo vệ tim mạch, và các hoạt động điều hòa miễn dịch. Thử nghiệm lâm sàng về hiệu quả của chiết xuất M. abla trong việc giảm đường huyết, cholesterol và tăng cường khả năng nhận thức đã được tiến hành [14]. Tác dụng chống viêm của nhiều flavonoid thuộc các nhóm flavon, flavanon, dihydroflavonol, anthocyanin, flavan-3-ol, chalcon, isoflavon, biflavon, 4-aryl courmarin, 4-aryl chromanđều được chứng minh bằng thực nghiệm do các flavonoid này ức chế con đường sinh tổng hợp prostaglandin [6]. Hoạt động kháng khuẩn của 18 flavonoids prenylated, được tinh chế từ năm nhà máy dược khác nhau, đã được đánh giá bằng cách xác định MIC bằng cách sử dụng các phương pháp pha loãng chống lại bốn khuẩn và hai vi sinh vật nấm (Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, lớp biểu bì Staphylococcus và S. aureus). Papyriflavonol A, kuraridin, sophoraflavanon D và sophoraisoflavanon. Một hoạt tính kháng nấm tốt với hoạt tính kháng khuẩn mạnh Kuwanon C, mullberrofuran G, albanol B, kenusanon C và sophoraflavanone G cho thấy hoạt tính kháng khuẩn mạnh mẽ với 5-30 mcg/ml MIC. Morusin, Sanggenon B và D, 14 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  24. kazinol B, kurarinon, kenusanon C và isosophoranon có hiệu quả các vi khuẩn gram dương, và broussochalcon A là hiệu quả để C. albicans IC50 giá trị của papyriflavonol A, kuraridin, sophoraflavanon D, sophoraisoflavanon A và broussochalcon A trong tế bào HepG2 là 20,9, 37,8, 39,1, 22,1 và 22,0 mg / ml, tương ứng. Những kết quả này hỗ trợ việc sử dụng các chất flavonoid prenylated trong y học truyền thống châu Á để điều trị nhiễm vi sinh vật và cho thấy một tiềm năng lớn về chất flavonoid prenylated như tác nhân kháng khuẩn cũng như các chất chống viêm [24]. Các đặc tính chống viêm của polyphenol được lấy từ thân cây Morus alba (dâu tằm), thường xuyên được nghiên cứu vì nó vốn được sử dụng truyền thống trong y học châu Á và sự phong phú của nó trong các loại khác nhau của các polyphenol, một số trong đó được biết đến là phytoalexin. Một coumarin glycosid mới, isoscopoletin 6-(6-O-β-apiofuranosyl-β-glucopyranosid) đã được phân lập chủ yếu bởi CPC (sắc ký phân vùng ly tâm) từ nhà máy này, cùng với bảy polyphenol được biết đến [12]. 1.4.3. Tác dụng làm trắng da Dịch chiết lá dâu có tác dụng ức chế enzyme tyrosinase. Một trong những chất có tác dụng được biết đến là mullberrosid F. Chất này cũng có tác dụng chống oxy hóa trên gốc tự do superoxide [6]. Tyrosinase là một enzyme quan trọng trong sự tổng hợp melanin. Chất ức chế của nó có thể được sử dụng để điều trị hiệu quả tăng sắc tố và áp dụng rộng rãi trong các sản phẩm mỹ phẩm và thực phẩm bổ sung. Trong nghiên cứu này, một thử nghiệm mới dựa trên siêu lọc hiệu suất cao sắc ký lỏng kết hợp với máy dò diode array và khối phổ (HPLC-DAD-MS) đã được phát triển cho việc kiểm tra nhanh chóng và xác định các phối tử cho tyrosinase. Mười hai hợp chất có hoạt tính ức chế tyrosinase đã được tìm thấy trong dịch chiết lá dâu tằm. Bản chất của các hợp chất này được đặc trưng bởi HPLC-DAD-MS n. Đặc biệt, hai hợp chất ức chế tyrosinase mới đã được xác định là quercetin-3-O-(6-O- malonyl) -β- d-glucopyranosid và kaempferol-3-O-(6-O-malonyl) -β- d - 15 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  25. glucopyranosid. Các kết quả kiểm tra đã được xác nhận bằng xét nghiệm ức chế tyrosinase [39]. Chiết xuất từ rễ cây Morus australis chứa chủ yếu một chất ức chế tyrosinase đã biết, oxyresveratrol, trong khi chiết xuất rễ và cành có thể chứa một số chất ức chế tyrosinase tiềm năng chưa được biết. Các chiết xuất từ rễ của Morus australis được tiếp tục tìm hiểu trong nghiên cứu này. Một hợp chất mới, austraone A, cùng với 21 hợp chất được biết đến, được phân lập và cấu trúc của chúng đã được xác định bằng cách giải thích dữ liệu MS và NMR. Trong các thử nghiệm ức chế tyrosinase, một số trong số chúng, chẳng hạn như oxyresveratrol, moracenin D, sanggenon T, và kuwanon O, trưng bày các hoạt động ức chế tyrosinase mạnh hơn so với axit kojic. Những kết quả này gợi ý rằng chiết xuất từ rễ Morus australis như là một nguồn cung cấp chất ức chế tyrosinase tự nhiên có tiềm năng lớn để được sử dụng trong thực phẩm như chất chống nâu và trong mỹ phẩm như chất da làm trắng [41]. 1.4.4. Một số tác dụng khác Tiến hành nghiên cứu tác dụng bảo vệ của mulberry digest (MBD) đối với stress gây oxy hóa do acrylamid gây ra. Phân tích thành phần của MBD cho thấy nó chứa 6 hợp chất phenolic chính (quercetin-3-O-rutinosid, quercetin hexosid, quercetin rhamnosylhexosid hexosid, kaempferol rhamnosylhexoside, cyanidin- 3-O-glucosid và cyanidin-3-O-rutinosid. Trong các in vitro, hàm lượng của hai anthocyanins giảm đáng kể, trong khi hàm lượng của bốn flavonoid glycosides tăng lên. Ngoài ra, MBD đã được tìm thấy thành công để ngăn chặn sự sản sinh ra ROC của acrylamide gây ra, khôi phục tiềm năng màng ty thể, và ức chế lipid peroxidation ty thể và sự suy giảm glutathion. Thú vị hơn, hiệu quả bảo vệ của MBD chống lại tác hại oxy hóa bởi acrylamide đã được tăng cường so với các trái dâu không bị tiêu hóa (MBE). Nghiên cứu sâu hơn cho thấy rằng MBD tăng khả năng kháng tế bào đối với stress gây oxy hóa do acrylamide gây ra chứ không phải phản ứng trực tiếp với acrylamid. Nhìn chung, kết quả của chúng tôi 16 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  26. chỉ ra rằng MBD cung cấp một sự bảo vệ mạnh mẽ chống lại acrylamid gây ra stress oxy hóa [21]. Một flavanone C-glycosid, sáu prenylated dẫn xuất 2- arylbenzofuran và hai acid phenolic được phân lập từ vỏ rễ của Morus alba L. để đánh giá về tác dụng bảo vệ chống lại bệnh cơ tim do xorubicin gây ra trong tế bào H9c2 [34]. Anthocyanin trong quả dâu tằm (MAE) có những lợi ích tiềm năng về bảo vệ tế bào gan chống lại stress oxy hóa trong quá trình tăng đường huyết trong các tế bào HepG2 và cải thiện rối loạn chức năng ở chuột bị tiểu đường thông qua quy định của AMPK/ ACC / mTOR [15]. 1.5. Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền 1.5.1 Tang diệp (lá cây dâu) Tính hàn, vị ngọt, đắng. Quy kinh: can, phế, thận [4]. Tác dụng, công dụng: - Giải cảm nhiệt, dùng đối bệnh nhân cảm nhiệt, biểu hiện miệng khát, sốt cao, đau đầu, ho khan, có thể dung với các vị khác; trong bài tang cúc ẩm như: tang diệp 2g, liên kiều 12g, bạc hà 4g, cam thảo 4g, hạnh nhân 12g, cát cánh 8g, lô căn 20g, sắc uống [4]. - Thanh can sáng mắt: dung khi kinh can bị phong nhiệt mắt đỏ sung đau, viêm màng kết mạc, hoa mắt, chảy nhiều nước mắt [4]. - Làm hạ huyết áp [4]. - Làm hạ đường huyết, dung trong bệnh tiêu khát (đái đường), phối hợp với sinh địa, tri mẫu, hoài sơn, cát căn [4]. - Y học cổ truyền dung lá dâu làm thuốc chữa đường hô hấp trên, ho khan, chóng mặt, nhức đầu, viêm mắt, mắt mờ. Ngày dùng 6-18 g [5]. - Các flavonoid của lá dâu có tác dụng chống oxy hóa và làm giảm các tổn thương do xơ cứng mạch. Chất có tác dụng chính trong xơ cứng mạch được xác định là quercetin 3-(6-malonylglucosid) [5]. 17 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  27. 1.5.2 Tang bạch bì (vỏ rễ cây dâu) Tính hàn, vị ngọt. Quy kinh: phế [4]. Tác dụng, công dụng: - Thanh phế, chỉ khái : dung trong trị phế nhiệt đàm nhiệt, bình suyễn, dung để trị hen suyễn còn có thể dùng phối hợp vị thuốc khác để chữa viêm màng phổi: tang bạch bì 12g, cỏ chỉ thiên, rễ cây lức, uất kim, mỗi thứ 12g, lá tre 20g, thanh bì, chỉ xác, hồng hoa, đào nhân mỗi thứ 8g. Có thể chữa ho có sốt, miệng khát, dùng tang bạch bì, tỳ bà diệp, mỗi thứ 12g, sắc uống [4]. - Lợi niệu, tiêu phù: dùng khi thủy thũng, tiểu tiện khó khăn (dùng trong bài ngũ bì ẩm); hoặc dùng tang bạch bì 20g, đậu đỏ 40g [4]. 1.5.3 Tang thầm (quả dâu chín) Tính ấm, vị ngọt, chua. Quy kinh: can, thận [4]. Tác dụng, công dụng: - Dưỡng huyết, an thần: dùng trong các bệnh thiếu máu, da xanh, người gầy, mắt mờ, chóng mặt, mất ngủ [4]. - Bổ gan, thận, dùng trong các bệnh mà chức năng gan, thận suy gây ù tai, di tinh [4]. - Sinh tân chỉ khát, dùng khi cơ thể phiền khát, miệng và môi khô sáp, người lúc nào cũng háo, khát nước; dùng chữa bệnh đái tháo đường, bệnh tràng nhạc [4]. - Nhuận tràng, dùng trong các trường hợp đại tiện bí táo [4]. 1.5.4. Tang chi (cành dâu non) Tính bình, vị đắng. Quy kinh: phế, thận [4]. Tác dụng, công dụng: - Trừ phong thấp, thông kinh lạc, trừ đau nhức ở tay và chân hoặc tay bị co rút [4]. 18 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  28. - Chỉ ho, chủ yếu là ho do hàn dùng phối hợp với bách bộ, cát cánh, trần bì [4]. - Lợi thủy: dùng trong các bệnh tiểu tiện bí, đái dắt, phù thũng; phối hợp với kim tiền thảo, bạch mao căn [4]. - Sát khuẩn tiêu độc [4]. - Hạ áp: dùng khi bị cao huyết áp. Có thể nấu nước tang chi, ngâm chân 20 phút trước khi đi ngủ [4]. 19 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  29. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng và nguyên vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Mẫu cây dâu tằm được thu hái vào tháng 6 năm 2016 tại huyện Phổ Yên, tỉnh Thái Nguyên. Mẫu thực vật (số hiệu: 10/16/SMP) tên khoa học là: Morus alba L. họ dâu tằm Moraceae (chi tiết theo phiếu giám định PL3), mẫu được lưu giữ tại Khoa Y Dược, ĐHQGHN. Lá cây dâu tằm được rửa sạch, làm khô và xay thành bột mịn, bảo quản để thành phần hóa học và chiết xuất, phân lập. 2.1.2. Hóa chất, trang thiết bị ▪ Hóa chất - Các dung môi dùng trong chiết xuất, phân lập: methanol (MeOH), ethyl acetat (EtOAc), n-hexan, dicloromethan (DCM) - Dung môi phân tích: MeOH, n-hexan, EtOAc, H2O - Sắc ký cột: chất hấp phụ là Silicagel. - Thuốc thử: dung dịch H2SO4 10%, hoặc phát hiện bằng đèn tử ngoại, phát các bức xạ có bước sóng ngắn 254 nm và bước sóng dài 365 nm. ▪ Trang thiết bị - Sắc ký cột: sắc ký cột sử dụng silicagel cỡ hạt 0,063-0,200 mm (Merck) và cỡ hạt 0,040- 0,063 mm (Merck) với các loại cột sắc ký có kích cỡ khác nhau. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: NMR được ghi trên máy Bruker Avance 500MHz tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Phổ khối ESI-MS: đo trên máy Varian Agilent 1100 LC-MSD tại Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 20 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  30. - Nhiệt độ nóng chảy: đo trên máy SMP10 BioCote, Khoa Y Dược, ĐHQGHN. - Máy đo phổ tử ngoại (UV-VIS) (Perkin Elmer, Mỹ) tại Khoa Y Dược, ĐHQGHN - Góc quay cực riêng: đo trên máy PLR-4, MRC scientific instruments, Khoa Y Dược, ĐHQGHN. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp chiết xuất và phân lập Phương pháp xử lý mẫu và chiết xuất Mẫu nghiên cứu sau khi thu hái, rửa sạch, phơi và sấy khô nghiền nhỏ thu được bột thô. Đem ngâm chiết với 9,0 lít methanol/lần x 4 lần ở nhiệt độ phòng, mỗi lần 48 giờ. Các dịch chiết được gom lại, lọc qua giấy lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu cắn chiết methanol. Phương pháp phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất Cắn chiết được phân bố vào nước cất vừa đủ và tiến hành chiết lần lượt với n-hexan, ethylacetat. Các dịch chiết n-hexan, ethylacetat và phần nước còn lại được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các cắn n-hexan, cắn ethylacetat và cắn nước. Để phân tách các phần chiết của cây cũng như phân lập các hợp chất, các phương pháp sắc ký đã được sử dụng như: sắc ký lớp mỏng (TLC, dùng để khảo sát), sắc ký cột (CC), sắc ký pha đảo. Sắc ký lớp mỏng (TLC): được thực hiện trên bản mỏng đế nhôm Kieselgel 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu. 21 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  31. Sắc ký cột (CC): được tiến hành với chất hấp phụ là silicagel pha thường và pha đảo. Silicagel pha thường có cỡ hạt là 0,040- 0,063 mm (230- 400 mesh, Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Nhật Bản), YMC ODS-A (50μm, YMC Co. Ltd., Nhật Bản). Silicagel pha đảo TLC Silica gel 60 RP-18 F254S (Merck, Damstadt, Đức). 22 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  32. Dược liệu Chiết với methanol Dịch chiết methanol Thu hồi dung môi Cao tổng methanol Phân tán trong MeOH: nước (1:1) Lắc phân đoạn với n-hexan Thu hồi dung môi Phân đoạn n- Phân đoạn nước hexan Lắc với ethyl acetat Thu hồi dung môi Phân đoạn nước Phân đoạn ethyl acetat Hình 2.1: Sơ đồ chiết tách phân đoạn 23 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  33. 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy, phổ khối (MS), phổ cộng huởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và so sánh các dữ liệu thu đuợc từ thực nghiệm với các dữ liệu đã công bố. 24 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  34. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất Lá dâu được thu hái, rửa sạch, phơi và sấy khô ở 50oC, nghiền nhỏ thu được bột thô. Lấy 6,0 kg bột khô (đã trừ độ ẩm) đem ngâm chiết với 9,0 lít methanol/lần x 4 lần ở nhiệt độ phòng, mỗi lần 48 giờ. Các dịch chiết được gom lại, lọc qua giấy lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 520 g cắn chiết methanol. Cắn chiết được phân bố vào nước cất vừa đủ và tiến hành chiết lần lượt với n-hexan, ethylacetat. Các dịch chiết n-hexan, ethylacetat và phần nước còn lại được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các cắn n-hexan (A, 60 g), cắn ethylacetat (B, 75 g) và còn lại cắn nước (C, 42 g). Sơ đồ chiết xuất lá Dâu tằm được trình bày theo hình sau: 25 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  35. Lá dâu tằm đã rửa sạch, phơi khô, xay thành bột Chiết kỹ với Methanol, 4 lần x 9L Dịch chiết Methanol Lọc, cất loại dung môi Cao chiết tổng Methanol (520g) Lưu làm đối chiếu Dùng lắc các phân đoạn 1. Hòa tan trong nước cất 2. Lắc với n-hexan, 2 lần Dịch chiết n – hexan Dịch chiết nước Lắc với EtOAc Cất thu hồi dung môi Dịch chiết ethyl acetat Cắn nước Cao chiết n-hexan (60g) Thu hồi dung môi mmôi Hình 3.1: Sơ đồ chiết xuất lá Dâu tằm. Cao chiết EtOAc (75g) 26 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  36. Cắn ethylacetat (B, 50 g) được hòa tan trong lượng dung môi vừa đủ và trộn với silicagel (150 g), sau đó cất loại dung môi để được dạng bột tơi, tiến hành sắc ký cột với chất hấp phụ silica gel, kích thước cột 60 cm x 10 cm (chiều dài x đường kính cột), dung môi rửa giải dicloromethan : methanol với độ phân cực của dung môi tăng dần (từ 20:1 đến 0:1) thu được 4 phân đoạn B1 (6,0 g), B2 (7,5 g), B3 (12,0 g) và B4 (10,0 g). Phân tách phân đoạn B3 trên sắc ký cột với chất hấp phụ pha đảo (ODS) sử dụng YMC-gel, kích thước cột 80 cm x 3 cm (chiều dài chất nhồi 70 cm) và kích thước cột 80 cm x 1,5 cm (chiều dài chất nhồi 70 cm), sử dụng hệ dung môi rửa giải aceton : nước (2:5, v:v) thu được 4 phân đoạn nhỏ là B3.1 (2,1 g), B3.2 (3,1 g), B3.3 (1,9 g), B3.4 (3,6 g). Phân đoạn B3.3 được chạy qua cột Sephadex LH-20 với hệ dung môi methanol:nước (1:1 v/v) thu được hợp chất 1 (10 mg). Phân đoạn B3.4 phân tách chất trên cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải aceton:diclometan:nước (5/1/0,1) thu được hợp chất 2 (12 mg) và phân đoạn nhỏ B3.4.1. Phân đoạn B3.4.1 tiếp tục được chạy qua cột silica gel với hệ dung môi chloroform:methanol:nước (6:1:0,01 v/v) thu được hợp chất 3 (15 mg). 27 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  37. Sơ đồ phân lập các hợp chất: Hình 3.2: Sơ đồ phân lập các chất trong cắn Ethylacetat 28 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  38. 3.2. Kết quả xác định cấu trúc hợp chất 3.2.1. Hợp chất 1: Maesopsin-4-O-glucosid + 25 Chất bột màu vàng. ESI-MS (positive) m/z 451 [M+H] ; Độ quay cực: [α]D = - 18,0 (c= 0,1, MeOH). 1 13 Số liệu phổ H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ(ppm) và C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ(ppm): 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ(ppm): 6,92 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-2', H-6'), 6,54 (2H, d, J= 8,0 Hz, H-3', H-5'), 5,99 (1H, s, H-5), 5,91 (1H, s, H-7), 4,95 (1H, d, J = 7,0 Hz, H-1''), 3,48-3,62 (2H, m, H-6''), 3,25 (1H, m, H-2''), 3,25 (1H, m, H-3''), 3,25 (1H, m, H-5''), 3,19 (1H, m, H-4''), 2,90 (2H, m, H-b). 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ(ppm): 105,5 (C-2), 192,3 (C-3), 101,3 (C- 3a), 156,7 (C-4), 95,1 (C-5), 169,0 (C-6), 91,5 (C-7), 171,8 (C-7a), 40,4 (C-b), 124,1 (C-1'), 131,2 (C-2', C-6'), 114,6 (C-3', C-5'), 155,8 (C-4'), 99,5 (C-1”), 72,8 (C-2”), 76,7 (C-3”), 69,2 (C-4”), 77,1 (C-5”), 60,3(C-6”). Hình 3.3: Cấu trúc hoá học của hợp chất Maesopsin-4-O-glucosid Hợp chất 1 thu được dưới dạng bột màu vàng, phổ khối lượng ESI-MS xuất hiện píc ion phân tử tại m/z 451 [M+H]+ kết hợp với phổ 1H-NMR, 13C- 1 NMR có thể dự đoán CTPT C21 H22O11M, KLPT 450. Phổ H-NMR của hợp chất 1 xuất hiện tín hiệu của 6 proton vòng thơm trong đó có một hệ vòng thơm thế dạng para tại δ 6,92 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-2', H-6'), 6,54 (2H, d, J = 8,0 Hz, 29 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  39. H-3', H-5') và hai proton ở vị trí meta với nhau tại δ 5,99 (1H, s, H-5), 5,91 (1H, s, H-7). Ngoài ra phổ 1H-NMR còn xuất hiện tín hiệu của một nhóm methylene tại δ 2,90 (2H, m) và tín hiệu của một phân tử đường với proton anome đặc trưng tại δ 4,95 (1H, d, J= 7,0Hz). Phổ 1H-NMR còn xuất hiện tín hiệu của một nhóm –OH tại δ 9,17 đã gợi ý nhóm hydroxy này có tạo liên kết hydro với một nhóm carbonyl. Phổ 13C-NMR xuất hiện tín hiệu của 21 nguyên tử carbon nếu trừ đi 6 tín hiệu của phần đường thì phần aglycone còn lại 15 nguyên tử carbon. Kết hợp với phổ DEPT nhận thấy có sự xuất hiện của một nhóm carbonyl tại δC 192,3, tín hiệu của một vòng thơm thế para tại δC 124,1 (C-1'), 131,2 (C-2', C-6'), 114,6 (C-3', C-5'), 155,8 (C-4'), tín hiệu của một nhóm CH2 tại δC 40,4 đồng thời phổ HMBC cho thấy nhóm methylene này tương tác với các nguyên tử carbon của vòng thơm thế para ngoài ra còn tương tác với nhóm carbonyl (δC 192,3) và một cacbon không đính với hydro tại 105,5. Phân tử đường được xác định là glucose với các tín hiệu đặc trưng tại ’’ ” ” ” ” ” δC 99,5 (C-1 ), 72,8 (C-2 ), 76,7 (C-3 ), 69,2 (C-4 ), 77,1 (C-5 ), 60,3 (C-6 ), hằng số tương tác của proton anome (J = 7,0 Hz) chứng tỏ cấu hình của phân tử đường là β-D-glucose. Phổ HMBC cho thấy tương tác của proton anome với C-4 (δC 156,7) chứng tỏ phân tử đường được đính tại vị trí C-4. So sánh các dữ kiện phổ của hợp chất 1 với các dữ kiện phổ của hợp chất maesopsin-4-O- glucosid [Bao Jun Xu, Yu Qiu Deng (2003), “Chemical compositions of the genus Hovenia”, Journal Natural produc science, 9(3):143-153] thấy có sự trùng khớp, chứng tỏ hợp chất 1 là maesopsin-4-O-glucosid. 3.2.2. Hợp chất 2: Leonuriside A o Chất bột trắng, khó tan trong dung môi hữu cơ, tnc = 232-234 C, 25 [ α ] D = - 44,6 (c = 0,2 trong aceton/MeOH). 1 13 Số liệu phổ H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ(ppm) và C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ(ppm): 1 Phổ H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 6,05 (s, H-4, H-6), 4,63 (d, J = 7,5 Hz, H-1'), 3,67 (s, 1-OMe, 3-OMe), 3,58 (1H, dd, J = 10; 2,5 Hz, Ha- 30 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  40. 6'), 3,41 (1H, Hb-6'), 3,16 (m, H-2'), 3,16 (m, H-3'), 3,12 (m, H-4'), 3,00 (m, H- 5'). 13 Phổ C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 153,9 (C-5), 153,2 (C-1, C- 3), 127,5 (C-2), 103,5 (C-1'), 93,8 (C-4, C-6), 77,0 (C-5'), 76,5 (C-3'), 74,2 (C- 2'), 70,0 (C-4'), 61,0 (C-6'), 56,1 (1-OMe, 3-OMe). Hình 3.4: Cấu trúc của hợp chất Leonuriside A Khi so sánh phổ 1H-NMR và 13C-NMR của chất dimethyl crenatin và hợp chất 2, chúng có các tín hiệu cộng hưởng tương tự nhau, chỉ khác nhau là trong phổ 13C-NMR của hợp chất 2 mất đi một nhóm hydroxymetylen, chính điều này đã làm cho C-5 chuyển dịch về phía trường thấp tại δ 153,9. Mặt khác, dữ kiện phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất 2 cũng cho thấy sự xuất hiện các tín hiệu của một nhóm đường β-O-D-glucopyranosyl gắn trên carbon C-2, hai proton thơm ở vị trí meta tại δ 6,05 (2H, s, H-4, H-6) và hai nhóm methoxy tại δ 56,1 đối xứng nhau gắn trên hai carbon C-1 và C-3. Từ các phân tích trên và so sánh với dữ liệu phổ của hợp chất leonuriside A [28], hợp chất 2 được xác định là leonuriside A. 3.2.3. Hợp chất 3: Eriodictyol Tính chất: Chất bột màu vàng nhạt. Phổ khối lượng ESI-MS xuất hiện píc ion phân tử tại m/z 289 [M+H]+ kết 1 13 hợp với phổ H- NMR, C-NMR có thể dự đoán CTPT C15H12O6 khối lượng phân tử M = 288. 1 13 Số liệu phổ H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ(ppm) và C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ(ppm): 31 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  41. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ (ppm): 6,93 (1H, s, H-2'), 6,80 (2H, m, H- 5', H-6'), 5,85 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 5,83 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 5,28 (1H, dd, J = 3,0, 12,5 Hz, H-2), 3,05 (1H, dd, J = 13,0, 17,0 Hz, Hb-3), 2,69 (1H, dd, J = 3,0, 17,0 Hz, Ha-3). 13 C-NMR (125MHz, CD3OD) δ(ppm): 80,4 (C-2), 44,0 (C-3), 197,6 (C-4), 165,3 (C-5), 97,0 (C-6), 168,6 (C-7), 96,2 (C-8), 164,7 (C-9), 103,2 (C-10), 131,7 (C-1'), 114,7 (C-2'), 146,4 (C-3'), 146,8 (C-4'), 116,2 (C-5'), 119,2 (C-6'). Hình 3.5: Cấu trúc hoá học hợp chất Eriodictyol Hợp chất 3 thu được dưới dạng hợp chất bột màu vàng nhạt, phổ khối lượng ESI-MS xuất hiện píc ion phân tử tại m/z 289 [M+H]+ kết hợp 1 13 với phổ H- NMR, C-NMR có thể dự đoán CTPT C15H12O6 khối lượng phân tử M = 288. Phổ 1H-NMR của chất 3 xuất hiện tín hiệu của nhóm methine liên kết với oxi tại δ 5,28 (1H, dd, J = 3,0, 12,5 Hz) và hai proton của nhóm methylene tại 3,05 (1H, dd, J = 13,0, 17,0 Hz), 2,69 (1H, dd, J = 3,0, 17,0 Hz). Hai proton có tín hiệu xuất hiện tại δ 5,83 (1H, d, J = 2,0 Hz), 5,85 (1H, d, J = 2,0 Hz) chứng tỏ đây là hai proton ở vị trí meta với nhau trong vòng thơm tại H-6, H-8. Phổ DEPT của chất 3 cho thấy tín hiệu của nhóm methylene tại δ 44,0 và tín 32 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  42. hiệu của nhóm methine tại δ 80,4 khẳng định đây là nhóm CH2 và nhóm CH liên kết với oxi. Thêm nữa có các tín hiệu của nhóm CH xuất hiện trong vùng đặc trưng của olefin vòng benzen, các tín hiệu của carbon bậc 4 và của một carbon bậc 4 liên kết đôi với oxi tại 197,6, như vậy có thể sơ bộ nhận định hợp chất 3 có khung flavanon và các tín hiệu tại δ 5,28 (1H, dd, J = 3,0, 12,5 Hz) tương ứng với H-2, tại 3,05 (1H, dd, J = 13,0, 17,0 Hz), 2,69 (1H, dd, J 13 = 3,0, 17,0 Hz) tương ứng với 2 hydro ở H-3 là Hb-3, Ha-3. Trên phổ C- NMR của chất 3 các tín hiệu tại δ 80,4; 44,0 và 197,6 tương ứng với C-2, C-3 và C-4. Điều này được khẳng định trên phổ HSQC của chất 3 khi thấy sự tương tác của H-2 với carbon ở vị trí δC 80,4 (C-2), sự tương tác của Ha-3, Hb-3 1 với carbon ở vị trí δC 44,0 (C-3). Phổ H-NMR của chất 3 cũng xuất hiện tín hiệu một vòng thế benzen kiểu 1,3,4 với các tín hiệu tại δH 6,93 (1H, s), 6,80 (2H, s) tương ứng lần lượt với H-2', H-5' và H-6'. So sánh các dữ kiện phổ của hợp chất 3 với các dữ kiện phổ của hợp chất eriodictyol đã được công bố [36] thấy có sự trùng khớp chứng tỏ hợp chất 3 chính là eriodictyol. 3.3. Bàn luận kết quả 3.3.1. Về chiết xuất cao toàn phần và chiết phân đoạn từng phần Đề tài đã chiết xuất cao toàn phần từ lá cây dâu tằm đã được sấy khô bằng phương pháp ngâm tại nhiệt độ phòng với dung môi methanol. Phương pháp này có ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản. Cao toàn phần thu được bằng 8,67% khối lượng so với khối lượng dược liệu đem ngâm ban đầu. Cao toàn phần thu được sau đó được phân bố vào nước cất và chiết phân đoạn với các dung dịch n-hexan, ethylacetat thu được lần lượt các cán phân đoạn với khối lượng đạt 0,1% (n-hexan); 0,125% (ethylacetat); 0,07%(cắn nước) so với khối lượng dược liệu khô ban đầu. 3.3.2. Về phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất Đề tài đã phân lập được 03 hợp chất từ phân đoạn dịch chiết ethylacetat của lá cây dâu tằm thu hái tại tỉnh Thái Nguyên. Sử dụng phương pháp sắc ký, dựa vào đặc điểm lý hoá (cảm quan, nhiệt độ nóng chảy), phổ khối (APCI-MS, 33 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  43. ESI-MS), cộng hưởng từ hạt nhân NMR (1H-NMR, 13CNMR, DEPT) và qua đối chiếu với các tài liệu đã công bố của các hợp chất liên quan đã phân lập, xác định cấu trúc phân tử 3 hợp chất là: maesopsin-4-O-glucosid (1), leonuriside A (2), eriodictyol (3). Các hợp chất này lần đầu tiên phân lập được từ lá cây dâu. Vì vậy đây là đóng góp mới, làm phong phú hơn tri thức về thành phần hoá học của lá cây dâu Morus alba L. MAESOPIN-4-O-GLUCOSID Maesopin-4-O-glucosid là một auronol glucosid được tìm thấy trong rễ Medicago truncatula [11], vỏ cây Hovenia trichocarea [19], Báo cáo của Trinh Thi Thuy và công sự (2016) đã phân lập được Maesopin-4-O-glucosid trong lá cây chay Artocarpus tonkinensis A. Chev. Ex Gagnep, và đã đượcc hứng mình có hoạt tính chống ung thư, kháng u trên động vật có vú [30]. LEONURISIDE A Leonuriside A thuộc nhóm phenolic glycosides đã được tìm ra trong rất nhiều loài thực vật từ rất sớm, như được tìm thấy của bộ phận trên mặt đất của cây ích mẫu Leonurus japonicus Houtt [37], quả của cây Rhus parviflora [26], loài Spatholobus sinensis [38], vỏ cây Davidia involucrate [32] Nghiên cứu cho thấy tác dụng ức chế tích tụ triglyceride (TG) trong tế bào HepG2 gây cảm ứng axit béo tự do [37]. ERIODICTYOL Eriodictyol thuộc nhóm flavanon và cũng được coi là một phân tử lipid flavonoid. Eriodictyol là thực tế không hòa tan (trong nước) và một hợp chất có tính axit rất yếu (dựa trên pKa của nó). Eriodictyol có thể được tìm thấy chủ yếu trong máu và nước tiểu, cũng như trong thận và mô gan của con người. Trong tế bào, eriodictyol chủ yếu nằm trong tế bào chất và trong màng tế bào (được dự đoán từ logP). Eriodictyol là một flavanone cay đắng mặt nạ, một flavonoid chiết xuất từ Yerba Santa (Eriodictyon californicum), một loại thực vật có nguồn 34 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  44. gốc ở Bắc Mỹ. Eriodictyol là một trong 4 flavanon được xác định trong cây này là có tính chất thay đổi vị giác, ba chất khác là: homoeriodictyol, muối natri và sterubin (Wikipedia). Eriodictyol là một flavonoid, một hợp chất được phân lập từ Eriodictyon californicum và có thể được sử dụng trong y học như một chất làm ra đờm [42]. Như vậy, với những hợp chất phân lập được đã góp phần trong việc định hướng nghiên cứu thêm về thành phần hóa học cũng như tác dụng sinh học của lá dâu tằm Morus alba L. 35 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  45. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đề tài nghiên cứu thu được một số kết quả: ✓ Đã chiết xuất, phân lập được 3 hợp chất từ lá cây dâu tằm thu hái tại tỉnh Thái Nguyên ✓ Đã xác định được cấu trúc của 3 hợp chất trên là: Maesopsin-4-O- glucosid (1), Leonuriside A (2), Eriodictyol (3). Các hợp ch-ất này lần đầu tiên phân lập được từ lá cây dâu. KIẾN NGHỊ ➢ Tiếp tục nghiên cứu thành phần hoá học của lá cây dâu tằm, cụ thể là ở các phân đoạn n-hexan, phân đoạn nước và tiếp tục nghiên cứu phân đoạn ethylacetat, rộng hơn là nghiên cứu ở các bộ phận khác như quả, thân, rễ của cây dâu tằm tằm (Morus abla L) ➢ Xác định hàm lượng ba chất vừa tìm ra ở nghiên cứu trên đồng thời đánh giá tác dụng sinh học của chúng đối với con người, từ đó xác định tiềm năng làm thuốc. 36 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  46. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt: 1. Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật và thông dụng tập 2, NXB Khoa học và Kĩ thuật, tr.233. 2. Đại học dược Hà Nội (2005), Giáo trình thực vật dược phần 3, tr. 259-261. 3. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr. 721. 4. Phạm Xuân Sinh (2006), Dược học cổ truyền, NXB Y học, tr. 136-195-252- 255. 5. Đỗ Thị Nghĩa Tình (2017), khoá luận “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hoá học của lá cây dâu tằm (Morus alba L)”, khoa Y Dược-Đại học Quốc gia Hà Nội. 6. Ngô Vân Thu, Trần Hùng (2011), Dược liệu học tập 1. NXB Y học,tr.381 7. Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam. NXB Khoa học và kỹ thuật, tr. 462-468. 8. Anna Gryn-Rynko, Grzegorz Bazylak, Dorota Olszewska-Slonina (2016), " New potential phytotherapeutics obtained from white mulberry (Morus alba L.) leaves", Biomedicine & Pharmacotherapy, Vol. 84, pp. 628–636. Tài liệu tiếng anh: 9. Anna Stochmal, Iwona Kowalska, Bogdan Janda (2009), “Gentisic acid conjugates of Medicago truncatula roots”, Phytochemistry, Vol 70, pp. 1272-1276. 37 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  47. 10. Ayse Kuruzum-uz, Zühal Guvenalp, Cavit Kazaz (2013), "Phenolic compounds from the roots of Anchusa azurea var. azurea", Turk J Pharm Sci, 10 (2), pp. 177-184. 11. Bao Jun Xu, Yu Qiu Deng (2003), “Chemical compositions of the genus Hovenia”, Journal Natural produc science, 9(3):143-153 12. Céline Rivière, Stéphanie Krisa, Laurent Péchamat, Merian Nassra, Jean- Claude Delaunay, Axel Marchal, Alain Badoc, Pierre Waffo-Téguo, Jean- Michel Mérillon) (2014), "Polyphenols from the stems of Morus alba and their inhibitory activity against nitric oxide production by lipopolysaccharide-activated microglia", J Fototerapia , Vol. 97, pp. 253- 260. 13. Choi J, Kang HJ, Kim SZ, Kwon To, Jeong SI, Jang SI (2013), "Antioxidant effect of astragalin isolated from the leaves of Morus alba L. against free radical-induced", Archives of Pharmacal Research, Vol 36, pp. 912-917. 14. Eric Wei-Chiang Chan, Phui-Yan Lye, Siu-Kuin Wong (2016), "Phytochemistry, pharmacology, and clinical trials of Morus alba", Chinese Journal of Natural Medicines, pp. 17-30. 15. Fujie Yan, Xiaodong Zheng (2017), "Anthocyanin-rich mulberry fruit improves insulin resistance and protects hepatocytes against oxidative stress during hyperglycemia by regulating AMPK/ACC/mTOR pathway", Journal of Functional Foods, Vol. 30, pp.270-281. 16. Hamzah, Ahmad Sazali; Lajis, N. H.; Sargent, M.V. (1994), "Kaempferitrin from the leaves of Hedyotis verticillata and its biological activity", Planta Medica, pp.388–389. 38 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  48. 17. Jiang Du, Zhen-Dan He, Ren-Wang Jiang, Wen-Cai Ye, Hong-Xi Xu, Paul Pui-Hay But (2003), "Antiviral flavonoids from the root bark of Morus alba L.", Phytochemistry, Vol. 62, pp. 1235-1238. 18. Katsube, Takuya, et al (2009), "Effect of air-drying temperature on antioxidant capacity and stability of polyphenolic compounds in mulberry ( Morus alba L.) leaves", Food Chemistry, Vol. 113, pp. 964- 969. 19. Kazuko Yoshikawa, Kimura Eiko, Noriko Mimura (1998), “Hovetrichosides C -G, Five New Glycosides of Two Auronols, Two Neolignans, and a Phenylpropanoid from the Bark of Hovenia trichocarea”, J. Nat. Prod, 61, 786-790. 20. Li Gao, Yuan-Dong Li, Bao-Kun Zhu, Zhi-Yu Li, Li-Bin Huang, Xian-Yi Li, Fei Wang, Fu-Cai Ren & Tou-Gen Liao (2017): Two new prenylflavonoids from Morus alba, Journal of Asian Natural Products Research, Vol 20, pp. 117-121. 21. Linxia Zhang, Yang Xu, Yuting Li, Tao Bảo, vemana Gowd, Chen Wei (2017), " Protective property of mulberry digest against oxidative stress – A potential approach to ameliorate dietary acrylamide-induced cytotoxicity ", Food chemistry, Vol. 203, pp. 306-315. 22. Marija Radojković, Zoran Zeković, Pavle Mašković, Senka Vidović, Anamarija Mandić, Aleksandra Mišan, Saša Đurović (2016), "Biological activities and chemical composition of Morus leaves extracts obtained by maceration and supercritical fluid extraction", The Journal of Supercritical Fluids, pp. 50-58. 39 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  49. 23. Mi Zhang, Man Chen, Han-Qing Zhang, Shi Sun, Bing Xia, Fei-Hua Wu (2009), "In vivo hypoglycemic effects of phenolics from the root bark of Morus alba.L", J Fitoterapia, Vol. 80, pp. 475-477. 24. Nakai. H.-Y. Sohn, K.H. Son, C.-S. Kwon, G.-S. Kwon, S.S. Kang (2004), "Antimicrobial and cytotoxic activity of 18 prenylated flavonoids isolated from medicinal plants: Morus alba L., Morus mongolica Schneider, Broussonetia papyrifera (L.) Vent, Sophora flavescens Ait and Echino Sophora koreensis Nakai", Phytomedicine, Vol. 11, pp. 666-672. 25. Park, Ji- Hae. 21, (2014), "A new flavonoid glycoside from the root bark of Morus alba L.", Natural Product Research, Vol. 28, p. 1859. 26. Sabina Shrestha, Dae-Young Lee, Ji-Hae Park (2013), “Phenolic components from Rhus parviflora fruits and their inhibitory effects on lipopolysaccharide-induced nitric oxide production in RAW 264.7 macrophages”, Natural Product Research, Vol 27, pp 2244-2247. 27. Scientia Horticulturae, Yongcheol Lee, Keum Taek Hwang (2017), "Changes in physicochemical properties of mulberry fruits (Morus alba L.) during ripening", J. Agric. Food Chem, Vol. 217, pp.189-196. 28. Seoung Rak Lee, Jon Clardy , Donald Robert Senger , Shugeng Cao , Ki Hyun Kim (2016), " Iridoid and phenylethanoid glycosides from the aerial part of Barleria lupulina", Revista Brasileira de Farmacognosia 26: 281– 284. 29. Takuya Katsube, Naoto Imawaka, Yasuhiro Kawano, Yoshimitsu Yamazaki, Kuninori Shiwaku, Yosuke Yamane (2006), "Antioxidant flavonol glycosides in mulberry (Morus alba L.) leaves isolated based on LDL antioxidant activity", Food chemistry, Vol. 97, pp. 25-31. 40 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  50. 30. Trinh Thi Thuy, Dao Duc Thien, Tran Quang Hung (2016),“In vivo anticancer activity of maesopsin 4-O-β-glucoside isolated from leaves of Artocarpus tonkinensis A. Chev. Ex Gagnep”, Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 9, 4, pp. 351-356. 31. Wang S, Liu X-M, Zhang J, Zhang Y-Q. (2014), "An Efficient Preparation of Mulberroside A from the Branch Bark of Mulberry and Its Effect on the Inhibition of Tyrosinase Activity", Plos one, Vol 9 (10). 32. Wu ZJ, Ouyang MA, Wang SB (2008), “Two new phenolic water-soluble constituents from branch bark of Davidia involucrate”, Natural Product Research, Vol 22, pp. 483-488. 33. Xuewei Wu, Ming Li, Xiaoning Wang, Tao Shen, Shuqi Wang & Dongmei Ren (2018), “Two new 2-arylbenzofurnan derivatives from the leaves of Morus alba L”, Natural Product Research, pp. 1478-6419. 34. Xiao-Ke Zheng, Yan-Gang Cao, Ying-Ying Ke, Yan-Li Zhang, Fang Li, Jian-Hong Gong, Xuan Zhao, Hai-Xue Kuang, Wei-Sheng Fenga (2017), "Phenolic constituents from the root bark of Morus alba L and their cardioprotective activity in vitro", Phytochemistry, Vol. 135, pp. 128-134. 35. Yan Yang, Ting Zhang, Lei Xiao, Lixin Yang, Ruoyun Chen (2010), " Two new chalcones from leaves of Morus alba L.", Fitoterapia, Vol. 81, pp. 614-616. 36. Yoshiaki Miyake and Masanori Hiramitsu (2011), "Isolation and extraction of antimicrobial substances against oral bacteria from lemon peel", Journal of Food Science and Technology 48(5): 635–639. 41 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  51. 37. Zhang Y, Deng S, Qu L (2013), “Rare syringyl acylated flavonol glycosides from the aerial parts of Leonurus japonicus Houtt”, Molecules, pp. 2967-2977. 38. Yin T, Liu H, Wang B (2008), “Chemical constituents from Spatholobus sinensis”, Yao Xue Xue Bao, (1): 67-70. 39. Zhenzhong Yang, Yufeng Zhang, Lijuan Sun, Yi Wang, Xiumei Gao, Yiyu Cheng (2012), "An ultrafiltration high-performance liquid chromatography coupled with diode array detector and mass spectrometry approach for screening and characterising tyrosinase inhibitors from mulberry leaves", Analytica Chimica Acta, Vol. 719, pp. 87-95. 40. Zhi-Gang Yang, Keiichi Matsuzaki, Satoshi Takamatsu and Susumu Kitanaka (2011), "Inhibitory Effects of Constituents from Morus alba var. multicaulis on Differentiation of 3T3-L1 Cells and Nitric Oxide Production in RAW264.7 Cells", Molecules, 16(10), pp. 8305-8318. 41. Zong-Ping.Zheng, Hui-Yuan Tan, Mingfu Wang (2012), "Tyrosinase inhibition constituents from the roots of Morus australis", Fitoterpia, Vol. 83, pp. 979-1152. Trang web: 42. Human metabolome database /Showing metabocard for Eriodictyol 42 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  52. PHỤ LỤC 43 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU