›

Khóa luận Nghiên cứu chiết xuất và tinh sạch steviosid và rebaudiosid A từ cây Cỏ Ngọt (Stevia rebaudiana) làm chất tạo ngọt trong thực phẩm và dược phẩm

pdf 63 trang thiennha21 18/04/2022 2940
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu chiết xuất và tinh sạch steviosid và rebaudiosid A từ cây Cỏ Ngọt (Stevia rebaudiana) làm chất tạo ngọt trong thực phẩm và dược phẩm", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_nghien_cuu_chiet_xuat_va_tinh_sach_steviosid_va_re.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu chiết xuất và tinh sạch steviosid và rebaudiosid A từ cây Cỏ Ngọt (Stevia rebaudiana) làm chất tạo ngọt trong thực phẩm và dược phẩm

  1. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG NGUYỄN KIM ĐÔNG NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ STEVIOSID VÀ REBAUDIOSID A TỪ CÂY CỎ NGỌT (STEVIA REBAUDIANA) LÀM CHẤT TẠO NGỌT TRONG THỰC PHẨM VÀ DƯỢC PHẨM NĂM 2016 i
  2. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong đề tài là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kì công trình nào khác. Tác giả đề tài Ký tên Nguyễn Kim Đông ii
  3. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô TÓM TẮT Mục đích của nghiên cứu này là để sản xuất steviosid và rebaudiosid A có độ tinh khiết cao, chiết xuất từ lá cây làm chất tạo ngọt cho thực phẩm và dược phẩm. Lá Cỏ Ngọt được sấy khô và nghiền nhỏ thành bột, bột lá Cỏ Ngọt được chiết xuất bằng nước, dịch chiết được kiềm hóa bởi canxi hydroxit và sau đó bằng sắt (III) clorua, tiến hành khử muối, khử ion, khử màu và làm bay hơi dịch lọc đến khô thu được hỗn hợp glycosid thô. Hỗn hợp glycosid thô tiến hành phân lập và tinh sạch steviosid và rebaudiosid A bằng cách sử dụng metanol, etanol để kết tủa, thu được steviosid và rebaudiosid A có độ tinh khiết cao. Tỷ lệ thích hợp của bột lá Cỏ Ngọt và nước trong quá trình chiết xuất giới hạn khoảng 1:20 đến 1:25 w/v. Nhiệt độ và thời gian chiết xuất tốt nhất là 75oC trong 240 phút và 100oC trong 30 phút. Sự phân lập và tinh sạch steviosid từ hỗn hợp glycosid thô đã được tiến hành bằng cách sử dụng metanol để kết tủa. Tỷ lệ hỗn hợp glycosid thô và metanol là giữa 1:2 đến 1:7 w/v, tốt nhất là 1:5, hàm lượng steviosid thu được trong khoảng 91,1-91,5%. Sự phân lập và tinh sạch rebaudiosid A được tiến hành bằng cách sử dụng etanol để kết tủa. Tỷ lệ xirô và etanol là 1:2 đến 1:7 w/v, tốt nhất là 1:5. Rebaudiosid A với 90,7-90,9% độ tinh khiết thu được. Steviosid và rebaudiosid A là hai chất tạo ngọt không sinh năng lượng, không đắng, áp dụng trong thực phẩm và dược phẩm. Từ khoá: cỏ ngọt, chiết xuất, steviosid, rebaudiosid A , tinh sạch, phân lập iii
  4. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô ABSTRACT The purpose of the study is to produce highly purified stevioside and rebaudioside A from the extract of Stevia rebaudiana Bertoni plant use in food and drugs. Stevia rebaudiana Bertoni leaves were dried and powdered leaves being subjected to water extraction and the resulted extract is purified using treatment with a base such as calcium hydroxide and then iron chloride, desalting, decolorizing, and evaporating the filtrate to drynessobtained glycoside. The mixture of glycosides, conducting isolation and purification of stevioside and rebaudioside A were developed using methanol, alcoholic precipitation.The highly purified stevioside and rebaudioside A were obtained.The preferable ratio of leaves to water is within the limits of about 1:20 to 1:25, wt/vol.The extraction temperature and time preferably were at 75oC for 240 min and and 100oC for 30min. The isolation and purification of Stevioside was developed using methanol precipitation. The proportion of glycosides and methanol was between 1:2- 1:7 w/v, preferably 1:5, the powder contents were around 91.1-91.5% of stevioside. The isolation and purification of rebaudioside A was developed using ethanol precipitation. The proportion of syrup and ethanol was between 1:2-1:7 w/v, preferably 1:5. Rebaudioside A with 90.7- 90.9% purity was obtained. Steviosid and rebaudiosid A are two sweeteners non-calorie, non- cariogenic, non-bitter, applied in foods and drugs. Keywords: Stevia rebaudiana, extracts, stevioside, rebaudioside A, purification, isolation. iv
  5. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ii TÓM TẮT iii ABSTRACT iii MỤC LỤC v DANH SÁCH HÌNH vi DANH SÁCH BẢNG viii DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT ix CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1 1.1Đặt vấn đề 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2 1.3 Nội dung nghiên cứu 2 CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3 2.1 Lịch sử về cây Cỏ Ngọt 3 2.2 Đặc điểm, tính vị và công dụng của cây Cỏ Ngọt 3 2.3 Thành phần hóa học của cây cỏ ngọt 7 2.4 Hoạt tính sinh học. 9 2.5 Các phương pháp chiết mẫu thực vật 11 CHƯƠNG III NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Nguyên liệu nghiên cứu 15 3.1.1 Nguyên liệu thí nghiệm 15 3.1.2 Hóa chất, chất chuẩn 15 v
  6. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô 3.1.3 Thiết bị và dụng cụ 15 3.2 Phương pháp nghiên cứu 16 3.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 16 3.2.2 Thiết kế thí nghiệm 16 3.2.3 Thời gian thực hiện đề tài 16 3.2.4 Bố trí thí nghiệm 16 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 4.1 Kết quả khảo sát tỷ lệ chiết giữa nước và nguyên liệu trong quá trình ly trích hỗn hợp glycosid thô 24 4.2 Kết quả khảo sát thời gian và nhiệt độ trong quá trình ly trích hỗn hợp glycosid thô 26 4.3 Kết quả phân lập và tinh sạch hai loại chất tạo ngọt steviosid và rebaudiosid A 27 CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 5.1 Kết luận 35 5.2 Đề nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC 1 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HOÁ LÝ 39 PHỤ LỤC 2 KẾT QUẢ THỐNG KÊ 40 PHỤ LỤC 3 MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM 50 PHỤ LỤC 4: QUY TRÌNH PHÂN LÂP, TINH SẠCH STEVIOSID VÀ REBAUDIOSIDA 54 vi
  7. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô DANH SÁCH HÌNH Hình 2.2 Cây Cỏ Ngọt Error! Bookmark not defined. Hình 2.3 Công thức hóa học của steviosid, thành phần chính được tìm thấy trong lá của cây Cỏ Ngọtvà một số thành phần khác có liên quan. 8 Hình 3.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tỷ lệ lá nước thích hợp trong quá trình chiết 17 Hình 3.2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ và thời gian thích hợp trong quá trình chiết 19 Hình 3.2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập, tinh sạch steviosid và rebaudiosid A 22 Hình 4.1 Khảo sát tỷ lệ chiết giữa nước và nguyên liệu 25 Hình 4.2 Khảo sát thời gian và nhiệt độ trong quá trình ly trích 26 Hình 4.3.1 Sắc ký đồ chuẩn steviosid 28 Hình 4.3.2 Sắc ký đồ mẫu steviosid 29 Hình 4.3.3 Sắc ký đồ chuẩn rebaudiosid A 33 Hình 4.3.4 Sắc ký đồ mẫu rebaudiosid A 31 Hình 1 Lá Cỏ Ngọt 50 Hình 2 Cột Amberlite 50 Hình 3 Dịch sau khi qua Amberlite 51 Hình 4 Bếp cách thủy 51 Hình 5 Hỗn hợp glucosid 52 Hình 6 Steviosid 52 vii
  8. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Hình 7 Lá Cỏ Ngọt nghiền nhỏ 53 Hình 8 Dung dịch Cỏ Ngọt 53 Hình 9 Quy trình phân lập, tinh sạch steviosid và rebaudiosidA 54 DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.3 Cấu trúc của các dẫn xuất steviosid và các hợp chất liên quan của cây Cỏ Ngọtvà độ ngọt so với đường sucrose. 9 Bảng 4.3.1 Kết quả phân lập và tinh sạch steviosid 32 Bảng 4.3.2 Kết quả phân lập và tinh sạch rebaudiosid A 32 viii
  9. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT HPLC sắc ký lỏng hiệu năng cao µm micromet mg/L milligram trên lít mL millilit nm nanomet % (v/v) phần trăm thể tích trên thể tích RT thời gian lưu UV – Vis đầu dò tử ngoại khả kiến RPF lưu lượng huyết tương qua thận GFR tăng tốc độ lọc cầu thận LC-MS sắc ký lỏng khối phổ ix
  10. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay trên thế giới, con người tiêu thụ một lượng đường rất đáng kể. Tuy nhiên ngoài mặt lợi đường cũng có những mặt trái của nó do cung cấp nhiều năng lượng nên có thể gây béo phì, cho dù liều lượng sử dụng không đáng kể. Vì vậy để tránh béo phì, tiểu đường thì người ta buộc phải dùng đường ít lại hay dùng một chất tạo ngọt khác để thay thế. Hiện nay, trên thị trường đã có rất nhiều sản phẩm hoá học tạo vị ngọt dùng để thay thế đường như saccharin, sodium cyclamate, sucrolose, acefulfame potassium nhưng phổ biến nhất là chất aspartame. Mặc dù các loại đường này rẻ tiền và tiện dụng nhưng người ta rất e ngại khi sử dụng vì chúng có thể gây ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ con người về lâu về dài. Qua một số nghiên cứu cho thấy saccharin gây ung thư bàng quang ở chuột. Vì vậy saccharin đã bị cấm sử dụng ở một số quốc gia. Trước các nguy hại của đường hoá học, tâm lý chung của người tiêu dùng là muốn tìm lại sản phẩm đường tự nhiên ly trích từ thực vật. Cây Cỏ Ngọt (Stevia rebaudiana Bertoni) là loại thảo dược có nguồn gốc từ Nam Mỹ, lá cây Cỏ Ngọt có chứa các chất ngọt tự nhiên như steviosid (4-13% trên trọng lượng khô), rebaudiosid A (2-4%), rebaudiosid C, rebaudiosid B (1– 2%), rebaudiosid D, rebaudiosid E và dulcosid A (0,4–0,7%) (Kinghorn et al., 1991).Trong đó độ ngọt của rebaudiosid A gấp 250 – 450 lần so với đường mía và steviosid khoảng 300 lần so với đường mía (Cramer et al.,1986). Chất tạo ngọt chứa trong cây Cỏ Ngọt là loại chất tạo ngọt không sinh năng lượng. Ngoài ra, chất tạo ngọt trong cây Cỏ Ngọt còn điều trị được bệnh tiểu đường, hạ đường huyết (Lailerd et al.,2004), béo phì, sâu răng, tăng huyết áp (Dyrskog et al., 2005), kháng vi khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng viêm (Ghosh et al., 2008). Đặc biệt trong cây Cỏ Ngọt có hai loại chất tạo ngọt steviosid và rebaudiosid A với độ ngọt cao và chiếm hàm lượng lớn nhất.Từ 1
  11. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô những lợi ích to lớn đó đã dẫn đến nhu cầu con người muốn sử dụng sản phẩm chất tạo ngọt tự nhiên, đặc biệt là hai loại chất tạo ngọt steviosid và rebaudiosid A. Do đó việc ly trích và tinh sạch để có hai loại chất tạo ngọt steviosid và rebaudiosid A với độ sạch cao, an toàn cho thực phẩm và dược phẩm là rất cần thiết. Xuất phát từ thực tế này, “Nghiên cứu chiết xuất và tinh sạch steviosid và rebaudiosid A từ cây Cỏ Ngọt (Stevia rebaudiana) làm chất tạo ngọt trong thực phẩm và dược phẩm” được thực hiện nhằm góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống của con người. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng quy trình chiết xuất, tinh sạch 02 hợp chất tự nhiên đặc trưng từ cây Cỏ Ngọt là steviosid và rebaudiosid A làm chất tạo ngọt trong thực phẩm và dược phẩm. 1.3 Nội dung nghiên cứu Để đạt được mục tiêu trên, đề tài đã tiến hành 3 nội dung chính sau đây: - Khảo sát tỷ lệ chiết giữa nước và nguyên liệu trong quá trình ly trích hỗn hợp glucosid thô. - Khảo sát thời gian và nhiệt độ trong quá trình ly trích hỗn hợp glucosid thô. - Phân lập và tinh sạch hai loại chất tạo ngọt steviosid và rebaudiosid A 2
  12. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Lịch sử về cây Cỏ Ngọt Vào năm 1887, MS Bertoni, một nhà thực vật học là người châu Âu đầu tiên nghiên cứu về Cỏ Ngọt. Sau đó vào năm 1931, nhà hóa học Pháp đã ly trích được steviosid. Steviosid là hợp chất tinh thể màu trắng có độ ngọt rất cao.Từ đó Cỏ Ngọt được sử dụng như một chất làm ngọt ở Anh trong thế chiến II. Nhật Bản đã sử dụng Cỏ Ngọt để thay thế cho saccharin sau khi nó bị cấm sử dụng vào những năm của thập niên 70 và chất ngọt từ Cỏ Ngọt được tiêu thụ tại Nhật Bản với số lượng rất lớn so với bất kỳ quốc gia nào khác. Tại Bắc Mỹ và Châu Âu, Cỏ Ngọt bắt đầu được sử dụng như là sản phẩm thảo dược và có sẵn trên thị trường vào những năm 1970 và 1980. Cỏ Ngọt đã được chiết xuất và cho phép sử dụng ở Mỹ vào năm 1994. 2.2 Đặc điểm, tính vị và công dụng của cây Cỏ Ngọt 2.2.1 Thực vật học (Đỗ Huy Bích et al., 2004) Tên khoa học: Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley. Hình 2.2 Cây Cỏ Ngọt 3
  13. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Họ: Cúc (Asteraceae). Cây thảo nhỏ, sống nhiều năm, cao 0,5 - 0,6 m và có khi cao tới 1m. Thân cứng mọc thẳng, có rãnh dọc và nhiều lông mịn, ít phân nhánh.Lá mọc đối, hình mác hoặc bầu dục, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn dài 5 -7 cm, rộng 1 - 1 , 5 cm, có 3 gân, 4-6 đôi răng nhọn ở phần nửa về phía đầu lá, hai mặt có lông trắng mịn, nhấm lá thấy có vị ngọt rất đậm, cuống lá rất ngắn. Hoa lưỡng tính, tụ họp thành đầu màu trắng ở ngọn. Quả bế, không có mào lông, hạt không có nội nhũ. Mùa hoa khoảng tháng 5-9 2.2.2 Phân bố, sinh thái (Đỗ Huy Bích et al., 2004) Chi Stevia Cav không có một đại diện nào ở vùng châu Á. Cỏ Ngọt đang được trồng phố biến ở Việt Nam hiện nay, được nhập nội từ một nước Nam Mỹ (nguồn gốc ở Paraguay) năm 1988. Cỏ Ngọt là cây ưa ấm và ưa sáng, có thể chịu bóng hoặc ưa bóng vào thời kỳ cây con. Vốn là cây ở vùng nhiệt đới, Cỏ Ngọt trồng ở Việt Nam sinh trưởng và phát triển tốt vào vụ xuân - hè. Về mùa đông, cây có hiện tượng rụng lá và hơi tàn lụi. Cây ra hoa, quả nhiều hàng năm. Tuy nhiên, người ta thường áp dụng cách nhân giống bằng cắm cành. 2.2.3 Bộ phận dùng (Đỗ Huy Bích et al., 2004) Phần trên mặt đất của cây Cỏ Ngọt. Thu hái lúc cây xum xuê. 2.2.4 Tác dụng dược lý (Đỗ Huy Bích et al., 2004) 2.2.4.1 Tác dụng hạ đường huyết: thành phần steviosid trong lá cây Cỏ Ngọt có tác dụng làm đường huyết giảm rõ rệt ở thỏ, chuột cống trắng và bệnh nhân mắc bệnh đái tháo đường. 2.2.4.2 Tác dụng giãn mạch: steviosid có tác dụng làm giãn tĩnh mạch toàn thân rõ rệt. 4
  14. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô 2.2.4.3 Tác dụng trên thận và huyết áp: thành phần steviosid trong lá cây Cỏ Ngọt có tác dụng làm tăng lưu lượng huyết tương qua thận (RPF), tăng tốc độ lọc cầu thận (GFR), hạ huyết áp, tăng bài niệu và tăng thải trừ natri. 2.2.4.4 Tác dụng kháng khuẩn Cao lá Cỏ Ngọt có tác dụng đối với Pseudomonas aeruginosa và Proteus vulgaris. Chưa thấy tài liệu công bố về tác dụng trên các vi khuẩn Streptococcus inutans, Lactobacillus plantarum và Lactobacillus casei là những vi khuẩn có liên quan đến quá trình sún răng ở trẻ em, vì hiện nay có dùng steviosid thay thế đường trong chế biến bánh kẹo. 2.2.4.5 Liều dùng an toàn ở người Nồng độ steviosid trong một số nước giải khát ở Nhật Bản là 0,005 - 0,007%. Nếu một ngày uống 1 lít thì lượng steviosid đưa vào cơ thể là 0,05 - 0,07g tương ứng với khoảng lg lá Cỏ Ngọt. Điều đó có thể được chấp nhận vì là liều an toàn, đã được Nhà nước Nhật cho phép. 2.2.4.6 Độc tính cấp: Cho chuột uống steviosid với liều 2g/kg không thấy có chuột chết và cũng không thấy có biểu hiện độc sau 2 tuần theo dõi. 2.2.4.7 Độc tính bán cấp: Cho chuột cống trắng ăn với liều dùng hàng ngày 0,5g/kg trong 56 ngày, các thông số theo dõi gồm cân nặng, các chỉ tiêu huyết học, các chỉ tiêu hoá sinh và xét nghiệm tổ chức học gan đều bình thường. 2.2.4.8 Độc tính trên thận: Thí nghiệm trên chuột cống trắng, liều cao steviosid có thể gây độc với thận, làm tăng urê và creatinin huyết thanh.Tiêm tĩnh mạch cho chuột cống trắng, liều 0,4; 0,8; 1,2; l,6g/kg rồi theo dõi độ thanh thải của một số chất có so sánh với lô đối chứng, thấy từ liều 0,8g/kg trở lên độ thanh thải inulin không thay đổi, chứng tỏ chức năng lọc cầu thận không bị ảnh hưởng. Độ thanh thải của glucose tăng, chứng tỏ chức năng tái hấp thu của ống lượn gần bị suy giảm, 5
  15. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô một phần glucose không được tái hấp thu và đã bị thải trừ qua nước tiểu. Độ thanh thải steviosid cao hơn độ thanh thải inulin, chứng tỏ steviosid còn bị thải trừ qua niêm mạc của ống thận. Ngoài ra, steviosid cũng gây bài niệu tăng thải natri niệu và làm tăng độ thanh thải của para-aminohippuric. Tiêm dưới da cho chuột cống trắng với liều 1,5g/kg, kết quả thấy những thay đổi giống thí nghiệm trên là tăng nồng độ urê và creatinin trong huyết thanh, thấy glucose trong nước tiểu. Ngoài ra về tổ chức bệnh học, thấy có biến đổi hình thái ở tế bào niêm mạc ống lượn gần. Những tổn thương này là do hoạt động của 2 enzym phosphatase kiềm và gama-glutamyl-transpeptidase tăng lên. Những enzym này khu trú chủ yếu ở điểm bàn chải của tế bào ống lượn gần. 2.2.4.9 Khả năng gây đột biến Nhiều thí nghiệm nghiên cứu khả năng gây đột biến trên các chủng Salmonella typhimurium TA 98, TA 100, TA 1535, TA 1538 và TM 677, hoặc trên chủng Escherichia coli WP2 đều xác định cao Cỏ Ngọt không gây đột biến. Có nghiên cứu cho biết một số chất chuyển hoá của steviosid lại có thể gây đột biến. Mặc dù steviosid không bị chuyển hoá trong cơ thể và thải trừ nguyên vẹn qua nước tiểu. Song người ta lo ngại một số tạp khuẩn vùng màng tràng có thể phân giải được steviosid. 2.2.5 Tính vị, công năng (Đỗ Huy Bích et al., 2004) Cỏ Ngọt có vị ngọt rất đậm, có ích cho người đái tháo đường và người béo phì, thuốc ít độc. 2.2.6 Công dụng (Đỗ Huy Bích et al., 2004) Chữa đái tháo đường: Cỏ Ngọt và steviosid có vị ngọt sẽ làm giảm nhu cầu chất đường và chất bột của người bệnh, vì thế sẽ làm giảm đường huyết. Liều dùng theo thử nghiệm ở Braxin là mỗi lần 0,25g steviosid (hoặc 2,5g lá Cỏ 6
  16. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Ngọt), ngày 4 lần, uống nhiều ngày. Ngoài ra Cỏ Ngọt và steviosid còn chữa béo phì do có vị ngọt sẽ làm giảm nhu cầu chất đường và chất bột của cơ thể, nên cũng có tác dụng chữa béo phì. Liều dùng 0,5 - lg steviosid chia ra 3 - 4 lần trong ngày, uống nhiều ngày. Lá Cỏ Ngọt hoặc steviosid thường dùng làm chất điều vị cho các loại trà thuốc, trà túi lọc tỷ lệ lá Cỏ Ngọt hoặc steviosid trong đó thường thấp. Tại Việt Nam, cũng đã có một số chế phẩm trà thuốc có Cỏ Ngọt như trà actisô - stevia. Trà sâm quy - stevia có sâm khu 5, tam thất, đương quy, thục địa, táo, long nhãn, ngũ gia bì và Cỏ Ngọt.Trà nhân trần, thảo quyết minh, Cỏ Ngọt.Trà túi lọc Sotevin có dừa cạn, hoa cúc, hoa hoè và Cỏ Ngọt. Chữa cao huyết áp hàng ngày uống trà sotevin. Dùng thay thế đường sacharose trong công nghiệp thực phẩm để làm chất điều vị cho bánh mứt kẹo, nước giải khát. 2.3 Thành phần hóa học của cây cỏ ngọt Trong các loại đường thay thế, chất ngọt tự nhiên đã được xem xét rất nhiều bởi các nhà nghiên cứu và đường trong cây Cỏ Ngọt được giả định là nguồn chất tạo ngọt tự nhiên chính. Một loạt các loài cây Cỏ Ngọt đã được nghiên cứu bởi các nhà hóa sinh và công nghệ sinh học về các thành phần hóa học của cây Cỏ Ngọt và chỉ ra có khoảng 110 loài, trong đó có 18 loài có tính năng tốt (Soejarto et al.,1982). Steviosid là một thành phần chính trong cây Cỏ Ngọt và steviosid chứa nhiều nhất trong lá của cây Cỏ Ngọt (Geuns, 2003). Cùng với steviosid, một số hợp chất ngọt khác như steviobiosid, rebaudiosid A, B, C, D, E và dulcosid A cũng đã được tìm thấy trong lá của Cỏ Ngọt (Savita et al.,2004). Việc xây dựng cấu trúc của các dẫn xuất steviosid và vị ngọt của nó so với sucrose được nghiên cứu đầy đủ (Cramer et al.,1986 ), (Geuns, 2003). Kết quả được ghi nhận ở Bảng 2.3 cùng với vị ngọt, cây Cỏ Ngọt cũng có một số dư vị đắng do sự hiện diện của một số loại tinh dầu, tannin và flavonoids và đã nhận thấy rằng steviosid và rebaudiosid A 7
  17. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô có trách nhiệm ở một mức độ cho dư vị đắng này, mặc dù vai trò của rebaudiosid A là ít hơn đáng kể so với các steviosid (Phillips, 1987). Hình2.3 Công thức hóa học của steviosid, thành phần chính được tìm thấy trong lá của cây Cỏ Ngọtvà một số thành phần khác có liên quan. 8
  18. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Bảng 2.3 Cấu trúc của các dẫn xuất steviosid và các hợp chất liên quan của cây Cỏ Ngọt và độ ngọt so với đường sucrose (Cramer et al., 1986 ), (Geuns, 2003) H Chu Chu Độ ngọt so với ợp chất ỗi R1 ỗi R2 sucrose Stevioside β - Glc β-Glc-β-Glc (2 1) 300 Steviolbioside H β - Glc - β - Glc (2 1) 100-125 β - Glc - β - Glc (2 1) Rebaudioside A β - Glc 250-50 β - Glc – (3 1) β - Glc - β - Glc (2 1) Rebaudioside B H 300-350 β - Glc – (3 1) β - Glc - α - Rha (2 1) Rebaudioside C β - Glc 50-120 β - Glc – (3 1) β - Glc - β - Glc (2 1) Rebaudioside D β - Glc - β - Glc (2 1) 250-450 β - Glc – (3 1) Rebaudioside E β - Glc - β - Glc (2 1) β - Glc - β - Glc (2 1) 150-300 Dulcoside A β - Glc β - Glc - α - Rha (2 1) 50-120 2.4 Hoạt tính sinh học Quá trình sử dụng hai thành phần chính của cây Cỏ Ngọt là steviosid và rebaudiosid A uống bằng đường miệng để kiểm tra độc tính thì được chấp nhận không độc trong quá trình sử dụng (Medon et al., 1982), (Toyoda et al., 1997). Sử dụng steviol glycosid với liều cao cho vào miệng của chuột và nuốt vào bụng cho thấy trọng lượng cơ thể của chuột giảm (Curry et al., 2008), nhưng không có bằng chứng mạnh mẽ về độc tính (Carakostas et al., 2008), 9
  19. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô (Hagiwara et al.,1984), nghiên cứu tác dụng gây ung thư của steviosid trên bàng quang thấy rằng không có tiền ung thư hoặc ung thư. Dịch chiết cũng như các chất tách được từ Cỏ Ngọt có tác dụng mạnh trong việc điều khiển quá trình chuyển hoá glucose và insulin trong cơ thế. Theo Chen et al., 2005, khi sử dụng steviosid với liều 0,5 mg/kg sẽ làm giảm lượng đường glucose trong máu đồng thời hạn chế sự kháng insulin ở chuột bị tiểu đường. Tác giả Ferreira cũng chỉ ra rằng dịch chiết nước Cỏ Ngọt (20 mg/kg/ngày) cũng có tác dụng làm ức chế quá trình chuyến hoá glucose trong gan trên chuột thí nghiệm (Arayjo et al.,2006). Trước đó vào năm 1986, Curi đã thử nghiệm tác dụng của dịch chiết nước Cỏ Ngọt trên một nhóm người tình nguyện. Kết quả cho thấy với dịch chiết 5 g lá dùng liên tục trong 3 ngày, hàm lượng đường glucose trong huyết tương giảm rõ rệt (Curi et al.,1986). Các nghiên cứu này mở ra khả năng ứng dụng Cỏ Ngọt trong việc chữa trị bệnh tiểu đường và các bệnh liên quan đến sự chuyển hoá glucose. Ngoài ra, cùng với tác dụng giảm đường huyết, steviosid còn có tác dụng hạ huyết áp trên lô chuột bị tiểu đường (Xiao et al., 2003). Tác dụng chống ung thư và chống viêm của Cỏ Ngọt cũng được nghiên cứu chi tiết trên mô hình chuột thí nghiệm gây u bằng 12-0- tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA). Các hợp chất tách được từ cây này gồm steviosid, rebaudiosid A và C, và dulcosid A ức chế mạnh quá trình gây viêm đồng thời hỗn hợp các hợp chất này ngăn ngừa tốt sự hình thành ung thư da trên chuột với liều 1,0 và 0,1 mg/con (Yasukawa et al.,2002). Hợp chất steviosid còn được sử dụng trong trị liệu chữa tiêu chảy hiệu quả. Khởi nguồn từ kết quả nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn và kháng virút của dịch chiết nóng cây Cỏ Ngọt cho thấy tác dụng diệt mạnh chủng E. coli là nguyên nhân gây ra bệnh ỉa chảy (Tomita et al.,2002). Các nghiên cứu tiếp sau đó khẳng định tác dụng và khả năng ứng dụng rất cao của Cỏ Ngọt cũng 10
  20. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô như nhóm chất steviosid trong việc chữa trị ỉa chảy (Pariwat et al.,2008),(Shiozaki et al.,2006),(Takahashi et al.,2001). Ngoài các hợp chất đitecpen, trong cây Cỏ Ngọt còn chứa nhóm chất phenol và flavonoit. Tác giả Ghanta đã định lượng được hàm lượng nhóm chất này trong dịch chiết etyl axetat là tương đương 0,86 mg axit galic và 0,83 mg quercetin trên 1 mg. Bằng phân tích LC-MS và phổ NMR, nhóm tác giả đó nhận dạng được sự có mặt của quercetin-3-O-arabinoside, quercitrin, apigenin, apigenin-4-O-glucoside, luteolin, and kaempferol-3-O-rhamnoside. Dịch chiết metanol và etyl axetat cho thấy có khả năng diệt các gốc tự do bằng phương pháp thử DPPH và lipid peroxidation. Nghiên cứu này chứng tỏ cây Cỏ Ngọt còn là một dược liệu thiên nhiên chống oxy hoá hiệu quả (Ghanta et al., 2007). 2.5 Các phương pháp chiết mẫu thực vật Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân cực trung bình ) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau. 2.5.1 Chọn dung môi chiết Thông thường các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau. Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm. Dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận. Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy. Những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng. Nếu chúng có lẫn các chất khác thì có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết. Thường có một số chất dẻo lẫn trong 11
  21. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô dung môi như các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar và tributylphosphat. Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong khâu bảo quản như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy bằng nhựa. Metanol và chloroform thường chứa dioctylphtalat [di-(2- etylhexyl) phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Chloroform, metylen clorit và metanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây như: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa Những tạp chất của chloroform như CH2C12, CH2ClBr có thể phản ứng với một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm khác. Tương tự như vậy sự có mặt của lượng nhỏ axit clohiđric (HCl) cũng có thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp chất khác. Vì chloroform có thể gây tổn thương cho gan và thận nên nó cần được thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng và phải đeo mặt nạ phòng độc. Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn chloroform. Metanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hiđrocacbon thế clo. Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn các thành phần trong tế bào.Trái lại, khả năng phân cực của chlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các etanol hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp. Vì vậy khi chiết bằng etanol thì các chất này cũng bị hoà tan đồng thời. Thông thường dung môi etanol trong nước có những đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ. Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng metanol trong suốt quá trình chiết (Goad et al.,1997). Thí dụ trechlonolid A 12
  22. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô thu được từ Trechonaetes aciniata được chuyển thành trechonolid B bằng quá trình phân huỷ 1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense được chiết trong metanol nóng. Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà thay vào đó là dùng dung dịch nước của metanol. Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit dễ nổ, peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với những họp chất không có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid. Tiếp đến là axeton cũng có thế tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit. Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit-bazơ có thể tạo thành những sản phẩm mong muốn. Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết tránh được sự phân huỷ chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất mong muốn. Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cô quay ở nhiệt độ không quá 30-40ỏC, với một hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn. 2.5.2 Quá trình chiết Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau: - Chiết ngâm. - Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết soxhlet. - Chiết sắc với dung môi nước. - Chiết lôi cuốn theo hơi nước. Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời 13
  23. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô gian. Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi, dung môi có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Trước đây, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng bình thuỷ tinh. Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ rồi chất chiết được lấy ra. Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa. Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách khác nhau. Như vậy tuỳ thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý nhằm đạt hiệu quả cao. Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết. 14
  24. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô CHƯƠNG III NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nguyên liệu nghiên cứu 3.1.1 Nguyên liệu thí nghiệm Nguyên liệu dùng để chiết xuất các đối tượng nghiên cứu của đề tài: lá cây Cỏ Ngọt dùng để chiết xuất steviosid và rebaudiosid A. Cỏ Ngọt thuộc họ cúc được mua tại nhà thuốc Minh Phát, 73B Hải Thượng Lãng Ông, phường 10, quận 5, Thành phố Hồ Chí Minh. 3.1.2 Hóa chất, chất chuẩn - Metanol (99,99%), (Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Đức) - Acetonitrile (99,9 %), (Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Đức) - Etanol (99,9%), (Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Đức) - Steviosid hydrate (98%), (Sigma – Aldrich) - Rebaudiosid A (96%),(Sigma – Aldrich) - Amberlite FPC23 H (Sigma – Aldrich) - Amberlite FPA51 (Sigma – Aldrich) - Amberlite FPA98Cl (Sigma – Aldrich) - Ca(OH)2(96%), (Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Đức) - FeCl3 (98%)(Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Đức) - Nước khử ion 3.1.3 Thiết bị và dụng cụ - Sắc ký lỏng cao áp (HPLC, 20A, Shimadzu, Nhật) - Thiết bị lọc nước khử ion (TKA, Thermo Fisher scientific, Mỹ) - Thiết bị đun cách thuỷ (Thermo Haake V15, Mỹ) - Cân phân tích (Sartorius, MC 210S, Đức) 15
  25. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô - Tủ sấy (Memmert, Đức) - Lọc polysulfone (Liumar Technologies, Ottawa, Canađa) - Các thiết bị thông thường khác hỗ trợ cho quá trình phân tích. 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Sơ đồ nghiên cứu Sơ đồ nghiên cứu. Xây dựng qui trình chiết xuất, phân lập, tinh chế steviosid & 2 hợp chất đặc trưng từ dược rebaudiosid A liệu đạt độ tinh khiết cao. 3.2.2 Thiết kế thí nghiệm - Cỡ mẫu: tùy theo hàm lượng hợp chất đặc trưng trong dược liệu, khối lượng dược liệu (cỡ mẫu) sử dụng đủ để chiết xuất nhiều mẻ nhằm thu được 20 g hợp chất. - Chiết xuất, phân lập, tinh chế: thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Khoa Sinh học Ứng dụng và phòng thí nghiệm Công nghệ Thực phẩm Trường Đại học Tây Đô. - Phân tích và kiểm nghiệm: phòng thí nghiệm trung tâm Khoa Dược và Điều Dưỡng Trường Đại học Tây Đô. 3.2.3 Thời gian thực hiện đề tài Đề tài được thực hiện từ 10/2014 đến 10/2015. 3.2.4 Bố trí thí nghiệm 3.2.4.1 Thí nghiệm 1: khảo sát tỷ lệ chiết giữa nước và nguyên liệu trong quá trình ly trích hỗn hợp glycosid thô. * Mục đích: tìm ra tỷ lệ chiết xuất thích hợp giữa nguyên liệu và nước mà ở đó hàm lượng glycosid thô cao nhất. 16
  26. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố, 5 mức độ với 5 nghiệm thức và 3 lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức. Kết quả phân tích hàm lượng glycosid thô được xử lý thống kê. Nhân tố A: tỷ lệ nước A1: 1:6 A2: 1:9 A5: 1:25 A3: 1:15 A4: 1:20 Bột Cỏ Ngọt + Thêm nước A1 A2 A3 A4 A5 + Lọc Dịch chiết + Sấy Cân Hình 3.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tỷ lệ lá nước thích hợp trong quá trình chiết 17
  27. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô * Tiến hành: Mẫu được mua về tiến hành tách lá ra khỏi thân cây, lá mang phơi khô dưới ánh sáng mặt trời trực tiếp ở nhiệt độ dao động từ 25°C đến 30°C trong 24 giờ đến 48 giờ. Các lá khô được nghiền thành bột. Bột lá Cỏ Ngọt được cho vào túi polyethylene, buộc kín và bảo quản ở nhiệt độ 4 ± 1°C trong tủ lạnh cho đến khi sử dụng (Abou-Arab et al., 2010). Bột lá Cỏ Ngọt cân 1g cho vào cốc 50mL, cho thêm 6mL nước vào ta có tỷ lệ 1:6. Tương tự các cốc còn lại bố trí với tỷ lệ 1:9, 1:15, 1:20, 1:25. Sau đó cho tất cả các cốc vào bếp đun cách thủy với nhiệt độ 75oC trong vòng 120 phút, mỗi tỷ lệ được tiến hành 3 lần lặp lại. Khi kết thúc quá trình đun cách thủy, các cốc chứa dịch chiết sẽ được lọc qua giấy lọc. Tách lấy phần dịch lọc cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 105oC. Sau khi sấy xong mang cốc ra cho vào bình hút ẩm, chờ ổn định và tiến hành cân cốc. Tính được lượng glycosid thô. 3.2.4.2 Thí nghiệm 2: khảo sát thời gian và nhiệt độ trong quá trình ly trích glycosid thô. * Mục đích: chọn thời gian và nhiệt độ chiết xuất thích hợp để thu được hàm lượng glycosid thô tốt nhất. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 2 nhân tố, với 16 nghiệm thức và 3 lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức. Kết quả phân tích glycosid thô. Nhân tố B: nhiệt độ chiết Nhân tố C: thời gian chiết B1: 45oC B2: 75oC C1: 30 phút C2: 60 phút B3: 10oC B4:1000C C3:120 phút C4:240 phút 18
  28. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Cỏ Ngọt + Nghiền nhỏ + Thêm nước + Gia nhiệt B1 B2 B3 B4 + Thời gian gia nhiệt C1 C2 C3 C4 + Lọc Dịch lọc + Sấy Cân Hình 3.2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ và thời gian thích hợp trong quá trình chiết 19
  29. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Tiến hành Từ khảo sát tỷ lệ chiết giữa nước và nguyên liệu trong quá trình ly trích hỗn hợp glycosid thô ở trên ta chọn được tỷ lệ tốt nhất để tiến hành cho thí nghiệm khảo sát thời gian và nhiệt độ trong quá trình ly trích hỗn hợp glycosid thô. Cân 1g bột lá Cỏ Ngọt cho vào cốc 50mL thêm nước vào với tỷ lệ được chọn như trên. Tiến hành gia nhiệt các mẫu ở nhiệt độ 45oC, 75oC, 100oC và làm lạnh ở 10oC với thời gian lần lượt là 30, 60,120, 240 phút. Các mẫu sau đó được lọc qua giấy lọc. Phần rắn bỏ đi, phần dịch lọc cho vào cốc 50mL đã biết trước trọng lượng. Tiếp tục cho cốc chứa dịch lọc vào tủ sấy ở nhiệt độ 105oC và sấy đến khối lượng không đổi. Sau đó cân khối lượng, tính được hàm lượng hỗn hợp glycosid thô có trong mẫu. 3.2.4.3 Thí nghiệm 3: phân lập và tinh sạch hai loại chất tạo ngọt steviosid và rebaudiosid A * Mục đích: dùng metanol, cồn tinh sạch hai loại đường steviosid và rebaudiosid A + Phân lập, tinh sạch steviosid: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố là dung môi metanol với 6 nghiệm thức và 3 lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức. Việc phân tích hàm lượng steviosid bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Nhân tố D: dung môi metanol D1: 1:1 D2: 1:2 D3: 1:3 D4: 1:5 D5:1:6 D6: 1:7 20
  30. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô + Phân lập, tinh sạch rebaudiosid A: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố là dung môi etanol với 6 nghiệm thức và 3 lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức. Việc phân tích hàm lượng rebaudiosid A bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Nhân tố E: dung môi etanol E1: 1:1 E2: 1:2 E3: 1:3 E4: 1:5 E5: 1:6 E6:1:7 21
  31. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Bột lá Cỏ Ngọt + Thêm nước + Đun cách thủy + Lọc Bả Dịch lọc + Ca (OH) + FeCl3 +Lọc Tủa Dịch lọc + Cho qua cột Amberlite + Sấy Glucosid thô +Thêm methanol Steviosid + Sấy D1 D2 D3 D4 D5 D6 D Rắn ịch lọc +Sấy Xirô +Hòa tan vào nước +Lọc polysulfon +Sấy Xirô +Cồn (96o) E1 E2 E3 E4 E5 E6 +Lọc Rắn +Sấy Rebaudiosid A Hình 3.2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập, tinh sạch steviosid và rebaudiosidA 22
  32. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô * Tiến hành: Bột lá Cỏ Ngọt cân 300g thêm nước vào theo tỷ lệ lá: nước tốt nhất đã được chọn ở thí nghiệm khảo sát tỷ lệ chiết giữa nước và nguyên liệu trong quá trình ly trích hỗn hợp glycosid thô. Sau đó cho mẫu vào đun cách thủy ở nhiệt độ và thời gian đun tốt nhất đã được chọn ở thí nghiệm khảo sát thời gian và nhiệt độ trong quá trình ly trích hỗn hợp glycosid thô. Kết thúc thời gian đun, tiến hành cho mẫu qua giấy lọc, phần rắn bỏ đi, phần dịch lọc thu được cho Ca(OH)2 vào đến khi pH của dịch lọc khoảng 10, tiếp tục cho FeCl3 vào dịch lọc để tạo kết tủa. Tiến hành lọc lấy phần dịch, bỏ kết tủa nhằm loại bớt màu của dung dịch. Sau đó, tiếp tục cho phần dịch lọc thu được qua các cột chứa hạt Amberlite lần lượt Amberlite FPC23 H, Amberlite FPA51 và Amberlite FPA98Cl nhằm khử muối, khử ion, khử màu. Phần dịch sau khi cho qua các cột Amberlite mang sấy hoặc sấy phun thu được hỗn hợp glycosid thô. Hỗn hợp glycosid thô thu được đem hòa tan trong metanol và duy trì ở nhiệt độ 20-25°C, trong thời gian khoảng 30 - 60 phút. Tại thời gian này sự kết tủa được hình thành, lọc và làm khô kết tủa ta thu được steviosid, còn phần dịch lọc cho vào tủ sấy để loại bỏ metanol thu được được hỗn hợp ở dạng xirô. Hỗn hợp xirô này được pha loãng với nước và cho qua màng siêu lọc polysulfone. Tiếp tục thu dịch lọc đem sấy khô. Dịch lọc sấy khô thu được thêm etanol và duy trì ở nhiệt độ 45-50°C trong khoảng 30 phút. Trong thời gian này sự kết tủa được hình thành, lọc và làm khô kết tủa ta thu được rebaudiosid A tinh khiết. 23
  33. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả khảo sát tỷ lệ chiết giữa nước và nguyên liệu trong quá trình ly trích hỗn hợp glycosid thô. Trong quá trình chiết xuất, yếu tố ảnh hưởng quan trọng nhất đến hiệu suất chiết là dung môi được sử dụng trong quá trình trích ly với khối lượng nguyên liệu ban đầu không đổi. Khi lượng dung môi gia tăng thì quá trình trích ly diễn ra nhanh chóng và lượng chất tạo ngọt còn lại trong bã sẽ giảm. Ngoài ra mức độ công phá mẫu ban đầu cũng rất quan trọng. Khi mẫu được nghiền càng nhỏ thì năng suất trích ly sẽ càng cao và ngược lại. Vì với cấu trúc tế bào hoàn toàn bị phá vỡ, các phân tử dễ dàng tiếp xúc với dung môi nên đẩy nhanh và làm triệt để được tiến trình trích ly bởi dung môi. Ở thí nghiệm này, để tìm được tỷ lệ chiết giữa nước và nguyên liệu tốt nhất trong quá trình ly trích hỗn hợp glycosid thô thì mẫu đã được nghiền kỹ và dung môi được sử dụng là nước. Nước là dung môi phân cực. Vì chất tạo ngọt trong lá Cỏ Ngọt là chất phân cực nên tan tốt trong dung môi phân cực. Do đó, việc lựa chọn dung môi là nước để ly trích là thích hợp vì khi đó sẽ thu được lượng chất tạo ngọt tốt nhất. Theo (Nishiyama et al.,1992) cũng đã dùng nước để chiết xuất hàm lượng chất tạo ngọt trong lá Cỏ Ngọt khô. 24
  34. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô 0.2 d d 0.18 0.16 c 0.14 0.12 b 0.1 0.08 a 0.06 Hàm lượng glucosid thô (g) lượng glucosid Hàm 0.04 0.02 0 1:06 1:09 1:15 1:20 1:25 Tỷ lệ lá:nước Hình 4.1 Khảo sát tỷ lệ chiết giữa nước và nguyên liệu Thí nghiệm được tiến hành như đã nêu ở phần nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu có 5 nghiệm thức thay đổi giữa tỷ lệ dung môi khác nhau được tiến hành với 3 lần lặp lại. Bột lá khô ngâm với nước nóng ở nhiệt độ 75oC theo tỷ lệ khác nhau giữa bột và lá lần lượt là 1:6, 1:9, 1:15, 1:20, 1:25. Ở kết quả nghiên cứu này chỉ ra rằng khi bổ sung lượng nước từ tỷ lệ 1:6 – 1:25 thì nhận thấy lượng chất tạo ngọt tăng dần từ tỷ lệ 1:6 – 1:20 và từ tỷ lệ 1:20 – 1:25 thì lượng chất tạo ngọt không tăng nữa. Kết quả thống kê giữa hai tỷ lệ 1:20 và 1:25 không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy 95%. Ở tỷ lệ 1:20 – 1:25 lượng chất tạo ngọt không tăng là do lượng chất tạo ngọt và lượng nước đã đạt đến trạng thái cân bằng cho nên khi lượng nước tăng thêm thì lượng chất tạo ngọt thu được cũng không tăng. Từ các kết quả thu được có thể kết luận rằng hàm lượng chất tạo ngọt cao nhất là ở tỷ lệ từ 1:20 – 1:25, tốt nhất là ở tỷ lệ 1:20 được minh họa ở Hình 4.1 25
  35. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô 4.2 Kết quả khảo sát thời gian và nhiệt độ trong quá trình ly trích hỗn hợp glycosid thô Trong quá trình chiết xuất dược liệu, nhiệt độ và thời gian chiết xuất là hai nhân tố ảnh hưởng rất lớn đến việc chiết xuất. Nhiệt độ chiết xuất có ảnh hưởng đến khả năng chiết tách hàm lượng chất tạo ngọt trong cây Cỏ Ngọt. Khi nhiệt độ tăng sẽ làm giảm độ nhớt đồng thời làm tăng vận tốc khuếch tán, do đó tạo điều kiện thuận lợi cho việc chuyển các chất hòa tan từ trong nguyên liệu vào dung môi. Mặt khác nhiệt giúp cho quá trình trích ly dễ dàng hơn bằng cách phá hủy màng tế bào làm tăng khả năng hòa tan của bột lá Cỏ Ngọt và chất cần trích. Vì vậy nhiệt độ phù hợp sẽ cho hàm lượng chất tạo ngọt rất cao. Quá trình chiết xuất cũng phụ thuộc vào thời gian chiết xuất. Nếu thời gian trích ly quá ngắn thì không đủ để dung môi hòa tan chất tạo ngọt. Khi thời gian càng tăng thì hàm lượng chất tạo ngọt trong và ngoài tế bào sẽ càng đi đến trạng thái cân bằng. Khi đạt đến trạng thái cân bằng thì quá trình trích ly không xảy ra, do đó hiệu suất trích ly sẽ giảm. Hình 4.2 Khảo sát thời gian và nhiệt độ trong quá trình ly trích 26
  36. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Trong thí nghiệm khảo sát nhiệt độ và thời gian chiết xuất tỷ lệ bột lá Cỏ Ngọt và nước chọn được tỷ lệ tốt nhất là 1:20 là nhân tố cố định, các nhân tố thay đổi là nhiệt độ và thời gian. Ở thí nghiệm này nhiệt độ khảo sát là 45oC, 75oC, 10oC, 100oC, thời gian khảo sát cho mỗi nhiệt độ là 30, 60, 120, 240 phút. Kết quả trình bày ở Hình 4.2 cho thấy lượng chất tạo ngọt của các nghiệm thức dao động từ 0,065-0,189g và giữa các nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với mức độ tin cậy 95%. Từ đó cho thấy quá trình chiết xuất ở nhiệt độ và thời gian khác nhau thì kết quả hàm lượng chất tạo ngọt khác nhau, nên trong quá trình chiết xuất nhiệt độ và thời gian là hai nhân tố ảnh hưởng rất lớn. Nhìn chung, quá trình khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ có hai nghiệm thức cao nhất là 75oC, 240 phút có hàm lượng đường 0,189g và nghiệm thức 100oC, 30 phút có kết quả 0,185g, được minh họa ở Hình 4.2 Hai nghiệm thức này không khác biệt có ý nghĩa thống kê với mức độ tin cậy 95%. 4.3 Kết quả phân lập và tinh sạch hai loại chất tạo ngọt steviosid và rebaudiosid A Dịch chiết được kiềm hóa bởi canxi hydroxit và sau đó bằng sắt (III) clorua, tiến hành khử muối, khử ion, khử màu bằng Amberlite và làm bay hơi dịch lọc đến khô thu được hỗn hợp glycosid thô. Hỗn hợp glycosid thô tiến hành phân lập và tinh sạch steviosid và rebaudiosid A bằng cách sử dụng metanol, etanol để kết tủa thu được steviosid và rebaudiosid A có độ tinh khiết cao. Kết quả hàm lượng steviosid và rebaudiosidA sau phân lập, tinh sạch được đo bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và trình bày ở Hình 4.3.1, 4.3.2, 4.3.3 và 4.3.4. 27
  37. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Hình 4.3.1 Sắc ký đồ chuẩn steviosid 28
  38. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Hình 4.3.2 Sắc ký đồ mẫu steviosid 29
  39. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Hình 4.3.3 Sắc ký đồ chuẩn rebaudiosid A 30
  40. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Hình 4.3.4 Sắc ký đồ mẫu rebaudiosid A 31
  41. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô - Phân lập và tinh sạch steviosid Phân lập và tinh sạch hàm lượng steviosid từ glycosid thô bằng cách sử dụng metanol, tỷ lệ glycosid thô và metanol được khảo sát trong khoảng 1:2 đến 1:7. Xác định hàm lượng steviosid bằng HPLC ta thu được kết quả ở Bảng 4.3.1. Qua kết quả thu được ta thấy hàm lượng steviosid dao động từ 74,3% đến 91,4% và giữa các nghiệm thức khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy 95%. Theo đó, ở tỷ lệ 1:2 đến 1:4 khi hàm lượng metanol tăng dần thì hàm lượng steviosid có độ tinh khiết cũng tăng và giữa các nghiệm thức từ 1:2 đến 1:4 có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy 95%. Ở tỷ lệ 1:5 đến 1:7 mặc dù hàm lượng metanol tăng dần nhưng hàm lượng steviosid không tăng và giữa các nghiệm thức này không khác biệt có ý nghĩa thống kê. Nhìn chung, từ kết quả ở trên cho thấy rằng tỷ lệ tốt nhất cho quá trình phân lập và tinh sạch hàm lượng steviosid là tỷ lệ 1:5 và độ tinh khiết của steviosid là 91,1% - 91,5%. Bảng 4.3.1 Kết quả phân lập và tinh sạch steviosid Tỷ lệ bột và metanol(w/v) Hàm lượng steviosid (%) 1:2 74,3a±0,1528 1:3 74,7b±0,0577 1:4 80,8c±0,1528 1:5 91,3d±0,2000 1:6 91,2d±0,1528 1:7 91,4d±0,0707 Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại 32
  42. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Các giá trị có mẫu tự giống nhau không khác biệt về mặt thống kê ở độ tin cậy 95% - Phân lập và tinh sạch rebaudiosid A Phần dịch lọc từ thí nghiệm tinh sạch steviosid cho vào tủ sấy để loại bỏ metanol và tiến hành tinh sạch rebaudiosid A. Dịch lọc sau khi loại bỏ methanol được pha loãng với nước và cho qua màng siêu lọc polysulfone. Dịch lọc thu được đưa đi sấy khô thu được xirô. Xirô thu được thêm etanol và duy trì nhiệt độ ở mức 45-50°C, khoảng 30 phút. Trong thời gian này sự kết tủa được hình thành, lọc lấy kết tủa và làm khô. Hàm lượng chất tạo ngọt thu được đem đi xác định rebaudiosid A bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Rebaudiosid A có độ tinh khiết thu được trình bày ở Bảng 4.3.2. Bảng 4.3.2 Kết quả phân lập và tinh sạch rebaudiosid A Tỷ lệ xirô và etanol (w/v) Hàm lượng Rebaudiosid A (%) 1:2 88,5a±0,0577 1:3 90,5b±0,0577 1:4 90,6c±0,0001 1:5 90,8d±0,1000 1:6 90,7d±0,1155 1:7 90,8d±0,0577 Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại Các giá trị có mẫu tự giống nhau không khác biệt về mặt thống kê ở độ tin cậy 95% 33
  43. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Trong quá trình phân lập và tinh sạch hàm lượng rebaudiosid A, tỷ lệ hỗn hợp xirô và etanol dùng giới hạn ở khoảng 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7. Qua kết quả trình bày ở Bảng 4.3.2 cho thấy hàm lượng rebaudiosid A dao động từ 88,5% đến 90,8%, giữa các nghiệm thức khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy 95%. Bên cạnh đó, cũng thấy rằng ở các tỷ lệ 1:2, 1:3, 1:4 hàm lượng metanol tăng dần thì hàm lượng rebaudiosid A cũng tăng theo. Ở các tỷ lệ 1:5, 1:6, 1:7 hàm lượng etanol tăng nhưng tỷ lệ rebaudiosid A không tăng. Vì thế, trong quá trình phân lập và tinh sạch rebaudiosid A tỷ lệ bột và etanol tốt nhất là 1:5 và độ tinh khiết của rebaudiosid A là 90,7% - 90,9%. 34
  44. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua nghiên cứu này, quá trình khảo sát tỷ lệ thích hợp của bột lá Cỏ Ngọt và nước trong quá trình chiết xuất giới hạn khoảng 1:20 đến 1:25 w/v. Nhiệt độ và thời gian chiết xuất tốt nhất là 75oC trong 240 phút và 100oC trong 30 phút. Sự phân lập và tinh sạch steviosid từ hỗn hợp glycosid thô đã được tiến hành bằng cách sử dụng metanol để kết tủa, tỷ lệ glycosid thô và metanol là giữa 1:2 đến 1:7 w/v, tốt nhất là 1:5 w/v, hàm lượng steviosid thu được trong khoảng 90,1% - 91,5%. Sự phân lập và tinh sạch rebaudiosid A được tiến hành bằng cách sử dụng etanol để kết tủa rebaudiosid A, tỷ lệ xirô và etanol là 1:2 đến 1:7 w/v, tốt nhất là 1:5 w/v, rebaudiosid A với 90,7% - 90,9% độ tinh khiết thu được. Hai chất ngọt thu được không sinh năng lượng, không đắng, áp dụng trong thực phẩm và dược phẩm. 5.2 Đề nghị - Tiếp tục tinh sạch hợp chất steviosid và rebaudiosid A trên đạt tiêu chuẩn chất chuẩn đối chiếu dùng trong lĩnh vực hóa phân tích và kiểm nghiệm. - Tiếp tục phân lập các chất còn lại rebaudiosid B, C, D, E và Dulcosid 35
  45. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Abou-Arab A. E, Abou-Arab A. A, and Abu-Salem M. F. (2010). Physico-chemical assessment of natural sweeteners steviosides produced from Stevia rebaudiana bertoni plant. African Journal of Food Science 4(5): 269- 281. 2.Arayjo Funari Ferri L, Bazotte RB. (2006). Comparative effects of Stevia rebaudiana leaves and stevioside on glycaemia and hepatic gluconeogenesis. Planta Med, 72, 691-696. 3.Carakostas M.C, Curry L.L, Boileau A.C, Brusick D.J. (2008). Overview the history, echnical function and safety of rebaudioside A, a naturallyoccurring steviol glycoside, for use in food and beverages. Food and Chemical Toxicology. 46: S1–S10. 4.Chen TH, Chen SC, Chan P, Chu YL, Yang HY, Cheng JT. (2005). Mechanism of the hypoglycemic effect of stevioside, a glycoside of Stevia rebaudiana. Planta Med. 71, 108- 113. 5 Cramer B, Ikan R. (1986). Sweet glycosides from the Steviaplant. Chemistry in Britain 22: 915-916. 6.Curry L.L, Roberts A. (2008). Subchronic toxicity of rebaudioside A. Food Chem. Toxicol.46/7S, S11–S20. 7.Curi R, Alvarez M, Bazotte RB, Botion LM, Godoy JL, Bracht A. (1986). Effect of Stevia rebaudiana on glucose tolerance in normal adult humans. Braz J Med Biol Res, 19, 771-4. 8.Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Trung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiến, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập, Trần Toàn.(2004). Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam. Nhà xuất bản Khoa học Kỹ Thuật Hà Nội tập 1, trang 495-498. 9.Dyrskog SE, Jeppensen PB, Colombo M, Abudula R, Hermansen K. (2005). Preventive effects of soy based diet supplemented with stevioside on development of type 2 diabetes. Metabolism; 54: 1181-1188. 10.Geuns, J.M. (2003). Stevioside. Phytochemistry. 64(5): 913-921. 11.Ghosh S, Subhudhi E, Nayak S. (2008). Antimicrobial assay of Stevia rebaudiana Bertoni leaf extracts against 10 pathogen. Int J Integrative Biol; 2(1): 27-31. 36
  46. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô 12.Ghanta S, Banerjee A, Poddar A, Chattopadhyay S. (2007). Oxidative DNA damage preventive activity and antioxidant potential of Stevia rebaudiana (Bertoni) Bertoni, a natural sweetener. J Agric Food Chem.55, 10962-10967. 13.Goad J. L. and Akihisa T. (1997). Analysis of sterols, Blackie Academic and Professional Pub First edition, p.378. 14.Hagiwara A, Fukushima S, Kitaori M. (1984). Effects of the three sweetenerson rats urinary bladder carcinogenesis initiated by Nbutyl- N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine. Gann. 75: 763–768. 15. Kinghorn A.D, Soejarto D.D. (1991) .Stevioside. In: Nabors L.B, Gelardi R.C. (eds) Alternative Sweeteners. New York: Marcel Dekker, 157–171. 16.Lailerd N, Saengsirisuwan V, Sloniger JA, Toskulkao C, Henriksen EJ. (2004). Effects of stevioside on glucose transport activity in insulin-sensitive and insulin-resistant rat skeletal muscle. Metabolism 53, 101-107. 17.Medon P.J, Pezzuto J.M, Havanec-Brown J.M, Nanayakkara N.P, Soejarto D.D, Kamath S.K. (1982). Safety assessment of some Steviarebaudiana sweet principles. Fed. Proc. 41, 1568−1982. 18.Nishiyama P, Alvarez M, Vieira LG. (1992). Quantitative analysis ofstevioside in the leaves of Stevia rebaudiana by near infraredreflectance spectroscopy. J. Sci. Food Agric. 59: 277-281. 19.Pariwat P, Homvisasevongsa S, Muanprasat C, & Chatsudthipong V. (2008). A natural plant-derived dihydroisosteviol prevents choleratoxin-induced intestinal fluid secretion. J Pharmacol Exp Ther 324,798-805. 20.Phillips K.C. (1987). Stevia: Steps in developing a new sweetener. In: Grenby TH, editor. Developments in sweeteners New York: Elsevier. pp 1–5. 21.Savita S.M, Sheela K, Sunanda S, Shankar A.G, Ramakrishna P, Sakey S. (2004). Health implications of Stevia rebaudiana. J. Hum. Eco. 15: 191-194. 22.Sharma N, Kaushal N, Chawla A, Mohan M, Sethi A, Sharma Y. (2006). Stevia rebaudiana A review. Agrobios Newslett. 5(7):46–48. 37
  47. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô 23.Shiozaki K, Fujii A, Nakano T, Yamaguchi T, & Sato M. (2006). Inhibitory effects of hot water extract of the Stevia stem on the contractile response of the smooth muscle of the guinea pig ileum. Biosci Biotechnol Biochem 70, 489-494. 19 24.Soejarto D.D. (2002). Ethnobiology of Stevia and Stevia rebaudiana. In:Kinghorn, A.D.(Ed.), Stevia the genus Stevia (Medicinal and Aromatic Plants– Industrial Profiles). Taylor & Francis/CRC Press, New York/London, UK, 40–67. 25.Soejarto DD, Kinghorn AD, Fransworth NR .(1982). Potential sweetening agents of plants origin. J.Nat.Prod.45:590- 599. 26.Toyoda K, Matsui H, Shoda T, Uneyama C, Takada K, Takahashi M.(1997). Assessment of the carcinogenicity of stevioside in F344 rats. FoodChem. Toxicol. 35: 597–603. 27.Tomita T, Sato N, Arai T, Shiraishi H, Sato M, Takeuchi, M. (1997). Bactericidal activity of a fermented hot-water extract from Stevia rebaudiana Bertoni towards enterohemorrhagic Escherichia coli 0157:H7 and other food-borne pathogenic bacteria. Microbiol Immunol 4, 1005-1009. 28.Takahashi K, MatsudaM, Ohashi K, Taniguchi K, Nakagomi 0, Abe Y. (2001). Analysis of anti-rotavirus activity of extract from Stevia rebaudiana Phytochemistry, 1976, 15,981-983. 29.Xiao J, Kruhuffer M, Orntoft T, Hermansen K. (2003). Antihyperglycemic and blood pressure-reducing effects of stevioside in the diabetic Goto- Kakizaki rat. Metabolism. 52, 372-378. 30.Yasukawa K, Kitanaka S, Seo S.(2002). Inhibitory effect of stevioside on tumor promotion by 12-O-tetradecanoylphorbol- 13-acetate in two-stage carcinogenesis in mouse skin. Biol Pharm Bull, 25, 1488- 1490. 38
  48. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô PHỤ LỤC 1.PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HOÁ LÝ Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) HPLC phân tích được thực hiện bằng cách sử dụng cột HIQSIL 100 C18 (25 cm x 4,6 mm ID, 5 micron). Nhiệt độ cột được duy trì ở mức 27-28°C và đầu dò UV điều chỉnh ở 210 nm. Pha động là acetonitril HPLC và nước khử ion (80:20) và độ pH được điều chỉnh đến 3,0 bằng acid phosphoric 85%. Các mẫu được lọc qua bộ lọc 0,22 µm hoặc tương đương. Thể tích tiêm đã được thiết lập để 10μL với tốc độ dòng của 1ml / phút. Các chuẩn steviosid hydrate (98%) và rebaudiosid A (96%), (Sigma – Aldrich) đã được sử dụng. Phân tích thống kê Các thí nghiệm được tiến hành ba lần lặp lại. Phân tích phương sai (ANOVA) được thực hiện và sự khác biệt có ý nghĩa (p <0,05) giữa các giá trị trung bình được đánh giá bởi Duncan, sử dụng SPSS phiên bản 19.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). 39
  49. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô PHỤ LỤC 2 KẾT QUẢ THỐNG KÊ 1. Kết quả thống kê khảo sát tỷ lệ bột lá Cỏ Ngọt và nước Descriptives Hamluongduong 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std. Deviation Std. Error Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum 1:6 3 .063767 .0004163 .0002404 .062732 .064801 .0633 .0641 1:9 3 .096633 .0020551 .0011865 .091528 .101738 .0953 .0990 1:15 3 .151200 .0039000 .0022517 .141512 .160888 .1473 .1551 1:20 3 .183567 .0033975 .0019616 .175127 .192007 .1798 .1864 1:25 3 .183600 .0034699 .0020033 .174980 .192220 .1796 .1858 Total 15 .135753 .0497607 .0128482 .108197 .163310 .0633 .1864 Test of Homogeneity of Variances Hamluongduong Levene Statistic df1 df2 Sig. 1.689 4 10 .228 40
  50. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô ANOVA Hamluongduong Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups .035 4 .009 1.001E3 .000 Within Groups .000 10 .000 Total .035 14 Post Hoc Tests Subset for alpha = 0.05 Nghiem thuc N 1 2 3 4 a Duncan 1:6 3 .063767 1:9 3 .096633 1:15 3 .151200 1:20 3 .183567 1:25 3 .183600 Sig. 1.000 1.000 1.000 .989 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000. 41
  51. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô 2. Kết quả thống kê khảo sát thời gian và nhiệt độ trong quá trình ly trích Hamluongduong 95% Confidence Interval for Mean Std. Upper N Mean Deviation Std. Error Lower Bound Bound Minimum Maximum 45C,30p 3 .156233 .0009609 .0005548 .153846 .158620 .1552 .1571 45C,60p 3 .161567 .0012503 .0007219 .158461 .164673 .1603 .1628 45C,120p 3 .164333 .0013650 .0007881 .160942 .167724 .1631 .1658 45C,240p 3 .167900 .0016523 .0009539 .163796 .172004 .1663 .1696 75C,30p 3 .171700 .0051176 .0029547 .158987 .184413 .1675 .1774 75C,60p 3 .176500 .0026889 .0015524 .169820 .183180 .1748 .1796 75C,120p 3 .173100 .0023643 .0013650 .167227 .178973 .1706 .1753 75C,240p 3 .189333 .0061330 .0035409 .174098 .204568 .1854 .1964 10C,30p 3 .161067 .0005686 .0003283 .159654 .162479 .1606 .1617 10C,60p 3 .153167 .0003512 .0002028 .152294 .154039 .1528 .1535 10C,120p 3 .158800 .0007211 .0004163 .157009 .160591 .1582 .1596 10C,240p 3 .159267 .0001528 .0000882 .158887 .159646 .1591 .1594 100C,30p 3 .184667 .0040415 .0023333 .174627 .194706 .1810 .1890 100C,60p 3 .144567 .0030892 .0017836 .136893 .152241 .1410 .1464 100C,120p 3 .064867 .0017616 .0010171 .060491 .069243 .0629 .0663 100C,240p 3 .116433 .0130470 .0075327 .084023 .148844 .1014 .1248 Total 48 .156469 .0292170 .0042171 .147985 .164952 .0629 .1964 42
  52. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Test of Homogeneity of Variances Levene Statistic df1 df2 Sig. 7.745 15 32 .000 ANOVA Hamluongduong Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups .040 15 .003 148.610 .000 Within Groups .001 32 .000 Total .040 47 43
  53. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Subset for alpha = 0.05 Nghiemthuc N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 a Duncan 100C,120p 3 .064867 100C,240p 3 .116433 100C,60p 3 .144567 10C,60p 3 .153167 45C,30p 3 .156233 .156233 10C,120p 3 .158800 .158800 .158800 10C,240p 3 .159267 .159267 .159267 10C,30p 3 .161067 .161067 .161067 45C,60p 3 .161567 .161567 .161567 45C,120p 3 .164333 .164333 45C,240p 3 .167900 .167900 75C,30p 3 .171700 .171700 75C,120p 3 .173100 .173100 75C,60p 3 .176500 100C,30p 3 .184667 75C,240p 3 .189333 Sig. 1.000 1.000 1.000 .114 .176 .160 .077 .163 .197 .184 44
  54. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Hamluongduong 95% Confidence Interval for Mean Std. Upper N Mean Deviation Std. Error Lower Bound Bound Minimum Maximum 45C,30p 3 .156233 .0009609 .0005548 .153846 .158620 .1552 .1571 45C,60p 3 .161567 .0012503 .0007219 .158461 .164673 .1603 .1628 45C,120p 3 .164333 .0013650 .0007881 .160942 .167724 .1631 .1658 45C,240p 3 .167900 .0016523 .0009539 .163796 .172004 .1663 .1696 75C,30p 3 .171700 .0051176 .0029547 .158987 .184413 .1675 .1774 75C,60p 3 .176500 .0026889 .0015524 .169820 .183180 .1748 .1796 75C,120p 3 .173100 .0023643 .0013650 .167227 .178973 .1706 .1753 75C,240p 3 .189333 .0061330 .0035409 .174098 .204568 .1854 .1964 10C,30p 3 .161067 .0005686 .0003283 .159654 .162479 .1606 .1617 10C,60p 3 .153167 .0003512 .0002028 .152294 .154039 .1528 .1535 10C,120p 3 .158800 .0007211 .0004163 .157009 .160591 .1582 .1596 10C,240p 3 .159267 .0001528 .0000882 .158887 .159646 .1591 .1594 100C,30p 3 .184667 .0040415 .0023333 .174627 .194706 .1810 .1890 100C,60p 3 .144567 .0030892 .0017836 .136893 .152241 .1410 .1464 100C,120p 3 .064867 .0017616 .0010171 .060491 .069243 .0629 .0663 100C,240p 3 .116433 .0130470 .0075327 .084023 .148844 .1014 .1248 45
  55. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô 3. Kết quả thống kê phân lập và tinh sạch rebaudiosid A hamluong Descriptives 95% Confidence Interval for Mean Std. N Mean Deviation Std. Error Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum 1:2 3 88.467 .0577 .0333 88.323 88.610 88.4 88.5 1:3 3 90.467 .0577 .0333 90.323 90.610 90.4 90.5 1:4 3 90.600 .0000 .0000 90.600 90.600 90.6 90.6 1:5 3 90.800 .1000 .0577 90.552 91.048 90.7 90.9 1:6 3 90.733 .1155 .0667 90.446 91.020 90.6 90.8 1:7 3 90.833 .0577 .0333 90.690 90.977 90.8 90.9 Total 18 90.317 .8631 .2034 89.887 90.746 88.4 90.9 Test of Homogeneity of Variances hamluong Levene Statistic df1 df2 Sig. 2.650 5 12 .077 ANOVA hamluong Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 12.598 5 2.520 453.540 .000 Within Groups .067 12 .006 Total 12.665 17 46
  56. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Subset for alpha = 0.05 nghiemthuc N 1 2 3 4 a Duncan 1:2 3 88.467 1:3 3 90.467 1:4 3 90.600 1:6 3 90.733 1:5 3 90.800 1:7 3 90.833 Sig. 1.000 1.000 1.000 .143 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000. 47
  57. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô 4. Kết quả thống kê phân lập và tinh sạch steviosid Stevioside Descriptives 95% Confidence Interval for Mean Std. Lower Upper N Mean Deviation Std. Error Bound Bound Minimum Maximum 1:2 3 74.333 .1528 .0882 73.954 74.713 74.2 74.5 1:3 3 74.733 .0577 .0333 74.590 74.877 74.7 74.8 1:4 3 80.767 .1528 .0882 80.387 81.146 80.6 80.9 1:5 3 91.300 .2000 .1155 90.803 91.797 91.1 91.5 1:6 3 91.233 .1528 .0882 90.854 91.613 91.1 91.4 1:7 2 91.450 .0707 .0500 90.815 92.085 91.4 91.5 Total 17 83.529 7.8804 1.9113 79.478 87.581 74.2 91.5 Test of Homogeneity of Variances Stevioside Levene Statistic df1 df2 Sig. .721 5 11 .622 ANOVA Stevioside Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 993.384 5 198.677 9.434E3 .000 Within Groups .232 11 .021 Total 993.615 16 48
  58. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Stevioside Subset for alpha = 0.05 nghiemt hu N 1 2 3 4 a Duncan 1:2 3 74.333 1:3 3 74.733 1:4 3 80.767 1:6 3 91.233 1:5 3 91.300 1:7 2 91.450 Sig. 1.000 1.000 1.000 .122 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. 49
  59. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô PHỤ LỤC 3 MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM Hình 1 Lá Cỏ Ngọt Hình 2 Cột Amberlite 50
  60. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Hình 3 Dịch sau khi qua Amberlite Hình 4 Bếp cách thủy 51
  61. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Hình 5 Hỗn hợp glucosid Hình 6 Steviosid 52
  62. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Hình 7 Lá Cỏ Ngọt nghiền nhỏ Hình 8 Dung dịch Cỏ Ngọt 53
  63. Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô PHỤ LỤC 4: QUY TRÌNH PHÂN LÂP, TINH SẠCH STEVIOSID VÀ REBAUDIOSIDA Bột lá Cỏ Ngọt + Thêm nước 1:20 đến 1:25 w/v + Đun cách thủy 75oC trong 240 phút và 100oC trong 30 phút + Lọc Bả Dịch lọc + Ca (OH) + FeCl3 +Lọc Tủa Dịch lọc + Cho qua cột Amberlite + Sấy Glucosid thô +Thêm methanol Tỷ lệ 1:5 Steviosid + Sấy D Rắn ịch lọc +Sấy Xirô +Hòa tan vào nước +Lọc polysulfon +Sấy Xirô +Cồn (96o) Tỷ lệ 1:5 +Lọc Rắn +Sấy Rebaudiosid A Hình 9 Quy trình phân lập, tinh sạch steviosid và rebaudiosidA 54