›

Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn dichlomethane loài Dó đất (Balanophora fungosa subsp. indica (Arn.) B. Hansen)

pdf 52 trang thiennha21 15/04/2022 6290
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn dichlomethane loài Dó đất (Balanophora fungosa subsp. indica (Arn.) B. Hansen)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_khao_sat_thanh_phan_hoa_hoc_phan_doan_dichlomethan.pdf

Nội dung text: Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn dichlomethane loài Dó đất (Balanophora fungosa subsp. indica (Arn.) B. Hansen)

  1. TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HÓA HỌC &&& NGUYỄN THỊ HẢI KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN DICHLOMETHANE LOÀI DÓ ĐẤT (BLANNOPHORA FUNGOSA SUBSP. INDICA (ARN.) B. HANSEN) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ HÀ NỘI - 2018
  2. TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HÓA HỌC &&& NGUYỄN THỊ HẢI KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN DICHLOMETHANE LOÀI DÓ ĐẤT (BLANNOPHORA FUNGOSA SUBSP. INDICA (ARN.) B. HANSEN) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS. BÙI HỮU TÀI HÀ NỘI - 2018
  3. LỜI CẢM ƠN Để có thể hoàn thiện đƣợc khóa luận tốt nghiệp, ngoài sự nỗ lực không ngừng của bản thân, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới thầy giáo PGS.TS Nguyễn Văn Bằng và các thầy cô khoa hóa học, trƣờng đại học sƣ phạm Hà Nội 2 đã luôn quan tâm và tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu cho em trong suốt thời gian qua. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Bùi Hữu Tài ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn, cùng các thầy cô phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh Biển-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp này. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể gia đình, bạn bè, những ngƣời vẫn luôn quan tâm, động viên và đồng thời là chỗ dựa tinh thần giúp em hoàn thành tốt nhiệm vụ đƣợc giao trong suốt thời gian học tập và quá trình nghiên cứu thực hiện khóa luận tốt nghiệp vừa qua. Hà nội, tháng 5 năm 2018 Sinh viên Nguyễn Thị Hải
  4. DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ (Tiếng Anh) Viết đầy đủ (Tiếng Việt) 13C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Cộng hƣởng từ hạt nhân cacbon Resonance 13 1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Cộng hƣởng từ hạt nhân proton Resonance CC Column chromatography Sắc kí cột DEPT Distortionless Enhancement Distortionless Enhancement by by Polarisation Transfer Polarisation Transfer DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxide DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl ESI-MS Electrospray Ionization Mass Phổ khối lƣợng ion hóa phun Spectrometry mù điện EtOAc Ethyl acetate Etyl axetat HMBC Heteronuclear mutiple Bond Tƣơng tác dị hạt nhân qua Connectivity nhiều liên kết HPLC High-performance liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography HR-ESI- High Resolution Electrospray Phổ khối lƣợng phân giải cao MS Ionization Mass Spectrometry ion hóa phun mù điện HSQC Heteronuclear Single- Tƣơng tác dị hạt nhân qua 1 Quantum Coherence liên kết LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lƣợng RP-18 Reserve phase C-18 Chất hấp phụ pha đảo C-18 TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng TMS Tetramethylsilane Tetramethylsilane
  5. MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về cây Dó đất 3 1.1.1. Thực vật học 3 1.1.2. Mô tả cây Dó đất 5 1.1.3. Phân bố và sinh thái 6 1.1.4. Bộ phận dùng 6 1.1.5. Tính vị và công dụng 6 1.1.6. Thành phần hóa học 6 1.1.7. Hoạt tính sinh học 11 1.2. Tổng quan về phƣơng pháp chiết mẫu thực vật 12 1.2.1. Chọn dung môi chiết 13 1.2.2. Quá trình chiết 14 1.3. Tổng quan về phƣơng pháp sắc ký 15 1.3.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký 16 1.3.2. Cơ sở của phương pháp sắc ký 16 1.3.3. Phân loại phương pháp sắc ký 16 1.3.3.1. Sắc ký cột 17 1.3.3.2. Sắc ký lớp mỏng 17 1.4. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ 18 1.4.1. Phổ hồng ngoại (IR) 19 1.4.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 19 1.4.2.1. Phổ 1H-NMR 20 1.4.2.2. Phổ 13C-NMR 20 1.4.2.3. Phổ DEPT 20 1.4.2.4. Phổ 2D-NMR 20
  6. CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. Mẫu thực vật 22 2.2. Các phƣơng pháp phân lập các hợp chất 22 2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) 22 2.2.2. Sắc ký cột (CC) 22 2.3. Các phƣơng pháp xác định cấu trúc các hợp chất. 22 2.4. Dụng cụ và hóa chất 23 2.4.1. Dụng cụ 23 2.4.2. Hóa chất 23 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 24 3.1. Phân lập các hợp chất 24 3.2. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất 27 3.2.1. Hợp chất BF1 27 3.2.2. Hợp chất BF2 27 3.2.3. Hợp chất BF3 27 CHƢƠNG 4: THẢO LUẬN KẾT QUẢ 29 4.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất BF1 (Isolariciresinol) 29 4.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất BF2 (Salicifoliol) 34 4.3. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất BF3 (Dihydroconiferyl alcohol) 37 KẾT LUẬN 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42
  7. DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất BF1 và hợp chất tham khảo 33 Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất BF2 và hợp chất tham khảo 37 Bảng 4.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất BF3 và hợp chất tham khảo 40
  8. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.1. Sơ đồ chiết các phân đoạn từ cây Dó đất 24 Sơ đồ 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất BF1 – BF3 26 Hình 1.1. Hình ảnh một số loài thuộc chi Balanophora 4 Hình 1.2. Một số hình ảnh về loài B. fungosa subsp. indica 5 Hình 4.1.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF1 29 Hình 4.1.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF1 30 Hình 4.1.3. Phổ HSQC của hợp chất BF1 31 Hình 4.1.4. Phổ HMBC của hợp chất BF1 32 Hình 4.1.5. Cấu trúc hóa học và các tƣơng tác HMBC chính của hợp chất BF1 32 Hình 4.2.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất BF2 34 Hình 4.2.2. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF2 34 Hình 4.2.3. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF2 35 Hình 4.2.4. Phổ HSQC của hợp chất BF2 36 Hình 4.3.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF3 38 Hình 4.3.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF3 38 Hình 4.3.3. Phổ HSQC của hợp chất BF3 39 Hình 4.3.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất BF3 và hợp chất tham khảo BF3a 40
  9. MỞ ĐẦU Là một quốc gia nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, Việt Nam có một thảm thực vật vô cùng phong phú và đa dạng với hơn 12.000 loài thực vật bậc cao khác nhau. Thiên nhiên thuận lợi là điều kiện cho sự phát triển đa dạng của hệ thực vật. Thực vật không chỉ là nguồn cung cấp dinh dƣỡng cho con ngƣời mà còn là những phƣơng thuốc chữa bệnh hết sức quý giá. Việc nghiên cứu, tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học cao từ nguồn thực vật này để ứng dụng trong Y học, nông nghiệp và các mục đích khác nhau trong cuộc sống của con ngƣời là một trong những nhiệm vụ quan trọng và đang đƣợc các nhà khoa học trong và ngoài nƣớc quan tâm. Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kĩ thuật, nền Y học cổ truyền dân tộc với các phƣơng thuốc đông y cùng với y học hiện đại đã và đang có những đóng góp to lớn trong việc phòng và chữa bệnh cho con ngƣời, nâng cao chất lƣợng cuộc sống. Chính vì vậy việc nghiên cứu hóa học của các loài cây thuốc có ý nghĩa vô cùng quan trọng nhằm làm cơ sở khoa học cho việc sử dụng nguồn tài nguyên một cách hiệu quả nhất và mang lại giá trị sử dụng và hiệu quả kinh tế của dƣợc liệu. Cây Dó đất (hay còn gọi là Tỏa dƣơng, Nấm ngọc cẩu) có tên khoa học là Balanophora fungosa subsp. indica là loại cây sống ký sinh, đƣợc dùng trong một số bài thuốc dân gian với tác dụng bổ máu, kích thích ăn ngon miệng, phục hồi sức khỏe nhanh, Hiện nay, chúng là loài bị săn tìm ráo riết để phục vụ cho những bài thuốc tăng cƣờng sinh lực nên có thể dẫn đến nguy cơ cạn kiệt, một số loài thuộc chi dó đất đã nằm trong sách đỏ của Việt Nam. Do đó, việc nghiên cứu thành phần hóa học và phát hiện các hoạt chất của loài dó đất mang nhiều ý nghĩa khoa học và thực tiễn, vừa tạo cơ sở giải thích công dụng dân gian của loài, vừa tạo cơ sở để đánh giá hiệu quả kinh tế của nó. 1
  10. Xuất phát từ thực tiễn trên, tôi lựa chọn và thực hiện đề tài “Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn dichlomethane loài Dó đất (Balanophora fungosa subsp. indica (Arn.) B. Hansen)” nhằm tìm hiểu kĩ hơn về hóa học của loài dó đất, góp phần nâng cao kiến thức bản thân, đồng thời có cách nhìn khái quát về vấn đề nghiên cứu. Nhiệm vụ của đề tài là: 1. Xử lý mẫu và tạo dịch chiết 2. Phân lập các hợp chất từ phân đoạn dichlomethane loài dó đất. 3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc. 2
  11. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cây Dó đất 1.1.1. Thực vật học Theo khóa phân loại thực vật, chi Balanophora hay còn gọi là chi Dó đất có vị trí phân loại nhƣ sau: + Ngành: Mộc lan – Magnoliphyta + Lớp: Hai lá mầm – Magnoliopsida + Bộ: Đàn hƣơng – Santalales + Họ: Dó đất, Dƣơng đài – Balanophoraceae + Chi: Dó đất – Balanophora Các loài thuộc chi Balanophora là một loại thực vật hạt kín sống trong khu vực cận nhiệt đới. Họ Dó đất bao gồm các loại thực vật thân thảo, sống một năm hay nhiều năm, ký sinh bắt buộc, đáng chú ý vì sự phát triển thất thƣờng và các mối quan hệ không rõ ràng vật chủ-vật ký sinh. Các loài cây này thông thƣờng đƣợc tìm thấy trong các khu rừng ẩm ƣớt, mọc trên rễ các cây khác và có cụm hoa nằm trên mặt đất với bề ngoài tổng thể trông giống nhƣ nấm, bao gồm vô số hoa nhỏ, màu nâu, hồng hay hơi tía. Các cụm hoa phát triển bên trong phần ngầm dƣới đất dạng củ của cây, trƣớc khi tách khỏi nó và xuất hiện trên bề mặt. Phần ngầm dƣới đất gắn với vật chủ, trông giống nhƣ củ, to cỡ nhƣ quả dứa và không phải là rễ hoàn hảo. Các loài thực vật này không có diệp lục. Lá suy giảm nhiều hay không có. Nếu có thì các lá này dƣới dạng màng nhầy. Trên thế giới, chi Balanophora đã ghi nhận có khoảng 120 loài, phân bố ở vùng khí hậu ôn đới và nhiệt đới Châu Á và Châu Úc [21]. Chi Dó đất ở Việt Nam có khoảng 7 loài, trong đó có một số loài thƣờng gặp và đƣợc sử dụng làm thuốc nhƣ: Balanophora fungosa, B. laxiflora, B. latisepala, B. 3
  12. polyandra, B. cucphuongensis. Nhiều loài thuộc chi Dó đất đƣợc các nhà khoa học nghiên cứu sử dụng làm thuốc chữa bệnh nhƣ: trĩ nội, trĩ ngoại, làm thuốc tăng cƣờng sinh lực, Ở Việt Nam ngƣời dân tộc miền núi thƣờng dùng cụm hoa làm thuốc bổ, có tác dụng mạnh gân cốt, giúp cơ thể cƣờng tráng, chữa đau bụng, nhức mỏi chân tay. Ngƣời dân thƣờng dùng dƣới dạng thuốc sắc nƣớc hoặc ngâm rƣợu [2]. B. cucphuongensis B. Fungosa B. latisepala B. polyandra B. laxiflora Hình 1.1. Hình ảnh một số loài thuộc chi Balanophora 4
  13. 1.1.2. Mô tả cây Dó đất Dó đất có tên khoa học là Balanophora fungosa subsp. indica, thuộc họ Dó đất – Balanophoraceae. Tên gọi khác: Xà cô, Dƣơng đài, Nấm ngọc cẩu, Chu ca ra. Dó đất là thực vật có hoa đặc biệt, sống kí sinh trên rễ của nhiều loại cây gỗ lớn trong rừng ẩm, không có diệp lục, thân thoái hóa thành một củ nhỏ, có kích thƣớc và hình dạng khác nhau, thƣờng gồm nhiều thùy, sần sùi, màu nâu sẫm, không có lá hay chỉ có lá vẩy, đến khi sinh sản thì cụm hoa của nó mới lộ ra trên mặt đất. Tùy từng loài, cây Dó đất có hoa đơn tính cùng gốc hay khác gốc. Cụm hoa đực dài hình trụ, trụ hoa ở gốc có lá không có diệp lục, bao hoa có 4-7 thùy; nhị có 4-7 bao phấn hình móng ngựa. Cụm hoa cái ngắn, hình thoi hay hình trứng dài 5-7 cm, mang rất nhiều hoa cực nhỏ, không có bao hoa. Thụ phấn nhờ côn trùng. Mùa hoa thƣờng vào tháng 11 đến tháng 2 năm sau. Hoa rất thơm, tỏa hƣơng vào chiều tối và sáng sớm [1]. Hình 1.2. Một số hình ảnh về loài B. fungosa subsp. indica 5
  14. 1.1.3. Phân bố và sinh thái Cây Dó đất mọc dải rác trong các rừng cây lá rộng, nơi ẩm, ở độ cao 500 – 2600 m, nó sống ký sinh trên rễ của nhiều loại cây thân gỗ, kể cả cây gỗ dây leo, nhƣ các loài Cissus, Tetrastigma trong họ Nho và nhiều loại cây họ Đậu ở các vùng rừng núi Hòa Bình, Lào Cai, Lâm Đồng, Khánh Hòa 1.1.4. Bộ phận dùng Theo các bài thuốc dân gian, Dó đất đƣợc sử dụng cả cây. Có thể ngâm rƣợu hoặc sắc nƣớc uống. 1.1.5. Tính vị và công dụng Tính vị: Có vị ngọt, có tác dụng giảm nhẹ tác hại rƣợu đối với tế bào gan. Công dụng: Dó đất là loài giàu dƣợc tính. Có tác dụng dƣợc lí rất đa dạng nhƣ: giảm đau, kháng viêm, giải độc rƣợu, hạ đƣờng huyết, 1.1.6. Thành phần hóa học Các nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới đã chỉ ra thành phần hóa học chính của các loài thuộc chi Balanophora là các hợp chất dạng polyphenol có chứa nhiều các nhóm caffeoyl, coumaroyl, galloyl, Các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học một số loài thuộc chi Balanophora bắt đầu vào giữa thế kỉ 20, khởi đầu với công bố phân lập một số hợp chất triterpen từ loài B. japonica [23]. Tiếp sau đó, Mitsumara và cộng sự của ông đã thông báo phân lập và xác định đƣợc một hợp chất neo-lignan, balanophonin (3), và 10 hợp chất khác (4-13) từ loài B. japonica [4]. 6
  15. Một nghiên cứu khác về thành phần hóa học loài B. japonica đã đƣợc công bố trong khoảng thời gian này, Jiang và cộng sự ngƣời Nhật đã phân lập và xác định cấu trúc của 34 hợp chất phenolic (19-52) có cấu trúc hóa học đặc biệt chỉ gồm một đơn vị đƣờng liên kết qua cầu ester với các nhóm phenolic acid khác nhau gồm caffeic acid, coumaroic acid, galloic acid và hexahydroxydiphenoic acid [7]. 7
  16. Tuy chƣa có các nghiên cứu về phân tích định lƣợng, các hợp chất 19-52 đã có sự phân lập đƣợc với hiệu suất 0.0012-0.7069% (các hợp chất 19,20,22,24-27) so với khối lƣợng mẫu khô từ phần dƣới mặt đất và hiệu suất 0.0014-0.2231% (các hợp chất 19-21, 23, 28-52) từ phần trên mặt đất loài B. japonica [7]. Tiếp đó, Jiang và cộng sự tiếp tục công bố ba hợp chất balanophotanin A-C (53-55), các lignan glycoside (56-59); balanophotanin D-G (60-63) từ loài B. japonica [8, 9]. Các kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào đã phát hiện hợp chất balannophotnanin E diệt tế bào ung thƣ gan tốt nhất, với giá trị IC50 là 4.22 μM [9]. 8
  17. Trong thí nghiệm về sàng lọc hoạt tính chống oxi hóa (theo phƣơng pháp DPPH) của các dịch chiết từ các cây thuốc truyền thống, Wang và cộng sự đã phát hiện dịch chiết 80% acetone từ loài B. polyandra thể hiện khả năng thu dọn gốc tự do mạnh. Các nghiên cứu về thành phần hóa học loài này đã phân lập đƣợc 2 hợp chất, balapolyphorin A-B (64-65), cùng với 20 hợp chất dạng lignan hoặc phenolic (9, 20, 35, 37, 41, 42, 50-52, 54, 57, 66-74). Các hợp chất này cũng đã đƣợc đánh giá hoạt tính DPPH, hầu hết các hợp chất đều thể hiện khả năng thu dọn gốc tự do với giá trị thu dọn 50% số lƣợng gốc tự do DPPH (SC50) từ 8.4-68.3 µM [19]. Từ hoa loài Balanophora laxiflora, Ho và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu các thành phần chống oxi hóa bằng hệ thống HPLC kết hợp DPPH. Trong số các hợp chất phát hiện đƣợc, 5 hợp chất bao gồm: caffeic acid (6), 1-O-(E)- caffeoyl-β-D-glucopyranose (20), 1-O-(E)-p-coumaroyl-β-D-glucopyranose (19), 1-O-(E)-caffeoyl-4,6-(S)-hexahydroxydiphenoyl-β-D-glucopyranose (46), và 1,3-di-O-galloyl-4,6-(S)-hexahydroxydiphenoyl-β-D-glucopyranose (52) đƣợc xác định là thành phần chống oxi hóa chính của loài này [5]. Một nghiên cứu khác của She cũng về tác dụng chống oxi hóa đã phân lập và xác định cấu trúc của 2 hợp chất, balaxiflorins A- B (75, 76) cùng 17 hợp chất 9
  18. phenolic khác (6, 20, 35, 37, 41, 48, 49, 52, 58, 68, 70, 71, 74, 77-80) [15]. Các hợp chất phenolic có chứa nhóm galloyl, cafeoyl, và (S)- hexahydroxydiphenoyl (81-89) cũng đƣợc phát hiện thấy có trong thành phần hóa học của loài B. tobiracola [18]. Từ loài B. harlandii, Wang và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của hợp chất, 1-O-[(E)-p-coumaroyl]-3-O-galloyl-β-D-glucopyranose (90) và 18 hợp chất (7, 20, 30, 37, 42, 68, 71, 81-83, 86, 87, 91-96). Các hợp chất này đã đƣợc đánh giá hoạt tính chống oxi hóa DPPH, kết quả cho thấy một số hợp chất mang khung dihydrochalcone và tannin thể hiện hoạt tính tốt nhất với giá trị SC50 trong khoảng 8.2-16.2 µM [20]. 10
  19. Từ loài B. involucrata, Luo và cộng sự phân lập đƣợc ba hợp chất phenolic đã biết (11, 71, 72) [12]. Một nghiên cứu khác về thành phần hóa học loài B. papuana của các nhà khoa học Nhật Bản, Hosoya và cộng sự đã phân lập đƣợc 2 hợp chất khác có khung dihydrochalcone, papuabalanols A-B (97, 98). Các hợp chất này đã đƣợc đánh giá hoạt tính hạ huyết áp và ức chế enzyme tyrosinase [6]. Kết quả cho thấy, hợp chất 97 (100 µM) phát hiện có tác dụng làm giãn mạch trong khi hợp chất 98 lại có tác dụng ức chế hoạt động của enzym tyrosinase (33-79%) ở các nồng độ thử nghiệm 12.5, 25, và 50 µM. Từ kết quả tổng quan các nghiên cứu trên, có thể nhận thấy các nghiên cứu chủ yếu xuất phát từ các nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật Bản và Trung Quốc. Thành phần hóa học của các loài thuộc chi Balanophora chủ yếu là các hợp chất dạng lignan hoặc các phenolic có chứa các nhóm galloyl, caffeoyl, và hexahydroxydiphenoyl. Tuy vậy, cho đến nay gần nhƣ chƣa có nghiên cứu về hóa học loài B. fungosa subsp. indica. 1.1.7. Hoạt tính sinh học Các công bố về hoạt tính sinh học của chi Balanophora có thể khái quát bao gồm: hoạt tính chống oxi hóa, hoạt tính ức chế hoạt động của enzyme tyrosinase/α-glucosidase. Trong đó, đáng kể nhất là các công bố về hoạt tính chống oxi hóa. Ngoài ra, một số hoạt tính khác của các hợp chất phân 11
  20. lập từ chi Balanophora cũng đƣợc nhắc đến nhƣ diệt tế bào ung thƣ, kháng virus HIV, giãn mạch, ức chế hoạt động của enzyme PTP1B trên chuột [21]. a) Hoạt tính chống oxi hóa Cho đến nay, khá nhiều các công bố chứng minh rằng các hợp chất phân lập đƣợc từ chi Balanophora có hoạt tính chống oxi hóa mạnh. Phần lớn các nghiên cứu này thực hiện dựa trên khả năng thu dọn gốc tự do DPPH. Các tác giả cũng chỉ ra rằng, những hợp chất dạng tanin, hay hợp chất chứa nhiều nhóm galloyl, catechol thƣờng thể hiện hoạt tính chống oxi hóa tốt hơn cả [15, 19, 20]. b) Ức chế hoạt động của enzyme tyrosinase, α-glucosidase Tyrosinase là một enzyme xúc tác cho qua trình oxi hóa tổng hợp ra melanin, một yếu tố quan trong quyết định sắc tố da. Sự sản sinh quá nhiều melanin sẽ dẫn đến sạm da, đen da, và đẩy nhanh quá trình lão hóa da. Ngoài ra, melanin cũng là yếu tố gây ra các vết sạm, nám trên hoa quả. Do đó các chất ức chế sự hoạt động của enzyme tyrosinase ngoài ý nghĩa ứng dụng làm trắng da trong mỹ phẩm, nó còn giúp cải thiện chất lƣợng của thực phẩm trong ngành công nghiệp thực phẩm. Trong nghiên cứu tìm kiếm các chất có nguồn gốc thiên nhiên có tác dụng ức chế hoạt động của enzyme tyrosinase, dịch chiết EtOH 50% từ loài B. fungosa thể hiện hoạt tính tốt với giá trị IC50 15.0 µg/mL. Tiếp đó, nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học loài B. fungosa cho thấy hợp chất phenolic 1-O-(E)-caffeoyl-3-O-galloyl4,6-(S)- HHDP-β-D- glucopyranose và 1-O-(E)-caffeoyl-3,4,6-tri-O-galloyl-β-D- glucopyranose là những chất thể hiện hoạt tính [14]. 1.2. Tổng quan về phƣơng pháp chiết mẫu thực vật Mẫu cây sau khi thu hái về đem rửa sạch, để ráo nƣớc sau đó làm khô, tùy thuộc vào đối tƣợng chất có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, không phân cực, chất có độ phân cực trung bình, ) mà ta lựa chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau. 12
  21. 1.2.1. Chọn dung môi chiết Chiết suất là quá trình dùng dung môi thích hợp để hòa tan các chất tan có trong cây, chủ yếu là các chất đang nghiên cứu, sau đó tách chúng ra khỏi phần không tan của cây. Chính vì vậy, cần phải có sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hóa thứ cấp trong cây đƣợc chiết, từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho sự phân hủy chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất mong muốn. Dung môi dùng cho các quá trình chiết phải đƣợc lựa chọn rất cẩn thận. Dung môi phải hòa tan những chất chuyển hóa thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng đƣợc loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy và giá thành phù hợp. Nếu dung môi có lẫn các tạp chất có thể gây ảnh hƣởng tới hiệu quả và chất lƣợng của quá trình chiết vì vậy những dung môi này nên đƣợc chƣng cất để đƣợc dạng sạch trƣớc khi sử dụng. Thƣờng có lẫn một số chất dẻo trong các dung môi nhƣ các diankinphtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar, tributyl phosphat trong quá trình sản xuất hoặc trong quá trình bảo quản (dung môi trong các thùng chứa nhựa). Methanol và chlorofrom thƣờng chứa dioctylphtalat [di-(2etylhexyl)- phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Chất này làm sai lệch kết quả phân lập trong quá trình nghiên cứu hóa thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Chlorofrom, metylen clorit và methanol là những dung môi thƣờng đƣợc lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây nhƣ: lá, thân, rễ, hoa, Chlorofrom có thể gây tổn thƣơng cho gan và thận nên khi làm việc với chất này cần thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng mát và phải đeo mặt nạ phòng độc. Metylen cloritits độc hơn và dễ bay hơi hơn chlorofrom. Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hidrocacbon thế clo. Ngƣời ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rƣợu sẽ 13
  22. thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu đƣợc lƣợng lớn các thành phần trong tế bào. Ngƣợc lại chlorofrom lại có độ phân cực thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol hòa tan phần lớn các chất chuyển hóa phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp. Vì vậy, các chất này cũng bị hòa tan đồng thời khi chiết bằng ancol. Trong quá trình chiết sơ bộ ngƣời ta thƣờng dùng dung môi cồn trong nƣớc. Ngƣời ta thƣờng ít khi sử dụng nƣớc để thu đƣợc dịch chiết thô từ cây mà thay vào đó là dung dịch nƣớc của methanol. Đietyl ete hiếm khi đƣợc dùng cho các quá trình chiết thực vật và nó sẽ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hƣớng tạo thành peoxit dễ nổ. Peoxit của đietyl ete dễ gây phản ứng oxi hóa với các hợp chất không có khả năng tạo cholesterol nhƣ các carotenoid. Axeton cũng có thể tạo thành axetoit nếu 1,2-sis-diol có mặt trong môi trƣờng axit. Quá trình chiết dƣới điều kiện axit hoặc bazơ thƣờng đƣợc dùng với quá trình phân tách đặc trƣng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit- bazơ có thể tạo thành những sản phẩm mong muốn. Sau khi chiết dung môi đƣợc cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 30-40oC, với một vài hóa chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn. 1.2.2. Quá trình chiết Bằng cách lặp đi lặp lại việc chiết một vài lần, ta có thể tách hoàn toàn chất cần tinh chế vào dung môi đã chọn, sau đó cất loại dung môi và cất lấy chất tinh khiết ở nhiệt độ và áp suất thích hợp. Đây là phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian. Tuy nhiên, trong quá trình chiết một mẫu thực vật chỉ thực hiện qua ba lần dung môi vì khi đó cặn thu đƣợc hầu nhƣ không còn chứa những chất giá trị nữa và bình chiết ngâm không đƣợc sử dụng nhƣ 14
  23. phƣơng pháp chiết liên tục bởi mẫu đƣợc ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ, sau đó lấy chất chiết ra. Việc kết thúc quá trình chiết đƣợc xác định bằng một vài cách nhƣ: - Với các ankaloid ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trƣng nhƣ tác nhân Đragendroff và tác nhân Maye. - Các flavonoid thƣờng là những chất màu vì vậy dịch chảy ra mà không có màu thì chứng tỏ đã rửa hết chất này trong quá trình chiết. - Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự xuất hiện của cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết. Ngƣời ta cũng thƣờng chiết một chất từ hỗn hợp rắn bằng một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi với một dụng cụ chuyên dùng đặc biệt đƣợc gọi là bình chiết Xoclet. Phƣơng pháp này dựa trên nguyên tắc hóa hơi. Dung môi tinh khiết đƣợc đun nóng, cho bay hơi liên tục chảy vào bình chứa hỗn hợp cần chiết tách, dung môi sẽ hòa tan chất rắn cần tinh chế và nhờ một ống xiphong, dung dịch chảy suống bình cầu bên dƣới, dung môi nguyên chất lại tiếp tục đƣợc cất lên. Phƣơng pháp này tiết kiệm đƣợc dung môi và hiệu quả tƣơng đối cao. Nhƣ vậy, tùy thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì mà ngƣời ta lựa chọn dung môi phù hợp và thực hiện quá trình chiết hợp lí để đạt đƣợc hiệu quả cao. 1.3. Tổng quan về phƣơng pháp sắc ký Phƣơng pháp sắc ký là một phƣơng pháp phổ biến và hữu hiệu nhất. hiện nay, phƣơng pháp này đƣợc sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các chất hữu cơ nói chung và hợp chất thiên nhiên nói riêng. 15
  24. 1.3.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký Sắc ký là phƣơng pháp tách, phân tích, phân li các chất dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau giữa hai pha luôn tiếp xúc và không hòa tan lẫn nhau: pha tĩnh và pha động. Khi tiếp xúc với pha tĩnh các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tƣơng ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan, ). Tốc độ di chuyển của các chất trong pha động khi tiếp xúc mật thiết một pha tĩnh có sự khác nhau là do khả năng bị hấp phụ và phản hấp phụ hoặc do khả năng trao đổi khác nhau của các chất ở pha động với các chất ở pha tĩnh. Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tƣơng tác yếu hơn với pha này. Từ các đặc điểm trên mà ngƣời ta có thể tách các chất nhờ quá trình sắc ký. 1.3.2. Cơ sở của phương pháp sắc ký Phƣơng pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha dộng và pha tĩnh. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật hấp phụ đơn phân tử đặc biệt langmuir mô tả sự phụ thuộc của lƣợng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là áp suất riêng phần) nα .bC n 1+bC Trong đó: n α { 1.3.3. Phân loại phương pháp sắc ký Phƣơng pháp sắc ký là một phƣơng pháp đƣợc sử dụng khá phổ biến và rộng rãi. Tùy thuộc vào bản chất của pha tĩnh hay pha động hay cách thức triển khai sắc ký mà ngƣời ta phân loại thành các phƣơng pháp sắc ký khác 16
  25. nhau nhƣ: sắc ký khí, sắc ký lỏng, sắc ký lọc gel, sắc ký ái lực, sắc ký cột, sắc ký, sắc ký lớp mỏng, Tùy theo mục đích nghiên cứu và đối tƣợng cần phân lập ngƣời ta lựa chọn những phƣơng pháp sắc ký phù hợp. 1.3.3.1. Sắc ký cột Sắc ký cột là phƣơng pháp đƣợc sử dụng để phân lập các hợp chất hữu cơ từ nguồn tự nhiên. Trong phƣơng pháp này, pha tĩnh là những hạt có kích thƣớc tƣơng đối lớn (50-150 μm), đƣợc nạp trên các cột thủy tinh. Mẫu chất cần phân tích đƣợc đặt trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly đƣợc đặt phía trên cao. Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phía bên dƣới cột đƣợc hứng vào những lọ nhỏ đặt ngay ống dẫn ra của cột. Pha tĩnh đƣợc nạp lên cột sắc ký theo hai phƣơng pháp khác nhau là nạp ƣớt hoặc nạp khô. Phƣơng pháp nạp khô, chất hấp phụ đƣợc đƣa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột. Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt. Phƣơng pháp nạp ƣớt, chất hấp phụ đƣợc hòa tan trong dung môi chạy cột trƣớc với lƣợng dung môi tối thiểu. Sau đó đƣa dần vào cột đến khi đủ lƣợng cần thiết. Khi chuẩn bị cột phải lƣu ý không đƣợc để bọt khí bên trong (nếu có bọt khí gây nên hiện tƣợng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách) và cột không bị nứt, gãy, dò. 1.3.3.2. Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng (SKLM) hay còn gọi là sắc ký phẳng, dựa chủ yếu vào hiện tƣợng hấp phụ. Trong đó pha động là một dung môi hay một hỗn hợp dung môi, di chuyển qua một pha tĩnh là một chất hấp phụ trơ ví dụ: silicagel, oxit alumin, Pha tĩnh đƣợc tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên trên nền phẳng nhƣ tấm kính hay tấm nhôm. Do chất hấp phụ đƣợc tráng 17
  26. thành một lớp mỏng nên phƣơng pháp này đƣợc gọi là sắc ký lớp mỏng.  Bình sắc ký: Một chậu, lọ bằng thủy tinh có nắp đậy.  Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25-0,5 nm của một loại hợp chất hấp phụ nhƣ silicagel, alumin đƣợc tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên trên tấm kính, tấm nhôm. Chất hấp phụ trên nhờ giá đỡ sulphat canxi khan, tinh bột hay một loại polymer hữu cơ.  Mẫu phân tích: Thƣờng là hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khác nhau. Sử dụng khoảng 1ul dung dịch mẫu với nồng độ pha loãng 2-5%, nhờ một vi quản để chấm thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phải trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng chứa trong bình.  Pha động: Dung môi hay hỗn hợp hai dung môi di chuyển chầm chậm dọc theo bản mỏng và lôi kéo mẫu chất phân tích đi theo nó. Tùy theo khả năng hấp phụ - giải hấp phụ của mỗi chất mà chúng sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau và quãng đƣờng khác nhau trên bản mỏng. Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng có ƣu điểm là chỉ cần một lƣợng rất ít mẫu để phân tích, có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng điều kiện phân tích, tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể đƣợc định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng. Chính vì vậy với mục đích là phân tích định tính hay sử dụng làm chỉ thị cho sắc ký cột để phân lập các hợp chất hữu cơ ngƣời ta sẽ sử dụng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng. 1.4. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ Cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ có thể đƣợc xác định nhờ vào phƣơng pháp phổ kết hợp. Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng loại chất mà ngƣời ta sử dụng phƣơng pháp phổ cụ thể nhƣ: phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NRM), phổ khối lƣợng, hay chuyển hóa hóa học. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp với các 18
  27. phƣơng pháp phổ càng cao. Trong một vài trƣờng hợp để xác định cấu trúc hóa học của hợp chất ngƣời ta phải dựa vào các phƣơng pháp bổ sung nhƣ chuyển hóa hóa học hay các phƣơng pháp sắc ký so sánh 1.4.1. Phổ hồng ngoại (IR) Trong nghiên cứu cấu trúc các hợp chất hữu cơ thƣờng chỉ sử dụng phổ có số sóng từ 4000 đến 400 cm-1 và biến thành năng lƣợng của dao động phân tử. Sự hấp thụ ấy có định lƣợng nhƣng phổ hồng ngoại không biểu hiện thành đƣờng thẳng mà là các dải hấp thụ với cƣờng độ khác nhau bởi và sự biến đổi năng lƣợng dao động luôn đi kèm với sự biến đổi của năng lƣợng quay. Nhƣ vậy, phổ hồng ngoại là phổ hấp thụ của hai dạng năng lƣợng trong phân tử là năng lƣợng dao động và năng lƣợng quay. Dựa vào sự hấp thụ này ngƣời ta chia phổ hồng ngoại ra thành 3 vùng: - Vùng sóng ngắn (4000-1300 cm-1) gọi là vùng các nhóm chức vì các băng hấp thụ của các nhóm chức hữu cơ nhƣ OH, NH, CO đều xuất hiện ở đây. - Vùng sóng dài (900-400 cm-1 ) đặc trƣng cho các hấp thụ của dao động biến dạng của vòng thơm và các hấp thụ biến dạng của CH ngoài mặt phẳng. - Vùng sóng trung bình (1300-900 cm-1 ) đƣợc gọi là vùng chỉ vân tay vì nó đƣợc dùng để so sánh hình dạng các băng hấp thụ của các mẫu xem có đồng nhất hay không về phƣơng diện hóa học. Phƣơng pháp phân tích này cho ta xác định các nhóm chức, vòng benzen có trong phân tử. 1.4.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân là một phƣơng pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Phƣơng pháp phổ NMR là sự cộng hƣởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dƣới tác dụng của từ trƣờng ngoài. Sự khác nhau này đƣợc biểu diễn bằng độ chuyển dịch hóa học. Ngoài ra, đặc trƣng phân tử còn đƣợc xác định nhờ tƣơng tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau. 19
  28. 1.4.2.1. Phổ 1H-NMR Độ dịch chuyển hóa học của các proton đƣợc so với chất chuẩn nội TMS và thƣờng nằm trong khoảng thang ppm từ 0 – 14 ppm tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng nhƣ đặc trƣng riêng của từng phần. Dựa vào đặc trƣng của độ dịch chuyển hóa học và tƣơng tác spin mà ngƣời ta xác định đƣợc cấu trúc hóa học của hợp chất hữu cơ. 1.4.2.2. Phổ 13C-NMR Cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon cộng hƣởng ở một trƣờng khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thông thƣờng tín hiệu của cacbon xuất hiện trong thang chia từ 0 tới 230 ppm. 1.4.2.3. Phổ DEPT Cho phép phân loại các tín hiệu trên phổ cacbon thành nhóm khác nhau: cacbon không liên kết trực tiếp với hydro, nhóm CH, nhóm CH2, và nhóm CH3. Trên phổ DEPT, tín hiệu của các cacbon không liên kết trực tiếp với hydro sẽ không xuất hiện. Tín hiệu của CH và CH3 nằm về một phía (phía trên) và của CH2 về một phía (phía dƣới) trên phổ DEPT135. Trên phổ DEPT90 chỉ xuất hiện tín hiệu của CH. 1.4.2.4. Phổ 2D-NMR Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tƣơng tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kỹ thuật chủ yếu thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ sau: Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence): các tƣơng tác trực tiếp H-C đƣợc xác định nhờ vào các tƣơng tác trên phổ này. Trên phổ, một trục là phổ 1H-NMR, trục còn lại là 13C-NMR. Các tƣơng tác HSQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ. Phổ 1H-1H COSY (1H-1H Corelation Spectroscopy): phổ này biểu diễn tƣơng tác H-H, chủ yếu là các proton đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ 20
  29. này mà các phần tử của phân tử đƣợc nối ghép lại với nhau. Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): đây là phổ biểu diễn tƣơng tác xa của H và C trong phân tử. Nhờ vào các tƣơng tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng nhƣ toàn phân tử đƣợc xác định về cấu trúc. Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): phổ này biểu diễn các tƣơng tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử. Ngƣời ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE một chiều để xác định cấu trúc không gian của phân tử. Các proton có cùng phía cũng nhƣ gần nhau về không gian sẽ cộng hƣởng mạnh hơn và cho tín hiểu phổ với cƣờng độ mạnh hơn bằng vệc đƣa chúng vào một xung đúng bằng từ trƣờng cộng hƣởng của một proton xác định. Ngoài ra ngƣời ta còn sử dụng phổ X-RAY (nhiễu xạ Ronghen) để xác định cấu trúc không gian của toàn bộ phân tử của hợp chất kết tinh ở dạng đơn tinh thể. Vì yêu cầu tiên quyết là cần phải có đơn tinh thể nên phạm vi sử dụng của phổ này hạn chế. Đây là điều kiện không phổ biến đối với các hợp chất hữu cơ. Ngoài việc sử dụng các loại phổ, ngƣời ta còn sử dụng các phƣơng pháp chuyển hóa hóa học cũng nhƣ các phƣơng pháp phân tích, so sánh, kết hợp khác. Đặc biệt đối với các phân tử nhiều mạch nhánh dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều, khó xác định chính xác đƣợc chiều dài các mạch, cũng nhƣ đối với các phân tử có các đơn vị đƣờng thì việc xác định chính xác loại đƣờng cũng nhƣ cấu hình đƣờng thông thƣờng phải sử dụng phƣơng pháp thủy phân rồi xác định bằng phƣơng pháp so sánh LC-MS hoặc GC-MS với các đƣờng chuẩn dự kiến. 21
  30. CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mẫu thực vật Mẫu thực vật đƣợc thu thập tại Đăk Lăk vào tháng 7 năm 2016. Tên khoa học, Balanophora fungosa subsp. indica (Arn.) B. Hansen, đƣợc xác định bởi TS. Nguyễn Thế Cƣờng, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu tiêu bản (ký hiệu NCCT- P06) đƣợc lƣu tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Loài này thƣờng đƣợc ngƣời dân bản địa gọi với tên Dó đất. 2.2. Các phƣơng pháp phân lập các hợp chất 2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) TLC đƣợc thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254S (Merck). Phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bƣớc sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% đƣợc phun đều trên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ tới khi xuất hiện màu. 2.2.2. Sắc ký cột (CC) CC tiến hành với chất hấp phụ là silica gel, pha đảo, sephadex LH-20, hoặc diaion HP-20. Silica gel có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silica gel pha đảo RP-18 (75 m hoặc 150 m, Fuji Silysia Chemical Ltd.). 2.3. Các phƣơng pháp xác định cấu trúc các hợp chất. Phƣơng pháp chung để xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ là sử dụng các phƣơng pháp xác định các thông số vật lý, các phƣơng pháp phổ hiện đại bao gồm: + Điểm nóng chảy đo trên máy Kofler micro-hotstage. + Độ quay cực đo trên máy Jasco P-2000 Polarimeter. 22
  31. + Phổ khối lƣợng phân giải thấp ESI-MS đƣợc đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap. + Phổ cộng hƣởng từ nhân một chiều (1D) 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, hai chiều (2D) HSQC, HMBC đƣợc đo trên máy Varian 400 MHz NMR Spectrometer. 2.4. Dụng cụ và hóa chất 2.4.1. Dụng cụ Các dụng cụ dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch bao gồm: + Bình chiết: bình chiết thủy tinh dung tích 3L, 5L + Máy cô quay chân không hãng Eyela + Đèn tử ngoại hai bƣớc sóng 254 nm và 365nm + Máy sấy + Micropipet loại 1 mL và 0.2 mL + Bình sắc ký loại phân tích và điều chế + Các loại cột sắc ký: các cột thủy tinh (Duran-Đức) + Bếp điện 2.4.2. Hóa chất + Dung môi hữu cơ thông thƣờng nhƣ n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate, acetone, methanol là loại dung môi kỹ thuật và đƣợc chƣng cất lại trƣớc khi sử dụng. + Bản mỏng pha thƣờng/pha đảo: bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254S (Merck). + Silica gel pha thƣờng có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (Merck)/pha đảo RP-18 cỡ hạt 75; 150 m (Fuji Silysia Chemical Ltd.). + Diaion HP-20 (Nhật Bản). 23
  32. CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. Phân lập các hợp chất Mẫu dƣợc liệu B. fungosa subsp. indica sau khi sấy khô, nghiền nhỏ (3,5 kg) chiết siêu âm với methanol (5L x 3 lần) ở 40 oC, mỗi lần 30 phút. Lọc thu lấy dịch chiết và cất loại dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc 300 g cặn chiết methanol. Bổ sung vào 300 g cặn chiết methanol này với 2 lít nƣớc cất, lắc đều cho tan hết rồi lần lƣợt chiết với dichloromethane và ethyl acetate mỗi loại dung môi 2L x 3 lần. Các dịch chiết đƣợc gom lại và cất loại dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc các cặn chiết dichloromethane (BFD, 70 g), ethyl acetate (BFE, 104 g) và lớp nƣớc (BFW). B. fungosa subsp. Indica (3,5 Kg) Chiết MeOH Cặn chiết methanol (300 g) Bổ sung nƣớc CH2Cl2 : nƣớc 1/1 Lớp nƣớc Bổ sung EtOAc Cặn chiết CH2Cl2 (70 g) (BFD) Cặn chiết EtOAc Lớp nƣớc (104 g) (BFW) (BFE) Sơ đồ 3.1. Sơ đồ chiết các phân đoạn từ cây Dó đất 24
  33. Cặn dịch chiết dichloromethane (BFD, 70 g) đƣợc phân lập trên sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel và hệ dung môi rửa giải là n-Hexane/acetone (0 – 100% acetone) thu đƣợc 8 phân đoạn kí hiệu từ BF1A – BF1H. Phân đoạn BF1B đƣợc phân lập bằng sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel và hệ dung môi rửa giải là dichloromethane/ methanol (10/1, theo tỉ lệ về thể tích), thu đƣợc hai phân đoạn kí hiệu là BF2A và BF2B. Phân đoạn BF2A tiếp tục đƣợc phân tách trên cột sắc ký pha đảo với hệ dung môi rửa giải là methanol/ nƣớc (3/2, theo tỉ lệ về thể tích), thu đƣợc hợp chất BF2 (27 mg). Phân đoạn BF1D đƣợc phân lập bằng sắc ký cột với chất hấp phụ là sephadex LH-20 và hệ dung môi rửa giải là methanol/ nƣớc (1/1, theo tỉ lệ về thể tích), thu đƣợc ba phân đoạn kí hiệu là BF3A, BF3B và BF3C. Phân đoạn BF3C tiếp tục đƣợc phân tách trên cột sắc ký pha đảo với hệ dung môi rửa giải là axetone/ nƣớc (2/3, theo tỉ lệ về thể tích), thu đƣợc hợp chất BF3 (16 mg). Phân đoạn BF1E đƣợc phân lập bằng sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel và hệ dung môi rửa giải là dichloromethane/ methanol/ nƣớc (7/1/0,1, theo tỉ lệ về thể tích), thu đƣợc bốn phân đoạn kí hiệu là BF4A, BF4B, BF4C và BF4D. Phân đoạn BF4C tiếp tục đƣợc phân tách trên cột sắc ký pha đảo với hệ dung môi rửa giải là acetone/ nƣớc (1/2, theo tỉ lệ về thể tích), thu đƣợc hợp chất BF1 (15 mg). 25
  34. Cặn CH2Cl2 (70 g) (BFD) Silica gel, CC HA (0 – 100% A) BF1A BF1B BF1C BF1D BF1E BF1F BF1G BF1H Silica gel, CC LH – 20, CC D/M/W DM (10/1, v/v) MW (1/1, v/v) (7/1/0.1, v/v/v) BF2A BF2B BF3A BF3B BF3C BF4A BF4B BF4C BF4D RP-18, CC RP-18, CC RP-18, CC MW (3/2, v/v) AW (2/3, v/v) AW (1/2, v/v) BF2 BF3 BF1 (16 mg) (27 mg) (15 mg) Sơ đồ 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất BF1 – BF3 26
  35. 3.2. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất 3.2.1. Hợp chất BF1 Isolariciresinol: Chất bột màu vàng nhạt, vô định hình. Công thức phân tử C20H24O6. Khối lƣợng phân tử 360. 1 H-NMR (CDCl3+ CD3OD, 400 MHz) δH (ppm): 6.62 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-5), 6.47 (d, J = 7.6 Hz, H-6), 6.45 (1H, s, H-2), 6.43 (1H, s, H-2′), 6.07 (1H, s, H-5′), 3.67 (s, 3′-OCH3), 3.64 (s, 5-OCH3), 3.54-3.56 (4H, H-7, H-9b, H-9′a, H-9′b), 3.27 (1H, dd, J = 4.4, 10.4 Hz, H-9a), 1.84 (1H, m, H-8′), và 1.62 (1H, m, H-8). 13 C-NMR (CDCl3+ CD3OD, 100 MHz) δC (ppm): 136.8 (C-1), 111.8 (C-2), 147.0 (C-3), 144.0 (C-4), 114.3 (C-5), 121.9 (C-6), 47.3 (C-7), 47.5 (C- 8), 61.9 (C-9), 55.5 (5-OCH3), 127.2 (C-1ʹ), 110.4 (C-2ʹ), 145.2 (C-3ʹ), 143.4 (C-4ʹ), 115.8 (C-5ʹ), 132.5 (C-6ʹ), 32.7 (C-7ʹ), 39.5 (C-8ʹ), 65.5 (C-9ʹ), 55.5 (3′-OCH3). 3.2.2. Hợp chất BF2 Salicifoliol: Chất bột vô định hình màu vàng nhạt. Công thức phân tử C13H14O5. Khối lƣợng phân tử 250. 1 H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δH (ppm): 6.88 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5′), 6.87 (1H, br s, H-2′), 6.79 (1H, br d, J = 8.0 Hz, H-6′), 4.59 (1H, d, J = 6.8 Hz, H-2), 4.48 (1H, dd, J = 7.2, 9.6 Hz, H-4a), 4.32 (2H, H-4b, H-8a), 4.17 (1H, dd, J = 3.2, 9.6 Hz, H-8b), 3.89 (3H, s, OCH3), và 3.43 (1H, m, H-1). 13 C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δH (ppm): 46.0 (C-1), 86.1 (C-2), 69.9 (C-4), 48.2 (C-5), 178.2 (C-6), 69.8 (C-8), 130.5 (C-1ʹ), 108.4 (C-2ʹ), 146.9 (C-3ʹ), 145.8 (C-4ʹ), 114.4 (C-5ʹ), 119.1 (C-6ʹ), 56.0 (OCH3). 3.2.3. Hợp chất BF3 Dihydroconiferyl alcohol: Chất bột vô định hình màu vàng nhạt. Công thức phân tử C10H44O3. Khối lƣợng phân tử 182. 27
  36. 1 H-NMR (CD3OD, 400 MHz) δH (ppm): 6.74 (1H, br s, H-2), 6.67 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5), 6.60 (1H, br d, J = 8.0 Hz, H-6), 3.80 (3H, s, 4- OCH3), 3.53 (2H, t, J = 6.4 Hz, H-9), 2.56 (2H, t, J = 7.6 Hz, H-7), và 1.77 (2H, m, H-8). 13 C-NMR (CD3OD, 100 MHz) δC (ppm): 134.9 (C-1), 113.1 (C-2), 148.8 (C-3), 145.5 (C-4), 116.0 (C-5), 121.8 (C-6), 32.6 (C-7), 35.6 (C-8), 62.2 (C-9), và 56.3 (4-OCH3). 28
  37. CHƢƠNG 4: THẢO LUẬN KẾT QUẢ 4.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất BF1 (Isolariciresinol) Hợp chất BF1 phân lập đƣợc dƣới dạng bột vô định hình màu vàng nhạt. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất BF1 có thể nhận dạng đƣợc một số các tín hiệu nhƣ: 5 proton thơm tại δH 6.62 (1H, d, J = 7.6 Hz), 6.47 (1H, d, J = 7.6 Hz), 6.45 (1H, s), 6.43 (1H, s), 6.07 (1H, s); 2 nhóm methoxy tại δH 3.67 và 3.64 (mỗi tín hiệu 3H, s). Hình 4.1.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF1 29
  38. Hình 4.1.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF1 Phân tích phổ 13C-NMR của hợp chất BF1 nhận thấy xuất hiện tín hiệu của 20 carbon. Dựa trên phổ tƣơng tác dị hạt nhân qua một liên kết HSQC có thể phân loại các tín hiệu carbon và proton nhƣ sau: 3 nhóm methin tại δH 1.62/ δC 47.5, δH 1.84/ δC 39.5, δH 3.54/ δC 47.3; 3 nhóm methylene tại δH 2.58/ δC 32.7, δH 3.27 và 3.54/ δC 61.9, δH 3.54 và 3.56/ δC 65.5; năm nhóm CH thơm tại δH 6.45/ δC 111.8, δH 6.62/ δC 114.3, δH 6.47/ δC 121.9, δH 6.43/ δC 110.4, và δH 6.07/ δC 115.8. Bẩy tín hiệu carbon còn lại là các nguyên tử carbon không liên kết trực tiếp với hydro. Nhƣ vậy sự xuất hiện của hai cặp các tín hiệu carbon dạng C6-C3 (sáu tín hiệu carbon thơm và 3 tín hiệu carbon lai hóa sp3) cho thấy hợp chất BF1 là một hợp chất lignan. Hơn nữa, sáu tín hiệu carbon thuộc hai phần nhánh C3 gồm có 3 carbon methylen và 3 carbon methin đã cho thấy BF1 có cấu trúc khung carbon của hợp chất aryltetralin lignan. Tiếp đó, phân tích phổ HMBC nhận thấy các tín hiệu proton thơm H-2 (δH 6.45), H-6 (δH 6.47) có tƣơng tác với C-7 (δC 47.3), và dạng tín hiệu 30
  39. singlet của H-2, doublet (J = 7.6 Hz) của H-6 cho phép xác định phần ‘aryl’ của BF1 có dạng vòng benzen thế ba vị trí 1,3,4. Mặt khác, độ chuyển dịch hóa học của C-4 (δC 144.0), C-3 (δC 147.0) và tƣơng tác HMBC từ methyl proton (δH 3.64) tới C-3 (δC 147.0) đã khẳng định vị trí của nhóm hydroxy tại C-4 và một nhóm methoxy tại C-3. Hai tín hiệu proton thơm còn lại đều có dạng signlet và trên phổ HMBC quan sát thấy H-2′ (δH 6.43) có tƣơng tác với C-7′ (δC 32.7) trong khi đó H-5′ (δH 6.07) lại có tƣơng tác HMBC tới C-7 (δC 47.3) cho phép xác định vòng benzen còn lại đều bị thế ở 4 vị trí 1′,3′,4′,6′. Hơn nữa giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-3′ (δC 145.2), C-4′ (δC 143.4) và tƣơng tác HMBC từ H-5′ (δH 6.07), proton methyl (δH 3.67) tới C-3′ (δC 145.2) đã chỉ ra sự có mặt của một nhóm thế hydroxy tại C-4′ và nhóm methoxy tại C-3′. Các tín hiệu của nhóm oxymethylen carbon tại C-9 (δC 61.9), C-9′ (δC 65.5) cũng cho thấy có hai nhóm thế hydroxy ở C-9 và C-9′. Điều này cũng hoàn toàn phù hợp với các tƣơng tác HMBC quan sát đƣợc từ H-7′ (δH 2.58) tới C-9′ (δC 65.5) và H-7 (δH 3.54) tới C-9 (δC 61.9). Hình 4.1.3. Phổ HSQC của hợp chất BF1 31
  40. Hình 4.1.4. Phổ HMBC của hợp chất BF1 Hình 4.1.5. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất BF1 Cuối cùng, sự tƣơng đồng về các số liệu phổ 13C-NMR của hợp chất BF1 (đặc biệt là các giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-7, C-8, C-8’, C-7’) và các số liệu 13C-NMR đã công bố của hợp chất isolariciresinol cho phép kết luận hợp chất BF1 phân lập đƣợc là isolariciresinol [10]. Hợp chất này đƣợc thông báo có trong một số loài thuộc chi Balanophora nhƣ B. involucrata 32
  41. [17], B. laxiflora [16]. Tuy nhiên chƣa thấy có công bố phân lập hợp chất này từ loài B. fungosa subsp. indica. Các số liệu phổ NMR của hợp chất BF1 đƣợc quy kết nhƣ bảng 4.1 dƣới đây. Bảng 4.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất BF1 và hợp chất tham khảo # a,b a,c STT δC δC δH (mult., J in Hz) 1 138.6 136.8 - 2 113.8 111.8 6.45 (s) 3 149.0 147.0 - 4 145.9 144.0 - 5 115.9 114.3 6.62 (d, 7.6) 6 123.2 121.9 6.47 (d, 7.6) 7 48.1 47.3 3.54* 8 48.0 47.5 1.62 (m) 9 62.2 61.9 3.27 (dd, 4.4, 10.4) 3.54* 5-OCH3 56.3 55.5 3.64 (s) 1ʹ 129.0 127.2 - 2ʹ 112.4 110.4 6.43 (s) 3ʹ 147.2 145.2 - 4ʹ 145.3 143.4 - 5ʹ 117.3 115.8 6.07 (s) 6ʹ 134.2 132.5 - 7ʹ 33.6 32.7 2.58 (d, 7.6) 8ʹ 40.0 39.5 1.84 (m) 9ʹ 65.9 65.5 3.54* 3.56* 3ʹ-OCH3 56.4 55.5 3.67 (s) 33
  42. a b c # Đo trong CDCl3 + CD3OD, 100 MHz, 400MHz, δC của hợp chất *) isolariciresinol [10] đo trong CD3OD; mult: độ bội tín hiệu, Tín hiệu bị chồng lấp. 4.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất BF2 (Salicifoliol) Hợp chất BF2 đƣợc phân lập dƣới dạng chất rắn vô định hình màu vàng nhạt. Hình 4.2.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất BF2 Trên phổ 1H-NMR của hợp chất BF2 nhận thấy các tín hiệu gồm ba tín hiệu proton thơm thuộc hệ tƣơng tác ABX tại δH 6.88 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.87 (1H, br s), 6.79 (1H, br d, J = 8.0 Hz); tín hiệu của một nhóm methoxy tại δH 3.89 (3H, s). Hình 4.2.2. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF2 34
  43. Hình 4.2.3. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF2 Phân tích phổ 13C-NMR hợp chất BF2 nhận thấy xuất hiện tín hiệu của 13 carbon. Dựa trên phân tích phổ hai chiều HSQC có thể xác định các tín hiệu carbon này gồm một nhóm carbonyl tại δC 178.2; sáu carbon thơm với ba carbon không liên kết trực tiếp với hydro tại δC 146.9, 145.8, 130.5 và ba nhóm CH tại δH 6.88 / δC 114.4, δH 6.79 / δC 119.1, δH 6.87 / δC 108.4; một nhóm oxymethin tại δH 4.59/ δC 86.1; hai nhóm oxymethylene tại δH 4.48, 4.32/ δC 69.9 và δH 4.32, 4.17 / δC 69.8; và hai nhóm methin tại δH 3.10 / δC 48.2 và δH 3.43 / δC 46.0; một nhóm methoxy tại δH 3.89/ δC 56.0. Các tín hiệu proton thuộc hệ tƣơng tác ABX và sáu carbon thơm trên phổ 13C-NMR cho thấy hợp chất BF2 có chứa 1 vòng benzen thế ba vị trí 1,3,4. Ngoài ra, tín hiệu ở trƣờng thấp của C-3′ (δC 146.9) và C-4′ (δC 145.8) cho thấy các nguyên tử carbon này liên kết với oxy. Độ chuyển dịch hóa học của hai tín hiệu carbon oxymethylene C-8 (δC 69.8), C-4 (δC 69.9) cho thấy các nguyên tử oxy thế tại C-8 và C-4 thuộc nhóm chức ete hoặc ester. 35
  44. Hình 4.2.4. Phổ HSQC của hợp chất BF2 Từ các phân tích trên cho phép dự đoán đƣợc cấu trúc hóa học của hợp chất BF2 có dạng furanolactone có chứa một vòng benzen thế ba vị trí 1,3,4. Thống kê tài liệu tham khảo và so sánh số liệu phổ 13C-NMR của hợp chất BF2 với hợp chất salicifoliol là một hợp chất có đặc điểm về cấu trúc hóa học phù hợp với các dẫn chứng đã phân tích trên. Sự trùng hợp về số liệu phổ 13C- NMR của hợp chất BF2 với hợp chất salicifoliol cho phép kết luận cấu trúc hóa học của hợp chất BF2 chính là salicifoliol [3]. Hợp chất này đƣợc phân lập lần đầu tiên từ loài Bupleurum salicifolium [3]. Gần đây hợp chất này còn đƣợc công bố là thành phần có hoạt tính kháng viêm của loài Forsythia suspensa [11] và có tác dụng ức chế enzyme 5α-reductase ở loài Swertia atroviolacea [22]. Tuy vậy, chƣa có công bố phân lập đƣợc hợp chất này từ các loài thuộc chi Balanophora. 36
  45. Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất BF2 và hợp chất tham khảo # a,b a,c STT δC δC δH (mult., J in Hz) C-1 46.19 46.0 3.43 (m) C-2 86.30 86.1 4.59 (d, 6.8) C-4 70.15 69.9 4.48 (dd, 7.2, 9.6) 4.32* C-5 48.34 48.2 3.10 (m) C-6 178.24 178.2 - C-8 70.00 69.8 4.32* 4.17 (dd, 3.2, 9.6) 1ʹ 130.84 130.5 - 2ʹ 108.69 108.4 6.87 (br s) 3ʹ 147.12 146.9 - 4ʹ 146.07 145.8 - 5ʹ 114.63 114.4 6.88 (d, 8.0) 6ʹ 119.27 119.1 6.79 (br d, 8.0) OCH3 56.17 56.0 3.89 (s) a b c # Đo trong CDCl3, 100 MHz, 400MHz, δC của hợp chất salicifoliol đo trong *) CDCl3 [3]; mult: độ bội tí hiệu, Tín hiệu bị chồng lấp. 4.3. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất BF3 (Dihydroconiferyl alcohol) Hợp chất BF3 phân lập đƣợc dƣới dạng bột vô định hình màu vàng nhạt. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất BF3 có thể nhận dạng đƣợc một số các tín hiệu nhƣ: 5 proton thơm tại δH 6.74 (1H, br s), 6.67 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.60 (1H, br d, J = 8.0 Hz; 1 nhóm methoxy tại δH 3.80 (3H, s); 3 nhóm methylene tại δH 3.53 (2H, t, J = 6.4 Hz), 1.77 (2H, m), 2.56 (t, J = 7.6 Hz). 37
  46. Hình 4.3.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF3 Hình 4.3.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF3 38
  47. Phân tích phổ 13C-NMR của hợp chất BF3 nhận thấy xuất hiện tín hiệu của 10 carbon. Dựa trên phổ tƣơng tác dị hạt nhân qua một liên kết HSQC có thể phân loại các tín hiệu carbon và proton nhƣ sau: 1 nhóm methoxy tại δH 3.80 / δC 56.3; ba nhóm methylene tại δH 3.53 / δC 62.2, δH 1.77 / δC 35.6, và δH 2.56 / δC 32.6; 6 tín hiệu carbon thơm với 3 carbon không liên kết trực tiếp với hydro tại δC 134.9, 148.8, 145.5 và 3 nhóm CH thơm tại δH 6.74/ δC 113.1, δH 6.67/ δC 116.0, δH 6.60/ δC 121.8. Sự xuất hiện tín hiệu của 3 proton thơm với hệ tƣơng tác spin ABX và 6 tín hiệu carbon thơm cho thấy hợp chất BF3 cũng có chứa một vòng benzen thế 3 vị trí 1,3,4. Mặt khác, giá trị độ chuyển dịch hóa học ở trƣờng thấp của C-3, C-4 cho thấy các nguyên tử carbon này liên kết trực tiếp với oxy. Ngoài ra, ba tín hiệu carbon methylen còn lại cho thấy sự có mặt của mảnh cấu trúc trimethylen. Đồng thời giá trị độ chuyển dịch hóa học của carbon oxymethylen tại δC 62.2 cho thấy nguyên tử carbon này mang nhóm thế hydroxy. Hình 4.3.3. Phổ HSQC của hợp chất BF3 39
  48. Từ các phân tích trên có thể dự đoán cấu trúc hóa học của hợp chất BF3 là dihydroconiferyl alcohol một hợp chất phenylpropanoid đƣợc thông báo phân lập ở nhiều loài thực vật khác nhau. Số liệu phổ 13C-NMR của hợp chất BF3 cũng nhận thấy phù hợp với các số liệu ở phần aglycone của hợp chất dihydroconiferin (BF3a) [13], là hợp chất O-glucoside của dihydroconiferyl alcohol ở vị trí 4 (Hình 4.3.4). Hình 4.3.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất BF3 và hợp chất tham khảo BF3a Bảng 4.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất BF3 và hợp chất tham khảo # a,b a,c STT δC δC δH (mult., J in Hz) 1 136.4 134.9 - 2 113.3 113.1 6.74 (br s) 3 149.3 148.8 - 4 145.1 145.5 - 5 115.9 116.0 6.67 (d, 8.0) 6 120.6 121.8 6.60 (br d, 8.0) 7 31.7 32.6 2.56 (t, 7.6) 8 34.9 35.6 1.77 (m) 9 60.6 62.2 3.53 (t, 6.4) 4-OCH3 56.1 56.3 3.80 (s) a b c # Đo trong CD3OD, 100 MHz, 400 MHz, δC ở phần aglycone của hợp chất dihydroconiferin (BF3a) đo trong DMSO-d6 [13]; mult: độ bội tín hiệu. 40
  49. KẾT LUẬN Bằng các phƣơng pháp sắc ký kết hợp, đã phân lập đƣợc ba hợp chất từ cây Dó đất là: Isolariciresinol (BF1), Salicifoliol(BF1) và Dihydroconiferyl alcohol (BF1) đƣợc phân lập từ dịch chiết dichloromethane. Cấu trúc hóa học của chúng nhƣ sau: Cấu trúc của ba hợp chất trên đƣợc xác định bằng phƣơng pháp phổ hiện đại nhƣ phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hai chiều (HMBC, HSQC). 41
  50. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Võ Văn Chi, Từ điển cây thuốc Việt Nam. Vol. Tập 1. 2012, Nhà xuất bản Y học Hà Nội. [2] Trần Công Khánh, Cây Dó đất. Tạp chí Thuốc & Sức khỏe, 420-421, 33 (2012). Tiếng Anh [3] A.G. González, R. Estévez-Reyes, C. Mato, Salicifoliol, a New Furolactone-Type Lignan from Bupleurum salicifolium. Journal of Natural Products, 52, 1139-1142 (1989). [4] M. Haruna, T. Koube, K. Ito, H. Murata, Balanophonin, A new neo- lignan from Balanophora japonica Makino. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 30, 1525-1527 (1982). [5] S.T. Ho, Y.T. Tung, K.C. Cheng, J.H. Wu, Screening, determination and quantification of major antioxidants from Balanophora laxiflora flowers. Food Chemistry, 122, 584-588 (2010). [6] T. Hosoya, A. Nakata, K. Zaima, J. Latip, L.B. Din, N. Muslim, H. Morita, Papuabalanols A and B, new tannins from Balanophora papuana. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 58, 738-741 (2010). [7] Z.H. Jiang, Y. Hirose, H. Iwata, S. Sakamoto, T. Tanaka, I. Kouno, Caffeoyl, coumaroyl, galloyl, and hexahydroxydiphenoyl glucoses from Balanophora japonica. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 49, 887-892 (2001). [8] Z.H. Jiang, T. Tanaka, H. Iwata, S. Sakamoto, Y. Hirose, I. Kouno, Ellagitannins and lignan glycosides from Balanophora japonica (Balanophoraceae). Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 53, 339- 341 (2005). [9] Z.H. Jiang, X.Y. Wen, T. Tanaka, S.Y. Wu, Z. Liu, H. Iwata, Y. Hirose, S. Wu, I. Kouno, Cytotoxic hydrolyzable tannins from Balanophora japonica. Journal of Natural Products, 71, 719-723 (2008). [10] A. Jutiviboonsuk, H. Zhang, G.T. Tan, C. Ma, N. Van Hung, N. Manh Cuong, N. Bunyapraphatsara, D.D. Soejarto, H.H. Fong, Bioactive constituents from roots of Bursera tonkinensis. Phytochemistry, 66, 2745-51 (2005). 42
  51. [11] P.-C. Kuo, H.-Y. Hung, C.-W. Nian, T.-L. Hwang, J.-C. Cheng, D.-H. Kuo, E.J. Lee, S.-H. Tai, T.-S. Wu, Chemical Constituents and Anti- inflammatory Principles from the Fruits of Forsythia suspensa. Journal of Natural Products, 80, 1055-1064 (2017). [12] B. Luo, K. Zou, Z. Guo, F. Dan, J. Wang, H. Wang, Balanoinvolin, a new steroid derivative from Balanophora involucrate. Chemistry of Natural Compounds, 45, 371-373 (2009). [13] M. Mazur, K. Hope‐Ross, J.F. Kadla, R. Sederoff, H.m. Chang, Synthesis of Hydroxyphenylpropanoid β‐D‐glucosides. Journal of Wood Chemistry and Technology, 27, 1-8 (2007). [14] T. Ogi, M. Higa, S. Maruyama, Melanin synthesis inhibitors from Balanophora fungosa. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 59, 1109-1114 (2011). [15] G.M. She, Y.J. Zhang, C.R. Yang, Phenolic constituents from Balanophora laxiflora with DPPH radical-scavenging activity. Chemistry & Biodiversity, 6, 875-880 (2009). [16] G.M. She, Y.J. Zhang, C.R. Yang, Phenolic Constituents from Balanophora laxiflora with DPPH Radical‐Scavenging Activity. Chemistry & Biodiversity, 6, 875-880 (2009). [17] G.M. She, Y.J. Zhang, C.R. Yang, A New Phenolic Constituent and a Cyanogenic Glycoside from Balanophora involucrata (Balanophoraceae). Chemistry & Biodiversity, 10, 1081-1087 (2013). [18] T. Tanaka, R. Uehara, K. Nishida, I. Kouno, Galloyl, caffeoyl and hexahydroxydiphenoyl esters of dihydrochalcone glucosides from Balanophora tobiracola. Phytochemistry, 66, 675-681 (2005). [19] K.J. Wang, Y.J. Zhang, C.R. Yang, New phenolic constituents from Balanophora polyandra with radical-scavenging activity. Chemistry & Biodiversity, 3, 1317-1324 (2006). [20] W. Wang, S.F. Zeng, C.R. Yang, Y.J. Zhang, A new hydrolyzable tannin from Balanophora harlandii with radical-scavenging activity. Helvetica Chimica Acta, 92, 1817-1822 (2009). [21] X. Wang, Z. Liu, W. Qiao, R. Cheng, B. Liu, G. She, Phytochemicals and biological studies of plants from the genus Balanophora. Chemistry Central Journal, 6, 79(1)-79(9) (2012). [22] H.Y. Wu, X.Q. Kan, Y. Sheng, L.Y. Mou, Q.S. Yang, Q.F. Hu, G.P. Li, Two new phenylpropanoids from Swertia atroviolacea and their anti-5alpha-reductase activity. Nat Prod Res, 31, 1431-1436 (2017). [23] K. Yagishita, Isolation and identification of taraxasterol and β- amyrin from the bird-lime of Balanophora japonica Makino. Bulletin 43
  52. of the Agricultural Chemical Society of Japan, 20, 206-210 (1956). [24] L.J. Zhang, H.T. Huang, S.Y. Huang, Z.H. Lin, C.C. Shen, W.J. Tsai, Y.H. Kuo, Antioxidant and Anti-Inflammatory Phenolic Glycosides from Clematis tashiroi, Journal of Natural Products, 78, 1586-1592 (2015). [25] T. Zhou, X.H. Zhang, S.W. Zhang, S.S. Liu, L.J. Xuan, New phenylpropanoids and in vitro alpha-glucosidase inhibitors from Balanophora japonica, Planta medica, 77, 477-481 (2011). 44