Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn A5 cao chloroform rễ cây hà thủ ô trắng Streptocaulon juventas

Nội dung text: Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn A5 cao chloroform rễ cây hà thủ ô trắng Streptocaulon juventas

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN A5 CAO CHLOROFORM RỄ CÂY HÀ THỦ Ô TRẮNG Streptocaulon juventas NGUYỄN HỮU TOÀN Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 05 năm 2019
2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN A5 CAO CHLOROFORM RỄ CÂY HÀ THỦ Ô TRẮNG Streptocaulon juventas Giảng viên hƣớng dẫn: TS. Bùi Xuân Hào Sinh viên thực hiện: Nguyễn Hữu Toàn Mã số sinh viên: K40.201.094 Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 05 năm 2019
3. NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN PHẢN BIỆN Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 05 năm 2019 Giảng viên phản biện
4. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm Hợp chất thiên nhiên, khoa Hóa học, trƣờng Đại học Sƣ phạm thành phố Hồ Chí Minh. Em xin chân thành cảm ơn giáo viên hƣớng dẫn Thầy Bùi Xuân Hào đã tận tâm trong việc truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm quý báu. Thầy luôn theo dõi quá trình làm việc của em để kịp thời phát hiện, điều chỉnh, sửa chữa những sai sót. Tất cả nhằm tạo điều kiện tối ƣu nhất có thể để em hoàn thành Khóa luận tốt nghiệp của mình. Song song với những bài học thực nghiệm, Thầy còn truyền cho em tinh thần nghiên cứu khoa học, giúp em có động lực trong việc học tập và nghiên cứu. Em xin cảm ơn quý Thầy Cô trong phòng thí nghiệm Hợp chất thiên nhiên nói riêng cũng nhƣ quý Thầy Cô khoa Hóa học – trƣờng Đại học Sƣ phạm thành phố Hồ Chí Minh nói chung đã tận tâm trong công tác giảng dạy, truyền thụ cho em nhiều kiến thức khoa học hữu ích trong suốt thời gian em học tập tại trƣờng. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến bạn Trần Thị Tú Quyên, bạn Nguyễn Thị Ngọc Nƣơng, chị Trần Thị Thu Sƣơng đã đồng hành cùng em trong suốt thời gian qua. Xin chân thành cảm ơn.
5. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn MỤC LỤC MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 2 1.1.1. Mô tả chung 2 1.1.2. Vùng phân bố 3 1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƢỢC TÍNH 3 1.2.1. Dƣợc tính theo y học cổ truyền 3 1.2.2. Nghiên cứu về dƣợc tính 3 1.3. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 4 CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM 12 2.1. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ, PHƢƠNG PHÁP 12 2.1.1. Hoá chất 12 2.1.2. Thiết bị 12 2.1.3. Phƣơng pháp tiến hành 12 2.2. NGUYÊN LIỆU 12 2.2.1. Thu hái nguyên liệu 12 2.2.2. Xử lý mẫu nguyên liệu 13 2.3. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO 13 2.4. CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO CHLOROFORM 14 2.4.1. Sắc kí cột silica gel trên cao chloroform 14 2.4.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn A5 của bảng 2.1 14 2.4.3. Sắc kí cột pha đảo trên phân đoạn A5.4 của bảng 2.2 15 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 20 4.1. KẾT LUẬN 20 4.2. ĐỀ XUẤT 20 TÀI LIỆU THAM KHẢO 21
6. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, Tiếng Anh Tiếng Việt chữ viết tắt Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR Proton (1) Nuclear Magnetic Resonance của proton (1) Carbon (13) Nuclear Magnetic Phổ cộng hƣởng từ hạt 13C-NMR Resonance nhân của carbon (13) Heteronuclear Single Quantum Phổ tƣơng tác dị hạt nhân HSQC Correlation qua một liên kết Phổ tƣơng tác dị hạt nhân HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence qua nhiều liên kết s Singlet Mũi đơn d Doublet Mũi đôi t Triplet Mũi ba dd Double of doublet Mũi đôi đôi m Multiplet Mũi đa  Chemical shift Độ chuyển dịch hoá học J Coupling constant Hằng số ghép spin ppm Part per million Một phần một triệu UV Ultra Violet Tia cực tím EA Ethyl Acetate Etyl axetat C Chloroform Clorofom Me Methanol Metanol Et Ethanol Etanol H n-Hexane Hexan AcOH Acetic acid Axit axetic Ac Acetone Axeton SKC Sắc ký cột SKLM Sắc ký lớp mỏng g Gam Gam mg Miligam Mi-li-gam MHz Mega Hertz Me-ga-héc Hz Hertz Héc cm Centimeter Xăng - ti- mét mm Milimeter Mi-li-mét m Micrometer Mi-crô-mét nm Nanometer Na-nô-mét
7. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các nghiên cứu về thành phần hóa học 4 Bảng 2.1. Sắc kí cột silica gel trên cao chloroform 14 Bảng 2.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn A5 15 Bảng 3.1. So sánh số liệu phổ của hợp chất SJ1 và hợp chất 5-pregnen-3,17,20-triol 19
8. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Quy trình điều chế cao chloroform từ rễ cây Hà thủ ô trắng 13 Sơ đồ 2.2. Quy trình cô lập hợp chất 16
9. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cây và củ Hà thủ ô trắng 2 Hình 3.1. Cấu trúc hợp chất SJ1 18 Hình 3.2. Một số tƣơng quan HMBC của hợp chất SJ1 18
10. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục 1a. Phổ 1H-NMR (MeOD) của hợp chất SJ1 Phụ lục 1b. Phổ 13C-NMR (MeOD) của hợp chất SJ1 Phụ lục 1c. Phổ HSQC (MeOD) của hợp chất SJ1 Phụ lục 1d. Phổ HMBC (MeOD) của hợp chất SJ1
11. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn LỜI MỞ ĐẦU Việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các chất có trong thảo mộc đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển y học nói chung và Đông Y nói riêng. Kết quả thu đƣợc từ các nghiên cứu mở ra con đƣờng tổng hợp các hợp chất có những hoạt tính quý, có tác dụng chữa bệnh. Cây Hà thủ ô trắng có tên khoa học là Streptocaulon juventas (Lour) Merr, thuộc họ thiên lý Asclepiadaceae. Cây Hà thủ ô trắng có công dụng làm cho ngƣời già trẻ lại, giúp cho sự giao hợp đƣợc bền lâu, tóc bạc hóa đen. Trong kháng chiến tại các vùng dân tộc, ngƣời ta dùng củ và thân lá cây này chữa cảm sốt, cảm nắng, sốt rét. Ngoài ra, có nơi ngƣời ta sắc cây này với nƣớc cho phụ nữ mới sinh uống để ra sữa. Hi vọng với đề tài “Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn A5 cao chloroform rễ cây Hà thủ ô trắng” có thể đóng góp một phần nhỏ chứng cứ khoa học có giá trị vào kho dƣợc liệu của Y học dân tộc Việt Nam. 1
12. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT Tên thông thƣờng: Hà thủ ô trắng. Tên gọi khác: hà thủ ô nam, bạch hà thủ ô, củ vú bò, dây sữa bò, dây mốc, cây sừng bò, cây đa lông, khâu cần cà (Thổ), khâu nƣớc (Lạng Sơn), mã liên an, mã lìn ón, khua mak tang ning (Lào), khua khao (Luang Prabang), chừa ma sìn (Thái) [1]. Tên khoa học: Streptocaulon juventas (Lour) Merr. Thuộc họ Thiên lý (Asclepiadaceae). Hình 1.1. Cây và củ Hà thủ ô trắng 1.1.1. Mô tả chung Hà thủ ô trắng là một loại dây leo dài từ 2 đến 5m. Thân và cành màu hơi đỏ hay nâu đỏ, có rất nhiều lông, khi già thì nhẵn dần. Lá mọc đối, hình mác dài, đầu nhọn, đáy tròn hoặc hơi hình nón cụt, có lông mịn và nhiều ở mặt dƣới, mặt trên cũng có lông nhƣng ngắn hơn. Phiến lá dài 4-14 cm, rộng 2-9 cm, cuống lá dài 5-8 cm cũng có nhiều lông. Hoa màu nâu nhạt hoặc vàng tía mọc thành xim, rất nhiều lông. Quả đại tách đôi ngang ra trông nhƣ 2
13. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn sừng bò. Quả hình thoi, màu xám nhiều lông, dài 7-11 cm, rộng 8 mm. Hạt dẹt, phồng ở lƣng, dài 5-7 mm, rộng 2 mm, có chùm lông mịn dài 2 cm. Toàn cây bấm thân, lá, quả non chỗ nào cũng ứa ra thứ nhựa trắng nhƣ sữa. Rễ củ dài mẫm và trắng, giữa có lõi trông nhƣ củ sắn nhƣng có vị đắng [1]. 1.1.2. Vùng phân bố Cây Hà thủ ô trắng mọc hoang ở khắp đồi núi trọc nƣớc ta. Thƣờng ƣa những nơi đất đồi cứng vùng Vĩnh Phúc, Hà Tây, Hà Giang, Tuyên Quang, Cao Bằng, Lạng Sơn [1]. Ngoài ra, cây còn mọc ở Trung Quốc, Campuchia, Ấn Độ, Indonesia, Lào, Myanmar, Thái Lan. 1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƢỢC TÍNH 1.2.1. Dƣợc tính theo y học cổ truyền Cây Hà thủ ô trắng làm cho ngƣời già trẻ lại, giúp cho sự giao hợp đƣợc bền lâu, tóc bạc hóa đen. Ngƣời ta dùng củ và thân lá cây chữa cảm sốt, cảm nắng, sốt rét [1]. Dịch trích nƣớc rễ cây Hà thủ ô trắng dùng giải độc, chữa cảm sốt, trị vết sƣng đau, vết thƣơng do rắn cắn, làm thuốc bổ cho các bệnh khác nhƣ thấp khớp, suy nhƣợc thần kinh, và chứng khó tiêu. 1.2.2. Nghiên cứu về dƣợc tính Năm 2002, có nghiên cứu dùng cao chiết cồn đậm đặc của rễ củ Hà thủ ô trắng tăng cholesterol ngoại sinh trên chuột [2]. Sau đó, nghiên cứu trong dịch chiết rễ cây Hà thủ ô trắng có ức chế mạnh đối với các dòng tế bào ung thƣ là ung thƣ cổ tử cung Hela ở ngƣời, tế bào ung thƣ phổi ngƣời A549, tế bào ung thƣ đại tràng chuột 26-L5, tế bào ung thƣ phổi chuột LLC, các dòng tế bào ung thƣ ác tính chuột B16-BL6 [6], tế bào ung thƣ phổi lớn tế bào NCl-H460, nguyên bào phổi của thai nhi tế bào MRC-5 [11], cùng các tế bào khối u khác nhƣ: PC3, SMMC7721, CNE [13]. 3
14. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn Ngoài ra, trong dịch chiết của cây Hà thủ ô trắng có thể ức chế sự phát triển của tế bào ung thƣ bạch cầu HL-60 ở ngƣời đáng kể [14]. 1.3. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC Bảng 1.1. Các nghiên cứu về thành phần hóa học Số chất Năm Tác giả Tên chất cô lập acovenosigenin A digitoxoside (1), digitoxigenin gentiobioside (2), digitoxigenin 3-O- [O-β-D-glucopyranosyl- (1 → 6)–O-β-D-glucopyranosyl-(1 → 4)-3-O-acetyl-β-D- digitoxopyranoside] (3), digitoxigenin 3-O-[O-β-D- glucopyranosyl-(1 → 6)–O-β-D-glucopyranosyl-(1 → 4)–O- β-D-digitalopyranosyl-(1 → 4)–β-D-cymaropyranoside] (4), periplogenin 3-O-(4-O-β-D-glucopyranosyl-β-D- digitalopyranoside) (5), (4R)-4-hydroxyl-3- (1- Jun-ya metyletyl)pentyl rutinoside (6), (R)-2-etyl-3-metylbutyl 2003 Ueda và 21 cộng sự rutinoside (7), acovenosigenin A (8), periplogenin 3-O-β- digitoxoside (9), periplocymarin (10), periplogenin (11), digitoxigenin (12), digitoxigenin 3-O-[O-β-D- glucopyranosyl-(1 → 6)–O-β-D-glucopyranosyl-(1 → 4)–β- D-digitoxopyranoside] (13), digitoxigenin sophoroside (14), echujin (15), periplogenin glucoside (16), corchorusoside C (17), subalpinoside (18), acid caffeic (19), 4,5-di-O- caffeoylquinic acid (20), 2-phenylethyl rutinoside (75) [6]. periplogenin - 3β-acetate (21), -amyrol acetate (22), - amyrol tridecanoate (23), ursolic acid (24), 9,19-cyclolart-25- Ma 2005 Chunhui và 12 en-3β,24R-diol (25), 9,19-cyclolart-25-en-3β,24S-diol (26), cộng sự cycloeucalenol (27), 9,19-cycloart-23E-en-3 β, 25-diol (28), 25-methoxy-9,19-cycloart-23E-en-3 β-ol (29), 11 ,12 - 4
15. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn epoxytaraxer-14-en-3β-acetate (30), oleanolic acid (76), uzarigenin (77) [8]. 5 17β-H-Periplogenin 3-O-β-D-digitoxoside (31), ∆ -Pregnene- Myint 3β,16α-diol 3-O-[2,4-O-diacetyl-β-D- Myint 2007 2 Khine và digitalopyranosyl(1→4)-β-D-cymaropyranoside]- 16-O-[β-D- cộng sự glucopyranoside] (32) [9]. β –sitosterol (33), syringaldehyde (34), acid syringic (35), Zhinhui Liu 2008 cùng cộng 9 isofraxidin (36), scopoletin (37), scoparone (38), acid ferulic sự (39), salicylaldehyde (40), daucosterol (74) [14]. Bùi Xuân 2009 1 acovenosigenin A 3-O-glucoside (41) [3]. Hào 17 -H-periplogenin-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O-acetyl- Luay β-D-digitalopyranoside (42), oleandrin (43), oleandrigenin-3- 2011 J. Rashan 6 O-β-D-sarmentoside (44), neritaloside (45), odoroside H (46), và cộng sự odoroside A (47) [7]. 1 -14β-dihudroxy-5β-card-20 (22)-enolide 3-O-[O-β-D- digitalopyranoside] (48), acovenosigenin A 3-O-[O-β-D- glucopyranosyl-(1→4)-β-D-digitalopyranoside] (49), 16-O- acetyl-hdroxyperiplogenin 3-O-β-D-digitoxopyranoside (50), 16-O-acetyl-hydroxyacovenosigenin (51), 3-O-(β- glucopyranosyl) acovenosigenin A (52), evonogenin (53), Rui Xue và 2013 15 glucoevonogenin (54), digitoxigenin 3-O-[O-β-D- cộng sự glucopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O- acetyl-β-D- digitalopyranoside] (55), digitoxigenin (56), digitoxigenin 3-O-β-D-glucoside (57) echunbioside (58), 1β, 3β, 14β-trihydroxy-5β-card-16,20 (22)-dienolide (59), griffithigenin (60), ∆(16) -digitoxigenin –β-D-glucoside (61), emicymarin (78) [10]. periplogenin 3-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-O-β-D- glucopyranosyl-(1→4)-2-O-acetyl-β-D-digitalopyranoside] Chun Ye và 2015 9 cộng sự (62), periplogenin 3-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-O-β- D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-digitoxopyranoside] (63), 5
16. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn acovenosigenin A 3-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-O-β- D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranoside] (64), acovenosigenin A 3-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-O-β- D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O-acetyl-β-D-digitalopyranoside] (65), 16-O-acetyl-hydroxyacovenosigenin 3-O-[O-β-D- glucopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O- acetyl-β-D-digitalopyranoside] (66), acovenosigenin A 3-O- [O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-O-β- D-glucopyranosyl- (1→4)-O-β-D-digitalopyranosyl-(1→4)-β-D- cymaropyranoside] (67), digitoxigenin 3-O-β-D-cellobioside (68), digitoxigenin-3-O-β-D-glucosyl-(1→4)-3-O-acetyl-β-D- digitoxoside (69), 5β-Hydroxygitoxigenin (70) [4]. 28, 29-nor-3β, 4β-dihydroxyl-9, 19-cycloartan-26-acid (71), 28, 29-nor-3β, 4β-dihydroxyl-9, 19-cycloartan-26-acid Yi-Chao Ge 2017 6 và cộng sự methylester (72), 30-nor-3-β-acetoxy-lupan-20-one (73), - amyrin (79), betulinic acid (80), lupeol palmitate (81) [13]. 6
17. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn Các công thức cấu tạo của một số hợp chất trong cây Streptocaulon juventas (Lour) Merr. 7
18. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn 8
19. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn 9
20. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn 10
21. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn Chú thích: 11
22. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn CHƢƠNG 2 THỰC NGHIỆM 2.1. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ, PHƢƠNG PHÁP 2.1.1. Hoá chất Silica gel 37 – 63 μm, Himedia dùng cho sắc kí cột. Sắc kí lớp mỏng loại DC - Alufolein 20×20, Kiesel gel 60 F , Merck. 254 Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm: hexane, chloroform , ethyl acetate, ethanol, methanol, n-butanol và nƣớc cất. Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên lớp mỏng: dung dịch H2SO4 20%. 2.1.2. Thiết bị Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu. Các cột sắc kí. Máy cô quay chân không. Bếp cách thuỷ. Đèn soi UV: bƣớc sóng 254 nm và 365 nm. Cân điện tử. 2.1.3. Phƣơng pháp tiến hành Phƣơng pháp phân lập các hợp chất Cô lập các hợp chất hữu cơ bằng phƣơng pháp sắc kí, bao gồm kỹ thuật sắc kí cột silica gel pha thƣờng; pha đảo và sắc kí lớp mỏng. Đƣợc hiện hình bằng đèn tử ngoại ở hai bƣớc sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 20%. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz), 2D-NMR trên máy Bruker Avance đƣợc ghi tại phòng NMR, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 18, Hoàng Quốc Việt, Quận Cầu Giấy, Hà Nội. 2.2. NGUYÊN LIỆU 2.2.1. Thu hái nguyên liệu Mẫu cây dùng trong nghiên cứu đề tài là rễ cây Hà thủ ô trắng (Streptocaulon 12
23. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn juventas (Lour) Merr.) đƣợc thu hái ở Tịnh Biên tỉnh An Giang vào tháng 10 năm 2016. Mẫu cây đã đƣợc Th.S Hoàng Việt, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh nhận danh tên khoa học là “Streptocaulon juventas”, họ Thiên lý (Asclepiadaceae). 2.2.2. Xử lý mẫu nguyên liệu Mẫu nguyên liệu đƣợc rửa sạch, loại bỏ sâu bệnh, phơi khô trong bóng râm, rồi xay thành bột mịn. 2.3. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO Bột rễ cây Hà thủ ô đƣợc đun hoàn lƣu với dung môi methanol ở nhiệt độ 64-65oC, mỗi mẻ đun 3 lần, mỗi lần đun trong 2 giờ. Sau đó đem lọc, thu đƣợc dịch, rồi đem cô quay với áp suất thấp thu đƣợc cao methanol thô. Cao methanol thô đƣợc chiết lỏng – lỏng với dung môi chloroform, cô quay dịch chiết thu đƣợc cao chloroform. Quá trình thực hiện đƣợc tóm tắt theo sơ đồ 2.1. Bột thô rễ Hà thủ ô (20 kg) - Đun hoàn lƣu với methanol (3 lần x 2 giờ). - Lọc bã. - Cô quay thu hồi dung môi ở áp suất thấp. Cao methanol Bã khô (2.02 kg) - Phân tán vào nƣớc - Chiếc lỏng-lỏng lần lƣợt với các dung môi choloroform; ethyl acetate và n-butanol - Cô quay thu hồi dung môi ở áp suất thấp. Cao chloroform Cao ethyl acetate Cao n-butanol (400 gam) (80 gam) (350 gam) Sơ đồ 2.1. Quy trình điều chế cao chloroform từ rễ cây Hà thủ ô trắng 13
24. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn 2.4. CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO CHLOROFORM 2.4.1. Sắc kí cột silica gel trên cao chloroform Cao chloroform (400g) đƣợc sắc kí cột (SKC) silica gel, giải ly với hệ dung môi H:EA có độ phân cực tăng dần từ 0% đến 100% EA, sau đó giải ly lần lƣợt với các hệ dung môi EA:Me 9:1, EA:Me:H2O 8:1:1, EA:Me:H2O 4:1:1, EA:Me:H2O 2:1:1 và 100% Me. Kết quả thu đƣợc mƣời ba phân đoạn ký hiệu từ A1 đến A13 Bảng 2.1. Sắc kí cột silica gel trên cao chloroform Khối lƣợng Sắc kí lớp STT Phân đoạn Dung môi giải ly Ghi chú (g) mỏng 1 A1 H 3.6 Nhiều vết Chƣa khảo sát 2 A2 H: EA 99:1 5.0 Nhiều vết Chƣa khảo sát 3 A3 H:EA 95:5 5.6 Nhiều vết Đã khảo sát 4 A4 H:EA 9:1 8.4 Nhiều vết Chƣa khảo sát 5 A5 H:EA 85:15 6.0 Nhiều vết Khảo sát 6 A6 H:EA 8:2 8.4 Nhiều vết Chƣa khảo sát 7 A7 H:EA 1:1 13.0 Nhiều vết Chƣa khảo sát 8 A8 EA 19.6 Nhiều vết Chƣa khảo sát 9 A9 EA:Me 9:1 26.8 Nhiều vết Chƣa khảo sát 10 A10 EA:Me:H2O 8:1:1 31.0 Nhiều vết Chƣa khảo sát 11 A11 EA:Me:H2O 4:1:1 41.2 Nhiều vết Chƣa khảo sát 12 A12 EA:Me:H2O 2:1:1 53.0 Vệt dài Chƣa khảo sát 13 A13 Me 71.6 Vệt dài Chƣa khảo sát 2.4.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn A5 của bảng 2.1 Phân đoạn A5 (6.0 gam) cho SKLM nhiều vết, tách rõ nên phân đoạn A5 đƣợc thực hiện SKC silica gel, giải ly với hệ dung môi Hexane:Ethanol có độ phân cực tăng dần. 14
25. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn Tiến hành các bƣớc tƣơng tự nhƣ khi sắc kí cột phân đoạn trƣớc. Kết quả thu đƣợc năm phân đoạn phụ ký hiệu từ A5.1 đến A5.5 Bảng 2.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn A5 Phân Khối lƣợng Sắc kí lớp STT Dung môi giải ly Ghi chú đoạn (mg) mỏng 1 A5.1 H 960 Nhiều vết Chƣa khảo sát 2 A5.2 H:Et 100:1 882 Nhiều vết Chƣa khảo sát 3 A5.3 H:Et 50:1 798 Nhiều vết Chƣa khảo sát 4 A5.4 H:Et 19:1 950 Nhiều vết Khảo sát 5 A5.5 H:Et 9:1 940 Nhiều vết Chƣa khảo sát 2.4.3. Sắc kí cột pha đảo trên phân đoạn A5.4 của bảng 2.2 Phân đoạn A5.4 có SKLM cho nhiều vết tách rõ. Tiến hành SKC pha đảo, C-18 nhiều lần với hệ dung môi giải ly MeOH: H2O 9:1 thu đƣợc hợp chất SJ1 có dạng tinh thể hình kim, không màu, tan hoàn toàn trong dung môi methanol. Quá trình thực hiện đƣợc tóm tắt theo sơ đồ 2.2. 15
26. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn Cao chloroform (400 gam) - Sắc kí cột silica gel - Giải ly H:EA, EA:Me:H2O - Cô quay thu hồi dung môi A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 3.6 g 5.0 g 5.6 g 8.4 g 6.0 g 8.4 g 13.0 g 19.6 g 26.8 g 31.0 g 41.2 g 53.0 g 71.6 g - Sắc kí cột silica gel - Giải ly Hexane:Ethanol A5.1 A5.2 A5.3 A5.4 A5.5 960 mg 882 mg 798 mg 950 mg 940mg - Sắc kí cột pha đảo, C-18 - Giải ly hệ MeOH:H2O 9:1 SJ1 122.5 mg Sơ đồ 2.2. Quy trình cô lập hợp chất 16
27. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT SJ1 Hợp chất SJ1 (122,5 mg) thu đƣợc đƣợc từ phân đoạn A5.4 của cao chloroform, có các tính chất sau: - Dạng tinh thể hình kim, không màu, tan hoàn toàn trong dung môi methanol. - Sắc kí lớp mỏng cho một vết duy nhất khi nhúng bằng H2SO4 20% và sấy nóng đến khi hiện vết, bảng mỏng cho vết màu nâu rêu. Phổ 1H-NMR (MeOD): Phụ lục 1a. Phổ 13C-NMR (MeOD): Phụ lục 1b. Phổ HSQC (MeOD): Phụ lục 1c. Phổ HMBC (MeOD): Phụ lục 1d.  BIỆN LUẬN CÁU TRÚC Phổ 1H-NMR của hợp chất SJ1 (phụ lục 1a) cho thấy sự hiện diện tín hiệu cộng hƣởng của ba nhóm methyl ở H 1.19 (3H, d, J = 6.0 Hz); 0.8 (3H, s) và 1.05 (3H, s). 1 Trên phổ H-NMR còn cho thấy tín hiệu cộng hƣởng của proton olefin ở H 5.37 (1H, m), hai proton methine gắn oxygen ở H 3.42 (1H, m) và 3.80 (1H, dd, J = 6.3; 12.5 Hz). Ngoài ra, phổ proton còn có sự hiện diện của các tín hiệu cộng hƣởng proton methylene và methine trong khoảng H 1.3 - 2.2 ppm. Phổ 13C-NMR của hợp chất SJ1 (phụ lục 1b) cho thấy sự hiện diện của 21 carbon, gồm có tín hiệu cộng hƣởng của ba carbon methyl ở C 14.8 (C-18); 18.8 (C-21); 19.8 (C-19), tám carbon methylene, sáu carbon methine trong đó có hai carbon methine gắn với oxygen ở C 72.4 (C-3) và C 72.9 (C-20), một carbon methine của olefin ở C 122.4 (C-6), và bốn carbon bậc bốn trong đó có một carbon olefin ở C 142.3 (C-5), một carbon gắn với oxygen ở C 87 (C-17). Phổ HMBC của hợp chất SJ1 (phụ lục 3d) cho thấy có sự tƣơng quan của proton nhóm methyl H 1.05 (3H, s, H-19) với carbon olefin C 142.3 (C-5) và các carbon ở C 38.6 (C- 1), 51.5 (C-9), 37.7 (C-10). Đồng thời proton olefin ở H 5.37 (1H, m, H-6) tƣơng quan với carbon C 33.2 (C-7), 33.3 (C-8), 37.7 (C-10) xác nhận sự hiện diện của liên kết đôi ở vị trí C5-C6. Proton nhóm methyl ở H 1.19 (3H, d, H-21) tƣơng quan với hai carbon ở C 87 17
28. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn (C-17); 72.9 (C-20). Đồng thời proton nhóm methyl ở H 0.8 (3H, s, H-18) tƣơng quan với carbon ở C 87.0 (C-17), 47 (C-13), 52.6 (C-14) xác nhận sự hiện diện của hai nhóm hydroxyl ở vị trí C-17 và C-20. Các tƣơng quan HMBC còn lại đƣợc trình bày cụ thể trong Hình 3.2 và Bảng 3.1. Từ các số liệu phổ trên, kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo (đƣợc trình bày trong Bảng 3.1) [12], cấu trúc của SJ1 đƣợc đề nghị là 5-pregnen-3,17,20-triol. Hình 3.1. Cấu trúc hợp chất SJ1 Hình 3.2. Một số tƣơng quan HMBC của hợp chất SJ1 18
29. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn Bảng 3.1. So sánh số liệu phổ của hợp chất SJ1 và hợp chất 5-pregnen-3,17,20-triol Hợp chất Hợp chất SJ1 5-pregnen-3,17,20-triol (MeOD) Vị trí (CD3)2CO Loại carbon carbon δH δC HMBC δC (ppm) (ppm) (ppm) (1H⟶13C) 1 -CH2- 1.9; 1.1 (m) 38.6 38.3 2 -CH2- 1.58; 1.52 (m) 33.2 32.6 3 >CH-O- 3.42 (m) 72.4 71.1 4 -CH2- 2.25; 2.20 (m) 43.0 C-3; 5; 6 43.4 5 >C= - 142.3 142.4 6 =CH- 5.37 (m) 122.4 C-7; 8; 10 121.6 7 -CH2- 2.05; 2.0 (m) 32.3 C-5; 6; 8; 9 32.8 8 >CH- 1.52 (m) 33.3 C-7; 9; 14 32.8 9 >CH- 0.97 (m) 51.5 C-10; 11; 19 51.1 10 >C C CH- 1.75 (m) 52.6 C-8; 13; 16; 18 52.2 15 -CH2- 2.08; 1.73 (m) 38.1 C-14; 16 38.6 16 -CH2- 1.76; 1.17 (m) 24.5 C-17 24.2 17 >C-O- - 87.0 85.8 18 -CH3 0.80 (s) 14.8 C-13; 14; 17; 14.4 19 -CH3 1.05 (s) 19.8 C-5; 9; 10 19.8 3.80 (q, 20 >CH-O- 72.9 C-21 72.2 J=6.3) 1.19 (d, 21 -CH 18.8 C-17; 20 19.2 3 J=6.0) 19
30. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn CHƢƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1. KẾT LUẬN Từ mẫu rễ cây Hà thủ ô trắng thu hái đƣợc ở huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang, tôi đã khảo sát thành phần hoá học cao chlorofom của rễ cây Hà thủ ô trắng. Bằng kỹ thuật sắc ký cột trên silica gel pha thƣờng, pha đảo, sắc ký lớp mỏng, đã cô lập đƣợc hợp chất: 5- pregnen-3,17, 20-triol. 4.2. ĐỀ XUẤT Trong thời gian tới chúng tôi sẽ tiếp tục khảo sát các phân đoạn khác của cây với hy vọng cô lập thêm những hợp chất có cấu trúc mới. Với mong muốn đóng góp những chứng cứ khoa học có giá trị trong Y học, tôi sẽ tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học trên các hợp chất cô lập đƣợc. 20
31. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1]. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, 836-837. [2]. Phạm Thanh Tâm, Trần Hùng (2002), Chuyên đề Nghiên cứu Khoa học Dƣợc, Y Học TP. Hồ Chí Minh, 49-52. Tài liệu Tiếng Anh [3]. Bui Xuan Hao, Nguyen Thi Hong Yen, Nguyen Minh Duc, Tran Le Quan (2009), Chemical constituents from the roots of Streptocaulon juventas, Science & Technology Development, 12(10), 72-77. [4]. Chun Ye, Hua Wang, Rui Xue, Na Han, Lihui Wang, Jingyu Yang, Yu Wang, Jun Yin (2015), Minor cytotoxic cardenolide glycosides from the root of Streptocaulon juventas, Steroids, 93, 39-46. [5]. Iman Omer, Ibrahim Abdurrahman, Yang Cai-Xia (2017), New Triterpenoid from the roots of Calotropis gigantea (L) Dryand (Asclepiadaceae), American Journal of Organic Chemistry, 7(1), 13-15. [6]. Jun-ya Ueda, Yasuhiro Tezuka, Arjun Hari Banskota, Quan Le Tran, Qui Kim Tran, Ikuo Saiki, and Shigetoshi Kadota (2003), Antiproliferative Activity of Cardenolides Isolated from Streptocaulon juventas, Biol. Pharm. Bull, 26(10), 1431-1435. [7]. Luay J.Rashan, Katrin Franke, Myint Myint Khine, Gerhard Kelter, Heinz H.Fiebig, Joachim Neumann, Ladger A. Wessjohann (2011), Characterization of the anticancer properties of monoglycosidic cardenolides isolated from Nerium oleander and Streptocaulon tomentosum, Journal of Ethnopharmacology, 134, 781-788. [8]. Ma Chunhui, Huang Tianfang, Qi Huayi, Li Bogang, Zhang Guolin (2005), Chemical study of Streptocaulon Griffithii, Chin j Appl Environ Biol, 11(3), 265-270. [9]. Myint Myint Khine, Norbert Arnold, Katrin Franke, Andrea Porzel, Jurgen Schimidt, Ludger Wessjohann (2007), Phytoconstituents from the root of Streptocaulon tomentosum and their chemotaxonomical relevance for separation from S. juventas, Biochemical Systematics and Ecology, 35, 517-524. 21
32. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn [10]. Rui Xue, Na Han, Chun Ye, Hai-bo, Jun Yin (2013), Cardenolide glycosides from root of Streptocaulon juventas, Phytochemistry, 88, 105-111. [11]. Rui Xue, Na Han, Chun Ye, Lihui Wang, Jingyu Yang, Yu Wang, Jun Yin (2014), The cytotoxic activities of cardiac glycosides from Streptocaulon juventas and the structure-activity relationships, Fitoterapia, 98, 228-233. [12]. Rui Xue, Na Han, Mingyu Xia, Chun Ye, Zhihui Hao, Lihui Wang, Yu Wang, Jingyu Yang, Ikuo Saiki, Jun Yin (2015), TXA9, a cardiac glycoside from Streptocaulon juventas, exerts a potent anti-tumor activity against human non-small cell lung cancer cells in vitro and in vivo, Steroids, 94, 51-59. [13]. Yi-Chao Ge, Yu-Chun Cheng, Kui-Wu Wang, Hong Wang (2017), Unusual 28, 29- nor-9, 19 cycloartane triterpenoids from Chinese medical plant Streptocaulon giffithii Hook, Phytochemistry Letters, 22, 185-188. [14]. Zhihui Liu, Songbo Li, Na Han, Dongxue Sun, Yunfeng Cao, Jun Yin (2008), Studies on the chemical constituents of the vines of Streptocaulon juventas (Lour.) Merr., Asian Journal of Tranditional Medicines, 3(5), 193-198. 22
33. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn PHỤ LỤC 23
34. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn Ph ụ l ụ c 1a c 24
35. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn Ph ụ l ụ c 1a c 25
36. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn Ph ụ l ụ c 1b c 26
37. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn 4 Phụ lục 1c 27
38. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn Phụ lục 1c 28
39. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn 4 Phụ lục 1d 29
40. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn Phụ lục 1d 30