›

Khóa luận Khảo sát thành phần hoá học của lá ngũ sắc (Lantana camara L.) họ roi ngựa (Verbenaceae)

pdf 118 trang thiennha21 15/04/2022 3780
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Khảo sát thành phần hoá học của lá ngũ sắc (Lantana camara L.) họ roi ngựa (Verbenaceae)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_khao_sat_thanh_phan_hoa_hoc_cua_la_ngu_sac_lantana.pdf

Nội dung text: Khóa luận Khảo sát thành phần hoá học của lá ngũ sắc (Lantana camara L.) họ roi ngựa (Verbenaceae)

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA HỌC CHUYÊN NGÀNH : HOÁ HỮU CƠ Đề tài: KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA LÁ NGŨ SẮC (Lantana camara L.) HỌ ROI NGỰA (Verbenaceae).  Người hướng dẫn Khoa học: ThS. PHÙNG VĂN TRUNG  Người thực hiện: TRẦN THỊ KIM CANG Năm học 2011-2012 
  2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA HỌC CHUYÊN NGÀNH : HOÁ HỮU CƠ Đề tài: KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA LÁ NGŨ SẮC (Lantana camara L.) HỌ ROI NGỰA (Verbenaceae).  Người hướng dẫn Khoa học: ThS. PHÙNG VĂN TRUNG  Người thực hiện: TRẦN THỊ KIM CANG Năm học 2011-2012 
  3. LỜI CẢM ƠN Đề tài này được thực hiện tại phòng Hóa Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên – Viện Công Nghệ Hóa Học – Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam tại số 1, Mạc Đỉnh Chi, phường Bến Nghé, Quận 1, thành phố Hồ Chí Minh năm học 2011- 2012. Với tấm lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới : PGS.TS. Nguyễn Ngọc Hạnh. ThS. Phùng Văn Trung. Người thầy đã truyền đạt cho em những kiến thức chuyên môn, tận tình chỉ dẫn kỹ thuật cũng như những kinh nghiệm vô cùng quý báu và đầy tâm huyết trong quá trình em thực hiện đề tài, luôn động viên và tạo mọi điều thuận lợi để em thực hiện tốt đề tài này. Qúy thầy cô ban giám hiệu trường Đại Học Sư Phạm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm khoa hóa, cùng tất cả quý thầy cô giáo đã trang bị cho em những kiến thức nền tảng vững chắc. ThS. Phan Nhật Minh, CHV Nguyễn Tấn Phát, CN Nguyễn Trung Kiên, CN Võ Thị Bé cùng các anh chị cao học viên trường Đại Học Cần Thơ, các anh chị sinh viên trường Đại Học Lạc Hồng đã giúp em tìm tài liệu, động viên, giúp đỡ, góp ý với em rất nhiều trong quá trình em thực hiện đề tài này. Cuối cùng, con xin cảm ơn gia đình đã luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ con về mặt vật chất lẫn tinh thần để con học tập, nghiên cứu và hoàn thành đề tài.
  4. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN 1 MỤC LỤC 1 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 1 DANH MỤC CÁC BẢNG 3 DANH MỤC CÁC HÌNH 4 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ 5 DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC 6 LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ CÂY NGŨ SẮC 2 1.1.1 KHÁI QUÁT [2] 2 1.1.2 MÔ TẢ CÂY [3] 2 1.1.3 PHÂN BỐ SINH THÁI[3,11] 4 1.1.4 Y HỌC DÂN GIAN CỦA NGŨ SẮC 4 1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CÂY NGŨ SẮC 5 1.2.1. TÁC DỤNG DƯỢC LÝ 5 1.2.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC 7 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT 20 2.2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ[6] 20 2.2.1. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ BẢN MỎNG 20 2.2.2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ CỘT 21 2.2. PHƯƠNG PHÁP PHỔ 21 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 24
  5. 3.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 24 3.1.1 NGUYÊN LIỆU 24 3.1.2 HÓA CHẤT 24 3.1.3 THIẾT BỊ 24 3.2. CHIẾT XUẤT CAO 25 3.3. CÔ LẬP VÀ TINH CHẾ 26 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ & THẢO LUẬN 31 4.1 KẾT QUẢ CHIẾT XUẤT CAO 31 4.2 KẾT QUẢ CÔ LẬP VÀ TINH CHẾ 31 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ 56 5.1 KẾT LUẬN 56 5.2 ĐỀ NGHỊ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 TRONG NƯỚC 57 PHỤ LỤC 60
  6. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Viết đầy đủ A Analysis. CHCl3 Chloroform. 13C NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance. COSY Correlation Spectroscopy. d Doublet. DAD Diot array detector. dd Doublet of doublet. DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer. DMSO Dimethyl sulfoxide. EtOAc Ethyl acetate. EtOH Ethanol. H2SO4 Acid Sulfuric. HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation. 1H NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance. HPLC High Performance Liquid Chromatography. HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation. IR Infrared Spectroscopy. J Coupling constant.
  7. m Multiplet. MeOH Methanol. NMR Nuclear Magnetic Resonance. PĐ Phân Đoạn. ppm Parts per million. Rf Retention factor. s Singlet. T Technical. t Triplet. TLC Thin Layer Chromatography. UV Ultra Violet.
  8. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Kết quả sắc ký cột cao áp từ cao EtOAc. Bảng 4.1: Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC và COSY của Lc01. Bảng 4.2: So sánh dữ liệu phổ 13C-NMR của Lc01 với tài liệu tham khảo. Bảng 4.3: Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR và HMBC của Lc02. Bảng 4.4: So sánh dữ liệu phổ 13C-NMR của Lc02 với tài liệu tham khảo. Bảng 4.5: Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR và HMBC của Lc03. Bảng 4.6: Dữ liệu phổ 13C-NMR và DEPT của Lc03. Bảng 4.7: So sánh dữ liệu phổ 13C-NMR của Lc03 với tài liệu tham khảo. Bảng 5.1: Tóm tắt các chất cô lập được trong ngũ cao EtOAc.
  9. DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cây ngũ sắc. Hình 1.2: Thân, lá ngũ sắc. Hình 1.3: Hoa ngũ sắc. Hình 1.4: Quả ngũ sắc. Hình 1.5: Bản đồ phân bố cây ngũ sắc trên thế giới. Hình 3.1: Sắc ký lớp mỏng. Hình 3.2: Máy cô quay chân không hiệu BUCHI Rotavapor R–200. Hình 3.3: Máy sắc ký cột điều chế (HPLC). Hình 3.4: Cột HPLC. Hình 3.5: Tinh chế Lc01. Hình 3.6: Tinh chế Lc02. Hình 3.7: Tinh chế Lc03. Hình 4.1: Chất Lc01. Hình 4.2: TLC của Lc01. Hình 4.3: Chất Lc02. Hình 4.4: TLC của Lc02. Hình 4.5: Chất Lc03. Hình 4.6: TLC của Lc03.
  10. DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.1: Quy trình chiết xuất cao EtOH và phân lập các cao từ lá ngũ sắc. Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập và tinh chế các hợp chất từ cao EtOAc. Sơ đồ 3.3: Quy trình phân lập và tinh chế phân đoạn E3.
  11. DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục 1a: Phổ 13C-NMR của Lc01. Phụ lục 1b: Phổ 13C-NMR của Lc01. Phụ lục 1c: Phổ 13C-NMR của Lc01. Phụ lục 2a: Phổ 1H-NMR của Lc01. Phụ lục 2b: Phổ 1H-NMR của Lc01. Phụ lục 2c: Phổ 1H-NMR của Lc01. Phụ lục 3a: Phổ HSQC của Lc01. Phụ lục 3b: Phổ HSQC của Lc01. Phụ lục 3c: Phổ HSQC của Lc01. Phụ lục 4a: Phổ HMBC của Lc01. Phụ lục 4b: Phổ HMBC của Lc01. Phụ lục 4c: Phổ HMBC của Lc01. Phụ lục 4d: Phổ HMBC của Lc01. Phụ lục 5a: Phổ COSY của Lc01. Phụ lục 5b: Phổ COSY của Lc01. Phụ lục 6a: Phổ 13C-NMR của Lc02. Phụ lục 6b: Phổ 13C-NMR của Lc02. Phụ lục 6c : Phổ 13C-NMR của Lc02. Phụ lục 7a: Phổ 1H-NMR của Lc02. Phụ lục 7b: Phổ 1H-NMR của Lc02. Phụ lục 7c: Phổ 1H-NMR của Lc02. Phụ lục 8a: Phổ HSQC của Lc02 Phụ lục 8b: Phổ HSQC của Lc02 Phụ lục 8c: Phổ HSQC của Lc02.
  12. Phụ lục 9a: Phổ HMBC của Lc02. Phụ lục 9b: Phổ HMBC của Lc02. Phụ lục 9c: Phổ HMBC của Lc02. Phụ lục 10a: Phổ 13C-NMR của Lc03. Phụ lục 10b: Phổ 13C-NMR của Lc03. Phụ lục 10c: Phổ 13C-NMR của Lc03. Phụ lục 11a: Phổ DEPT của Lc03. Phụ lục 11b: Phổ DEPT của Lc03. Phụ lục 12a: Phổ 1H-NMR của Lc03. Phụ lục 12b: Phổ 1H-NMR của Lc03. Phụ lục 12c: Phổ 1H-NMR của Lc03. Phụ lục 13a: Phổ HSQC của Lc03. Phụ lục 13b: Phổ HSQC của Lc03. Phụ lục 13c: Phổ HSQC của Lc03. Phụ lục 14a: Phổ HMBC của Lc03. Phụ lục 14b: Phổ HMBC của Lc03. Phụ lục 14c: Phổ HMBC của Lc03. Phụ lục 14d: Phổ HMBC của Lc03. Phụ lục 14e: Phổ HMBC của Lc03. Phụ lục 15a: Phổ COSY của Lc03. Phụ lục 15b: Phổ COSY của Lc03. Phụ lục 15c: Phổ COSY của Lc03. Phụ lục 16: Phổ MS của Lc03.
  13. LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của kinh tế và xã hội thì nhu cầu về chăm sóc sức khỏe của con người cũng ngày một tăng. Nghiên cứu về các phươnng pháp bảo vệ nâng cao sức khỏe ngày càng nhiều được các nhà khoa học quan tâm. Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học đóng một vai trò hết sức quan trọng trong đời sống con người. Các chất có hoạt tính sinh học được sử dụng làm thuốc chữa bệnh cho con người, vật nuôi, các thuốc bảo vệ thực vật, các chất kích thích, điều hoà sinh trưởng động thực vật và làm nguyên liệu cho công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm. Hiện nay, các nhà khoa học đang rất quan tâm đến các hợp chất chống ôxi hoá cũng như các hợp chất có khả năng ức chế tiểu đường, ngăn chặn và tiêu diệt ung thư cũng như hỗ trợ điều biến quá trình miễn dịch. Hiện nay khoảng từ 70%-80% các loại thuốc chữa bệnh đang được lưu hành hoặc đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng có nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên. Tuy nhiên, phần lớn các dược phẩm hiện nay đang lưu hành trong nước đều phải nhập khẩu do khả năng nghiên cứu và cung cấp dược liệu cho ngành công nghiệp hoá dược nước ta còn rất hạn chế mặc dầu tiềm năng về tài nguyên thiên nhiên của nước ta được đánh giá là phong phú vào loại bậc nhất thế giới (Theo thống kê gần đây nhất (Phạm Hoàng Hộ, 1993), Việt Nam hiện nay có 10.585 loài, thuộc 2342 chi, 337 họ, trong đó có 24 họ có từ 100 loài trở lên). Cho đến nay, mặc dù chúng ta đã có những thành công nhất định trong việc nghiên cứu tạo ra các sản phẩm thuốc chữa bệnh, nhưng mới chỉ đáp ứng được chừng vài phần trăm nhu cầu. Rõ ràng những kết quả đó chưa tương xứng với tiềm năng to lớn về tài nguyên thiên nhiên của nước ta. Cây ngũ sắc ( Lantana camara L.) thuộc họ roi ngựa (Verbenaceae) thường trồng làm cảnh do hoa có nhiều màu khác nhau, có xuất xứ từ nước ngoài, song phân bố rộng rãi toàn Việt Nam do khí hậu nước ta ở vùng nhiệt đới. Nhiều công trình nghiên cứu trong nước và nước ngoài về hoạt tính của loài cây này về loét da, kháng khuẩn, chữa lành vết thương, tiểu đường Do đó, chúng tôi chọn đề tài khảo sát thành phần hóa học cây ngũ sắc với mục đích làm sáng tỏ thêm về thành phần hóa học của loài cây này nhằm góp phần làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu ứng dụng vào sản xuất.
  14. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ CÂY NGŨ SẮC 1.1.1 KHÁI QUÁT [2] + Tên khoa học: Lantana camara L. (Verbenaceae). + Họ: roi ngựa (Verbenaceae). + Chi: Lantana. + Loài: camara. + Tên thường gọi là ngũ sắc, trâm ổi, bông ổi, ổi nho, trâm anh, mã anh đơn, nhá khí mu (Tày) + Tên tiếng Anh: Lantana wild sage, tick berry. + Tên tiếng Pháp: bois de sauge, lantanier 1.1.2 MÔ TẢ CÂY [3] Ngũ sắc là loài cây nhỏ, cây cao từ 1,5-2 mét, hay có thể hơn một chút, thường mọc thành bụi và mọc hoang dại nhiều cành ngang, có lông và gai ngắn quặp về phía dưới. Thân có gai, cành dài hình vuông có gai ngắn và lông ráp. Lá cây có mùi thơm của ổi nên còn gọi là trâm ổi, bông ổi hay thơm ổi. Lá hình bầu dục, nhọn, mặt lá xù xì, mép lá có răng cưa, mặt trên có lông ngắn cứng, mặt dưới lông mềm hơn, mọc đối, phiến lá dài 3-9 cm, rộng 3-6 cm, cuống lá ngắn. Hoa có nhiều màu sắc nên được dân gian đặt tên là hoa ngũ sắc, nhiều giống màu trắng, vàng, vàng cam, tím hay đỏ, nở suốt 4 mùa nên còn gọi là tứ quý hay tứ thời. Hoa không cuống mọc thành bông dạng hình cầu, hoa có lá bắc hình mũi giáo. Quả hạch hình cầu nằm trong lá dài, mọc thành từng chùm, non màu xanh khi chín màu đen.
  15. Hình 1.1: Cây ngũ sắc Hình 1.2: Thân, lá ngũ sắc Hình 1.3: Hoa ngũ sắc Hình 1.4: Quả ngũ sắc
  16. 1.1.3 PHÂN BỐ SINH THÁI[3,11] Ngũ sắc, tên khoa học là Lantana camara L., thuộc họ roi ngựa (Verbenaceae). Cây có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Trung, Nam Mỹ. Năm 1600 các nhà thám hiểm người Hà Lan đã đem vào Hà Lan trồng, từ Brazil đến các quốc gia khác đã mang hạt giống về trồng ở châu Âu, Vương quốc Anh và Bắc Mỹ. Sau khi được trồng ở Hawaii như một giống hoa, cây ngũ sắc nhanh chóng lan rộng ra hòn đảo của Thái Bình Dương, Úc và Nam Á. Theo cách tương tự, từ nó đã nhanh chóng được mọc ở các khu vực ấm hơn của Nam Phi do chim ăn quả và phân bố hạt. Trong thế kỷ 18 và 19 ngũ sắc nhanh được canh tác một cách thươg mại hóa trên toàn thế giới như là một cây cảnh vì màu sắc của hoa. Cũng vào thế kỷ mười chín, ngũ sắc được trồng làm cảnh ở Việt Nam. Đến nay cây đã phổ biến rộng rãi, mọc hoang ở các bãi đất trống, đồi núi, ven biển. Hình 1.5: Bản đồ phân bố cây ngũ sắc trên thế giới 1.1.4 Y HỌC DÂN GIAN CỦA NGŨ SẮC Theo kinh nghiệm dân gian, ngũ sắc có những công dụng sau: Lá ngũ sắc chữa táo bón, sốt, làm ra mồ hôi, viêm phế quản, ngày từ 20-30g cây tươi sắc uống. Dùng ngoài đấp vết thương, trị lỡ loét hoặc cầm máu, dùng lá sắc uống trị ghẻ lỡ, hoa trị ho lao, kèm ho ra máu, cao huyết áp[2], người ta còn dùng lá ngũ sắc để đắp lên vết thương trị rắn cắn, cho vào nước xông chữa cảm mạo, sốt[3]. Toàn cây có thể chữa viêm da, mẩn ngứa, chàm. Lá tươi là thuốc cầm máu, sát khuẩn, chữa lành vết thương. Hoa ngũ sắc chữa ho ra máu, cảm sốt, bệnh ôn nhiệt vào mùa hè, thu. Rễ hoa ngũ sắc kết hợp với các loại vị thuốc khác chữa rắn cắn. Cành, lá và hoa phơi khô, sắc uống thay chè hằng ngày, mỗi ngày 40g, bài thuốc này có tác
  17. dụng hổ trợ chữa bệnh tiểu đường. Tác dụng chữa bệnh của cây ngũ sắc tùy thuộc vào bộ phận dùng làm thuốc: rễ cây có vị ngọt đắng, tính lạnh, có tác dụng thanh nhiệt. Lá có tính mát, có tác dụng tiêu viêm sưng, chữa ngứa gãi, rắn cắn. Hoa có vị ngọt, nhạt, tính mát, có tác dụng cầm máu. Lá, hoa và cành hái về phơi khô để dùng làm thuốc chữa bệnh. Khi cần có thể dùng cả cành lá tươi[11]. Ở nam Trung Quốc, dịch hoa ngũ sắc được dùng để tắm chữa ghẻ. Ở Indonesia, Philippines lá và hoa ngũ sắc giã đắp các vết đứt, lở loét, sưng tấy. Loài cây này đã được sử dụng ở nhiều nơi trên thế giới để điều trị một loạt các chứng rối loạn. Ngũ sắc sử dụng trong dân gian như một biện pháp khắc phục hậu quả đối với bệnh ung thư, lá và hoa phơi khô uống như trà có thể hổ trợ chữa cúm, sốt và đau dạ dày. Ở Trung và Nam Mỹ, người ta dùng lá tươi nghiền nát đắp lên chỗ sưng để điều trị vết loét, thủy đậu và sởi. Ngoài ra, ngũ sắc còn được sử dụng để chữa sốt, lạnh, hen suyễn và cao huyết áp. Ở Ghana, theo dân gian toàn cây ngũ sắc được dùng để chữa viêm phế quản. Ở các nước châu Á, lá đã được sử dụng để điều trị vết cắt, loét và như là một loại thuốc sổ giun[11]. 1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CÂY NGŨ SẮC 1.2.1. TÁC DỤNG DƯỢC LÝ 1.2.1.1 TRONG NƯỚC Năm 2007 các tác giả Diệp Thị Mỹ Hạnh và E. Garnier Zarli đã nghiên cứu khả năng hấp thụ Pb trong đất của cây ngũ sắc. Kết quả nghiên cứu cho thấy trong điều 3 -1 kiện ô nhiễm đất đến 4x10 mg kg Pb cây Lantana có thể sống và hấp thu Pb. Hấp thụ Pb trong hệ rễ của Lantana quan trọng lúc đầu, có sự tương quan tốt giữa nồng độ chì trong đất và lượng chì hấp thụ trong cây Lantana. Nhưng sau đó, Pb được chuyển lên tích lũy trong thân và lá[1]. Năm 2009 các tác giả Nguyễn Văn Đậu, Lê Thị Huyền đã phân lặp được năm triterpenes trong lá của cây ngũ sắc ở Lâm Thao Phú Thọ. Kết quả trong năm triterpens đó có β-sitosterol, sitosterol 3-O-β-D-glucopiranozit còn ba triterpen còn lại là dẫn xuất của axit oleanolic[5]. 1.2.1.2 NGOÀI NƯỚC
  18. Năm 2008 ở tạp chí International Journal of Applied Research in Natural Products cho thấy các tác giả ở vùng Trinidad và Tobago là Nayak BS, Raju SS, Ramsubhag A đã nghiên cứu khả năng chữa lành vết thương bỏng trên chuột. Các tác giả đã cho chuột hấp thụ một lượng nhất định phần chiết ethanol của bột lá ngũ sắc khô. Kết quả là sau 19 ngày là vết bỏng trên chuột đã lành lại 87% so với khả năng tự lành thông thường là 82% qua kết quả phân tích ANOVA. Từ đó các tác giả đã kết luận lá ngũ sắc có khả năng chữa lành vết thương trên chuột[21]. Năm 2008, các tác giả người Ấn Độ là M. Sathish Kumar và S. Maneemegalai đã đánh giá khả năng diệt ấu trùng của hai loài muỗi Aedes aegypti (tác nhân gây bệnh sốt vàng da) và Culex quinquefasciatus (tác nhân gây bệnh viêm não nhật bản) từ phần chiếc ethanol, methanol của lá và hoa ngũ sắc. Ấu trùng của hai loài muỗi này mới nở sau bảy ngày được hấp thu một lượng chiết nhất định từ lá và hoa của loài cây này. Sau 24 giờ số lượng ấu trùng chết đi được ghi lại và tính toán tỷ lệ phần trăm tử vong. Từ kết quả thực nghiệm đó, hai nhà khoa học đã kết luận phần chiết xuất từ lá và hoa của ngũ sắc có khả năng diệt ấu trùng của hai loài muỗi này[19]. Năm 2009, cũng nhóm tác giả người Ấn Độ là Deepak Ganjewala, Silviya Sam, Kishwar Hayat Khan, nghiên cứu khả năng chống các loại vi khuẩn Bacillus subtillis, Escherichia coli (gây bệnh dịch tả), Staphylococcusaureus, Pseudomonas aeruginosa. Kết quả cho thấy chất từ dịch chiết lá trong ethyl acetate là hiệu quả nhất trong việc chống lại một số vi khuẩn. Chiết xuất trong acetone và chloroform không có thành phần quan trọng tác dụng ức chế chống lại các vi khuẩn trên[10]. Tháng 10 năm 2010, ở tạp International Journal of Plant Physiology and Biochemistry, các tác giả người Nigeria đã nghiên cứu và kết luận được rằng các chất trong phần chiết ethanol, ethylacetate của cây ngũ sắc có khả năng ổn định màng tế bào hồng cầu trong máu ở trâu bò[22]. Năm 2010, các tác giả ở Brazil là Erlânio O. Sousa, Aracelio V. Colares, Fabiola F. G. Rodrigues, Adriana R. Campos, Sidney G. Lima và José Galberto M. Costa đã nghiên cứu sự thay đổi thành phần hóa học trong tinh dầu của lá ngũ sắc ở vùng Đông Bắc Brazil do thời điểm thu hái lá khác nhau trong một ngày[12]. Năm 2011, ở tạp chí Journal of Pharmacy Research các tác giả người Ấn Độ đã nghiên cứu các con chuột sau khi bị gây bệnh tiểu đường bằng cách hấp thụ
  19. streptozotocin, sau 21 ngày được hấp thụ một lượng nhất định phần chiết từ quả của cây ngũ sắc, bằng phương nghiên cứu mô bệnh học ở tế bào gan chuột, phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) có thể kết luận phần chiết từ quả cây ngũ sắc có hoạt tính chống tiểu đường[26]. Năm 2011, nhóm các tác giả cũng người Ấn Độ gồm Jitendra Patel, G.S Kuma, Deviprasad S.P, Deepika S, Md Shamim Qureshi đã nghiên cứu hoạt tính chống giun từ phần chiết ethanol của lá ngũ sắc. Bằng chứng thực nghiệm thu được trong mô hình phòng thí nghiệm có thể chứng minh cho việc các bộ lạc truyền thống cũng đã dùng loài cây này để chống giun trong việc điều trị bệnh nhiễm trùng đường ruột do giun[16]. 1.2.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC Thành phần hóa học của họ Lantana rất phong phú và đa dạng, cho đến nay người ta đã cô lập được khoảng gần hai trăm chất hữu cơ từ họ Lantana. Sau đây là một số chất đã được phân lập từ cây ngũ sắc (Lantana camara .L): Sesquiterpene[6]. Có trong thành phần của tinh dầu, cấu trúc hóa học của các hợp chất tự nhiên sesquiterpene có thể là mạch hở, 1, 2, 3 hoặc 4 vòng với 80 khung sườn cacbon cơ bản chính. 2 14 14 3 1 9 1 10 2 8 4 10 9 5 5 7 12 15 3 11 4 6 8 11 12 6 7 H 15 13 13 Guaian Eudesman Một số sesquiterpene có trong tinh dầu ngũ sắc [15]: Germacrene D β – elemene 1-β-bisabolene
  20. Triterpene[6] Triterpene (C30H48) được phân bố rộng rãi trong giới động vật và thực vật, hiện diện ở dạng tự do hoặc glycoside. Cấu trúc hóa học của triterpenes có thể là mạch hở, 3, 4 hoặc 5 vòng với 33 khung sườn cacbon cơ bản chính. Một số triterpen và quy ước đánh số thứ tự: 30 29 28 27 26 25 Squalan 30 30 2 9 29 20 21 19 20 21 19 12 22 12 13 18 22 11 26 13 11 26 18 25 17 25 17 1 14 28 1 9 16 14 28 2 9 16 2 10 8 15 10 8 15 27 3 4 5 7 3 7 4 5 27 6 6 24 23 24 23 Oleanan Ursan Một số triterpene trong ngũ sắc[8, 11, 14, 21, 27] H3C CH3 O H C CH3 3 H CH3 CH3 O O CH CH3 H 3 COOH CH3 CH H 3 O CH3 CH3 CH3 COOH O H H CH3 H3C CH3 O H H3C CH3 Latandene A Latandene B
  21. H3C CH3 H3C CH3 O CH H 3 O CH H 3 CH3 O CH3 CH3 O CH3 COOH CH3 COOH H H3C H CH3 H CH3 O O H H CH H3C CH3 H3C 3 Latandene C Latandene D H3C H3C CH3 CH3 O CH3 H H CH3 O CH3 CH3 COOH CH3 CH3 COOH H CH3 H CH3 O O H H H3C H3C OH OH Icterogenin 24- Hydroxy-3- oxoolean-12-en-28-oic acid H3C CH H3C CH3 3 H H OH CH3 CH3 CH3 CH3 COOH COOH H H CH3 CH3 O O H H H C 3 H3C CH CH3 3 Oleanonic acid 22β- hydroxy-3-oxoolean-12-en-28-oic acid
  22. H3C H3C CH3 CH3 H H H H CH3 CH3 CH3 COOH COOH O H H CH3 CH3 HO HO H H H3C CH3 H3C CH3 Oleanolic acid Lantanolic acid H3C CH3 H3C CH3 O O H CH3 H CH3 CH O 3 CH CH3 O CH3 3 CH3 COOH COOH CH3 H H CH3 CH3 HO HO H H H C CH H3C CH3 3 3 22β-angeloyoxy-3β-hydroxyolean-12-en-28-oic acid 22β-dimethylacryloyoxy-3β-hydroxyolean-12-en-28-oic H3C CH3 H3C CH3 O CH3 H O CH3 H O CH3 O CH CH3 COOH 3 CH3 COOH O H H C 3 O H CH3 HO HO H H H3C CH3 H3C CH3 Camaric acid Lantanilic acid
  23. H3C CH3 H3C CH3 H O CH3 H CH3 CH3 O COOH CH3 COOH CH3 H CH3 O H CH3 H3C HO O H H CH3 H3C CH3 HO Camarilic acid 3β,24- dihydroxyolean-12-en-18-oic acid H CH3 H CH3 H3C H3C H H C 3 CH3 COO H H C 3 CH3 COO H CH3 H CH3 HO O H H H C H3C 3 H CH3 C 3 Ursolic acid Ursonic acid H CH3 H3C H CH3 H3C HO HO H H C 3 CH3 COO H H C 3 CH3 COO H CH O 3 O H CH3 H H3C CH3 HO H H3C CH3 CH3 H3C 3β,19α-dihydroxyursan-28-oic acid Lantaiursolic acid
  24. H CH3 H CH3 H3C H3C H OAc CH 3 CH3 COOH COOH O H O H CH3 CH3 HO HO H H H 3C CH3 H3C CH3 Lantic acid Camarinic acid H CH3 H CH3 H3C H3C O CH3 O CH CH3 3 COOH COOH H3C O O H H H CH3 C 3 H3CO H3CO H H H H3C CH3 3C CH3 Camaracinic acid Ursoxy acid H H CH3 CH3 CH COOH 3 COOH O H H CH3 CH3 O HO H H H3C H3C CH3 CH3 Betulonic acid Lantabetulic acid
  25. H3C H3C O CH3 O CH3 O CH3 H3C H H O H O CH 3 O H CH3 H H CH3 H CH3 O H AcO CH 3 H HOOC O CH3 Euphane lactone A Euphane lactone B H3C O CH3 OH O H CH3 O CH3 H OH H OH O c HO A O H HO OOC OH CH3 Euphane lactone C Flavonoid[6] Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa Phần lớn các flavonoids có màu vàng (do từ flavus là màu vàng); tuy vậy, một số sắc tố có màu xanh, tím, đỏ không màu cũng được xếp vào nhóm này vì về mặt hóa học, chúng có cùng khung sườn căn bản. Flavonoid có cấu trúc cơ bản là 1, 3-diphenylpropan, nghĩa là 2 vòng benzene A và B nối nhau bằng một dây có 3 cacbon, nên thường được gọi là C6-C3-C6. Cách đánh số tùy theo C3 đóng hay hở. Nếu dây C3 đóng, thì đánh số bắt đầu từ dị vòng với
  26. dị tố oxi mang số 1 rồi đánh tiếp theo đến vòng A, còn vòng B đánh số phụ. Nêú dây C3 hở, đánh số chính trên vòng B và đánh số phụ trên vòng A. 3' 3 2' 4' 2 4 1 B B 8 5' 1 O 2 OH 5 7 1' 5' 4' 6' A 6' A 6 6 3' 3 1' 5 4 2' O O Thường các flavonoid có mang một hoặc nhiều nhóm –OH ở vị trí 5 và vị trí 7 trên nhân A và ở vị trí 3, 4, 5 trên nhân B. Các flavonoids có thể ở dạng ự do hoặc ở dạng glycoside. Các đường thường gặp nhất là đường D-glucose, D-galactose, L-rhamnose, L-arabinose, D-xylose, D-apiose và acid uronic. Các flavonoid thường dễ kết tinh và thường có màu. Flavon thường có màu vàng nhạt hoặc màu cam, flavonol màu vàng đến vàng nhạt, chalcon có màu vàng đến cam đỏ. Một số flavonoid trong cây ngũ sắc[11, 18, 20, 24, 25, 27] OH OH H CO O HO O 3 OH OH OCH OCH3 3 OH O OH O 3-methoxyquercetin 3,7-dimethoxyquercetin
  27. OH OCH3 H3CO O HO O OH OCH3 H3CO OCH3 OH O OH O 3,7,4’-trimethoxyquercetin Hispidulin OH OCH3 O HO HO O O OH H3CO OH O Pectolinargenin 7-O-β-D-glucoside OH OCH3 O HO HO O O OH H3CO OH OH O Camaraside Hợp chất thuộc loại quinone[6] Trong các loài thực vật, có thể gặp các loại quinone như benzoquinone, naptiquinon, antraquinone Các naptoquinone, antraquinone thường gặp trong gỗ, vỏ cây, rễ chúng hiện diện ở trạng thái tự do hoặc kết hợp với đường. Các quinone có tính kích thích nên một số quinone được sử dụng trong ngành y để trị nhuận trường, một vài khung hợp chất quinone:
  28. O O CH2CH3 OCH3 O OH O Eloides lon icollis Plumba in g g OH O OH O CH2OH O O O Aloe ferox Tectona randis g Trong rễ cây ngũ sắc có furanonaphthoquinones sau [11]: O OH O O O OH O O Diodantunezone Isodiodantunezone O O MeO O O MeO OH O OH O 6-methoxydiodantunezone 7-methoxydiodantunezone
  29. OH O OH O MeO O O MeO O O 6-methoxyisodiodantunezone 7-methoxyisodiodantunezone Hợp chất glycoside [6] Các glycoside hiện diện trong nhiều họ thực vật và tất cả các bộ phận: lá, vỏ, hạt Các glycoside thường là những chất kết tinh có vị đắng. Glycoside là hợp chất mà cấu trúc hóa học gồm hai phần: phần đường và phần không đường thường gọi là aglycon. Dưới tác dụng của ezym thực vật, dung dịch acid, kiềm, glycoside bị phân hủy thành aglycon và phần đường. Phần đường của glycoside thường phổ biến là D-glucose, D-galactose, L- rhamnose, L-arabinose, D-xylose, D-apiose, acid glucuronic và một số đường khác Phần aglycon của glycoside rất rất đa dạng, gồm tất cả các loại hợp chất tự nhiên: monoterpene, sesquiterpene, diterpene, triterpene, steroid, iridoid, alcaloid, quinonoid, polyphenol Trong cây ngũ sắc có hợp chất glycoside là iridoid glycosides, phenyl ethanoid glycosides Iridoid glycoside [11,16] COOCH3 COOCH3 H HO O O HOH C HOH2C H 2 H HOH2C HOH2C O O HO HO O O HO HO OH OH Theviridoside Genposide
  30. COOCH3 COOCH3 HO HO HO O O HO HO HOH2C O HOH2C O HO HO O O HO HO OH OH Shanzhside methyl ester Lamiridoside Phenyl ethanoid glycoside [11,16] O OH HO O O O OH O HO OH H C 3 O OH HO HO OH Verbascoside OH OH OH O O OH O O O OH OH H3C O HO HO OH Lantanaside O OH H3CO O O O OCH3 O HO OH H C 3 O OH HO HO OH Martynoside
  31. O HO O HO O HO O OH O OH H C 3 O OH HO HO OH Isoverbascoside O OH HO O O O OH HO HO OH OH Derhamnosylverbascoside HO O HO O O HO OH O O O OH OH HO HO OH Isonuomioside A
  32. CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT Phương pháp chiết siêu âm là phương pháp chiết ngâm dầm (maceration) cổ điển kết hợp với siêu âm được sử dụng trong đề tài. Phương pháp này không đòi hỏi kỹ thuật phức tạp, vì thế có thể dễ dàng thực hiện thao tác với một lượng lớn mẫu cây. Ngâm bột cây (hoặc nguyên liệu được cắt nhỏ) trong bình chứa bằng thủy tinh hoặc bình thép không rỉ, bình có nắp đậy. Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp mặt của lớp nguyên liệu. Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc màng tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên. Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc, thu hồi dung môi sẽ có được cao chiết. Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chứa nguyên liệu và tiếp tục chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây. Trong quá trình chiết có thể trộn, đảo nguyên liệu để chúng thấm đều với dung môi, tăng hiệu quả khi chiết. 2.2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ[6] Sắc ký là phương pháp vật lý để tách một hỗn hợp gốm nhiều hợp chất ra riêng thành đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đó đối với hệ thống (hệ thống gồm hai pha: pha động và pha tĩnh). 2.2.1. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ BẢN MỎNG Sắc ký bản mỏng (TLC – thin layer chromatography) hay còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), chủ yếu dựa vào hiện tượng hấp thu, trong đó pha động là một dung môi hay một hỗn hợp dung môi đi ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ (silicagel, Al2O3). Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đều phủ lên một nền phẳng như một tấm kiếng, tấm nhôm. Bình sắc ký: bằng thủy tinh, trong suốt, có nắp đậy. Pha tĩnh: một lớp mỏng khoảng 0,25 mm của một loại chất hấp thu (silicagel, Al2O3) được tráng thành một lớp mỏng, đều phủ lên một nền phẳng như một tấm kiếng, tấm nhôm. Chất hấp thu trên tấm giá đỡ nhờ CaSO4 khan hoặc tinh bột, polyme hữu cơ.
  33. Mẫu phân tích: thường là hỗn hợp với nhiều hợp chất có độ phân cực khác nhau, sử dụng khoảng 1μL dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2-5%, dùng một vi quản chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phía cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng chứa trong bình. Pha động: dung môi hoặc hỗn hợp hai dung môi, di chuyển chầm chậm trên tấm bản mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Dung môi di chuyển đi lên cao nhờ tính mao quản. Mỗi thành phần của chất mẫu sẽ di chuyển với những vận tốc khác nhau, phía sau mực của dung môi. Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh (hiện tượng hấp thu của pha tĩnh) và tùy thuộc vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi. Với chất hấp thu là silicagel hoặc alumin, các hợp chất kém phân cực sẽ di chuyển nhanh và hợp chất rất phân cực sẽ di chuyển chậm. 2.2.2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ CỘT Sắc ký cột dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu. Pha động là chất lỏng, pha tĩnh là các hạt silicagel. Ở phương pháp sắc ký này, các chất của hỗn hợp sẽ hấp thu hoặc dính lên bề mặt của pha tĩnh. Các hợp chất khác nhau sẽ có những mức độ hấp thu khác nhau lên pha tĩnh và chúng cũng phụ thuộc vào tính chất của pha động. Kết quả là trong quá trình pha động di chuyển chúng sẽ tách nhau ra. Trong sắc ký cột hấp thu pha rắn thường là những hạt silica gel. Trên bề mặt những hạt này có mang nhiều nhóm -OH nên đây là những pha tĩnh có tính rất phân cực. Sự hấp thu xảy ra là do sự tương tác lẫn nhau giữa các phân tử phân cực, do sự tương tác giữa những phân tử có mang những nhóm phân cực đối với pha rắn là chất rất phân cực. 2.2. PHƯƠNG PHÁP PHỔ Sử dụng các phương pháp phổ để có thể xác định được cấu trúc của các chất hữu cơ. PHỔ 1H-NMR[7]
  34. Cho thông tin về các proton 1 H có trong phân tử. Các thông số của phổ 1 H NMR cho biết độ dịch chuyển hóa học, hình dạng tín hiệu và hằng số tương tác (J) spin-spin giữa các proton không tương đương nhau sẽ cho các kiểu ghép vân phổ khác nhau, tích phân cường độ của tín hiệu thể hiện số lượng proton tương ứng với tín hiệu đó. PHỔ 13 C-NMR Cho thông tin về độ dịch chuyển hóa học của carbon trong phân tử. Các tín hiệu phổ 13 C-NMR xuất hiện trong khoảng thang chia độ rộng (0-240 ppm) nên các tín hiệu tách rõ ràng, mũi đơn dễ quan sát. Mỗi loại carbon trong hợp chất hữu cơ có độ dịch chuyển hóa học khác nhau. Dựa vào độ dịch chuyển hóa học của carbon trong phổ 13 C-NMR , có thể dự đoán được loại carbon và liên kết của carbon đó[7]. Phổ 13 C-NMR DETP cũng là một dạng phổ 13 C-NMR, theo kỹ thuật đo này người ta thực hiện ba lần ghi phổ khác nhau, lần đầu (DEPT-45) sẽ thu được phổ với đầy đủ tín hiệu của các carbon. Trong lần đo thứ hai thực hiện ngay sau đó, (DEPT- 135), những carbon metin (-CH<), và methyl (-CH3) cho tín hiệu xuất hiện ở phía trên (cường độ dương) còn tín hiệu của carbon metylen (-CH2-) cho tín hiệu ở phía dưới (cường độ âm). Ở lần đo thứ ba (DEPT-90), chỉ có những carbon metin (-CH<) mới cho tín hiệu phổ[4]. PHỔ COSY 1H -1H[4] Phổ Cosy 1H -1H, là phổ tương quan proton- proton, dùng thay thế kỹ thuật khử ghép proton trong phổ một chiều, cho biệt proton nào trong phân tử đã tương tác spin- spin với nhau. PHỔ HSQC VÀ HMBC[4] Khảo sát hạt nhân 1H ghép cặp với 13 C Phổ HSQC là phổ hai chiều cho thấy sự tương tác giữa tín hiệu carbon và tín hiệu proton gắn trực tiếp với nó. Phổ HMBC cho thấy sự tương tác của các tín hiệu carbon với tín hiệu proton ở cách nhau hai hoặc ba liên kết PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)[4]
  35. Phổ khối lượng hay còn gọi là phổ khối là một phương pháp phân tích mà trong đó hợp chất nghiên cứu trước tiên được hóa hơi trong điều kiện chân không cao, sau đó được ion hóa và phá thành các mảnh nhờ những va đập điện tử. Cấu tạo của hợp chất nghiên cứu được xác định thông qua việc nghiên cứu khối lượng và điện tích các mảnh cùng với xác suất xuất hiện của mảnh đó.
  36. CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 3.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 3.1.1 NGUYÊN LIỆU Nguyên liệu sử dụng cho đề tài này là phần lá của cây ngũ sắc (Lantana camara L. Verbenaceae). Nguyên liệu này được thu hái ở Cần Thơ. Mẫu nguyên liệu lá ngũ sắc được phơi khô vào tháng 9 năm 2011. 3.1.2 HÓA CHẤT + Silica gel 60, MERCK, đường kính hạt 0,06–0,2 mm. + Thuốc thử định tính H2SO4 10%/EtOH ( Pha 50ml H2SO4 đậm đặc trong 500 ml EtOH 95 %). + Ethanol 960 (T, Trung Quốc). + n-Hexan (T, Trung Quốc). + Chloroform (T, Trung Quốc). + Ethylacetate (T, Trung Quốc). + Methanol (A, Trung Quốc). 3.1.3 THIẾT BỊ + Máy siêu âm Elma S 100 H Elmasonic. + Bản mỏng silica gel Merck–GF60F254 tráng sẵn, kích thước 20 × 20 cm, độ dày lớp hấp phụ 0,2 mm của hãng Merck, Germany. + Máy soi UV: MINERALIGHT ® LAMP, U.S.A. + Bình phun xịt thuốc thử. ® + Bếp điện dùng nướng bản mỏng Blacker . + Cột cao áp các loại. + Máy HPLC cột Natpro_C18 crude sep 141110. + Cân điện tử hiệu TANITA KD–200 và PRECISA XB 220ª. + Máy cô quay chân không hiệu BUCHI Rotavapor R–200.
  37. + Tủ sấy. Hình 3.1: Sắc kí lớp mỏng. Hình 3.2: Máy cô quay chân không hiệu BUCHI Rotavapor R–200. Hình 3.3: Máy sắc ký cột điều chế Hình 3.4: Cột HPLC (HPLC) 3.2. CHIẾT XUẤT CAO Lá ngũ sắc khô (1kg) được ngâm dầm với ethanol 960 (10lít). Lọc tách bã, cô quay đuổi dung môi ở áp suất thấp thu được 160g cao ethanol. Đem cao ethanol lắc lần lượt với các đơn dung môi từ không phân cực đến phân cực: n-hexan, ethyl acetate. Sau khi lắc với n-hexan, lọc lấy dịch chiết, cô quay loại dung môi thu được cao n- hexan 28g, phần không tan tiếp tục lắc với ethyl acetate, làm tương tự như trên ta thu được 11g cao ethyl acetate, phần không tan còn lại là cao methanol 121g.
  38. Sơ đồ 3.1: Quy trình chiết xuất cao EtOH và phân lập các cao từ lá ngũ sắc Lá ngũ sắc khô (1kg) -EtOH 96o (10 lít) . -Lọc. -Cô quay đuổi dung môi. Bã Cao EtOH (160g) -n-hexan (5 lít). -Cô quay đuổi dung môi. Phần không tan Cao n-hexan (28g) -EtOAc (5 lít). -cô quay đuổi dung môi. Phần không tan Cao EtOAc (121g) (11g) 3.3. CÔ LẬP VÀ TINH CHẾ 3.3.1 CÔ LẬP Sau khi tiến hành TLC các mẫu cao, chúng tôi nhận thấy cao EtOAc cho nhiều vết rõ ràng trên bản mỏng. Do đó, chúng tôi lựa chọn cao EtOAC để cô lập các hợp chất. Tiến hành cô lập bằng phương pháp sắc ký cột hấp thu với máy sắc ký cột HPLC. + silica gel 0.06 -0.2 mm. + dcột = 40 X 300 mm. Dùng bơm để bơm dung môi n-hexan ổn định cột. Sau khi ổn định cột, nạp mẫu cao EtOAc (12g) dạng khô vào cột. Tăng dần độ phân cực của dung môi giải ly.
  39. Lấy thể tích mỗi phân đoạn 250ml. Theo dõi cột bằng sắc ký lớp mỏng, hện vết bằng cách phun dung dịch axit H2SO4 10% trong EtOH và hơ nóng trên bếp điện. Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập và tinh chế các hợp chất từ cao EtOAc CAO EtOAc 10 g - Cho 2g Silica gel vào bình cầu, trộn đều đến khô. Sau đó nạp vào cartridge 12g. - Chuẩn bị cột: Nén đầy Silica gel vào cột dcột = Hệ dung môi 4cm, Hcột= 300 cm. - Ổn định cột bằng n - Hexan trong 15 phút ở tốc + HE : n-Hexan_EtOAc độ 20 ml/phút. + EM : EtOAc _MeOH - Gắn cartridge chứa mẫu vào đầu cột và tiến hành sắc ký để cho ra 8 phân đoạn chính. HE HE HE HE HE EtOAc EM EM 90 : 10 80 : 20 70 : 30 50 : 50 25:75 100% 85:15 70:30 PĐ E1 PĐ E2 PĐ E3 PĐ E4 PĐ E5 PĐ E6 PĐ E7 PĐ E8 44.5mg 458mg 2.36g 1.73g 2.04g 415.4mg 1.56g 810mg Kết tinh Kết tinh Lc01 Lc02 5mg 4mg
  40. Bảng 3.1: Kết quả sắc ký cột cao áp từ cao EtOAc Phân đoạn Hệ dung môi Kết quả TLC 1 n-Hexan-Ethylacetate 90:10 Nhiều vết 2 n-Hexan-Ethylacetate 80:20 Nhiều vết, có ba vết chính 3 n-Hexan-Ethylacetate 70:30 Nhiều vết có hai vết chính màu tím 4 n-Hexan-Ethylacetate 50:50 Nhiều vết 5 n-Hexan-Ethylacetate 25:75 Nhiếu vết 6 Ethylacetate 100 Nhiều vết 7 Ethylacetate:methanol 85:15 Có 1 vết chính màu vàng 8 Ethylacetate: methanol70:30 Nhiều vết kéo vệt 3.3.2 TINH CHẾ 3.3.2.1 TINH CHẾ CHẤT Lc01 Tại phân đoạn E2, quan sát thấy có kết tinh dạng hình kim, chúng tôi thực hiện loại bỏ chất màu bằng EtOAc, kết tinh lại nhiều lần, chúng tôi nhận thấy phần kết tinh sạch, có dạng hình kim màu trắng, thực hiện chấm bản mỏng với hệ CHCl3-MeOH (9:1) thì có một vết màu tím với Rf= 0.53. Sau nhiều lần kết tinh và gom lại chúng tôi thu được 6 mg chất tinh thể hình kim màu trắng. Kí hiệu là: Lc01. (a) Trước (b) Sau Hình 3.5 Tinh chế Lc01
  41. 3.3.2.2 TINH CHẾ CHẤT Lc02 Tại phân đoạn E7, quan sát thấy có xuất hiện dạng bột vô định hình và chúng tôi thực hiện loại bỏ chất màu bằng MeOH, kết tinh lại nhiều lần, chúng tôi nhận thấy phần bột dạng vô định hình màu vàng nhạt, thực hiện chấm bản mỏng với hệ CHCl3- MeOH ( 9:1) thì có một vết màu vàng với Rf= 0.25. Sau nhiều lần kết tinh và gom lại chúng tôi thu được 4 mg sạch màu vàng nhạt. Kí hiệu là: Lc02. (a) Trước (b) Sau Hình 3.6: Tinh chế Lc02 3.3.2.3 TINH CHẾ CHẤT Lc03 Tại phân đoạn E3, chúng tôi quan sát thấy có kết tinh của tinh thể hình kim rất giống chất Lc01, chúng tôi trích một ít hòa với MeOH, chấm lên bản mỏng, so với Lc01, giải ly ba lần với hệ CHCl3-MeOH (95:5), thấy vết màu bẩn ở trên, và hai vết màu tím sát cạnh nhau, vết dưới có Rf trùng với Lc01, còn vết trên đậm hơn có Rf = 0.58. Chúng tôi tiến hành sắc ký điểu chế (HPLC) với hệ MeOH - H2O (94:6). + Cột Phenomenex : 10×250 mm. + Hạt : 5 µm. + Tốc độ dòng: 4 ml/phút. + Dung môi sử dụng: metanol, nước. + Đầu dò: DAD. + Bước sóng: 254 nm. + Isocratic.
  42. Sơ đồ 3.3: Quy trình phân lập và tinh chế phân đoạn E3 PĐ 3 HPLC PĐ E3a PĐ E3b Lc03 7mg Trong phân đoạn E3 này, chúng tôi thu được hai phân đoạn E3a và E3b, trong đó phân đoạn E3b có dạng tinh thể hình kim, nhanh chống kết tinh và tách ra khỏi phần dung dịch chưa bay hơi. Nhận thấy hiện tượng này, chúng tôi đã tách riêng phần dung dịch và phần kết tinh. Kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng: + Phần dung dịch vẫn cho hai vết màu tím sát gần nhau, giải ly ba lần hệ CHCl3 – CH3OH (95:5). + Phần tinh thể cho một vết màu tím Rf = 0.58, hệ CHCl3 – CH3OH (9:1). Sau nhiều lần tiến hành như trên chúng tôi đã thu được 7mg kết tinh hình kim, hiện màu một vết sạch màu tím. Phần kết tinh  Phần dung dịch  (a)Trước (b) Sau Hình 3.7: Tinh chế Lc03
  43. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ & THẢO LUẬN 4.1 KẾT QUẢ CHIẾT XUẤT CAO Từ 1kg nguyên liệu khô thu được 160g cao ethanol thô (24% ẩm độ). Đem cao EtOH thô lắc lần lượt với các dung môi: n-hexan, EtOAc thu được: • Cao n-hexan 28g (8.3% ẩm độ). • Cao EtOAc 11g (10% ẩm độ). • Cao MeOH 121g (23.5 % ẩm độ). 4.2 KẾT QUẢ CÔ LẬP VÀ TINH CHẾ Từ 10g cao EtOAc tiến hành sắc ký cột tách ra thành 8 phân đoạn. • Tinh chế phân đoạn 2 thu được chất Lc01. • Tinh chế phân đoạn 7 thu được chất Lc02. Từ phân đoạn 3 tiến hành sắc ký cột điều chế pha đảo (HPLC). Tinh chế phân đoạn thu được chất Lc03. 4.2.1 NHẬN DANH CẤU TRÚC CHẤT Lc01 Những đặc tính của Lc01 + Là tinh thể hình kim màu trắng, kết tinh trong MeOH. + Tan tốt trong CHCl3, ít tan trong EtOAc và MeOH. + Sắc ký lớp mỏng (TLC) hiện màu bằng dung dịch axit H2SO4 10% trong EtOH: Giải ly bằng hệ CHCl3 – MeOH (9:1) cho vết tròn màu tím có Rf = 0.52. Giải ly bằng hệ CHCl3 – MeOH (95 :5) cho vết tròn màu tím có Rf = 0.15.
  44. Hình 4.1 Chất Lc01 Hình 4.2 TLC của Lc01 Hệ CHCl3-MeOH ( 9:1) Xác định cấu trúc Lc01 Phổ 13C NMR (bảng 4.1), (Phụ lục 1a, 1b, 1c) cho thấy sự xuất hiện 30 tín hiệu carbon: + Có chín carbon bậc bốn, gồm có một carbon carbonyl đặc trưng của acid (>C=O) 181.28 ppm, một carbon sp2 143.75 ppm, một carbon acetal (O-C-O) 98.61 ppm, các carbon bậc bốn khác có độ chuyển dịch lần lượt là [46.84, 40.47, 38.59, 35.36, 42, 31.24] ppm. + Có bốn carbon bậc ba (>CH-), gồm một carbon sp2 122.72 ppm chứng tỏ trong khung triterpene này có nối đôi, các carbon bậc ba có độ chuyển dịch lần lượt là 41.94, 50.64, 42.20 ppm. + Sáu carbon của các nhóm methyl (-CH3) [ 33.21, 27.44, 23.92, 23.67, 18.43, 17.73] ppm. + Còn lại mười một carbon methylen (-CH2-), trong đó có một carbon nối với oxi có độ chuyển dịch cao 67.91 ppm, các nhóm carbon khác có độ chuyển dịch [45.94, 34.89, 34.09, 32.48, 30.84, 29.64, 28.07, 25.53, 23.38, 19.96] ppm. Phổ 1H NMR (bảng 3.1) với một số tín hiệu đặc trưng (phụ lục 2b) + Ở vùng trường thấp có một proton 5.31 (t, J = 3.3 Hz, 1H ), proton này gắn 2 trên carbon sp có độ chuyển dịch cao nhất so với các proton khác, bên cạnh đó xuất hiện proton 2.83 (dd, J = 13.5, 4.0 Hz, 1H) trên carbon bậc ba (>CH-) là proton đặc
  45. trưng cho H-18 của khung olean, hai proton 4.22 (dd, J = 8.8, 2.7 Hz, 1Ha); 3.89 (dd, J = 8.8, 1.6 Hz, 1Hb) là proton trên carbon methylen kề oxi. + Kế tiếp là sự xuất hiện của các proton 2.12 (m), 1.98 (m), 2.14 (m) và vùng chồng chập của các nhóm methylen (-CH2-) rất khó xác định. + Ở vùng trường cao có xuất hiện các proton của sáu nhóm methyl (-CH3) lần lượt 0.89 (s, 3H), 1.03 (s, 3H), 1.13 (s, 3H), 0.92 (s, 3H), 0.97 (s, 3H), 0.74 (s, 3H). Từ phổ HSQC (phụ lục 3a) có thể thấy các tín hiệu tương tác đặc trưng giữa carbon 122.72 ppm và proton 5.31 (t, J = 3.3 Hz, 1H ), giữa carbon 41.94 ppm và proton 2.83 (dd, J = 13.5, 4.0 Hz, 1H), giữa hai proton 4.22 (dd, J = 8.8, 2.7 Hz, 1Ha); 3.89 (dd, J = 8.8, 1.6 Hz, 1Hb) và carbon 67.91 ppm. Qua các tín hiệu đặc trưng trên phổ 13 C NMR, carbon carbonyl (>C=O) 181.28 2 1 ppm (C-28), carbon sp 143.75 ppm (C-13), 122.72 ppm (C-12) và phổ H NMR có proton 5.31 (t, J = 3.3 Hz, 1H) (H-12), proton 2.83 (dd, J = 13.5, 4.0 Hz, 1H) (H-18), proton của sáu nhóm methyl (-CH3) đều chẻ mũi đơn lần lượt 0.89 (s, 3H), 1.03 (s, 3H), 1.13 (s, 3H), 0.92 (s, 3H), 0.97 (s, 3H), 0.74 (s, 3H) ppm. Có thể khẳng định Lc01 là một triterpene thuộc khung olean mà cụ thể là dẫn xuất của acid oleanolic. Ngoài ra trên phổ HMBC (phụ lục 4a), (bảng 4.1) ta thấy carbon acetal (O-C-O) 98.61 ppm có tín hiệu tương tác với các proton của hai nhóm methyl (-CH3)có độ dịch chuyển hóa học lần lượt là 1.03 (s, 3H), 0.97 (s, 3H) ppm, có thể tạm kết luận carbon acetal này là C-3 trong khung olean; đồng thời carbon acetal này cũng tương tác với hai proton trên carbon methylen có 4.22 (dd, J = 8.8, 2.7 Hz, 1H), 3.89 (dd, J = 8.8, 1.6 Hz, 1H). Từ đó ta có thể khẳng định được carbon acetal (C-3) có cầu nối oxi với carbon methylen 67.91 ppm, carbon methylen này vẫn còn hai proton nên có thể kết luận carbon là C-25 trong khung triterpene olean. Các tương tác đặc trưng trên phổ HMBC của Lc01.
  46. 12 18 25 COOH O 3 HO Bảng 4.1: Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC và COSY của Lc01 (Phụ lục 1a, 1b, 1c, 2a, 2b, 2c, 4a, 4b, 4c, 4d, 5a, 5b) 13C- Vị trí 1H-NMR δppm Loại HMBC COSY NMR C/H (số H; dạng mũi; J = Hz) carbon 1H → 13C 1H → 1H δppm H1b → 2.12(m, 1Ha) H → C 1a 3,5,10 H 1 34.89 –CH2– 25a 1.20 (m, 1Hb) H → C 1b 4,10 2 1.15 (m, 1H), 1.64 (m, 1H) 28.07 –CH2– 3 98.61 HO-C–O 4 40.47 >C C< H → H9→ H12 9 1.68 (m, 1H) 42.20 –CH< 9 C8,10,11,14
  47. 10 35.36 >C C= 14 42.00 >C CH C< 1.19(m, 1H) → H21a C17,16 21 34.09 –CH2– 1.31 (m, 1H) H21b→C20,19 1.56(1H, m) H22a→C17 22 32.48 –CH2– 1.74(1H,m) H22b→C30 23 1.03 (s, 3H) 27.44 –CH3 H23→C3,4,5 24 0.97 (s, 3H) 18.43 –CH3 H24→C2,3,4,5 4.22 (dd, J = 8.8, 2.7 Hz, H →C 25 1Ha) 67.91 –CH –O 25a 10 H → H 3.89 (dd, J = 8.8, 1.6 Hz, 2 25a 2 H25b→C3,5,10 1Hb) 26 0.74 (s, 3H) 17.73 –CH3 H26→C7,9,14 27 1.13 (s, 3H) 23.92 –CH3 H27→C8,13,14,15
  48. 28 181.28 –COOH 29 0.89(s, 3H) 33.21 –CH3 H29→C19,21,22 30 0.92(s,3H) 23.67 –CH3 H30→C19,21,22 Bảng 4.2: So sánh dữ liệu phổ 13C-NMR của Lc01 với tài liệu tham khảo [9,17] 13 Vị trí C-NMR (ppm) C Lc01 Lantanilic acid Lantanolal 1 34.89 34.53 34.9 2 28.07 29.24 29.5 3 98.61 98.87 98.0 4 40.47 40.25 34.9 5 50.64 50.16 50.4 6 19.96 19.72 19.5 7 30.84 30.95 31.2 8 38.59 38.26 38.5 9 42.2 41.95 41.8 10 35.36 35.04 40.1 11 23.38 23.73 23.7 12 122.72 122.48 123.2 13 143.75 143.02 142.7 14 42.00 41.95 41.8 15 29.64 27.74 26.7 16 25.53 24.11 22.1
  49. 17 46.84 50.70 49.2 18 41.94 39.15 40.9 19 45.94 45.78 45.3 20 31.24 30.07 30.6 21 34.09 37.68 27.6 22 32.48 75.30 33.1 23 27.44 27.43 27.2 24 18.43 18.27 18.2 25 67.91 67.68 67.7 26 17.73 17.44 17.5 27 23.92 25.30 24.9 28 181.28 177.98 207.1 29 33.21 33.74 33.0 30 23.67 27.20 23.3 1’ - 166.34 - 2’ - 115.94 - 3’ - 157.10 - 4’ - 20.22 - 5’ - 26.23 -
  50. 30 29 4' 19 20 21 O CH3 12 22 C 2' C 26 13 18 11 O 1' 3' H 17 C C 3 25 28 5' 1 14 COOH 9 16 H 2 O 10 8 15 7 3 4 5 27 HO 6 24 23 Lantanilic acid So sánh phổ 13C-NMR, Lc01 với Lantanilic acid ta thấy sự khác biệt lớn nhất ở C-22, C-22 của Lc01 32.48 ppm, C-22 của Lantanilic acid 75.30 ppm, còn lại ở các proton khác thì có sự chênh lệch không đáng kể. 30 29 19 20 21 12 22 13 11 18 26 25 17 28 1 14 CHO 9 16 2 O 10 8 15 7 3 4 5 27 HO 6 24 23 Lantanolal 13 So sánh phổ C-NMR, Lc01 với Lantanolal ta thấy sự khác biệt lớn nhất ở C-28, C-28 của Lc01 181.28 ppm, C-22 của Lantanolal acid có 207.1 ppm, còn lại ở các proton khác thì có sự chênh lệch không đáng kể. Từ các tín hiệu đặc trưng trên, kết hợp so sánh với tài lệu tham khảo cho ta thấy chất Lc01 có các tín hiệu trùng khớp với triterpen khung oleanan mà cụ thể là acid oleanolic, có cầu nối oxi từ C-3 qua C-25, cho ta khẳng định rằng chất Lc01 có công thức cấu tạo là:
  51. 30 29 19 20 21 12 22 13 11 26 18 17 25 1 14 COOH 9 16 28 2 O 10 8 15 7 3 4 5 27 HO 6 24 23 3,25-epoxy-3β-hydroxyolean-12-en-28-oic acid hay Lantanolic acid 4.2.2 NHẬN DANH CẤU TRÚC CHẤT Lc02 Những đặc tính của Lc02 + Là dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, tan tốt trong EtOAc, hỗn hợp MeOH và CHCl3, ít tan trong MeOH. + Sắc ký lớp mỏng (TLC) hiện màu bằng dung dịch axit H2SO4 10% trong EtOH: Giải ly bằng hệ CHCl3 – MeOH (9:1) cho vết tròn màu vàng có Rf = 0.25. Giải ly bằng hệ CHCl3 – MeOH (85 :15) cho vết tròn màu vàng có Rf = 0.41. Hình 4.3 Chất Lc02 Hình 4.4 TLC của Lc02 Hệ CHCl3-MeOH ( 9:1)
  52. Xác định cấu trúc Lc02 Phổ 13 C NMR (phụ lục 6a, 6b, 6c) cho thấy sự xuất hiện 21 tín hiệu của cacbon: + Chín carbon bậc bốn, trong đó có một carbon 182.29 ppm (C-4) là carbon carbonyl, bốn carbon 162.44, 156.48, 152.39, 132.59 là carbon sp2 nối với oxy, bốn carbon [163.84, 152.11, 122.74, 105.76] ppm. + Bốn carbon bậc ba [128.34, 114.60, 103.34, 94.44] ppm là carbon của vòng thơm. + Sáu carbon [100.24, 77.25, 76.70, 73.17, 69.61, 60.63] ppm là carbon của phân tử đường. + Hai cacbon 60.24, 55.55 ppm là carbon của nhóm methoxy (O-CH3). Từ dữ liệu phổ13C-NMR (Phụ lục 6a, 6b, 6c), tính chất vật lý cho phép dự đoán Lc02 là một flavonoid glycoside, có hai nhóm thế methoxy (-O-CH3). Phổ 1H NMR với các tính hiệu đặc trưng (phụ lục 7a, 7b, 7c): + Một mũi đơn có độ chuyển dịch rất cao 12.90 (s, 1H) là proton kiềm nối chứng tỏ có nhóm -OH trên C-5 trên vòng A của flavonoid. + Vòng A có tín hiệu của hai mũi đơn của hai proton nhân thơm tại 7.04 (s, 1H), 6.94 (s, 1H) chứng tỏ hai proton này được gắn trên hai carbon còn lại của vòng thơm, còn ở các vị trí khác các carbon đều được thế. + Vòng B có các mũi của bốn proton nhân thơm tại 8.05 (dt, J=9 và J=3), (H- 2′, H-6′) ; 7.14 (dt, J=9 và J=3), (H-3′, H-5′) cho thấy đây là bốn proton có tương tác ortho đối xứng trên nhân thơm. Do đó, vòng B là vòng thơm có hai nhóm thế ở vị trí 1' và 4'. + Một proton anomer của đường 5.11 (d, J =7 Hz, 1H) (H-1’’), các proton còn lại của đường 3.37 (m,1H), 3.34 (m, 1H), 3.20 (ddd, J = 19.4; 8.0, 4.0 Hz,1H), 3.54 (m, 1H), hai proton trên C-6’’ của đường: 3.55 (m, 1Ha), 3.73 (m, 1Hb), cùng với các proton của nhóm -OH là 5.41 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 5.13 (s, 1H), 5.12 (m, J = 2.2 Hz, 1H), 5.07 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 4.61 (m, J = 5.6 Hz, 1H). + Sáu proton methoxy (-OCH3) với cường độ mạnh 3.87 (s, 3H), 3.77 (s, 3H).
  53. Từ phổ 13 C NMR, kết hợp phổ 1H NMR có thể khẳng định Lc02 là một flavonoid glycoside, có hai nhóm thế -O-CH3. Trên phổ HSQC (phụ lục 8a, 8b) (bảng 4.3) + Cho các tương tác giữa pronton nhân thơm của vòng A là proton 7.04 (s, 1H) với carbon 94.44 ppm, giữa pronton 6.94 (s, 1H) với carbon 103.34 ppm. + Vòng B proton nhân thơm 8.05 (dt, J=9 và J=3) (H-2′, H-6′) tương tác với carbon 128.34 ppm (C-2′, C-6′); proton 7.14 (dt, J=9 và J=3) (H-3′, H-5′) tương tác với carbon 114.60 ppm (C-3′, C-5′). Trên phổ HMBC (phụ lục 9a, 9c), các proton của vòng B tại 8.05 (dt, J=9 và J=3, H-2′, H-6′) ; 7.14 (dt, J=9 và J=3, H-3′, H-5′ ) có tương tác với một carbon bậc bốn 162.44 ppm, đồng thời các proton của nhóm methoxy (O-CH3) 3.87 (s, 3H) cũng tương tác với carbon này suy ra carbon này là C-4’của vòng B và mang nhóm methoxy (O-CH3). Ngoài ra trên phổ HMBC có tương tác giữa H-2′, H-6′ với carbon bậc bốn 163.84ppm, giữa H-3’, H-5′ với carbon bậc bốn 122.74 ppm, hai carbon gần các proton trên chỉ có thể là C-1’ và C-2, C-2 là carbon bậc bốn có 163.84 ppm do gần oxi hơn, còn lại là C-1’ 122.74 ppm. Các proton của nhóm methoxy còn lại (O-CH3) tương tác với carbon bậc bốn 132.60 ppm, carbon này lại có tương tác với proton kiềm nối ở C-5 của vòng A, kết luận carbon này chỉ có thể là C-6 của vòng A nối với nhóm methoxy (-OCH3). 11 3' OCH 2' 4' 3 1 O 2 1' 5' 6' 6 H3CO 5 4 OH O Trên phổ HMBC proton 6.94 (s, 1H) có tương tác với các carbon 182.29 ppm (C-4), 163.84 ppm (C-2), 122.74 ppm (C -1’), nên khẳng định rằng proton này là H-3; proton 7.04 (s, 1H) chỉ có thể gắn trên C-7 hoặc C-8, trên phổ HMBC proton này có
  54. tương tác với C-6 132.60ppm, C-10 có 105.76 ppm, carbon bậc bốn 156.48 ppm, có thể kết luận proton 7.04 (s, 1H) gắn trên C-8 do có thể tương tác tới C-10. Trên phổ HMBC carbon bậc bốn 156.48 ppm có tương tác với proton 5.11 (d, J ″ =7 Hz, 1H), là proton anomer của đường trên C1 100.24 ppm. Kết hợp các số liệu từ phổ 13C-NMR, 1H-NMR, có thể kết luận C-7 gắn với phân tử đường β-glucose do J=7 Hz. HO OCH3 6'' O 8 1' HO O 7 O 2 HO 1'' OH 6 10 3 H3CO 5 4 OH O Bảng 4.3: Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR và HMBC của Lc02 (Phụ lục 6a, 6b, 6c, 7a, 7b, 7c, 9a, 9b, 9c) 1 Vị trí H-NMR δppm 13C-NMR Loại HMBC C/H (số H, dạng mũi, J = Hz) δppm carbon 1H → 13C 2 163.84 O-C= 3 6.94 (s, 1H) 103.34 -CH= H3→ C2,4, 1’, 10 4 182.29 >C=O 5 152.39 O-C= 6 132.60 O-C= 7 156.48 O-C= 8 7.04 (s, 1H) 94.44 -CH= H8 → C6, 9, 7, 10 9 152.11 O-C= 10 105.76 >C= 11 3.87 (s, 3H) 55.55 O-CH3 H11 → C4’
  55. 12 3.77 (s, 3H) 60.24 O-CH3 H12 → C6 1′ 122.74 >C= 2′ 8.05 (dt, J=9 và J=3, 2H) 128.34 -CH= H2’→ C4’ 3′ 7.14 (dt, J=9 và J=3, 2H) 114.60 -CH= H3’ → C1’, 4’ 4′ 162.44 O-C= 5′ 7.14 (dt, J=9 và J=3, 2H) 114.60 -CH= H5’ → C1’, 4’ 6′ 8.05 (dt, J=9 và J=3, 2H) 128.34 -CH= H6' → C 4’ 1″ 5.11 (d, J =7 Hz, 1H) 100.24 O-CH-O H1”→ C 2”,3”,7 ″ ″ 2″ 3.37 (m,1H) 73.17 >CH-O H2 → C3 ″ ″ 3″ 3.34 (m, 1H) 76.70 >CH-O H3 → C2 3.20 (ddd, J = 19.4; 8.0, 4″ 69.61 >CH-O 4.0 Hz,1H) 5″ 3.54 (m, 1H) 77.25 >CH-O 3.55 (m, 1Ha) 6″ 60.63 HO-CH2- 3.73 (m, 1Hb) Bảng 4.4: So sánh dữ liệu phổ 13C-NMR của Lc02 với tài liệu tham khảo [13] 13 Vị trí C-NMR (ppm) C Lc02 Pectolinarigenin Pectolinarin 2 163.84 164.2 164.7 3 103.34 103.3 104.2 4 182.29 182.8 183.1 5 152.39 153.1 154.0 6 132.6 131.1 133.8 7 156.48 156.4 157.7
  56. 8 94.44 94.1 95.0 9 152.11 152.3 153.1 10 105.76 105.0 107.1 11 55.55 55.3 55.4 12 60.24 60.5 60.8 1′ 122.74 123.3 123.5 2′ 128.34 127.9 128.8 3′ 114.60 114.3 115.2 4′ 162.44 162.5 163.0 5′ 114.60 114.3 115.2 6′ 128.34 127.9 128.8 1″ 100.24 - 102.3 2″ 73.17 - 74.6 3″ 77.25 - 78.4 4″ 69.61 - 71.2 5″ 76.70 - 77.6 6″ 60.63 - 67.5 1′′′ - - 102.4 2′′′ - - 72.0 3′′′ - - 72.8 4′′′ - - 74.0 5′′′ - - 69.8 6′′′ - - 18.5
  57. Pectolinarigenin là flavonoid gần giống như Lc02, nhưng trong flavonoid này không kèm theo phân tử đường, hầu hết các độ chuyển dịch hóa học của hai flavonoid này có sự chênh lệch không đáng kể. 11 3' OCH 2' 4' 3 8 1 HO 9 O 2 7 1' 5' 6' 12 3 6 10 H3CO 5 4 OH O Pectolinarigenin Pectolinarin là flavonoid có gắn phân tử đường giống như Lc02, nhưng trong công thức của flavonoid này có đền hai phân từ đường là β-glucose và rhamnose, có sự chênh lệch ở vị trí gắn thêm phân tử đường β-glucose ở C-6’’, ở Lc02 60.63 ppm, Pectolinarin 67.5 ppm. OH HO 4''' 3''' 2''' HO O 11 H3C 3' 6''' 1''' OCH3 5''' 2' 4' O 6'' 4'' O 8 1 5'' 9 HO O 7 O 2 5' HO 1' 2'' 1'' 3'' OH 6' 12 3 6 10 H3CO 5 4 OH O Pectolinarin Từ các tín hiệu đã quy kết ở trên, kết hợp so sánh với tài lệu tham khảo cho ta thấy chất Lc02 có các tín hiệu là flavonoid glycoside, từ đó chúng tôi khẳng định rằng chất Lc02 có công thức cấu tạo là:
  58. 3' 11 OCH HO 2' 4' 3 6'' 4'' O 8 1 5'' 9 HO O 7 O 2 5' HO 1' 2'' 1'' 3'' OH 6' 12 3 6 10 H3CO 5 4 OH O pectolinarigenin 7-O-β-D-glucoside hay Linaroside 4.2.3 NHẬN DANH CẤU TRÚC CHẤT Lc03 Những đặc tính của Lc03 + Là tinh thể hình kim màu trắng, kết tinh trong MeOH. +Tan tốt trong CHCl3, ít tan trong EtOAc và MeOH. +Sắc ký lớp mỏng (TLC) hiện màu bằng dung dịch axit H2SO4 10% trong EtOH: Giải ly bằng hệ CHCl3 – MeOH (9:1) cho vết tròn màu tím xanh có Rf = 0.58. Giải ly bằng hệ CHCl3 – MeOH (95:5) cho vết tròn màu tím có Rf = 0.19. Hình 4.6 TLC cùa Lc03 Hình 4.5 Chất Lc03 Hệ CHCl3-MeOH (9:1) Xác định cấu trúc Lc03 Phổ 13C NMR kết hợp với DEPT (bảng 4.5) cho thấy sự xuất hiện 35 tín hiệu của carbon:
  59. + Có mười một carbon bậc bốn, trong đó có hai carbon 177.50 ppm, 165.35 là carbon carbonyl, đặc trưng carbon của acid (-COOH) và carbon của ester (>C=O), hai carbon 143.75 ppm và 157.01 ppm là carbon sp2, một carbon 98.89 ppm là carbon acetal (O-C-O), còn lại các carbon bậc bốn khác có độ chuyển dịch lần lượt là [50.79, 42.05, 40.32, 38.37, 35.14, 30.10] ppm. + Có sáu carbon bậc ba (>CH-), trong đó có hai carbon 122.61 ppm, carbon 116.05 ppm là carbon sp2 chứng tỏ trong triterpene này có hai nối đôi, một carbon 75.31 ppm là carbon nối với oxi (>CH-O-) còn ba carbon còn lại có độ chuyển dịch lần lượt là [50.38, 42.03, 39.29] ppm. + Tám carbon [33.74, 27.39, 27.26, 26.28, 25.34, 20.24, 18.28, 17.42] ppm là carbon của nhóm methyl. + Còn lại mười nhóm methylen (-CH2-), gồm carbon 67.75 ppm là carbon nối với oxi, còn lại là các carbon khác có độ chuyển dịch [45.86, 37.80, 34.68, 31.07, 29.40, 27.82, 24.17, 23.79, 19.78] ppm. Phổ 1H NMR (bảng 4.5) với một số tín hiệu đặc trưng (phụ lục 12a, b) + Ở vùng trường thấp có các proton hiện tín hiệu rõ, gồm hai proton 5.57ppm (s, 1H ), 5.38 (s, 1H) gắn trên các carbon sp2, ngoài ra còn có proton kề oxi của nhóm ester là proton 5.01 (s,1H), bên cạnh đó xuất hiện proton 3.03 (dd, J = 13.5, 4.0 Hz, 1H) trên carbon bậc ba, proton này đặc trưng cho H-18 của khung olean, hai proton 4.22 (dd, J = 8.8, 2.7 Hz, 1Ha); 3.90 (dd, J = 8.8, 1.6 Hz, 1Hb) là hai proton gắn trên carbon methylen kề oxi. + Kế tiếp là sự xuất hiện của các proton 2.12 (m), 1.98 (m), 2.14 ( m) và vùng chồng chập của các nhóm methylen (-CH2-) rất khó xác định. + Ở vùng trường cao có xuất hiện các proton [0.78(s, 3H), 0.88 (s, 3H), 0.96 (s, 3H), 1.01(s, 3H), 1.03 (s, 3H), 1.15 (s, 3H)] ppm với tín hiệu có cường độ mạnh, mũi đơn là proton của sáu nhóm methyl (-CH3). Bên cạnh đó còn hai mũi đơn mạnh 1.85 2 (s, 3H), 2.13 (s, 3H) của proton các nhóm methyl (-CH3) kề carbon sp . Qua các tín hiệu đặc trưng trên phổ 13-C NMR (>C=O) carbon 177.50 ppm (C- 2 2 1 28), một carbon sp 143.05 ppm (C-13), carbon sp 122.61 ppm (C-12) và phổ H NMR proton 5.38 (t, J = 3.3 Hz, 1H (H-12), proton 3.03 (dd, J = 13.5, 4.0 Hz, 1H) (H-
  60. 18), proton của sáu nhóm methyl (-CH3) đều chẻ mũi đơn lần lượt [0.89(s, 3H), 1.03 (s, 3H), 1.13 (s, 3H), 0.92(s, 3H), 0.97 (s, 3H), 0.74 (s, 3H)] ppm. Có thể khẳng định Lc03 tương tự như Lc01 là một triterpene thuộc khung olean mà cụ thể là dẫn xuất của acid oleanolic. Từ phổ HSQC (phụ lục 13a, b, c) có thể thấy các tín hiệu tương tác đặc trưng giữa carbon sp2 122.61 ppm (C-12) và proton 5.38 (t, J = 3.3 Hz, 1H ) (H-12), carbon sp2 116.05 và proton 5.57ppm (s, 1H ), giữa carbon 39.29 (C-18) và proton 3.03 (dd, J = 13.5, 4.0 Hz, 1H) (H-18), giữa hai proton [4.22 (dd, J = 8.8, 2.7 Hz, 1Ha); 3.90 (dd, J = 8.8, 1.6 Hz, 1Hb)] và carbon 67.75 ppm, giữa proton 5.01 (s,1H) và carbon (>CO-) 75.31 ppm. Ngoài ra trên phổ HMBC ta thấy carbon acetal (O-C-O) 98,89 ppm có tín hiệu tương tác với các proton của hai nhóm methyl (-CH3) có 1.03 (s, 3H), 0.96 (s, 3H) ppm, có thể tạm kết luận carbon acetal này là C-3 trong khung olean; đồng thời carbon acetal này cũng tương tác với hai proton 4.22 (dd, J = 8.8, 2.7 Hz, 1Ha); 3.90 (dd, J = 8.8, 1.6 Hz, 1Hb). Từ đó ta có thể khẳng định được carbon acetal là C-3, C-3 có cầu nối oxi với carbon methylen có 67.75 ppm, carbon này vẫn còn hai proton nên có thể kết luận carbon là C-25 trong khung triterpene olean. Như đã phân tích ở trên, Lc03 có công thức tương tự như Lc01, là triterpene thuộc khung olean, có cầu nối oxi từ C-3 qua C-25. Nhưng có sự khác biệt: Dựa vảo phổ DEPT ta nhận thấy được Lc03 có mười nhóm methilen (-CH2- ) ít hơn Lc01 một nhóm methylen, do đó có một carbon methylen (-CH2-) đã bị thế bởi một dây ester có năm carbon, trở thành carbon kề oxi (>CO-) 75.31 ppm, proton trên carbon này là proton 5.01(s, 1H). Ngoài ra trên phổ HMBC, proton 5.01(s, 1H) của carbon kề oxi này có dấu hiệu tương tác carbon bậc ba 39.29 ppm (C-18), carbon bậc bốn 30.01(C-20). Nên có thể kết luận carbon gắn với oxi này là C-19 hoặc C-22 Trên phổ COSY, ta thấy proton 3.03 (dd, J = 13.5, 4.0 Hz, 1H) (H-18), có tương tác với hai proton methylen 1.29 (m, 1 Ha) 1.75 (m, 1 Hb), bên cạnh H-18 hai proton của nhóm methylen, hai proton đó chỉ có thể là hai proton của C-19, từ đó có thể khẳng định dây ester này thế vào C-22 Proton 5.01 (s, 1H) có tương tác với hai nhóm (-CH3), [20.24 (s, 3H), 27.26(s, 3H)], các proton trên hai nhóm (-CH3) là proton trên carbon nhóm methyl (-CH3) kề
  61. carbon sp2 là các prpton 1.85 (s, 3H), 2.13(s, 3H). Bên cạnh đó Lc03 còn có thêm một carbon bậc ba 116.05 ppm, một carbon bậc bốn 157.01 ppm, cho thấy giữa hai carbon này có nối đôi, hai nhóm methyl trên cùng nằm trên carbon bậc bốn. Những tương tác đặc trưng trên phổ HMBC 4' 5' O 3' 20 21 12 2' 22 1' 18 O 25 COOH O 4 HO 3 24 23 Phổ khối lượng ESI-MS của hợp chất Lc03 (phụ lục 16) cho đỉnh ion phân tử tại m/z: 567,30 [M-H1]- (negative) cho phép xác định M = 568. Bảng 4.5: Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR và HMBC của Lc03 (Phụ lục 10a, 10b, 10c, 12a, 12b, 12c, 14a, 14b, 14c, 14d, 14e) 1H-NMR δppm 13C- Vị trí Loại HMBC (số H; dạng mũi; J = NMR C/H carbon 1H → 13C Hz) δppm 2.17 (m, 1H),1.23 (m, 1 34.68 –CH – H → C 1H) 2 1 3,5,10 1.26 (m, 1H), 2.16 (m, 2 29.40 –CH2– 1H) 3 98.89 HO-C–O 4 40.32 >C< 5 1.22 (m,1H) 50.38 –CH< 6 1.53 (m, 2H) 19.78 –CH2–
  62. 1.42 (m, 1H), 1.37 7 31.07 –CH – H → C (m,1H) 2 7 5,6,9,8 8 38.37 >C C C= 14 42.05 >C CH C CH– H22→C20,18,1’ 21a 23 1.03 (s, 3H) 27.26 –CH3 H23→C3,4,5 24 0.96 (s, 3H) 18.28 –CH3 H24→C2,3,4,5
  63. 4.22 (dd, J = 8.8, 2.7 Hz, H →C 25 1Ha) 67.75 –CH –O 25a 10 H → H 3.90 (dd, J = 8.8, 1.6 Hz, 2 25(a) 1b H25b→C3,5,10 1Hb) 26 0.78 (s, 3H) 17.42 –CH3 H26→C7,8,9,14 27 1.15 (s, 3H) 25.34 –CH3 H27→C8,13,14,15 28 177.50 –COOH 29 0.88 (s, 3H) 33.74 –CH3 H29→C19,21,22 30 1.01(s,3H) 26.28 –CH3 H30→C19,21,22 1’ 165.35 –COO– 2’ 5.57 (s, 1H ) 116.05 –CH= H2’→C4’,5’ H2’→ H4’,5’ 3’ 157.01 >C= 4’ 2.13 (s, 3H) 20.24 –CH3 H4’→C2’,1,’,3’ H4’→ H22 5’ 1.85 (s, 3H) 27.26 –CH3 H5’→C2’,3’ Bảng 4.6: Dữ liệu phổ 13C-NMR và DEPT của Lc03 (phụ lục 10a, 10b, 10c, 11a, 11b) Vị trí C 13C (ppm) DEPT90 DEPT135 Kết luận 1 34.68 Biến mất Peak âm –CH2– 2 29.40 Biến mất Peak âm –CH2– 3 98.89 Biến mất Biến mất HO-C–O 4 40.32 Biến mất Biến mất >C< 5 50.38 Peak dương Peak dương –CH< 6 19.78 Biến mất Peak âm –CH2– 7 31.07 Biến mất Peak âm –CH2–
  64. 8 38.37 Biến mất Biến mất >C C C= 14 42.05 Biến mất Biến mất >C CH C CH– 23 27.26 Biến mất Peak dương –CH3 24 18.28 Biến mất Peak dương –CH3 25 67.75 Biến mất Peak âm –CH2–O 26 17.42 Biến mất Peak dương –CH3 27 25.34 Biến mất Peak dương –CH3 28 177.50 Biến mất Biến mất –COOH 29 33.74 Biến mất Peak dương –CH3 30 26.28 Biến mất Peak dương –CH3
  65. 1’ 165.35 Biến mất Biến mất –COO– 2’ 116.05 Peak dương Peak dương –CH= 3’ 157.01 Biến mất Biến mất >C= 4’ 20.24 Biến mất Peak dương –CH3 5’ 27.26 Biến mất Peak dương –CH3 Bảng 4.7 : So sánh dữ liệu phổ 13C-NMR của Lc03 với tài liệu tham khảo[17] 13C-NMR (ppm) Vị trí C Latanilic Lc03 acid 1 34.68 34.53 2 29.40 29.24 3 98.89 98.87 4 40.32 40.25 5 50.38 50.16 6 19.78 19.72 7 31.07 30.95 8 38.37 38.26 9 42.03 41.95 10 35.14 35.04 11 23.79 23.73 12 122.61 122.48 13 143.05 143.02 14 42.05 41.95
  66. 15 27.82 27.74 16 24.17 24.11 17 50.79 50.70 18 39.29 39.15 19 45.86 45.78 20 30.10 30.07 21 37.80 37.68 22 75.31 75.30 23 27.26 27.43 24 18.28 18.27 25 67.75 67.68 26 17.42 17.44 27 25.34 25.30 28 177.50 177.98 29 33.74 33.74 30 26.28 27.20 165.35 166.34 1’ 116.05 115.94 2’ 157.01 157.10 3’ 20.24 20.22 4’ 27.26 26.23 5’
  67. Từ những dữ liệu phổ trên, kết hợp tính chất vật lý và tài liệu tham khảo, có thể khẳng định công thức cấu tạo của Lc03 là: 30 29 4' 5' O 3' 19 20 21 2' 12 22 1' 13 11 26 18 O 25 17 1 14 COOH 9 16 28 2 O 10 8 15 7 3 4 5 27 HO 6 24 23 22β –dimethylacryloyloxy- 3, 25-epoxy-3β-hydroxyolean-12-en-28-oic acid hay Lantanilic acid
  68. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Từ cao EtOH, chúng tôi đã tiến hành tách riêng thành 3 loại cao theo độ phân cực của các hợp chất có trong lá ngũ sắc: Cao n-hexan 28g (8.3% ẩm độ). Cao EtOAc 11g (10% ẩm độ). Cao MeOH 121g (23.5% ẩm độ). Từ cao EtOAc, đã cô lập, tinh chế và định danh được 3 chất: Bảng 5.1: Tóm tắt các chât cô lập được trong ngũ cao EtOAc Ký hiệu Khối Tính chất R Tên chất lượng f - Tinh thể hinh kim, màu trắng. 3, 25-epoxy-3β-hydroxyolean- 12-en-28-oic acid hay Lc01 6 mg - Kết tinh trong MeOH. 0.53 Lantanolic acid. - Kiểm tra bằng TLC cho một vết tròn màu tím. - Dạng bột, màu vàng nhạt. pectolinarigenin 7-O-β-D- Lc02 4 mg - Kết tinh trong MeOH. 0.25 glucoside hay Linaroside - Kiểm tra bằng TLC cho một vết tròn màu vàng. - Dạng hình kim, màu 22β –dimethylacryloyloxy- 3, trắng. 25-epoxy-3β-hydroxyolean-12- Lc03 7 mg - Kết tinh trong MeOH. 0.58 en-28-oic acid - Kiểm tra bằng TLC cho hay Lantanilic acid một vết tròn màu tím.
  69. 5.2 ĐỀ NGHỊ - Tiếp tục cô lập và tinh chế các phân đoạn còn lại cao EtOAc, cao n-Hexan, cao MeOH để làm sáng tỏ thêm thành phần hóa học của lá cây ngũ sắc. - Thử hoạt tính sinh học của các chất đã phân lập được. TÀI LIỆU THAM KHẢO TRONG NƯỚC 1. Diệp Thị Mỹ Hạnh, E. Garnier Zarli, (2007), Lantana camara L., Thực Vật có khả năng hấp thu Pb trong đất để giải ô nhiễm, tạp chí phát triển Khoa Học và Công Nghệ, tập 10, số 1. 2. Đỗ Huy Ích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiền, Vũ ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập, Trần Toàn, (2004), Viện Dược Liệu, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập I, Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật, trang 260- 262. 3. GS.TS Đỗ Tất Lợi, (1995), Những Cây Thuốc và Vị Thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội, trang 684, 685. 4. Nguyễn Tiến Công, (2009), Một số phương pháp phổ nghiên cứu cấu trúc phân tử, trường đại học sư phạm tp. Hồ Chí Minh, trang 47,49, 50, 55. 5. Nguyễn Văn Đậu, Lê Thị Huyền, (2009), Các tritecpen Oleanan từ cây bông ổi Lantana camara L., tạp chí Hóa Học, tập 47, số 2, trang 144-148. 6. PGS.TS. Nguyễn Kim Phi Phụng, (2007), Các phương pháp tách chiết hợp chất hữu cơ, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh. 7. PGS.TS. Nguyễn Kim Phi Phụng, (2005), Phổ NMR sử dụng trong phân tích hữu cơ, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh. NGOÀI NƯỚC 8. Barua AK, Chakrabarti P, Dutta SP, Mukherjee DK, Das BC, (1971), Tetrahedron, 27:1141. 9. Chung-Liang Chiua, Tzong-Huei Leeb, Yi-Yuan Shaoc and Yueh-Hsiung Kuoadef, (2008), Three new triterpenes from the roots of Rhus javanica L. var.
  70. roxburghiana, Journal of Asian Natural Products Research, Vol. 10, No. 7, July 2008, 684–688. 10. Deepak Ganjewala, Silviya Sam, Kishwar Hayat Khan, (2008), Biochemical compositions and antibacterial activities of Lantana camara plants with yellow, lavender, red and white flowers, EurAsian Journal of BioSciences, 3, pp 69-77. 11. E.L. Ghisalberti, (2000), Lantana camara L. Verbenaceae, Fitoterapia 71 pp 467-486. 12. Erlânio O. Sousa, Aracelio V. Colares, Fabiola F. G. Rodrigues, Adriana R. Campos, Sidney G. Lima and José Galberto M. Costa, (2010), Effect of Collection Time on Essential Oil Composition of Lantana camara Linn (Verbenaceae) Growing in Brazil Northeastern, Records of Natural Products, vol 4 (1) pp 31-37. 13. Fu-Chiang Juang, Yu-Fang Chen, Fuh-Mei Lin1and Keh-Feng Huang, (2005), Constituents from the leaves of Lantana camara (IV), J Chin Med 16(2-3): 149- 155. 14. Hart NK, Lamberton JA, Sioumis AA, Suares H., (1976), Aust J Chem, 29:655. 15. Hidayat Hussain, Javid Hussain1, Ahmed Al-Harrasi, And Zabta Khan Shinwari, December, (2011), Chemistry of some species genus lantana, Special Issue (Medicinal Plants: Conservation & Sustainable use), Pak. J. Bot, 43: pp 51-62. 16. Jitendra Patel, G.S Kumar, Deviprasad S.P, Deepika S, Md Shamim Qureshi, (2011), Phytochemical and anthelmintic evaluation of Lantana camara (L.) var. aculeate leaves against Pheretima posthuma, Journal of Global Trends in Pharmaceutical Sciences, Vol.2, Issue 1, pp 11-20. 17. Keh-Feng Huang and Kao-Wei Huang, (2004), Constituents from the stems of Lantana camara (III), J Chin Med 15(2): 109-114. 18. Lai J-S, Chan J-F, Huang K-F, (1998), Chin Pharmaceut J, 50:385. 19. M. Sathish Kumar and S. Maneemegalai, (2008), Evaluation of Larvicidal Effect of Lantana Camara Linn Against Mosquito Species Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus, Advances in Biological Research, vol 2 (3-4) pp 39-43. 20. Mahato SB, Sahu NP, Roy SK, Sharma OP. (1994), Tetrahedron;50:9439.
  71. 21. Nayak BS, Raju SS, Ramsubhag A, 2008, Investigation of wound healing activity of Lantana camara L. in Sprague dawley rats using a burn wound model, International Journal of Applied Research in Natural Products, Vol. 1 (1), pp. 15-19. 22. O. O. Oyedapo, B. A. Akinpelu, K. F. Akinwunmi, M. O. Adeyinka and F. O. Sipeolu, (2010), Red blood cell membrane stabilizing potentials of extracts of Lantana camara and its fractions, International Journal of Plant Physiology and Biochemistry Vol. 2(4), pp. 46-51. 23. Siddiqui BS, Raza SM, Begum S, Siddiqui S, Firdous S., (1995), Phytochemistry, 38:681. 24. Syah YM, Pennacchio M, Ghisalberti EL., (1998), Fitoterapia, 69:285 25. Taoubi K, Fauvel MT, Gleye J, Moulis C, Fouraste I., (1997), Planta Med, 63:192. 26. T.Venkatachalam, V.Kishor Kumar, P.Kalai Selvi, Avinash O. Maske, V.Anbarasan, P.Siva Kumar, (2011), Antidiabetic activity of Lantana camara Linn fruits in normal and streptozotocin-induced diabetic rats, Journal of Pharmacy Research, vol 4(5), pp 1550-1552. 27. Wollenweber E, Dorr M, Muniappan R, Siems K., (1997), Biochem Syst Ecol, 25:269
  72. PHỤ LỤC Phụ lục 1a: Phổ 13C-NMR của Lc01
  73. Phụ lục 1b: Phổ 13C-NMR của Lc01
  74. Phụ lục 1c: Phổ 13C-NMR của Lc01
  75. Phụ lục 2a: Phổ 1H-NMR của Lc01
  76. Phụ lục 2b: Phổ 1H-NMR của Lc01
  77. Phụ lục 2c: Phổ 1H-NMR của Lc01
  78. Phụ lục 3a: Phổ HSQC của Lc01
  79. Phụ lục 3b: Phổ HSQC của Lc01
  80. Phụ lục 3c: Phổ HSQC của Lc01
  81. Phụ lục 4a: Phổ HMBC của Lc01
  82. Phụ lục 4b: Phổ HMBC của Lc01
  83. Phụ lục 4c: Phổ HMBC của Lc01
  84. Phụ lục 4d: Phổ HMBC của Lc01
  85. Phụ lục 5a: Phổ COSY của Lc01
  86. Phụ lục 5b: Phổ COSY của Lc01
  87. Phụ lục 6a: Phổ 13C-NMR của Lc02
  88. Phụ lục 6b: Phổ 13C-NMR của Lc02
  89. Phụ lục 6c : Phổ 13C-NMR của Lc02
  90. Phụ lục 7a: Phổ 1H-NMR của Lc02
  91. Phụ lục 7b: Phổ 1H-NMR của Lc02
  92. Phụ lục 7c: Phổ 1H-NMR của Lc02
  93. Phụ lục 8a: Phổ HSQC của Lc02
  94. Phụ lục 8b: Phổ HSQC của Lc02
  95. Phụ lục 8c: Phổ HSQC của Lc02
  96. Phụ lục 9a: Phổ HMBC của Lc02
  97. Phụ lục 9b: Phổ HMBC của Lc02
  98. Phụ lục 9c: Phổ HMBC của Lc02
  99. Phụ lục 10a: Phổ 13C-NMR của Lc03
  100. Phụ lục 10b: Phổ 13C-NMR của Lc03
  101. Phụ lục 10c: Phổ 13C-NMR của Lc03
  102. Phụ lục 11a: Phổ DEPT của Lc03
  103. Phụ lục 11b: Phổ DEPT của Lc03
  104. Phụ lục 12a: Phổ 1H-NMR của Lc03
  105. Phụ lục 12b: Phổ 1H-NMR của Lc03
  106. Phụ lục 12c: Phổ 1H-NMR của Lc03
  107. Phụ lục 13a: Phổ HSQC của Lc03
  108. Phụ lục 13b: Phổ HSQC của Lc03
  109. Phụ lục 13c: Phổ HSQC của Lc03
  110. Phụ lục 14a: Phổ HMBC của Lc03
  111. Phụ lục 14b: Phổ HMBC của Lc03
  112. Phụ lục 14c: Phổ HMBC của Lc03
  113. Phụ lục 14d: Phổ HMBC của Lc03
  114. Phụ lục 14e: Phổ HMBC của Lc03
  115. Phụ lục 15a: Phổ COSY của Lc03
  116. Phụ lục 15b: Phổ COSY của Lc03
  117. Phụ lục 15c : Phổ COSY của Lc03
  118. Phụ lục 16 : Phổ MS của Lc03