›

Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học của nấm Pestalotiopsis

pdf 48 trang thiennha21 15/04/2022 5980
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học của nấm Pestalotiopsis", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_khao_sat_thanh_phan_hoa_hoc_cua_nam_pestalotiopsis.pdf

Nội dung text: Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học của nấm Pestalotiopsis

  1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA – BỘ MÔN HÓA HỮU CƠ ______ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA NẤM PESTALOTIOPSIS GV hướng dẫn: ThS. Dương Thúc Huy SV thực hiện: Hoàng Khánh An MSSV: K38.201.001 Tp. HCM, ngày 22 tháng 5 năm 2016 Trang 1
  2. TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA – BỘ MÔN HÓA HỮU CƠ ______ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỮU CƠ KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA NẤM PESTALOTIOPSIS GV hướng dẫn: ThS. Dương Thúc Huy SV thực hiện: Hoàng khánh An MSSV: K38.201.001 Tp. HCM, ngày 22 tháng 5 năm 2016 Trang 2
  3. NHẬN XÉT CỦA HỘI ĐỒNG Trang 3
  4. LỜI CẢM ƠN Với tấm lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến: Thầy Dương Thúc Huy, người Thầy tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, tài trợ cho em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận này. Thầy đã nhiệt tâm giảng dạy, hướng dẫn, quan tâm và giúp đỡ em trong quá trình học tập tại trường. Các Thầy/ Cô khoa Hóa, đặc biệt là các Thầy/ Cô bộ môn Hóa hữu cơ đã tận tình giảng dạy, chỉ bảo và tạo điều kiện để em hoàn thành luận văn này. Thầy/ Cô bộ môn Hóa Hữu Cơ trường Đại Học Sư Phạm Tp.HCM, đã nhận lời phản biện, đóng góp nhiều ý kiến giúp em hiểu rõ thêm về nội dung mà mình đang thực hiện. Các bạn Lê Thị Kim Dung, Trần Thị Ngọc Nhung, Hạng Tái Xuân Hòa cùng các bạn, các em sinh viên lớp K38, K39, Khoa Hóa trường ĐHSP Tp.HCM đã cộng tác, chỉ bảo và tận tình giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu. Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ em đã tạo mọi điều kiện vật chất, luôn là điểm dựa tinh thần cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường. Trang 4
  5. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN Trang MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC PHỔ PHẦN MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Vài nét về chi Pestalotiopsis sp. 2 1.2. Các nghiên cứu hóa sinh về loài nấm Pestalotiopsis 2 1.2.1. Cây chưa được xác định loài ở Trung Quốc 2 1.2.2. Cây đặc hữu vùng, không có ở Việt Nam 3 1.2.2.1. Melaleuca quinquenervia (Tràm gió) 3 1.2.2.2. Virola mechelii (Myristicaceae) ở Brazil 4 1.2.3. Cây vùng rừng ngập mặn 4 1.2.3.1. Cây Đưng Rhizophora mucronata 4 1.2.3.2. Cây Sấu Dracontomelon duperreanum 4 1.2.3.3. Cây Bần chua Sonneratica caseolaris 5 1.2.3.4. Cây Trang Kandelia candel (L.) Druce 5 1.2.3.5. Cây Sú biển Aegiceras corniculatum 6 1.2.4. Các loài cây khác 6 1.2.4.1. Cây trà Trung Quốc Camellia sinensis 6 1.2.4.2. Thông la hán Podocarpus macrophyllus 7 1.2.4.3. Cây cau vua Roystonea regia 8 1.2.4.4. Thông trắng Pinus armandii 8 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 19 Trang 5
  6. 2.1. Hóa chất, thiết bị, dụng cụ 19 2.1.1. Hóa chất 19 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ 19 2.2. Nguyên liệu 19 2.3. Quy trình thực nghiệm 20 2.3.1 Sắc ký cột trên cao Et3 20 2.3.2 Sắc ký bản mỏng W1 20 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1. Khảo sát cấu trúc hợp chất Et35 22 3.1.1. Đặc điểm hợp chất Et35 22 3.1.2. Biện luận cấu trúc hợp chất Et35 22 3.2. Khảo sát cấu trúc hợp chất EtA 25 3.2.1. Đặc điểm hợp chất EtA 25 3.2.2. Biện luận cấu trúc hợp chất EtA 25 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN- ĐỀ XUẤT 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO 28 PHỤ LỤC Trang 6
  7. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU DMSO : DiMethyl SulfOxide NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) HMBC : Tương quan 1H-13C qua 2,3 nối (Heteronuclear Multiple Bond Coherence) HSQC : Tương quan 1H-13C qua 01 nối (Heteronuclear Single Quantum Correlation) pTLC : Sắc ký lớp mỏng điều chế (preparative Thin - Layer Chromatography) CC : Sắc ký cột (Chromotogrophy Column) 1H-NMR: Proton Nuclear Magnetic Resonance. 13C-NMR: Carbon Nuclear Magnetic Resonance. J: Hằng số tương tác spin – spin. m/z: mass to charge ratio Transfer. ppm: part per million. Ac : Dung môi Acetone. AcOH : Acetic Acid. EA : Ethyl Acetate. EtOH : Ethanol. Me : Methanol. H : Hexane. Trang 7
  8. DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm 9 Bảng 1.2: Hoạt tính kháng virus 9 Bảng 1.3: Hoạt tính gây độc tế bào 10 Bảng 3.1: Dữ liệu phổ NMR của (R)-(-)-5-Ethoxycarbonyl-6-methyl- 24 4-phenyl-3,4-dihydropyrimidin-2(1H)-one và Et35 trong DMSO-d6 Bảng 3.2: Dữ liệu phổ NMR của Uracil và EtA trong DMSO-d6 26 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ Trang Hình 1.1: Các hợp chất cô lập từ nấm Pestalotiopsis 11 Hình 3.1: Một số tương quan HMBC của hợp chất Et35 23 Hình 3.2: Cấu trúc đề nghị của hợp chất EtA 25 Hình 4.1: Hai hợp chất cô lập được trong nấm Pestalotiopsis 27 Sơ đồ 1: Quá trình ly trích và cô lập các hợp chất 21 Trang 8
  9. DANH MỤC PHỤ LỤC PHỔ Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR của hợp chất Et35 Phụ lục 2: Phổ 13C-NMR của hợp chất Et35 Phụ lục 3: Phổ HSQC của hợp chất Et35 Phụ lục 4: Phổ HMBC của hợp chất Et35 Phụ lục 5: Phổ HMBC dãn rộng của hợp chất Et35 Phụ lục 6: Phổ 1H-NMR của hợp chất EtA Phụ lục 7: Phổ 13C-NMR của hợp chất EtA Trang 9
  10. HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP LỜI NÓI ĐẦU Trong khoảng 10 năm trở lại đây, những nghiên cứu hóa học và sinh học về chi Pestalotiopsis sp. trên thế giới trở nên phổ biến. Loài nấm thuộc chi Pestalotiopsis có thể sinh trưởng trên nhiều loài thực vật khác nhau như trên thực vật bậc thấp như nấm lỗ, địa y hay san hô hoặc cây bậc cao. Nấm Pestalotiopsis gây một số bệnh cho các loại cây trồng, tuy nhiên các hợp chất được cô lập từ các loại nấm này có ứng dụng rất nhiều trong nông nghiệp và y tế, đặc biệt ứng dụng vào việc điều trị căn bệnh thế kỉ HIV và một số bệnh ung thư khác. Xuất phát từ những ứng dụng y học quý giá và kế thừa những nghiên cứu đã có về chi Pestalotiopsis sp., chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên một loài nấm Pestalotiopsis do Th.S Trần Thị Minh Định – Khoa sinh học Đại học Sư phạm TP.HCM, được ly trích từ cây Trang ở vùng rừng ngập mặn Cần Giờ và nuôi cấy trong phòng thí nghiệm. Trang 1
  11. HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. VÀI NÉT VỀ CHI PESTALOTIOPSIS PS. Pestalotiopsis sp. là một trong ba nhánh lớn của họ Amphisphaeriaceae (Fungi-nấm) và được phân bố rộng rãi trên khắp các vùng nhiệt đới và ôn đới. Loài nấm Pestalotiopsis là nguồn hợp chất tự nhiên phong phú và các loài nấm thuộc chi này có thể sinh trưởng trên thân cây bậc cao, trên nấm, địa y, san hô biển. Tùy thuộc vào loại cây mà chúng sinh trưởng, chúng sản sinh ra đa dạng các loại hợp chất tự nhiên. Nghiên cứu thành phần hóa học cho thấy nếu loài nấm sinh trưởng trên thực vật bậc thấp như nấm lỗ, địa y hay san hô sẽ tạo thành các hợp chất tự nhiên rất khác biệt so với khi chúng sinh trưởng trên cây bậc cao. Cụ thể: Ambuic acid và 6 dẫn xuất khác và một dẫn xuất của torreyanic acid được cô lập từ loài nấm Pestalotiopsis theae trên địa y Clavaroids sp; từ loài nấm Pestalotiopsis trên san hô biển, cô lập được hợp chất alkaloid pestaloxazine A; từ loài nấm Pestalotiopsis sinh trưởng trên bề mặt của một loài nấm lỗ ở Georgia, cô lập được các hợp chất serquiterpene; trong khi đó trên các cây bậc cao, khi nuôi cấy trong điều kiện thí nghiệm, cô lập được các loại hợp chất thuộc khung polyketide chiếm chủ yếu như chromone, coumarin, cytosporone, Ngoài ra, tùy thuộc vào loài cây mà nấm sinh trưởng cũng như môi trường sinh trưởng của cây chủ, mỗi loại nấm cùng chi sản sinh các nhóm hợp chất đặc hữu. Những nghiên cứu về hóa sinh học trên thế giới tập trung chủ yếu về nuôi cấy loài nấm Pestalotiopsis sinh trưởng trên các cây bậc cao ở vùng rừng ngập mặn, chủ yếu ở vùng rừng ngập mặn phía Nam Trung Quốc với các công bố liên tục trong năm năm gần đây của nhóm tác giả Trung Quốc. 1.2. CÁC NGHIÊN CỨU HÓA SINH VỀ LOÀI NẤM PESTALOTIOPSIS 1.2.1. Cây chưa được xác định loài ở Trung Quốc [30] Pestalachloride A-C (1-3) được cô lập từ loài nấm Pestalotiopsis adusta. Trang 2
  12. HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Các chất này được đánh giá khả năng kháng một số nấm gây bệnh cây trồng gồm Fusarium culmorum, Gibberella zeae, Verticillium aiboatrum. Pestalachloride A có khả năng kháng nấm F. culmorum với giá trị IC50 0.89 µM. Pestalachloride B thể hiện khả năng kháng mạnh với nấm G. zeae với giá trị IC501.1 µM. Tuy nhiên Pestalachloride C không thể hiện khả năng kháng nấm F. culmorum, G. zeae và V. aiboatrum.[30] Pestaloficiol A-E (4-8) được cô lập từ loài nấm Pestalotiopsis fici.[18] Pestaloficiol A, B và D có khả năng ức chế sự nhân lên của HIV-1 trong dòng tế bào C8166 với giá trị EC50 lần lượt là 26.0, 98.1, 64.1 µM (chứng dương indinavir [31] sulfate có giá trị EC50 là 8.81 nM). Pestalofone A-E (9-13) cũng được cô lập từ loài nấm sinh trưởng trên cây này.[17,20] Pestalofone A, B và E thể hiện hoạt tính ức chế sự nhân lên của HIV-1 trong dòng tế bào C8166 với giá trị EC50 lần lượt là 90.4, 64.0, 93.7 µM (chứng dương indinavir sulfate có giá trị EC50 8.81 nM) ). Pestalofone A-E còn được đánh giá khả năng kháng C. albicans (ATCC10231), G. candidum (AS2.498) và A. fumigatus (ATCC10894). Pestalofone A và C thể hiện hoạt tính kháng mạnh đối với A. fumigatus với giá trị IC50/MIC lần lượt là 1.10/35.3, 0.90/31.2 µM (chứng dương fluconazole có giá trị IC50/MIC là 7.35/163.4 µM).[19,20] 1.2.2. Cây đặc hữu vùng, không có ở Việt Nam. 1.2.2.1. Melaleuca quinquenervia (Tràm gió). Pestalactam A-C (14-16) cô lập từ loài nấm Pestalotiopsis sp. trên cây Melaleuca quinquenervia ở Úc bởi Davis R. A. và cộng sự công bố vào năm 2010.[4] Pestalactam A và B ở nồng độ 25 µM thể hiện khả năng ức chế từ 16 – 41% sự phát triển của kí sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum. Hai hợp chất này ở nồng độ 100 µM còn có hoạt tính gây độc tế bào đối với 2 dòng tế bào MCF-7 và NFF (ức chế sự phát triển từ 12-64%).[4] Trang 3
  13. HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 1.2.2.2. Virola mechelii (Myristicaceae) ở Brazil Một dẫn xuất mới của anthraquinone là guepinone (17), cùng với 2 hợp chất đã biết isosulochrin (18) và chloroisosulochrin (19) được cô lập từ nấm Pestalotiopsis guepinii ở cây thuốc Virola michelii.[22] Các hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất này đã được đánh giá, chỉ có hoạt tính kháng S. aureus (đường kính vòng ức chế 13 mm), và hoạt tính của hợp chất chloroisosulchrin là tích cực nhất.[22] 1.2.3. Cây vùng rừng ngập mặn. 1.2.3.1. Cây Đưng Rhizophora mucronata Pestalotiopyrone A-H (20–26), pestalotiopisorin A (27), pestalotiollides A-B (28-29), pestalotiopin A (30), amide pestalotiopamide A-D (31-34), nigrosporapyrone D (35), p-hydroxybenzaldehyde (36) được cô lập từ loài nấm Pestalotiopsis sp. sinh trưởng trên cây Đưng Trung Quốc Rhizophora mucronata sinh trưởng ở vùng rừng ngập mặn bởi nhóm nghiên cứu của Xu J. và cộng sự năm 2011. Các hợp chất chromone Pestalotiopsone A-F (37-42) cũng được cô lập bởi Xu J. và cộng sự năm 2008, đã được xác định cấu hình tuyệt đối vào năm 2013 bởi nhóm tác giả Beekman A. M. và Barrow R. A.[2,24,29,30] Pestalotiopsone F thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ở mức trung bình với giá trị [28] EC50 là 8.93 µg/mL. 1.2.3.2. Cây Sấu Dracontomelon duperreanum Virgatolide A-C (43-45) được cô lập từ nấm Pestalotiopsis virgatula ở cây Sấu Dracontomelon duperreanum bởi Li J. và cộng sự năm 2011.[14] Các hợp chất này có hoạt tính gây độc tế bào ở mức trung bình đối với dòng tế bào HeLa, giá trị IC50 lần lượt là 19.0, 22.5, 20.6 µM (chứng dương 5-fluorouracil có [14] giá trị IC50 là 10.0 µM). Trang 4
  14. HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 1.2.3.3. Cây Bần chua Sonneratica caseolaris Pestalotiopyrone I-L (46-49), một xuyên lập thể phân của hydroxypestalotin và hydropestalotin, pestalotin, và pestalopyrone được cô lập từ loài nấm Pestalotiopsis virgatula trên cây Bần chua Sonneratica caseolaris ở vùng rừng ngập mặn bởi Ronsberg D. và cộng sự được công bố vào năm 2013.[23] Các hợp chất này không có hoạt tính kháng khuẩn, không có khả năng gây độc tế bào cũng như không có khả năng tiêu diệt ấu trùng của côn trùng.[23] Các dẫn xuất prenyl depside (50) và methylcoumarin (51, 52), endocrocin (53), pestalotiollide B, pestalotiopyrone G, scirpyrone A (54), và chromone (55) được cô lập từ loài nấm Pestalotiopsis acaciae bởi Yang X.-L. và cộng sự vào năm 2013.[32] Các hợp chất này không có hoạt tính gây độc tế bào cũng như kháng khuẩn, kháng virus.[32] Cytosporin F-K (56-61) và cytosporin D (62) được cô lập từ nấm Pestalotiopsis theae trên cây thuốc Turraeanthus longipes ở Cameroon bởi Akone S. H. và cộng sự cũng vào năm 2013.[1] Các hợp chất này cũng không có hoạt tính gây độc tế bào cũng như kháng khuẩn và kháng virus.[1] 1.2.3.4. Cây Trang Kandelia candel (L.) Druce Pestalamine A (63) được cô lập từ loài nấm Pestalotiopsis vaccinii, sinh trưởng trên cây Trang Kandelia candel (L.) Druce ở vùng rừng ngập mặn Trung Quốc cùng với các hợp chất diketopiperazine, các hợp chất đơn vòng khác. Pestalamine A thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ở mức trung bình đối với các dòng tế bào MCF-7, HeLa và HepG2, với giá trị IC50 lần lượt là 40.3, 22.0, 32.8 µM (giá trị IC50 của chứng dương taxol đối với các dòng tế bào ung thư này lần lượt là 5.2, 21.0 và 960 nM). Trang 5
  15. HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Các hợp chất vaccinol A-G (64-70), vaccinal A (71) cùng với 5 hợp chất cladoacetal B (72), cladoacetal A (73), xylarinol A (74), agropyrenol (75), vaccinol H- I (76-77), 3-(2-formyl-3-hydroxyphenyl)-propionic acid (78) được cô lập từ loài nấm Pestalotiopsis vaccinii bởi Wang J. và cộng sự vào năm 2014 và 2015.[25,26] Vaccinal A có khả năng kháng dòng tế bào COX-2 với giá trị IC50 là 1.8 µM. Vaccinal A cũng có khả năng kháng virus đường ruột EV71 với giá trị EC50 là 19.2 µM. Vaccinol I thể hiện hoạt tính kháng dòng tế bào COX-2 với giá trị IC50 là 16.8 µM.[25,26] 1.2.3.5. Cây Sú biển Aegiceras corniculatum Pestalols A-E (79-83) cùng với 4-hydroxyphenethyl 2-(4-hydroxyphenyl) acetate (84), p-hydroxyphenylacetic acid methyl ester, trans-harzialactone A (85) và F (86), 3-hydroxy-3-methyl-δ-lactone (87), -trihydroxy  -7,22-en- ergost-6-one và -hydroxysterol được cô lập từ loài nấm Pestalotiopsis sinh trưởng trên cây sú biển Aegiceras corniculatum ở vùng rừng ngập mặn bởi Jian-Fan S. và cộng sự vào năm 2014.[24] Trong số các chất này, có 7 chất thể hiện khả năng ức chế sự nhân lên của H3N2 và H1N1. -hydroxysterol có hoạt tính ức chế mạnh nhất, giá trị IC50 đối với H3N2 là 4.7 µM, đối với H1N1 là 2.2 µM. Pestalol B có khả năng kháng vi khuẩn lao.[24] 1.2.4. Các cây loài khác 1.2.4.1. Cây trà Trung Quốc Camellia sinensis Năm 2008, Ding G. và cộng sự đã cô lập được pestalazine A-B (88-89), asperazine (90), pestalamide A-C (91-93), aspernigzrin (94), carbonarone (95) từ loài nấm Pestalotiopsis theae.[5] Pestalazine A, pestalamide A, asperazine có khả năng ức chế sự nhân lên của HIV-1 trong tế bào C8166 với giá trị EC50lần lượt là 47.6, 64.2, 98.9 µM (chứng dương indinavir sulfate có giá trị EC50 là 5.5 nM). Pestalamide A còn có khả năng Trang 6
  16. HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP kháng nấm A. fumigatus với giá trị IC50 và MIC lần lượt là 1.5 và 57.8 µM (chứng [5] dương fluconazole có giá trị IC50 và MIC lần lượt là 7.35 và 163.4 µM). Năm 2009, nhóm nghiên cứu của Ling L. đã cô lập được pestaloficiol F-L (96- 102), các dẫn xuất isoprenyl chromone từ nấm Pestalotiopsis fici trên cây trà Camellia sinensis.[16] Pestaloficiol J thể hiện khả năng ức chế sự nhân lên của HIV-1 trong tế bào C8166 với giá trị EC50 là 8.0 µM (chứng dương indinavir sulfate có giá trị EC50 là 8.2 µM). Pestaloficiol L thể hiện hoạt tính gây độc tế bào với dòng tế bào HeLa và MCF7 với giá trị IC50 lần lượt là 8.7 và 17.4 µM (chứng dương 5-fluorouracil có giá trị IC50 lần lượt là 10.0 và 15.0 µM).[15] Pestaloficiol Q-S (103-105), các dẫn xuất isoprenyl chromone, cùng với anofinic acid, siccayne, pyrenophorol được cô lập bởi Shuchun và cộng sự, công bố năm 2013.[21] Siccayne thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với cả 2 dòng tế bào HeLa và HT29 với giá trị IC50 lần lượt là 48.2 và 33.9 µM (chứng dương 5-fluorouracil có giá [21] trị IC50 lần lượt là 8.0 và 12.0 µM). Ling L. và cộng sự cô lập được chloropestolide B-G (107-112), dechloromaldoxin (113) vào năm 2013.[15] Chloropestolide B có khả năng gây độc với cả 3 dòng tế bào CNE1-LMP1, A375, MCF-7 với giá trị IC50 lần lượt là 16.4, 9.9 và 23.6 µM (chứng dương [15] paclitaxel có giá trị IC50 lần lượt là 4.2, 8.9 và 0.14 nM). Nhóm nghiên cứu của Ling L. tiếp tục cô lập tiếp được pestalotriol A (114) và B (115) từ Pestalotiopsis fici cũng trên cây Trà Camellia sinensis. Pestalotriol B thể hiện hoạt tính yếu đối với dòng tế bào HeLa với giá trị IC50 là 87.0 µM (chứng dương cisplatin có giá trị IC50 là 7.4 µM). Trang 7
  17. HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 1.2.4.2. Thông la hán Podocarpus macrophyllus Cytosporin D và hai dẫn xuất isoprenyl epoxyquinol, pestaloquinol A - B (116- 117 được cô lập từ nấm nội sinh Pestalotiopsis sp. trên cây Podocaarpus macrophyllus bởi nhóm nghiên cứu của Gang Ding, công bố năm 2011.[7] Pestaloquinol B và cytosporin D thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng tế bào HeLa với giá trị IC50 là 8.8 µM (chứng dương VP-16 và D-24851 thể hiện giá [7] trị IC50 là 1.63 và 0.88 µM). MP [4-(3’,3’-dimethylallyloxy)-5-methyl-6-methoxyphthalide] (118) được cô lập từ nấm Pestalotiopsis photiniae ở cây Thông la hán Podocarpus macrophyllus bởi Chen . và Yang R. L. năm 2013.[3] Hợp chất này có khả năng ức chế sự nhân lên của dòng tế bào HeLa với giá trị [3] IC50 sau 24, 48, 72 giờ lần lượt là 36, 22, 13 µg/mL. 1.2.4.3. Cây Cau vua Roystonea regia Photinide A-F (119-124) với khung sườn benzofuranone γ-lactone cô lập từ loài nấm Pestalotiopsis photiniae trên cây cau vua Roystonea regia ở Trung Quốc bởi Ding G. và cộng sự, công bố năm 2009.[8] Các hợp chất này ở nồng độ 10 µg/mL đều thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng tế bào MDA-MB-231 với mức độ ức chế tế bào lần lượt là 24.4%, 24.2%, 23.1%, 24.4%, 24.6%. Tuy nhiên, ở cùng nồng độ, không có hợp chất nào thể hiện hoạt tính gây độc với dòng tế bào HeLa.[8] 1.2.4.4. Thông trắng Pinus armandii Năm 2014, Jin Xie và cộng sự đã cô lập được hai dẫn xuất của ambuic acid 1,2 (125-126) từ Pestalotiopsis sp. trên cây thông trắng Pinus armandii.[27] Trong đó hợp chất thứ nhất có khả năng gây độc yếu đối với 5 dòng tế bào ung thư, giá trị IC50 lần lượt là 18.99 µM (HL-60), 17.68 µM (SMMC-7721), 18.28 µM (A-549), 21.67 µM (MCF-7) và 12.27 µM (SW480).[27] Trang 8
  18. HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Bảng 1.1: Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm Hợp chất Vi khuẩn, nấm Pestalachloride A Nấm F. culmorum Pestalachloride B Nấm G. zeae Nấm Candida albicans (ATC 10231), Pestalazine A, Pestalamide A, asperazine Geotrichum candidum (AS2.498), và Aspergillus fumigatus (ATCC 10894). Pestalamide A Nấm A. fumigatu C. albicans (ATCC10231), G. candidum Pestalofone A – E (AS2.498) và A. fumigatus (ATCC10894). Nấm C. albicans và Cryptococcus Pestalolide neoformans. Pestalol B Vi khuẩn lao. Bảng 1.2: Hoạt tính kháng virus Hợp chất Hoạt tính Pestalazine A; Pestalamide A; asperazine; pestaloficiol J; Chloropestolide A; Ức chế sự nhân lên của virus HIV - 1 pestaloficiol A, B, D; pestalofone A, B, E. Pestaloxazine A, Vaccinal A. Kháng virus đường ruột EV71 Ức chế mạnh sự nhân lên của H3N2, -hydroxysterol H1N1 Trang 9
  19. HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Bảng 1.3: Hoạt tính gây độc tế bào Hợp chất Hoạt tính gây độc Pestalactam A – C, Dòng tế bào MCF – 7 và NFF. Photinide A – F Dòng tế bào MDA – MB – 231. Pestaloficiol L Dòng tế bào HeLa và MCF7. Siccayne Dòng tế bào HeLa và HT29. Chloropestolide A Dòng tế bào HeLa, HT29. Dòng tế bào CNE1 - LMP1, A375, Chloropestolide B MCF – 7. Dòng tế bào HeLa, A549, T24, MCF – Pestalotriol A – B 7 Pestaloquinol B, cytosporin D, Virgatolide Dòng tế bào HeLa. A-C Pestalamine A Dòng tế bào HeLa, MCF – 7, HepG2. Vaccinal A, vaccinol I Dòng tế bào COX – 2 Trang 10
  20. HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CÔNG THỨC CỦA CÁC HỢP CHẤT CÔ LẬP TỪ PESTALOTIOPSIS SP. H OH O OH O O Cl O Cl O HN H OH OH OH O Cl O OH OH Cl O H Cl Cl Pestalachloride B 2 Pestalachloride C 3 Pestalachloride A (1) ( ) ( ) RO RO O O O OH O OH OH OH OH O O O Pestaloficiol A (4) R=H Pestaloficiol B (5) R=H Pestaloficiol D (7) R=CH Pestaloficiol E 8 R=CH3 Pestaloficiol C (6) 3 ( ) O O O O O O O O O O C OH OH OH OH O OH HO O HO HO O O O OH OH COOCH3 O O O OH O COOCH OH 3 Pestalofone A (9) Pestalofone B (10) Pestalofone C (11) Pestalofone D (12) Pestalofone E (13) O O O HO HO HO NH Cl NH Cl NH OH OH O O O Pestalactam A (14) Pestalactam B (15) Pestalactam C (16) Hình 1.1: Các hợp chất cô lập từ nấm Pestalotiopsis Trang 11
  21. HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP HO HO HO OH O H O O O O Cl HO HO O O O O O O O O O oro sosu oc r n Guepinone (17) Isosulochrin (18) Chl i l h i (19) O O OH O OH O O O O O O OH Pestalotio rone D 22 Pestalotiopyrone A (20) Pestalotiopyrone C (21) py ( ) O O O O O O OH O O O O O Pestalotiop rone G 25 Pestalotiopyrone F (24) y ( ) Pestalotiopyrone E (23) O OH OH O O O O O HO O O Pestalotio isorin A 27 Pestalotiopyrone H (26) p ( ) OH O O R = Pestalotiollides A (28) R O OH O OH OH O O O R = Pestalotiollides B 29 Pestalotiopin A (30) HO ( ) OH Hình 1.1: Các hợp chất cô lập từ nấm Pestalotiopsis (tiếp) Trang 12
  22. HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP O H O N O NH2 OH O O O O amide Pestalotio amide B 32 amide Pestalotiopamide A (31) p ( ) O H O N OCH3 H O N OCH3 O O O O O amide Pestalotiopamide D (34) amide Pestalotiopamide C (33) O O O O O OH Nigrosporapyrone D (35) p-hydroxybenzaldehyde (36) HO O R1 R2 O 2 O R1 = R = Pestalotiopsone A (37) O O R1 = R2 = Pestalotiopsone B (38) O OH R1 = R2 = Pestalotiopsone C (39) O O 2 esta ot o sone R1 = R = P l i p D (40) OH O 2 = O Pestalot o sone E R1 = R i p (41) O OH O esta ot o sone R2 = P l i p F (42) R1 = O OH OH OH O O O O O HO O HO O O O O O O O O HO HO HO Virgatolide A (43) Virgatolide B (44) Virgatolide C (45) Hình 1.1: Các hợp chất cô lập từ nấm Pestalotiopsis (tiếp) Trang 13
  23. HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP O O O OH OH O O OH O R O HO O O O O OH O OH O O O Pestalotio rone I 46 R = CH2OH Pestalotiopyrone J (47) py ( ) Pestalotiopyrone L (49) R = CH2OCOCH3 Pestalotiopyrone K (48) OH OH OH OH O HO HO OH O O O O O OH OH Prenyl depside (50) Methylcoumarin (51-52) O O OH O OH O COOH OH O O HO O HO O O Chromone (55) Endocrocin 53 ( ) Pestalotiopyrone G (54) R1 R2 R3 R4 H H H H Cytosporin D (62) O Ac H H H C tos orin F 56 OH y p ( ) 4 2 R R Ac OH H H Cytosporin G (57) Ac H OH H Cytosporin H (58) O H Ac H H OH Cytosporin I (59) R3 OR1 H H OH H Cytosporin J (60) H H H OH Cytosporin K (61) OH O O O OH O NH2 O esta am ne P l i A (63) Hình 1.1: Các hợp chất cô lập từ nấm Pestalotiopsis (tiếp) Trang 14
  24. HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP OH OH OH O O O OH O O R1 R2 R1 = OH R2 = H Vaccinol C (66) Vaccinol A (64) Vaccinol B 65 ( ) R1 = H R2 = OH Vaccinol D (67) OH O OH O O H O OH R1 R2 OH R1 = OH R2 = H Vaccinol E (68) Vaccinol G (70) R1 = H R2 = OH Vaccinol F 69 ( ) OH O O OH OH OH O O O OH HO O O O OH OH X larinol A 74 Vaccinal A (71) Cladoacetal B (72) Cladoacetal A (73) y ( ) Agropyrenol (75) OH OH O O OH O O O OH COOH OH Vaccinol H (76) - 2-form l- -h drox hen l ro anoic acid 7 Vaccinol I (77) 3 ( y 3 y yp y )p p ( 8) OH HO O OH O OH H OH OH H Pestalols A 79 Pestalols B 80 ( ) ( ) Pestalol C (81) Hình 1.1: Các hợp chất cô lập từ nấm Pestalotiopsis (tiếp) Trang 15
  25. HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP HO OH O O OH O OSO3H O OH H OH H Pestalol D (82) Pestalol E (83) 4-hydroxyphenethyl 2-(4-hydroxyphenyl)acetate (84) H O O O O OH O O H O O Harzialactone A 85 Harzialactone F 86 3-hydroxy-3-methyllactone (87) ( ) ( ) O O O H H H H H H HN N N HN N N HN N N O H O H O H H N H N N H O H O N H O N N N N O H N O H O H Pestalazine A 88 Pestalazine B (89) Asperazine (90) ( ) O O O O O O O H2N HOOC N H2N H N R R HO R=O Pestalamide A (91) R=O Ar erni rin 94 Pestalamide C (93) p g ( ) R=NH Pestalamide B (92) R=NH Carbonarone (95) OH O O O O OH O OH O OH OH OH OH O O O O Pestaloficiol F (96) Pestaloficiol G (97) Pestaloficiol H (98) Pestaloficiol I (99) Hình 1.1: Các hợp chất cô lập từ nấm Pestalotiopsis (tiếp) Trang 16
  26. HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP O O OH O OH HO O OH OH O O H H O O O COOC 3 Pestaloficiol J (100) Pestaloficiol K 101 Pestaloficiol L (102) ( ) O HOOC OH O O O O O OH OH O OH O O OH OH O Pestaloficiol Q (103) Pestaloficiol R (104) Pestaloficiol S (105) Pyrenophorol (106) HO O HO HO O O OH O O O O O O HO O O O HO O O O O O C H Cl O O O C C OH H Cl Cl OH O O H O Cloropestolides C (108) Cloropestolides D (109) HO Cloropestolides B (107) OH OH OH O O O O O O O O O O O O O O O O O O Cl Cl Cl H H H H O O OH O HO OH HO OH O O O r t Chloro estolides G 112 Chloropestolides E (110) Chlo opes olides F (111) p ( ) Hình 1.1: Các hợp chất cô lập từ nấm Pestalotiopsis (tiếp) Trang 17
  27. HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP OH H OH O O O O O OH O O H O O OH OH O O Pestaloficiol A (114) Pestaloficiol B (115) O Dechloromaldoxin (113) HO HO O O OH O O OH O O O O O O O O O O H OH H n-C H OH 5 11 n-C5H11 Pestaloquinol B (117) Pestaloquinol A (116) Cl O O O O O n-C5H11 n-C5H11 O HO HO HO O O O (1) (2) COOH COOH MP (118) Dẫn xuất của acid ambumic 1,2 (125-126) O O OMe OR O O OR OH O O O OR O O OH O O O O O O OH O O OH O R = CH Photinide A (119) R = CH Photinide B (120) 3 3 Photinide E 123 Photinide F (124) ( ) R = H Photinide C (121) R = H Photinide D (122) Hình 1.1: Các hợp chất cô lập từ nấm Pestalotiopsis (tiếp) Trang 18
  28. HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ 2.1.1. Hóa chất Dung môi dung trong sắc ký cột và sắc ký điều chế, sắc ký lớp mỏng gồm: hexan, ethyl acetate, acetic acid, acetone, ethanol, methanol đều là hóa chất của hãng Chemsol-Việt Nam. Thuốc thử: để hiện hình các vết hữu cơ bằng sắc ký lớp mỏng bằng vanillin/H2SO4, đèn UV. Sắc ký cột thường dùng silica gel sắc ký cột 70-30, cỡ hạt: 0.04-0.06 mm xuất xứ Ấn Độ. 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ Các thiết bị dùng để ly trích (lọ thủy tinh, becher, bình lóng). Máy cô quay chân không Buchi-111 kèm bếp cách thủy Buchi 461 Water Bath. Cột sắc ký: cột cổ điển. Sắc ký lớp mỏng 25DC-Alufolien 20 x 20 cm Kiesel gel F254 Merck. Các thiết bị ghi phổ: Phổ 1H-NMR, 13C-NMR: Ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker ở tần số 500 MHz cho phổ 1H-NMR và 125 MHz cho phổ 13C-NMR. Tất cả phổ NMR được ghi tại: Phòng Phân Tích Trung Tâm Trường đại học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh. 2.2. NGUYÊN LIỆU Mẫu nấm Pestalotiopsis được cung cấp bởi thạc sĩ Trần Thị Minh Định – Khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm TP.HCM. Trang 19
  29. HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2.3. QUY TRÌNH THỰC HIỆN Từ 500.0 g sinh khối nấm, thực hiện phương pháp ngâm dầm trong ethanol ở nhiệt độ phòng, lấy được dịch cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất thấp thu được 19.2 g cao ethanol thô. Cao ethanol thô được hòa tan trong EtOH: H2O (9:1) thu được phần dung dịch DE (2.0 g) và phần tủa TE (18.0 g, tủa tan hoàn toàn trong nước). Lấy phần dung dịch DE thực hiện sắc kí cột với hệ dung môi H: EA: Ac: Me: AcOH với tỉ lệ thể tích 40: 6: 2: 1: 1 thu được các phân đoạn cao tương ứng là Et1 (201.0 mg), Et2 (196.0 mg), Et3 ( 405.0 mg), Et4 (361.0 mg) và Et5 (150.0 mg). Tiến hành sắc ký cột trên phần TE bằng hệ dung môi EA: Ac: Me: AcOH với tỉ lệ thể tích là 3: 1: 0.5: 0.5, thu được các phân đoạn cao tương ứng W1 (0.5 g), W2 (2.0 g), W3 (5.1 g) và W4 (6.1 g). 2.3.1. Sắc kí cột lên cao Et3 Cao Et3 (405.0 mg) được tiến hành sắc kí cột với hệ H: EA: Ac: Me: AcOH (40: 6: 2: 1: 1) thu được 5 phân đoạn Et3.1 (130.0 mg), Et3.2 (60.0 mg), Et3.3 (26.0 mg), Et3.4 (20.0 mg) và Et3.5 (40.0 mg). Thực hiện sắc kí lớp mỏng điều chế trên phân đoạn Et3.5 (40.0 mg) ta thu được 8.0 mg hợp chất Et35. 2.3.2. Sắc kí bản mỏng W1 Thực hiện sắc ký lớp mỏng điều chế trên phân đoạn W1 (0.5 gam) với hệ dung môi EA: Ac: Me: AcOH (3: 1: 0.5: 0.5), thu được 25.0 mg hợp chất EtA. Trang 20
  30. HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Cao EtOH thô (20.0 g) Phần dung dịch DE Phần tủa TE (tan trong nước) (2.0 g) (18.0 g) Hòa tan trong EtOH:H2O (9:1) CC/A CC/B Et1 Et2 Et3 Et4 Et5 W1 W3 (201.0 mg) (196.0 mg) (405.0 mg) (361.0 mg) (150.0 mg) W2 W4 (0.5 g) (2.0 g) (5.1 g) (6.1 g) CC/A pTLC/B EtA (25.0 mg) Et3.1 Et3.2 Et3.3 Et3.4 Et3.5 (130.0 mg) (60.0 mg) (26.0 mg) (20.0 mg) (40.0 mg) Hệ dung môi A H:EA:Ac:Me:AcOH 40:6:2:1:1 pTLC/A Hệ dung môi B EA:Ac:Me:AcOH 3:1:0.5:0.5 Et35 (8.0 mg) Sơ đồ 1: Quá trình ly trích và cô lập các hợp chất Trang 21
  31. HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT Et35 3.1.1. Đặc điểm hợp chất Et35 • Chất dầu không màu, hấp thụ UV (γ= 254 µm), cô lập từ phân đoạn Et3. • α 25 o [ ]D = -27.6 (c 0.17, MeOH). 1 13 • Dữ liệu phổ H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) (Phụ lục 1) và C-NMR (100MHz, DMSO-d6) (Phụ lục 2) được trình bày trong bảng 3.1. • Phổ HSQC được trình bày ở phụ lục 3. • Phổ HMBC được trình bày ở phụ lục 4 và phụ lục 5. 3.1.2. Biện luận cấu trúc hợp chất Et35 Phổ 1H-NMR cho thấy có hai proton nhóm -NH [ 9.18 (H, br); 7.73(1H, m)], năm proton nhân thơm [ 7.32 (2H, m); 7.24 (2H, m𝛿𝛿); 7.23 (H, m𝛿𝛿)], một proton nhóm methine [ 5.14 (H,𝛿𝛿 d, J= 3.5Hz)] có𝛿𝛿 tín hiệu dịch v𝛿𝛿ề từ trường thấp, một nhóm ethoxyl [ 3.98 (𝛿𝛿2H, q, J= 7.0Hz), 1.09 (3H, t, J= 7.5Hz)], một nhóm methyl tại 2.24 2 (3H, s) gắ𝛿𝛿n trên carbon sp . 𝛿𝛿 𝛿𝛿 Phổ 13C-NMR cho thấy có một nhóm carboxyl ester ( 165.2), một nhóm 3 carboxyl amide ( 152.2), một nhóm methine sp liên kết với nitrogen𝛿𝛿 tại 53.9. Proton H-𝛿𝛿2’’ và H-6’’ có tương quan HMBC với C-1’’ ( 145.0) và𝛿𝛿 C-4 ( 53.9) đồng thời H-4 cũng có tương quan HMBC với C-1’’, C-2’’ và C𝛿𝛿-6’’ ( 126.2), giúp𝛿𝛿 xác định sự liên kết giữa 2 nhân A và B tại C-4. 𝛿𝛿 Proton H-4 ( 5.14) có tương quan HMBC với các carbon C-5 ( 99.3), C-6 ( 148.3), C-1’ ( 165.4𝛿𝛿). Mặt khác, proton H3-4’ ( 2.24) cũng có tương quan𝛿𝛿 HMBC vớ𝛿𝛿i các carbon C-5𝛿𝛿 và C-6 đồng thời có tương quan xa𝛿𝛿 với C-1’ và C-4, từ đó xác định các vị trí nhóm thế trên nhân A. Proton H2-2’ có tương quan HMBC với C-1’, xác định sự liên kết giữa nhóm ethoxyl với C-1’. Trang 22
  32. HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Proton NH-1 tại 7.73 có tương quan HMBC với C-4 và C-5 và NH-3 tương quan với C-5 và C-4’, giúp𝛿𝛿 xác định các vị trí còn lại trên nhân A. Từ các dữ liệu trên, kết hợp và so sánh với dữ liệu phổ và năng lực triền quang α [ ]D của (R)-(-)-5-ethoxycarbonyl-6-methyl-4-phenyl-3,4-dihydropyrimidin-2(1H)- [10] α one , thấy dữ liệu phổ và năng lực triền quang [ ]D của (R)-(-)-5-ethoxycarbonyl-6- methyl-4-phenyl-3,4-dihydropyrimidin-2(1H)-one và Et35 có sự tương đồng, nên cấu trúc hợp chất Et35 được đề nghị như hình vẽ 3.1. HMBC 4'' 5'' 3'' B 6'' 2'' 3' O 1'' 2' 4 1' 5 O 3 NH A 2 6 1 N O 4' H Hình 3.1: Một số tương quan HMBC của hợp chất Et35 Trang 23
  33. HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Bảng 3.1: Dữ liệu phổ NMR của (R)-(-)-5-Ethoxycarbonyl -6-methyl-4-phenyl-3,4- dihydropyrimidin-2(1H)-one và Et35 trong DMSO-d6 (R)-(-)-5-ethoxycarbonyl-6-methyl-4- Et35 (DMSO-d6) phenyl-3,4-dihydropyrimidin-2(1H)- one (DMSO-d6) O N δH δC δH δC 1 9.18 (1H,s) 9.18 (1H,s) 2 152.7 152.2 3 7.73 (1H,s) 7.73 (1H,s) 4 5.14 (1H,s) 51.6 5.14 (1H,d) 53.9 5 97.7 99.3 6 148.6 148.3 1’ 165.3 165.4 2’ 3.97 (2H, q) 59.1 3.98 (2H, q) 59.2 3’ 1.09 (3H, t) 14.3 1.09 (3H, t) 14.1 4’ 2.20 (3H, s) 17.8 2.24 (3H, s) 17.8 1’’ 136.3 145.0 2’’- 6’’ 7.35 (2H, m) 126.4 7.32 (2H, m) 126.2 3’’- 5’’ 7.25 (2H, m) 127.4 7.24 (2H, m) 127.2 4’’ 7.15 (1H, m) 128.7 7.23 (1H, m) 128.4 Hợp chất Et35 đã được công bố là sản phẩm tổng hợp hữu cơ. Đây là lần đầu tiên hợp chất Et35 được tìm thấy trong tự nhiên. Trang 24
  34. HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 3.2. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT EtA 3.2.1. Đặc điểm hợp chất EtA • Chất bột màu trắng, hấp thụ UV (γ= 254 µm), cô lập từ phân đoạn W1. 1 13 • Dữ liệu phổ H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) (Phụ lục 6) và C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) (Phụ lục 7) được trình bày trong bảng 3.2. 3.3.2. Biện luận cấu trúc hợp chất EtA Phổ 1H-NMR cho thấy có 4 tín hiệu bao gồm: hai proton gắn với dị tố tại δ 10.98, hai proton nhân thơm tại δ 7.39 (1H, d, J=7.5Hz) và δ 5.44 (1H, d, J=7.5Hz). Phổ 13C-NMR cho thấy 4 tín hiệu carbon, bao gồm hai carbon liên kết với oxygen tại δ 164.7 và δ 151.4, hai carbon nhân thơm tại δ 142.2 và δ 100.2. Từ những dữ kiện phổ trên, kết hợp với so sánh dữ liệu phổ của uracil[9], thấy dữ liệu phổ của uracil và EtA có sự tương đồng, nên cấu trúc của hợp chất EtA được xác định là uracil như hình vẽ 3.2. OH 4 H 3 5 N 2 6 1 H N OH Hình 3.2: Cấu trúc đề nghị của hợp chất EtA Trang 25
  35. HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Bảng 3.2: Dữ liệu phổ NMR của Uracil và EtA Uracil (DMSO-d6) EtA (DMSO-d6) N δH δC N δH δC 1 10.82 1 2 152.3 2 151.4 3 11.02 3 4 165.1 4 164.7 5 5.47 (d, 7.5Hz) 101.0 5 5.44 (d, 7.5Hz) 100.2 6 7.41 (dd,7.5Hz, 142.9 6 7.39 (d, 7.5Hz) 142.2 5.7 Hz) Trang 26
  36. HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – ĐỀ XUẤT 4.1. KẾT LUẬN Từ mẫu sinh khối nấm Pestalotiopsis đã tiến hành điều chế được cao ethanol thô. Cao ethanol thô được hòa tan vào dung dịch EtOH: H2O (9: 1) thu được hai phần: phần tan trong dung dịch DE và phần tủa TE. Thực hiện các phương pháp sắc kí trên phần DE và TE thu được 2 hợp chất Et35 và EtA. Sử dụng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo xác định được cấu trúc của hai hợp chất hữu cơ Et35 và EtA đã cô lập được, trong đó hợp chất Et35 là sản phẩm tổng hợp, lần đầu tiên được tìm thấy trong tự nhiên. OH O H 4 N 5 O 3 NH 2 H N OH 6 1 N O H Uracil (R)-(-)-5-ethoxycarbonyl-6-methyl-4-phenyl -3,4-dihydropyrimidin-2(1H)-one Hình 4.1: Hai hợp chất cô lập được trong nấm Pestalotiopsis 4.2. ĐỀ XUẤT Vì điều kiện về thời gian và vật chất không cho phép, nên trong phạm vi của đề tài này, chúng tôi chỉ khảo sát trên phân đoạn cao Et3 và W1. Trong thời gian sắp tới, nếu có điều kiện chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát trên các phân đoạn cao còn lại. Đồng thời chúng tôi sẽ tiến hành thử nghiệm một số hoạt tính sinh học ở các loại cao và hợp chất đã cô lập được. Trang 27
  37. HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Akone S. H., Amrani M. E., Lin W., Lai D., Proksch P., Cytosporins F-K, new epoxyquinols from the endophytic fungus Pestalotiopsis theae, Tet. Lett., 54, 6751-6754, 2013. [2] Beekman A. M., Barrow R. A., Stereochemical assignment of the fungal metabolites pestalotiopsones D and E through entiopure synthesis, J. Nat. Prod., 76, 2054-2059, 2013. [3] Chen C., Yang R. L., A phthalide derivative isolated from endophytic fungi Pestalotiopsis photniae induces G1 cell cycle arrest and apoptosis in human HeLa cells, Braz. J. Med. Bio. Res., 46, 643-649, 2013. [4] Davis R. A., Carrol A. R., Andrews K. T., Boyle G. M., Tran T. L., Healy P. C., Kalaitzis J. A., Shivas R. G., Pestalactams A-C: novel caprolactams from the endophytic fungus Pestalotiopsis sp., Org. Biomol. Chem., 8, 1785-1790, 2010. [5] Ding G., Jiang L., Guo L., Chen X., Zhang H., Che Y., Pestalazines and pestalamides, bioactive metabolites from the plant pathogenic fungus Pestalotiopsis theae, J. Nat. Prod., 71, 1861-1865, 2008. [6] Ding G., Li Y., Fu S., Liu S., Wei J., Che Y., Ambuic acid and torreyanic acid derivatives from the endolichenic fungus Pestalotiopsis sp., J. Nat. Prod., 72, 182-186, 2009. [7] Ding G., Zhang F., Chen H., Guo L., Zou Z., Che Y., Pestaloquinols A and B, isoprenylated epoxyquinols from Pestalotiopsis sp., J. Nat. Prod., 74, 286-291, 2011. [8] Ding G., Zheng Z ., Liu S., Zhang H., Guo L., Che Y., Photinides A-F, cytotoxic benzofuranone-derived γ-lactone from the plant endophytic fungus Pestalotiopsis photiniae, J. Nat. Prod., 72, 942-945, 2009. [9] Erno P., Martin B., Philippe B., Structure Determination of Organic Compounds, th 4 , Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2009, 150 – 237. Trang 28
  38. HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP [10] Huang Y., Yang F., Zhu C., Highly Enantioseletive Biginelli Reaction Using a New Chiral Ytterbium Catalyst: Asymmetric Synthesis of Dihydropyrimidines, 2005. [11] Hwang I. H., Swenson D. C., Gloer J. B., Wicklow D. T., Pestaloporonins: Caryophylllene-Derived sesquiterpenoids from a fungicolous isolate of Pestalotiopsis sp., Org. Lett., 17, 4284-4287, 2015. [12] Jia Y.-L., Wei M.-Y., Chen H.-Y., Guan F.-F., Wang C.-Y., Shao C.-L., (+)- and (-)-Pestaloxazine A, a pair of antiviral enantiomeric alkaloid dimers with a symmetric spiro[oxazinane-piperazinedione] skeleton from Pestalotiopsis sp., Org. Lett., 17, 4216- 4219, 2015. [13] Klaiklay S., Rukachaisirikul V., Tadpetch K., Sukpondma Y., Phongpaichit S., Buatong J., Sakayaroj J., Chlorinated chromone and diphenyl ether derivatives from the mangrove-derived fungus Pestalotiopsis sp. PSU-MA69, Tetrahedron, 68, 2299-2305, 2011. [14] Li J., Li L., Si Y., Jiang X., Guo L., Che Y., Virgatolides A-C, benzannulated spiroketals from the plant endophytic fungus Pestalotiopsis virgatula, Org. Lett., 13(10), 2670-2673, 2011. [15] Liu L., Li Y., Li L., Cao Y., Guo L., Liu G., Che Y., Spiroketals of Pestalotiopsis fici provide evidence for a biosynthetic hypothesis involving diversified Diels-Alder reaction cascades, J. Org. Chem., 78, 2992-3000, 2013. [16] Liu L., Liu S., Niu S., Guo L., Chen X., Che Y., Isoprenylated chromone derivatives from the plant endophytic fungus Pestalotiopsis fici, J. Nat. Prod., 72, 1482- 1486, 2009. [17] Liu L., Tian R., Liu S., Chen X., Guo L., Che Y., Chloropestolide A, an antitumor metabolite with an unprecedented spiroketal skeleton from Pestalotiopsis fici, Org. Lett., 11, 2836-2839, 2009. [18] Liu L., Tian R., Liu S., Chen X., Guo L., Che Y., from Pestalotiopsis fici, Org. Lett., 10, 1397-1400, 2008. Trang 29
  39. HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP [19] Liu L., Tian R., Liu S., Chen X., Guo L., Che Y., Pestaloficiols A-E, bioactive cyclopropane derivatives from the plant endophytic fungus Pestalotiopsis fici, Bioorg. & Med. Chem., 16, 6021-6026, 2008. [20] Liu L., Tian R., Liu S., Chen X., Guo L., Che Y., Pestalofones A-E, bioactive cyclohexanone derivatives from the plant endophytic fungus Pestalotiopsis fici, Bioorg. & Med. Chem., 17, 606-613, 2009. [21] Liu S., Guo L., Che Y., Liu L., Pestaloficiol Q-S from the plant endophytic fungus Pestalotiopsis fici, Fitoterapia, 85, 114-118, 2013. [22] Oliveira M. N., Santos L. S., Guilhon G. M. S. P., Santos A. S., Ferreira I. C. S., Lopes-Junior M. L., Arruda M. S. P., Marinho A. M. R., Silva M. N., Rodrigues-Filho E., Oliveira M. C. F., Novel anthraquinone derivatives produced by Pestalotiopsis guepinii, an endophytic of the medicinal plant Virola mechelii (Myristicaceae), J. Braz. Chem. Soc., 22(5), 993-996, 2011. [23] Ronsberg D., Debbab A., Mandi A., Wray V., Dai H., Kurtan T., Proksch P., Aly A. H., Secondary metabolites from the endophytic fungus Pestalotiopsis virgatula isolated from the mangrove plant Sonneratica caseolaris, Tet. Lett., 54, 3256-3259, 2013. [24] Sun J.-S., Lin X., Zhou X.-F., Wan J., Zhang T., Yang B., Yang X.-W., Tu Z., Liu Y., Pestalols A-E, new alkenyl phenol and benzaldehyde derivatives from the endophytic fungus Pestalotiopsis sp. AcBC2 isolated from the Chinese mangrove plant Aegiceras corniculatum, The Journal of Antibiotics, 67, 451-467, 67, 2014. [25] Wang J., Wei X., Lu X., Xu F., Wan J., Lin X., Zhou X., Liao S., Yang B., Tu Z., Liu Y., Eight new polyketide metabolites from the fungus Pestalotiopsis vaccinii endogenous with the mangrove Kandelia candel (L.) Druce, Tetrahedron, 70, 9695-9701, 2014. [26] Wang J., Wei X., Quin X., Chen H., Lin X., Zang T., Wang X., Liao S., Yang B., Liu J., Zhou X., Tu Z., Liu Y., Two new prenylated phenols endogenous fungus Trang 30
  40. HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Pestalotiopsis vaccinii of mangrove plant Kandelia candel (L.) Druce, Phytochem. Lett., 12, 59-62, 2015. [27] Xie J., Li J., Yang Y.-H., Chen Y.-H., Zhao P.-J., Two new ambuic acid analogs from Pestalotiopsis sp. cr013, Phytochem. Lett., 10, 291-294, 2014. [28] Xu J., Aly A. H., Wray V., Proksch P., Polyketide derivatives of endophytic fungus Pestalotiopsis sp. isolated from the Chinese mangrove plant Rhizophora mucronata, Tet. lett., 52, 21-25, 2011. [29] Xu J., Kjer J., Sendker J., Victor W., Guan H., Edrada R., Lin W., Wu J., Proksch P Chromones from the endophytic fungus Pestalotiopsis sp. isolated from the Chinese mangrove plant Rhizophora mucronata, J. Nat. Prod., 72, 662-665, 2009. [30] Xu J., Kjer J., Sendker J., Victor W., Guan H., Edrada R., Muller W. E. G., Bayer M., Lin W., Wu J., Proksch P., Cytosporones, coumarins, and an alkaloid from the endophytic fungus Pestalotiopsis sp. isolated from the Chinese mangrove plant Rhizophora mucronata, Bioorg. & Med. Chem., 17, 7362-7367, 2009. [31] Xu J., Lin Q., Wang B., Wray V., Lin W.-H., Proksch P., Pestalotiopamide E, a new amide from the endophytic fungus Pestalotiopsis sp., J. A. Nat. Prod. Res., 13(4), 372-376, 2011. [32] Yang X.-L., Awakawa T., Wakimoto T., Abe I., Induced production of novel prenyldepside and coumarins in endophytic fungi Pesta lotiopsis acaciae, Tet. Lett., 54, 5814-5817, 2013. [33] Zhou X., Lin X., Ma W., Fang W., Chen Z., Yang B., A new aromatic amine from fungus Pestalotiopsis vaccinii, Phytochem. Lett., 7, 35-37, 2014. Trang 31
  41. PHỤ LỤC
  42. 4'' 5'' 3'' 6'' 2'' 3' O 1'' 2' 4 1' 5 4’ O 3 NH 2 6 1 N O 3’ 4' H 2’’-6’’ 2’ 4 1 2 Phụ lục 1. Phổ 1H-NMR của hợp chất Et35
  43. 4'' 5'' 3'' 6'' 2'' 3' O 1'' 2' 4 1' 5 O 3 NH 2’ 3’ 2 6 1 N O 2’’-6’’ 4' H 4 4’ 6 5 1’ 1’’ 2 Phụ lục 2. Phổ 13C-NMR của hợp chất Et35
  44. 4’ 3’ 2’ 2’’-6’’ 1 2 4 3’ 4’ 4 2’ 5 4'' 2’’-6’’ 5'' 3'' 1’’ 6 6'' 2'' 2 3' O 1'' 1’ 2' 4 1' 5 O 3 NH 2 6 1 N O 4' H Phụ lục 3. Phổ HSQC của hợp chất Et35
  45. 4’ 3’ 2’’-6’’ 2’ 1 2 4 3’ 4’ 4 2’ 5 2’’-6’’ 4'' 1’’ 5'' 3'' 6 2 6'' 2'' 3' O 1’ 1'' 2' 4 1' 5 O 3 NH 2 6 1 N O 4' H Phụ lục 4. Phổ HMBC của hợp chất Et35
  46. 4’ 3’ 2’ 2’’-6’’ 4 1 2 3’ 4’ 4 2’ 4'' 5'' 3'' 5 6'' 2'' 3' O 1'' 2’’-6’’ 2' 4 1' 5 O 3 NH 1’’ 2 6 6 1 N O 2 4' H 1’ Phụ lục 5. Phổ HMBC dãn rộng của hợp chất Et35
  47. ETA-DMSO-1H OH 4 H 3 5 N 2 6 OH H N1 5 6 Phụ lục 6. Phổ 1H-NMR của hợp chất EtA
  48. OH 4 H 3 5 N 2 6 OH H N1 5 6 4 2 Phụ lục 7. Phổ 13C-NMR của hợp chất EtA