›

Khóa luận Góp phần nghiên cứu thành phần saponin của bộ phận lá của Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidius Seem.)

pdf 66 trang thiennha21 18/04/2022 3990
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Góp phần nghiên cứu thành phần saponin của bộ phận lá của Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidius Seem.)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfgop_phan_nghien_cuu_thanh_phan_saponin_cua_bo_phan_la_cua_sa.pdf

Nội dung text: Khóa luận Góp phần nghiên cứu thành phần saponin của bộ phận lá của Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidius Seem.)

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN ANH ĐỨC GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN SAPONIN CỦA BỘ PHẬN LÁ CỦA SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidius Seem.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà nội 2020
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN ANH ĐỨC GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN SAPONIN CỦA BỘ PHẬN LÁ CỦA SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidius Seem.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa: QH.2015.Y Người hướng dẫn 1: PGS.TS. NGUYỄN HỮU TÙNG Người hướng dẫn 2: ThS. NGUYỄN THỊ HOÀNG ANH Hà Nội-2020
  3. LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ vô cùng quý báu của thầy cô giáo của Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội cùng với gia đình và bạn bè. Trước hết, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới ThS. Nguyễn Thị Hoàng Anh - Khoa Y Dược Đại học Quốc gia Hà Nội và PGS. TS Nguyễn Hữu Tùng – Khoa Dược, Đại học Phenikaa; những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo tận tình, tạo điều kiện và đóng góp ý kiến cho tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu. Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban chủ nhiệm Khoa, các thầy cô trong Khoa Y Dược đặc biệt là Bộ môn Hóa Dược và Kiểm nghiệm thuốc đã luôn tạo điều kiện cho em hoàn thành khóa luận này. Lời cuối cùng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh, động viên, ủng hộ em trong suốt quá trình học tập và đạt được kết quả như ngày hôm nay. Hà Nội, ngày 22 tháng 05 năm 2020 Sinh viên Nguyễn Anh Đức
  4. MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3 1.1.Tổng quan về Sâm vũ diệp 3 1.1.1. Tên khoa học, tên đồng danh 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật 3 1.1.3. Phân bố và sinh thái 4 1.1.4. Thành phần hóa học 5 1.1.5. Tính vị, công năng 12 1.1.6. Công dụng 12 1.1.7. Tác dụng dược lý 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1. Đối tượng nghiên cứu 14 2.2. Thiết bị, dụng cụ 14 2.4. Phương pháp nghiên cứu 15 2.4.1. Phương pháp xử lý mẫu và chiết xuất 15 2.4.2. Phương pháp phân lập các hợp chất hóa học 15 2.4.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất được phân lập 16 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 17 3.1. Chiết xuất và phân lập các hợp chất tinh khiết 17 3.2. Đặc điểm vật lý và dữ liệu phổ của araloside A phân lập được 18 3.3. Biện giải cấu trúc của saponin stipuleanosid phân lập được: 24 3.4. Bàn luận 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 28
  5. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT BuOH n-butanol 13C-NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13) DAD Diode array detector (Detector mảng diod) DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer ĐHQGHN Đại học Quốc gia Hà Nội ESI-MS Eletrospray Ionization Mass Spectroscopy EtOH Ethanol EtOAc Ethyl acetat 1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) HPLC High performace liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) MeOH Methanol MS Mass spectrum (Phổ khối) NMR Nuclear Magetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân) P. Panax SKLM Sắc ký lớp mỏng Rha α-ʟ-rhamnopyranosyl v/v Thể tích/ thể tích
  6. DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU STT Tên bảng Trang 1 Bảng 1.1. Axit béo trong SVD 9 2 Bảng 1.2. Axit amin trong SVD 10 3 Bảng 1.3. Nguyên tố đa lượng và vi lượng 10 4 Bảng 3.1. Dữ liệu phổ 1H, 13C, DEPT phần aglycon của 20 chất F223 5 Bảng 3.2. Dữ liệu phổ 1H, 13C, DEPT phần đường của chất 22 F223
  7. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ STT Tên hình Trang 1 Hình 1.1. Hình ảnh cây Sâm vũ diệp 3 2 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của 10 saponin được tách 7 từ rễ SVD 3 Hình 2.1. Mẫu lá SVD (Panax bipinnatifidus Seem.) 13 thu hái tại Sapa, Lào Cai 4 Hình 3.1. Quá trình chiết lá SVD ban đầu 16 5 Hình 3.2. Quá trình tách hợp chất chính aralosid A từ 17 phân đoạn BuOH 6 Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của aralosid A phân lập 18 được. 7 Hình 3.4. Phổ IR của aralosid A phân lập được 19 8 Hình 3.5. Phổ ESI-MS của aralosid A phân lập được 20 9 Hình 3.6. Dữ liệu nhóm chức CH3 trong phân tử dựa 23 trên phổ 13C và DEPT 10 Hình 3.7. Dữ liệu carbon mang nối đôi, nhóm chức 24 carbonyl và dữ liệu carbon trong vùng 60-100 ppm. 11 Hình 3.8. Dữ liệu HMBC thể hiện tương quan giữa các 25 phân tử trong đường 12 Hình 3.9. Dữ liệu HMBC chỉ ra mối quan hệ giữa các 26 đường và phần aglycon 13 Hình 3.10. Cấu trúc hóa học của saponin phân lập 26 được, aralosid A.
  8. ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, xu hướng sử dụng các sản phẩm chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc tự nhiên ngày càng tăng. Từ xu hướng đó, các dược liệu quý trong nước cũng như trên thế giới trở thành mục tiêu cho việc nghiên cứu, tìm kiếm, khai thác nguồn tài nguyên này. Việt Nam là một quốc gia có nguồn tài nguyên dược liệu phong phú với trên 5000 loài thực vật có khả năng được sử dụng làm thuốc. Tuy nhiên trên thực tế các loài thảo dược này chỉ được sử dụng trực tiếp hoặc dưới dạng nguyên liệu thô thông qua một số phương pháp sơ chế đơn giản, điều này khiến cho giá trị các loài thảo dược này chưa được phát huy hết tác dụng. Một trong số đó phải kể đến sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) là một dược liệu quý của vùng Dược liệu Tây Bắc được sử dụng trong các bài thuốc cổ truyền có tiềm năng để phát triển thành sản phẩm chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc tự nhiên. Các kết quả nghiên cứu công bố gần đây khẳng định phần thân rễ Sâm vũ diệp chứa nhiều saponin có giá trị. Tuy nhiên liên hệ với loài Panax nổi tiếng khác như nhân sâm (P. ginseng), tam thất (P. notoginseng) cho thấy các bộ phận khác của cây bao gồm thân, lá và hoa đều giàu hoạt chất saponin không kém phần thân rễ. Bên cạnh đấy, phần thân lá của các loài trên cũng được sử dụng trong y học giống như phần dưới mặt đất của chúng. Hơn nữa, lá và hoa là bộ phận tái sinh cùng với quá trình sinh trưởng của Sâm vũ diệp. Nếu thành phần hoạt chất trong phần thân, lá Sâm vũ diệp có sự tương đồng với thành phần hoạt chất trong phần thân rễ của cây thì trong tương lai chúng ta có khả năng sử dụng phần trên mặt đất làm dược liệu thay thế cho phần thân rễ Sâm vũ diệp. Trên cơ sở đó, kế thừa và phát triển tiếp nghiên cứu về đối tượng Sâm vũ diệp, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “ Góp phần nghiên cứu thành phần Saponin của bộ phận lá của Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidius Seem.)”. Nội dung KLTN này là một phần trong đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) ở Việt Nam” 1
  9. (Mã số: B2019_BKA.02 (2019-2020); CNĐT: PGS TS Vũ Đình Hoàng và TKĐT: PGS TS Nguyễn Hữu Tùng), đề tài nghiên cứu khoa học cấp bộ, Bộ Giáo dục và Đào tạo. Mục tiêu của đề tài: Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của hợp chất phân lập được. 2
  10. CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về Sâm vũ diệp 1.1.1. Tên khoa học, tên đồng danh Sâm vũ diệp là một loài thực vật thuộc chi Panax, họ Araliaceae được Seem. miêu tả lần đầu tiên vào năm 1868. SVD còn có những tên gọi khác như Tam thất lá xẻ, Vũ diệp tam thất, Sâm hai lần xẻ, Phan xiết (Dao), Hoàng liên thất, Nữu tử thất, Tam thất lá lông chim, Hương sơn tam thất (Trung Quốc), Hoa diệp tam thất, Trúc tiết nhân sâm. [1,3] Ngoài tên khoa học cho loài là Panax bipinnatifidus (Seem.) Sâm Vũ Diệp còn có những tên đồng danh khác như Aralia bipinnatifida (Seem.) C.B.Clarke; Aralia quinquefolia (L.) Dec. et Plan. var. major Burk; Aralia quinquefolia (L.) Dec. et Plan. var. elegantior Burk; Panax pseudoginseng Wall. var. bipinnatifidus (Seem.) Li; Panax pseudoginseng Wall. var. major (Burk.) Li; Panax major Ting ex Pei; Panax pseudoginseng Wall. Spp. himalaicus Hara; Panax pseudoginseng Wall. var. elegantior (Burk) Hoo et Tseng; Panax japonicas Mey. var. bipinnatifidus (Seem.) Wu et Feng. [1,3] 1.1.2. Đặc điểm thực vật Cây thân thảo sống lâu năm, cao 0,3- 0,5 m. Rễ củ dài, vặn vẹo, có nhiều đốt và những vết sẹo to do thân cây rụng để lại, đầu rễ có hình con quay. Thân khí sinh mảnh, thường đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa, có vạch dọc, cao 20-30 cm. Lá kép chân vịt gồm 2-3 cái mọc vòng. Lá chét 5-7 (ít khi 3) thuôn, dài 2,5- 14 cm, rộng 1,5- 4 cm, gốc tròn, đầu thuôn thành mũi nhọn, xẻ thùy lông chim không đều, mép khía răng, có lông. Cụm hoa tán đơn mọc ở ngọn, hoa màu trắng đục; 5 cánh hoa; 5 nhị; bầu 2- 3 ô. Quả mọng, hình cầu hơi dẹt, màu đỏ khi chín, có châm đen to ở đầu, chứa 1-2 hạt. Hạt hình cầu hoặc gần cầu, màu xám trắng; vỏ cứng, có rốn hạt. [1,3] 3
  11. Hình 1.1. Hình ảnh Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) 1.1.3. Phân bố và sinh thái Sâm vũ diệp loài sâm mọc hoang dại được phát hiện vào năm 1868. Trên thế giới cây phân bố ở Trung Quốc, Ấn Độ, Nepal (vùng cận Hymalaya). Tại Việt Nam SVD được phân bố ở khu vực núi Hoàng Liên Sơn ở độ cao trên 1600m. Năm 1973, cây được phát hiện ngay ở núi Hàm Rồng, sát thị trấn Sapa, ở độ cao 1600m. Hiện nay vùng phân bố của sâm vũ diệp bị thu hẹp dần ở độ cao khoảng 1800m trở lên, cây được coi là cực hiếm. Gần đây Sâm vũ diệp bước đầu được trồng thử ở Hà Giang và Lào Cai. [1,3] Sâm vũ diệp đặc biệt ưa bóng và đặc biệt ưa ẩm, mọc rải rác hay tập trung dưới tán rừng ẩm kín thường xanh núi cao. Quần hệ rừng nơi có Sâm vũ diệp được xác định là rừng thường xanh mưa ẩm nhiệt đới trên cao. Cây gieo giống tự nhiên từ hạt. Mùa hoa tháng 4-5, quả xanh cuối tháng 4-6, quả chín tháng 7. Quả chín thường rơi xuống gốc mẹ, tuy nhiên do tháng 7 rơi vào thời kỳ có lượng mưa lớn nên có thể bị cuốn trôi ảnh hưởng đến khả năng tái sinh tự nhiên của Sâm Vũ Diệp. Quả chín chim thường ăn (bỏ hạt), hạt rơi xuống lại bị một loại sóc nâu nhỏ ăn nhân hạt. Thân rễ bị gãy hoặc khai thác mất phần già, phần đầu thân rễ (có chồi ngủ) còn lại vẫn có khả năng tái sinh. Toàn bộ phần thân mang lá tàn lụi vào mùa đông, đến đầu mùa xuân năm sau từ đầu mầm thân rễ sẽ mọc lên các chồi thân mới. [8] 4
  12. 1.1.4. Thành phần hóa học Ở Việt Nam và trên thế giới có rất ít tài liệu nghiên cứu về thành phần hóa học của SVD. Các bài báo nghiên cứu bước đầu cho thấy saponin là thành phần hóa học chính của SVD, trong đó khung oleanan với hàm lượng tương đối cao cùng một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp hơn. a. Saponin Năm 1989, nhóm nghiên cứu Trung Quốc công bố phân lập 13 saponin từ lá khô của cây Panax japonicus var. bipinnatifidus (Seem.) Wu et Feng thu hái ở dải núi Tần Lĩnh, Thiểm Tây, Trung Quốc trong đó bao gồm 2 saponin mới là bipinnatifidusosid F1, F2 và 11 saponin đã biết được xác định là ginsenosid F1, F2, F3, Rg2, Re, Rd, Rb1, Rb3, 24(S)-pseudoginsenosid F11, panasenosid và majorosid F1. [11,12] Tên R1 R2 Ginsenoside Rb1 Glc(2→1)Glc Glc(6→1)Glc Ginsenoside Rd Glc(2→1)Glc Glc Ginsenoside Rb3 Glc(2→1)Glc Glc(6→1)Xyl 5
  13. Tên R1 R2 R3 Ginsenoside Re H Glc(2→1)Rha Glc Ginsenoside Rg2 H Glc(2→1)Rha H Ginsenoside F3 H H Glc(6→1)Ara(p) Ginsenoside F1 H H Glc R= Glc (2→1)Rha (24S) 24(S)-pseudoginsenosid F11 6
  14. Ginsenosid F2 Majorosid F1 Rễ Sâm vũ diệp chứa saponin thuộc nhóm oleanan gồm những chất như chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginsenosid Ro, Rb1, Rd, Re, Rg1 và Rg2.[1,3] Nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc năm 2011, phân lập một nhóm 10 saponin khung oleanan (1-10) từ dịch chiết methanol của rễ SVD thu hái ở núi Hoàng Liên Sơn, Việt Nam, trong đó có 3 chất mới bifinosid A-C (1-3) và bảy hợp chất được biết bao gồm narcissiflorin methyl este (4), chikusetsusaponin IVa (5), pseudoginsenosid RP1 methyl este (6), stipuleanosid R1 (7), pseudoginsenosid RT1 methyl este (8), momordin IIe (9) và stipuleanosid R2 methyl ester (10). [10] 7
  15. Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của 10 saponin được tách từ rễ SVD [5] Chất R1 R2 R3 R4 R5 1 Ara(p) H H Me H 2 H Xyl (1→6) H Me H 3 Xyl Ara(p) H Me GlcA 4 Ara(p) H Ara(p) Me H 5 Ara(p) H H Me GlcA 6 Xyl H H Me H 7 H Glc Ara(f) H H 8 Xyl H H Me GlcA 9 Xyl Ara(p) H H GlcA 10 H Glc Ara(f) Me GlcA Me : Methyl Ara(f) : α-L-arabinofuranosyl Ara(p) : α-L-arabinopuranosyl Glc : β-D-glucopyranosyl Xyl : β-D-xylopyranosyl GlcA β-D-glucuronopyranosyl 8
  16. Năm 2017, Đỗ Văn Hào và cộng sự đã xác định được axít oleanolic và daucosterol. Sử dụng phương pháp HPLC- DAD định lượng axít oleanolic cho thấy hàm lượng axít oleanolic trong cao Sâm vũ diệp và rễ Sâm vũ diệp lần lượt là: 0,034% và 0,0066% tương đương với 340 μg/g và 66 μg/g; hàm lượng saponin trong cao Sâm vũ diệp và dược liệu SVD lần lượt là 0,364% và 0,0698% tương đương 3640 µg/g và 698 μg/g. [1] axit oleanolic daucosterol Nguyễn Thị Thu Thủy năm 2018, đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học 2 hợp chất saponin mới từ phân đoạn n-butanol của thân rễ Sâm vũ diệp thu hái tại Sapa, đó là stipuleanosid R2, aralosid A methyl ester, trong đó hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu SVD là 0,49%. Đây là 2 hợp chất lần đầu được tìm thấy của cây này tại Việt Nam. [2] 9
  17. Stipuleanosid R2 Aralosid A methyl ester b. Steroid [6] β-sitosterol c. Lipit [6] + Xác định hàm lượng lipit thô Kết quả cho thấy hàm lượng lipit thô trong Sâm vũ diệp là 5,86% + Axit béo 10
  18. Bảng 1.1. Axit béo trong SVD STT (Số carbon: Số Tên axit béo Hàm lượng (% so liên kết đôi) với dịch tổng) 1 (16:0) Axit palmitic 9,38 2 (18:0) Axit steraric 3,2 3 (18:1) Axit oleic 32,23 4 (18:2) Axit linoleic 5,78 5 (18:3) Axit limolenic 4,37 6 (24:0) Axit lignoceric 35,92 7 Cx Chưa biết 9,12 d. Acid amin [6] Bảng 1.2. Axit amin trong SVD STT Axit amin % Axit amin tự do 1 Aspartic acid + glutamic acid 0,13 2 Glycin 0,01 3 Arginin 0,04 4 Threonin + alanin 0,05 5 Isoleucin + leucin 0,34 e. Nguyên tố đa lượng và vi lượng [6] Bảng 1.3. Nguyên tố đa lượng và vi lượng STT Nguyên tố Phần trăm (so với dược liệu khô) 1 Al 0,05 2 Si 0,02 3 Mg 1 11
  19. 4 Ca >1 5 Ba 0,02 6 Fe 0,03 7 Mn 0,015 8 Ti 0,02 9 Ni 0,0001 10 Cu 0,0015 11 Pb 0,0001 12 P 0,2 13 Na 0,1 f. Polyacetylen [6] Ở Việt Nam, nghiên cứu về thành phần hóa học của SVD còn khá mới mẻ. Trong nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự năm 2009, kết quả định tính sơ bộ cho thấy trong thân rễ và rễ củ SVD có chứa hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin. 1.1.5. Tính vị, công năng Sâm vũ diệp có vị đắng, ngọt, tính hơi ấm, có tác dụng dưỡng huyết, hoạt lạc, chỉ huyết tán ứ. [1,3] 1.1.6. Công dụng Theo kinh nghiệm nhân dân, Sâm vũ diệp được làm thuốc bổ huyết nhất là cho phụ nữ sau khi đẻ và người cao tuổi. Cách dùng: rễ thái mỏng, phơi khô, sắc nước nóng, hoặc ninh với chân giò, hoặc tán bột hầm với thịt gà. Sâm vũ diệp còn được dùng cầm máu, tán ứ tiêu sưng. Khi dùng ngoài, rễ phơi khô tán bột mịn, rắc chữa chảy máu và làm vết thương mau lành. Rễ Sâm vũ diệp còn được ngâm rượu rồi chiết dưới dạng tinh sâm dùng rất tốt, lại có kích thích sinh dục. Ngoài ra, nhân dân còn tận dụng cả thân và lá để nấu cao. Cao này pha với nước hoặc rượu để uống cũng có tác dụng như 12
  20. rễ. Ở Trung Quốc, Sâm vũ diệp là thuốc chữa hư lao, thổ huyết, chảy máu cam, đòn ngã tổn thương. [1,3] 1.1.7. Tác dụng dược lý Trên thế giới có rất ít các nghiên cứu liên quan đến tác dụng dược lý của Sâm Vũ Diệp. Theo như một số công bố thì cho biết SVD có tác dụng: Tác dụng tăng cường tính đề kháng chung của cơ thể: bằng phương pháp chiếu xạ tia gamma cho chuột cống trắng, trong thí nghiệm dùng gamma liều cao (1500 rengben), Sâm vũ diệp với liều 5g/kg có tác dụng kéo dài thời gian sống của động vật thí nghiệm, thời gian sống của chuột dùng sâm vũ diệp là 5 ngày còn đối với lô đối chứng là 4,8 ngày. [1,3] Tác dụng cầm máu: Sâm vũ diệp có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu trên in vitro ở các phân đoạn và các mức liều: phân đoạn tổng, phân đoạn n-butanol, phân đoạn ethylacetat có tác dụng ở các mức liều: 0,5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL, 5 mg/mL, phân đoạn ether ở các mức liều 1-2-5 mg/mL. [3,9] Tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư: nhóm nghiên cứu Trung Quốc đã công bố kết quả sàng lọc hoạt tính diệt tế bào ung thư từ 57 cây trong hơn 2000 cây trong cơ sở dữ liệu y học cổ truyền Trung Quốc, Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) là một trong số những loài thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư. [3,9] Ảnh hưởng đối với hệ thần kinh trung ương: thí nghiệm trên chuột, ở liều thấp (0,5 g/kg) không ảnh hưởng rõ rệt hoặc có chiều hướng rút ngắn thời gian gây ngủ của hexobarbital, đối với liều cao có tác dụng kéo dài thời gian gây ngủ của hexobarbital chưa rõ rệt. [1,3] 13
  21. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Mẫu nghiên cứu là lá Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) được thu hái ở Sapa, Lào Cai vào tháng 3/2016 và được giám định thực vật học bởi TS. Phạm Thanh Huyền, Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu. Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Khoa Y Dược, ĐHQGHN với mã số PB-001/2016. Hình 2.1. Mẫu lá Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sapa, Lào Cai 2.2. Thiết bị, dụng cụ Trong quá trình nghiên cứu đề tài, chúng tôi đã sử dụng các thiết bị, dụng cụ tại Khoa Y Dược ĐHQGHN và Trường Đại học PHENIKAA bao gồm: - Năng suất quay cực đo trên máy Jasco DIP-360 digital polarimeter. - Điểm nóng chảy được đo trên máy Stuart SMP3 (Sanyo, Nhật Bản). - Phổ khối ion hóa phun mù điện tử (ESI-MS) được đo trên máy AGILENT 1260 Series LC-MS/MS ion Trap (Agilent Technologies, Hoa Kỳ). - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một và hai chiều được đo trên máy Brucker Biospin 500 (Bruker, Đức) và sử dụng dung môi pyridine-d5 (C5D5N) 14
  22. 2.3. Dung môi, hóa chất Các dung môi dùng trong chiết xuất, phân lập như ethanol (EtOH), methanol (MeOH), dicloromethan (CH2Cl2), chloroform (CHCl3), ethyl acetat (EtOAc), n- butanol (BuOH) đều đạt tiêu chuẩn công nghiệp và được chưng cất lại trước khi dùng. Sắc ký cột tiến hành với chất hấp phụ silica gel pha thường (0,040 - 0,063 mm, Nacalai Tesque Inc., Nhật Bản), silica gel pha đảo ODS-A (50 μm, YMC Co. Ltd., Nhật Bản). Sắc ký bản mỏng tiến hành trên bản mỏng pha thường Kieselgel 60 F254 và pha đảo TLC Silica gel 60 RP-18 F254S (Merck, Damstadt, Đức). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại bước sóng 254 nm và 365 nm, thuốc thử axit H2SO4 10 % và được hơ nóng đến khi hiện màu. 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp xử lý mẫu và chiết xuất Mẫu nghiên cứu sau khi thu hái, rửa sạch, phơi và sấy khô nghiền nhỏ thu được bột thô. Sau đó mẫu được đem ngâm chiết với EtOH 80%, chiết hồi lưu 3 lần (mỗi lần 1,5 L trong 3 giờ). Các dịch chiết được gom lại, lọc qua giấy lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu cắn chiết EtOH. Cắn chiết được phân bố vào nước cất vừa đủ và tiến hành chiết lần lượt với Ê-te, EtOAc và n-BuOH. Cô quay dưới áp suất giảm để thu được các cắn phân đoạn tương ứng Ê-te, EtOAc và BuOH. 2.4.2. Phương pháp phân lập các hợp chất hóa học Dược liệu được chiết hồi lưu bằng dung môi EtOH 80%. Phân đoạn hóa bằng dung môi kỹ thuật Ê-te, EtOAc và n-BuOH. Sử dụng sắc ký cột với chất nhồi cột là silica gel pha thường và pha đảo để phân lập các hợp chất. 15
  23. Theo dõi các phân đoạn chất bằng sắc ký lớp mỏng. Đèn tử ngoại hoặc thuốc thử dùng để phát hiện vết chất, kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập bằng sắc ký lớp mỏng. 2.4.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất được phân lập Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng đầy đủ tổng hợp các phương pháp vật lý và hóa lý, đặc biệt đo phổ hồng ngoại IR, phổ khối MS và phổ cộng huởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, HMBC, COSY, HSQC) kết hợp với so sánh các dữ liệu thu đuợc từ thực nghiệm với các dữ liệu đã công bố. 16
  24. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Chiết xuất và phân lập các hợp chất tinh khiết Mẫu thân lá SVD (0,5 kg) sau khi rửa sạch, phơi khô, thái nhỏ được chiết hồi lưu bằng dung môi ethanol 70%, chiết 3 lần (mỗi lần 1,5 L) sử dụng thiết bị chiết hồi lưu trong 3 giờ. Các dịch chiết ethanol thu được được lọc qua giấy lọc, gom lại và cất loại dưới dung môi dưới áp suất giảm cho 95,9 g cao chiết tổng ethanol. Lấy 95,0 g cao chiết hòa tan trong 500 mL nước cất và chiết phân bố bằng Ê-te, EtOAc và BuOH (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 500 mL). Các dịch chiết phân đoạn được cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được phân đoạn tương ứng Ê-te (6,52 g), EtOAc (3,70 g) và BuOH (18,3 g). Hình 3.1. Quá trình chiết lá SVD ban đầu Tiến hành phân tích phân đoạn BuOH trên cột sắc ký silica gel (85 mm Φ× 80 mm) với hệ pha động CH2Cl2:MeOH (thay đổi trong khoảng 5:1 đến 0:1, v/v, 600 mL) thu được 4 phân đoạn F1 (0,76 g), F2 (5,4 g), F3 (4,7 g), F4 (4,8 g). Phân tích phân đoạn F2 thu được tiếp 4 phân đoạn F2.1 (230 mg), F2.2 (900 mg), F2.3 (550 mg), F2.4 17
  25. (900mg). Gom phân đoạn F2.2 và F2.3 (1450 mg) và tiếp tục tinh chế trên cột C18 pha đảo (35 mm Φ× 400 mm) với hệ pha động MeOH:H2O (1:1, 600 mL; 3:2, 600 mL) thu được 100 mg chất F223 có màu trắng ngà. Hình 3.2. Quá trình tách hợp chất chính aralosid A từ phân đoạn BuOH Hợp chất saponin chính thu được được được đem đi phân tích, xác định cấu trúc hóa học trên cơ sở các đặc điểm vật lý (cảm quan, nhiệt độ nóng chảy, độ tan) và đặc biệt là các phương pháp phổ bao gồm phổ hồng ngoại IR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR và phổ khối MS kết hợp với việc so sánh với dữ liệu trong tài liệu tham khảo. 3.2. Đặc điểm vật lý và dữ liệu phổ của aralosid A phân lập được Trên cơ sở đầy đủ cơ sở dữ liệu thực nghiệm, chúng tôi đã xác định được hợp chất saponin phân lập được là aralosid A (Hình 3.3), là một saponin khung oleanan có danh pháp là 3-O-[α-ʟ-arabinofuranosyl(1→4)-β-ᴅ-glucuronopyranosyl]oleanolic acid 28-O-β-ᴅ-glucopyranosyl ester. Dữ liệu và biện giải cấu trúc sẽ được trình bày sau đây. 18
  26. Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của aralosid A phân lập từ SVD 3.2.1. Đặc điểm, tính chất vật lý - Đặc điểm cảm quan: bột vô định hình màu trắng, không mùi - Tính tan: không tan trong dung môi hữu cơ ít phân cực, tan trong dung môi phân cực 25 - Saponin F223 phân lập được dưới dạng bột màu trắng, năng suất quay cực riêng [α]D = +16 (c 0,3, MeOH). Nhiệt độ nóng chảy 202-204oC. 3.2.2. Dữ liệu phổ 3.2.2.1. Phổ IR 19
  27. Hình 3.4. Phổ IR của aralosid A phân lập được -1 Trên phổ IR xuất hiện 1 pic hydroxyl (OH) ở vị trí 3423,03 cm , 1 pic CHsp3 ở vị trí 2957,3 cm-1, 2 pic carbonyl ở vị trí 1624,73 cm-1 và ở vị trí 1653,66 cm-1, 1 pic -1 CHsp2=C xuất hiện ở vị trí 2928,38 cm . Điều này cho thấy chất A có xuất hiện nhóm hydroxyl (OH), nhóm carbonyl và liên kết đôi với 1 carbon là CH. 20
  28. 3.2.2.2. Phổ khối lượng Hình 3.5. Phổ ESI-MS của aralosid A phân lập được Trên phổ ESI-MS xuất hiện pic ion phân tử tại m/z 949,4. Pic này phù hợp với pic ion phân tử của chất tại [M+Na]+ . 3.2.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân a) Dữ liệu phổ phần aglycon Dữ liệu phổ NMR của phần aglycon (triterpen khung oleanan) được ghi nhận trong bảng dưới đây: Bảng 3.1. Dữ liệu phổ 1H, 13C, DEPT phần aglycon của chất F223 Aglycon Dữ liệu 13C theo 13C 1H (số H; độ bội; J=Hz) DEPT tài liệu tham Vị trí carbon khảo [7] 1 38,5 1,37 (1H; m) CH2 38,8 0,77 (1H; m) 2 26,4 2,12 (1H; m) CH2 26,2 1,78 (1H; m) 3 89,1 3,40 (1H; dd; J=12,0;4,0) CH 89,7 4 39,3 - C 39,7 21
  29. 5 55,6 0,72 (1H; m) CH 55,7 6 18,3 1,40 (1H; d; J=12,0) CH2 18,4 1,18 (1H; m) 7 33,0 1,37 (1H; m) CH2 33,1 1,28 (1H; m) 8 39,7 - C 39,9 9 47,8 1,55 (1H; t; J=8) CH 48,0 10 36,8 - C 36,9 11 23,6 1,82 (1H; m) CH2 23,7 1,55 (1H; m) 12 122,7 7,19 (1H; m) CH 122,5 13 144,0 - C 144,2 14 42,0 - C 42,1 15 28,1 2,27 (1H; m) CH2 28,2 1,15 (1H; m) 16 23,2 2,05 (1H; m) CH2 23,7 1,92 (1H; m) 17 46,9 - C 47,0 18 41,6 3,12 (1H; dd; J=12,0;4,0) CH 41,7 19 46,1 1,71 (1H; m) CH2 46,7 1,19 (1H; m) 20 30,6 - C 30,8 21 33,8 1,04 (1H; m) CH2 34,0 1,19 (1H; m) 22 32,4 1,78 (1H; m) CH2 32,6 1,71 (1H; m) 23 28,0 0,93 (3H; s) CH3 28,2 24 16,8 1,23 (3H; s) CH3 17,0 25 15,4 0,77 (3H; s) CH3 15,5 22
  30. 26 17,3 1,03 (3H; s) CH3 17,4 27 26,0 1,24 (3H; s) CH3 26,2 28 176,5 - COOR 176,5 29 33,0 0,86 (3H; s) CH3 33,1 30 23,5 0,83 (3H; s) CH3 23,7 b) Dữ liệu phổ phần đường: Dữ liệu phổ của 3 đường (GlcA, Ara và Glc) được ghi nhận trong bảng dưới đây: Bảng 3.2. Dữ liệu phổ 1H, 13C, DEPT phần đường của chất F223 Đường Dữ liệu 13C theo Vị trí Carbon tài liệu tham 13C 1H (số H; độ bội; J=Hz) DEPT khảo [7] Đường GlcA 1′ 106,8 4,92 (1H; d; J=8,0) CH 106,8 2′ 75,0 4,04 (1H; t; J=8,5) CH 75,4 3′ 75,9 4,24 (1H; m) CH 76,3 4′ 78,5 4,69 (1H; m) CH 78,9 5′ 75,9 4,60 (1H; m) CH 76,3 6′ 172,5 - COOH 172,3 Đường Ara 1′′ 108,6 6,05 (1H; s) CH 108,3 2′′ 82,4 4,82 (1H; d; J=3,0) CH 82,4 3′′ 76,9 4,71 (1H; m) CH 78,2 4′′ 87,2 4,97 (1H; dd; J=8,0;4,0) CH 87,4 5′′ 62,5 4,09 (1H; dd; J=12,0;4,0) CH2 62,5 4,19 (1H; dd; J=12,0;4,0) Đường Glc 23
  31. 1′′′ 95,6 6,22 (1H; d; J=8,0) CH 95,8 2′′′ 73,8 4,15 (1H; t; J=8,5) CH 74,1 3′′′ 79,0 3,97 (1H; m) CH 78,9 4′′′ 70,9 4,26 (1H; m) CH 71,2 5′′′ 78,5 4,26 (1H; m) CH 78,2 6′′′ 62,0 4,40 (1H; d; J=10,0) CH2 62,2 4,31 (1H; dd; J=12,0;4,5) 3.3. Biện giải cấu trúc của saponin araloside A phân lập được: Khi quan sát phổ 1H, phổ 13C cũng như phổ HSQC ta nhận thấy có 7 nhóm CH3 ở các vị trí δH 0,77; 0,93; 1,30, 1,03, 1,24, 0,86, 0,83 và hai nhóm carbonyl ở vị trí δC 176,5 và vị trí 172,5, và các tín hiệu carbon nối đôi ở vị trí 122,7 và vị trí 144,0. Tất cả những tín hiệu này gợi ý chất F223 có khung axit oleanolic. Thêm vào đó, khi so sánh phổ của chất F223 với phổ của chất mormodin IIe ta có thể khẳng định khung aglycon của chất F223 chính là axit oleanolic. [10] 13 Hình 3.6. Dữ liệu nhóm chức CH3 trong phân tử dựa trên phổ C và DEPT 24
  32. Hình 3.7. Dữ liệu carbon mang nối đôi, nhóm chức carbonyl và dữ liệu carbon trong vùng 60-100 ppm. Ngoài 30 tín hiệu của khung aglycon, ta còn quan sát được 13 tín hiệu carbon trong vùng 60-100 ppm, đặc biệt hơn khi quan sát trên phổ DEPT ta nhận thấy có 11 tín hiệu là của nhóm CH, 2 tín hiệu CH2 ở vị trí δC 62,5 và 62,0. Kết hợp với tín hiệu carbonyl ở vị trí δC 172,5 gợi ý có 3 phân tử đường cấu trúc, 2 đường thuộc dạng hexose và 1 đường thuộc dạng pentose. Sự xuất hiện tín hiệu ở vị trí δC 172,5 cho thấy có một đường thuộc nhóm axit uronic. Phân tích COSY và HMBC cho biết thông tin về các đường liên kết trong phân tử. Cụ thể là, phổ COSY cho thấy các hệ liên kết liên tục H1′-H2′-H3′-H4′-H5′ (δH 4,92-4,04-4,24-4,69-4,60), H1′′-H2′′-H3′′-H4′′-H5′′ (δH 6,05-4,82-4,71-4,97-4,09/4,19) và hệ H1′′′-H2′′′-H3′′′-H4′′′-H5′′′-H6′′′ (δH 6,22-4,15-3,97-4,26-4,26-4,40/4,31). Phổ HMBC cho thấy mối liên hệ giữa H-1′ (δH 4,92) với C-5′ (δC 75,9), H-1′′ (δH 6,05) với C-4′′ (δC 87,2), H-1′′′ (δH 6,22) với C-5′′′ (δC 78,5). Điều này khẳng định có 3 đường nằm trong phân tử, 1 đường thuộc nhóm pentose và 2 đường thuộc nhóm hexose. 25
  33. Hình 3.8. Dữ liệu HMBC thể hiện tương quan giữa các phân tử trong đường (→) Các đường được xác định bao gồm β-ᴅ-glucopyranose, β-ᴅ-glucopyranuronic, và một α-ʟ-arabinofuranose bằng việc phân tích hệ số tương quan của các anomeric proton tương ứng (J=8 Hz) và so sánh với phổ của chất tương tự trong tài liệu tham khảo. Ngoài ra, sự xuất hiện của ghép cặp giữa H-1′ với C-3, giữa H-1′′ với C-4′ cho ta thấy phức giữa α-ʟ-arabinofuranose với β-ᴅ-glucopyranuronic (C-1′′ → C-4′) được gắn vào phần aglycon qua liên kết C-1′→C-3; sự xuất hiện của ghép cặp giữa giữa H-1′′′ với C-28 cho ta thấy β-ᴅ-glucopyranose được gắn vào phần aglycon qua liên kết C- 1′′′→C-28. 26
  34. Hình 3.9. Dữ liệu HMBC chỉ ra mối quan hệ giữa các đường và phần aglycon (→) Từ phân tích các dữ kiện trên cũng như so sánh giữa phổ của chất F233 với aralosid A trong tài liệu tham khảo, ta có thể khẳng định đây chính là aralosid A Aralosid A Hình 3.10. Cấu trúc hóa học của saponin phân lập được, aralosid A. 27
  35. 3.4. Bàn luận Dựa trên các phương pháp vật lý (đặc điểm cảm quan, điểm chảy, độ quay cực) cũng như các phương pháp phổ bao gồm phổ khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) cộng với việc so sánh dữ liệu thu được với các nghiên cứu trước đó chúng tôi đi đến kết luận dữ liệu chất F223 thu được thông qua phân tích phân đoạn BuOH là của chất aralosid A. Nghiên cứu của Hui Yang, Bingtao Zhai và cộng sự vào năm 2018 cho thấy nhiều tác dụng dược lý như kích thích tiêu sợi huyết, ngăn ngừa đông máu, ức chế renin, giảm huyết áp, [13]. Nghiên cứu của Je-Hyuk Lee và cộng sự vào năm 2018 cho thấy tác dụng chống dị ứng bằng cơ chế ức chế sản xuất NO và ức chế một số dòng tế bào ung thư như AGS, SNU, tế bào ung thư buồng trứng. Nghiên cứu này đã chứng minh hoạt động tăng cường sức khỏe tiềm năng của aralosid A do ức chế cả viêm và ung thư mặc dù hoạt động chống oxy hóa thấp của nó.[14]. Nghiên cứu của Yanjie Ding và cộng sự vào năm 2019 cho thấy aralosid có tác dụng ức chế viêm khớp dạng thấp bằng nhiều cơ chế khác nhau như ức chế các chất trung gian hóa học gây viêm (NO và PGE2), ức chế cytokine tiền viêm (IL-1 và IL-6). [15] Nghiên cứu về tác dụng bảo vệ dạ dày của aralosid A vào năm 2019 cho thấy aralosid A có thể cải thiện lưu lượng máu niêm mạc dạ dày, chỉ số loét. Từ đó cho thấy tác dụng bảo vệ dạ dày có lợi đối với loét dạ dày do rượu và aspirin ở chuột, có liên quan đến việc ức chế H +/ K + -ATPase hoạt động do đó làm giảm tổn thương niêm mạc dạ dày [16]. Như vậy, với nhiều tác dụng có lợi như trên, aralosid A hoàn toàn có tiềm năng trở thành một loại thuốc mang các tác dụng sinh học quan trọng trong quá trình điều trị nhiều loại bệnh khác nhau. Việc có thể sử dụng phần trên mặt đất thay thế cho phần rễ của cây có ý nghĩa lớn trong việc phát triển dược liệu bền vững cũng như có thể làm giảm giá thành sử dụng cho người bệnh. 28
  36. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau khi tách chiết chất F223 và sử dụng các phương pháp phổ để tiến hành biện giải cấu trúc, chúng tôi đã hoàn thành mục tiêu đã đề ra, đó là chiết xuất, phân lập và biện giải cấu trúc phân lập được từ phân đoạn BuOH của phần lá của cây. Kết quả này có ý nghĩa thực tiễn trong công tác kiểm nghiệm thuốc nói chung và kiểm nghiệm dược liệu nói riêng, góp phần ý nghĩa vào cơ sở dữ liệu về hóa thực vật cũng như làm cơ sở định hướng cho các nghiên cứu hoạt tính sinh học của đối tượng tiềm năng thuộc chi Panax này. KIẾN NGHỊ Bài báo này trình bày kết quả nghiên cứu thành phần saponin của bộ phận trên mặt đất Sâm vũ diệp trồng ở Sa Pa, Lào Cai để đóng góp thêm vào cơ sở dữ liệu về hóa thực vật và tiêu chuẩn hóa dược liệu Sâm vũ diệp, góp phần bảo tồn và phát triển loài dược liệu quý này. Đây là những kết quả nghiên cứu đầu tiên trong nội dung nghiên cứu thành phần hóa học của sâm vũ diệp. Với những kết quả đầy tiềm năng và hứa hẹn trên, đề tài này cần tiếp tục nghiên cứu: - Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học của các phân đoạn khác như Ê-te, đặc biệt là phân đoạn butanol giàu saponin. - Nghiên cứu thêm các tác dụng dược lý của aralosid A nói riêng cũng như Sâm vũ diệp nói chung để làm cơ sở khoa học cho việc sử dụng cây thuốc này trong điều trị. - Tiến hành các nghiên cứu định tính định lượng sử dụng aralosid A làm chất đối chứng. 29
  37. TÀI LIỆU THAM KHẢO A. Tài liệu tiếng Việt 1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong cùng cộng sự (2003), Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt Nam tập 2, Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật, tr. 711 – 714. 2. Đỗ Văn Hào (2017), Nghiên cứu thành phần hóa học của cây sâm vũ diệp thu hái ở Tây Bắc, Khóa luận tốt nghiệp, Trường ĐH Quốc Gia, Hà Nội. 3. Lê Thị Tâm (2017), Nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của các phân đoạn dịch chiết Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. Tsai et K. M. Feng) trên in vitro, Khóa luận tôt nghiệp đại học, Khoa Y Dược, ĐHQGHN. 4. Nguyễn Thị Thu Thủy (2018), Nghiên cứu thành phần saponin của thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) trồng ở Sa Pa, Luận văn Thạc sĩ, Trường ĐH Quốc Gia, Hà Nội. 5. Nguyễn Thị Huệ (2017), Phân tích acid oleanolic và thành phần saponin trong rễ cây Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái ở Tây Bắc, Khóa luận tốt nghiệp, Trường ĐH Quốc Gia, Hà Nội. 6. Trần Công Luận, Lưu Thảo Nguyên, Nguyễn Tập (2009), Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng dược lý của hai loài Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng)", Tạp chí dược liệu, 14(1), tr. 17-23. B. Tài liệu tiếng anh 7. Chun Jie SHAO, Ryoji KASAI, Jing-Da Xu, Osamu TANAKA (1989), “Saponins from the roots of Kalopanax septemlobus 30
  38. (THUNB.) KOIDZ., Ciqui: Structure of Kalopanax-saponins C, D, E, F”, Chem. Farm. Bull, 37(2), 311-314. 8. Medicinal plants in Viet Nam (Institute of Materia Medica - HANOI - WHO/WPRO, 1990, 444 p.), 137. 9. Shao-Xing Dai, Wen-Xing Li et al. (2016), "In silico identification of anticancer compounds and plants from traditional Chinese medicine database", Scientific Reports, 25462, pp. 10. Tung NH, Quang TH, Ngan NTT, Minh CV, Anh BK, Long PQ, Cuong NM, Kim YH (2011), “Oleanolic triterpenesaponins from the roots of Panax bipinnatifidus”, 59(11), pp. 1417-1420. 11. Wang D.Q., Feng B.S. et al. (1989), "Further study on dammarane saponins of leaves of Panax japonicus var. major collected in Quinling Mountains China", Yao Xue Xue Bao, 24(8), pp. 633 – 636. 12. Wang DQ, Fan J, Feng BS, Li SR, et al. (1989), "Studies on saponins from the leaves of Panax japonicus var. bipinnatifidus (Seem.) Wu et Feng", Yao Xue Xue Bao, 24(8), pp. 593-599. 13. Hui Yang, Bingtao Zhai et al. (2018), “Intestinal absorption mechanisms of aralosid A in situ single-pass intestinal perfusion and in vitro Caco-2 cell model”, Biomedicine & Pharmacotherapy, 106, 1563–1569. 14. Je-Hyuk Lee, Jin-Sun Kim, Seon-Dae Shin (2018), “Anti-oxidant, anti- inflammatory, and anti-carcinogenic activities of araloside A from Aralia elata”, Journal of Applied Pharmaceutical Science Vol. 8(10), pp 129-135. 15. Yanjie Ding, Qing Zhao, Laifang Wang (2019), “Pro-apoptotic and Anti-Inflammatory Effects of Araloside A on Human Rheumatoid 31
  39. Arthritis Fibroblast-Like Synoviocytes”, Chemico-Biological Interactions 306, pp 131–137. 16. Haibo He et al. (2019), “Gastroprotective Effect of Araloside A on Ethanol- And Aspirin-Induced Gastric Ulcer in Mice: Involvement of H +/K +-ATPase and Mitochondrial-Mediated Signaling Pathway”, J Nat Med;73(2), pp 339-352. C. Trang Web: 17. 18. 32
  40. PHỤ LỤC Phụ lục 1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất F223 Phụ lục 2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất F223 Phụ lục 3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2D (DEPT, COSY, HSQC, HMBC) của chất F223
  41. 7.566 12 7.190 6.236 6.220 6.048 11 5.423 5.375 4.961 4.953 10 4.927 4.912 4.826 4.821 9 4.724 4.716 4.711 4.697 8 4.619 4.600 4.389 4.319 7 4.276 4.268 1.04 4.258 PB223-Pyridine-1H 0.98 4.251 2.14 4.236 6 1.07 4.183 1.84 4.175 1.09 4.162 4.145 1.12 5 4.107 1.23 4.098 2.64 4.061 2.28 4.044 2.18 4 3.542 1.16 3.541 1.03 1.818 1.790 1.00 3 1.762 1.08 1.718 1.03 1.691 1.07 1.410 1.17 2 1.388 4.06 1.301 1.97 1.273 1.20 1.258 2.06 1 1.235 1.229 3.30 1.194 10.43 1.167 4.08 0 1.025 3.22 0.927 6.44 0.862 3.60 0.833 1.27 ppm 0.769 0.727 PC 1.00 PC 0 GB Hz 0.30 LB 0 SSB EM WDW MHz 500.1890265 SF 65536 SI parameters Processing - F2 W 22.00000000 PLW1 usec 10.20 P1 1H NUC1 MHz 500.1920889 SFO1 === f1 CHANNEL === 1 TD0 sec 1.00000000 D1 K 303.9 TE usec 6.50 DE usec 50.000 DW 64.21 RG sec 3.2767999 AQ Hz 0.152588 FIDRES Hz 10000.000 SWH 2 DS 16 NS Pyr SOLVENT 65536 TD zg30 PULPROG BB/ PABBO mm 5 PROBHD spect INSTRUM 20.37 Time 20200419 Date_ Parameters Acquisition - F2 1 PROCNO 1 EXPNO 22DUONG_PB223 NAME Parameters Data Current
  42. 6.3 1.04 6.236 6.2 6.220 6.1 0.98 6.048 6.0 5.9 5.8 5.7 PB223-Pyridine-1H 5.6 5.5 5.4 5.423 5.375 5.3 5.2 5.1 5.0 4.969 4.961 2.14 4.953 4.9 4.944 4.927 4.912 4.826 1.07 4.8 4.821 4.724 4.716 4.7 1.84 4.711 4.697 4.679 4.6 4.619 1.09 4.600 4.590 4.5 1.12 ppm 4.409 4.389
  43. 4.409 4.5 4.389 4.328 4.319 4.304 4.4 1.12 4.295 4.286 4.276 4.268 1.23 4.3 4.258 4.251 4.236 2.64 4.218 4.2 4.206 4.198 4.183 2.28 4.175 4.162 4.1 4.145 4.129 2.18 4.107 4.098 4.0 4.084 PB223-Pyridine-1H 4.075 1.16 4.061 4.052 3.9 4.044 4.027 3.987 3.981 3.8 3.973 3.7 3.6 3.542 3.541 3.5 3.4 3.310 3.3 3.303 1.03 3.287 3.279 3.2 3.140 1.00 3.1 3.119 3.112 ppm
  44. 2.4 2.3 1.08 2.295 2.269 2.247 2.2 2.134 1.03 2.1 2.113 2.071 2.049 1.07 2.0 2.044 2.023 1.935 1.9 1.17 1.909 PB223-Pyridine-1H 1.8 1.818 4.06 1.790 1.762 1.7 1.718 1.691 1.97 1.6 1.569 1.20 1.553 1.5 1.534 2.06 1.4 1.410 1.388 1.344 1.338 3.30 1.3 1.301 1.273 1.258 1.2 1.235 1.229 10.43 1.194 1.167 1.1 1.139 1.054 4.08 1.0 1.025 3.22 0.9 0.927 0.899 0.862 6.44 0.8 0.833 0.805 3.60 0.769 0.7 0.727 0.703 1.27 ppm
  45. PB223-Pyridine-C13CPD Current Data Parameters NAME 22DUONG_PB223 135.84 135.64 135.44 123.68 123.48 123.28 122.70 108.56 106.75 95.55 89.12 87.23 82.36 79.03 78.48 76.93 75.94 74.98 73.80 70.88 62.49 61.98 55.61 47.84 46.88 46.06 41.98 41.59 39.74 39.31 38.49 36.77 33.84 32.97 32.37 30.59 28.09 28.02 26.36 25.95 176.46 172.50 149.76 149.54 149.33 144.00 EXPNO 2 PROCNO 1 F2 - Acquisition Parameters Date_ 20200419 Time 21.32 INSTRUM spect PROBHD 5 mm PABBO BB/ PULPROG zgpg30 TD 65536 SOLVENT Pyr NS 1024 DS 4 SWH 31250.000 Hz FIDRES 0.476837 Hz AQ 1.0485760 sec RG 198.57 DW 16.000 usec DE 6.50 usec TE 304.8 K D1 2.00000000 sec D11 0.03000000 sec TD0 1 === CHANNEL f1 === SFO1 125.7864591 MHz NUC1 13C P1 10.00 usec PLW1 88.00000000 W === CHANNEL f2 === SFO2 500.1910008 MHz NUC2 1H CPDPRG[2 waltz16 PCPD2 80.00 usec PLW2 22.00000000 W PLW12 0.35764000 W PLW13 0.17989001 W F2 - Processing parameters SI 32768 SF 125.7726179 MHz WDW EM SSB 0 LB 1.00 Hz GB 0 PC 1.40 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 ppm
  46. 180 176.46 170 172.50 160 150 149.76 149.54 149.33 144.00 140 135.84 135.64 PB223-Pyridine-C13CPD 130 135.44 123.68 123.48 120 123.28 122.70 110 108.56 106.75 100 95.55 89.12 90 87.23 82.36 79.03 78.48 80 76.93 75.94 74.98 73.80 70 70.88 62.49 61.98 60 55.61 47.84 46.88 46.06 50 41.98 41.59 39.74 39.31 40 38.49 36.77 33.84 32.97 30 32.37 30.59 28.09 20 28.02 26.36 25.95 23.60 10 23.49 23.24 18.33 17.30 ppm 16.77 15.35
  47. 180 176.46 172.50 170 160 150 149.76 149.54 149.33 PB223-Pyridine-C13CPD 144.00 140 135.84 135.64 135.44 130 123.68 123.48 123.28 120 122.70 110 108.56 106.75 100 95.55 90 89.12 87.23 82.36 80 79.03 78.48 76.93 75.94 74.98 73.80 70 70.88 62.49 ppm 61.98
  48. 65 62.49 61.98 60 55 55.61 PB223-Pyridine-C13CPD 50 47.84 46.88 46.06 45 41.98 41.59 40 39.74 39.31 38.49 36.77 35 33.84 32.97 32.37 30 30.59 28.09 28.02 26.36 25 25.95 23.60 23.49 23.24 20 18.33 17.30 16.77 15.35 ppm
  49. PB223-Pyridine-C13CPD &DEPT DEPT90 210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm DEPT135 CH&CH3 CH2 210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm C13CPD 210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm
  50. PB223-Pyridine-C13CPD &DEPT DEPT90 120 115 110 105 100 95 90 85 80 75 ppm DEPT135 CH&CH3 CH2 120 115 110 105 100 95 90 85 80 75 ppm C13CPD 120 115 110 105 100 95 90 85 80 75 ppm
  51. PB223-Pyridine-C13CPD &DEPT DEPT90 60 55 50 45 40 35 30 25 20 ppm DEPT135 CH&CH3 CH2 60 55 50 45 40 35 30 25 20 ppm C13CPD 60 55 50 45 40 35 30 25 20 ppm
  52. PB223-Pyridine-COSYGP Current Data Parameters NAME 22DUONG_PB223 EXPNO 7 PROCNO 1 ppm F2 - Acquisition Parameters Date_ 20200419 Time 23.04 INSTRUM spect PROBHD 5 mm PABBO BB/ PULPROG cosygpppqf TD 2048 SOLVENT Pyr 1 NS 2 DS 8 SWH 4854.369 Hz FIDRES 2.370297 Hz AQ 0.2109440 sec RG 30.85 DW 103.000 usec 2 DE 6.50 usec TE 304.3 K D0 0.00000300 sec D1 1.94224596 sec D11 0.03000000 sec D12 0.00002000 sec 3 D13 0.00000400 sec D16 0.00020000 sec IN0 0.00020600 sec === CHANNEL f1 === SFO1 500.1912561 MHz 4 NUC1 1H P0 10.20 usec P1 10.20 usec P17 2500.00 usec PLW1 22.00000000 W PLW10 2.54320002 W 5 === GRADIENT CHANNEL === GPNAM[1] SMSQ10.100 GPZ1 10.00 % P16 1000.00 usec F1 - Acquisition parameters 6 TD 128 SFO1 500.1913 MHz FIDRES 75.849518 Hz SW 9.705 ppm FnMODE QF 7 F2 - Processing parameters SI 1024 SF 500.1890320 MHz WDW QSINE SSB 0 LB 0 Hz GB 0 8 PC 1.40 F1 - Processing parameters SI 1024 MC2 QF SF 500.1890315 MHz WDW QSINE SSB 0 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm LB 0 Hz GB 0
  53. PB223-Pyridine-COSYGP Current Data Parameters NAME 22DUONG_PB223 EXPNO 7 PROCNO 1 ppm F2 - Acquisition Parameters Date_ 20200419 Time 23.04 INSTRUM spect PROBHD 5 mm PABBO BB/ PULPROG cosygpppqf 4.0 TD 2048 SOLVENT Pyr NS 2 DS 8 4.2 SWH 4854.369 Hz FIDRES 2.370297 Hz AQ 0.2109440 sec RG 30.85 DW 103.000 usec 4.4 DE 6.50 usec TE 304.3 K D0 0.00000300 sec D1 1.94224596 sec 4.6 D11 0.03000000 sec D12 0.00002000 sec D13 0.00000400 sec D16 0.00020000 sec 4.8 IN0 0.00020600 sec === CHANNEL f1 === SFO1 500.1912561 MHz NUC1 1H 5.0 P0 10.20 usec P1 10.20 usec P17 2500.00 usec PLW1 22.00000000 W 5.2 PLW10 2.54320002 W === GRADIENT CHANNEL === GPNAM[1] SMSQ10.100 GPZ1 10.00 % 5.4 P16 1000.00 usec F1 - Acquisition parameters TD 128 5.6 SFO1 500.1913 MHz FIDRES 75.849518 Hz SW 9.705 ppm FnMODE QF 5.8 F2 - Processing parameters SI 1024 SF 500.1890320 MHz WDW QSINE 6.0 SSB 0 LB 0 Hz GB 0 PC 1.40 6.2 F1 - Processing parameters SI 1024 MC2 QF SF 500.1890315 MHz 6.4 WDW QSINE SSB 0 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 ppm LB 0 Hz GB 0
  54. PB223-Pyridine-COSYGP Current Data Parameters NAME 22DUONG_PB223 EXPNO 7 PROCNO 1 ppm F2 - Acquisition Parameters Date_ 20200419 Time 23.04 INSTRUM spect 3.9 PROBHD 5 mm PABBO BB/ PULPROG cosygpppqf TD 2048 SOLVENT Pyr NS 2 4.0 DS 8 SWH 4854.369 Hz FIDRES 2.370297 Hz AQ 0.2109440 sec RG 30.85 4.1 DW 103.000 usec DE 6.50 usec TE 304.3 K D0 0.00000300 sec D1 1.94224596 sec 4.2 D11 0.03000000 sec D12 0.00002000 sec D13 0.00000400 sec D16 0.00020000 sec 4.3 IN0 0.00020600 sec === CHANNEL f1 === SFO1 500.1912561 MHz NUC1 1H 4.4 P0 10.20 usec P1 10.20 usec P17 2500.00 usec PLW1 22.00000000 W PLW10 2.54320002 W 4.5 === GRADIENT CHANNEL === GPNAM[1] SMSQ10.100 GPZ1 10.00 % 4.6 P16 1000.00 usec F1 - Acquisition parameters TD 128 SFO1 500.1913 MHz FIDRES 75.849518 Hz 4.7 SW 9.705 ppm FnMODE QF F2 - Processing parameters SI 1024 4.8 SF 500.1890320 MHz WDW QSINE SSB 0 LB 0 Hz 4.9 GB 0 PC 1.40 F1 - Processing parameters SI 1024 5.0 MC2 QF SF 500.1890315 MHz WDW QSINE SSB 0 5.0 4.9 4.8 4.7 4.6 4.5 4.4 4.3 4.2 4.1 4.0 ppm LB 0 Hz GB 0
  55. PB223-Pyridine-COSYGP Current Data Parameters NAME 22DUONG_PB223 EXPNO 7 PROCNO 1 ppm F2 - Acquisition Parameters Date_ 20200419 Time 23.04 INSTRUM spect PROBHD 5 mm PABBO BB/ PULPROG cosygpppqf TD 2048 SOLVENT Pyr NS 2 1.0 DS 8 SWH 4854.369 Hz FIDRES 2.370297 Hz AQ 0.2109440 sec RG 30.85 DW 103.000 usec DE 6.50 usec TE 304.3 K D0 0.00000300 sec 1.5 D1 1.94224596 sec D11 0.03000000 sec D12 0.00002000 sec D13 0.00000400 sec D16 0.00020000 sec IN0 0.00020600 sec === CHANNEL f1 === SFO1 500.1912561 MHz 2.0 NUC1 1H P0 10.20 usec P1 10.20 usec P17 2500.00 usec PLW1 22.00000000 W PLW10 2.54320002 W === GRADIENT CHANNEL === 2.5 GPNAM[1] SMSQ10.100 GPZ1 10.00 % P16 1000.00 usec F1 - Acquisition parameters TD 128 SFO1 500.1913 MHz FIDRES 75.849518 Hz SW 9.705 ppm 3.0 FnMODE QF F2 - Processing parameters SI 1024 SF 500.1890320 MHz WDW QSINE SSB 0 LB 0 Hz GB 0 3.5 PC 1.40 F1 - Processing parameters SI 1024 MC2 QF SF 500.1890315 MHz WDW QSINE SSB 0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 ppm LB 0 Hz GB 0
  56. PB223-Pyridine-COSYGP Current Data Parameters NAME 22DUONG_PB223 EXPNO 7 PROCNO 1 ppm F2 - Acquisition Parameters Date_ 20200419 Time 23.04 INSTRUM spect PROBHD 5 mm PABBO BB/ PULPROG cosygpppqf TD 2048 SOLVENT Pyr 0.8 NS 2 DS 8 SWH 4854.369 Hz FIDRES 2.370297 Hz AQ 0.2109440 sec RG 30.85 1.0 DW 103.000 usec DE 6.50 usec TE 304.3 K D0 0.00000300 sec D1 1.94224596 sec D11 0.03000000 sec 1.2 D12 0.00002000 sec D13 0.00000400 sec D16 0.00020000 sec IN0 0.00020600 sec === CHANNEL f1 === SFO1 500.1912561 MHz 1.4 NUC1 1H P0 10.20 usec P1 10.20 usec P17 2500.00 usec PLW1 22.00000000 W 1.6 PLW10 2.54320002 W === GRADIENT CHANNEL === GPNAM[1] SMSQ10.100 GPZ1 10.00 % P16 1000.00 usec 1.8 F1 - Acquisition parameters TD 128 SFO1 500.1913 MHz FIDRES 75.849518 Hz SW 9.705 ppm 2.0 FnMODE QF F2 - Processing parameters SI 1024 SF 500.1890320 MHz WDW QSINE SSB 0 2.2 LB 0 Hz GB 0 PC 1.40 F1 - Processing parameters SI 1024 MC2 QF 2.4 SF 500.1890315 MHz WDW QSINE SSB 0 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 ppm LB 0 Hz GB 0
  57. PB223-Pyridine-HSQC ppm 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm
  58. PB223-Pyridine-HSQC ppm 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 ppm
  59. PB223-Pyridine-HSQC ppm 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 5.0 4.9 4.8 4.7 4.6 4.5 4.4 4.3 4.2 4.1 4.0 3.9 ppm
  60. PB223-Pyridine-HMBC ppm 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
  61. PB223-Pyridine-HMBC ppm 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 ppm
  62. PB223-Pyridine-HMBC ppm 70 75 80 85 90 95 100 105 110 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 ppm
  63. PB223-Pyridine-HMBC ppm 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 ppm
  64. PB223-Pyridine-HMBC ppm 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 ppm
  65. PB223-Pyridine-HMBC ppm 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 ppm
  66. PB223-Pyridine-HMBC ppm 15 20 25 30 35 40 45 50 55 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 ppm