Khóa luận Định lượng acid chlorogenic trong dược liệu Ké đầu ngựa (Fructus Xanthii strumarii) thu hái tại Việt Nam bằng phương pháp HPLC

Nội dung text: Khóa luận Định lượng acid chlorogenic trong dược liệu Ké đầu ngựa (Fructus Xanthii strumarii) thu hái tại Việt Nam bằng phương pháp HPLC

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ HƯƠNG TRANG ĐỊNH LƯỢNG ACID CHLOROGENIC TRONG DƯỢC LIỆU KÉ ĐẦU NGỰA (Fructus Xanthii strumarii) THU HÁI TẠI VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2020
2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC Người thực hiện: NGUYỄN THỊ HƯƠNG TRANG ĐỊNH LƯỢNG ACID CHLOROGENIC TRONG DƯỢC LIỆU KÉ ĐẦU NGỰA (Fructus Xanthii strumarii) THU HÁI TẠI VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa: QH.2015.Y Người hướng dẫn: TS. NGUYỄN THỊ PHƯƠNG TS. NGUYỄN THỊ THANH BÌNH Hà Nội - 2020
3. LỜI CẢM ƠN Khoá luận này được thực hiện và hoàn thành tại Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược Liệu với sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Phương và TS. Nguyễn Thị Thanh Bình. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Thị Phương (Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu) và TS. Nguyễn Thị Thanh Bình (Bộ môn Hóa dược và kiểm nghiệm, Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội) là những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tận tình, chu đáo, luôn chỉ bảo, góp ý, đưa ra những ý kiến quý báu và động viên em hoàn thiện khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Dược liệu, PGS.TS. Phương Thiện Thương (Trưởng khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu) cùng các anh chị, cán bộ nhân viên khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất để em hoàn thành khóa luận. Em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể thầy cô trong Khoa Y – Dược, những người thầy đã luôn tận tâm dạy dỗ, trang bị cho em những kiến thức quý giá trong những năm tháng theo học tại trường. Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn ở bên cạnh động viên, ủng hộ và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận. Sau cùng, em xin kính chúc các thầy cô luôn mạnh khỏe, hạnh phúc và thành công trong công việc cũng như trong cuộc sống. Hà Nội, ngày 09 tháng 06 năm 2020 Sinh viên Nguyễn Thị Hương Trang
4. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT, CÁC KÝ HIỆU Ký hiệu Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học Tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril Association of Official Analytical Hiệp hội các nhà Hóa phân AOAC Chemists tích CGA Acid chlorogenic Axit clorogenic High Performance Liquid HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography High performance Liquid HPLC- Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography-Diod array DAD ghép nối đầu dò mảng diod detector High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC-UV Chromatography-Ultraviolet ghép nối đầu dò tử ngoại MeOH Methanol Methanol Methanol extracts of fruits Chiết xuất methanol quả của MEX of Xanthium strumarium Xanthium strumarium Chiết xuất methanol của lá cây MEXL Methanol extracts of leaves of Xanthium strumarium Xanthium strumarium Chiết xuất methanol phần thân MEXS Methanol extracts of stems of Xanthium strumarium cây Xanthium strumarium RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha RP-HPLC- Reversed phase High performance đảo ghép nối đầu dò mảng DAD Liquid Chromatography-Diod array detector diod TLTK Tài liệu tham khảo tt/tt Thể tích/Thể tích
5. DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh cây Ké đầu ngựa Xanthium strumarium L. 3 Hình 1.2. Hợp chất axit caffeic (22) và xanthiumnolic A (23) 6 Hình 1.3. Các hợp chất coumarin được phân lập từ Xanthium strumarium L. 8 Hình 1.4. Các hợp chất liganolid được phân lập từ Xanthium strumarium L. 8 Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của acid chlorogenic 15 Hình 2.1. Hình ảnh dược liệu Ké đầu ngựa lưu trữ tại Viện Dược liệu 20 Hình 3.1. Sắc ký đồ HPLC phân tích acid chlorogenic trong dược liệu Ké ầđ u ngựa 27 Hình 3.2. Sắc ký đồ đánh giá tính chọn lọc của phương pháp 28 Hình 3.3. Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ CGA và diện tích pic 30
6. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Cấu trúc của các hợp chất sesquiterpenoid phân lập từ Xanthium strumarium L 4 Bảng 1.2. Cấu trúc các dẫn xuất của axit caffeoylquinic được phân lập từ Xanthium strumarium L. 7 Bảng 1.3. Cấu trúc của các hợp chất steroid và glycosid đã được phân lập từ Xanthium strumarium L. 9 Bảng 1.4. Một số phương pháp xác định acid chlorogenic 17 Bảng 2.1. Danh sách các mẫu dược liệu Ké đầu ngựa thu thập 20 Bảng 3.1. Các thông số đánh giá đối với acid chlorogenic 27 Bảng 3.2. Kết quả đánh giá tính thích hợp hệ thống 29 Bảng 3.3. Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích của pic CGA 29 Bảng 3.4. Kết quả đánh giá độ lặp lại 31 Bảng 3.5. Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp 32 Bảng 3.6. Hàm lượng acid chlorogenic trong mẫu dược liệu Ké đầu ngựa thu hái tại Việt Nam 32
7. MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan về cây Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.) 2 1.1.1. Vị trí phân loại 2 1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố 2 1.1.3. Bộ phận dùng 3 1.1.4. Thành phần hóa học 3 1.1.5. Một số tác dụng dược lý của cây Ké đầu ngựa 11 1.2. Tổng quan về acid chlorogenic 15 1.2.1. Công thức hóa học 15 1.2.2. Tính chất vật lý 15 1.2.3. Tác dụng dược lý 15 1.2.4. Một số phương pháp xác định acid chlorogenic 16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. Đối tượng nghiên cứu 20 2.2. Chất chuẩn, hóa chất và thiết bị 21 2.2.1. Chất chuẩn 21 2.2.2. Hóa chất 21 2.2.3. Thiết bị 21 2.3. Phương pháp nghiên cứu 21 2.3.1. Chuẩn bị dung dịch thử 21 2.3.2. Chuẩn bị dung dịch chuẩn 22 2.3.3. Xây dựng phương pháp định lượng acid cholorogenic trong Ké đầu ngựa 22 2.3.4. Áp dụng trên một số mẫu dược liệu Ké ầđ u ngựa 25 2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu 25
8. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 26 3.1. Khảo sát điều kiện phân tích và quy trình xử lý mẫu 26 3.2. Thẩm định phương pháp phân tích 28 3.2.1. Tính chọn lọc của phương pháp 28 3.2.2. Tính thích hợp của hệ thống 28 3.2.3. Xác định khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn 29 3.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 30 3.2.5. Độ lặp lại 30 3.2.6. Độ đúng 31 3.3. Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng acid chlorogenic trong các mẫu dược liệu Ké đầu ngựa 32 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 34 4.1. Về thu thập mẫu dược liệu 34 4.2. Về xây dựng phương pháp định lượng 34 4.3. Về thẩm định phương pháp định lượng 35 4.4. Về kết quả áp dụng phương pháp HPLC định lượng acid chlorogenic trong dược liệu Ké đầu ngựa thu hái tại Việt Nam 35 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO
9. ĐẶT VẤN ĐỀ Cùng với sự tiến bộ của nền cách mạng khoa học – kỹ thuật, con người dần có xu hướng “trở về với thiên nhiên”, nền Y học cổ truyền ngày càng được quan tâm, nghiên cứu và phát triển. Trong đó, việc tập trung tìm kiếm, phân lập các hoạt chất chữa bệnh từ các loài dược liệu tự nhiên đã mang lại giá trị to lớn và có ý nghĩa vô cùng thiết thực cho công cuộc chăm sóc sức khỏe con người. Ké đầu ngựa có tên khoa học Xanthium strumarium L., thuộc họ Cúc Asteraceae, là một trong những vị thuốc quý được sử dụng rộng rãi trong nền Y học truyền thống Việt Nam và Trung Quốc với nhiều công dụng như tiêu độc, sát trùng, tán phong, trừ thấp. Ké đầu ngựa thường được dùng để chữa phong hàn đau đầu, tay chân đau co rút, phong tê thấp, đau khớp, bướu cổ, mày đay, lở ngứa, mụn nhọt [3]. Bên cạnh đó, đây còn là loại dược liệu có nhiều tác dụng dược lý quan trọng như ức chế khối u, kháng viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa và chống đái tháo đường. Trong Ké đầu ngựa có chứa các nhóm chất mang hoạt tính sinh học, trong đó phải kể đến acid chlorogenic – một hợp chất hóa học thuộc nhóm axit phenolic, có công dụng chống oxy hóa, chống đột biến gen, ngăn chặn sự phát triển tế bào ung thư, chống vi rút và kháng khuẩn. Acid chlorogenic là hoạt chất được yêu cầu định lượng trong nhiều loài dược liệu như Kim ngân hoa theo Dược điển Trung Quốc 2015 [51]; các chuyên luận trong Dược điển Mỹ 38 [54]. Tuy nhiên, Dược điển Việt Nam V chưa đề cập tới định lượng acid chlorogenic trong dược liệu Ké đầu ngựa, mới chỉ có các công trình nghiên cứu định lượng acid chlorogenic trong dược liệu bằng các phương pháp HPLC tại Việt Nam [2]. Từ thực tiễn trên, để góp phần xây dựng một phương pháp kiểm nghiệm dược liệu chính xác, đơn giản và có thể ứng dụng rộng rãi, tôi đã tiến hành đề tài “Định lượng acid chlorogenic trong dược liệu Ké đầu ngựa (Fructus Xanthii strumarii) thu hái tại Việt Nam bằng phương pháp HPLC” với 2 mục tiêu: - Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid chlorogenic trong dược liệu Ké đầu ngựa bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). - Ứng dụng phương pháp HPLC đã xây dựng để định lượng acid chlorogenic trong một số mẫu dược liệu Ké đầu ngựa thu hái tại các vùng khác nhau của Việt Nam. 1
10. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cây Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.) 1.1.1. Vị trí phân loại Ké đầu ngựa có tên khoa học là Xanthium strumarium L., thuộc họ Cúc Asteraceae, hay còn gọi là Thương nhĩ (tên Trung Quốc), Phát ma (tên Thổ). Ở Trung Quốc, gọi quả ké là Thương nhĩ tử (Fructus Xanthii strumarii) [4]. Vị trí phân loại của Xanthium strumarium L.: Giới: Thực vật (Plants) Ngành: Ngọc lan (Magnoliaphyta) Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida) Bộ: Cúc (Asterales) Họ: Cúc (Asteraceae) Chi: Xanthium L. Loài: Xanthium strumarium L. [65] 1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố Cây thảo, sống hàng năm, cao khoảng 50 - 80 cm, ít phân cành. Thân hình trụ, cứng, có khía, màu lục, đôi khi có điểm những chấm màu nâu tím, có lông cứng. Lá mọc so le, dài 4 - 10 cm, rộng 4 - 12 cm, chia làm 3 - 5 thùy, mép khía răng không đều, có lông ngắn và cứng ở cả hai mặt, gân chính 3, cuống lá dài 10 cm, có lông cứng [3]. Cụm hoa mọc ở đầu cành hoặc kẽ lá, màu lục nhạt, gồm hai loại đầu, cùng gốc, nhưng đầu trên nhỏ mang hoa lưỡng tính, đầu khác mang hoa cái. Lá bắc xếp thành hai hàng, có lông. Hoa lưỡng tính hình ống, không có mào lông, tràng có 5 thùy, nhị 5, hoa cái không có tràng và mào lông. Quả bế đôi, hình trứng, có hai sừng nhọn ở đầu và phủ dày gai móc, dài 12 - 15 mm, rộng 7 mm [3]. Chi Xanthium L. chỉ có một loài Ké đầu ngựa ở Việt Nam. Cây có nguồn gốc ở châu Mỹ, sau lan ra khắp các vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới châu Á, châu Phi và cả ở châu Âu. Ở Việt Nam, Ké đầu ngựa có ở hầu hết các tỉnh miền núi, trung du và đồng bằng, nhất là các tỉnh phía Bắc, từ Nghệ An trở ra [3]. 2
11. Ké đầu ngựa ưa sáng và ưa ẩm, thường mọc tương đối tập trung thành đám lớn ở các bãi trống, ven đường đi hoặc trên các ruộng trồng hoa màu mới, bỏ hoang. Cây mọc từ hạt vào khoảng tháng 4 - 5, sinh trưởng nhanh trong mùa hè, mùa hoa quả tháng 5 - 8, sau khi có quả sẽ tàn lụi vào khoảng giữa mùa thu [3]. Hình 1.1. Hình ảnh cây Ké đầu ngựa Xanthium strumarium L. [64] 1.1.3. Bộ phận dùng Quả và toàn bộ phần trên mặt đất cây Ké đầu ngựa, quả thu hái khi chưa ngả màu vàng, phơi hoặc sấy khô [3]. 1.1.4. Thành phần hóa học 1.1.4.1. Các Sesquiterpenoid Sesquiterpenoid là thành phần đặc trưng trong nhóm thực vật họ Cúc Asteraceae, có nhiều chức năng sinh học và tác dụng dược lý quan trọng như chống vi khuẩn, chống vi rút, chống khối u và chống viêm [45, 55]. Năm 2015, 8 sesquiterpene đã được phân lập từ quả của X. strumarium, bao gồm sibirolid A (1), sibirolid B (2) và norxanthantolid A – F (3 - 8) [46]. Năm 2008, Han Ting và các cộng sự cũng phân lập được 1β-hydroxyl-5α-chloro-8-pei- xanthatin (9) và 11α,13-dihydro-8-epi-xanthatin (10) từ phần trên mặt đất của X. strumarium [13]. Hai xanthanolid mới là 6β,9β-dihydroxy-8-epi-xanthatin (11) và 2-hydroxytomentosin-1β,5β-epoxid (12) sau đó cũng được tìm thấy trong chiết xuất từ lá cây Xanthium strumarium L. [35]. Bên cạnh đó, dịch chiết lá X. strumarium cũng cho thấy sự có mặt của các hợp chất xanthinin (13), xanthumin (14), xanthanol (15), xanthatin (16), xanthinosin (17) [36, 59]. Ngoài ra, vào năm 1998, Ahmed A. Mahmoud đã phân lập được 3 loại xanthanolid mới từ phần trên mặt đất của X. strumarium bằng phương pháp phổ 1D, 2D NMR độ phân giải cao là 11α,13-dihydroxanthatin (18), 4β,5β- 3
12. epoxyxanthatin-1α,4α-endoperoxid (19) và axit 1β,4β,4α,5α-diepoxyxanth-11(13)- en-12-oic (20) [34]. Bảng 1.1. Cấu trúc của các hợp chất sesquiterpenoid phân lập từ Xanthium strumarium L. STT Tên chất Cấu trúc hóa học TLTK 1 Sibirolid A 2 Sibirolid B 3 Norxanthantolid A 4 Norxanthantolid B [46] 5 Norxanthantolid C 6 Norxanthantolid D 7 Norxanthantolid E 8 Norxanthantolid F 1β-hydroxyl-5α- 9 [13] chloro-8-pei-xanthatin 4
13. 11α,13-dihydro-8-epi- 10 xanthatin 6β,9β-dihydroxy-8-epi- 11 xanthatin [35] 2-hydroxytomentosin- 12 1β,5β-epoxid 13 Xanthinin 14 Xanthumin 15 Xanthanol [36, 59] 16 Xanthatin 17 Xanthinosin 11α, 13- 18 dihydroxanthatin 4β,5β-epoxyxanthatin- 19 [34] 1α,4α-endoperoxid 1β,4β,4α,5α- 20 diepoxyxanth-11(13)- en-12-oic axit 5
14. 1.1.4.2. Các Phenylpropenoid Phenylpropenoid là một trong những nhóm chất quan trọng được tìm thấy trong X. strumarium, tính đến hiện nay, có khoảng 45 loại phenylpropenoid đã được tìm thấy trong loại cây này. Trong đó, các phenolic axit, đặc biệt là axit clorogenic (21) phân lập được từ quả X. strumarium được xem là chất mang tác dụng chống viêm, giảm đau chính của cây [15]. Năm 2012, D. P. Pandey và M. A. Rather đã phân lập được trong dịch chiết methanol cây X. strumarium hợp chất axit caffeic (22) bằng các phương pháp phổ [39]. Năm 2017, từ chiết xuất quả X. strumarium đã xác định được năm hợp chất phenylpropanoid mới là xanthiumnolic A (23) và xanthiumnolic B-E [23]. (22) (23) Hình 1.2. Hợp chất axit caffeic (22) và xanthiumnolic A (23) Trong khoảng thời gian từ năm 1993 - 2016, 10 dẫn xuất của axit caffeoylquinic (CQA) cũng được tìm thấy trong các bộ phận của X. strumarium, bao gồm: Axit 1,3,5-tri-O-CQA (24), axit 3,5-di-O-CQA (25) [7], axit 3,5- dimethyl-CQA (26), axit 1,5-di-O-CQA (27), axit 1,3-di-O-CQA (28) [20], axit 5- O-CQA (29), axit 1,4-di-O-CQA (30), axit 4,5-di-O-CQA (31) [14], axit 4-O-CQA methyl este (32), axit chlorogenic (21) [9]. 6
15. Bảng 1.2. Cấu trúc các dẫn xuất của axit caffeoylquinic được phân lập từ Xanthium strumarium L. S T Hợp chất T Caffeoyl R1 R2 R3 R4 R5 21 Axit clogenic H H H Caffeoyl H Axit 1,3,5-tri- 24 Caffeoyl Caffeoyl H Caffeoyl H O-CQA Axit 3,5-di-O- 25 H Caffeoyl H Caffeoyl H CQA Axit 3,5- 26 dimethyl- H Caffeoyl H Caffeoyl CH3 CQA Axit 1,5-di-O- 27 Caffeoyl H H Caffeoyl H CQA Axit 1,3-di-O- 28 Caffeoyl Caffeoyl H H H CQA Axit 5-O- 29 H H H Caffeoyl H CQA Axit 1,4-di-O- 30 Caffeoyl H H Caffeoyl H CQA Axit 4,5-di-O- 31 H H Caffeoyl Caffeoyl H CQA Axit 4-O- 32 CQA methyl H H Caffeoyl H CH3 este 7
16. 1.1.4.3. Các Coumarin và Lignanoid Trong những năm gần đây, một số nghiên cứu đã phân lập được các hợp chất lignanoid và coumarin trong X. strumarium. Cụ thể, năm 2011, Suqin Kan và những cộng sự đã tách chiết được từ rễ cây X. strumarium 4 loại coumarin là scopoletin (33), jatrocin B (34), cleomiscosin A (35) và cleomiscosin C (36) bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR và phương pháp khối phổ MS [26]. (33) (34) (35) (36) Hình 1.3. Các hợp chất coumarin được phân lập từ Xanthium strumarium L. Năm 2018, trong một nghiên cứu về nhóm chất lignan trong quả khô Ké đầu ngựa (Fructus Xanthii strumarii) của H. Jiang và cộng sự đã phân lập được nhiều hợp chất lignanoid khác, ví dụ như: (-)-1-O-β-D-glucopyranosyl-2-{2-methoxy-4- [1-(E)-propen-3-ol]phenoxyl}-propane-3-ol (37), leptolepisol D (38), dihydrodehydrodiconiferyl alcohol (39), chushizisin E (40) [24]. (37) (39) (38) (40) Hình 1.4. Các hợp chất liganolid được phân lập từ Xanthium strumarium L. 8
17. 1.1.4.4. Các hợp chất khác Ngoài những nhóm chất chính nêu trên, trong cây X. strumarium còn chứa rất nhiều nhóm chất hóa học khác. Trong nghiên cứu về các thành phần hóa học từ rễ cây Xanthium sibiricum của Suqin Kan và cộng sự năm 2011 không chỉ phân lập được 4 coumarin nêu trên mà còn phân lập được năm hợp chất steroid, bao gồm: β- sitostenon (41), β-sitosterol (42), daucosterol (43), stigmast-4-en-β-ol-3-on (44) và 5α,8α-epidioxy-22E-ergosta-6,22-dien-3β-ol (45) [26]. Các nhóm chất glycosid cũng được chứng minh sự có mặt của chúng trong X. strumarium, năm 1975, JC. Craig và các cộng sự đã xác định được tác nhân hạ đường huyết – carboxyatractylosid (46) từ X. strumarium [10]. Năm 2013, 4 hợp chất glycosid mới đã được phân lập từ chiết xuất ethanol của Fructus Xanthii là 3β-norpinan-2-on-3-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D- glucopyranosid (47), (6Z)-3-hydroxymethyl-7-methylocta-1,6-dien-3-ol-8-O-β-D- glucopyranosid (48), (6E)-3-hydroxymethyl-7-methylocta-1,6-dien-3-ol-8-O-β-D- glucopyranosid (49) và 7-[(β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl) oxymethy]-8,8-dimethyl-4,8-dihydrobenzo [1,4] thiazin-3,5-dion (50) [21]. Bảng 1.3. Cấu trúc của các hợp chất steroid và glycosid đã được phân lập từ Xanthium strumarium L. STT Tên chất Cấu trúc hóa học TLTK 41 β-sitostenon 42 β-sitosterol [26] 43 Daucosterol 44 Stigmast-4-en-β-ol-3-on 9
18. 5α,8α-epidioxy-22E- 45 ergosta-6,22-dien-3β-ol 46 Carboxyatractylosid [10] 3β-norpinan-2-on-3-O- β-D-apiofuranosyl- 47 (1→6)-β-D- glucopyranosid (6Z)-3-hydroxymethyl- 7-methylocta-1,6-dien- 48 3-ol-8-O-β-D- glucopyranosid (6E)-3-hydroxymethyl- [22] 7-methylocta-1,6-dien- 49 3-ol-8-O-β-D- glucopyranosid 7-[(β-D-apiofuranosyl- (1→6)-β-D- glucopyranosyl) 50 oxymethy]-8,8- dimethyl-4,8- dihydrobenzo[1,4] thiazin-3,5-dion Ngoài ra, tại Việt Nam, trong hai năm 1969 và 1970, Đỗ Tất Lợi, Phạm Kim Loan và Nguyễn Văn Cát (Trường Đại học Dược Hà Nội) cũng đã định tính và định lượng iod trong cây Ké đầu ngựa Việt Nam. Kết quả cho thấy rằng, dù cây ké mọc ở miền núi hay đồng bằng, gần biển hay xa biển đều có chứa iod với hàm lượng khá cao, 1 gam lá hoặc thân chứa trung bình 200 μg, 1g quả chứa 220 - 230 μg, nước sắc 15 phút cô thành cao chứa 300 μg trong 1g cao [4]. 10
19. 1.1.5. Một số tác dụng dược lý của cây Ké đầu ngựa 1.1.5.1. Tác dụng chống khối u Tác dụng chống khối u được xem là tác dụng dược lý chính của X. strumarium và đã được nghiên cứu rộng rãi qua nhiều công trình khoa học, bao gồm ung thư phổi, ung thư vú, ung thư gan, ung thư ruột kết và một số dòng tế bào ung thư khác. Năm 1995, Ahn và cộng sự báo cáo rằng xanthatin và 8-epi-xanthatin phân lập được từ lá của X. strumarium có hoạt tính gây độc tế bào đáng kể đối với dòng tế bào HCT-15 gây ung thư ruột kết với giá trị ED50 (Effective Dose) lần lượt là 1,1 và 0,1 μg/mL [60]. Năm 2013, một nghiên cứu về tác dụng ức chế glycogen synthase kinase 3β (GSK3β) của xanthatin - một sesquiterpen lacton được phân lập từ X. strumarium đã được tiến hành bởi Tao và những người cộng sự. Nghiên cứu cho thấy, xanthatin ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thư phổi NSCLC (non-small cell lung cacer) dòng tế bào A549, H1975, H1299, H1650 và HCC827 của con người. Các nghiên cứu khác của Tao và cộng sự sau đó cũng phát hiện ra rằng xanthatin có khả năng ức chế STAT3, GSK3β và β-catenin. Ngoài ra, xanthatin còn có thể kích hoạt phản ứng phá hủy ADN qua trung gian Chk1 và làm mất ổn định gen Cdc25C thông qua sự thoái hóa lysosomal trong các tế bào ung thư phổi [48, 49, 50]. Năm 2007, bằng phương pháp xét nghiệm CellTiter 96 in vitro, Ramı'rez- Erosa và các cộng sự phát hiện ra rằng xanthatin và xanthinosin, hai loại sesquiterpen lacton có trong X. strumarium cho thấy hoạt động gây độc tế bào in vitro với các dòng tế bào ung thư ở người, bao gồm tế bào ung thư đại tràng WiDr ATCC, tế bào ung thư vú MDA-MB-231 và tế bào ung thư phổi NCl-417. Các chiết xuất chloroform phần trên mặt đất của X. strumarium cho thấy độc tính cao nhất với tất cả các dòng tế bào thử nghiệm, giá trị nồng độ ức chế 50% đối tượng thử IC50 thu được từ những thử nghiệm đa liều nằm trong khoảng 0,1 – 6,2 μg/mL [43]. Năm 2016, trong một nghiên cứu về các hợp chất gây độc tế bào từ phần trên mặt đất của X. strumarium của Janet và cộng sự đã cho thấy hợp chất (-) spathulenol có trong X. strumarium mang hoạt tính chống khối u với một số dòng tế bào ung thư như CACO-2 (ung thư đại trực tràng), Hep-G2 (ung thư gan tế bào gan nguyên phát), HeLa và A2780 (ung thư biểu mô buồng trứng) [12]. 11
20. Tác dụng chống khối u của X. strumarium đối với bệnh ung thư gan cũng đã được báo cáo trong những năm gần đây. Liu và cộng sự đã chứng minh rằng xanthatin (5 – 40 μM) có thể gây ra sự chết tế bào Hep-G2 và HeLa bằng cách ức chế thioredoxin reductase và gây căng thẳng oxy hóa [33]. 1.1.5.2. Tác dụng chống viêm mũi dị ứng X. strumarium là một loại thuốc truyền thống được sử dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh về mũi, đặc biệt là viêm mũi dị ứng (AR). Trong nghiên cứu dược lý hiện đại, cơ chế của X. strumarium trong điều trị AR đã được nghiên cứu rộng rãi. Năm 2008, Zhao và cộng sự phát hiện ra rằng chiết xuất methanol từ quả của X. strumarium (MEX) (0,251 mg/mL) có thể điều chỉnh các tế bào mast trung gian (HMC-mediated), tế bào đơn nhân máu ngoại vi trung gian (PBMNC-mediated) dễ bị viêm và các phản ứng miễn dịch được gây ra bởi các cytokin tiền viêm, bao gồm: Interleukin (IL)-4, IL-6, IL-8, GM-CSF và TNF-α [63]. Năm 2010, một nghiên cứu của G.H. Yang và cộng sự đã cho thấy tác dụng ức chế đáng kể của MEX trên hợp chất 40/80 gây ra sự hoạt hóa tế bào mast và sự giảm 2+ cAMP (cyclic adenosine monophosphate) trong tế bào mast ở màng bụng chuột RPMCs (rat peritoneal mast cell). Cơ chế chống dị ứng của MEX có thể liên quan tới sự ức chế hấp thu Ca2+, sự giải phóng histamin và sự tăng cAMP trong RPMCs [61]. Ngoài ra, vào năm 2014, W. Peng và cộng sự đã chứng minh rằng caffeoylxanthiazonosid được phân lập từ quả của X. strumarium có tác dụng cải thiện các triệu chứng của AR trên chuột thí nghiệm thông qua các đặc tính chống dị ứng, chống viêm và giảm đau hiệu quả [42]. 1.1.5.3. Tác dụng chống viêm và giảm đau Vào năm 2005, Kim và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu đánh giá tác dụng chống viêm từ chiết xuất methanol phần thân cây X. strumarium (MEXS) trong cả in vitro và in vivo. Kết quả nghiên cứu cho thấy MEXS nồng độ 30, 60 và 90 mg/mL có khả năng ức chế sản xuất nitric oxit (NO), prostaglandin E2 (PGE2) và yếu tố hoại tử u TNF-α. Ngoài ra, MEXS còn ức chế hoạt động gắn kết ADN của yếu tố nhân kappa B (NF-kB), ngăn cản quá trình sao mã sớm bằng cách ngăn chặn sự giảm dần các chất ức chế kappa B-α (IkB- α) [30]. 12
21. Năm 2016, Hossen và cộng sự đã thực hiện các phương pháp phân tích miễn dịch toàn diện, phân tích mARN để nghiên cứu hoạt động chống viêm của MEXS và cho ra kết luận: Vai trò chống viêm mạnh mẽ của MEXS trong bệnh viêm gan và một số bệnh lý viêm khác có thể là do cơ chế ức chế tín hiệu viêm của MAPK (mitogen-activated protein kinase) và AP-1 (activator protein-1) [17]. Trong một nghiên cứu khác, Hossen và cộng sự cũng nhận thấy hoạt tính chống viêm tiềm tàng của MEXS trên các đại thực bào được điều trị bằng LPS (lipopolysaccharide) và mô hình chuột viêm dạ dày do HCl/Etanol gây ra bằng cách ức chế sản xuất NO, PGE2 và ngăn chặn hoạt động của enzym PDK1 (phosphoinositide dependent kinase 1) [16]. 1.1.5.4. Tác dụng chống oxy hóa Năm 2011, Huang và các cộng sự đánh giá hoạt tính chống oxy hóa từ chiết xuất quả X. strumarium cho thấy khả năng loại gốc 2,2′-azino-bis (3- ethylbenzothiazoline-6-sulphonic axit (ABTS) và 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) ở nồng độ 0,05 mg/mL một cách đáng kể [19]. Năm 2015, ba hợp chất là axit hexadecanoic, α-amyrin và 14-methyl-12,13- dehydro-sitosterol-heptadeconat đã được phân lập từ lá của X. strumarium và tiềm năng chống oxy hóa của chúng cũng được đánh giá. Ba thành phần hóa học cho thấy hoạt động chống oxy hóa một cách đáng kể phụ thuộc vào liều [28]. Ngoài ra, Kamboj và cộng sự đã báo cáo rằng, trong số tất cả các bộ phận của X. strumarium thì chiết xuất từ lá có hàm lượng phenolic và flavonoid cao nhất, cho thấy hoạt động chống oxy hóa mạnh nhất, đó là một công dụng tiềm năng trong phòng ngừa và điều trị các bệnh liên quan đến stress oxy hóa [25]. 1.1.5.5. Tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm Một nghiên cứu của Sato và cộng sự năm 1997 đã chỉ ra rằng hợp chất xanthatin được phân lập từ lá của X.strumarium cho thấy tiềm năng chống lại mạnh mẽ các loài Staphylococcus aureus, bao gồm cả S. aureus kháng methicillin (MRSA) và một số vi khuẩn khác như Staphyloc Focus cholermidis, Bacillus cereus , Klebsiella pneumoniae , Pseudomonas aeruginosa và Salmonella fyphi [44]. Sau đó, A Devkota và RK Das đã tiến hành một nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của X. strumarium trong phòng thí nghiệm. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng chiết xuất methanol của lá cây X. strumarium (MEXL) có khả năng kháng sáu loại vi khuẩn gây bệnh, ba gram âm: Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, 13
22. Escherichia coli và ba gram dương: Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus ở các nồng độ khác nhau (50 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml). Những phát hiện này cho thấy MEXL có tiềm năng phát triển thành thuốc kháng khuẩn [11]. Tương tự như tiềm năng kháng khuẩn, tác dụng chống nấm của X. strumarium cũng đã được các nhà khoa học tiến hành nghiên cứu chuyên sâu. Năm 2002, Kim và cộng sự đã tìm thấy một thành phần chống nấm từ X. strumarium, được đặt tên là deacetylxanthumin. Đây là hoạt chất có thể ức chế sự phát triển của sợi nấm và sự nảy mầm của loài Phytophthora drechsleri với giá trị MIC là 12,5 μg/mL [29]. Ngoài ra, vào năm 2016, Parveen và các cộng sự đã thực hiện phân tách các thành phần từ lá X. strumarium bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ và thu được các hợp chất có khả năng chống nấm như: β-caryophyllen (17.53%), α-cadinol (6.66%), spathulenol (6.09%), limonen (5.66%) và 1,3,5-trimethyl-2[2-nitroallyl] benzen (3.29%). Các chất này cho thấy tác dụng ức chế tăng trưởng đáng chú ý với một số chủng nấm như: A. Niger, Aspergillus flavus, F. oxysporum, Fusarium solani, Alternaria alternata và Penicillium digitatum với giá trị nồng độ kiềm khuẩn tối thiểu MIC và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MBC là 8 μg/mL [41]. 1.1.5.6. Tác dụng dược lý khác Ngoài những tác dụng dược lý nêu trên, X. strumarium còn có nhiều tác dụng dược lý khác cũng đã được nghiên cứu rộng rãi. Năm 2000, Hsu và cộng sự đã tiến hành đánh giá tác dụng hạ đường huyết của axit caffeic – một hợp chất phenolic có trong quả X. strumarium. Kết quả cho thấy, sau khi tiêm tĩnh mạch axit caffeic liều 0,5 – 3,0 mg/kg vào hai mô hình chuột bị tiểu đường kháng streptozotocin và kháng insulin thì xuất hiện sự giảm glucose huyết tương phụ thuộc vào liều do tăng sử dụng glucose [18]. Năm 2015, một nghiên cứu khác cũng chứng minh được rằng thành phần hóa học caffeoylxanthiazonosid (CYXD) được phân lập từ quả của X. strumarium cho tác dụng bảo vệ chống nhiễm trùng trên mô hình chuột nhiễm trùng huyết in vitro và in vivo bằng cách tiêm CYXD vào trong màng bụng chuột với các nồng độ lần lượt là 10, 20 và 40 mg/kg/ngày [57]. Ngoài ra, X. strumarium còn có khả năng chống huyết khối trong sỏi tiết niệu gây ra bởi ethylen glycol thông qua việc ức chế sự hình thành các tinh thể canxi 14
23. oxalat ở thận [40], tiềm năng chống loét, bảo vệ dạ dày nhờ sự sửa chữa ADN, chống gốc tự do, giảm stress [27], chống co giật, giảm thời gian trung bình của giai đoạn co thắt và khởi phát cơn co thắt tim [31]. 1.2. Tổng quan về acid chlorogenic 1.2.1. Công thức hóa học Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của acid chlorogenic [66] Công thức phân tử: C16H18O9 Trọng lượng phân tử: 354, 31 g/mol Tên khoa học theo hệ thống IUPAC: (1S,3R,4R,5R)-3-[(E)-3-(3,4- dihydroxyphenyl)prop-2-enoyl]oxy-1,4,5-trihydroxycyclohexane-1-carboxylic acid Tên khác: 3-O-Caffeoylquinic acid 3-(3,4-Dihydroxycinnamoyl) quinic acid 3-Caffeoylquinic acid (E)-chlorogenic acid [66]. 1.2.2. Tính chất vật lý Acid chlorogenic (CGA) là chất rắn, dạng bột màu trắng hoặc hơi ngả vàng, tan được trong nước và trong dung môi hữu cơ như ethanol, methanol, dimethyl sulfoxyd, dimethylformamid. Đây là một chất khá bền vững, điều kiện bảo quản tốt nhất là 4°C [6]. Nhiệt độ nóng chảy: 205 – 209°C; Độ hòa tan: 40 mg/mL ở 25°C [66]. 1.2.3. Tác dụng dược lý CGA là một trong những hợp chất axit phenolic có thể tìm thấy nhiều trong tự nhiên, đặc biệt là chiết xuất cà phê và trà xanh. Đây là một hợp chất hoá học mang hoạt tính sinh học quan trọng, đóng vai trò như chất chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống viêm, quét gốc tự do cũng như bảo vệ một số cơ quan của cơ thể. 15
24. CGA có khả năng bảo vệ gan bằng cách bảo vệ cơ thể khỏi các tổn thương do hóa chất hoặc lipopolysacarid gây ra [37]. Năm 2017, Tajik và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tổng quan về tác dụng tiềm năng của CGA đối với các dấu ấn sinh học của bệnh lý mãn tính trên động vật và người in vivo. Nghiên cứu cho thấy CGA đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa chuyển hóa chuyển hóa glucose và lipid cũng như các rối loạn liên quan khác. CGA còn cho thấy tiềm năng trong việc chống tiểu đường, chống béo phì và chống ung thư [47]. Tác dụng chống oxy hóa của CGA đã được nghiên cứu bởi Zhang và cộng sự năm 2003, kết quả chứng minh rằng CGA có khả năng dọn gốc hydroxyl (·OH) phụ thuộc vào liều với hằng số tốc độ dọn gốc tự do là 7,73 x 109 M−1 sec−1 [62]. Ngoài ra, tác dụng bảo vệ của CGA trong tình trạng oxy hóa bệnh lý gây ra bởi paraquat đã được kiểm chứng trên chuột. Hoạt động của hồng cầu, glutathion peroxidase và catalase ở gan tăng lên khi sử dụng paraquat, trong khi đó CGA có tác dụng làm giảm những phản ứng này [53]. Năm 2013, Ong và cộng sự đã thực hiện đánh giá sự ảnh hưởng của CGA đến sự dung nạp glucose, độ nhạy insulin, quá trình chuyển hóa lipid và hấp thụ glucse cơ xương trong mô hình chuột Leprdb/db . Nghiên cứu chỉ ra rằng CGA hoạt hóa sự phosphoryl hóa AMPK gây tăng tổng hợp GLUT4, giảm sự hình thành G6Pase, dẫn tới sự ức chế tổng hợp axit béo và tân tạo đường, đồng thời tăng vận chuyển glucose ở cơ [38]. Một nghiên cứu khác cũng nhận định rằng CGA có khả năng kích thích bài tiết insulin từ dòng tế bào tiết insulin INS-1E và tăng hấp thu glucose trong tế bào cơ L6 [52]. CGA trong chiết xuất hạt cà phê còn được chứng minh mang lại tác dụng giảm huyết áp ở chuột và người bị tăng huyết áp một cách tự nhiên thông qua các thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên, có đối chứng [56]. 1.2.4. Một số phương pháp xác định acid chlorogenic CGA là thành phần hợp chất hóa học quan trọng được tiến hành định tính, định lượng trong nhiều mẫu dược liệu khác nhau, tại những đất nước khác nhau. Hầu hết các nghiên cứu trên thế giới đều sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để đánh giá hàm lượng CGA với những điều kiện sắc ký riêng, một số nghiên cứu được tổng kết theo bảng 1.4 dưới đây. 16
25. Bảng 1.4. Một số phương pháp xác định acid chlorogenic STT Mục tiêu nghiên cứu Phương pháp Điều kiện sắc ký TLTK + Cột: Agilent SB-C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 μm) Xác định protocatechuic, + Cột bảo vệ: C18 (5 μm) syringin, axit chlorogenic, + Pha động: Axit phosphoric 0,05% : ACN axit caffeic, liriodendrin (0,01 phút – tỷ lệ 94 : 6 tt/tt, 50 phút – tỷ lệ 65 : 35 tt/tt) 1 HPLC-DAD [32] và isofraxidin trong bột + Nhiệt độ cột: 35°C dược liệu Acanthopanax + Tốc độ dòng: 0,9 ml/phút senticosus + Detector DAD: 200 – 370 nm + Kết quả: Thời gian lưu pic CGA khoảng 15,5 phút + Cột sắc ký: Inertsil ODS-3 C18 (4,6 mm x 250 mm, 5 μm) + Cột bảo vệ: ReproSil-Pur ODS-3 C18 (4 mm x 10 mm) + Pha động: Nước chứa 0,2% axit phosphoric, pH 1,46 (dung môi A) và methanol (dung môi B) + Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút Định lượng CGA trong RP-HPLC- 2 + Thể tích tiêm: 5 μl [8] một số dược liệu Thái DAD + Nhiệt độ cột: 30°C + Bước sóng phát hiện: 325 nm + Kết quả: Hàm lượng CGA cao nhất được tìm thấy trong nụ hoa Lonicera japonica, lá Melissa officinalisa và hạt Coffea canephora ở nồng độ tương ứng là 9,900 ± 0,004; 19,88 ± 17
26. 0,171 và 1,233 ± 0,003 g/100 g cây khô + Cột sắc ký: Phenomenex Luna C18 (2) (4,6 mm x 250 mm, Xác định hàm lượng CGA cỡ hạt 5 μm, cỡ lỗ 100 Å) trong bột dược liệu + Pha động: ACN : axit phosphoric 0,5% (11,5 : 88,5 tt/tt) Lepidogrammitis 3 UV-HPLC + Tốc độ dòng: 1 ml/phút [58] drymoglossoides (Baker) + Bước sóng xác định: 327 nm Ching (L. + Kết quả: Thời gian lưu pic CGA khoảng 15,7 phút và hàm drymoglossoides) lượng CGA trong bột dược liệu đạt 0,24% + Cột sắc ký: Phenomenex RP 18 (250 mm x 5 mm, 5 μm) Nghiên cứu thiết lập chất + Pha động: Acetonitril : axit phosphoric 0,4% (13 : 87 tt/tt) 4 chuẩn CGA từ Kim ngân HPLC + Tốc độ dòng: 1ml/phút [2] hoa + Thể tích tiêm: 20 μl + Bước sóng phát hiện: 327 nm + Cột sắc ký: Ascentis C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm) + Pha động: nước chứa 0,1% acid phosphoric (A) : ACN (B) (20 : 80 tt/tt) Định lượng đồng thời + Tốc độ dòng: 1 ml/phút 5 loganin và axit HPLC-UV + Detector UV/VIS, bước sóng phát hiện đối với loganin và [5] chlorogenic acid chlorogenic lần lượt là 236 nm và 327 nm. + Kết quả: Hàm lượng CGA dao động từ 0,07% đến 0,29% và hàm lượng loganin dao động từ 0,03% đến 0,26% 18
27. + Cột sắc ký: Phenomenex C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 μm) + Pha động: Axit acetic 0,1% : ACN (70:30 tt/tt) Định lượng CGA trong + Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút 6 Ngũ gia bì chân chim HPLC [1] + Thể tích tiêm: 10 μm (Schefflera heptaphylla) + Bước sóng hiện phát: 320 nm + Kết quả: Thời gian lưu pic CGA khoảng 6,7 phút Nhận xét: Thông qua một số nghiên cứu định tính, định lượng CGA nêu trên, có thể thấy được trong các phân tích HPLC, CGA thường được phát hiện ở bước sóng nằm trong khoảng 320 – 327 nm, hệ dung môi pha động thường sử dụng là hỗn hợp dung dịch acid phosphoric (kênh A) và ACN (kênh B). Tùy vào mẫu đối tượng nghiên cứu, hệ số tỷ lệ dung môi pha động và thời gian lưu pic CGA sẽ có sự khác nhau, kết quả hàm lượng CGA trong các mẫu dược liệu cũng có sự khác biệt rõ ràng. 19
28. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là mẫu dược liệu Ké đầu ngựa (Fructus xanthii strumarii) được thu mua ở một số tỉnh thuộc Việt Nam. Mẫu nghiên cứu được gửi về Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu, lưu trữ từ tháng 11/2019 để tiến hành xây dựng phương pháp và đánh giá chất lượng. Dược liệu tươi sau đó được sấy khô ở 60oC, xay nhỏ, bảo quản trong túi bóng kín ở nơi khô ráo thoáng mát. Hình 2.1. Hình ảnh dược liệu Ké đầu ngựa lưu trữ tại Viện Dược liệu Bảng 2.1. Danh sách các mẫu dược liệu Ké đầu ngựa thu thập STT Ký hiệu mẫu Nguồn gốc mẫu Ngày lấy mẫu 1 M1 Hà Nội 17/11/2019 2 M2 Sóc Trăng 25/11/2019 3 M3 Cà Mau 16/12/2019 4 M4 Hồ Chí Minh 23/12/2020 5 M5 Hòa Bình 05/01/2020 6 M6 U Minh 16/01/2020 7 M7 Kiên Giang 27/01/2020 8 M8 An Giang 08/02/2020 9 M9 Thanh Hóa 11/02/2020 10 M10 Hà Giang 15/02/2020 20
29. 2.2. Chất chuẩn, hóa chất và thiết bị 2.2.1. Chất chuẩn - Chất chuẩn: Acid chlorogenic hàm lượng 99,60% (nguyên trạng); SKS: 711211 của AK Scientific, TnC, Mỹ. 2.2.2. Hóa chất - Các dung môi dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao (MeOH, ACN, acid phosphoric) của hãng Merck, Đức. - Các dung môi, hoá chất dùng để xử lý mẫu: MeOH, acid formic của Trung Quốc và đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (P.A.) - Nước cất sử dụng là nước cất hai lần đã được deion hoá. 2.2.3. Thiết bị - Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Shimadzu bao gồm: Hệ bơm binary LC-30AD, detector SPD-M20A DAD, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL-30AC, bộ phận ổn nhiệt CTO-10AS của Shimadzu. Phần mềm điều khiển Labsolution. - Cột sắc ký: Cột silica gel pha đảo C18 (kích thước cột 250 mm x 4,6 mm; kích thước hạt 5 μm). - Bếp cách thủy (Memmert, WB – 14 LO). - Cân phân tích (Precisa XT 220A), độ chính xác 0,00001 g. - Cân kỹ thuật điện tử (Ohaus) độ chính xác 0,01 g - Tủ sấy (Memmert, ULM 500). - Cân xác định độ ẩm (Sartorius, MA – 45). - Máy ly tâm (Hettich Zentrifugen, Universal – 320). - Các dụng cụ thông thường ở phòng thí nghiệm. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Chuẩn bị dung dịch thử - Dung dịch thử: Cân chính xác 0,5 g bột dược liệu Ké đầu ngựa đã rây qua rây số 3 cho vào bình nón, thêm chính xác 20 ml dung dịch acid formic 5% trong MeOH 50%, cân khối lượng. Sau đó siêu âm (công suất 300W, tần số 40 kHz) trong 40 phút, để nguội, cân lại, bổ sung khối lượng giảm bằng dung dịch acid formic 5% trong MeOH 50%. Lắc đều, lọc, thu được dung dịch sắc ký [51]. 21
30. 2.3.2. Chuẩn bị dung dịch chuẩn - Dung dịch chuẩn acid chlorogenic: Cân chính xác khoảng 5,0 mg CGA vào bình định mức 5 ml. Thêm 3 ml dung dịch MeOH 50%, siêu âm cho tan hết. Định mức đến vạch mức bằng methanol 50%, thu được dung dịch chuẩn có nồng độ chính xác khoảng 1 mg/ml. Tiến hành pha loãng thu được dung dịch chuẩn CGA trung gian có nồng độ thích hợp. 2.3.3. Xây dựng phương pháp định lượng acid cholorogenic trong Ké đầu ngựa 2.3.3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký - Khảo sát chương trình pha động: Tiến hành khảo sát chương trỉnh rửa giải gradient với pha động gồm ACN (kênh B) phối hợp với H2O (kênh A). Các kết quả thu được với từng khảo sát được đánh giá, so sánh về thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS), và hệ số đối xứng (AS). RS ≥ 1,5; AS nằm trong khoảng 0,8 – 1,5 (tối ưu xấp xỉ bằng 1); tR của các chất phân tích không quá dài nhưng phải đảm bảo tách xa nhau. Tiến hành sắc ký dung dịch mẫu thử và dung dịch chuẩn CGA trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ghép nối với detector DAD (Shimadzu) để khảo sát điều kiện sắc ký. 2.3.3.2. Thẩm định phương pháp định lượng acid chlorogenic trong Ké đầu ngựa Sau khi khảo sát điều kiện sắc ký, tiến hành thẩm định phương pháp định lượng CGA trong Ké đầu ngựa bằng HPLC theo hướng dẫn của AOAC. a. Độ chọn lọc của phương pháp: - Độ chọn lọc của phương pháp: Là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác như tạp chất hoặc các chất cản trở khác. Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, tính chọn lọc thể hiện trên sắc ký đồ thu được từ mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng, pic của chất cần phân tích tách hoàn toàn với các pic tạp. Trên sắc ký đồ mẫu trắng phải không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn. - Cách xác định: Tiến hành chạy sắc ký dung dịch chuẩn CGA, dung dịch thử và mẫu trắng với chương trình đã lựa chọn. Ghi lại các thông số thời gian lưu và diện tích pic. Thời gian lưu pic CGA của dung dịch chuẩn, dung dịch thử phải tương đương nhau. Pic CGA trong mẫu thử phải tách hoàn toàn với các pic khác trong nền mẫu. 22
31. b. Tính thích hợp hệ thống - Tính thích hợp hệ thống: Là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống phân tích bởi các yếu tố như máy móc, thiết bị. - Cách xác định: Tiến hành sắc ký 6 lần liên tiếp một dung dịch chuẩn CGA đã chuẩn bị ở trên. Ghi lại các giá trị thời gian lưu, diện tích pic. Tính tương thích hệ thống được biểu thị qua độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích. Yêu cầu các giá trị thời gian lưu, diện tích pic có RSD ≤ 2%. c. Khoảng tuyến tính - Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích: Là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa tín hiệu đo được và nồng độ chất phân tích. - Đường chuẩn: Là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ các chất phân tích. Đánh giá đường chuẩn dựa vào giá trị R2 và độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn (Δ). Yêu cầu: 0,99 ≤ R2 ≤ 1. - Cách xác định: Tiến hành sắc kí các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu đo được và nồng độ. Vẽ đồ thị thuộc giữa tín hiệu và nồng độ, sau đó quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính. Việc xác định khoảng tuyến tính thường được khảo sát bắt đầu từ giới hạn định lượng (điểm thấp nhất) và kết thúc là giới hạn tuyến tính (điểm cao nhất). d. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) - Giới hạn phát hiện (LOD – Limit of Detection): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền nhưng chưa thể định lượng được. - Giới hạn định lượng (LOQ – Limit of Quantitation): Là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng được bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chính xác mong muốn. - Cách xác định: Tiến hành pha loãng dung dịch thử đã xác định nồng độ đến nồng độ thấp nhất còn xác định được bằng sắc ký. Xác định tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu S/N. Trong đó: S: Chiều cao tín hiệu của chất phân tích. N: Nhiễu đường nền. 23
32. LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2 – 3 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N=3. LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 - 20 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N=10. e. Độ lặp lại - Độ lặp lại của phương pháp: Là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại và được biểu diễn bằng độ lệch chuẩn SD (Standard Deviation) hay độ lệch chuẩn tương đối RSD (%). - Cách xác định: Tiến hành định lượng 6 lần riêng biệt trên một mẫu dược liệu và tính toán độ lệch chuẩn tương đối, theo AOAC yêu cầu RSD ≤ 3,7% đối với chất phân tích có hàm lượng trong mẫu ≥ 0,1%. 푆 푅푆 (%) = . 100 ⃐ ∑ ( − ̅)2 푆 = √ 푖=1 푖 − 1 Trong đó: xi : Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ i. ̅ : Nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm. N: Số lần thử nghiệm. f. Độ đúng - Độ đúng của phương pháp: Là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa các giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng. - Độ thu hồi (đánh giá độ đúng): Là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu được so với giá trị lý thuyết. - Cách xác định: Thêm vào mẫu Ké đầu ngựa đã được xác định hàm lượng hoạt chất một lượng chính xác chất chuẩn (2 mức thêm chuẩn). Độ thu hồi được tính theo công thức: − 푅(%) = 푡 푛 . 100 % Trong đó: R: Độ thu hồi (%). 푡 : Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử thêm chuẩn (µg/mL). Cn: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử (µg/mL). : Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (mg/mL). 24
33. Độ thu hồi chấp nhận cho trường hợp chất phân tích có hàm lượng trong khoảng 0,1 – 1% là 95,0 – 105,0%. 2.3.4. Áp dụng trên một số mẫu dược liệu Ké đầu ngựa Áp dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hàm lượng acid chlorogenic trong một số mẫu Ké đầu ngựa thu hái tại một số tỉnh ở Việt Nam. 2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu - Một số đặc trưng thống kê: Các đặc trưng thống kê tính dựa vào các hàm số trong Microsoft Excel. Giá trị trung bình (X): Hàm AVERAGE Độ lệch chuẩn (SD): Hàm STDEV 100 SD Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): (%) X - Tương quan hồi quy tuyến tính: Phương trình hồi quy tuyến tính thể hiện quan hệ giữa diện tích pic sắc ký (Y) và nồng độ chất phân tích (C): Y = aC +b Trong đó: Hệ số góc a: Hàm SLOPE Hệ số chắn b: Hàm INTERCEPT Hệ số tương quan R: Hàm CORREL - Hàm lượng acid chlorogenic trong mẫu thử được tính toán theo công thức: C x 20 x P x 100 x 100% X(%) = 1000 x 100 x m x (100-B) Trong đó: X(%): Hàm lượng của CGA trong mẫu thử C: Nồng độ CGA tính từ phương trình đường chuẩn P: Độ tinh khiết của chất chuẩn (%) m: Khối lượng mẫu thử (mg) B: Độ ẩm của mẫu thử (%) 25
34. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 3.1. Khảo sát điều kiện phân tích và quy trình xử lý mẫu Điều kiện phân tích HPLC và quy trình xử lý mẫu đối với phân tích định lượng acid chlorogenic trong dược liệu Ké đầu ngựa được tham khảo dựa trên chuyên luận Xanthii Fructus trong Dược điển Trung Quốc (2015) và một số tài liệu nghiên cứu khác. Các điều kiện phân tích cụ thể như sau: - Xử lý mẫu: Cân chính xác 0,5 g bột dược liệu Ké đầu ngựa đã rây qua rây số 3 cho vào bình nón, thêm chính xác 20 ml dung dịch acid formic 5% trong MeOH 50%, cân khối lượng. Sau đó siêu âm (công suất 300W, tần số 40 kHz) trong 40 phút, để nguội, cân lại, bổ sung khối lượng giảm bằng dung dịch acid formic 5% trong MeOH 50%. Lắc đều, lọc dịch thử qua màng lọc cellulose acetat 0,45 µm thu được dung dịch chạy HPLC. - Chuẩn bị mẫu chuẩn CGA: Cân chính xác khoảng 5,0 mg chất chuẩn CGA, chuyển vào bình định mức 5 ml, thêm khoảng 3 ml methanol 50%, siêu âm cho tan hết, định mức đến vạch mức bằng methanol 50%, thu được dung dịch chuẩn có nồng độ chính xác khoảng 1 mg/ml. Từ dung dịch này, tiến hành pha loãng bằng methanol 50% theo các tỷ lệ khác nhau để thu được các dung dịch chuẩn có nồng độ nhỏ hơn. - Điều kiện phân tích HPLC: + Pha tĩnh: Cột Silica gel pha đảo (C18) (250 mm x 4,6 mm, 5 µm) + Pha động: Nước chứa 0,1% axit phosphoric (kênh A) và ACN (kênh B) (tỷ lệ 20 : 80 tt/tt) + Tốc độ dòng: 0,7 ml/phút + Thể tích tiêm mẫu: 5 µl + Nhiệt độ cột: 25 oC + Detector UV quan sát tại: 327 nm. Đánh giá lại điều kiện phân tích HPLC và quy trình xử lý mẫu trên hệ thống máy móc và phòng thí nghiệm tại Khoa Hóa Phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu, kết quả thu được như hình 3.1 và bảng 3.1. 26
35. Dataf ile Name:AC-115.2_15_015.lcd Sample Name:AC-115.2 Sample ID:15 mAU 175 327nm,4nm 3565529 150 125 100 75 50 25 5847 4540 2411 0 4270 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min A- Sắc kýDataf đ ileồ Name:M10_10_010.lcd HPLC mẫu chuẩn CGA Sample Name:M10 Sample ID:10 mAU 327nm,4nm 125 2725119 100 75 50 25 0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min B- Sắc ký đồ HPLC mẫu thử Ké ầđ u ngựa uV 125000 100000 75000 50000 25000 0 -25000 -50000 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 min C - Sắc kí đồ HPLC phân tích CGA trong dược liệu Ké đầu ngựa Hình 3.1. Sắc ký đồ HPLC phân tích acid chlorogenic trong dược liệu Ké ầđ u ngựa Bảng 3.1. Các thông số đánh giá đối với acid chlorogenic STT Thông số đánh giá Giá trị 1 Thời gian lưu, tR 10,225 Diện tích pic (ứng với dung dịch chuẩn có 2 3565529 nồng độ 13 µg/ml) 3 Độ phân giải, Rs 1,685 4 Hệ số kéo đuôi pic (As) 1,223 27
36. Nhận xét: Các thông số độ phân giải RS = 1,685 > 1,5; hệ số kéo đuôi của pic AS = 1,223, thuộc khoảng 0,8 – 1,5, đều đạt yêu cầu, chứng tỏ điều kiện phân tích HPLC này là phù hợp cho phân tích CGA trong dược liệu Ké đầu ngựa. 3.2. Thẩm định phương pháp phân tích 3.2.1. Tính chọn lọc của phương pháp Tiến hành phân tích 3 mẫu: dung dịch CGA chuẩn, dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu thử thêm chuẩn với điều kiện phân tích HPLC đã trình bày ở mục 2.3.3.2, thu được kết quả đánh giá bằng các sắc ký đồ tương ứng như hình sau: Hình 3.2. Sắc ký đồ đánh giá tính chọn lọc của phương pháp (1-Mẫu chuẩn CGA; 2-Mẫu thử dược liệu Ké đầu ngựa; 3-Mẫu thử dược liệu Ké đầu ngựa thêm chuẩn CGA) Nhận xét: Trên sắc ký đồ thu được cho thấy, thời gian lưu của CGA ở 3 mẫu là tương đương nhau, pic CGA không bị trùng với các pic khác khác, diện tích pic CGA trong mẫu thử thêm chuẩn tăng lên tương ứng với lượng chuẩn thêm vào so với diện tích pic CGA trong mẫu thử, chứng tỏ phương pháp và hệ thống sắc ký có tính đặc hiệu cao. 3.2.2. Tính thích hợp của hệ thống Tính thích hợp của hệ thống được đánh giá theo phương pháp như đã trình bày ở mục 2.3.3.2. Kết quả được đánh giá thông qua giá trị RSD (%) của diện tích pic và thời gian lưu sau 6 lần phân tích lặp lại cùng một mẫu chuẩn CGA có nồng độ 13 µg/ml. Kết quả được trình bày trong bảng 3.2. 28
37. Bảng 3.2. Kết quả đánh giá tính thích hợp hệ thống Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU.s) 1 10,22 3565529 2 10,33 3583510 3 10,27 3567425 4 10,27 3567644 5 10,21 3623564 6 10,24 3488457 Trung bình 10,26 3566022 RSD(%) 0,42 1,23 Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối RSD của diện tích pic và thời gian lưu đều nhỏ hơn 2%, từ đó có thể kết luận rằng các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống HPLC sử dụng là phù hợp và đảm bảo độ ổn định của phép phân tích định lượng CGA trong dược liệu Ké đầu ngựa. 3.2.3. Xác định khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn Chuẩn bị một dãy gồm dung dịch CGA chuẩn có nồng độ tăng dần từ 20 µg/ml đến 160 µg/ml rồi tiến hành phân tích HPLC với các điều kiện như đã trình bày ở mục 2.3.3.2. Kết quả khảo sát sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ CGA được trình bày trong bảng 3.3. Phương trình đường chuẩn thu được như hình 3.3. Bảng 3.3. Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích của pic CGA Diện tích pic Nồng độ tính lại từ Nồng độ (µg/ml) Độ chệch (%) (mAU.s) đường chuẩn (µg/ml) 6,5 2060900 6,325 -2,69 13 3565529 14,789 13,76 39 8000950 39,738 1,89 65 12409380 64,536 -0,71 91 17000180 90,360 -0,70 117 21760950 117,139 0,12 130 24090910 130,246 0,19 Phương trình đường chuẩn (trong Y = 176579.X + 106 khoảng từ 20 µg/ml đến 160 µg/ml) Hệ số tương quan R2 = 0,9998 29
38. 30000000 y = 176579x + 1E+06 25000000 R² = 0.9998 20000000 15000000 S (mAU.s) S 10000000 5000000 0 0 50 100 150 C (µg/ml) Hình 3.3. Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ CGA và diện tích pic Nhận xét: Đường chuẩn được đánh giá thông qua hệ số tương quan R và độ chệch của nồng độ tìm lại được từ đường chuẩn so với nồng độ thực. Kết quả đánh giá đường chuẩn được trình bày trong bảng 3.3 cho thấy độ chêch lệch (∆) tại các nồng độ đều nằm trong giới hạn cho phép (<15%). R2 = 0,9998, nằm trong khoảng 0,99 – 1, cho thấy đường chuẩn được xây dựng có độ tuyến tính cao đảm bảo để thực hiện phép phân tích định lượng CGA trong Ké đầu ngựa. 3.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Phân tích mẫu thử đã được xác định nồng độ CGA, sau đó pha loãng dần đến khi trên sắc kí đồ của dung dịch thử, tại thời gian lưu của CGA, xác định được tỷ lệ S/N = 2 - 3 và S/N = 9 - 11. Từ đó tìm được LOD và LOQ, mỗi mẫu làm lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình. Kết quả thu được là: Tại nồng độ 0,12 (µg/ml) và 0,41 (µg/ml) tỷ lệ S/N tương ứng là 3 và 10. Với kết quả này tôi xác định: - Giới hạn phát hiện (LOD): 0,12 (µg/ml) - Giới hạn định lượng (LOQ): 0,41 (µg/ml) 3.2.5. Độ lặp lại Cân chính xác khoảng 0,5 gam dược liệu, xử lý mẫu theo quy trình đã trình bày ở mục 2.3.3.2 để thu được dung dịch tiêm sắc ký. Tiến hành làm lặp lại 6 lần trên cùng một mẫu dược liệu. Kết quả được trình bày trong bảng 3.4. 30
39. Bảng 3.4. Kết quả đánh giá độ lặp lại Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 mdược liệu (g) 0,5086 0,5158 0,5002 0,5134 0,5206 0,4950 Hàm lượng 0,217 0,214 0,221 0,215 0,212 0,223 CGA(%) Trung bình 0,217 hàm lượng (%) SD 4,243 x 10-3 RSD(%) 1,96 Nhận xét: Hàm lượng trung bình của CGA trong mẫu dược liệu Ké đầu ngựa là 0,217% > 0,1% (tính theo khối lượng dược liệu khô tuyệt đối), với độ lệch chuẩn tương đối RSD =1,96% < 3,7% cho thấy phương pháp xây dựng có độ lặp lại cao. 3.2.6. Độ đúng Mẫu thêm chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,5 gam bột dược liệu Ké đầu ngựa và thêm một lượng CGA chuẩn, quá trình thêm chuẩn được tiến chuẩn bị ở 2 mức: 1,085 mg (ứng với mức thêm chuẩn 50%) và 2,17 mg (ứng với mức thêm chuẩn 100%), được chuẩn bị bằng cách pha cân và thêm trực tiếp lượng chất chuẩn trên vào mẫu thử. Sau đó, tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đã trình bày ở trên. Mẫu không thêm chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,5 gam bột dược liệu và tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đã trình bày ở trên. Định lượng CGA trong mẫu thêm chuẩn và mẫu không thêm chuẩn bằng HPLC, mỗi mức thêm chuẩn được làm lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình. Kết quả được trình bày trong bảng 3.5. 31
40. Bảng 3.5. Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp Nồng Nồng Nồng độ Độ Mức M Nồng độ độ mẫu thêm dược thu Trung bình thêm độ thực thêm thêm chuẩn liệu hồi (%) chuẩn (g) (mg/ml) chuẩn chuẩn tìm lại (%) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) 0,5021 0,161 0,053 98,15 50% 0,5046 0,1085 0,054 0,160 0,052 96,30 98,76 0,4953 0,163 0,055 101,85 0,5032 0,215 0,107 98,62 100% 0,5001 0,1085 0,1085 0,217 0,109 100,46 98,93 0,5056 0,214 0,106 97,70 Nhận xét: Độ thu hồi trung bình của phương pháp định lượng CGA trong dược liệu Ké đầu ngựa bằng HPLC tại mức thêm chuẩn 50% là 98,76%, tại mức thêm chuẩn 100% là 98,93%, đều đạt trong khoảng 95,0 – 105,0%, chứng tỏ phương pháp đã xây dựng có độ đúng cao. 3.3. Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng acid chlorogenic trong các mẫu dược liệu Ké đầu ngựa Áp dụng phương pháp định lượng đã xây dựng và thẩm định, tôi tiến xác định hàm lượng acid chlorogenic trong các mẫu dược liệu Ké đầu ngựa thu hái tại một số tỉnh ở Việt Nam. Mỗi mẫu được tiến hành lặp lại 3 lần độc lập. Kết quả được trình bày trong bảng 3.6. Bảng 3.6. Hàm lượng acid chlorogenic trong mẫu dược liệu Ké ầđ u ngựa thu hái tại Việt Nam Ký Hàm lượng CGA STT hiệu Nguồn gốc mẫu Ngày lấy mẫu (%) mẫu 1 M1 Hà Nội 17/11/2019 0,360 2 M2 Sóc Trăng 25/11/2019 0,144 3 M3 Cà Mau 16/12/2019 0,230 4 M4 Hồ Chí Minh 23/12/2020 0,249 5 M5 Hòa Bình 05/01/2020 0,375 6 M6 U Minh 16/01/2020 0,217 7 M7 Kiên Giang 27/01/2020 0,057 8 M8 An Giang 08/02/2020 0,174 9 M9 Thanh Hóa 11/02/2020 0,077 10 M10 Hà Giang 15/02/2020 0,079 32
41. Nhận xét: Kết quả thu được cho thấy hàm lượng CGA trong dược liệu Ké đầu ngựa thu hái tại Việt Nam nằm trong khoảng từ 0,057 – 0,375%. Trong đó, mẫu Ké đầu ngựa thu hái tại Hòa Bình cho hàm lượng CGA cao nhất (0,375%), mẫu Ké đầu ngựa thu hái tại Kiên Giang cho hàm lượng CGA thấp nhất (0,057%). 33
42. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1. Về thu thập mẫu dược liệu Ké ầđ u ngựa (Xanthium strumarium L.) là một loại thảo dược có vị ngọt, tính ôn, hơi có độc, quy vào kinh phế. Tại Việt Nam, đây là một vị thuốc được dùng để chữa bướu cổ, mụn nhọt, ung thư phát bối (đằng sau lưng), đau răng, đau họng, viêm mũi [4]. Dược lý hiện đại cũng đã có rất nhiều nghiên cứu về các tác dụng chống khối u, chống viêm mũi dị ứng, chống viêm, giảm đau, kháng khuẩn của Ké ầđ u ngựa và đưa ra những kết quả có triển vọng, góp phần chăm sóc sức khỏe con người. Theo tài liệu đã công bố, cây Ké đầu ngựa được tìm thấy ở hầu hết các tỉnh miền núi, trung du và đồng bằng, nhất là các tỉnh phía Bắc, từ Nghệ An trở ra [3]. Trong quá trình thực hiện đề tài, mẫu dược liệu là quả của cây Ké đầu ngựa (Fructus Xanthii strumarii) đã được thu hái tại 10 vùng, bao gồm: Hà Nội, Hòa Bình, Hà Giang, Thanh Hóa, Hồ Chí Minh, An Giang, Sóc Trăng, Kiên Giang, U Minh, Cà Mau. Việc lấy mẫu cơ bản phù hợp với đặc điểm phân bố của cây Ké đầu ngựa, thu thập mẫu từ Bắc vào Nam, tập trung ở các tỉnh phía Bắc. Do điều kiện có hạn về thời gian nên các mẫu dược liệu Ké đầu ngựa tại các địa phương khác chưa được thu thập, tuy nhiên, 10 mẫu nghiên cứu trong đề tài cũng đã góp phần vào việc đánh giá hàm lượng CGA có trong dược liệu Ké đầu ngựa phân bố tại Việt Nam. 4.2. Về xây dựng phương pháp định lượng Acid chlorogenic là một hợp chất mang hoạt tính sinh học được các nhà khoa học quan tâm và tiến hành nghiên cứu tác dụng rộng rãi qua nhiều công trình. Đây là hoạt chất có tác dụng chống viêm, giảm đau, ức chế khối u, chống oxy hóa và có tiềm năng ứng dụng trong phát triển thuốc mới. Tại các nước trên thế giới, việc định lượng CGA trong các mẫu dược liệu, cao dược liệu đã được đề cập đến trong các chuyên luận Dược điển Trung Quốc 2015; Dược điển Mỹ 38, Dược điển châu Âu 8.0. Tại Việt Nam, đã có nhiều công trình định lượng CGA trong một số loài dược liệu như Kim ngân Hoa, Ngũ gia bì chân chim, cao Actiso. Tuy nhiên, chưa có chuyên luận về định lượng CGA trong dược liệu Ké đầu ngựa được công bố trong Dược điển Việt Nam V. Do đó, việc xây dựng phương pháp định lượng CGA trong dược liệu Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.) là cần thiết để nâng cao tiêu chuẩn chất lượng dược liệu. 34
43. Trong đề tài này, tôi tiến hành xây dựng phương pháp định lượng CGA trong dược liệu Ké đầu ngựa trong điều kiện phòng thí nghiệm. Phương pháp HPLC là một trong những phương pháp được sử dụng phổ biến trong phân tích, kiểm nghiệm thuốc, dược liệu với nhiều ưu điểm như: Vừa có khả năng định tính, định lượng, vừa tốn ít mẫu mà kết quả lại có độ chính xác và chọn lọc cao. Quy trình xử lý mẫu tương đối đơn giản, không cần trải qua nhiều giai đoạn phức tạp, không gây thất thoát mẫu và có thời gian xử lý mẫu ngắn, phù hợp với công tác đảm bảo chất lượng dược liệu, tránh tình trạng sai số kết quả quá nhiều. Loại cột sắc ký được sử dụng trong nghiên cứu này là cột Silica gel pha đảo C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm). Đây là loại pha tĩnh được sử dụng rộng rãi trong quy trình định lượng, các điều kiện phân tích sắc có thể dễ dàng áp dụng. Hệ dung môi pha động là hỗn hợp nước chứa 0,1% acid phosphoric : ACN được xây dựng với tỷ lệ 20 : 80 tt/tt, đảm bảo khả năng tách CGA ra khỏi nền mẫu và thu được pic có tính đối xứng nhất. Điều kiện sắc ký này có thể áp dụng để định lượng CGA trong một số mẫu dược liệu khác. 4.3. Về thẩm định phương pháp định lượng Kết quả thẩm định theo hướng dẫn của AOAC trên nền mẫu dược liệu Ké đầu ngựa cho thấy quy trình có tính đặc hiệu cao, đảm bảo độ ổn định của phép phân tích, khoảng tuyến tính, đường chuẩn xây dựng được cho thấy có sự tương quan chặt chẽ giữa nồng độ CGA và diện tích pic tương ứng với hệ số tương quan xấp xỉ 1. Phương pháp có độ nhạy tốt với giới hạn định lượng 0,41 µg/ml, độ lặp lại và độ đúng cao. 4.4. Về kết quả áp dụng phương pháp HPLC định lượng acid chlorogenic trong dược liệu Ké đầu ngựa thu hái tại Việt Nam Nghiên cứu tập trung vào phân tích đánh giá hàm lượng CGA trong mẫu dược liệu Ké đầu ngựa (Fructus Xanthii strumarii). Tuy nhiên, Ké đầu ngựa tại Việt Nam được trồng ở nhiều vùng khác nhau, thời điểm thu hái khác nhau nên hàm lượng CGA sẽ có sự chênh lệch rõ rệt giữa các vùng, khó có thể tiêu chuẩn hóa được dược liệu. Trong nghiên cứu này, tôi tiến hành định lượng CGA trong 10 mẫu dược liệu Ké đầu ngựa, thu hái tại 10 tỉnh thành khác nhau của Việt Nam theo phương pháp HPLC đã xây dựng và thẩm định. Kết quả cho thấy hàm lượng CGA trong các mẫu nghiên cứu có sự khác nhau nhiều, cụ thể: Mẫu Ké đầu ngựa thu hái tại Hòa Bình 35
44. cho hàm lượng CGA cao nhất (0,375%); Mẫu Ké đầu ngựa thu hái tại Kiên Giang cho hàm lượng CGA thấp nhất (0,057%). Hàm lượng CGA có trong các mẫu nghiên cứu trung là 0,196%. Theo Dược điển Trung Quốc 2015, hàm lượng tiêu chuẩn của CGA định lượng được trong Fructus Xanthii không nhỏ hơn 0,25% [51]. Như vậy, có thể thấy hàm lượng trung bình CGA trong dược liệu Ké đầu ngựa thu hái tại Việt Nam có giá trị thấp hơn tiêu chuẩn cơ sở Trung Quốc, cần tiến hành nghiên cứu và tiêu chuẩn hóa thêm để thu được kết quả chính xác nhất. 36
45. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT A. Kết luận Trên cơ sở các kết quả thực nghiệm nghiên cứu đã đạt được của đề tài, tôi rút ra kết luận rằng các mục tiêu đặt ra đã hoàn thành, cụ thể như sau: 1. Đã xây dựng và thẩm định được phương pháp định lượng acid chlorogenic trong dược liệu Ké đầu ngựa bằng phương pháp HPLC. - Đã khảo sát điều kiện sắc ký với điều kiện như sau: + Pha tĩnh: Cột Silica gel pha đảo (C18) (250 mm x 4,6 mm, 5 µm) + Pha động: Nước chứa 0,1% acid phosphoric : ACN (tỷ lệ 20 : 80 tt/tt) + Tốc độ dòng: 0,7 ml/phút + Thể tích tiêm mẫu: 5 µl + Nhiệt độ cột: 25oC + Detector UV quan sát tại: 327 nm. Dung dịch thử: Cân chính xác 0,5 g bột dược liệu Ké đầu ngựa đã rây qua rây số 3 cho vào bình nón, thêm chính xác 20 ml dung dịch acid formic 5% trong MeOH 50%, cân khối lượng. Sau đó siêu âm trong 40 phút, để nguội, cân lại, bổ sung khối lượng giảm bằng dung dịch acid formic 5% trong MeOH 50%. Lắc đều, lọc dịch thử qua màng lọc cellulose acetat 0,45 µm thu được dung dịch sắc ký. Dung dịch chuẩn acid chlorogenic: Cân chính xác khoảng 5,0 mg CGA vào bình định mức 5 ml. Thêm 3 ml dung dịch MeOH 50%, siêu âm cho tan hết. Định mức đến vạch mức bằng methanol 50%, thu được dung dịch chuẩn có nồng độ chính xác khoảng 1 mg/ml. Tiến hành pha loãng thu được dung dịch chuẩn CGA trung gian có nồng độ thích hợp. - Thẩm định phương pháp định lượng theo các tiêu chí của AOAC và đạt yêu cầu về các tiêu chí sau: + Tính chọn lọc của phương pháp: Tính đặc hiệu cao. + Tính thích hợp của hệ thống: RSD < 2%, hệ thống HPLC phù hợp và đảm bảo độ ổn định của phép phân tích định lượng. 37
46. + Khoảng tuyến tính và đường chuẩn: Xây dựng được đường chuẩn trong khoảng nồng độ từ 6,5 - 130 µg/ml và 0,99 ≤ R2 = 0,9998 ≤ 1. + Giới hạn phát hiện là 0,12 µg/ml và giới hạn định lượng là 0,41 µg/ml. + Độ lặp lại: RSD (%) < 2%, độ lặp lại cao. + Độ thu hồi: Độ thu hồi nằm trong khoảng 95,0 – 105,0%, độ đúng cao. 2. Đã áp dụng phương pháp định lượng acid chlorogenic trên 10 mẫu Ké đầu ngựa thu hái tại các vùng khác nhau của Việt Nam. Kết quả cho thấy hàm lượng acid chlorogenic trong các mẫu Ké đầu ngựa nằm trong khoảng 0,057 – 0,375%. Trong đó, mẫu Ké đầu ngựa thu hái tại Hòa Bình cho hàm lượng acid chlorogenic cao nhất (0,375%). B. Đề xuất 1. Áp dụng phương pháp đã xây dựng để tiến hành định lượng acid chlorogenic trong nhiều mẫu dược liệu Ké đầu ngựa tại các vùng khác nhau, thu hái tại những thời điểm khác nhau nhằm tiêu chuẩn hóa dược liệu này trong dược điển Việt Nam. 2. Tiếp tục khảo sát thử nghiệm các điều kiện sắc ký khác để tối ưu hóa phương pháp định lượng acid chlorogenic trong dược liệu Ké đầu ngựa. 38
47. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1. Vũ Bình Dương "Xây dựng phương pháp định lượng acid chlorogenic trong ngũ gia bì chân chim (Schefflera heptaphylla) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao", Tạp chí Dược học, 55(4), 46-50. 2. Lê Thị Thu Hiền (2010), Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn acid chlorogenic từ Kim ngân hoa phục vụ công tác kiểm tra chất lượng thuốc, Luận văn Thạc sĩ, Đại học Dược Hà Nội. 3. Đỗ Bích Huy (2011), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, Tập 1. 4. Đỗ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 5. Nguyễn Thị Hà Ly, Trịnh Thị Nga, Phương Thiện Thương, Nguyễn Thị Hằng, Nguyễn Thị Phương (2019), "Phát triển phương pháp phân tích định lượng đồng thời loganin và acid chlorogenic trong Kim ngân cuộng bằng HPLC-UV", Tạp chí Dược liệu, 24(2), 85-90. 6. Nguyễn Thị Mai, Nguyễn Thị Kiều Anh (2018), "Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid chlorogenic trong viên nang mềm Bổ gan bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao", Tạp chí Dược học, 58(4), 35-39. Tài liệu Tiếng Anh 7. Agata I, Goto S, Hatano T, Nishibe S, Okuda T (1993), "1, 3, 5-Tri-O- caffeoylquinic acid from Xanthium strumarium", Phytochemistry, 33(2), 508-509. 8. Chaowuttikul C, Palanuvej C, Ruangrungsi N (2020), "Quantification of chlorogenic acid, rosmarinic acid, and caffeic acid contents in selected Thai medicinal plants using RP-HPLC-DAD", Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, 56. 9. Cheng Z, Wang L, Chen B, Li F, Wang M (2011), "Chemical constituents from Fructus xanthii", Chin. J. Appl. Environ. Biol, 17, 350-352. 10. Craig Jr JC, Mole ML, Billets S, El-Feraly F (1976), "Isolation and identification of the hypoglycemic agent, carboxyatractylate, from Xanthium strumarium", Phytochemistry. 11. Devkota A, Das RK (2015), "Antibacterial Activities of Xanthium Strumarium L.", Journal of Natural History Museum, 29, 70-77. 12. Ferrer JP, Zampini IC, Cuello AS, Francisco M (2016), "Cytotoxic Compounds from Aerial Organs of Xanthium strumarium", Natural Product Communications, 11(3), 1934578X1601100313. 13. Han T, Zhang H, Li HL, Zhang QY, Zheng HC, Qin LP (2008), "Composition of supercritical fluid extracts of some Xanthium species from China", Chemistry of Natural Compounds, 44(6), 814-816. 14. Han T, Li HL, Hu Y, Zhang QY, Huang BK, Zheng HC (2006), "Phenolic acids in Fructus Xanthii and determination of contents of total phenolic acids
48. in different species and populations of Xanthium in China", Journal of Chinese Integrative Medicine, 4(2), 194-198. 15. Hong Y, Han YQ, Xia LZ, Gui J (2013), "Simultaneous Determination of Nine Phenolic Acid Components in Xanthii Fructus", Chin. Pharm. J, 13, 1109-1112. 16. Hossen MJ, Cho JY, Kim D (2016), "PDK1 in NF-κB signaling is a target of Xanthium strumarium methanolic extract-mediated anti-inflammatory activities", Journal of Ethnopharmacology, 190, 251-260. 17. Hossen MJ, Kim MY, Cho JY (2016), "MAPK/AP-1-targeted anti- inflammatory activities of Xanthium strumarium", The American Journal of Chinese Medicine, 44(06), 1111-1125. 18. Hsu FL, Chen YC, Cheng JT (2000), "Caffeic acid as active principle from the fruit of Xanthium strumarium to lower plasma glucose in diabetic rats", Planta Medica, 66(03), 228-230. 19. Huang MH, Wang BS, Chiu CS, Amagaya S (2011), "Antioxidant, antinociceptive, and anti-inflammatory activities of Xanthii Fructus extract", Journal of Ethnopharmacology, 135(2), 545-552. 20. Hwang SH, Wang Z, Yoon HN, Lim SS (2016), "Xanthium strumarium as an inhibitor of α-glucosidase, protein tyrosine phosphatase 1β, protein glycation and ABTS+ for diabetic and its complication", Molecules, 21(9), 1241. 21. Jiang H, Yang L, Liu C, Hou H, Wang Q (2013), "Four new glycosides from the fruit of Xanthium sibiricum Patr.", Molecules, 18(10), 12464-12473. 22. Jiang H, Yang L, Liu C, Hou H, Wang Q (2013), "Four new glycosides from the fruit of Xanthium sibiricum Patr", Molecules, 18(10), 12464-12473. 23. Jiang H, Yang L, Ma GX, Xing XD, Yan ML (2017), "New phenylpropanoid derivatives from the fruits of Xanthium sibiricum and their anti-inflammatory activity", Fitoterapia, 117, 11-15. 24. Jiang H, Yang L, Xing XD, Yan ML, Guo XY (2018), "Study on lignans from Xanthii Fructus", China Journal of Chinese Materia Medica, 43(10), 2097-2103. 25. Kamboj A, Atri P, Saluja AK (2014), "Phytochemical screening, in-vitro evaluation of antioxidant and free radical scavenging activity of leaves, stems and roots of Xanthium strumarium L.,(Compositae)", Journal of Pharmaceutical Research International, 1-22. 26. Kan S, Chen G, Han C, Chen Z (2011), "Chemical constituents from the roots of Xanthium sibiricum", Natural Product Research, 25(13), 1243-1249. 27. Kandhare AD, Kumar VS, Adil M, Rajmane AR, Ghosh P, Bodhankar SL (2012), "Investigation of gastro protective activity of Xanthium strumarium L. by modulation of cellular and biochemical marker", Oriental Pharmacy and Experimental Medicine, 12(4), 287-299. 28. Kaur M, Kamboj A, Rathour A, Saluja AK (2015), "Isolation and Characterization of Constituents from the Leaves of Xanthium strumarium and their Evaluation for Antioxidant and Antimicrobial Potential", Nat Prod Chem Res, 3(168), 2.
49. 29. Kim DK, Shim CK, Bae DW, Kawk YS, Yang MS, Kim HK (2002), "Identification and biological characteristics of an antifungal compound extracted from Cocklebur (Xanthium Strumarium) against Phytophthora drechsleri", The Plant Pathology Journal, 18(5), 288-292. 30. Kim IT, Park YM, Won JH, Jung HJ, Park HJ (2005), "Methanol extract of Xanthium strumarium L. possesses anti-inflammatory and anti-nociceptive activities", Biological and Pharmaceutical Bulletin, 28(1), 94-100. 31. Kumar KS, Rajkapoor B (2010), "Evaluation of Anti-epileptic Activity of Xanthium strumarium L.", Pharmacologyonline, 2, 850-855. 32. Li Q, Jia Y, Xu L, Wang X, Shen Z, Liu Y (2006), "Simultaneous Determination of Protocatechuic Acid, Syringin, Chlorogenic Acid, Caffeic Acid, Liriodendrin and Isofraxidin in Acanthopanax senticosus HARMS by HPLC-DAD", Biological and Pharmaceutical Bulletin, 29(3), 532-534. 33. Liu R, Shi D, Zhang J, Li X, Han X, Yao X, Fang J (2018), "Xanthatin promotes apoptosis via inhibiting thioredoxin reductase and eliciting oxidative stress", Molecular Pharmaceutics, 15(8), 3285-3296. 34. Mahmoud, Ahmed A (1998), "Xanthanolides and xanthane epoxide derivatives from Xanthium strumarium", Planta Medica, 64(08), 724-727. 35. Malik MS, Sangwan NK, Dhindsa KS (1993), "Xanthanolides from Xanthium strumarium", Phytochemistry, 32(1), 206-207. 36. McMillan C, Chavez PI, Mabry TJ (1975), "Sesquiterpene lactones of Xanthium strumarium in a Texas population and in experimental hybrids", Biochemical Systematics and Ecology, 3(3), 137-141. 37. Naveed M, Hejazi V, Abbas M, Kamboh AA, Khan GJ (2018), "Chlorogenic acid (CGA): A pharmacological review and call for further research", Biomedicine & Pharmacotherapy, 97, 67-74. 38. Ong KW, Hsu A, Tan BKH (2013), "Anti-diabetic and anti-lipidemic effects of chlorogenic acid are mediated by ampk activation", Biochemical Pharmacology, 85(9), 1341-1351. 39. Pandey DP, Rather MA (2012), "Isolation and Identification of Phytochemicals from Xanthium strumarium", International Journal of Chem Tech Research, 4(1), 266-271. 40. Panigrahi PN, Dey S, Sahoo M, Choudhary SS, Mahajan S (2016), "Alteration in Oxidative/nitrosative imbalance, histochemical expression of osteopontin and antiurolithiatic efficacy of Xanthium strumarium (L.) in ethylene glycol induced urolithiasis", Biomedicine & Pharmacotherapy, 84, 1524-1532. 41. Parveen Z, Mazhar S, Siddique S, Manzoor A, Ali Z (2017), "Chemical composition and antifungal activity of essential oil from Xanthium strumarium L. leaves", Indian Journal of Pharmaceutical Sciences, 79(2), 316-321. 42. Peng W, Ming QL, Han P, Zhang QY, Jiang YP (2014), "Anti-allergic rhinitis effect of caffeoylxanthiazonoside isolated from fruits of Xanthium strumarium L. in rodent animals", Phytomedicine, 21(6), 824-829.
50. 43. Ramírez-Erosa I, Huang Y, Hickie RA, Sutherland RG, Barl B (2007), "Xanthatin and xanthinosin from the burs of Xanthium strumarium L. as potential anticancer agents", Canadian Journal of Physiology and Pharmacology, 85(11), 1160-1172. 44. Sato Y, Oketani H, Yamada T, Singyouchi KI, Ohtsubo T (1997), "A Xanthanolide with Potent Antibacterial Activity against Methicillin‐resistant Staphylococcus aureus", Journal of Pharmacy and Pharmacology, 49(10), 1042-1044. 45. Seaman, Frederick C (1982), "Sesquiterpene lactones as taxonomic characters in the Asteraceae", The Botanical Review, 48(2), 121-594. 46. Shi YS, Liu YB, Ma SG, Li Y, Qu J (2015), "Bioactive sesquiterpenes and lignans from the fruits of Xanthium sibiricum", Journal of Natural Products, 78(7), 1526-1535. 47. Tajik N, Tajik M, Mack I, Enck P (2017), "The potential effects of chlorogenic acid, the main phenolic components in coffee, on health: A comprehensive review of the literature", European Journal of Nutrition, 56(7), 2215-2244. 48. Tao L, Fan F, Liu Y, Li W, Zhang L, Ruan J (2013), "Concerted suppression of STAT3 and GSK3β is involved in growth inhibition of non-small cell lung cancer by xanthatin", PLoS One, 8(11). 49. Tao L, Sheng X, Zhang L, Li W, Wei Z (2016), "Xanthatin anti-tumor cytotoxicity is mediated via glycogen synthase kinase-3β and β-catenin", Biochemical Pharmacology, 115, 18-27. 50. Tao L, Cao Y, Wei Z, Jia Q, Yu S (2017), "Xanthatin triggers Chk1- mediated DNA damage response and destabilizes Cdc25C via lysosomal degradation in lung cancer cells", Toxicology and Applied Pharmacology, 337, 85-94. 51. The State Pharmacopoeia Commission of P.R. China (2015), Pharmacopoeia of the People's Republic of China, China Medical Science Press270-271. 52. Tousch D, Lajoix AD, Hosy E, Azay MJ, Ferrare K (2008), "Chicoric acid, a new compound able to enhance insulin release and glucose uptake", Biochemical and Biophysical Research Communications, 377(1), 131-135. 53. Tsuchiya T, Suzuki O, Igarashi K (1996), "Protective effects of chlorogenic acid on paraquat-induced oxidative stress in rats", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 60(5), 765-768. 54. United States Pharmacopeial Convention (2015), United States Pharmacopeia, United States Pharmacopeiale. 55. Vasas A, Hohmann J (2011), "Xanthane sesquiterpenoids: structure, synthesis and biological activity", Natural Product Reports, 28(4), 824-842. 56. Watanabe T, Arai Y, Mitsui Y, Kusaura T, Okawa W, Kajihara Y, Saito I (2006), "The blood pressure-lowering effect and safety of chlorogenic acid from green coffee bean extract in essential hypertension", Clinical and Experimental Hypertension, 28(5), 439-449.
51. 57. Wang YH, Li TH, Wu BQ, Shi YF, Feng DY (2015), "Protective effects of caffeoylxanthiazonoside isolated from fruits of Xanthium strumarium on sepsis mice", Pharmaceutical Biology, 53(9), 1367-1371. 58. Wen J, Kang L, Liu H, Xiao Y, Chen Y. (2012), "A validated UV-HPLC method for determination of chlorogenic acid in Lepidogrammitis drymoglossoides (Baker) Ching, Polypodiaceae", Pharmacognosy Research, 4(3), 148. 59. Winters TE, Geissman TA, Safir D (1969), "Sesquiterpene lactones of Xanthium species. Xanthanol and isoxanthanol, and correlation of xanthinin with ivalbin", The Journal of Organic Chemistry, 34(1), 153-155. 60. Woong AJ, No Z, Ryu SY, Zee OP, Kim SK (1995), "Isolation of Cytotoxic Compounds from the Leaves of Xantbium strumarium L", Natural Product Sciences, 1(1), 1-4. 61. Yan GH, Jin GY, Li GS, Cui CA, Quan GH (2010), "The possible mechanism of inhibitory effect of Xanthium strumarium on mast cells activated by compound 48/80", Progress of Anatomical Sciences, 16, 164-66. 62. Zhang LY, Cosma G, Gardner H, Vallyathan V, Castranova V (2003), "Effect of chlorogenic acid on hydroxyl radical", Molecular and Cellular Biochemistry, 247(1-2), 205-210. 63. Zhao Y, Yang H, Zheng YB, Wong YO, Leung PC (2008), "The effects of Fructus Xanthii extract on cytokine release from human mast cell line (HMC-1) and peripheral blood mononuclear cells", Immunopharmacology and Immunotoxicology, 30(3), 543-552. 64. 65. 66. acid#section=Spectral-Information.