Khóa luận Đánh giá khả năng chống oxy hóa và ức chế enzym α-Glucosidase của Hồng đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook. f.)

Nội dung text: Khóa luận Đánh giá khả năng chống oxy hóa và ức chế enzym α-Glucosidase của Hồng đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook. f.)

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGÔ HÀ LINH TRANG ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE CỦA HỒNG ĐẢNG SÂM (Codonopsis javanica (Blume) Hook. f.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2020
2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGÔ HÀ LINH TRANG ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE CỦA HỒNG ĐẢNG SÂM (Codonopsis javanica (Blume) Hook. f.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: QH2015.Y Người hướng dẫn 1: PGS.TS. BÙI THANH TÙNG Người hướng dẫn 2: ThS. ĐẶNG KIM THU Hà Nội – 2020
3. LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu, hoàn thành khóa luận với đề tài “Đánh giá khả năng chống oxy hóa và ức chế enzym α-glucosidase của Hồng đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook. f.)”, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn nhiệt tình của PGS.TS. Bùi Thanh Tùng và ThS. Đặng Kim Thu. Bên cạnh đó là sự giảng dạy tâm huyết của các thầy cô giáo tại Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội và sự khích lệ, cổ vũ của gia đình đã luôn bên cạnh động viên, tạo điều kiện thuận lợi để tôi học tập, nghiên cứu cho việc hoàn thành khóa luận. Với những tình cảm chân thành, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn và gửi lời cảm ơn trân trọng nhất tới 2 thầy cô đã hướng dẫn tôi trong khóa luận này là PGS.TS. Bùi Thanh Tùng và ThS. Đặng Kim Thu – Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng Khoa Y Dược, người không chỉ tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài này mà còn định hướng cho tôi trên con đường sự nghiệp sắp tới. Nhân dịp này, tôi cũng chân thành cảm ơn Khoa Y Dược đã trang bị cho tôi cơ sở vật chất và cho phép tôi sử dụng các dụng cụ, phòng thí nghiệm để hoàn thành khóa luận. Trong quá trình thực hiện tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô tại các bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, Bào chế, Dược liệu – Dược cổ truyền và Hóa dược – Kiểm nghiệm. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ tôi trong lúc khó khăn cũng như trong quá trình thực hiện khóa luận này. Mặc dù bản thân đã nỗ lực, cố gắng song khó tránh khỏi những hạn chế, thiếu sót. Kính mong quý thầy, cô giáo đóng góp thêm ý kiến để khóa luận được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 6 năm 2020 Tác giả khóa luận Ngô Hà Linh Trang
4. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN 3 MỤC LỤC 4 DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 4 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ 7 DANH MỤC CÁC BẢNG 8 MỞ ĐẦU 1 Chương 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về bệnh tiểu đường 3 1.1.1. Khái niệm 3 1.1.2. Phân loại đái tháo đường 3 1.1.3. Cơ chế bệnh sinh của đái tháo đường tuýp 2 4 1.1.4. Dịch tễ học 4 1.1.5. Các biến chứng 5 1.1.6. Phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường 5 1.2. Enzym α-glucosidase và các chất ức chế enzym α-glucosidase 5 1.2.1. Tổng quan về enzym và chất ức chế enzym 5 1.2.2. Enzym α-glucosidase 6 1.2.3. Các chất ức chế enzym α-glucosidase 7 1.3. Quá trình oxy hóa trong cơ thể và các chất chống oxy hóa 8 1.3.1. Khái niệm 8 1.3.2. Các chất chống oxy hóa 9 1.4. Các phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase và tác dụng chống oxy hóa in vitro 11 1.4.1. Các phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro 11 1.4.2. Các phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro 12 1.5. Tổng quan về Hồng đảng sâm 13 1.5.1. Nguồn gốc, phân loại 13 1.5.2. Đặc điểm thực vật 14 1.5.3. Bộ phận dùng 15 1.5.4. Thành phần hóa học 15 1.5.5. Tác dụng và công dụng 16
5. Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 18 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 18 2.1.2. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 18 2.1.3. Hóa chất, dung môi 18 2.1.4. Thiết bị, dụng cụ 19 2.2. Nội dung nghiên cứu 19 2.3. Phương pháp nghiên cứu 19 2.3.1. Phương pháp chiết xuất 19 2.3.2. Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa của cao rễ Hồng đảng sâm theo phương pháp DPPH 20 2.3.3. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro của cao rễ Hồng đảng sâm 21 2.4. Phương pháp xử lí số liệu 22 Chương 3. KẾT QUẢ 24 3.1. Quy trình chiết xuất và phân đoạn dịch chiết của cao rễ Hồng đảng sâm 24 3.2. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các phân đoạn dịch chiết rễ Hồng đảng sâm theo phương pháp DPPH 25 3.3. Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro của các phân đoạn dịch chiết rễ Hồng đảng sâm 27 Chương 4. BÀN LUẬN 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1
6. DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DMSO Dimethyl sulfoxid DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl ĐTĐ Đái tháo đường EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol FDA Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration) IC50 Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%) iNOS Nitric oxide synthase cảm ứng (Inducible nitric oxide synthase) IU Đơn vị quốc tế (International Unit) n-BuOH n-buthanol pNP p-nitrophenol pNPG p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid RNS Nitrogen hoạt tính ROS Oxy hoạt tính RSS Sulfur hoạt tính SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) 푿 Giá trị trung bình
7. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình Tên Trang 1.1. Cơ chế hoạt động của enzym α-glucosidase. 6 1.2. Nguyên tắc khảo sát hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase. 12 1.3. Hình ảnh cây Hồng đảng sâm 12 1.4. Một số hợp chất được phân lập từ rễ Hồng đảng sâm. 16 2.1. Mẫu dược liệu Hồng đảng sâm. 18 2.2. Sơ đồ chiết phân đoạn rễ Hồng đảng sâm. 20 3.1. Sơ đồ sản phẩm chiết phân đoạn rễ Hồng đảng sâm. 24 Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của cao chiết toàn 3.2. phần và các phân đoạn cao rễ Hồng đảng sâm ở các nồng độ 26 khác nhau. Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa in vitro của acid 3.3. ascorbic. 27 Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế enzym α-glucosidase in vitro 3.4. của cao toàn phần và các phân đoạn của rễ Hồng đảng sâm ở 28 các nồng độ khác nhau. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế enzym α-glucosidase in vitro 3.5. của Acarbose. 28
8. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên Trang 1.1. Nguyên nhân ĐTĐ nguyên phát. 3 1.2. Các hợp chất tự nhiên ức chế enzym α-glucosidase. 7 1.3. Các chất chống oxy hóa nội sinh. 9 Cấu trúc hóa học, ứng dụng của một số chất chống oxy hóa tổng 1.4. hợp. 10 Khả năng chống oxy hóa in vitro của dịch chiết toàn phần và 3.1. các phân đoạn dịch chiết cao rễ Hồng đảng sâm và chất đối 25 chứng ở các nồng độ khác nhau. Khả năng ức chế enzym α-glucosidase in vitro của cao toàn 3.2. phần, các phân đoạn dịch chiết rễ Hồng đảng sâm và chất đối 27 chứng ở các nồng độ khác nhau.
9. MỞ ĐẦU Trên toàn thế giới, đái tháo đường đang ngày một tăng về tỷ lệ, mức độ ảnh hưởng lên các vấn đề sức khỏe khác, là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu, gây ra nhiều biến chứng trầm trọng và ảnh hưởng lớn đến chất lượng cuộc sống. Số lượng người mắc đái tháo đường tăng gấp đôi trong vòng 3 thập kỉ gần đây. Bên cạnh đó, cùng với việc tăng sử dụng thực phẩm không thích hợp, ít hoặc không hoạt động thể lực ở trẻ em, bệnh ĐTĐ tuýp 2 đang có xu hướng tăng ở cả trẻ em, trở thành vấn đề sức khỏe cộng đồng nghiêm trọng. Bệnh ĐTĐ gây nên nhiều biến chứng nguy hiểm, là nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tim mạch, mù lòa, suy thận, và cắt cụt chi [6]. Mặc dù có nhiều tiến bộ mới trong điều trị bệnh tiểu đường bằng các thuốc tân dược đường uống, việc nghiên cứu và phát triển thuốc mới vẫn đang được tiếp tục vì chi phí cao và tác dụng phụ gây ra cho người bệnh. Tại Việt Nam, khuynh hướng quay về với thiên nhiên, tìm tòi, phát triển thuốc Đông y hoặc thuốc Y học cổ truyền ngày càng được chú trọng nhiều hơn khi kết hợp với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật và y học. Với lãnh thổ trải dài từ Bắc tới Nam, thuộc khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm, nước ta có một nguồn tài nguyên thực vật phong phú, đa dạng. Việc sử dụng thảo dược trong y học có nhiều mục đích như là cơ sở cho công nghiệp xanh và công dụng của thảo dược được nhắm đến nhiều đích, hỗ trợ điều trị được nhiều bệnh. Các nhà khoa học cũng tiến hành rất nhiều nghiên cứu chứng minh được các loại thảo dược có tác dụng hạ glucose máu, mang lại nhiều kết quả khá khả quan, có thể được đưa vào sử dụng lâm sàng. Những loài thảo dược này có đặc điểm là chứa lượng lớn các hợp chất tự nhiên có tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym α-glucosidase. Đây là hai đích thường được sử dụng khi nghiên cứu các tác dụng của thảo dược hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường. Hồng đảng sâm (Codonopsis javanica) là một vị thuốc cổ truyền được sử dụng phổ biến tại nhiều nước châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản, [45] Từ nhiều loài thuộc chi Codonopsis như C.lanceolata, C.pilosula, C.ussuriesis, C. subglobosa người ta đã chiết được các triterpen glycosid và các polysaccharid có tác dụng lên hệ miễn dịch giúp điều trị ung nhọt, cải thiện trí nhớ. Ở Việt Nam, chi Codonopsis có 3- 4 loài, trong đó loại Hồng đảng sâm Việt Nam Codonopsis javanica đã được sử dụng từ lâu trong dân gian với nhiều công dụng quý như điều hòa huyết áp, tăng cường sinh lực. Các nghiên cứu phân lập các thành phần hóa học của rễ Hồng đảng sâm cho kết quả có nhiều nhóm chất quý từ tự nhiên như axit phenolic, flavonoid, alcaloid, Một số nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy Hồng đảng sâm có tác dụng chống viêm, kháng khuẩn và hạ đường huyết nhưng qua tìm hiểu thì Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu chứng minh nhằm phát triển loại thảo dược này thành các sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường. Vì vậy, đề tài nghiên cứu khoa học: “Đánh giá khả năng chống oxy hóa và ức chế enzym α-glucosidase của Hồng đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook. f.)” được thực hiện nhằm mục tiêu sau: 1
10. 1. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro theo phương pháp DPPH của các phân đoạn dịch chiết rễ Hồng đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook. f.). 2. Đánh giá tác dụng ức chế enzym anpha-glucosidase in vitro của các phân đoạn dịch chiết rễ Hồng đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook. f.). 2
11. Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về bệnh tiểu đường 1.1.1. Khái niệm Bệnh đái tháo đường là bệnh rối loạn chuyển hóa không đồng nhất, có đặc điểm tăng glucose huyết do khiếm khuyết về tiết insulin, về tác động của insulin, hoặc cả hai. Tăng glucose mạn tính trong thời gian dài gây nên những rối loạn chuyển hóa carbohydrate, protide, lipide, gây tổn thương ở nhiều cơ quan khác nhau, đặc biệt ở tim và mạch máu, thận, mắt, thần kinh [6]. 1.1.2. Phân loại đái tháo đường Đái tháo đường tuýp 1 Đái tháo đường tuýp 1 do tế bào beta bị phá hủy nên bệnh nhân không còn hoặc còn rất ít insulin, 95% do cơ chế tự miễn (tuýp 1A), 5% vô căn (tuýp1 B). Đái tháo đường tuýp 2 Đái tháo đường tuýp 2 do suy giảm chức năng của tế bào beta tụy tiến triển trên nền tảng đề kháng insulin. Bảng 1.1. Nguyên nhân ĐTĐ nguyên phát. Các nguyên nhân ĐTĐ tuýp 1 ĐTĐ tuýp 2 Tiền sử gia đình Kháng nguyên HLA- Đặc tính dân tộc Yếu tố nguy cơ DR3, HLA-DR4 Ăn nhiều, ít tập luyện thể lực Nhiễm độc Nhiễm virus Béo phì Yếu tố khởi phát Stress chuyển hóa/ Stress chuyển hóa/ yêu cầu quá mức yêu cầu quá mức Các tế bào tại đảo tụy thoái hóa/ suy Phá hủy đảo tụy theo Yếu tố bệnh sinh yếu dần cơ chế tự miễn Giảm receptor insulin Đái tháo đường thai kỳ ĐTĐ thai kỳ là ĐTĐ được chẩn đoán trong 3 tháng giữa hoặc 3 tháng cuối của thai kỳ và không có bằng chứng về ĐTĐ tuýp 1, tuýp 2 trước đó. Thể bệnh chuyên biệt của ĐTĐ - Đái tháo đường thứ phát Thể bệnh chuyên biệt của ĐTĐ do các nguyên nhân khác như ĐTĐ do bệnh lý nội tiết, do thuốc, hóa chất, bệnh lý tụy; khiếm khuyết gen liên quan đến hoạt tính 3
12. insulin, khiếm khuyết trên nhiễm sắc thể thường, di truyền theo gen tại tế bào beta; các hội chứng bất thường nhiễm sắc thể khác, [3, 4, 6] 1.1.3. Cơ chế bệnh sinh của đái tháo đường tuýp 2 Hai yếu tố cơ bản trong cơ chế bệnh sinh là kháng insulin và rối loạn tiết insulin. 1.1.3.1. Cơ chế liên quan đến kháng insulin Kháng insulin là tình trạng giảm hoặc mất tính nhạy cảm của cơ quan đích với insulin. Kháng insulin do nhiều nguyên nhân: tế bào beta tiết insulin bất thường, có chất đối kháng insulin lưu thông trong máu như: glucagon, cortisol, catecholamine, hormon GH, axit béo tự do (FFA), kháng thể kháng insulin, kháng thể kháng thụ thể insulin, resistin, TNF alpha (Tumor Necrosis factor alpha), IL-6 (Interleukin-6) [20]. 1.1.3.2. Cơ chế liên quan đến rối loạn tiết insulin Khi mới mắc tiểu đường tuýp 2, insulin có thể ở mức bình thường hoặc tăng lên nhưng tốc độ tăng không tương ứng với mức tăng của glucose máu. Tế bào beta đảo tụy đáp ứng lại việc nồng độ glucose trong máu tăng quá cao bằng cách sản xuất nhiều hơn insulin. Quá trình này kéo dài khiến chức năng của tế bào beta bị suy giảm [24]. Tăng insulin máu bù trừ, tăng tiền chất không có hoạt tính proinsulin, mất tính chất tiết insulin theo từng đợt là các nguyên nhân gây rối loạn tiết insulin. 1.1.4. Dịch tễ học Đái tháo đường là căn bệnh rối loạn chuyển hóa đáng báo động nhất trên toàn thế giới ngay cả ở những nước phát triển và đang phát triển. Nó gây ra gánh nặng lên xã hội, hệ thống tài chính, y tế một cách nghiêm trọng. Theo Liên đoàn Đái tháo đường Thế giới (IDF), trong năm 2019, trên toàn thế giới có 463 triệu người trong độ tuổi 20-79 (chiếm 9,3% tổng số người trưởng thành trong độ tuổi này) mắc bệnh tiểu đường, dự kiến sẽ tăng lên 578,4 triệu vào năm 2030 và 700,2 triệu vào năm 2045. Phân loại bệnh học của bệnh tiểu đường chủ yếu phân tách thành tuýp 1 và tuýp 2, với ĐTĐ tuýp 2 chiếm phần lớn (> 85%) trong tổng tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ. Trong năm 2019, hơn một nửa trong số những người mắc tiểu đường (231,9 triệu người) không biết họ đang mắc bệnh, có 4,2 triệu ca tử vong trên toàn thế giới là do bệnh tiểu đường ở độ tuổi từ 20-99 và chi phí chăm sóc sức khỏe toàn cầu cho người mắc bệnh tiểu đường được ước tính là 760.3 tỷ USD. Tại Việt Nam, có 3,77 triệu người đang chung sống với bệnh đái tháo đường, chiếm 5,7% dân số từ 20 – 79 tuổi. Trong đó, 53,4% người bệnh chưa được chẩn đoán và 70% bệnh nhân đã được chẩn đoán ĐTĐ tuýp 2 song chưa đạt mục tiêu điều trị [40]. 4
13. 1.1.5. Các biến chứng Một số biến chứng nguy hiểm và các bệnh cấp tính, mạn tính kèm theo xuất hiện khi bệnh tiểu đường không được điều trị tốt và quá trình điều trị không chặt chẽ. Biến chứng cấp tính giai đoạn đầu của đái tháo đường thường gặp: nhiễm toan ceton – hay xảy ra đối với đái tháo đường tuýp 2, hôn mê do tăng áp lực thẩm thấu máu, hạ đường huyết – hay gặp ở người bệnh dùng thuốc hạ đường huyết quá liều hoặc dùng thuốc trong khi đói bỏ bữa. Một số biến chứng mạn tính như: biến chứng mạch máu lớn (tăng huyết áp, rối loạn lipid máu, bệnh mạch vành, ), bệnh lý mạch máu nhỏ (bệnh lý thận, bệnh lý về võng mạc, bệnh lý thần kinh, ) [4, 6]. Các biến chứng của bệnh đái tháo đường tuýp 2 có liên quan đến quá trình phát sinh và phát triển của bệnh. Do đó ngay khi phát hiện bệnh trên lâm sàng, bác sĩ đã phải tìm được các biến chứng của bệnh. 1.1.6. Phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường Dựa vào tác dụng và cơ chế tác dụng, các thuốc điều trị bệnh ĐTĐ được chia thành 3 nhóm chính: Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin như sulfonylurea, nateglinid (starlix) Các thuốc làm tăng tính nhạy cảm của thụ thể với insulin, giảm đề kháng insulin như: các biguanid (metformin), các thuốc nhóm thiazolidincdion. Các thuốc chống tăng glucose máu sau bữa ăn, thuốc ức chế enzyme α- glucosidase như: acarbose, voglibose, miglitol, làm chất đường trong ruột được hấp thụ chậm vào cơ thể và đường ngay sau khi ăn sẽ không tăng cao trong máu. Ở bệnh nhân ĐTĐ tuýp 2, cần kết hợp điều trị bằng thuốc, chế độ ăn và luyện tập thể chất để đạt hiệu quả quả tốt nhất. Ngoài ra, sẽ có một số đối tượng có bệnh lý mắc kèm hay thể trạng khác nhau nên cần kết hợp các thuốc trong nhóm với nhau và lưu ý tương tác thuốc nhằm giảm đường huyết an toàn và hữu hiệu. 1.2. Enzym α-glucosidase và các chất ức chế enzym α-glucosidase 1.2.1. Tổng quan về enzym và chất ức chế enzym Enzym là chất xúc tác sinh học được hình thành trong mọi tế bào sinh vật dưới dạng hợp chất protein có cấu trúc hóa học đặc thù. Nhờ có enzym mà nhiều phản ứng hóa học xảy ra với hiệu suất cao mặc dù ở điều kiện bình thường về nhiệt độ, áp suất, pH. Các phần tử tham gia vào ngay lúc đầu của quá trình phản ứng được gọi là chât nền và enzym biến đối chất nền thành các phân tử khác. Enzym có tính đặc hiệu và chọn lọc rất cao đối với các chất nền của nó, đóng vai trò định hướng tất cả mọi phản ứng xảy ra trong tế bào [16, 27]. Chất ức chế enzym có khả năng làm yếu hoặc chấm dứt hoàn toàn tác dụng của enzym. Bản chất hóa học của các chất ức chế enzym rất khác nhau, có thể là các protein, các hợp chất hữu cơ phân tử nhỏ, các anion hoặc các ion hóa kim loại, tạo 5
14. phản ứng thuận nghịch hoặc không thuận nghịch với enzym. Thường sẽ có hai loại ức chế thuận nghịch là ức chế cạnh tranh và ức chế không cạnh tranh [16, 27]. Đối với chất ức chế cạnh tranh: chất kìm hãm có cấu trúc tương tự như cơ chất, gắn thuận nghịch vào trung tâm phản ứng của enzym, làm chức năng xúc tác của enzym chậm lại. Đối với chất ức chế không cạnh tranh: chất kìm hãm gắn thuận nghịch vào vị trí khác trên enzym (gọi là vị trí dị lập thê) chứ không gắn vào vị trí xúc tác và làm thay đối cấu hình, vị trí hoạt động của enzym khiến không phù hợp để cơ chất gắn vào. Khi giải phóng các chất ức chế, hoạt tính xúc tác của enzym sẽ bình thường trở lại [16]. 1.2.2. Enzym α-glucosidase Enzym α-glucosidase là enzym một thành phần, thuộc nhóm hydrolase (nhóm enzym làm gãy các liên kết bằng thủy phân), có trong màng bề mặt đường ruột, tham gia vào bước cuối của quá trình tiêu hóa carbohydrat [21, 44]. Enzym α-glucosidase có những tên gọi khác như maltase, glucoinvertase, glucosidosucrase, maltase glucoamylase, α-glucopyranosidase, glucosidoinvertase, α-D-glucosidase, α- glucoside hydrolase, α-1,4-glucosidase, α-D-glucoside glucohydrolase. Cơ chế hoạt động của enzym α-glucosidase: glucose được cung cấp bởi carbohydrat chứa trong thức ăn. Sau khi vào cơ thể, carbohydrat được các enzym ở tụy (α-amylase) và ruột non (α-glucosidase) tiết ra, thủy phân thành những phân tử đường đơn rồi thẩm thấu vào máu, tỏa ra để nuôi các tế bào cơ thể. Enzym α- glucosidase có chức năng xúc tác việc cắt đứt liên kết 1,4-α-D-glucosid của cơ chất đề giải phóng α-D-glucose [49]. Có thể làm giảm sự thủy phân carbohydrat và chậm sự thẩm thấu glucose vào máu bằng việc kiểm soát hoạt động của enzym α- glucosidase [35]. Hình 1.1. Cơ chế hoạt động của enzym α-glucosidase. 6
15. 1.2.3. Các chất ức chế enzym α-glucosidase 1.2.3.1. Chất ức chế enzym α-glucosidase tổng hợp Các thuốc tân dược có tác dụng ức chế enzym α-glucosidase tại ruột, làm giảm sự hấp thu glucose vào máu sau ăn như Acarbose, Miglitol, Voglibose được sử dụng rộng rãi trong điều trị đái tháo đường tuýp 2 [3]. Acarbose là một tetrasaccharid, ít hấp thu ở đường tiêu hóa và ức chế cạnh tranh với enzym α-glucosidase mà không gây hạ đường huyết và không gây tăng tiết insulin. Tuy vậy, nó lại để lại nhiều tác dụng phụ trên đường tiêu hóa như đầy hơi, chướng bụng, tiêu chảy, buồn nôn, nhất là khi ăn đường mía và thực phẩm có đường do carbohydrat không được hấp thụ và lên men ở đại tràng [5]. 1.2.3.2. Chất ức chế enzym α-glucosidase tự nhiên Việc tìm kiếm các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên đang rất được quan tâm để khắc phục những nhược điểm của các hợp chất tổng hợp. Hiện nay, các nhà khoa học đã tìm ra được một số nhóm hợp chất ức chế enzym α-glucosidase như flavonoid, alcaloid, curcuminoid, phenolic, terpinoid, Bảng 1.2. Các hợp chất tự nhiên ức chế enzym α-glucosidase [44]. STT Nhóm hợp chất Tên hoạt chất Quercetin 3-O-β-d-xylopyranosyl (1’”→2”)-β- dgalactopyranoside, Luteolin, Apigennin, Hesperetin, (+)-catechin, Cyanidin-3-galactoside, 1 Flavonoid Cyanidin-3-galactoside 2R,3R.4R,5R)2,5- bis(hydroxymethyl)-3,4-dihydroxypyrrolidine, 1- deoxynojirmycin Piperumbellactam A 2 Alcaloid Piperumbellactam B Piperumbellactam C Axit 3b-Acetoxy-16b-hydroxybetulinic 28-O-α-larabinopyranosyl-(1→4)-a-l- 3 Saponin-triterpenoid arabinopyranosyl-(I→3)-β-d-xylopyranosyl-(1→4)- α-Irhamnopyranosyl-(1→2)-β-d-fucopyranosyl ester Curcumin 4 Curcuminoid Demethoxycurcumin Bisdemethoxycurcumin Chebulanin 5 Phenolic Chebulagic axit 7
16. Chebulinic axit (-)-3-O-galloylepicatechin (-)-3-O-galloylcatechin Bromophenols 6 Miscellaneous 2,4,6-trbromophenol 2,4-dibromophenol 1.3. Quá trình oxy hóa trong cơ thể và các chất chống oxy hóa 1.3.1. Khái niệm Oxy hóa là quá trình xảy ra phản ứng hóa học, khi mà các electron chuyển thành chất oxy hóa, hình thành nên gốc tự do. Sự gia tăng các gốc tự do sinh ra các phản ứng dây chuyền, dẫn đến phá hủy tế bào cơ thể. Các gốc tự do là trạng thái cấu trúc của phân thử có một điện tích lẻ ở quỹ đạo điện tử ngoài cùng, bao gồm các nguyên tử, phân tử, ion, electron chưa ghép gặp. Chúng rất không ổn định và tạo phản ứng hóa học với các phân tử khác. Các dạng hoạt động của gốc tự do là ROS (Oxy hoạt tính), RNS (Nitrogen hoạt tính), RSS (Sulfur hoạt tính) [2, 32]. Các gốc tự do rất kém ổn định, có khả năng phản ứng cao với các chất, thời gian tồn tại ngắn phụ thuộc vào bản chất và điều kiện của hệ mà nó tồn tại [23, 32]. Cơ chế hình thành các gốc tự do trong cơ thể: Từ chuỗi hô hấp tế bào trong ty thể. Từ quá trình peroxyd hóa lipid. Từ phản ứng tạo gốc khác trong cơ thể. Đích phân tử chính của các gốc tự do gồm các aicd deoxyribonucleic (ADN), acid ribonucleic (ARN), protein, lipid và đường. Một số bệnh nghiêm trọng liên quan đến phản ứng của các gốc tự do như ung thư, tim mạch, tiểu đường, béo phì, lupus ban đỏ, loét dạ dày, Parkinson, bệnh Alzheimer, viêm khớp dạng thấp, ung thư [23, 28, 50] Các cơ chế chống oxy hóa [46]: Ức chế enzym xúc tác làm tăng sản xuất các ROS/ RNS. Tác động vào đường truyền tín hiệu oxy hóa khử, thúc đẩy quá trình chống oxy hóa của tế bào. Phản ứng trực tiếp với các gốc tự do tạo ra các chất ít độc hoặc mất hoạt tính. Stress oxy hóa là sự mất cân bằng giữa các chất oxy hóa và chống oxy hóa, dẫn đến gián đoạn tín hiệu và kiểm soát oxy hóa khử, làm ảnh hưởng xấu đến các 8
17. phân tử sinh học thông qua việc sản sinh các peroxid và các gốc tự do [31]. Vai trò của stress oxy hóa trong sự phát triển các biến chứng đã được nghiên cứu nhằm bổ sung thêm các phương pháp điều trị các biến chứng của bệnh tiểu đường [30]. Do đó, các chất có khả năng chống oxy hóa và cân bằng chất oxy hóa sẽ là chất tiềm năng trong điều trị bệnh đái tháo đường và các biến chứng của đái tháo đường gây ra. 1.3.2. Các chất chống oxy hóa 1.3.2.1. Các chất chống oxy hóa nội sinh Các chất chống oxy hóa nội sinh gồm có 2 loại là các chất có bản chất là enzym và các chất không phải enzym. Chúng đều có tác dụng ngăn chặn sự hình thành hoặc trung hòa các gốc tự do trong cơ thể. Các chất chống oxy hóa nội sinh không phải là enzym được tổng hợp trong cơ thể nhưng rất ít, chủ yếu đến từ thực phẩm bổ sung [32]. Các nhóm chất như flavonoid, carotenoid, đến từ thực vật có khả năng chống oxy hóa rất tốt. Các chất chống oxy hóa nội sinh có thể tác dụng độc lập hoặc hiệp đồng với nhau để chống lại các gốc tự do. Nhờ vậy mà quá trình oxy hóa trong cơ thể chỉ xảy ra ở mức độ nhất định, duy trì được cân bằng trao đổi chất. Nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất chống oxy hóa mới trong thảo dược có thể hỗ trợ điều trị các bệnh có liên quan đến sự oxy hóa trong cơ thể. Bảng 1.3. Các chất chống oxy hóa nội sinh. Bản chất là enzym Không phải enzym Catalase Vitamin A, vitamin C, vitamin E Superoxid dismutase Coenzym Q10 Glutathion peroxidase Hợp chất chứa nito (non-protein): axit Glutathion reductase uric Glucose – 6 phosphat dehydrogenase Hợp chất chứa lưu huỳnh: Glutathion 1.3.2.2. Các chất chống oxy hóa tổng hợp Các chất chống oxy hóa tổng hợp đã được chiết xuất trong phòng thí nghiệm để sử dụng trong hệ thống đo lường tiêu chuẩn chống oxy hóa so sánh với các chất chống oxy hóa tự nhiên và sử dụng trong ngành thực phẩm. Bảng 1.4. báo cáo các chất chống oxy hóa tổng hợp quan trọng nhất và có sẵn rộng rãi cũng như công dụng của chúng, cho thấy trọng tâm chính của chất chống oxy hóa tổng hợp là ngăn ngừa quá trình oxy hóa thực phẩm, đặc biệt là axit béo. BHT (butylated hydroxytoluene) và BHA (butylated hydroxyanisole) là những chất chống oxy hóa hóa học được sử dụng rộng rãi nhất [32]. 9
18. Bảng 1.4. Cấu trúc hóa học, ứng dụng của một số chất chống oxy hóa tổng hợp. Tên hợp chất Công thức cấu tạo Ứng dụng BHA (butylated Chống oxy hóa thực phẩm hydroxyanisole) BHT (butylated Chống oxy hóa thực phẩm hydroxytoluene) TBHQ Chống oxy hóa thực phẩm (tert- chế biến từ động vật butylhydroquinone) PG Chống oxy hóa thực phẩm (propyl gallate) Chống oxy hóa thực phẩm OG và mỹ phẩm (octyl gallate) Kháng nấm 2,4,5-Trihydroxy Chống oxy hóa thực phẩm butyrophenone NDGA (nordihydroguaiaretic Chống oxy hóa thực phẩm acid) Ngăn ngừa thực phẩm bị 4-Hexylresorcinol thâm đen 10
19. 1.3.2.3. Các chất chống oxy hóa có nguồn gốc từ thực vật Một số thực phẩm, đặc biệt là các thực vật, rất giàu chất chống oxy hóa thuộc nhiều nhóm khác nhau. Trong đó, đáng chú ý nhất là các dẫn xuất của phenol và các vitamin: Vitamin C (axit ascorbic): axit ascorbic bao gồm hai hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa (axit L-ascorbic, axit L-dehydroascorbic) được hấp thụ qua đường tiêu hóa, loại bỏ các gốc tự do anion superoxide, hydro peroxide, gốc hydroxyl, oxy nhóm đơn và oxit nitơ phản ứng ở pha nước của tế bào, tái tạo lại vitamin E ở dạng oxy hóa thành dạng khử [32, 33]. Vitamin E (tocopherol): vitamin E bao gồm tám đồng phân, với bốn tocopherol (α-tocopherol, β-tocopherol, γ-tocopherol, δ-tocopherol) và bốn tocotrienols (α-tocotrienol, β-tocotrienol, γ-tocotrienol, δ- tocotrienol). Nó ngăn chặn quá trình peroxy hóa lipid bằng cách liên kết gốc hydro phenolic của nó với các gốc peroxyl, tạo thành các gốc tocopheroxyl không thể tiếp tục phản ứng chuỗi oxy hóa [32]. Vitamin K: hòa tan trong chất béo, cần thiết cho quá trình chuyển đổi glutamate liên kết với protein thành γ-carboxyglutamate. Cấu trúc 1,4- naphthoquinone có tác dụng chống oxy hóa. Hai đồng dạng tự nhiên của vitamin này là K1 và K2 [32]. Flavonoid: Flavonoid là một nhóm các hợp chất chống oxy hóa bao gồm flavonol, flavanol, anthocyanin, isoflavonoid, flavanone và flavones. Các nhóm hydroxyl phenolic của flavonoid có cấu trúc vòng, có đặc tính chống oxy hóa hoạt động như các chất khử, cho hydro, chất khử oxy nhóm đơn, thu dọn gốc superoxide và tạo phức chelat. Chúng cũng kích hoạt các enzyme chống oxy hóa, giảm các gốc α-tocopherol (tocopheroxyls), ức chế các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa-khử, giảm nitro hóa, tăng mức axit uric và các phân tử trọng lượng phân tử thấp. Một số flavonoid có hoạt tính chống oxy hóa cao là catechin, catechin-gallate, quercetin, kaempferol, EGCG từ trà xanh, Genistein trong đậu nành [32, 39]. Ngoài ra còn có nhiều dẫn chất khác thuộc nhóm các phenolic tự nhiên cũng có tác dụng chống oxy hóa như axit phenolic, lingin, carotenoid, 1.4. Các phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase và tác dụng chống oxy hóa in vitro 1.4.1. Các phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro Phương pháp nghiên cứu ức chế enzym α-glucosidase trong điều trị đái tháo đường tuýp 2 có cơ chế đơn giản, an toàn, chỉ xảy ra trong bộ phận tiêu hóa chứ không tham gia vào quá trình chuyển hóa đường hay cải thiện chức năng của insulin hoặc kích thích sự sản sinh insulin của tế bào beta tuyến tụy như các phương pháp khác [37]. 11
20. Phương pháp nghiên cứu in vitro để khảo sát hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase của một số hợp chất thiên nhiên dựa trên nguyên tắc: Enzym α-glucosidase khi gặp liên kết a-D-glucopyranosyl sẽ cắt đứt để giải phóng đường D-glucose. Sử dụng chất nền có liên kết α với đường D-glucose như p-nitrophenyl-α- D-glucopyranosid (pNPG), dưới tác dụng của enzym α-glucosidase sẽ bị thủy phân cho ra đường α-D-glucose và p-nitrophenol (pNP). p-nitrophenol hấp thu trong ánh sáng nhìn thấy được, đo độ hấp thu ở bước sóng λ = 405nm. Từ đó xác định được lượng D-glucose sinh ra. Khi sử dụng chất ức chế α-glucosidase sẽ làm cho phản ứng của enzym bị ngừng lại, không tạo ra được sản phẩm D-glucose. α-glucosidase + Hình 1.2. Nguyên tắc khảo sát hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase. 1.4.2. Các phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro Ngày nay, các nhà khoa học trong và ngoài nước đã tiến hành nhiều phương pháp thử nghiệm để xác định hoạt tính chống oxy hóa, chia làm 2 loại là phương pháp in vitro và phương pháp in vivo. Một số thử nghiệm đánh giá in vitro thường được sử dụng: thu dọn gốc tự do DPPH, dọn gốc tự do superoxid O2•, dọn gốc tự do hydroxyl •OH, [19] Thử tác dụng dọn gốc tự do DPPH Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng giữa gốc tự do DPPH (màu tím đỏ) với chất chống oxy hóa để tạo ra hợp chất của DPPH có màu vàng và không hấp thụ ánh sáng tử ngoại tại bước sóng 517 nm. Đo độ hấp thụ tại bước sóng 517 nm của dung dịch sau phản ứng để tính lượng DPPH còn lại sau phản ứng. Ưu điểm: phổ biến nhất, nhanh, cho kết quả khá chính xác, dễ thực hiện và không tốn kém. Tuy nhiên, phép thử này chí mang ý nghĩa xác định khả năng loại bỏ gốc tự do của mẫu cần thử vì DPPH không tổn tại trong cơ thể sống. Dùng trong sàng lọc các mẫu dược liệu. Thử tác dụng dọn gốc tự do superoxid O2• Nguyên tắc: Gốc tự do O2• được hình thành trong quá trình oxy hóa xanthin thành acid uric được xúc tác bởi enzym xanthinoxidase. Gốc O2• tạo thành phản ứng với nitrobule tetrazolium sẽ tạo ra chất có màu xanh đậm, hấp thụ bước sóng tại 560 12
21. nm, đo hấp thụ quang của dung dịch phản ứng tại bước sóng này sẽ biết lượng O2• tham gia phản ứng. Ưu điểm: Nhanh, dễ thực hiện, yêu cầu ít máy móc, kết quả thu được tương đổi ổn định và chính xác. Thử tác dụng dọn gốc tự do superoxid •OH Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên phản ứng đường 2 - deoxyribose của gốc •OH. Khi hoạt động sẽ oxy hóa đường deoxyribose để tạo ra sản phẩm cuối cùng là MDA (maloydialdehyd). Phân tử MDA khi phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) ở nhiệt độ cao sẽ màu hồng có hấp thụ ánh sáng cực đại ở bước sóng 532 nm. Đo hấp thụ quang của dung dịch tại bước sóng này sẽ cho biết nồng độ MDA được tạo ra sau quá trìnhoxy hóa. Từ đó tính được mức độ deoxyribose bị oxy hóa và mức độ dọn gốc tự do •OH của mẫu thử. Ưu điểm: Nhanh, dễ thực hiện, chi phí thấp. Tuy nhiên gốc •OH có hoạt tính rất mạnh nên rất khó để đánh giá mức độ tác dụng và kết quá ít chính xác hơn các thử nghiệm trên. 1.5. Tổng quan về Hồng đảng sâm 1.5.1. Nguồn gốc, phân loại 1.5.1.1. Tên khoa học của Hồng đảng sâm Tên khoa học: Codonopsis javanica (Blume) Hook. f. Tên khác: đảng sâm Việt Nam, ngân đằng, cây đùi gà, mằn rày cáy (Tày), co nhả dòi (Thái), cang hô (H’Mông) [22]. Theo hệ thống của Armen Takhtajan, loài Codonopsis javanica có vị trí phân loại như sau: Liên giới: Eukaryota (Sinh vật nhân thực) Giới: Plantae (Thực vật) Phân giới: Viridaeplantae (Thực vật xanh) Ngành: Magnoliophyta (Thực vật có hoa; Mộc lan; Hạt kín) Lớp: Magnoliopsida (Thực vật hai lá mầm) Phân lớp: Asteridaes Bộ: Asterales (Bộ Cúc) Họ: Campanulaceae (Họ Hoa Chuông; Cát kiến) Chi: Codonopsis Loài: C. javanica 13
22. Hình 1.3. Hình ảnh cây Hồng đảng sâm. 1.5.1.2. Phân bố, sinh thái Chi Codonopsis. Blume có 44 loài trên thế giới, phân bố chủ yếu ở cùng cận nhiệt đới và ôn đới ấm châu Á và châu Âu. Ở Việt Nam, có 3 – 4 loài, trong đó một loài là cây nhập nội, các loài còn lại là cây mọc tự nhiên. Trong số các loài mọc tự nhiên, cây thuốc được gọi là “đảng sâm” thực tế chỉ có 2 loài C. javanica và một số loài mới phát hiện ở Hà Giang. Hồng đảng sâm là cây của vùng cận nhiệt đới, được ghi nhận ở Trung Quốc, Mianma, Ấn Độ, Lào, Việt Nam và Nhật Bản. Ở Việt Nam, cây được phân bố rộng rãi và tập trung nhiều ở vùng núi phía Bắc, giảm dần ở phía Nam, gồm 14 tỉnh miền núi, nhưng tập trung nhất ở Lai Châu, Lào Cai, Hà Giang Ở các tỉnh phía nam, Hồng đảng sâm có ở núi Ngọc Linh và vùng Đà Lạt. Cây ưa ẩm, ưa sáng và có thể hơi chịu nóng, thường mọc tương đối tập trung ở vùng nương rẫy cũ, ven rừng nhất là loại hình rừng núi đá vôi sau khi đã bị khai phá để lấy đất canh tác. Trong tự nhiên, số cây trưởng thành có hoa quả chiếm tỷ lệ 30 – 40%. Do rễ củ cắm sâu dưới đất, nên sau khi bị đốt nương, cây vẫn có khả năng tái sinh [22]. 1.5.2. Đặc điểm thực vật Cây thảo, sống lâu năm, leo bằng dây quấn. Rễ củ nạc, hình trụ dài, đường kính có thể đạt 1,2 – 2 cm, phân nhánh, dầu rễ phình to, có nhiều vết sẹo lồi của thân cũ. Màu trắng ngà, ở giữa có lõi gỗ màu vàng. Thân tròn, có chỗ bị bóp méo do quấn vào giá thể hoặc cây khác, màu lục nhạt hoặc hơi pha tím. Đường kính thân từ 1,5 – 3,0 mm. Thân non thường có lông, lớn lên thì nhẵn. Toàn cây có nhựa mủ trắng. Lá mọc đối, ít mọc so le, gốc hình tim hoặc hình thận, đầu nhọn, phiến mỏng, hình trứng rộng, dài 3 – 8 cm, rộng 2 – 4 cm, mép nguyên lượn sóng hoặc hơi khía răng, mặt trên màu lục nhạt, mặt dưới màu trắng xám, nhẵn hoặc có lông rải rác. 14
23. Hoa mọc riêng lẻ ở kẽ lá hoặc đối diện với lá ở phần ngọn, có cuống dài 2 – 6 cm, đài có 5 phiến hẹp, tràng hình chuông màu trắng hoặc hơi vàng, có vân tím ở họng, chia 5 thùy; nhị 5, chỉ nhị hơi dẹt, bao phấn đính gốc, bầu hình cầu có 5 ô. Quả nang, hình gần cầu, có 5 cạnh mờ, đầu quả hơi phẳng, phía trên có một núm nhỏ hình nón, đường kính 1 – 2 cm, có đài tồn tại, khi chín màu tím hoặc tím đỏ, hạt nhiều màu vàng nhạt, bề mặt bóng, có vân dạng lưới. Mùa hoa từ tháng 5 đến tháng 7, mùa quả từ tháng 7 đến tháng 9 [13, 18, 22]. 1.5.3. Bộ phận dùng Bộ phận dùng là rễ phơi hoặc sấy khô của cây Hồng đảng sâm (Codonopsis javanica). Rễ cây được thu hái vào mùa thu đông, rửa sạch đất cát, cắt bỏ đầu rễ và rễ con, phân loại rễ to nhỏ để riêng, phơi nắng nhẹ hoặc sấy ở nhiệt độ thấp cho đến hơi khô, lăn cho mềm, rồi tiếp tục phơi hoặc sấy nhẹ cho đến khi khô hẳn. Rễ hình trụ, có khi phân nhánh, đường kính 0,5 – 2 cm, mặt ngoài màu vàng nâu nhạt, trên có những rạch dọc, ngang. Loại to có thịt trắng ngà, vị ngọt dịu. Khi dùng thái mỏng tẩm nước gừng, sao qua. Dược liệu dễ bị sâu mọt cần được bảo quản ở nơi khô ráo [22]. 1.5.4. Thành phần hóa học Loài Codonopsis javanica cho đến nay mới có ít công trình nghiên cứu về thành phần hóa học. Theo các đánh giá sơ bộ, lá cây non chứa nước 77,5%, protid 4,2%, glucid 13,1%, xơ 3,3%, caroten 3,6mg%, vitamin C 85,5mg%. Sơ bộ thấy trong rễ cây có đường, chất béo, không có saponin. Còn có tinh dầu, glucosid sentellarin và vết alcaloid [11]. Theo Zheng-Tao Wang, trong C.javanica có taraxerol, β-sitosterol, α- spinasterol [37]. Theo tài liệu Những cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, trong rễ Hồng đảng sâm không chứa saponin. Ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu của Hoàng Minh Chung và cộng sự đã có những nghiên cứu ban đầu về thành phần hóa học của Hồng đảng sâm thu hái tại Sapa à phát hiện được trong C.javanica có chứa saponin, đường khử và 17 acid amin toàn phần; 6 chất khoáng Ca, Fe, Mg, Cu, Mn, Zn, một sesquiterpen là 8β- hydroxyasterolid; một dẫn xuất glycosid với phần khung là stigmasta-7,25-dien-3-ol [7-10]. Nghiên cứu của tác giả Trần Thanh Hà cho thấy, trong rễ C.javanica có chứa ampelopsin, β-D-fructopyranosyl (2→1) β-D-fructofuranosyl (2→1) β-D- fructofuranose, henicosyl trimethylsilane, galactitol, 2-(methoxymethyl)-3-(3,4- dimethoxyphenyl)propanal, acid 3,4,5-trihydroxycyclohex-enecarboxylic, 2’- hydroxy-N-((E,2R)-1,3,4-trihydroxyoctadec-8-en-2yl) hexacosanamid, α-spinasterol 3-O- β-D-glucopyranosid, đây đều là những hợp chất lần đầu tiên được công bố phân lập. Ngoài ra còn có hesperidin, adenosin, β-D-fructofuranose (2→1) β-D- fructofuranose (2→1) β-D-fructofuranose (2→1) α-D-glucopyranose (4←1) α-L-(6- acetyl-rhamnopyranose) [11, 12]. 15
24. Stigmasta-7,25-dien-3-ol α-spinasterol 3-O- β-D-glucopyranosid Hình 1.4. Một số hợp chất được phân lập từ rễ Hồng đảng sâm. 1.5.5. Tác dụng và công dụng 1.5.5.1. Tác dụng dược lý Các tác dụng dược lý về tác dụng ức chế enzym α-glucosidse và chống oxy hóa của C.Javanica hiện chưa được nghiên cứu chuyên sâu trên thế giới và tại Việt Nam. Do đó trong quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi đã tham khảo các tài liệu nghiên cứu tác dụng dược lý của các loài thuộc cùng chi Codonopsis. Y học cổ truyền Trung Quốc dùng 2 loài Đảng sâm: Codonopsis tangshen (Xuyên đảng sâm) và Codonopsis pilosula (Đảng sâm) [7]. Năm 1934, Kinh Lợi Bân và Thạch Nguyên Cao đã dùng Đảng sâm ngâm với cồn 70o trong 1 tháng. Lọc và đem bã còn lại sắc với nước: 1kg rễ dược liệu cho 200g cao cồn và 260g cao nước. Chế 2 loại trên thành dung dịch 20%, 1 phần sau khi hấp tiệt trùng thì đem tiêm, 1 phần cho lên men để loại hết các hợp chất carbohydrat (như đường) rồi mới tiêm, đồng thời chế thành thuốc cho uống [15]. Kết quả thu được như sau: Đối với đường huyết: Tiêm Đảng sâm vào thỏ bình thường thấy lượng đường huyết tăng lên. Tác giả cho rằng sở dĩ Đảng sâm làm tăng lượng đường huyết là do thành phần hydratcarbon trong Đảng sâm vì khi tiêm hoặc cho uống Đảng sâm đã cho lên men để loại chất đường thì đều không làm lượng đường huyết tăng lên. Tiêm thuốc Đảng sâm chưa lên men và đã lên men đều không thấy ức chế được hiện tượng đường huyết tăng lên do tiêm dưới da dung dịch 10% diuretin (4 ml/ kg cơ thể). Dựa vào quan điểm của Richter, Rose, Nishi và Pollak cho rằng Diuretin gây đường là do thần kinh giao cảm nên Kinh Lợi Bân cho rằng Đảng sâm không ức chế được đường huyết cao do nguồn gốc thần kinh. Đối với huyết áp: Tiêm mạch máu dung dịch Xuyên đảng sâm 20% (chiết bằng rượu và bằng nước) cho thỏ và chó đã gây mê đều thấy hạ huyết áp. Tác giả có tiêm dung dịch 4,8% glucosa và đối chứng thì không thấy hạ huyết áp, do tác giả cho rằng hiện tượng hạ huyết áp không liên quan đến phần đường trong Đảng sâm. Tác giả cho rằng hiện tượng hạ huyết áp là do giãn mạch ngoại vi. Đảng sâm còn có tác dụng ức chế hiện tượng cao 16
25. huyết áp do adrenalin gây ra: nếu lượng adrenalin tiêm cao thì hiện tượng ức chế kém, nếu lượng adrenalin tiêm thấp thì hiện tượng ức chế càng mạnh. Theo nghiên cứu của Chen và cộng sự, ở những con chuột kháng insulin khi được cho ăn fructose, cao chiết nước rễ C.javanica có tác dụng làm giảm sự tăng tiết insulin và peroxyd hóa lipid. Theo đó, C.javanica cải thiện đáng kể các hoạt động enzym chống oxy hóa, bao gồm glutathion peroxidae, superoxide dismutase và glutathione reductase trong gan [25]. 1.5.5.2. Công dụng theo y học cổ truyền Sử dụng thuốc có nguồn gốc thực vật trong phòng và chữa bệnh là thói quen, kinh nghiệm và truyền thống của người dân Việt Nam và nhiều nước trên thế giới. Có rất nhiều loài cây đã được dùng theo kinh nghiệm dân gian để làm giảm nhẹ triệu chứng cũng như biến chứng của bệnh ĐTĐ: Cải xoong (Nasturium officinale Brassicaceae); Mướp đắng (Mormordica charantia Cucurbitaceae); Bồ công anh (Taraxacum officinale Asteraceae); Dứa (Ananas sativus); Bạch truật (Atractiloides macrocephala Asteraceae); Ngò tàu (Eryngium foetidum Apiaceae); Quỷ trâm thảo (Bidens pilosa Asteraceae); Cam thảo nam (Scoparia ducis Scrophulariaceae); Dừa cạn (Catharanthus roseus Apocynaceae); Hoài sơn (Dioscorea persimilis Dioscoreaceae); Ngọc trúc (Polygotanum officinale Liliaceae); Củ cải trắng (Ravanus sativus); Ổi (Psidium guajava); Chuối hột (Musra barjoo Sieb); Rau má (Celltela asiatica) [29]. Theo Y học cổ truyền, rễ Hồng đảng sâm có vị ngọt, tính bình, có tác dụng bổ tỳ, kiện vị, ích khí, sinh tân dịch, giải khát. Rễ được dùng chữa tỳ vị suy kém, phế khí hụt nhược, kém ăn, đại tiện lỏng, mệt mỏi, khát nước, ốm lâu cơ thể suy nhược, lòi dom, sa tử cung, băng huyết, rong huyết, thiếu máu, vàng da, tăng bạch cầu, viêm thận, nước tiểu có albumin, chân phù đau. Ngoài ra nó còn được dùng làm thuốc bổ dạ dày, lợi tiểu, chữa ho, tiêu đờm [6], [7]. Tuy nhiên còn chưa có nhiều nghiên cứu về việc sử dụng Hồng đảng sâm C.javanica trong điều trị bệnh tiểu đường. Một số bài thuốc có Hồng đảng sâm dùng ở Việt Nam: Bồi đưỡng cơ thể, chữa thận suy, đau lưng, mỏi gối, đái rắt: hồng đảng sâm 20g, tắc kè 5g, huyết giác 1g, trần bì 1g, tiểu hồi 0,5g, rượu 40o 250 ml, đường đủ ngọt. Các vị thuốc cắt nhỏ, ngâm rượu trong khoảng một tháng. Mỗi lần uống 30 ml, ngày 1 – 2 lần. Chữa cơ thể suy nhược mệt mỏi, ăn không ngon, đại tiện lỏng: hồng đảng sâm 20g, bạch truật sao, đương quy, ba kích mỗi vị 12g. Sắc uống, hoặc tán bột viên với mật ong, uống mỗi ngày 12 – 20g. Chữa bệnh suy yếu của người gia hay người ốm lâu: hồng đảng sâm 40g, long nhãn, đương quy, ngưu tất, mạch môn, mỗi vị 12g. Sắc uống ngày một thang. Hoặc thêm nhân sâm 4-8 g uống riêng, nếu bệnh nặng nguy cấp. 17
26. Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Rễ Hồng đảng sâm được thu mua vào tháng 8 năm 2018, tại Buôn Ma Thuột. Mẫu nghiên cứu được giám định thực vật học tại Bộ môn Dược liệu & Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược với tên khoa học là Codonopsis javanica (Blume) Hook. f., họ hoa Chuông (Campanulaceae). Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Bộ môn Dược liệu & Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội. Hình 2.1. Mẫu dược liệu Hồng đảng sâm. 2.1.2. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu Rễ cây thu mua về rửa sạch, sấy khô lại trong lò sấy ở nhiệt độ 65oC trong 5 giờ. Sau đó đem rễ xay nhỏ và tiến hành chiết xuất theo phương pháp chiết xuất được trình bày ở mục 2.3.1. 2.1.3. Hóa chất, dung môi Acid ascorbic (99%, Sigma – Aldrich, Singapore). 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH, Sigma – Aldrich, Singapore). p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (Merck). 18
27. p-nitrophenol chuẩn (Merck). α-glucosidase 0,9 U/ml (pha trong nước khử ion lạnh) (Sigma). Cao chiết tổng và các phân đoạn. Dung môi: ethanol, n-hexan, ethyl acetat (EtOAc), n-buthanol (n-BuOH), methanol (MeOH), nước cất. 2.1.4. Thiết bị, dụng cụ Cân phân tích AY 129 (Shimadzu – Nhật Bản). Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC-150H (MRC – Israel). Máy cô quay chân không Rotavapor R-210 (Buchi – Đức). Máy khuấy từ gia nhiệt C-MAG HS 4 (IKA – Đức). Máy đo quang UV Agilent technologies Cary 60 (UV-VIS – Mỹ) Micro pipet một đầu kênh 2 – 20 μL, 10 – 100 μL, 100 – 1000 μL. Bông y tế, phễu lọc, đầu côn các loại Cuvet (1ml, 3ml), Eppendorf 1,5 ml Các dụng cụ thủy tinh sử dụng trong thực nghiệm: Pipet, bình định mức, bình chiết, cốc có mỏ dung tích 25 – 800 ml, bình cầu và các dụng cụ cần thiết khác. 2.2. Nội dung nghiên cứu Để thực hiện được các mục tiêu đã đề ra, đề tài được thiết kế với các nội dung sau: Nội dung 1: Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn của rễ Hồng đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook. f.) theo phương pháp DPPH. Nội dung 2: Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn của rễ Hồng đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook. f.) trên chất nền p-nitrophenyl-α-D- glucopyranosid. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp chiết xuất Lấy rễ sấy khô, cắt nhỏ khoảng 1cm (200g) ngâm ngập trong ethanol tuyệt đối, chiết xuất bằng phương pháp siêu âm ở 50ºC trong 30 phút, lặp lại 3 lần. Dịch chiết được lọc qua bông y tế và gộp lại, cô lại bằng máy cô quay chân không thu được cao chiết tổng ethanol. Giữ lại một ít cao tổng để làm các thí nghiệm xác định khả năng chống oxy hóa và ức chế enzym α-glucosidase in vitro. Phân tán chỗ cao còn lại vào nước cất tỷ lệ 1:1. Tiếp tục tiến hành chiết phân đoạn mẫu đó lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, ethyl acetat và n-buthanol (mỗi dung môi chiết 3 lần, mỗi lần 100 mL). Cô quay thu hồi cắn dịch chiết các phân đoạn bằng máy cô quay chân không rồi tiến hành thử hoạt tính cao tổng và cao từng phân đoạn. 19
28. Hình 2.2. Sơ đồ chiết phân đoạn rễ Hồng đảng sâm. 2.3.2. Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa của cao rễ Hồng đảng sâm theo phương pháp DPPH Thí nghiệm đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết rễ Hồng đảng sâm được tiến hành tại Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội. Nguyên lý Hợp chất DPPH có khả năng tạo ra gốc tự do bền trong dung dịch MeOH bão hòa. Khi phản ứng với các chất chống oxy hóa, dung dịch màu tím đỏ sẽ chuyển sang màu vàng cam không hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ = 517 nm. Cho chất thử vào dung dịch này, nếu chất có khả năng quét gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Đo hấp thụ tại bước sóng trên sẽ biết lượng DPPH còn lại sau phản ứng. Đánh giá khả năng chống oxy hóa bằng giá trị hấp thụ ánh sáng của dung dịch thử nghiệm so với chất đối chứng. Chuẩn bị hóa chất cần thiết Dung môi MeOH đạt tiêu chuẩn phân tích. Chất chuẩn dương acid ascorbic được hòa tan trong MeOH bão hòa với dãy nồng độ 1; 5; 10; 20; 50 μg/mL. Pha dung dịch DPPH có nồng độ 0,24mg/mL trong dung môi MeOH. Mẫu thử: cao dược liệu được pha loãng trong dung môi MeOH bão hòa thành các dãy nồng độ 31,25; 62,5; 125; 250; 500 và 1000 μg/mL dùng cho thí nghiệm. 20
29. Cách tiến hành Lấy 340 µL dung dịch DPPH trong MeOH, 100 µL dung dịch các mẫu thử đã được pha loãng và 560 µL MeOH trộn đều bằng micro pipet, bọc giấy bạc, ủ ở 25˚C trong 15 phút. Song song với mỗi mẫu thử, tiến hành mẫu chứng với cùng điều kiện và thành phần. Tiến hành đo hấp thụ tại bước sóng λ = 517 nm. Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình của 3 lần đo. Cách đánh giá kết quả Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Hoạt tính quét gốc tự do DPPH được đánh giá thông qua giá trị phần trăm ức chế (I%) và xác định được IC50 bằng phần mềm Sigma Plot 10.0 dựa theo đồ thị nồng độ mẫu thử (C) và phần trăm ức chế (I%). Tính I% theo công thức sau: A −A I% = C t ⋅ 100 AC − A0 Trong đó: I%: Hoạt tính chống oxy hóa AC: Độ hấp thụ của mẫu chứng At: Độ hấp thụ của mẫu thử A0: Độ hấp thụ của mẫu trắng (sử dụng methanol) Tác dụng chống oxy hóa in vitro của dịch chiết được so sánh bằng chất chuẩn dương acid ascorbic. 2.3.3. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro của cao rễ Hồng đảng sâm Thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro của dịch chiết rễ Hồng đảng sâm được tiến hành tại Viện công nghệ sinh học – Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam. Nguyên lý Enzym α-glucosidase xúc tác quá trình chuyển chất nền p-nitrophenyl-α-D- glucopyranosid thành α-glucose và p-nitrophenol có màu vàng nhạt - hấp thụ cực đại tại λ = 405 nm. Chất kìm hãm enzym làm cường độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch giảm. Dựa vào độ hấp thụ của dung dịch khi có hoặc không có mặt chất thử, từ đó suy ra phần trăm ức chế enzym. Dựa vào phần mềm, xác định IC50. Mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 càng thấp. Chuẩn bị hóa chất cần thiết Enzym Yeast α-glucosidase, p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid, p- nitrophenol 21
30. Cách tiến hành Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase được thực hiện theo phương pháp của Moradi-Afrapoli F và cộng sự [48]. Cụ thể như sau: Chất thử được hòa tan trong DMSO (Dimethyl sulfoxid) và pha loãng trong đệm phosphate 10 mM (pH 6,8) và 50 μL được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có được nồng độ 256 μg/mL, 64 μg/mL, 16 μg/mL; 4 μg/mL. Thêm vào mỗi giếng 20 μL α-glucosidase (0,5U/mL) và 130 μL đệm phosphate 100 mM (pH 6,8), trộn đều và ủ ở 37°C trong 15 phút. Thêm vào từng giếng cơ chất pNPG, ủ tiếp ở 37°C trong 60 phút. Đĩa thí nghiệm chỉ có chất thử, đệm phosphate và pNPG được sứ dụng làm chất chứng trắng (blank). Giếng thí nghiệm chỉ có DMSO 10%, đệm phosphate, enzym và pNPG được sử dụng làm đối chứng. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo sự chính xác. Dừng thí nghiệm bằng cách thêm vào 80 μL Na2CO3 0,2M và đo OD bằng máy đo ELISA Plate Reader (Bio-Rad) ở bước sóng λ = 405nm. Cách đánh giá kết quả Công thức đánh giá khả năng ức chế enzym α-glucosidase của mẫu thử: A % ức chế = 100 - t × 100 Ac Trong đó: Ac = A đối chứng = OD đối chứng – OD mẫu trắng đối chứng At = A mẫu thử = OD mẫu thử - OD mẫu trắng thử Giá trị IC50 được tính dựa vào đồ thị và phương trình biểu diễn nồng độ và % ức chế enzym α-glucosidase của cao toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ rễ Hồng đảng sâm. 2.4. Phương pháp xử lí số liệu Các số liệu được lưu trữ và phân tích xử lý dữ liệu theo phương pháp thống kê sinh học trên máy vi tính bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2016 và phần mềm SigmaPlot 12 (Systat Software, Inc, Mỹ). Các thuật toán sử dụng: Giá trị trung bình ( ) được tính bằng trung bình cộng 3 lần đo. Độ lệch chuẩn (SD) tính bằng công thức: Σ̅(X −X̅)2 SD = √ i n−1 22
31. Kết quả thí nghiệm được biểu thị bằng giá trị trung bình cộng/trừ đi độ lệch chuẩn ( ± SD). 2 Giá trị IC50 được tính bằng hàm số y = ax + bx + c, biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ của mẫu thử và phần trăm tác dụng của cao chiết nước rễ Hồng đảng sâm, trong đó x = 50% và y = IC50. 23
32. Chương 3. KẾT QUẢ 3.1. Quy trình chiết xuất và phân đoạn dịch chiết của cao rễ Hồng đảng sâm Rễ cây Hồng đảng sâm (200g) sau khi sấy khô, cắt nhỏ và chiết xuất 3 lần với ethanol tuyệt đối thì thu được 12,32g cao ethanol. Sau đó, giữ lại 2,32g cao ethanol để đánh giá khả năng chống oxy hóa và ức chế enzym α-glucosidase in vitro, lấy 10g còn lại đem hòa tan vào nước cất và chiết lần lượt các phân đoạn với n-hexan, ethyl acetat, n-buthanol thu được 3,16g cao n-hexan; 5,03g cao ethyl acetat và 5,26g cao n-buthanol. Kết quả cho thấy rễ Hồng đảng sâm chứa lượng lớn các hợp chất tự nhiên. Tách chiết bằng phương pháp dùng các dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao giúp tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách chiết các hợp chất về sau này. 200g dược liệu Chiết xuất 3 lần Giữ lại 12,32g cao EtOH 2,32g cao EtOH Chiết phân đoạn 3 lần Cao chiết nước 3,16g cao n-hexan Chiết phân đoạn 3 lần Cao chiết nước 5,03g cao ethyl acetat Chiết phân đoạn 3 lần Cao chiết nước 5,26g cao n-buthanol Hình 3.1. Sơ đồ sản phẩm chiết phân đoạn rễ Hồng đảng sâm. 24
33. Sau khi chiết phân đoạn xong, các phân đoạn dịch chiết và cao tổng được đem hòa tan trong dung môi methanol nhằm chuẩn bị các dung dịch mẫu thử có nồng độ khác nhau cho quá trình đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase và tác dụng chống oxy hóa in vitro của rễ Hồng đảng sâm. 3.2. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các phân đoạn dịch chiết rễ Hồng đảng sâm theo phương pháp DPPH Tác dụng chống oxy hóa in vitro theo phương pháp DPPH của cao toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ rễ Hồng đảng sâm được thí nghiệm tại các nồng độ 31,25; 62,5; 125; 250; 500 và 1000 μg/mL. Acid ascorbic là chất chứng dương được sử dụng trong thí nghiệm. Giá trị phần trăm ức chế I (%) của cao chiết toàn phần và các phân đoạn cao chiết ở nồng độ khác nhau từ rễ Hồng đảng sâm và Acid ascorbic được trình bày ở bảng 3.1. và hình 3.2. Bảng 3.1. Khả năng chống oxy hóa in vitro của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết cao rễ Hồng đảng sâm và chất đối chứng ở các nồng độ khác nhau. % ức chế tại các nồng độ (µg/mL) Giá trị Phân IC50 đoạn 1000 500 250 125 62,5 31,25 (µg/mL) Ethanol 92,78 75,36 59,63 43,25 23,54 10,24 186,5 ± 7,4 ± 3,2 ± 1,9 ± 2,3 ± 1,6 ± 0,9 ± 0,4 n-Hexan 79,46 57,36 48,25 31,25 14,6 7,84 294,7±10,2 ± 2,1 ± 2,2 ± 1,7 ± 1,1 ± 0,5 ± 0,2 EtOAc 97,58 86,45 76,24 65,87 46,35 35,25 80,6 ± 2,8 ± 3,3 ± 2,2 ± 1,9 ± 1,6 ± 1,5 ± 1,2 n-BuOH 85,7 74,6 60,5 45,8 30,7 12,9 159,2 ± 9,1 ± 1,9 ± 2,0 ± 2,1 ± 1,5 ± 0,9 ± 0,3 Chất % ức chế tại các nồng độ (µg/mL) Giá trị đối IC50 chứng 50 20 10 5 1 (µg/mL) Acid 85,68 52,42 36,58 21,2 5,33 17,2 ± 1,4 ascorbic ± 2,4 ± 1,4 ± 0,8 ± 0,5 ± 0,2 25
34. I% EtOH I% n-hexan 100 80 60 40 20 0 0 200 400 600 800 1000 1200 C (µg/mL) C (µg/mL) I% I% EtOAc BuOH 120 100 100 80 80 60 60 40 40 20 20 0 0 0 200 400 600 800 1000 1200 0 200 400 600 800 1000 C (µg/mL) C (µg/mL) Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của cao chiết toàn phần và các phân đoạn cao rễ Hồng đảng sâm ở các nồng độ khác nhau. Từ bảng 3.1. và hình 3.2., kết quả cho thấy tác dụng chống oxy hóa in vitro tăng dần theo nồng độ. Dịch chiết ethanol toàn phần từ rễ Hồng đảng sâm thể hiện tác dụng chống oxy hóa in vitro với giá trị IC50 tính được là 186,5 ± 7,4 µg/mL. Trong các phân đoạn dịch chiết, phân đoạn EtOAc thể hiện tác dụng chống oxy hóa in vitro mạnh nhất với I% ở nồng độ cao nhất 1000 µg/mL là 97,58 %, giá trị IC50 tính được là 80,6 ± 2,8 µg/mL. Tiếp theo là phân đoạn n-BuOH với giá trị I% đạt 85,7 % ở nồng độ cao nhất 1000 µg/mL, giá trị IC50 tính được là 159,2 ± 9,1 µg/mL. Phân đoạn n- Hexan thể hiện tác dụng chống oxy hóa yếu nhất với giá trị IC50 tính được là 294,7 ± 10,2 µg/mL. Song song với các mẫu thử, tiến hành tương tự với mẫu chứng dương acid ascorbic cho thấy tác dụng chống oxy hóa in vitro của acid ascorbic hoạt động ổn định trong thí nghiệm, có giá trị IC50 là 17,2 ± 1,4 µg/mL được thể hiện qua hình 3.3 26
35. I% Acid ascorbic 100 80 60 40 20 0 C (µg/mL) 0 10 20 30 40 50 60 Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa in vitro của acid ascorbic. 3.3. Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro của các phân đoạn dịch chiết rễ Hồng đảng sâm Tác dụng dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro của cao toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ rễ Hồng đảng sâm được thí nghiệm tại các nồng độ 31,25; 62,5; 125; 250; 500 và 1000 μg/mL. Acarbose là chất chứng dương được sử dụng trong thí nghiệm. Giá trị phần trăm ức chế I (%) của cao chiết toàn phần và các phân đoạn cao chiết ở nồng độ khác nhau từ rễ Hồng đảng sâm và chất đối chứng dương được trình bày ở bảng 3.2. và hình 3.4. Bảng 3.2. Khả năng ức chế enzym α-glucosidase in vitro của cao toàn phần, các phân đoạn dịch chiết rễ Hồng đảng sâm và chất đối chứng ở các nồng độ khác nhau. % ức chế tại các nồng độ (µg/mL) Giá trị Phân IC50 đoạn 1000 500 250 125 62,5 31,25 (µg/mL) Ethanol 95,23 80,23 69,25 51,24 39,25 25,14 99,5 ± 4,8 ± 3,6 ± 2,9 ± 2,5 ± 1,8 ± 1,3 ± 0,8 n-Hexan 68,25 58,25 49,2 32,12 15,23 8,25 291,4 ± 8,7 ± 2,6 ± 1,9 ± 1,4 ± 1,1 ± 0,4 ± 0,3 EtOAc 98,25 84,23 73,51 62,32 42,17 32,36 80,4 ± 5,9 ± 3,5 ± 2,3 ± 2,0 ± 1,8 ± 1,3 ± 1,0 n-BuOH 86,3 75,6 63,5 46,3 32,6 15,6 129,6 ± 6,2 ± 3,0 ± 2,5 ± 2,4 ± 1,3 ± 0,9 ± 0,5 Giá trị Chất đối % ức chế tại các nồng độ (µg/mL) IC50 chứng 50 20 10 5 1 (µg/mL) Acarbose 85,68 52,42 36,58 21,2 5,33 156,8 ± 2,8 ± 3,2 ± 1,3 ± 1,2 ± 0,8 ± 0,1 27
36. I% I% 100 EtOH 80 n-Hexan 70 80 60 60 50 40 40 30 20 20 10 0 0 0 200 400 600 800 1000 1200 0 200 400 600 800 1000 1200 C (µg/mL) C (µg/mL) EtOAc BuOH 120 I% 100 I% 100 80 80 60 60 40 40 20 20 0 0 0 200 400 600 800 1000 1200 0 200 400 600 800 1000 1200 C (µg/mL) C (µg/mL) Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế enzym α-glucosidase in vitro của cao toàn phần và các phân đoạn của rễ Hồng đảng sâm ở các nồng độ khác nhau. Acarbose 100I% 80 60 40 20 0 C (µg/mL) 0 200 400 600 800 1000 1200 Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế enzym α-glucosidase in vitro của Acarbose. 28
37. Từ bảng 3.2. và hình 3.4., kết quả cho thấy khả năng ức chế enzym α- glucosidase in vitro tăng dần theo nồng độ. Dịch chiết ethanol toàn phần, phân đoạn EtOAc và n-BuOH từ rễ Hồng đảng sâm có giá trị IC50 lần lượt là 99,5 ± 4,8 µg/mL, 80,4 ± 5,9 µg/mL, 129,6 ± 6,2 µg/mL, thể hiện tác dụng ức chế enzym α-glucosidase tốt hơn cả mẫu chứng Acarbose (giá trị IC50 là 156,8 ± 2,8 µg/mL). Trong các phân đoạn dịch chiết, phân đoạn EtOAc thể hiện tác dụng chống oxy hóa in vitro mạnh nhất với I% ở nồng độ cao nhất 1000 µg/mL là 98,25%. Phân đoạn n-Hexan thể hiện tác dụng chống oxy hóa in vitro yếu nhất với giá trị IC50 tính được là 291,4 ± 8,7 µg/mL. Song song với các mẫu thử, tiến hành tương tự với mẫu chứng dương Acarbose cho thấy tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro của Acarbose hoạt động ổn định trong thí nghiệm (hình 3.5.). 29
38. Chương 4. BÀN LUẬN Hiện nay, đái tháo đường là bệnh lý gây ra ảnh hưởng lên nhiều vấn đề sức khỏe khác, phát sinh ra nhiều biến chứng trầm trọng, ảnh hưởng lớn đến chất lượng cuộc sống và là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu. Số lượng người mắc đái tháo đường tăng gấp đôi trong vòng 3 thập kỉ gần đây và đang ngày càng trẻ hóa qua từng năm. Bệnh ĐTĐ gây nên nhiều biến chứng nguy hiểm, là nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tim mạch, mù lòa, suy thận, và cắt cụt chi [6]. Chính vì hậu quả do ĐTĐ gây ra không chỉ cho cá nhân người bệnh mà còn tạo nên gánh nặng cho toàn xã hội, hệ thống y tế, tài chính của quốc gia cho nên các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang nỗ lực tìm kiếm các phương pháp phòng và điều trị hiệu quả bệnh ĐTĐ, ngăn ngừa các biến chứng và nâng cao chất lượng cuộc sống. Bên cạnh việc nghiên cứu và phát triển các tân dược, các nhà khoa học cũng tiến hành rất nhiều nghiên cứu chứng minh được các loại thảo dược có tác dụng hạ glucose máu, nhất là các dược liệu có khả năng chống oxy hóa và ức chế enzym α-glucosidase. Rễ Hồng đảng sâm có tác dụng dược lý rất tốt, được sử dụng nhiều trong y học cổ truyền. Hồng đảng sâm thường được dùng để bồi bổ sức khỏe, dùng như một loại thuốc bổ, giúp bổ tỳ, ích khí, thanh tân chỉ khát. Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam, rễ của C.javanica thường xuyên bị khai thác lấy rễ củ để làm thuốc. Nạn phá rừng làm nương rẫy đã trực tiếp làm cho khu phân bố tự nhiên bị thu hẹp nhanh chóng. Trữ lượng tự nhiên bị giảm sút nhiều. Từ nhiều năm nay, Hồng đảng sâm và các loài thuộc chi Codonopsis đã được liệt vào Sách Đỏ Việt Nam và là đối tượng được ưu tiên bảo tồn [1]. Chính vì thế, để bảo vệ nguồn dược liệu mang tính đặc hữu của các khu vực nên đã có nhiều nghiên cứu tại Việt Nam nhằm bảo tồn, nhân giống và phát triển C.javanica và các loài khác thuộc chi Codonopsis [14, 17]. Trong bệnh ĐTĐ, quá trình tăng glucose huyết của cơ thể sản sinh ra nhiều gốc tự do làm suy yếu hệ thống phòng thủ chống oxy hóa nội sinh. Do đó, việc sử dụng các chất chống oxy hóa để phòng ngừa và làm suy giảm các triệu chứng của bệnh ĐTĐ là một biện pháp thường được cân nhắc sử dụng. Phương pháp quét gốc tự do DPPH được sử dụng rộng rãi để giá khả năng chống oxy hóa in vitro do có nhiều ưu điểm hơn các phương pháp khác. Kết quả nghiên cứu này cho thấy tác dụng chống oxy hóa bằng phương pháp thu dọn gốc tự do DPPH của cao chiết toàn phần và cao chiết các phân đoạn của rễ Hồng đảng sâm phụ thuộc vào nồng độ: khi nồng độ cao chiết tăng thì tác dụng quét các gốc tự do cũng tăng theo dựa theo đồ thị được dựng trên hình 3.2. Cao chiết phân đoạn EtOAc của rễ Hồng đảng sâm có khá năng quét gốc tự do DPPH cao nhất với IC50 là 80,6±2,8 μg/mL. Kết quả nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa của Hồng đảng sâm trong nghiên cứu nảy cũng tương đồng với các nghiên cứu trên thế giới đối với các loài cùng chi Codonopsis. Sang-Min Jeon và cộng sự có nghiên cứu trên 1 loài khác của chi Codonopsis là Codonopsis lanceolata về tác dụng chống oxy hóa in vitro của loài này thông qua chiết cao áp và hấp bằng quá trình lên men có hiệu quả hơn so với cách chiết xuất thông thường [41]. Chang-Seon Yoo và Sung-Jin Kim cũng chứng minh được chiết xuất methanol của Codonopsis pilosula có tác dụng chống oxy hóa in vivo rõ rệt thông qua ức chế quá trình oxy hóa iNOS và protein [51]. Judy Yuet-Wa Chan 30
39. và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng chống đái tháo đường và chống oxy hóa trên mô hình chuột mắc bệnh tiểu đường bằng một công thức có tên gọi là SR10, bao gồm rễ Astragali, rễ Codonopsis và Cortex Lycii. Kết quả cho thấy SR10 có hiệu quả trong việc giảm mức đường huyết trong điều trị mãn tính bằng cách cải thiện chức năng tế bào beta. Các hoạt động và biểu hiện của các enzyme chống oxy hóa, catalase và superoxide dismutase đều tăng lên khi được điều trị bằng SR10. Hơn nữa, SR10 không cho thấy bất kỳ tác dụng gây độc nào trên cơ thể [34]. Enzym α-glucosidase là enzym nằm trong màng đường ruột, tham gia vào bước cuối của quá trình tiêu hóa. Enzym này xúc tác cho quá trình phân hủy các đường disaccaride như sucrose hay maltose thành monosaccharide như glucose, do đó các chất ức chế enzym này sẽ làm giảm quá trình hấp thu đường từ cơ quan tiêu hóa vào máu. Các chất ức chế enzym α-glucosidase được sử dụng làm thuốc tân dược như acarbose, voglibose, thường gây nên một số tác dụng không mong muốn như đau bụng, tiêu chảy, Trong nghiên cứu này, acarbose được sử dụng làm chất đối chứng dương để đánh giá khả năng ức chế enzym α-glucosidase. Kết quả nghiên cứu của đề tài cho thấy cao chiết EtOH toàn phần, 2 phân đoạn EtOAc và n-BuOH của rễ Hồng đảng sâm có tác dụng ức chế enzym α-glucosidase mạnh so với chứng dương acarbose. Ngoài ra, tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro của cao chiết toàn phần và cao chiết các phân đoạn của rễ Hồng đảng sâm cũng phụ thuộc vào nồng độ (hình 3.4). Hướng nghiên cứu tiếp theo về loài này trong việc điều trị bệnh ĐTĐ là tiến hành phân tách các hợp chất trong các cao chiết để phân lập được các hợp chất có tác dụng ức chế α-glucosidase với giá trị IC50 cao. Kết quả nghiên cứu cao chiết của rễ C.Javanica của đề tài này cũng tương đồng với các nghiên cứu trước đây ở những loài cùng chi Codonopsis. Kai He và cộng sự chứng minh được rằng Codonopsis pilosula có khả năng hạ đường huyết ở chuột bị tiểu đường do streptozotocin bằng việc ức chế tốt enzym α-glucosidase [38]. Suk Whan Jung và cộng sự cũng nghiên cứu trên rễ của Codonopsis lanceolata có chứa 2 hợp chất tangshenoside và β-adenosine có tác dụng ức chế α-glucosidase in vitro yếu với IC50 lần là 1,4 và 9,3 mM [42]. Một số hợp chất được phân lập từ rễ Hồng đảng sâm có tiềm năng điều trị ĐTĐ và các bệnh mắc kèm do stress oxy hóa gây ra. Các nghiên cứu dưới đây là nghiên cứu in vitro và in vivo từ các loại dược liệu khác hoặc từ các dược chất tinh khiết. Taraxerol, β-sitosterol, α-spinasterol được chứng minh là có tác dụng chống đái tháo đường cũng như chống oxy hóa và có thể được xem xét nghiên cứu lâm sàng để phát triển thuốc điều trị bệnh tiểu đường và các biến chứng do tiểu đường gây ra như bệnh thận trong đái tháo đường [36, 43]. Ngoài ra, Abdullateef Isiaka Alagbonsi và cộng sự cho thấy adenosine có thể là mục tiêu điều trị trong điều trị bệnh tiểu đường tuýp 1 do khả năng hạ đường huyết của nó ở cả chuột mắc và không mắc bệnh tiểu đường [26]. Ayman Mahmoud và cộng sự chứng minh hesperidin đóng vai trò đầy hứa hẹn trong điều trị bệnh tiểu đường và các biến chứng của nó nhờ tác dụng điều hòa đối với chất vận chuyển glucose, bài tiết và độ nhạy insulin, stress oxy hóa, quá trình viêm, hấp thu glucose ngoại biên, hấp thu glucose ở ruột và sản xuất glucose ở gan [47]. 31
40. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Nghiên cứu đã đánh giá được tác dụng chống oxy hóa in vitro của các phân đoạn dịch chiết từ rễ Hồng đảng sâm thu được phân đoạn EtOAc có tác dụng tốt nhất với giá trị IC50 = 80,6 ± 2,8 µg/mL, xếp sau đó lần lượt là các phân đoạn n-BuOH, EtOH và n-Hexan. Nghiên cứu cũng đã đánh giá được phân đoạn EtOAc có tác dụng ức chế enzym α – glucosidase in vitro tốt nhất với giá trị IC50 = 80,4 ± 5 µg/mL so với các phân đoạn dịch chiết còn lại từ rễ Hồng đảng sâm. Ngoài ra, hai phân đoạn n-BuOH và EtOH cũng cho thấy khả năng ức chế enzym α – glucosidase in vitro với IC50 lần lượt là 129,6 ± 6,2 và 99,5 ± 4,8 µg/mL. KIẾN NGHỊ Nghiên cứu thêm các phương pháp tách chiết các thành phần hóa học trong rễ Hồng đảng sâm bằng các dung môi khác để thu được hàm lượng các chất có tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym α – glucosidase cao nhất. Kết quả thu được qua nghiên cứu này có ý nghĩa định hướng nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học của rễ Hồng đảng sâm, nhất là phân đoạn dịch chiết EtOAc, nhằm phân tách, tinh chế được các hoạt chất có tiềm năng trong điều trị đái tháo đường tuýp 2 và trong nghiên cứu khoa học, ứng dụng trong lâm sàng. 32
41. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Nguyễn Tiến Bân, Trần Đình Lý, Nguyễn Tập và các cộng sự. (2007), Sách đỏ Việt Nam (phần II - Thực vật), NXB Khoa học tự nhiên và công nghệ. 2. Đàm Trung Bảo (2001), "Các gốc tự do", Tạp chí Dược học, 6, tr. 29-30. 3. Bệnh viện Bạch Mai (2017), "Đái tháo đường", Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị bệnh nội khoa, NXB Y học, tr. 411-416. 4. Bộ Y tế (2009), "Bệnh học", Đái tháo đường, NXB Giáo Dục, tr. 179 - 191. 5. Bộ Y tế (2012), "Hormon và thuốc điều trị rối loạn nội tiết", Dược lý học tập 2, NXB Y học, tr. 303-304. 6. Bộ Y Tế (2017), "Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị đái tháo đường típ 2". 7. Hoàng Minh Chung (2003), "Định lượng một số chất khoáng trong Đảng sâm Việt Nam, dịch chiết men bia và chế phẩm SMC", Tạp chí dược liệu, 8(1), tr. 21 - 23. 8. Hoàng Minh Chung (2006), "Nghiên cứu bào chế Chế phẩm trà tan "Thảo Sâm Đông Đô" dùng cho cộng đồng", Tạp chí nghiên cứu y dược, 46(6), tr. 109-113. 9. Hoàng Minh Chung (2009), "Sesquiterpen của Đảng sâm trước và sau khi chế biến ", Tạp chí dược liệu, 14(3), tr. 163 - 166. 10. Hoàng Minh Chung (2010), "Phân lập, nhận dạng một dẫn xuất glycosid trong Đảng sâm Việt Nam", Tạp chí dược liệu, 15(3), tr. 182 - 186. 11. Trần Thanh Hà, Hà Vân Oanh và Đỗ Thị Hà (2016), "Thành phần hóa học của phân đoạn chiết bằng n-butanol rễ loài đảng sâm Việt Nam (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f) ", Tạp chí Dược học, 56(4). 12. Trần Thanh Hà, Nguyễn Minh Khởi, Nguyễn Thị Hà và các cộng sự. (2014), "Thành phần hóa học của rễ đảng sâm", Tạp chí Dược Liệu, 19, tr. 211-215. 13. Pham Thanh Huyen, Nguyen Quynh Nga, Phan Van Truong và các cộng sự. (2014), "Study on Morphological and Microscopic Characteristic of Codonopsis javanica (Blume) Hook. f. & Thoms. in Vietnam", Journal of Medicinal Materials-Hanoi, 19(5), tr. 263-268. 14. Đinh Đoàn Long Phạm Thanh Huyền (2017), "Sử dụng chỉ thị ADN (RAPD-PCR) trong nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Đảng sâm góp phần định hướng công tác bảo tồn và phát triển ở Việt Nam", Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, 33, tr. 32-39. 15. Đỗ Tất Lợi (2000), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. 16. Nguyễn Văn Mùi (2015), Enzyme học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, 361. 17. Nguyễn Thị Thanh Nga (2012), Đánh giá đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu Việt Nam thuộc chi Đảng Sâm (Codonopsis sp) bằng kỹ thuật AND mã vạchĐại học Quốc gia Hà Nội. 18. Nguyễn Tập (2007), Cẩm nang cây thuốc cần bảo vệ ở Việt Nam, NXB Y học. 19. Hoàng Thị Thúy (2019), Đánh giá tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase và tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết cây bơ (Persea americana Mill.), Khoa Y Dược - ĐHQGHN. 20. Mai Thế Trạch (2007), Nội tiết học đại cương, NXB Y học, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh.
42. 21. Bùi Thanh Tùng, Đặng Kim Thu, Hải PT và các cộng sự. (2018), "Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của các phân đoạn dịch chiết quả Lựu (Punica granatum Linn)", Tạp chí Y Dược cổ truyền Việt Nam, 5(18), tr. 59-63. 22. Viện Dược Liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Vol. 1. 23. Viện Dược Liệu (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ thảo dược, NXB Khoa học và kỹ thuật. 24. Đỗ Quốc Việt, Trần Văn Sung và Nguyễn Thanh Thủy (2006), "Sơ bộ nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của cây Chuối hột (Musa balbisiana Colla.) trên chuột thực nghiệm", Tạp chí Dược học, 5, tr. 8-10. Tài liệu tiếng Anh 25. Kun-Ning Chen, Wen-Huang Peng, Chien-Wen Hou và các cộng sự. (2013), "Codonopsis javanica root extracts attenuate hyperinsulinemia and lipid peroxidation in fructose-fed insulin resistant rats", journal of food and drug analysis, 21(4), tr. 347-355. 26. Abdullateef Isiaka Alagbonsi, Toyin Mohammed Salman, Hussein Mofomosara Salahdeen và các cộng sự. (2016), "Effects of adenosine and caffeine on blood glucose levels in rats", Nigerian Journal of Experimental and Clinical Biosciences, 4(2), tr. 35. 27. Antonio Blanco và Gustavo Blanco (2017), "Enzymes", Medical Biochemistry, tr. 153-175. 28. Halliwell B (1994), "Free radicals, antioxidants, and human disease: curiosity, cause, or consequence?", The Lancet, 344(8924), tr. 721-724. 29. Padavala Ajay Babu, Gadde Suneetha, Radha Boddepalli và các cộng sự. (2006), "A database of 389 medicinal plants for diabetes", Bioinformation, 1(4), tr. 130. 30. John W Baynes (1991), "Role of oxidative stress in development of complications in diabetes", Diabetes, 40(4), tr. 405-412. 31. D John Betteridge (2000), "What is oxidative stress?", Metabolism-Clinical and Experimental, 49(2), tr. 3-8. 32. Márcio Carocho và Isabel CFR Ferreira (2013), "A review on antioxidants, prooxidants and related controversy: natural and synthetic compounds, screening and analysis methodologies and future perspectives", Food and chemical toxicology, 51, tr. 15-25. 33. Anitra C Carr và Balz Frei (1999), "Toward a new recommended dietary allowance for vitamin C based on antioxidant and health effects in humans", The American journal of clinical nutrition, 69(6), tr. 1086-1107. 34. Judy Yuet‐Wa Chan, Fung‐Chun Lam, Ping‐Chung Leung và các cộng sự. (2009), "Antihyperglycemic and antioxidative effects of a herbal formulation of Radix Astragali, Radix Codonopsis and Cortex Lycii in a mouse model of type 2 diabetes mellitus", Phytotherapy Research: An International Journal Devoted to Pharmacological and Toxicological Evaluation of Natural Product Derivatives, 23(5), tr. 658-665.
43. 35. Chun Whan Choi, Yeon Hee Choi, Mi-Ran Cha và các cộng sự. (2010), "Yeast α- glucosidase inhibition by isoflavones from plants of Leguminosae as an in vitro alternative to acarbose", Journal of agricultural and food chemistry, 58(18), tr. 9988-9993. 36. Rajnish Gupta, Anil K Sharma, MP Dobhal và các cộng sự. (2011), "Antidiabetic and antioxidant potential of β‐sitosterol in streptozotocin‐induced experimental hyperglycemia", Journal of diabetes, 3(1), tr. 29-37. 37. Jing-Yu He, Na Ma, Shu Zhu và các cộng sự. (2015), "The genus Codonopsis (Campanulaceae): a review of phytochemistry, bioactivity and quality control", Journal of natural medicines, 69(1), tr. 1-21. 38. Kai He, Xuegang Li, Xin Chen và các cộng sự. (2011), "Evaluation of antidiabetic potential of selected traditional Chinese medicines in STZ-induced diabetic mice", Journal of ethnopharmacology, 137(3), tr. 1135-1142. 39. Kelly E Heim, Anthony R Tagliaferro và Dennis J Bobilya (2002), "Flavonoid antioxidants: chemistry, metabolism and structure-activity relationships", The Journal of nutritional biochemistry, 13(10), tr. 572-584. 40. Federation ID (2019), IDF Diabetes Atlas 9th Edition, 9th, International Diabetes Federation. 41. Sang-Min Jeon, So-Young Kim, In-Hye Kim và các cộng sự. (2013), "Antioxidant activities of processed Deoduck (Codonopsis lanceolata) extracts", Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition, 42(6), tr. 924-932. 42. Suk Whan Jung, Ae Jin Han, Hae Jin Hong và các cộng sự. (2006), "alpha- glucosidase inhibitors from the roots of Codonopsis lanceolata Trautv", Agricultural Chemistry and Biotechnology, 49(4), tr. 162. 43. Ritu Khanra, Niloy Bhattacharjee, Tarun K Dua và các cộng sự. (2017), "Taraxerol, a pentacyclic triterpenoid, from Abroma augusta leaf attenuates diabetic nephropathy in type 2 diabetic rats", Biomedicine & Pharmacotherapy, 94, tr. 726-741. 44. Sunil Kumar, Smita Narwal, Vipin Kumar và các cộng sự. (2011), "α-glucosidase inhibitors from plants: A natural approach to treat diabetes", Pharmacognosy reviews, 5(9), tr. 19. 45. Chia-Ying Li, Hong-Xi Xu, Quan-Bin Han và các cộng sự. (2009), "Quality assessment of Radix Codonopsis by quantitative nuclear magnetic resonance", Journal of Chromatography A, 1216(11), tr. 2124-2129. 46. Camilo López-Alarcón và Ana Denicola (2013), "Evaluating the antioxidant capacity of natural products: A review on chemical and cellular-based assays", Analytica chimica acta, 763, tr. 1-10. 47. Ayman M Mahmoud và Omnia E Hussein (2014), "Hesperidin as a promising anti- diabetic flavonoid: the underlying molecular mechanism", Int J Food Nutr Sci| Volume, 3(3), tr. 1. 48. Fahimeh Moradi-Afrapoli, Behavar Asghari, Soodabeh Saeidnia và các cộng sự. (2012), "In vitro α-glucosidase inhibitory activity of phenolic constituents from aerial parts of Polygonum hyrcanicum", DARU Journal of Pharmaceutical Sciences, 20(1), tr. 37.
44. 49. Kenjiro Tadera, Yuji Minami, Kouta Takamatsu và các cộng sự. (2006), "Inhibition of α-glucosidase and α-amylase by flavonoids", Journal of nutritional science and vitaminology, 52(2), tr. 149-153. 50. Marian Valko, Dieter Leibfritz, Jan Moncol và các cộng sự. (2007), "Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease", The international journal of biochemistry & cell biology, 39(1), tr. 44-84. 51. Chang-Seon Yoo và Sung-Jin Kim (2013), "Methanol extract of Codonopsis pilosula inhibits inducible nitric oxide synthase and protein oxidation in lipopolysaccharide- stimulated raw cells", Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 12(5), tr. 705- 710.