›

Khóa luận Đánh giá hoạt tính chống ngưng tập tiểu cầu và chống đông máu in vitro của các phân đoạn dịch chiết cây gừng đen (Kaempferia parviflora)

pdf 54 trang thiennha21 18/04/2022 4121
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Đánh giá hoạt tính chống ngưng tập tiểu cầu và chống đông máu in vitro của các phân đoạn dịch chiết cây gừng đen (Kaempferia parviflora)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_danh_gia_hoat_tinh_chong_ngung_tap_tieu_cau_va_cho.pdf

Nội dung text: Khóa luận Đánh giá hoạt tính chống ngưng tập tiểu cầu và chống đông máu in vitro của các phân đoạn dịch chiết cây gừng đen (Kaempferia parviflora)

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN THUỲ DUNG ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU VÀ CHỐNG ĐÔNG MÁU IN VITRO CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT GỪNG ĐEN ( KAEMPFERIA PARVIFLORA WALL.) KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội-2021
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC Người thực hiện: NGUYỄN THUỲ DUNG ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU VÀ CHỐNG ĐÔNG MÁU IN VITRO CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT GỪNG ĐEN ( KAEMPFERIA PARVIFLORA WALL.) KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khoá : QH.2016.Y Người hướng dẫn: 1. TS. Lê Hồng Luyến 2. ThS. Nguyễn Xuân Tùng Hà Nội- 2021
  3. LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin cảm ơn đến Ban chủ nhiệm Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội, Bộ môn Bào chế và công nghệ dược phẩm, các thầy cô đã tạo điều kiện cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô đã giảng dạy, giúp đỡ em hoàn thành chương trình học tập suốt 5 năm qua. Em xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến TS. Lê Hồng Luyến, trường Đại học Khoa học và Công nghệ Hà Nội – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và ThS. Nguyễn Xuân Tùng, trường Đại học Y dược – Đại học Quốc Gia Hà Nội đã luôn tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp em hoàn thành khóa luận . Em cũng xin cảm ơn đề tài “Nghiên cứu hoạt tính sinh học của Cây Gừng đen Kaempferia parviflora” đã tài trợ kinh phí để em thực hiện nội dung nghiên cứu này. Em cũng xin cảm ơn Khoa Khám bệnh và Điều trị ngoại trú, Khoa Đông máu, Viện Huyết học- Truyền máu Trung ương đã giúp đỡ em thực hiện thí nghiệm. Cuối cùng em xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, các bạn bè và người thân đã luôn quan tâm, khích lệ tinh thần giúp em có thêm quyết tâm hoàn thành khóa luận này. Dù đã rất cố gắng, nhưng là lần đầu làm nghiên cứu khoa học nên khó tránh khỏi những sai sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cô giúp em hoàn thiện khóa luận hơn nữa. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 06 năm 2021 Sinh viên Nguyễn Thuỳ Dung
  4. DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Giải nghĩa ADP Adenosin diphosphat AMP Adenosin monophosphat APTT Thời gian Thromboplastin từng phần hoạt hoá ( Activated partial Thromboplastin Time) ATP Adenosin triphosphat AUC Diện tích dưới đường cong (Area Under the aggregation curve) COX-2 Cyclooxygenase 2 cGMP guanosine monophosphat GP Glycoprotein HMWK Kininogen trọng lượng phân tử cao IC 50 Liều ức chế 50% đối tượng thử (Inhibitory concentration 50%) NTTC Ngưng tập tiểu cầu PPP Huyết tương nghèo tiểu cầu (Platelet Poor Plasma) PRP Huyết tương giàu tiểu cầu (Platelet Rich Plasma) PT Thời gian Prothrombin (Prothrombin Time) TT Thời gian Thrombin ( Thrombin Time) vWF Von- Willerbrand
  5. DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên Bảng Trang Bảng 1.1 Các yếu tố tham gia đông máu huyết tương 10 Bảng 3.1 Diện tích dưới đường cong (AUC) của các dịch chiết 28 Gừng đen ở nồng độ 0,2 mg/mL Bảng 3.2 Phần trăm ức chế ngưng tập tiểu cầu của các dịch chiết 29 Gừng đen ở nồng độ 0,2 mg/mL Bảng 3.3 Tốc độ ngưng tập tiểu cầu của các dịch chiết Gừng đen ở 30 nồng độ 0,2 mg/mL Bảng 3.4 Ảnh hưởng của các dịch chiết Gừng đen trên con đường 31 đông máu ngoại sinh Bảng 3.5 Ảnh hưởng của các dịch chiết Gừng đen trên con đường 31 đông máu nội sinh Bảng 3.6 Ảnh hưởng của các dịch chiết Gừng đen trên con đường 32 đông máu chung
  6. DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1.1 Sơ đồ sinh tiểu cầu 2 Hình 1.2 Sơ đồ cấu tạo của tiểu cầu 4 Hình 1.3 Cơ chế ngưng tập tiểu cầu của ADP 7 Hình 1.4 Sơ đồ quá trình đông máu huyết tương 12 Hình 1.5 Vai trò của thrombin trong quá trình đông cầm máu 14 Hình 1.6 Gừng đen (Kaempferia parviflora Wall. ex Baker) 15 Hình 2.1 Sơ đồ chiết tách dược liệu Gừng đen 22 Hình 2.2 Máy ACL TOP500 của hãng IL 23 Hình 2.3 Máy CHRONO –LOG 530 VS 23 Hình 2.4 Mẫu máu sau khi ly tâm 500 vòng/ phút trong 10 phút 25
  7. MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Sinh lý học tiểu cầu 2 1.1.1 Giới thiệu chung về tiểu cầu 3 1.1.2. Chức năng của tiểu cầu 3 1.2. Sinh lý quá trình đông máu huyết tương 9 1.2.1. Các yếu tố tham gia đông máu huyết tương 9 1.2.2. Các nhóm yếu tố tham gia đông máu huyết tương 11 1.2.3. Giai đoạn đông máu huyết tương 11 1.3. Tổng quan về Gừng đen 14 1.3.1. Đặc điểm thực vật 14 1.3.2. Thực trạng và phân bố 16 1.3.3. Thành phần hoá học 16 1.3.4. Công dụng và tác dụng dược lý 17 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1. Nguyên liệu, đối tượng nghiên cứu 21 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 21 2.1.2. Nguyên liệu, dụng cụ nghiên cứu 22 2.2. Phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1. Đánh giá hoạt tính chống đông máu của các phân đoạn dịch 25 chiết Gừng đen. 2.2.2.Đánh giá hoạt tính chống ngưng tập tiểu cầu của các phân 26 đoạn dịch chiết Gừng đen. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28
  8. 3.1. Kết quả 28 3.1.1. Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của các phân đoạn dịch 28 chiết Gừng đen 3.1.2. Tác dụng chống đông máu của các phân đoạn dịch chiết 30 Gừng đen 3.2. Bàn luận 32 3.2.1. Mô hình nghiên cứu 32 3.2.2. Kết quả nghiên cứu 34 3.2.3. Hạn chế của nghiên cứu 36 KẾT LUẬN 38 ĐỀ XUẤT 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO
  9. ĐẶT VẤN ĐỀ Huyết khối động mạch và huyết khối tĩnh mạch là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây nên tử vong trên toàn thế giới [37]. Các thuốc đã biết đến trong chống đông máu như: Heparin, wafarin, hay chống ngưng tập tiểu cầu như : aspirin, clopidogrel, prasugrel đều cho tác dụng điều trị tốt nhưng bên cạnh đó chúng cũng gây nên những tác dụng phụ như: dị ứng, giảm tiểu cầu, loét dạ dày [37,24]. Vì vậy, việc tìm kiếm liên tục các loại thuốc mới đặc biệt là thuốc chống kết tập tiểu cầu, chống đông máu là vô cùng cần thiết. Xác định được các con đường sinh hoá liên quan đến hoạt hoá đông máu và ngưng tập tiểu cầu đã đưa đến việc tìm kiếm các thuốc mới cho các thuốc chống huyết khối mới có ít tác dụng phụ hơn luôn được các nhà khoa học quan tâm. Bên cạnh các thuốc tổng hợp, các thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên là một ứng viên tiềm năng để sử dụng nghiên cứu [37]. Gừng đen (Kaempferia parviflora Wall. ex Baker) thuộc họ Gừng Zingiberaceae [51,28] đã được sử dụng rất lâu đời trong y học Thái Lan và y học cổ truyền để tăng cường sức khoẻ [47]. Chúng được nghiên cứu khá nhiều về tác dụng dược lý, hoá học. Tuy nhiên ở Việt Nam và trên thế giới, số lượng các nghiên cứu về tác dụng chống đông máu và ức chế ngưng tập tiểu cầu còn rất hạn chế. Vì vậy, để làm rõ cơ sở khoa học và giá trị sử dụng Gừng đen, góp phần sử dụng hiệu quả tài nguyên cây thuốc vào điều trị bệnh huyết khối, tôi đã thực hiện đề tài “ Đánh giá hoạt tính chống ngưng tập tiểu cầu và chống đông máu in vitro của các phân đoạn dịch chiết cây gừng đen (Kaempferia parviflora)” . Mục tiêu của đề tài là: 1. Đánh giá được hoạt tính chống đông máu của các dịch chiết cây Gừng đen. 2. Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của các dịch chiết cây Gừng đen. 1
  10. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Sinh lý học tiểu cầu 1.1.1. Giới thiệu chung về tiểu cầu Khái niệm: Tiểu cầu là những đĩa nhỏ hình tròn hoặc bầu dục, có đường kính 3 – 4 µm, độ dày trung bình 0,5 µm và thể tích khoảng 7 µm3. Đây là thành phần hữu hình nhỏ nhất của máu. Số lượng tiểu cầu lưu hành ở máu ngoại vi khoảng từ 150.000 - 400.000/µL (150 – 400 x 109/L). Tiểu cầu là những tế bào không có nhân và không có khả năng phân chia. Chúng là một trong những thành phần đóng vai trò quan trọng bậc nhất của quá trình cầm máu và đông máu, nhất là giai đoạn cầm máu ban đầu [3,1,35]. Nguồn gốc phát triển: Tiểu cầu được sinh sản từ mẫu tiểu cầu, nguyên mẫu tiểu cầu bắt nguồn từ tế bào nguồn dòng tuỷ (CFU - GEMM), do tế bào gốc sinh máu tạo nên (Hình 1.1). Mẫu tiểu cầu trưởng thành ở tuổi sinh tiểu cầu là tế bào máu lớn nhất trong các tế bào máu ở tủy xương, với nhân rất to, nhiều múi, nguyên sinh chất rộng chứa rất nhiều hạt, có đường kính 50 – 100 µm. Mỗi mẫu tiểu cầu có thể tạo được từ 1000 đến 3000 tiểu cầu [3,9,14]. Hình 1.1. Sơ đồ sinh tiểu cầu [3] (HSC: tế bào gốc sinh máu, MTC: mẫu tiểu cầu, TC: tiểu cầu) Đời sống của tiểu cầu: Tiểu cầu có đời sống ngắn, khoảng từ 8 - 14 ngày. Hiện nay có thể giữ tiểu cầu trong 7 ngày ngoài cơ thể ở nhiệt độ 20 – 22°C, lắc liên tục [3]. 2
  11. Cấu trúc tiểu cầu: Cũng như các tế bào khác, tiểu cầu gồm có lớp màng, các hạt, hệ thống vi ống, hệ thống nội NSC (nội sinh nguyên chất). - Màng tiểu cầu: Gồm hai lớp lipid (lớp lipid kép); trong đó có thành phần quan trọng là glycoprotein (GP). Chúng có trọng lượng phân tử khoảng 140kD, có các thành phần sau đây: + GPIb: Là protein xuyên màng có nhiệm vụ liên kết với yếu tố Von Willebrand (vWF). Đây là bước đầu tiên trong hoạt động động cầm máu của tiểu cầu. + GPIIb/IIIa: Là protein màng, hoạt động phụ thuộc vào Ca++, có nhiệm vụ liên kết với fibrinogen, giúp cho tiểu cầu ngưng tập thành “đinh cầm máu” [3]. - Hệ thống các hạt đặc hiệu: Có ba loại hạt: + Hạt δ (hạt đặc): Có kích thước nhỏ hơn hạt α, trong chứa nhiều các chất như ATP, ADP, calci, serotonin, histamin và epinephrin. Các chất này được giải phóng khi tiểu cầu bị kích thích. Mỗi tiểu cầu chứa khoảng 3 – 8 hạt đặc [3,26, 41]. + Hạt α: Là loại hạt chiếm tỷ lệ cao nhất trong tiểu cầu, mỗi tiểu cầu có khoảng 50 – 80 hạt α, chiếm khoảng 10% thể tích tiểu cầu. Hạt này chứa nhiều protein khác nhau: thromboglobulin, yếu tố phát triển (GF), fibrinogen, yếu tố V, vWF và nhiều protein quan trọng khác như thrombospondin, fibronectin, giúp cho hiện tượng dính của tiểu cầu [3,9,15]. + Hạt lysosome: Là các hạt có số lượng thưa thớt, chứa các enzym như acid hydrolase và protease. Các hạt này có chức năng tiêu hóa các thành phần ma trận tế bào chất. Sự bài tiết thành phần lysosome có các chức năng ngoại bào quan trọng gồm phân cắt thụ thể, tiêu sợi huyết và phân hủy chất nền ngoại bào [27]. - Hệ thống vi ống và vi sợi: 3
  12. + Các vi ống: Nằm ngay cạnh màng tiểu cầu, hệ thống này tạo nên khung đỡ của tiểu cầu và tham gia vào hiện tượng co rút khi tiểu cầu bị kích thích. + Các ống dày đặc: Đó là khối vật chất không định hình, dày đặc điện tử, đóng vai trò là kho dự trữ Ca++, đồng thời là nơi tổng hợp cyclooxygenase và prostaglandin của tiểu cầu. + Các vi sợi: Gồm các sợi actin tham gia tạo giả túc của tiểu cầu. [3] - Hệ thống các kênh mở: Gồm các kênh mở vào trong tiểu cầu như các không bào (vacuole) làm tăng diện tích bề mặt của tiểu cầu. Hệ thống này đóng vai trò như một đường dẫn cho các chất từ bên ngoài môi trường đi vào trong tế bào chất của tiểu cầu và là nơi đưa các chất được giải phóng từ các hạt ra khỏi tiểu cầu khi chúng bị hoạt hóa [3,9]. Hình 1.2. Sơ đồ cấu tạo của tiểu cầu [9] 1.1.2. Chức năng của tiểu cầu Tiểu cầu có ba chức năng chính là làm vững bền mạch máu (bảo vệ nội mô), tham gia vào quá trình cầm máu bằng cách tạo nút cầm máu ban đầu và tham gia vào quá trình đông máu huyết tương [8]. 1.1.2.1. Vai trò của tiểu cầu trong quá trình cầm máu Trong trạng thái sinh lý bình thường, tiểu cầu không dính vào nội mô mạch máu còn nguyên vẹn, có lẽ do một chất có tác dụng ức chế dính của tiểu cầu – chất đó có thể là prostagladin [3]. Tuy nhiên, khi tế bào nội mô thành 4
  13. mạch bị tổn thương, tiểu cầu nhanh chóng trải qua các quá trình bám dính, thay đổi hình dạng, bài tiết và kết tập thông qua một loạt các phản ứng phối hợp tinh xảo, mà đỉnh điểm là hình thành một nút tiểu cầu tại nơi mô tổn thương. Quá trình này đạt được thông qua ba bước riêng biệt: kết dính tiểu cầu, chế tiết tiểu cầu và kết tập tiểu cầu [9,21]. Giai đoạn bám dính Tiểu cầu có khả năng dàn ra và dính vào một số bề mặt. Trong in vitro, tiểu cầu có thể dính vào tất cả các bề mặt lạ như ống nghiệm, bi thủy tinh, thạch anh, bentonit, barbiturat. Còn trong in vivo, tiểu cầu không dính vào lớp tế bào nội mạc, nhưng lại có thể dính rất mạnh với tổ chức dưới nội mạc, đặc biệt là với collagen [8]. Khi thành mạch bị tổn thương, lớp tế bào nội mô bị mất đi và bộc lộ lớp dưới nội mô. Lớp này có bản chất là các protein dính như: collagen, yếu tố vWF, fibronectin, lamilin [9,16,50]. Yếu tố vWF tạo điều kiện cho sự bám dính ban đầu, thông qua liên kết với phức hợp GPIb/IX/V đóng vai trò thụ thể trên màng tiểu cầu. vWF đóng vai trò quan trọng trong bám dính của tiểu cầu khi tốc độ dòng máu cao. Trong điều kiện tốc độ dòng máu thấp hoặc tĩnh, bám dính ban đầu của tiểu cầu chủ yếu thông qua liên kết collagen với GPIa/IIa. Những tương tác này cho phép tiểu cầu lưu thông chậm lại đủ để có sự tương tác, ràng buộc hơn nữa của các cặp thụ thể - phối tử dẫn đến sự bám dính tĩnh [9,36]. Đặc biệt sự tương tác ban đầu giữa collagen và GPVI gây ra sự kích hoạt GPIIb/IIIa và GPIa/IIa. vWF và collagen hình thành liên kết mạnh mẽ tương ứng với GPIIb/IIIa và GPIa/IIa, fibrinogen liên kết với GP IIb/IIIa giữ tiểu cầu tại chỗ [9]. Giai đoạn chế tiết Tiểu cầu hoạt hóa, thay đổi hình dạng từ hình đĩa thành dạng quả cầu nhỏ gọn, với phần mở rộng đuôi gai dài tạo điều kiện thuận lợi cho độ bám dính [8,9]. Một khi sự kết dính tiểu cầu đã xảy ra tại vị trí thành mạch bị tổn thương, cần duy trì hoạt hóa tiểu cầu để quá trình cầm máu tiếp tục diễn ra. Điều cần thiết cho việc khuếch đại hoạt hóa tiểu cầu là sản xuất và giải phóng các chất chủ vận hòa tan tại vị trí tổn thương [69], hoạt động theo cách tự tiết (tác động lên chính các tế bào đã tạo ra chúng) và cận tiết (tác động lên các tế 5
  14. bào lân cận) để khuếch đại hoạt hóa tiểu cầu và thu nạp thêm các tiểu cầu lưu thông. Các chất chủ vận này bao gồm thromboxan A2, ADP, epinephrine và thrombin. ADP được tiết ra từ các hạt đặc của tiểu cầu và liên kết với các thụ thể liên quan của nó, gồm P2Y12 và P2Y1 trên bề mặt tiểu cầu [31]. Thụ thể ++ P2Y1 huy động Ca và thay đổi hình dạng tạm thời. Thụ thể P2Y12 tăng cường sự tiết của tiểu cầu và tham gia vào duy trì kết tập tiểu cầu bền vững [9]. P2Y12 cũng là mục tiêu của nhóm thuốc chống kết tập tiểu cầu gọi là thienopyridines (ticlopidine, clopidogrel, prasugrel), được sử dụng rộng rãi trong việc phòng ngừa các biến cố mạch máu ở bệnh nhân mắc các bệnh tim mạch [12]. Ở giai đoạn này, các hiện tượng sinh hóa xảy ra như: kích thích chuyển hóa tiêu đường, thoái hóa và tái tổng hợp từng phần ATP, ADP thành AMP, hoạt hóa thrombosterin. Hiện tượng này xảy ra có sự tham gia của thrombin, collagen và có tiêu tốn năng lượng của tiểu cầu. Đây là hiện tượng vô cùng ý nghĩa trong việc bảo vệ mạch máu khi mạch máu bị tổn thương [8]. Trong thực tế, các khả năng kết dính, ngưng tập, phóng thích của tiểu cầu có sự gắn bó rất chặt chẽ với nhau. Khả năng này thúc đẩy, tạo điều kiện và mở rộng cho khả năng khác xảy ra để đạt mục đích cuối cùng là thực hiện tốt các chức năng của tiểu cầu [8]. Giai đoạn ngưng tập Tiểu cầu có khả năng kết dính lẫn nhau tạo nên các kết chụm tiểu cầu gọi là hiện tượng ngưng tập tiểu cầu. Đây là một khả năng rất đặc biệt của tiểu cầu, thông qua hiện tượng này mà tiểu cầu thực hiện chức năng của mình [8]. Ngưng tập tiểu cầu được đặc trưng bởi sự tích tụ tiểu cầu vào một nút cầm máu. Các thụ thể tiểu cầu trung tâm trong quá trình này là GPIIb/IIIa, liên kết các tiểu cầu kích hoạt thông qua cầu fibrinogen. Một tiểu cầu không hoạt hóa có khoảng phức hợp GPIIb/IIIa trên bề mặt của nó. Trong trạng thái không hoạt động, thụ thể này không thể gắn với fibrinogen, vWF, fibronectin, vitronectin. Chỉ khi tiểu cầu được hoạt hóa, phức hợp GPIIb/IIIa mới được hoạt hóa, hoạt động như một thụ thể dành cho fibrinogen, chất này lại gắn với thụ thể trên các tiểu cầu khác tạo nên một cầu nối làm cho các tiểu cầu ngưng 6
  15. tập lại với nhau và tiếp tục hoạt hóa. Hai giai đoạn ngưng tập và hoạt hóa tác động qua lại, tương hỗ lẫn nhau diễn ra liên tục cho đến khi tạo thành nút tiểu cầu [8,9,28]. Có nhiều chất có khả năng gây ngưng tập tiểu cầu như: ADP, thrombin, adrenalin, serotonin, acid arachidonic, thromboxan A2, collagen, ristocetin, Các chất này được gọi là “chất kích hoạt tiểu cầu”. Trong đó, ADP đóng vai trò quan trọng nhất vì chất này gây ngưng tập tiểu cầu một cách độc lập không phụ thuộc các tác nhân khác và giúp cho phản ứng ngưng tập do các tác nhân khác xảy ra đầy đủ hơn. Ngoài ra, ADP còn có nguồn gốc từ hồng cầu. Những hồng cầu tại vị trí thành mạch bị tổn thương sẽ bài tiết ADP và nhờ vậy làm tăng nhanh nồng độ ADP khu trú tại chỗ tổn thương, góp phần làm tăng quá trình ngưng tập tiểu cầu, nhanh chóng tạo nút cầm máu ban đầu, làm ngừng chảy máu [8,12,51]. ADP gây ra ngưng tập tiểu cầu theo cơ chế sau: Bình thường các tiểu cầu không ngưng tập là phải có năng lượng, năng lượng được tạo ra là do sự thoái hoá ATP thành ADP. Trong trường hợp có nhiều ADP (do đưa từ ngoài vào) thì phản ứng này bị ức chế, nên gây ra thiếu năng lượng dẫn đến tiểu cầu bị ngưng tập (Hình 1.3) [8] Hình 1.3. Cơ chế ngưng tập tiểu cầu của ADP [8] (- -: ức chế, ngăn cản) 7
  16. Sự ngưng tập tiểu cầu là một hiện tượng có thể phục hồi được tự nhiên. Quá trình phục hồi này là do sự có mặt của một hệ thống men ở trong huyết tương và trong tiểu cầu; trong đó adenylat kinase đóng vai trò quan trọng nhất [8]. 1.1.2.2. Vai trò của tiểu cầu trong quá trình đông máu huyết tương Ngay từ khi bắt đầu hiện tượng bám dính, tiểu cầu thay đổi hình dạng và chế tiết những hoạt chất tham gia quá trình khởi động đông máu. Kininogen trọng lượng phân tử cao (HMWK) cùng với kallikrein hoạt hóa yếu tố XII bước đầu của quá trình đông máu. Tiểu cầu có thể làm tăng nhanh sự tổng hợp thrombin. Một lượng nhỏ thrombin được hình thành trên bề mặt của một số tế bào mang yếu tố tổ chức (TF – tissue factor) như: nguyên bào sợi, bạch cầu đơn nhân hoạt hóa hoặc tế bào nội mô. Lượng thrombin này không có khả năng để tạo ra một cục máu đông fibrin ổn định, nhưng đủ để hoạt hóa tiểu cầu. Tiểu cầu hoạt hóa sau đó có thể liên kết các yếu tố đông máu bởi các thụ thể chuyên biệt. Tiểu cầu liên kết với các yếu tố V và VIII chống lại sự phân cắt bởi hoạt tính protein C. Trên bề mặt tiểu cầu, XIa liên kết với thụ thể GPIb và hoạt hóa yếu tố IX. Ngược lại yếu tố Xa dễ dàng bị ức chế bởi TF. Các hoạt động phối hợp của các yếu tố đông máu trên bề mặt tiểu cầu mang đến một sự bùng nổ hình thành thrombin, vì vậy một cục máu đông ổn định fibrin được hình thành. Ngoài ra tiểu cầu còn cung cấp khoảng 20% yếu tố V và các yếu tố đông máu khác như fibrinogen, yếu tố IX, XIII [9]. 1.2. Sinh lý quá trình đông máu huyết tương Đông máu là quá trình chuyển máu ở thể lỏng sang thể đặc, mà thực chất là chuyển fibrinogen ở dạng hòa tan trong huyết tương thành fibrin ở dạng không hòa tan dưới xúc tác của thrombin [7]. Trong cơ thể luôn có sự cân bằng sinh lý giữa hai hệ thống: làm đông máu và chống lại quá trình đông máu. Một hệ thống mang tính bảo vệ cơ thể tránh chảy máu, một hệ thống đóng vai trò gìn giữ lưu thông lòng mạch để luôn bảo đảm tuần hoàn duy trì sự sống. Mất cân bằng hai hệ thống này sẽ dẫn đến hậu quả tắc mạch hoặc chảy máu [8]. Thông thường, quá trình đông máu nằm dưới sự kiểm soát của một số chất ức chế nhằm hạn chế sự hình 8
  17. thành cục máu đông, do đó tránh được sự lan truyền huyết khối. Sự cân bằng mong manh này bị gián đoạn bất cứ khi nào hoạt động đông máu của các yếu tố đông máu được tăng lên, hoặc hoạt động của các chất ức chế tự nhiên bị giảm [48]. 1.2.1. Các yếu tố tham gia đông máu huyết tương Phần lớn các yếu tố đông máu là tiền chất của các enzym phân giải protein được gọi là các zymogen ở dạng không hoạt động. Sự kích hoạt của mỗi zymogen được mô tả bằng cách thêm chữ cái “a” vào chữ số La Mã xác định zymogen cụ thể đó. Hầu hết các yếu tố đông máu và chống đông máu đều do gan sản xuất, ngoại trừ yếu tố III, IV và VIII. Các protein này trải qua một quá trình sửa đổi sau dịch mã để cho phép chúng liên kết với canxi và các cation hóa trị hai khác và tham gia vào quá trình đông máu. Thiếu vitamin K hoặc sử dụng thuốc đối kháng vitamin K (warfarin) dẫn đến chống đông máu [42,52]. Danh pháp của các protein tham gia vào quá trình đông máu khá phức tạp và được Ủy ban danh pháp quốc tế (1954) đặt tên cho các yếu tố đó bằng các chữ số La mã. Tuy nhiên về sau đã có sự thay đổi: một số yếu tố đã bị bỏ đi (như các yếu tố III, IV, VI) vì không tương ứng với một protein riêng biệt nào. Bên cạnh đó, một số yếu tố đông máu được phát hiện gần đây (ví dụ như prekallikrein, HMWK) không được chỉ định bằng số La mã (Bảng 1.1). Yếu tố V và VIII còn được gọi là yếu tố không bền vì hoạt tính đông máu của chúng không bền trong máu lưu trữ [8,52]. Bảng 1.1. Các yếu tố tham gia đông máu huyết tương [8,13,52] Nồng độ trong Chức Nửa đời Nơi sản Yếu tố đông máu huyết năng sống xuất tương (mg/dL) Tế bào gan I (fibrinogen) 150 – 400 Cơ chất 90 giờ Mẫu tiểu cầu 9
  18. II (prothrombin) 10,0 – 15,0 Zymogen 60 giờ Tế bào gan Đồng Tế bào gan V (proaccelerin) 0,5 – 1,0 12 – 36 giờ yếu tố Mẫu tiểu cầu VII (proconvertin) 1,0 Zymogen 4 – 6 giờ Tế bào gan VIII (yếu tố chống Đồng < 0,01 12 giờ Tế bào gan hemophilia A) yếu tố IX (yếu tố chống 0,01 Zymogen 24 giờ Tế bào gan hemophilia B) X (yếu tố Stuart) 0,75 Zymogen 24 giờ Tế bào gan XI (yếu tố Rosenthal) 1,2 Zymogen 40 giờ Tế bào gan XII (hageman) 0,4 Zymogen 48 – 52 giờ Tế bào gan XIII (yếu tố ổn định 2,5 Zymogen 3 – 5 ngày Tế bào gan sợi huyết) Prekallikrein (yếu tố 0,3 Zymogen 48 – 52 giờ Tế bào gan fletcher) HMWK (yếu tố Đồng 2,5 6,5 ngày Tế bào gan fitzgerald) yếu tố 1.2.2. Các nhóm yếu tố tham gia đông máu huyết tương Các yếu tố tham gia đông máu huyết tương có thể được phân thành ba nhóm như sau [52]: - Nhóm yếu tố tham gia vào giai đoạn đầu (giai đoạn tiếp xúc) được gọi chung là các yếu tố tiếp xúc. Đó là yếu tố XI, XII, prekallikrein và HMWK. Các yếu tố thuộc nhóm này có đặc tính không phụ thuộc vitamin K khi tổng hợp, không phụ thuộc Ca++ trong quá trình hoạt hóa, ổn định tốt trong huyết tương lưu trữ và là những yếu tố bền vững. Các yếu tố này hầu như không có vai trò gì trong quá trình cầm máu in vitro; tuy nhiên chúng lại có vai trò rất quan trọng trong việc khởi đầu cho quá trình đông máu theo con đường nội 10
  19. sinh. Ngoài ra, chúng cũng có vai trò quan trọng trong việc hoạt hóa hệ thống tiêu fibrin [8,52,13]. - Nhóm prothrombin gồm các yếu tố II, VII, IX, và X. Đây là các yếu tố phụ thuộc vitamin K khi tổng hợp, cần có Ca++ trong quá trình hoạt hóa. Ngoại trừ yếu tố II, các yếu tố kia không bị tiêu thụ trong quá trình đông máu (có mặt trong huyết thanh) và ổn định trong huyết tương lưu trữ [3,31]. Cả bốn yếu tố này đều là zymogen (tiền men) của các serin protease (men hoạt động). Chúng không có hoạt tính enzym ở trạng thái cơ bản, nhưng có thể bị biến đổi thành serin protease bằng sự phân cắt có lựa chọn một hoặc hai dây nối peptid [8]. - Nhóm fibrinogen gồm các yếu tố I, V, VIII và XIII. Thrombin có tác dụng qua lại với tất cả các yếu tố này. Các yếu tố trong nhóm fibrinogen bị tiêu thụ trong quá trình đông máu. Riêng yếu tố V và yếu tố VIII còn bị mất hoạt tính trong huyết tương lưu trữ [3,13]. 1.2.3. Giai đoạn đông máu huyết tương Quá trình đông máu huyết tương có thể chia thành ba thời kỳ [3]: - Hình thành thromboplastin hoạt hóa (phức hợp prothrombinase) bằng hai con đường nội sinh và ngoại sinh. - Hình thành thrombin. - Hình thành fibrin. 11
  20. Hình 1.4. Sơ đồ quá trình đông máu huyết tương [8] Hình thành thromboplastin hoạt hoá Theo đường nội sinh: Đây là con đường có sự tham gia của đa số các yếu tố đông máu và theo quy luật diễn tiến mở rộng, do vậy mà rất cơ bản và bền vững. Năm protein (yếu tố XII, prekallikrein, yếu tố XI, HMWK, kallikrein trọng lượng phân tử cao và chất ức chế CI) là những yếu tố quyết định chính quá trình hoạt hoá và ức chế giai đoạn tiếp xúc đông máu. Khi thành mạch bị tổn thương, các sợi collagen được bộc lộ. Bề mặt các sợi cơ này mang điện tích âm sẽ gắn và cố định các yếu tố XII, prekallikrein, HMWK, yếu tố XI vào. Ngay sau khi gắn, các yếu tố này được hoạt hoá để tạo yếu tố XIIa, tiếp đó là sự tác động của XIIa để chuyển XI XIa, nhờ có XIa mà yếu tố IX IXa. Yếu tố X được hoạt hóa với sự tham gia của một phức hợp bao gồm yếu tố XIa, đồng yếu tố VIIIa, ion Ca++ và phospholipid của tiểu cầu. Giai đoạn này còn có sự hiệp lực của con đường đông máu ngoại sinh. Yếu tố IXa không chỉ giới hạn tác dụng enzym lên yếu 12
  21. tố X mà còn có khả năng hoạt hóa yếu tố VII tạo nên mối liên hệ giữa đường đông máu nội và ngoại sinh [1,3,8,]. Theo đường ngoại sinh: Yếu tố tổ chức (các lipoprotein từ tổ chức bị tổn thương) hoạt hoá yếu tố VII. Yếu tố này cùng với ion Ca++ trực tiếp hoạt hoá yếu tố X. Tổ chức tổn thương, các chất hoạt hoá của tổ chức hoạt hoá đông máu đi đến hình thành fibrin sẽ thúc đẩy nhanh con đường nội sinh bằng sự hoạt hoá đồng yếu tố VIII và V [3]. Hình thành thrombin Thromboplastin hoạt hoá (phức hợp prothrombinase) nội sinh và ngoại sinh tác động chuyển prothrombin thành thrombin. Thrombin đóng vai trò quan trọng trong các phản ứng của quá trình đông máu. Tác động men của nó ảnh hưởng đến nhiều cơ chất và can thiệp vào nhiều khâu của quá trình đông máu với mục đích chủ yếu là tạo thành fibrin. Nó chuyển fibrinogen thành fibrin, hoạt hoá yếu tố XIII để ổn định sợi huyết. Nó cũng tự làm tăng tốc độ hình thành của bản thân, hoạt hoá yếu tố VIII và yếu tố V nhằm làm gia tăng sự hình thành yếu tố Xa bằng cả hai con đường nội sinh và ngoại sinh. Hơn nữa, thrombin tác động lên tế bào bằng cách cố định lên tế bào và hoạt hóa chúng như hoạt hóa tiểu cầu. Thrombin kích thích tế bào nội mạc sản xuất ra prostacyclin ức chế chất hoạt hóa plasminogen do nội mạch sản xuất và tăng sự phát triển tế bào do nội tiết tố sinh trưởng đặc hiệu. Nó cũng cố định lên tế bào sợi non (fibroblast) và kích thích chúng tăng sinh [3,8]. 13
  22. Hình 1.5. Vai trò của thrombin trong quá trình đông - cầm máu [8] Hình thành fibrin Thrombin tác động thủy phân fibrinogen thành fibrinopeptid A và B. Như vậy, fibrinogen được chuyển thành fibrin monomer. Với sự thay đổi về điện tích, xuất hiện các lực hút tĩnh điện fibrin monomer thành fibrin polymer. Yếu tố XIII được hoạt hóa bởi thrombin và có ion Ca++ đã làm ổn định fibrin polymer nhờ các liên kết đồng hóa trị giữa các sợi fibrin. Fibrin được ổn định có đặc tính cầm máu nghĩa là có khả năng bịt vết thương ở thành mạch làm ngưng chảy máu. Cục sợi huyết là những khối gel hóa được tạo thành bởi lưới fibrin có đường kính khoảng 1 micromet. Mạng lưới này bao bọc hồng cầu, bạch cầu và nhất là tiểu cầu. Một protein tiểu cầu là actomyosin sẽ tác động làm cục máu co lại [3,8]. 1.3. Tổng quan về Gừng đen 1.3.1. Đặc điểm thực vật Gừng đen, còn gọi là Ngải đen, Sâm Thái, Địa liền đen. Tên khoa học: Kaempferia parviflora Wall. ex Baker, thuộc họ Gừng – Zingiberaceae [10,59]. 14
  23. Gừng đen là một loại cây thân thảo lâu năm, có thể cao tới 20 cm. Thân rễ nhỏ và có màu tím đậm. Lá dài 8 – 16 cm, rộng 9 – 13 cm, mỏng, đỉnh nhọn, tròn ở gốc và có màu xanh trơn. Cuống lá ngắn và có rãnh. Hoa dạng cụm, dài 5,1 – 5,4 cm. Mỗi cây ra khoảng 8 bông hoa và mỗi ngày chỉ ra một bông hoa; thời gian ra hoa từ tháng 4 đến tháng 9. Các lá bắc dài 2,5 cm, hình mác, màu xanh lục. Đài hoa màu trắng, dài hơn lá bắc. Ống tràng hoa 3 cm; các đoạn có màu xanh lục, dài 1 cm, phía trên tăng dần và khá lõm. Nhị hai bên, thẳng, màu trắng. Môi dưới màu trắng với màu tím ở phần cuối, hình trứng, dài 0,75 – 1,0 cm. Bao phấn không cuống, có mào. Vòi nhụy dài 4,2 cm. Bầu noãn tròn, tam bội, hình elip [29,46]. Hình 1.6. Gừng đen (Kaempferia parviflora Wall. ex Baker) [17] 15
  24. 1.3.2. Thực trạng và phân bố Gừng đen phân bố chủ yếu ở các nước Đông Nam Á, gồm Thái Lan, Việt Nam, Malaysia, Lào, Myanmar và một số nước khác như Ấn Độ, Trung Quốc. Ở Việt Nam, loài này được tìm thấy nhiều ở các tỉnh An Giang, Đăklăk, Gia Lai, Thanh Hóa, Nghệ An, Hưng Yên và Lai Châu. Hiện nay, trữ lượng Gừng đen trong tự nhiên ở Việt Nam là không nhiều. Trong khi đó, nguồn dược liệu này ngày càng trở nên cạn kiệt do khai thác quá mức. Vì vậy, ngày càng có nhiều nghiên cứu trong nước cũng như quốc tế với mục tiêu xây dựng quy trình nhân giống Gừng đen nhằm chủ động cung cấp nguồn dược liệu thay thế nguồn dược liệu sẵn có. [10,11,46]. 1.3.3. Thành phần hóa học Thành phần hóa học chủ yếu trong Gừng đen bao gồm các nhóm chất chính như flavonoid, glycosid, steroid. Trong đó, chủ yếu là nhóm flavonoid với thành phần chính là dẫn xuất 7-methoxy [4,60]. Flavonoid Bằng phương pháp sắc ký khí, 11 flavonoid đã được phân lập; trong đó, 5,7,4′-trimethoxyflavone và 5,7-dimethoxyflavone là những thành phần chủ yếu [46]. Tuy nhiên, vào năm 2014, khi sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để phân tích các methoxyflavone trong dịch chiết ethanol của Gừng đen, Tuntiyasawasdikul S. và cộng sự đã chỉ ra ba thành phần chính là 5,7,4′-trimethoxyflavone, 5,7-dimethoxyflavone và 3,5,7,3′,4′- pentamethoxyflavone [61]. Glycosid Glycosid là một trong những thành phần chính trong Gừng đen. Năm 2008, Toshiaki Azuma và cộng sự đã phân lập được ba glycosid đầu tiên từ phân đoạn dịch chiết nước của thân rễ cây Gừng đen, bao gồm: rel- (5aS,10bS)- 5a,10b-dihydro-1,3,5a,9-tetrahydroxy-8-methoxy-6H- benz[b]indeno[1,2-d]furan-6-one 5a-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D- glucopyranoside], rel-5aS,10bR isomer, và (2R,3S,4S)-3-O-[α-L- rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl]-3’-O-methyl-ent-epicatechin- 16
  25. (2α→O→3,4α→4)-(5aS,10bS)-5a,10b-dihydro-1,3,5a,9-tetrahydroxy-8- methoxy-6H benz[b]indeno [1,2-d]furan-6-one 5a-O-[α-L-rhamnopyranosyl- (1→6)-β-D-glucopyranoside [36]. Gần đây, hai hợp chất glycoside mới được phân lập từ thân rễ của Gừng đen là Kaempferiaoside A và Kaempferiaoside B [53]. Steroid Steroid và các dẫn chất của chúng cũng được tìm thấy trong phần thân rễ Gừng đen. Hai hợp chất steroid chính đã được phân lập từ dịch chiết methanol có khả năng chống oxy hóa và chống loãng xương yếu, gồm: β- sitosterol và daucosterol [2,47]. Các thành phần khác Ngoài các thành phần chính trên, Gừng đen cũng bao gồm một số thành phần khác như: 2-methoxyanthraquinon, 2-hydroxy-9,10-anthraquinon, tilianine, (2R,3R)-(–)-Aromadendrin trimethyl ether, syringetin 3-O- rutinoside, tamarixetin 3-O-rutinoside [47,32]. 1.3.4. Công dụng và tác dụng dược lý Công dụng Từ xa xưa, Gừng đen đã được sử dụng cho mục đích y học ở Thái Lan. Trong y học cổ truyền, nó thường được sử dụng để tăng cường sức khỏe, chữa rối loạn tiêu hóa và chống viêm [47]. Gừng đen cũng được sử dụng như một chất kích thích tình dục để kích thích hoạt động tình dục ở nam giới. Trong dân gian, nó đã được sử dụng để cải thiện sức khỏe và điều trị các bệnh chuyển hóa. Gừng đen có thể được sử dụng bằng cách ăn trực tiếp cả thân rễ tươi hoặc khô trước khi thực hiện các hoạt động thể chất để nâng cao năng lực làm việc [43,66]. Tác dụng dược lý - Tác dụng kháng khuẩn: Hai flavonoid (gồm: 5,7,4'-trimethoxyflavone và 5,7,3',4'- tetramethoxyflavone) phân lập từ thân rễ Gừng đen thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với Plasmodium falciparum; giá trị IC50 tương ứng là 3,70 µg/mL 17
  26. và 4,06 µg/mL. Ngoài ra, 3,5,7,4’-tetramethoxyflavone và 5,7,4’- trimrthoxyflavone có hoạt tính chống lại Candida albicans và chủng Mycobacterium [68]. - Tác dụng kháng virus: 5-hydroxy-7-methoxyflavone và 5,7-dimethoxyflavone phân lập từ thân rễ Gừng đen thể hiện hoạt tính kháng virus đối với protease HIV-1 với giá trị IC50 là 19 µM. Một hợp chất khác là 5-hydroxy-3,7-dimethoxyflavone ức chế men HCV protease và HCMV với IC50 tương ứng là 190 µM và 250 µM [55]. - Tác dụng kháng viêm: Dịch chiết ethanol và dịch chiết cloroform thô của thân rễ Gừng đen tạo ra một số hợp chất methoxyflavonoid (5,5-hydroxy-3,7,3',4'- tetramethoxyflavone; 5,7-dimethoxyflavone; trimethylapigenin và tetramethylluteolin) có hoạt tính chống viêm. Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết ethanol và 5,5-hydroxy-3,7,3',4'-tetramethoxyflavone ức chế sự biểu hiện mRNA của men tổng hợp nitric oxide cảm ứng (iNOS) theo cách phụ thuộc vào liều lượng trong khi sự biểu hiện mRNA cyclooxygenase-2 (COX-2 ) bị ảnh hưởng một phần. Hoạt tính chống viêm của thân rễ Gừng đen là do ức chế biểu hiện mRNA iNOS, biểu hiện mRNA COX-2 và ức chế SYK có thể liên quan đến việc ức chế tín hiệu do LPS gây ra trong đại thực bào [56,57]. - Tác dụng bảo vệ gan: Trong số các hợp chất phân lập từ thân rễ Gừng đen, 5,3'-dihydroxy- 3,7,4'-trimethoxyflavone thể hiện hoạt tính bảo vệ gan cao so với tác nhân thương mại silybin với giá trị IC50 lần lượt là 18,4 µM và 38,8 µM khi thử nghiệm trên tế bào có độc tính, gây ra bởi D-GaIN trong tế bào gan chuột nuôi cấy sơ cấp [22]. - Tác dụng chống oxi hóa: Dịch chiết ethanol của Gừng đen được chứng minh hoạt tính chống oxy hóa mạnh bằng phương pháp ABTS và bằng xét nghiệm chất phản ứng với 18
  27. axit thiobarbituric (TBARS) trong huyết tương gộp của bệnh nhân đái tháo đường trong nghiên cứu in vitro [51,52]. Một nghiên cứu khác của Nguyễn Phương Thảo và cộng sự đã cho thấy các polymethoxy-flavonoid có trong dịch chiết methanol và chlorofom của thân rễ Gừng đen có tác dụng oxy hóa; trong đó, 4’-hydroxy-5,7-dimethoxylflavon cho tác dụng chống oxy hóa mạnh nhất [33,44]. - Tác dụng chống loãng xương: Hoạt tính chống loãng xương của các hợp chất phân lập từ phân đoạn dịch chiết dichloromethan và methanol của thân rễ Gừng đen đã được đánh giá dựa trên sự phân hủy xương quá mức bởi các tế bào hủy xương. Kết quả thử nghiệm cho thấy các dẫn xuất flavonoid và tecpen ức chế sự hình thành tế bào hủy xương theo cách phụ thuộc liều lượng với giá trị TRAP dao động từ 16,97 ± 1,02 đến 65,67 ± 2,76 (% đối chứng) ở nồng độ 10,0 µM [47]. - Tác dụng kiểu nội tiết tố sinh dục nam (adrogen): Tác dụng adrogen của các loại dịch chiết ethanol và nước của Gừng đen đã được khảo sát trên mô hình chuột nhắt đực bị giảm khả năng sinh dục. Kết quả nghiên cứu cho thấy cao cồn gừng đen liều 0,156 mL/kg và cao nước gừng đen liều 0,3125 mL/kg thể hiện hoạt tính adrogen trên mô hình chuột giảm khả năng sinh dục thông qua việc làm tăng hàm lượng testosteron trong huyết tương; làm tăng trọng lượng túi tinh – tuyến tiền liệt, trọng lượng cơ nâng hậu môn [6]. - Tác dụng trên tim mạch: Các dịch chiết của thân rễ Gừng đen cho thấy tác dụng tích cực trên con đường truyền tín hiệu oxit nitric (NO) dẫn đến giảm hiệu quả khử rung tim. Người ta thấy rằng các dịch chiết làm tăng nồng độ guanosine monophosphat (cGMP) theo chu kỳ, giảm chức năng tim và canxi nhất thời. Điều này ảnh hưởng đến sinh lý bình thường của tim thông qua sự suy giảm chức năng tim và giảm canxi nhất thời trong tế bào tâm thất ở các mô hình trên chuột [67]. 19
  28. - Cải thiện lưu lượng máu: Các hợp chất methoxyflavon phân lập từ các dịch chiết của thân rễ Gừng đen có tác dụng trong việc cải thiện tính lưu động của máu nhờ khả năng giảm thời gian máu đi qua một khe micro bằng cách sử dụng mô hình đông máu nội mạch lan tỏa. Điều này được cho là do sự hoạt hóa của quá trình tiêu sợi huyết, được chứng minh bằng việc kéo dài thời gian ly giải euglobulin và xét nghiệm tiêu sợi huyết trong ống nghiệm [45]. - Hoạt tính kháng cholinesterase: Các phân đoạn dịch chiết của thân rễ Gừng đen thể hiện hoạt tính ức chế acetycholinesterase và butrylcholinesterase đáng kể. Hai methylflavon, cụ thể là 5,7,4’-trimethoxyflavone và 5,7-dimethocyflavone được xác định là có hoạt tính ức chế tiềm năng các enzym này cao nhất, với phần trăm ức chế trong khoảng 43 – 85% [58]. - Hoạt tính chống dị ứng: Chiết xuất ethanol của Gừng đen thể hiện hoạt tính chống dị ứng mạnh nhất, chống lại sự giải phóng hexosaminidase do kháng nguyên gây ra như một dấu hiệu phân hủy tế bào RBL-2H3 trong một thử nghiệm được thực hiện ở họ Zingiberacea với giá trị IC50 là 10,9 µg/mL [58]. Thông qua một nghiên cứu khác, người ta phát hiện ra rằng một số methoxyflavone có hoạt tính chống dị ứng; trong số đó mạnh nhất là 5-hydroxy-3,7,3',4'- tetramethoxyflavone [64]. - Hoạt tính chống khối u: Thân rễ Gừng đen cho thấy tiềm năng điều trị đối với các tế bào HL-60, bệnh bạch cầu tăng nhân U937, dòng tế bào KB, ung thư đường mật ở người (HUCCA-1 và RMCCA-1) và dòng tế bào ung thư NCI-H187. Đặc điểm chung của các tác động này là giảm khả năng phát triển và khả năng sống của tế bào. Các nghiên cứu trên kính hiển vi cho thấy hình thái tế bào bị biến dạng với nhân cô đặc và thể apoptotic. Người ta thấy rằng các methoxyflavone chịu trách nhiệm cho những hoạt tính này và hợp chất có hoạt tính mạnh nhất là 5,7,4-trimethoxyflavon [18,37]. 20
  29. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu, đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Mẫu thực vật được thu hái ở Hưng Yên vào tháng 6/2020 và được định danh bởi Tiến sĩ Nguyễn Quốc Bình, Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Quy trình sơ chế nguyên liệu: Mẫu củ Gừng đen được rửa sạch và phơi khô trong bóng mát, nhiệt độ không quá 30oC. Quy trình chiết xuất các phân đoạn dịch chiết dược liệu: Mẫu củ Gừng đen sau khi thái nhỏ được sấy, nghiền mịn thành bột thô (11,8 kg). Bột thô sau đó được ngâm chiết siêu âm ở nhiệt độ 40oC trong methanol (36 lít x 4 lần). Quay cất dịch chiết methanol ở nhiệt độ 55oC đến khô thu được 800,55 g cao methanol. Hoà tan cao tổng bằng 4 L nước cất và chiết phân lớp lần lượt với n-hexan và ethyl acetat. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm đến khối lượng không đổi thu được các cặn chiết tương ứng; kí hiệu là cao n-Hexan (83,71 g), cao ethyl acetat (453,9 g) và dịch nước. Dịch nước còn lại cho lên cột diaion chạy với dung môi H2O (100%) rửa đường và muối. Sơ đồ chiết tách dược liệu được trình bày cụ thể trong hình 2.1. Các phân đoạn dịch chiết dược liệu được tiến hành tại Khoa Khoa học sự sống, Trường Đại học Khoa học và Công nghệ Hà Nội, do TS. Lê Hồng Luyến cung cấp. 21
  30. Hình 2.1. Sơ đồ chiết tách dược liệu Gừng đen 2.1.2. Nguyên liệu, dụng cụ nghiên cứu Nguyên liệu: Dung dịch DMSO nguyên chất (Dimethyl Sulfoxide) Nước muối sinh lí 0,9% Polyvinyl alcohol 1% (PVA 1%) Polyvinyl butyral 1% (PVB 1%) Collagen Dung môi (DMSO – Dimethyl sulfoxide) Thuốc thử( cao dược liệu) Thuốc chứng dương (Aspirin – Aspegic 100mg) Thuốc chứng dương (Heparin 5000 IU/mL ) Thuốc thử PT (Thuốc thử Thromborel S) Thuốc thử APTT (Dade Actin) Thuốc thử TT (Thuốc thử Thromboclotin) 22
  31. Dụng cụ nghiên cứu: Xy lanh 10 hoặc 20 mL Kim lấy máu 20G Ống nghiệm chống đông citrat Ống nghiệm sạch Ống đo mẫu Viên khuấy từ Đầu côn Eppendorf Micropipet các loại 1-10 µl; 20-200 µl; 100-1000µl Găng tay Bút dạ Giấy parafin Giá để ống đựng máu Thiết bị nghiên cứu: Máy siêu âm Máy ly tâm Máy đo độ ngưng tập tiểu cầu CHRONO-LOG 530 VS Máy ACL TOP500 Hình 2.2. Máy ACL TOP500 của Hình 2.3. Máy CHRONO-LOG 530 hãng IL VS 23
  32. 2.2. Phương pháp nghiên cứu Thu thập mẫu máu Sau khi được sự đồng ý và chấp thuận của hội đồng đạo đức tại Trường Đại học Y dược, ĐHQGHN (mã số hồ sơ 0220202/CN-HĐĐĐ), chúng tôi đã tiến hành thu thập mẫu máu lấy từ người tình nguyện khoẻ mạnh độ tuổi từ 18 đến 25. Để tiến hành nghiên cứu in vitro, đề tài cần tuân thủ theo hiệp ước Helsinki và hướng dẫn quốc gia về khía cạnh đạo đức trong nghiên cứu y sinh học trên đối tượng nghiên cứu là con người. Tiêu chuẩn lựa chọn: Người tình nguyện khoẻ mạnh, 18 – 25 tuổi, không hút thuốc lá, không có tiền sử các bệnh về máu, đang không sử dụng các thuốc tác dụng lên quá trình đông máu, tiêu fibrin. Tiêu chuẩn loại trừ: Có bất thường về số lượng tiểu cầu tại thời điểm nghiên cứu, mẫu máu thu nhận bị vỡ hồng cầu, người cho máu với số lượng trên 450 mL trong vòng 28 ngày trước. Người tình nguyện chỉ tham gia nghiên cứu khi đủ tiêu chuẩn, được hiểu rõ về lợi ích, nguy cơ, mục đích của nghiên cứu này. Người tình nguyện được quyền đồng ý hoặc từ chối tham gia và rút lui khỏi nghiên cứu mà không có bất kì ràng buộc nào. Những thông tin cá nhân về tình nguyện viên chỉ sử dụng cho nghiên cứu, không nhằm bất kì mục đích nào khác. Các tình nguyện viên được lấy 12 – 14 mL máu lúc đói và đo các chỉ số huyết học. Quy trình lấy máu được thực hiện bởi các bác sỹ hoặc y tá có chuyên môn. Địa điểm lấy máu: Khoa Khám bệnh và Điều trị ngoại trú thuộc Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương. Chuẩn bị mẫu: Máu tĩnh mạch toàn phần từ người tình nguyện khỏe mạnh được chống đông bằng natri citrate 3,8% (tỉ lệ 1 : 9). Người tình nguyện khoẻ mạnh phải nhịn ăn 12 giờ trước khi lấy máu. Ly tâm máu toàn phần (500 vòng x 10 phút), lấy phần nổi là huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) cho vào ống falcon 24
  33. vô khuẩn có nút và giữ ở nhiệt độ phòng. Ly tâm phần còn lại (3000 vòng x 10 phút), lấy phần nổi là huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP). Pha Stock dịch chiết của Gừng đen nồng độ 200 mg/mL trong DMSO 10%. Hình 2.4. Mẫu máu sau khi ly tâm 500 vòng/phút trong 10 phút 2.2.1. Đánh giá hoạt tính chống đông máu của các phân đoạn dịch chiết cây Gừng đen. Thời gian đông máu in vitro được đo bằng máy ACL TOP500 theo nguyên lý đo quang (phương thức phát hiện ánh sáng tán xạ). Mục đích: - Nghiên cứu tác dụng chống đông máu trên in vitro của các phân đoạn dịch chiết Gừng đen thông qua các chỉ số PT, APTT và TT. Trong đó: Chỉ số PT (thời gian Prothrombin): Là chỉ số đánh giá con đường đông máu ngoại sinh. Chỉ số APTT (thời gian thromboplastin từng phần được hoạt hoá): Là chỉ số đánh giá con đường đông máu nội sinh. 25
  34. Chỉ số TT (thời gian Thrombin): Là Chỉ số đánh giá con đường đông máu chung, thăm dò tốc độ tạo thành fibrin. Tiến hành: Thu huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP) vào ống falcon vô khuẩn. Chia 450 μL PPP vào mỗi ống máu đã được loại sạch chất chống đông. Thêm 50 μL hóa chất gồm DMSO 0,1%; Heparin 0,2 UI/mL, các phân đoạn dịch chiết dược liệu với nồng độ 0,2 mg/mL vào mỗi ống theo thứ tự sau và ủ trong 5 phút. - Ống 1: 450 µL PPP và 50 µL dung dịch DMSO 0,1% (chứng âm). - Ống 2: 450 µL PPP và 50 µL dung dịch Heparin 0,2 UI/mL (chứng dương). - Ống 3,4,5,6: 450 µL PPP và 50 µL dịch chiết nồng độ 0,2 mg/mL. Tiến hành đo chỉ số PT, APTT và TT bằng máy ACL TOP500. Lặp lại thí nghiệm 3 lần ứng với mỗi phân đoạn. 2.2.2. Đánh giá hoạt tính chống ngưng tập tiểu cầu của các phân đoạn dịch chiết cây Gừng đen. Sử dụng phương pháp đo quang của Born (1962) để đo độ ngưng tập tiểu cầu trên máy CHRONO-LOG 530 VS của Mỹ [19]. Các dịch chiết được hoà tan trong dung môi DMSO, PVA, PEG; sử dụng nồng độ nghiên cứu 0,2 mg/mL. Dùng DMSO 0,1% làm mẫu trắng, aspirin 0,1 mg/mL làm chứng dương. Tiến hành: Đo khả năng ngưng tập tiểu cầu của máu bình thường bằng cách cho 500 μL PRP vào cuvet thuỷ tinh chứa bi khuấy từ và thêm 1 μL chất kích tập tiểu cầu (collagen). Nếu độ ngưng tập đạt trên 50% thì bắt đầu tiến hành đo khả năng ngưng tập tiểu cầu của máu khi sử dụng các dịch chiết với nồng độ 0,2 mg/mL. Quy trình tiến hành cụ thể như sau: Cho lần lượt vào mỗi cuvet chứa bi khuất từ 450 μL PRP. Thêm lần lượt vào mỗi cuvet 50 μL hoá chất gồm DMSO 0,1%; aspirin 0,1 mg/mL; các dịch chiết của Gừng đen với nồng 26
  35. độ 0,2 mg/mL và ủ trong 3 – 5 phút ở 37oC. Sau đó, cho 1 μL chất kích thích ngưng tập tiểu cầu (collagen) vào mỗi cuvet. Tính phần trăm ngưng tập tiểu cầu (% NTTC) ở các ống PPR bằng cách so sánh lượng ánh sáng truyền qua các ống này so với ống chứng PPP (lượng ánh sáng truyền qua ống chứng PPP được coi là 100%). Lặp lại thí nghiệm 3 lần ở mỗi dịch chiết. Các thông số nghiên cứu Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa được biểu diễn qua chỉ số Amplitude. Phần trăm ức chế ngưng tập tiểu cầu (%I) của các mẫu thử và mẫu chứng dương được tính theo công thức. %퐍퐓퐓퐂 퐦á퐮 퐛ì퐧퐡 퐭퐡ườ퐧퐠 − %퐍퐓퐓퐂 퐦ẫ퐮%퐍퐓퐓퐂 %I= x100 %퐍퐓퐓퐂 퐦á퐮 퐛ì퐧퐡 퐭퐡ườ퐧퐠 (% NTTC tính theo chỉ số Amplitude) Tốc độ thay đổi trong một phút (Slope) cũng là một chỉ số được quan tâm nhằm đánh giá giai đoạn đầu của quá trình ngưng tập, giai đoạn tiểu cầu được hoạt hoá. Mức độ ngưng tập tiểu cầu được thể hiện qua chỉ số diện tích dưới đường cong (Area Under the aggregation Curve – AUC) tính từ thời điểm sau khi tiểu cầu biến dạng đến khi tiểu cầu ngưng tập tối đa. Đây là chỉ số quan trọng nhất vì nó phụ thuộc vào tốc độ thay đổi ngưng tập (Slope) và phần trăm ngưng tập tối đa. 2.3. Phương pháp phân tích số liệu Tất cả các thí nghiệm được thực hiện 3 lần và dữ liệu được biểu diễn ở dạng giá trị trung bình ±SD (SD: Độ lệch chuẩn). Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS 23.0, sử dụng Test one way ANOVA, dùng hậu kiểm Tukey. Sự khác biệt giữa các nhóm được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05. 27
  36. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả 3.1.1. Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của các phân đoạn dịch chiết cây Gừng đen Thí nghiệm tiến hành trên các dịch chiết của Gừng đen ở nồng độ 0,2 mg/mL bao gồm cao Ethyl acetat, cao Tổng (cao methanol), cao Hexan, dịch chiết bằng 50% methanol (ký hiệu: Me 50). 3.1.1.1. Ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết Gừng đen đến mức độ ngưng tập tiểu cầu (Area Under the aggregation curve- AUC) Ảnh hưởng của 4 phân đoạn dịch chiết Gừng đen đến mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) được trình bày trong bảng 3.1. Bảng 3.1. Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) của các dịch chiết Gừng đen ở nồng độ 0,2 mg/mL STT Chất thử N AUC p so với p so với dùng dùng Aspirin DMSO 1 DMSO 0,1% 3 306,67±79,03 0,05 4 Tổng 3 355,10±18,80 >0,05 0,05 6 Hexan 2 376,95±101,18 ND ND (DMSO 0,1% là chứng âm, Aspirin 0,1 mg/mL là chứng dương, n là số lần lặp lại thí nghiệm, ND: not determined (chưa xác định) p<0,05 có ý nghĩa thống kê) 28
  37. Nhận xét: Theo bảng 3.1, ở mức nồng độ 0,2 mg/mL cho thấy dịch chiết Ethyl acetat và Me 50 có khả năng làm giảm mạnh mức độ ngưng tập tiểu cầu một cách có ý nghĩa thống kê so với chứng âm DMSO 0,1% (p 0,05). Ở cùng nồng độ, cao Ethyl acetat làm giảm mức độ ngưng tập tiểu cầu tốt hơn cao Me 50 (AUC tương ứng là 14,17±13,68 và 103,27±68,05) (p 0,05 3 Tổng 3 9,37±4,29 0,05). So sánh giữa các dịch chiết với nhau ở cùng nồng độ 0,2 mg/mL, cao Ethyl acetat và cao Me 50 có tác dụng ức chế ngưng tập tiều cầu tốt nhất (% I lần lượt là 94,44±4,40 và 75,63±13,97); trong 29
  38. khi đó, cao Tổng và cao Hexan cho kết quả yếu nhất (% I lần lượt là 9,37±4,29 và 21,33±1,58) (p 0,05 4 Tổng 3 106±25,24 >0,05 0,05). Cao Me 50 có tác dụng làm giảm tốc độ ngưng tập tiểu cầu (p 0,05). 3.1.2. Tác dụng chống đông máu của các phân đoạn dịch chiết Gừng đen Hoạt tính chống đông máu của các phân đoạn dịch chiết Gừng đen trên con đường đông máu ngoại sinh được trình bày ở bảng 3.4. 30
  39. Bảng 3.4. Ảnh hưởng của các dịch chiết Gừng đen trên con đường đông máu ngoại sinh STT Chất thử N PT p so với lô dùng P so với lô dùng DMSO Heparin 1 DMSO 0,1% 3 11,35 ±0,65 >0,05 2 Heparin 0,2 UI/mL 3 11,80±0,40 >0,05 3 Etyl acetat 3 44,53±5,90 0,05 so với DMSO). Các dịch chiết Gừng đen đều có tác dụng kéo dài thời gian đông máu mạnh trên con đường đông máu ngoại sinh (p < 0,05). Trong đó, cao Ethyl acetat có hoạt tính mạnh nhất. Hoạt tính chống đông máu của các phân đoạn dịch chiết Gừng đen trên con đường đông máu nội sinh được trình bày ở bảng 3.5. Bảng 3.5. Ảnh hưởng của các dịch chiết Gừng đen trên con đường đông máu nội sinh STT Chất thử N APTT p so với lô P so với lô dùng DMSO dùng Heparin 1 DMSO 0,1% 3 26,57±1,60 <0,05 2 Heparin 0,2 UI/mL 3 44,27±1,57 <0,05 3 Etyl acetat 3 12,83±1,53 <0,05 <0,05 31
  40. 4 Tổng 3 12,07±0,25 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 với DMSO). 32
  41. 3.2. Bàn luận 3.2.1. Mô hình nghiên cứu Thử nghiệm chống ngưng tập tiểu cầu Đề tài đã sử dụng phương pháp quang học để đo độ ngưng tập tiểu cầu (Light Transmission Aggregometry - LTA) là phương pháp được phát triển bởi Born năm 1962. Đây được coi là tiêu chuẩn vàng đánh giá chức năng ngưng tập tiểu cầu và được sử dụng phổ biến hiện nay [23,49]. Các chất kết tập hay được sử dụng trong thực tế có thể kể đến như: ADP, Collagen, acid arachidonic, ristocetin, [12]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chất kết tập là Collagen do tác dụng nhanh, mạnh nhất sử dụng trong lâm sàng, chỉ cần một lượng nhỏ có thể gây tác dụng rõ rệt. Collagen liên kết với GpVI tham gia vào quá trình truyền tín hiệu tiểu cầu và tạo thành thromboxane A2 (TXA2) và collagen cũng liên kết với thụ thể GpIa/IIa có liên quan đến sự kết dính tiểu cầu[9] Aspirin là thuốc kháng tiểu cầu được sử dụng phổ biến trên lâm sàng hiện nay [23]. Có nhiều loại thuốc khác kháng tiểu cầu với cơ chế khác nhau như :Clopidogrel, Prasugrel, Ticlodipin Tuy nhiên, Aspirin với ưu điểm không cần chuyển hoá qua gan nên tôi sử dụng làm chứng dương trong nghiên cứu in vitro này. Việc sử dụng thêm chứng âm (dung dịch DMSO 0,1%) nhằm kiểm tra và loại bỏ ảnh hưởng của dung môi chiết đến kết quả nghiên cứu. Ảnh hưởng của các dịch chiết lên chức năng tiểu cầu được đánh giá với ba thông số: tỷ lệ phần trăm ức chế tiểu cầu (% I) thể hiện khả năng ức chế ngưng tập tiểu cầu, diện tích dưới đường cong ngưng tập tiểu cầu (AUC) ước tính tổng thể ngưng tập tiểu cầu; và độ dốc đường cong ngưng tập (S) cho biết vận tốc ngưng tập của tiểu cầu theo thời gian. Hiện nay, 3 thông số này luôn 33
  42. được các nhà nghiên cứu quan tâm trong việc đánh giá chức năng tiểu cầu của người bệnh và rất có giá trị trong việc phân loại các bệnh liên quan đến tiểu cầu. Với dịch chiết Hexan, số lần nghiên cứu mới dùng ở N=2 do hạn chế về kinh phí, lượng huyết tương được sử dụng cho mỗi lần nghiên cứu nên cần đánh giá lặp lại để đạt N=3 mới có thể đánh giá về chỉ số p, và so sánh với các dịch chiết khác một cách chính xác hơn. Thử nghiệm chống đông máu Các chỉ số: thời gian prothrombin (PT), thời gian thromboplastin được hoạt hóa một phần (APTT) và thời gian thrombin (TT) để đánh giá khả năng chống đông máu trên in vitro của các dịch chiết dược liệu đo bằng máy đông máu ACL TOP500. Máy dựa trên nguyên lý của hiện tượng tán xạ ánh sáng khi hình thành các sợi fibrin để đưa ra số liệu về thời gian đông máu. Ánh sáng đơn sắc từ đèn LED được truyền tới cuvet phản ứng và được thu nhận bởi đầu dò quang học và cường độ ánh sáng sẽ chuyển thành tín hiệu điện. Cường độ ánh sáng tán xạ tăng lên theo chu trình đông máu và dừng lại ở cuối phản ứng khi hình thành hoàn toàn cục máu đông. Bất kỳ thay đổi cường độ ánh sáng nào cũng đều được phát hiện . Hệ thống sẽ phân tích và đưa ra kết quả[20,25] Heparin là thuốc chống đông máu ức chế yếu tố X và thrombin, đồng thời kích hoạt anti-thrombin. Trong nghiên cứu này, heparin được sử dụng làm chứng dương với nồng độ 0,2 IU / mL, việc lựa chọn heparin là phù hợp và giống với mô hình của Li C., et al. 2013 [66] và Lau A. J., et al. 2009 [39]. Ở đây, heparin là chứng dương nhưng chưa thể hiện được tác dụng trên con đường đông máu ngoại sinh do mỗi con đường đặc trưng và bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác nhau, do đó nồng độ chứng dương của cùng một chất cũng có thể khác nhau. Vì vậy cần thêm thời gian để khảo sát nồng độ cao hơn của Heparin gây ra trên con đường đông máu ngoại sinh. 34
  43. DMSO 0,1% được sử dụng làm chứng âm nhằm kiểm tra và loại bỏ ảnh hưởng của dung môi chiết đến kết quả nghiên cứu. 3.2.2. Kết quả nghiên cứu Giá trị của Giá trị của thực vật, đặc biệt là thực vật ăn được như một chất tự nhiên có tác dụng sinh học, là nguồn cung cấp phong phú cho việc khám phá thuốc sử dụng trong phát triển thực phẩm chức năng và dược phẩm. Nghiên cứu dược liệu là một hướng đi giúp tìm ra những phương pháp điều trị mới và chữa được nhiều loại bệnh hơn mà ít gây tác dụng phụ như sử dụng thuốc hoá dược. Từ các nghiên cứu trên thân rễ Gừng đen, cho thấy flavonoid được cho là có tác dụng chống đông máu, ức chế tiểu cầu, kích hoạt làm giảm kích hoạt tiểu cầu. Do đó , dựa vào mối quan flavonoid với việc điều chỉnh chức năng tiểu cầu nên nó được xem xét để sử dụng làm chất chống kết tập tiểu cầu. Nghiên cứu cho thấy số lượng các nhóm hydroxy cho tác dụng chống đông máu thấp trong khi nhóm nhóm methoxyl làm tăng hoạt tính chống đông cho các chất tách chiết từ cây. Điều này có lẽ là do tính ưa béo dẫn đến tương tác đáng kể với màng tiểu cầu làm ức chế ngưng tập tiểu cầu [40]. Sử dụng chiết xuất methanol nghiên cứu trên chuột. cho thấy thành phần chính trong cacso chiết xuất là methoxyflvon, có ảnh hưởng ức chế đông máu và kết tập tiểu cầu. Trong số các thành phần tách chiết từ Gừng đen, hợp chất 3,5,7,4’,5’- pentamethoxyflavon là thành phần chính có vai trò trong kích hoạt tiêu sợi huyết[34]. Các nghiên cứu trước chủ yếu đánh giá trên các hợp chất hoá học được phân tách từ cây Gừng đen, hay sử dụng chiết etanol , nước nóng. Nghiên cứu này của tôi tập trung đánh giá trên các dịch chiết, bao gồm nhiều hợp chất hoá học có cấu trúc, tỉ lệ các nhóm hydroxyl và methoxyl khác nhau dẫn đến tác dụng có sự khác nhau nhiều. Cần thêm các nghiên cứu kĩ càng hơn để giải thích được ảnh hưởng, tác dụng của các dịch chiết trên quá trình đông máu và ngưng tập tiểu cầu. Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của các dịch chiết từ cây Gừng đen 35
  44. Trong nghiên cứu này, Gừng đen có 3 dịch chiết được đánh giá về tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu in vitro là dịch chiết Etyl acetat, cao Tổng, cao Me50. Các dịch chiết được đánh giá ở cùng nồng độ 0,2 mg/mL khi sử dụng chất ngưng tập là collagen. Khi nhìn vào các số liệu của %I của các dịch chiết, cao etyl acetat cho phần trăm ức chế ngưng tập (%I=94,44%) tương đương aspirin 1 mg/mL (%I=98,57%) (p<0,05). Tiếp đến là cao Me 50 cho tác dụng tương đương aspirin 1 mg/mL (%I=75,63%). Đối với chỉ số AUC và Slope, cao Etyl acetat và Me50 có tác dụng làm giảm AUC và Slope so với chứng âm (DMSO 0,1%) một cách đáng kể (p<0,05) nhưng vẫn yếu hơn so với chứng dương (aspirin 1 mg mL); tốc độ ngưng tập tiểu cầu cũng giảm khi sử dụng 2 dịch chiết này khi so với chứng âm DMSO (p < 0,05). Tác dụng chống đông máu của các dịch chiết từ cây Gừng đen Khi so sánh các số liệu từ bảng 4,5,6 nhận thấy hầu như các dịch chiết chỉ có tác dụng kéo dài thời gian đông máu trên con đường ngoại sinh. Với con đường nội sinh lại không cho tác dụng chống đông máu thậm chí còn làm máu đông nhanh hơn. Với con đường nội sinh này có thể là một cơ hội tiềm năng để sử dụng các dịch chiết cho các bệnh nhân mắc chứng máu khó đông, cần thêm các nghiên cứu chuyên sâu để khẳng định chắc chắn hơn. Theo con đường đông máu chung thông qua chỉ số TT thì các dịch chiết không thể hiện tác dụng rõ rệt. 3.2.3. Hạn chế của nghiên cứu Trong nghiên cứu này, chúng tôi mới chỉ khảo sát trên một chất kết tập là Collagen nên mới đánh giá được tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu theo con đường Collagen. Còn các đích tác dụng khác (như ADP, acid arachidonic, ristocetin ) chưa tiến hành đầy đủ nên có thể bỏ sót tác dụng trên các đích này. Hạn chế về số lượng tình nguyện viên và lượng huyết tương mỗi lần thu nhận trên người tình nguyện. Nghiên cứu chưa tiến hành cho thuốc thử ủ 36
  45. với máu toàn phần của các tình nguyện viên sau đó làm tổng phân tích tế bào máu ngoại vi để xem ảnh hưởng của thuốc đến các chỉ số huyết học và chưa đánh giá được IC50. Nghiên cứu này bước đầu chỉ dừng lại ở mức khảo sát, cần có các nghiên cứu chuyên sâu để khẳng định hơn nữa về hiệu quả cũng như mức độ an toàn khi sử dụng các chất chiết xuất từ cây Gừng đen. 37
  46. KẾT LUẬN Qua quá trình nghiên cứu tác dụng chống chống đông máu và chống ngưng tập tiểu cầu in vitro của các dịch chiết từ cây Gừng đen chúng tôi rút ra kết luận sau: Trong khảo sát 3 dịch chiết ở nồng độ 0,2 mg/mL, dịch chiết etyl acetat cho thấy tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu tốt nhất và tương đương với tác dụng của aspirin 1 mg/mL trên cả 3 thông số AUC, tốc độ ngưng tập và phần trăm ức chế ngưng tập (p 0,05 so với chứng dương). Tiếp theo, cao Me 50 cũng cho tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu nhưng yếu hơn so với aspirin (p<0,05). Cuối cùng,cao Tổng không cho tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu. Về đông máu, các dịch chiết chỉ cho thấy tác dụng kéo dài thời gian đông máu trên con đường ngoại sinh thể hiện qua chỉ số PT (p<0,05 so với DMSO 0,1%). Đối với con đường nội sinh, các dịch chiết thậm chí còn làm tăng tốc độ đông máu đáng kể so với chứng âm (p<0,05). 38
  47. ĐỀ XUẤT Tiến hành nghiên cứu tiếp với các chất kết tập khác như: ADP, acid arachidonic, ristocetin để đánh giá đầy đủ hơn các đích tác dụng của Gừng đen. Đặc biệt ADP vì chất này gây ngưng tập một cách độc lập không phụ thuộc các tác nhân khác và giúp phản ứng ngưng tập do các tác nhân khác xảy ra đầy đủ hơn. Nghiên cứu xác định thành phần các chất có mặt trong các phân đoạn đã được xác định thành phần hoá hoc để có biện luận chính xác cho kết quả nghiên cứu. Trong thời gian tới, thành phần hoá học và tác dụng chống đông trên các dịch chiết cần được thực hiện cùng với các dịch chiết còn lại. Tiến hành nghiên cứu in vivo trên mô hình gây huyết khối để đánh giá hiệu quả chống ngưng tập tiểu cầu và tính an toàn của các phân đoạn. 39
  48. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1. Bộ môn Sinh lý học (2017), Sinh lý học, Sách dùng cho đào tạo bác sĩ đa khoa, Nhà xuất bản Y học. 2. Bùi Kim Anh, Đào Duy Tiên, Phạm Gia Điền, Hồ Đắc Hùng, Phạm Quang Dương, Vũ Đình Hoàng (2017), “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học củ Ngải đen”, Tạp chí Dược liệu, 22(1), 24-29. 3. Đỗ Trung Phấn (2006), Bài giảng huyết học-truyền máu sau đại học, Nhà xuất bản Y học, 235-255. 4. Đỗ Thị Hà, Vũ Thị Diệp, Nguyễn Thị Thu, Nguyễn Tiến Dũng, Trần Ngọc Lân (2018), “Phân tích định tính và định lượng flavonoid trong thân rễ Ngải đen (Kaempferia parviflora Wall. ex Baker) bằng sắc ký lớp mỏng và phương pháp quang phổ”, Tạp chí Dược học, 512, 25-29. 5. Đỗ Trung Phấn (2009), Kỹ thuật xét nghiệm huyết học và truyền máu ứng dụng trong lâm sàng, NXB Y học. 6. Hà Quang Thanh, Mai Thành Chung, Trần Mỹ Tiên, Nguyễn Thị Ngọc Đan, Nguyễn Thị Thu Hương (2018), “Tác dụng kiểu nội tiết tố sinh dục nam của dịch chiết từ cây Ngải đen”, Tạp chí Dược liệu, 23(2), 116-121. 7. Mai Tất Tố, Vũ Thị Trâm (2012), Dược lí học, Tập 2, Nhà xuất bản Y học, 122-124. 8. Nguyễn Anh Trí (2008), Đông máu ứng dụng trong lâm sàng, Nhà xuất bản Y học, 7-63. 9. Nguyễn Quang Đông (2015), Nghiên cứu chất lượng và một số yếu tố ảnh hưởng tới chất lượng khối tiểu cầu, Luận án tiến sĩ y học, Đại học Y Hà Nội, 3-16. 10. Nguyễn Thị Thúy Diễm (2017), “Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng lên sự phát sinh chồi, rễ và loại giá thể phù hợp cho sự sinh trưởng của cây Gừng đen (Kaempferia parviflora) ở vườn ươm”, An Giang University Journal of Science, 16(4), 1-12.
  49. 11. Nguyễn Thị Vân (2017), Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học thân rễ Ngải đen (Kaempferia parviflora Wall. ex Baker), Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội, 10-13. 12. Phạm Quang Vinh (2013), Huyết học – truyền máu cơ bản, Nhà xuất bản Y học, 107-110. 13. Phan Thị Minh Ngọc (2018), Nghiên cứu một số chỉ số đông máu của thai phụ, Luận văn Tiến sĩ Y học, Đại học Y Hà Nội, 6-10. Tài liệu Tiếng Anh 14. Amer Wahed, Andres Quesada, Amitava Dasgupta (2020), Hematology and Coagulation, Acedemic Press, 19-30. 15. Blair P, Flaumenhaft R (2009), “Platelet alpha-granules: Basic biology and clinical correlates”, Blood Reviews, 23(4), 177-189. 16. Broos K, Feys HB, De Meyer SF, Vanhoorelbeke K, Deckmyn H (2011), “Platelets at work in primary hemostasis”, Blood Reviews, 25(4), 155-167. 17. Brother L.E. (2002), “US Botany Research Greenhouse”, Smithsonian Institution, NMNH, Botany. 18. Banjerdpongchai R, Suwannachot K, Rattanapanone V, Sripanidkulchai B (2008), “Ethanolic rhizome extract from Kaempferia parviflora Wall. ex Baker induces apoptosis in HL-60 cells”, Asian Pac J Cancer Prev, 9(4), 595-600. 19. Born GV (1962), “ Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal”, Nature, 194,927-9. 20. Bloom A. L. (1990), “Physiology of blood coagulation”, Pathophysiology of Haemostasis and Thrombosis, 20(1), 14 - 29. 21. Clemetson KJ (2012), “Platelets and primary haemostasis”, Thrombosis Research, 129(3), 220-224. 22. Chaipech S, Morikawa T, Ninomiya K, Yoshikawa M, Pongpiriyadacha Y, Hayakawa T, Muraoka O (2012), “Structures of two new phenolic glycosides, kaempferiaosides A and B, and
  50. hepatoprotective constituents from the rhizomes of Kaempferia parviflora”, Chem Pharm Bull, 60(1), 62-69. 23. Cattaneo M. (2009), "Results of a Worldwide Survey on the Assessment of Platelet Function by Light Transmission Aggregometry: a Report from the Platelet Physiology Subcommittee of the Scientific and Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis", J Thromb Haemost, 7(6), pp 1029 24. Gross PL, Weitz JI (2009), “ New antithrombotic drugs”, Clinical pharmacology & Therapeutics, 86(2),pp, 139-146. 25. Gregor B., Rama B., Julian D. S. (2014), “Optical blood coagulation monitor and method”, U.S. Patent. 26. Heemskerk JW, Bevers EM, Lindhout T (2002), “Platelet activation and blood coagulation”, Thromb Haemost., 88, 186–193. 27. Heijnen H, Van der Sluijs (2015), “Platelet secretory behaviour: as diverse as the granules or not?”, Journal of Thrombosis and Haemostasis, 13(12), 2141-2151. 28. Henri H. Versteeg, Johan W. M. Heemskerk, Marcel Levi, Pieter H. Reitsma (2013), “New Fundamentals in Hemostasis”, Physiol Rev., 93(1), 327-358. 29. Hooker JD. (1994), Flora of British India – Volume 6, Ashford, 221. 30. James G. White, Alan D. Michelson (2013), Platelets (Third Edition), Academic Press, 45-73. 31. Kaplan ZS, Jackson Sp (2011), “The role of platelets in atherothrombosis”, Hematology American Society of Hematology Education Program 2011, 51-61. 32. K. Ninomiya, T. Matsumoto, S. Chaipech, S. Miyake, Y. Katsutama et al. (2015), “Simultaneous quantitative analysis of 12 methoxyflavones with melanogenesis inhibitory activity from the rhizomes of Kaempferia parviflora”, J Nat Med, 70, 179-189. 33. Kusirisin W, Srichairatanakool S, Lerttrakarnnon P, Lailerd N, Suttajit M, Jaikang C, Chaiyasut C (2009), “Antioxidative activity, polyphenolic content and anti-glycation effect of some Thai medicinal
  51. plants traditionally used in diabetic patients”, Med Chem, 5(2), 139- 147. 34. Kazuya Murata, Takahiro Deguchi, Takanori Fujita, Hideaki Matsuda (2013) “Improvement in blood fluidity by Kaempferia parviflora rhizome”, 719-724. 35. Laura Twomey, Robert G. Wallace, Philip M. Cummins et al. (2018), “Homeostasis – An integrated Vision”, IntechOpen, 5, 71-92. 36. Li Z, Delaney MK, O’Brien KA, Du X (2010), “Signaling during platelet adhesion and activation”, Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 30(12), 2341-2349. 37. Leardkamolkarn V, Tiamyuyen S, Sripanidkulchai BO (2009), “Pharmacological activity of Kaempferia parviflora extract against human bile duct cancer cell lines”, Asian Pac J Cancer Prev, 10(4), 695-698. 38. Li C., et al. (2013), "A comparative study on anticoagulant activities of three Chinese herbal medicines from the genus Panax and anticoagulant activities of ginsenosides Rg1 and Rg2", Pharmaceutical biology, 51(8), 1077 - 1080. 39. Lau A. J., Ding F. T., et al. (2009), "Antiplatelet and anticoagulant effects of Panax notoginseng: comparison of raw and steamed Panax notoginseng with Panax ginseng and Panax quinquefolium", Journal of ethnopharmacology 125(3), 380 - 386. 40. Lett Lett Thein Tun (2020), “Screening on antiggregatory activity of kaempferia parviflora Wall. (Black Ginger). 41. Morrell CN, Aggrey AA, Chapman LM, Modjeski KL (2014), “Emerging roles for platelets as immune and inflammatory cells”, Blood., 123(18), 2759-2767. 42. Monroe DM, Hoffman M, Robert HR (2010), Williams Hematology, 8th edition, New York NY: McGraw-Hill Professional Publishing, 614- 616. 43. Mekjaruskul C, Jay M, Sripanidkulchai B (2012), “Pharmacokinetics, bioavailabilitiy, tissue distribution, excretion and metabolite
  52. identification of methoxyflavones in Kaempferia parviflora extract in rats”, Drug Metab Dispos, 40, 2342-2353. 44. Malakul W, Thirawarapan S, Ingkaninan K, Sawasdee P (2011), “Effects of Kaempferia parviflora Wall. Ex Baker on endothelial dysfunction in streptozotocin-induced diabetic rats”, J. Ethnopharmacol,133(2), 371-377. 45. Murata K, Deguchi T, Fujita T, Matsuda H (2012), “Improvement in blood fluidity by Kaempferia parviflora rhizome”, J Nat Med. 46. Ningombam Babyrose Devi, Ajit Kumar Das, P.K. Singh (2016), “Kaempferia parviflora (Zingiberaceae): A new record in the Flora of Manipur”, International Journal of Innovative Science, Engineering & Technology, 3(7), 661-665. 47. Nguyen Phuong Thao, Bui Thi Thuy Luyen, Sang Huyn Lee, Hae Dong Jang, Young Ho Kim (2016), “Anti-osteoporotic and antioxidant activities by rhizomes of Kaempferia parviflora Wall. ex Baker”, Natural Product Sciences, 22(1), 13-19. 48. Previtali E, Bucciarelli P, Passamonti SM, Martinelli I (2011), “Risk factors for venous and arterial thrombosis”, Blood Transfus., 9, 120–38. 49. “Principles of platelet aggregation in clinical trials”, JAVA clinical Research 50. Ruggeri ZM, Mendolicchio GL (2007), “Adhesion mechanism in platelet function”, Circulation Research, 100(12), 1673-1685. 51. Rivera J, Lozano ML, Navarro-Nunez L, Vicente V (2009), “Platelet receptors and signaling in the dynamics of thrombus formation”, Haematologica, 94(5), 700-711. 52. Sanjeev Palta, Richa Saroa, Anshu Palta (2014), “Overview of the coagulation system”, Indian J Anaesth, 58(5), 515-523. 53. Saowanee Chaipech, Toshio Morikawa, Kiyofumi Ninomiya et al. (2012), “Structures of Two New Phenolic Glycosides, Kaempferiaosides A and B, and Hepatoprotective Constituents from the Rhizomes of Kaempferia parviflora”, Chem. Pharm. Bull., 60(1), 62- 69.
  53. 54. Sutthanut K, Sripanidkulchai B, Yenjai C, Jay M (2007), “Simultaneous identification and quantitation of 11 flavonoid constituents in Kaempferia parviflora by gas chromatography”, J Chromatogr A, 1143, 227-233. 55. Sookkongwaree K, Geitmann M, Roengsumran S, Petsom A, Danielson UH (2006), “Inhibition of viral proteases by Zingiberaceae extracts and flavones isolated from Kaempferia parviflora”, Pharmazie, 61(8), 717-721. 56. Saewong C, Tansakul P, Tewtrakul S (2009), “Anti-inflammatory mechanism of Kaempferia parviflora in murine macrophage cells (RAW 264.7) and in experimental animals”, J Ethnopharmacol., 124(3), 576-580. 57. Saewong C, Matsuda H, Tewtrakul S, Tansakul P, Nakamura S, Nomura Y, Yoshikawa M (2011), “Suppressive effects of methoxyflavonoids isolated from Kaempferia parviflora on inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression in RAW 264.7 cells”, J. Ethnopharmacol., 136(3), 488-495. 58. Sawasdee P, Sabphon C, Sitthiwongwanit D, Kokpol U (2009), “Anticholinesterase activity of 7-methoxyflavones isolated from Kaempferia parviflora”, Phytother Res, 23(12), 1792-1794. 59. Tran H.D., Leong-Skornicková J. (2019), “Kaempferia parviflora Wall. ex Baker”, The IUCN Red List of Threatened Species. 60. Than Than Yee, Kyi War Yi Lwin (2019), “Study of phytochemical composition on Kaempferia parviflora Wall. ex Baker”, IEEE-SEM, 7(7), 128-136. 61. Tuntiyasawasdikul S, Limpongsa E, Jaipakdee N, Sripanidkulchai B (2014), “Transdermal permeation of Kaempferia parviflora methoxyflavones from isopropyl myristate-based vehicles”, AAPS PharmSciTech, 15, 947-955. 62. Toshiaki Azuma, Yasuo Tanaka, Hiroe Kikuzaki (2008), “Phenolic glycosides from Kaempferia parviflora”, Phytochemistry, 69, 2743- 2748.
  54. 63. Tewtrakul S, Subhadhirasakul S (2007), “Anti-allergic activity of some selected plants in the Zingiberaceae family”, J. Ethnopharmacol, 109(3), 535-538. 64. Tewtrakul S, Subhadhirasakul S, Kummee S (2008), “Anti-allergic activity of compounds from Kaempferia parviflora”, J. Ethnopharmacol, 116(1), 191-193. 65. Varga-Szabo D, Pleines I, Nieswandt B (2008), “Cell adhesion mechanisms in platelets”, Arterioscler Thromb Vase Biol, 28, 403-412. 66. Wasuntarawat C, Pengnet S, Walaikavinan N, Kamkaew N et al. (2010), “No effect of acute ingestion of Thai ginseng (Kaempferia parviflora) on sprint and endurance exercise performance in humans”, J Sports Sci, 28, 1243-1250. 67. Weerateerangkul P, Palee S, Chinda K, Chattipakorn SC, Chattipakorn N (2012), “Effects of Kaempferia parviflora Wall. ex Baker and sildenafil citrate on cGMP level, cardiac function, and intracellular Ca2+ regulation in rat hearts”, J Cardiovasc Pharmacol, 60(3), 299-309. 68. Yenjai C, Prasanphen K, Daodee S, Wongpanich V, Kittakoop P (2004), “Bioactive flavonoids from Kaempferia parviflora”, Fitoterapia, 75(1), 89-92. 69. Zharikov S, Shiva S (2013), “Platelet mitochondrial function: From regulation of thrombosis to biomarker of disease”, Biochemical Society Transactions, 41(1), 118-123.