›

Khóa luận Chiết xuất, phân lập stipuleanosid R2 từ Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) làm nguyên liệu xây dựng chất chuẩn cho dược liệu

pdf 45 trang thiennha21 18/04/2022 4431
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Chiết xuất, phân lập stipuleanosid R2 từ Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) làm nguyên liệu xây dựng chất chuẩn cho dược liệu", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_chiet_xuat_phan_lap_stipuleanosid_r2_tu_sam_vu_die.pdf

Nội dung text: Khóa luận Chiết xuất, phân lập stipuleanosid R2 từ Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) làm nguyên liệu xây dựng chất chuẩn cho dược liệu

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC BÙI THỊ THANH VÂN CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP STIPULEANOSID R2 TỪ SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus Seem.) LÀM NGUYÊN LIỆU XÂY DỰNG CHẤT CHUẨN CHO DƯỢC LIỆU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2019
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC Người thực hiện: Bùi Thị Thanh Vân CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP STIPULEANOSID R2 TỪ SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus Seem.) LÀM NGUYÊN LIỆU XÂY DỰNG CHẤT CHUẨN CHO DƯỢC LIỆU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa : QH.2014.Y Người hướng dẫn: TS. NGUYỄN HỮU TÙNG Hà Nội - 2019
  3. LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thiện khóa luận này, bên cạnh tôi luôn có sự giúp đỡ vô cùng quý giá đến từ các thầy cô giáo của Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội cùng với bạn bè và gia đình thân yêu của tôi. Thời điểm hoàn thành khóa luận cũng là lúc tôi dành những lời tri ân chân thành nhất đến những người đã chỉ dạy, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giáo viên hướng dẫn của mình – TS. Nguyễn Hữu Tùng – Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội - thầy đã dành nhiều thời gian hướng dẫn, dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin cảm chị Đặng Thị Ngần – Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình chỉ dạy, đóng góp ý kiến để khóa luận của tôi được hoàn thiện. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới chị Nguyễn Thị Thu Thủy và anh Nguyễn Hoàng Việt – Đại học Dược Hà Nội; cùng PGS.TS Dương Thị Ly Hương – Khoa Y Dược Đại học Quốc gia Hà Nội chủ nhiệm đề tài Tây Bắc đã giúp tôi có được kết quả để tiếp bước thực hiện nghiên cứu này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm Khoa, các thầy cô trong Khoa Y Dược, đặc biệt là bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc đã luôn tạo điều kiện cho tôi thực hiện khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể Dược học khóa QH.2014.Y, đặc biệt là các bạn Hà, Hoa, Nhung, Thảo đã đồng hành cùng tôi suốt thời gian nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin dành lời tri ân sâu sắc nhất tới gia đình thân yêu của tôi, đã nuôi nấng và tạo động lực để tôi có kết quả như ngày hôm nay. Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2019 Sinh viên Bùi Thị Thanh Vân
  4. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 2 1.1. CHẤT CHUẨN, CHẤT ĐỐI CHIẾU 2 1.1.1. Khái niệm 2 1.1.2. Ứng dụng 2 1.1.3. Phân loại 3 1.1.4. Sự cần thiết của việc thiết lập chất chuẩn đối chiếu 4 1.1.5. Phương pháp thiết lập chất chuẩn 4 1.2. TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP 6 1.2.1. Đặc điểm thực vật và phân bố 6 1.1.2. Thành phần hóa học 7 1.1.3. Tác dụng dược lý 8 1.1.4. Công dụng 9 1.2. TỔNG QUAN VỀ STIPULEANOSID R2 9 1.2.1. Công thức hóa học và đặc điểm 9 1.2.2. Tác dụng sinh học 10 1.2.3. Các nghiên cứu về stipuleanosid R2 10 CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 11 2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu 11 2.1.2. Dung môi, hóa chất 11 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ 12 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 12 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.3.1. Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế, xác định cấu trúc hóa học của stipuleanosid R2 13 2.3.2. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất 14
  5. 2.3.3. Phương pháp định tính, định lượng stipuleanosid R2 trong SVD bằng HPLC 14 2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu 15 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 16 3.1. Chiết xuất, phân lập và tinh chế Stipuleanosid R2 trong Sâm vũ diệp 16 3.1.1. Chiết xuất 16 3.1.2. Phân lập 17 3.1.3. Kiểm tra độ tinh khiết của stipuleanosid R2 phân lập được bằng SKLM 18 3.2. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng stipuleanosid R2 19 3.2.1. Đặc điểm cảm quan 19 3.2.2. Điểm chảy 19 3.2.3. Kết quả đo phổ 19 3.3. Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 tinh chế được bằng HPLC 22 3.3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký 22 3.3.2. Nhận dạng pic trên sắc ký đồ của stipuleanosid R2 phân lập được 23 3.3.3. Định lượng stipuleanosid R2 phân lập được 24 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 29 4.1. Về chiết xuất, phân lập và tinh chế 29 4.2. Bước đầu xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng 30 4.3. Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 phân lập được bằng HPLC30 4.3.1. Xây dựng phương pháp 30 4.3.2. Phân tích định tính và định lượng stipuleanosid R2 phân lập được 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
  6. DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT BuOH n-Butanol CCĐC Chất chuẩn đối chiếu EtOH Ethanol GC Sắc ký khí HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao MeOH Methanol MS Khối phổ NRM Phổ cổng hưởng từ proton LOD Giới hạn phát hiện LOQ Giới hạn định lượng RDS Độ lệch chuẩn tương đối SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng SVD Sâm vũ diệp UV Tử ngoại
  7. DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1. So sánh 2 loại chất chuẩn 3 Bảng 3.1. Hàm lượng cắn các phân đoạn chiết xuất từ Sâm vũ diệp 17 Bảng 3.2. Kết quả đo điểm chảy của stipuleanosid R2 20 Bảng 3.3. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR, DEPT của stipuleanosid R2 21 Bảng 3.4. Chương trình dung môi 25 Bảng 3.5. Sự phù hợp hệ thống xác định độ tinh khiết 26 Bảng 3.6. Kết quả định lượng nguyên liệu thiết lập chất chuẩn 28
  8. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) 6 Hình 1.2. Các hợp chất tách được từ rễ cây sâm vũ diệp 8 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của stipuleanosid R2 9 Hình 2.1. Mẫu sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sa Pa, Lào 11 Cai Hình 3.1. Quy trình chiết xuất stipuleanosid R2 18 Hình 3.2. Sơ đồ phân lập stipuleanosid R2 từ phân đoạn n-butanol 19 Hình 3.3. Sắc ký đồ của stipuleanosid R2 phân lập được sau khi phun TT H2SO4 20 10% /EtOH Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của stipuleanosid R2 24 Hình 3.5. SKĐ HPLC của stipuleanosid R2 phân lập được (A), cao BuOH (B) và 26 chất chuẩn đối chiếu (C) Hình 3.6. Sắc ký đồ xác định độ tinh khiết của stipuleanosid R2 27
  9. ĐẶT VẤN ĐỀ Đất nước Việt Nam ta luôn tự hào được thiên nhiên ưu đãi, tạo hóa ban cho chúng ta một nguồn dược liệu “giàu có” so với các nước trong khu vực và trên thế giới. Thống kê của Viện Dược liệu cho thấy, cả nước đã ghi nhận 5.117 loài thực vật và nấm, 408 loài động vật và 75 loại khoáng có công dụng làm thuốc, trong đó có nhiều loài dược liệu quý hiếm, đặc hữu như: sâm vũ diệp, sâm ngọc linh, ba kích, ngân đằng, thông đỏ Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem., họ Nhân sâm – Araliaceae) là một trong những dược liệu quý, phân bố ở Trung Quốc và dãy núi Hoàng Liên Sơn, Tây Bắc nước ta. Về mặt y học, sâm vũ diệp được sử dụng làm thuốc bổ và là thành phần trong một số bài thuốc truyền thống của các dân tộc vùng núi Tây Bắc có tác dụng chống ung thư, chống oxy hóa, bổ dưỡng, tăng trí nhớ Theo như các tài liệu đã được công bố về sâm vũ diệp cho thấy các saponin là thành phần hoạt chất chính mang lại tác dụng dược lý và giá trị sử dụng của dược liệu quý này trong y học, đặc biệt nói đến là stipuleanosid R2 – một saponin quan trọng có trong sâm vũ diệp. Để nâng cao chất lượng nghiên cứu về stipuleanosid R2 nói riêng và các hợp chất nói chung, việc kiểm tra, kiểm soát chất lượng dược liệu là vô cùng quan trọng. Song thực tế nước ta còn gặp khó khăn trong việc phân tích, kiểm nghiệm do thiếu các chất chuẩn cần thiết. Phần lớn chất chuẩn đang sử dụng phải nhập từ nước ngoài với giá cao và thời gian đặt hàng kéo dài. Nhằm khắc phục nhược điểm này, cùng với mục tiêu phát triển tiềm năng của vị dược liệu quý sâm vũ diệp, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Chiết xuất, phân lập stipuleanosid R2 từ Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) làm nguyên liệu xây dựng chất chuẩn cho dược liệu”. Mục tiêu đề tài: - Chiết xuất, phân lập và tinh chế stipuleanosid R2 có độ tinh khiết trên 95% từ dược liệu sâm vũ diệp. - Bước đầu xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng stipuleanosid R2: nhiệt độ nóng chảy, dữ liệu phổ. - Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 phân lập được. Kết quả của đề tài sẽ góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu thành phần hóa học, xây dựng tiêu chuẩn dược liệu sâm vũ diệp làm cơ sở cho các nghiên cứu hoạt tính sinh học của stipuleanosid R2, nền tảng cho việc phát triển sâm vũ diệp trong điều trị. 1
  10. CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1. CHẤT CHUẨN, CHẤT ĐỐI CHIẾU 1.1.1. Khái niệm Chất chuẩn (standard subtances) hay chất chuẩn đối chiếu (reference standards) là chất cần thiết để đánh giá các nguyên liệu, bán thành phẩm, thành phẩm theo các quy trình đã xác định nhằm đảm bảo kết quả phân tích đạt độ chính xác, đáng tin cậy [28]. Chất chuẩn đối chiếu là một phần quan trọng của đo lường và thiết lập tính khả thi trong so sánh (comparability) và có thể truy nguyên được (traceability)[6]. Theo dược điển Việt Nam V: Chất đối chiếu là chất đồng nhất đã được xác định là đúng để dùng trong các phép thử đã được quy định về hóa học, vật lý và sinh học. Trong các phép thử đó các tính chất của chất đối chiếu được so sánh với các tính chất của chất thử. Chất đối chiếu phải có độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng [3]. Theo định nghĩa FDA: “Chất chuẩn đối chiếu (reference standards) là một lô hay mẻ của hợp chất làm thuốc được điều chế đặc biệt bằng cách tổng hợp độc lập hoặc bằng cách tinh chế bổ sung của nguyên liệu điều chế và được chứng minh bằng một loạt các thử nghiệm phân tích sâu rộng để xác định nó là nguyên liệu xác thực có độ tinh khiết tối đa, có thể đạt được một cách hợp lý. Nó thường được dùng cho việc phân giải cấu trúc và chất làm chuẩn cho các chất chuẩn làm việc (working standards) [19]. 1.1.2. Ứng dụng Chất đối chiếu được dùng trong các phép thử sau: - Định tính bằng phương pháp quang phổ hấp thụ hồng ngoại. - Định lượng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến, quang phổ huỳnh quang. - Các phép thử định tính và định lượng bằng phương pháp sắc ký. - Định lượng bằng phương pháp vi sinh vật. - Các phép chuẩn độ đo thể tích, phân tích khối lượng. - Các phép thử sinh học. - Một số phép thử khác có hướng dẫn trong các chuyên luận riêng [3]. Ngoài ra chất đối chiếu còn dùng để: - Thẩm định một phương pháp mới. - Chuẩn hóa các chất đối chiếu khác. 2
  11. - Khẳng định giá trị pháp lý của một phương pháp đã chuẩn hóa [15]. 1.1.3. Phân loại Chất chuẩn được phân loại theo nhiều cách khác nhau, trong lĩnh vực khoa học dược phẩm, chất chuẩn được phân làm hai loại: chất chuẩn sơ cấp (primary standards) và chất chuẩn thứ cấp (secondary standards). - Chất chuẩn sơ cấp (primary standards): là các hợp chất với những chất lượng và độ tinh khiết được thiết lập độc lập, được chấp nhận mà không cần tham khảo các tiêu chuẩn khác. - Chất chuẩn thứ cấp (secondary standards): là các hợp chất mà chất lượng và độ tinh khiết được thiết lập dựa trên sự so sánh với chất chuẩn phân tích. So sánh 2 loại chất chuẩn: Bảng 1. So sánh 2 loại chất chuẩn [18] Chất chuẩn sơ cấp Chất chuẩn thứ cấp Chất chuẩn phòng thí nghiệm, Tên gọi khác Chất chuẩn gốc chất chuẩn làm việc Độ tinh khiết 99.5% 95% Chất lượng Cao Kém hơn chất chuẩn sơ cấp Được chấp nhận mà không cần so Yêu cầu phải so sánh với chất Đặc tính sánh chuẩn phân tích - Dùng trong mục đích công nghiệp: + Quá trình phát triển thuốc Mục đích sử Dùng trong phòng thí nghiệm + Nghiên cứu và phát triển (R&D) dụng và kiểm tra chất lượng (QC) + Chuẩn hóa dụng cụ, phương pháp và vật liệu. + Chuẩn hóa chất chuẩn thứ cấp Không sử Như thuốc hoặc mỹ phẩm cho Cho mục đích nghiên cứu yêu dụng người tiêu dùng cầu độ tinh khiết trên 95% Được cung cấp từ nhà máy Tổng hợp độc lập và lượng sẵn có Tính sẵn có Bulk hoặc bào chế trong phòng vô cùng ít thí nghiệm 3
  12. Giá cả Rất cao Thấp hơn 1.1.4. Sự cần thiết của việc thiết lập chất chuẩn đối chiếu Hiện nay, trên thế giới đã có một số chất chuẩn là những hợp chất đặc trưng của dược liệu được sản xuất đạt mức độ tinh khiết nhất định. Trong số đó, chỉ có một số ít chất chuẩn được tiếp cận mua được, nhưng thường có giá rất đắt. Hoạt động nghiên cứu thiết lập và sản xuất các chất chuẩn giúp cho công tác kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc và nguyên liệu làm thuốc được dễ dàng và thuận tiện. Nguồn chất chuẩn ở Việt Nam hiện nay đã có hơn 500 chất chuẩn bao gồm chất chuẩn Quốc tế, chuẩn khu vực, chuẩn Dược điển Việt Nam, chuẩn phòng thí nghiệm, chuẩn chính. Tuy nhiên chủ yếu trong đó là chất chuẩn hóa học, rất ít chất chuẩn có nguồn gốc từ dược liệu. Sự thiếu hụt này đã và đang gây nhiều khó khăn cho ngành Dược như: - Không kiểm tra, giám sát Dược liệu và các dạng bào chế có nguồn gốc từ dược liệu đang lưu hành trên thị trường một cách đầy đủ và toàn diện. - Không tiêu chuẩn hóa được các thuốc sản xuất trong nước bào chế từ dược liệu hoặc chiết xuất từ dược liệu về hàm lượng dược chất. Do đó khó có thể bào chế các thuốc có chất lượng cao phục vụ nhu cầu phòng bệnh và chữa bệnh. Do vậy nghiên cứu thiết lập chất chuẩn các hợp chất chiết xuất Dược liệu là nhiệm vụ khoa học công nghệ cấp thiết, đòi hỏi nhu cầu thực tiễn khách quan. 1.1.5. Phương pháp thiết lập chất chuẩn 1.1.5.1 Thiết lập, bảo quản và phân phối chất chuẩn sơ cấp Quy trình thiết lập chất chuẩn sơ cấp bao gồm các bước như sau [34]: - Đánh giá nhu cầu thiết lập chất chuẩn đối chiếu (CCĐC) - Lựa chọn nguồn nguyên liệu dùng để thiết lập CCĐC từ nhà cung cấp - Đánh giá chất chuẩn đối chiếu: + CCĐC dùng cho phép thử định tính: Thông thường chỉ cần kết quả đánh giá từ một phòng thí nghiệm đủ tiêu chuẩn. + CCĐC dùng cho phép thử độ tinh khiết: Yêu cầu mô tả đặc tính rộng hơn so với phép thử định tính, đặc biệt khi sử dụng trong các phép thử giới hạn. Nếu sử dụng kĩ thuật SKLM, thường đề nghị độ tinh khiết tối thiểu (≥ 90%), nhưng yêu cầu độ tinh khiết cao hơn (≥ 95%) đối với kỹ thuật HPLC hoặc GC. Thông thường chỉ cần một phòng thí nghiệm tham gia đánh giá CCĐC dùng cho phép thử độ tinh khiết. Nếu CCĐC được phân lập hoặc điều chế lần đầu tiên thì cần tiến hành một số phép thử hóa lý như phổ NMR, phổ MS và phân tích nguyên tố để mô tả đặc tính. 4
  13. + Các CCĐC dùng cho phép định lượng: Phạm vi các phép thử rất rộng, sử dụng nhiều kỹ thuật đã được thiết lập và thẩm định, bao gồm các phương pháp đã được sử dụng để đánh giá tiêu chuẩn chất lượng trong dược điển. Khi định lượng các CCĐC bằng các phương pháp không đặc hiệu, như đo quang phổ UV hay so màu, cần phải xác định hàm lượng nước và lượng dung môi tồn dư. Khi định lượng bằng các phương pháp đặc hiệu, cần phải xác định hàm lượng tạp chất. Trong trường hợp này, khuyến khích sử dụng thêm các phương pháp tuyệt đối để định lượng chất chính. + Các CCĐC dùng để hiệu chuẩn thiết bị: Yêu cầu phạm vi các test đánh giá như đối với định lượng. - Phân tích định tính, định lượng để đánh giá chất chuẩn sơ cấp. - Xác định giá trị ấn định. - Xác định thông tin cần cung cấp kèm theo chất chuẩn sơ cấp. - Đóng gói, bảo quản, nghiên cứu độ ổn định. 1.1.5.2. Thiết lập, bảo quản và phân phối chất chuẩn thứ cấp Trên cơ sở tham khảo quy trình thiết lập chất chuẩn sơ cấp, các hội đồng dược điển quốc gia hay khu vực hoặc các phòng thí nghiệm được ủy quyền của cơ quan quản lý dược quốc gia xây dựng quy trình thiết lập chất chuẩn thứ cấp hay chất chuẩn làm việc của cơ sở đó. Việc thiết lập chất chuẩn làm việc dựa trên chất chuẩn sơ cấp thường được tiến hành do nhu cầu thực tế, khi nguồn chất chuẩn sơ cấp không đủ cung cấp cho nhu cầu sử dụng trong công tác nghiên cứu và đảm bảo chất lượng thuốc. Việc phân loại chất chuẩn làm việc mang ý nghĩa tương đối. Một chất chuẩn làm việc của khu vực hay quốc gia có thể được coi là chất chuẩn sơ cấp để thiết lập chất chuẩn phòng thí nghiệm hoặc các nhà sản xuất dược phẩm. Trong trường hợp này, các chất chuẩn khu vực hay quốc gia được gọi là chuẩn liên kết. Theo quy định của ASEAN, chương trình đánh giá lại chất chuẩn đối chiếu ASEAN (ACRS) được thiết kế để phát hiện các dấu hiệu sớm của quá trình phân hủy bằng các kỹ thuật phân tích phù hợp. Các kỹ thuật này phải đáp ứng được các yêu cầu: sử dụng lượng mẫu ít, tiến hành nhanh, độ nhạy cao. Tần suất và cỡ mẫu dùng cho đánh giá lại phụ thuộc một số yếu tố như độ ổn định của CCĐC, đồ bao gói, nút đóng của đồ bao gói, điều kiện bảo quản, độ ẩm, tính chất vật lý và mục đích sử dụng của CCĐC. Đối với ACRS tần suất đánh giá lại được quy định như sau: 3 năm đối với CCĐC dùng cho phép thử hóa học, 2 năm đối với CCĐC dùng 5
  14. cho phép thử vi sinh, 1 năm đối với các chất đặc biệt nhạy cảm. Chương trình đánh giá lại thường bao gồm một số thử nghiệm sau: - Xác định hàm lượng nước, mất khối lượng khi sấy khô. - Xác định tạp chất bằng HPLC hoặc SKLM. - Xác định hàm lượng chất chính. - Xác định độ tinh khiết bằng đo nhiệt vi sai, nếu thích hợp. 1.2. TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP 1.2.1. Đặc điểm thực vật và phân bố Sâm vũ diệp có tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem. [2,12], thuộc chi Nhân sâm (Panax. L), họ Ngũ gia bì (Araliaceae), bộ Hoa tán (Apiales) [1]. SVD là cây thân thảo sống nhiều năm, ưa bóng và rất ưa ẩm [2,12]. Thân rễ dài có nhiều đốt và những vết sẹo do thân rụng hàng năm để lại. Thân khí sinh mảnh, cao 20 - 30 cm, thường đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa, có vạch dọc, thường lụi vào mùa đông, mọc chồi thân mới từ giữa tháng 2 đến đầu tháng 3 dương lịch. Lá kép chân vịt, gồm 2 - 3 chiếc mọc vòng. Lá chét gồm 5 - 7 (ít khi 3) lá thuôn, dài 2,5 - 14 cm, rộng 1,5 - 4 cm, gốc tròn, đầu thuôn thành mũi nhọn, xẻ thùy không đều, mép có răng cưa, có lông. Cụm hoa tán đơn, mọc ở ngọn; cuống cụm hoa 5 – 10 cm; cụm hoa có từ 20 – 90 hoa; cuống hoa mảnh dài 1 – 1,5 cm. Hoa màu trắng đục, mọc thành tán đơn ở ngọn thân, 5 cánh hoa, bầu 2 - 3 ô [2]. Quả hình cầu đến hình cầu dẹt; đường kính 0,6 – 1,2 cm; khi chín màu đỏ, có chấm đen ở đầu, chứa 1 – 2 hạt. Hạt hình cầu hoặc gần cầu, màu xám trắng; vỏ cứng, có rốn hạt [2,11]. Hình 1.1. Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) 6
  15. SVD là loài sâm mọc tự nhiên và được phát hiện tương đối sớm ở nước ta. Trên thế giới, SVD được tìm thấy ở Trung Quốc, Ấn Độ và Nepan (vùng cận Hymalaya), tại Việt Nam dược liệu này phân bố ở dãy núi Hoàng Liên Sơn: huyện Sa Pa, Bát Xát - Lào Cai và huyện Than Uyên - Lai Châu Tây Bắc [2,11-12] ở độ cao 1900-2400 m, trong rừng ẩm. 1.1.2. Thành phần hóa học Saponin là thành phần chính của lá và rễ cây SVD, trong đó bao gồm saponin khung oleanan với hàm lượng tương đối cao cùng với một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp hơn [8,13]. Saponin bao gồm: ginsenoside, notoginsenoside và chikusetsusaponin là các hợp chất có hoạt tính chính trong nhóm dược liệu này [35]. Năm 1989, các nhà khoa học Trung Quốc đã công bố phân lập được 13 saponin khung dammaran từ lá của dược liệu này ở Trung Quốc trong đó bao gồm một số ginseng saponin đặc trưng như ginsenosid F1, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re và Rb3 [31]. Năm 2002, nghiên cứu của Trần Công Luận cho thấy kết quả định tính sơ bộ trong thân rễ và rễ củ SVD có chứa hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin cùng với acid béo, acid amin [12]. Năm 2003, đã xác định thành phần saponin ở thân rễ SVD chủ yếu là saponin triterpen thuộc nhóm oleanan gồm những chất như chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginsenosid Ro. Ngoài ra còn có các saponin triterpen nhóm dammaran như Rb1, Rd, Re, Rg1 và Rg2 [11]. Năm 2018, nhóm nghiên cứu của Đại học Quốc gia Hà Nội đã phân lập được hai saponin từ rễ của SVD: stipuleanosid R2 và aralosid A methyl este [30]. Như vậy, tổng cộng có 28 hợp chất saponin đã được xác định từ các phần của cây SVD. 7
  16. Me Methyl Ara(f) α- L-arabinofuranosyl Ara(p) α-L-arabinopyranosyl Glc β-D-glucopyranosyl Xyl β-O-xylopyranosyl 1 2 3 4 5 Compoud R R R R R 1: Ara(p) H H Me H 2: H Xy (1 6)glc H Me H 3: Xy Ara(p) H Me Glc 4: H H Ara(p) Me H 5: H H H Me Glc 6: Xy H H Me H 7: H Glc Arara(f) H H 8: Xy H H Me Glc 9: Xy Ara(p) H H Glc 10: H Glc Ara(f) Me Glc Hình 1.2. Các hợp chất tách được từ rễ cây sâm vũ diệp [24] 1.1.3. Tác dụng dược lý Năm 2016, nhóm nghiên cứu Trung Quốc đã công bố kết quả sàng lọc hoạt tính diệt tế bào ung thư từ 57 cây trong cơ sở dữ liệu y học cổ truyền Trung Quốc, Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) là một trong số những loài thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư [21]. Năm 2017, nghiên cứu về SVD có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu trên in vitro ở các phân đoạn và các mức liều: phân đoạn tổng, phân đoạn n-butanol, phân đoạn ethylacetat có tác dụng ở các mức liều: 0,5-1-2-5 mg/mL, phân đoạn ether ở các mức liều 1-2-5 mg/mL [10]. 8
  17. Ngoài ra, các nhà nghiên cứu khám phá ra SVD nhờ các thành phần ginsenoside Rh1, Rh2, Rg1, Rg2 và chikusetsusaponin L5 có khả năng ức chế hoạt động enzyme tyrosinase trên 50% [35] – một enzyme có tác dụng tổng hợp melanin tạo sắc tố da, nếu thừa enzyme này sẽ làm da đen, sạm và nám. 1.1.4. Công dụng Rễ cây SVD ngâm rượu rồi chiết dưới dạng tinh sâm dùng rất tốt cho sức khỏe đặc biệt là chức năng sinh dục. Ngoài ra nhân dân ở vùng trồng còn tận dụng cả thân và lá nấu cao rồi dùng để pha với nước hoặc rượu để uống cũng có tác dụng như rễ. Ở Trung Quốc, SVD còn được dùng làm thuốc chữa lao, chảy máu cam, thổ huyết, đòn ngã tổn thương [5,11]. 1.2. TỔNG QUAN VỀ STIPULEANOSID R2 Stipuleanosid R2 là một hợp chất saponin quan trọng chiếm tỷ lệ lớn nhất trong SVD tính đến thời điểm nghiên cứu hiện nay, thành phần mang hoạt tính, đang tiếp tục được sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học, hợp chất này được phân lập trong một số dược liệu như: sâm vũ diệp, tam thất hoang, Aralia taibaiensis [29], Aralia elata [27] 1.2.1. Công thức hóa học và đặc điểm Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của stipuleanosid R2 [37] 9
  18. Tên khoa học theo hệ thống IUPAC: (2S,3S,4R,5R,6R)-6-[[(3S,4aR,6aR,6bS,8aS,12aS,14aR,14bR)-4,4,6a,6b,11,11,14b- heptamethyl-8a-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2- yl]oxycarbonyl-1,2,3,4a,5,6,7,8,9,10,12,12a,14,14a-tetradecahydropicen-3-yl]oxy]- 3-[(2S,3R,4R,5S)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-5-hydroxy-4- [(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxane-2- carboxylic acid [33]. Công thức phân tử: C53H84O23 [37]. Phân tử lượng: 1089,232 g/mol [38]. Tính chất lý hóa: Chất bột màu trắng, độ tan: 0,57 g/l [38], điểm nóng chảy 210 - 2150C [22]. 1.2.2. Tác dụng sinh học Theo kết quả của một số nghiên cứu in vitro trên thế giới, các nhà khoa học đã chứng minh rằng stipuleanosid R2 có tác dụng gây độc tế bào ung thư [27]; ức chế sự gia tăng các tế bào ung thư bạch cầu đặc biệt là đối với dòng tế bào K562 và U937 [22]; có tác dụng chống oxy hóa [32]; hạ đường huyết, điều hòa miễn dịch và hạ lipid máu [31]. 1.2.3. Các nghiên cứu về stipuleanosid R2 Hiện nay trên thế giới và trong nước vẫn chưa có nhiều các nghiên cứu công bố về hợp chất stipuleanosid R2 trong dược liệu. Các nghiên cứu đang dừng lại ở việc phân lập hợp chất này trong các dược liệu và xây dựng được phương pháp định lượng hợp chất stipuleanosid R2 trong thân rễ SVD [9]. Chính vì vậy để nâng cao chất lượng nghiên cứu cần phải có những tiêu chuẩn cho chất chuẩn stipuleanosid R2 10
  19. CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) được trồng và thu hái ở Sa Pa, Lào Cai là dược liệu được nghiên cứu trong đề tài này. Mô tả đối tượng nghiên cứu: thân rễ SVD có nhiều đốt và những vết sẹo, cong ngoằn ngoèo, dài 7-12 cm, đường kính 1,2-1,8 cm. Thể chất cứng chắc, giòn, dễ bẻ, mặt bẻ lởm chởm, màu vàng nâu nhạt. Mùi thơm nhẹ, vị đắng, hơi ngọt. Xử lí mẫu: thân rễ SVD rửa sạch, để khô, thái lát mỏng, sấy khô ở 500C đến hàm ẩm đạt dưới 10%, bảo quản trong túi nilong kín, để nơi khô ráo, thoáng mát để sử dụng trong nghiên cứu. Hình 2.1. Mẫu sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sa Pa, Lào Cai 2.1.2. Dung môi, hóa chất - Dung môi công nghiệp được cất lại trước khi dùng (chiết xuất dược liệu, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột) gồm: + Ethanol (EtOH) + Methanol (MeOH) + n-Hexan + Dicloromethan (CH2Cl2) + Cloroform (CHCl3) + Ethylacetat (EtOAc) + n-butanol (BuOH) - Chất chuẩn liên kết stipuleanosid R2 (Wako Chemicals, Nhật Bản, độ tinh 11
  20. khiết 98%, mã sản phẩm 155-01701) - Dung môi chạy sắc ký HPLC (Methanol, acetonitril) của Merck, Đức - Hạt nhồi dùng cho sắc ký cột loại: + Pha thường silica gel 60 (230-400 mesh, Nacalai Tesque, Nhật Bản) + Pha đảo YMC ODS-A (50 μm, YMC Co. Ltd., Nhật Bản) - Bản mỏng tráng sẵn trên đế nhôm loại pha thường Kieselgel 60 F254 và pha đảo TLC Silica gel 60 RP-18 F254S (Merck, Damstadt, Đức). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% hơ nóng để phát hiện vết chất. 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ Trong quá trình nghiên cứu đề tài, chúng tôi đã sử dụng các thiết bị, dụng cụ đáp ứng tiêu chuẩn ISO/IEC 17025 và GLP tại Khoa Y Dược, ĐH Quốc gia Hà Nội: - Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Mỹ) với detector DAD và bộ phận bơm mẫu tự động - Tủ sấy Memmert (Memmert – Đức), tủ hút - Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR (sai số 0,0001g, Precisa - Thụy Sĩ) - Cân xác định hàm ẩm Prescisa HA 60 - Máy siêu âm Power sonic 405 (Powersonic - Hàn Quốc) - Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi, Thụy Sĩ) - Máy đo điểm nóng chảy BUCHI 535 - Bếp điện, bếp đun cách thủy - Cột sắc ký các loại kích cỡ - Màng lọc 0,45 µm - Dụng cụ thủy tinh: bình gạn, bình nón, phễu lọc, cốc có mỏ, bình định mức, bình cầu dung tích 50 - 2000 mL, ống nghiệm, pipet chính xác 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế stipuleanosid R2 từ dược liệu sâm vũ diệp. - Bước đầu xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng stipuleanosid R2: nhiệt độ nóng chảy, dữ liệu phổ. - Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 tinh chế được. 12
  21. 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế, xác định cấu trúc hóa học của stipuleanosid R2 2.3.1.1. Phương pháp chiết xuất các hợp chất saponin từ dược liệu Các nghiên cứu về thành phần hoạt chất trong sâm vũ diệp đều cho thấy sâm vũ diệp có chứa thành phần chính là saponin, tham khảo các tài liệu về chiết xuất saponin và sapogenin trong dược liệu [13-14] để tìm ra phương pháp chiết xuất phù hợp nhất với mẫu nghiên cứu là thân rễ SVD. - Phương pháp chiết mẫu: chiết siêu âm với dung môi ethanol 70%. - Phương pháp chiết phân đoạn: chiết lỏng-lỏng. Quy trình chiết xuất: 1. Thân rễ SVD sau khi rửa sạch, phơi khô, thái nhỏ được chiết siêu âm bằng dung môi EtOH 70% ở nhiệt độ 400C, chiết 3 lần. 2. Thu dịch chiết, sau đó lọc dịch chiết qua giấy lọc, gom lại, cất quay loại dung môi dưới áp suất giảm, đun cách thủy thu được cao tổng ethanol. 3. Cao ethanol thu được cho phân tán trong nước rồi lắc lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần ether, ethyl acetat và n-butanol lặp lại 3 lần theo tỷ lệ 1:1. 4. Các phân đoạn thu được cho cất quay chân không dưới áp suất giảm để thu hồi dung môi, đun cách thủy thu được 3 cắn tương ứng với từng phân đoạn. 2.3.1.2. Phương pháp phân lập và tinh chế stipuleanosid R2 trong cao rễ SVD Lựa chọn phân đoạn n-butanol để tiến hành phân lập, sử dụng phương pháp: sắc ký cột pha thường và sắc ký cột pha đảo. Theo dõi quá trình phân lập chất bằng sắc ký lớp mỏng. - Sắc ký cột (SKC): được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường silica gel 60 (0,04 - 0,063 nm, Nacalai Tesque, Inc., Nhật) và pha đảo YMC ODS-A (50µm, YMC Co. Ltd, Nhật). Theo dõi quá trình phân lập bằng SKLM. - Sắc ký lớp mỏng (SKLM): được thực hiện trên bản mỏng Silicagel 60 F254 0 (Merk) và Silicagel RP-18 F254S (Merk) đã hoạt hóa ở 105 C trong 1 giờ. Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu. Tinh chế chất phân lập bằng phương pháp kết tinh lại hoặc rửa nhiều lần bằng dung môi thích hợp. 13
  22. 2.3.1.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập được Sử dụng các phương pháp phổ bao gồm phổ khối lượng (ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) kết hợp so sánh dữ liệu phổ thu được với các dữ liệu phổ đã công bố trong các tài liệu tham khảo để biện giải cấu trúc chất phân lập được. 2.3.2. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất Dữ liệu chuẩn dùng để nhận dạng chất nhằm cung cấp thông tin cho thiết lập hồ sơ nhận dạng chuẩn. Việc nhận dạng chất dựa vào: - So sánh phổ của chất phân tích với phổ chất chuẩn trong cùng điều kiện. - So sánh thông tin phổ, dữ liệu hóa lý, hằng số vật lý của chất phân tích với tài liệu khoa học hoặc thông tin đã công bố. Tập hợp các dữ liệu chuẩn đó có thể khẳng định được hợp chất là đúng đối tượng nghiên cứu. Các phương pháp được sử dụng để xây dựng bộ dữ liệu gồm có: đo điểm chảy; đo phổ tử ngoại khả kiến (trong dung môi MeOH), đo phổ hồng ngoại (trong KBr); đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều (H1 NMR, C13 NMR, DEPT) và 2 chiều (COSY, HMBC, HSQC), đo phổ khối lượng (MS) [3]. 2.3.3. Phương pháp định tính, định lượng stipuleanosid R2 trong SVD bằng HPLC Phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC sử dụng hệ thống Agilent 1260 Series Infinity của Agilent Technologies, Hoa Kỳ với detector DAD và bộ phận bơm mẫu tự động.  Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký Tham khảo một số tài liệu và điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm, tiến hành khảo sát về bước sóng, thành phần pha động, tỷ lệ dung môi, tốc độ dòng, thể tích bơm mẫu và lựa chọn điều kiện sắc ký để đảm bảo điều kiện phân tích định tính, định lượng thành phần stipuleanosid R2 trong thân rễ SVD.  Nhận dạng các pic trên sắc ký đồ của chất stipuleanosid R2 phân lập được từ thân rễ SVD Tiến hành sắc ký HPLC mẫu chất phân lập và mẫu cao BuOH theo điều kiện sắc ký đã lựa chọn. Nhận dạng pic trên SKĐ của chất phân lập được dựa vào thời gian lưu tương ứng trên SKĐ mẫu thử và xác định hàm lượng hợp chất stipuleanosid R2 của dược liệu dựa vào tương quan diện tích pic trên SKĐ. 14
  23. Yêu cầu của chất sử dụng làm chất đối chiếu: Diện tích pic chính phải > 95,0% và các pic phụ có tổng diện tích pic phải < 5,0% so với tổng diện tích pic trên sắc ký đồ tính theo nguyên trạng. Bỏ qua pic của pha động và pic có S/N < 2/1. Saponin chính trong thân rễ SVD đạt độ tinh khiết cần thiết được xây dựng làm chất đối chiếu hóa học sử dụng trong phép phân tích định tính và kiểm nghiệm dược liệu SVD.  Xác định hàm lượng Hàm lượng stipuleanosid R2 trong dung dịch thử được tính theo công thức: STx CCx V x 100 CT (%) = SCx mcân Trong đó: ST, SC: Diện tích pic stipuleanosid R2 trên sắc ký đồ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn tương ứng (mAU.min) Cc: Nồng độ của stipuleanosid R2 trong dung dịch chuẩn (mg/mL) mcân: Khối lượng mẫu cân thực nghiệm (mg) V: Thể tích dung dịch thử (mL) 2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê theo phương pháp thống kê ứng dụng trong nghiên cứu phân tích, sử dụng công cụ Data analysis của Microsoft Excel [36]. Một số công thức tính toán trong xử lý thống kê kết quả: Tính giá trị trung bình: = ∑ Tính độ lệch chuẩn: SD = x ∑ ( −) Tính độ lệch chuẩn tương đối: S RSD(%) = x 100 X Trong đó: : giá trị trung bình các mẫu thử xi: giá trị của mẫu thử n: số thử nghiệm/mẫu thử được sử dụng để tính giá trị trung bình SD: độ lệch chuẩn RSD: độ lệch chuẩn tương đối. 15
  24. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Chiết xuất, phân lập và tinh chế Stipuleanosid R2 trong Sâm vũ diệp 3.1.1. Chiết xuất Cân 500 g thân rễ SVD (độ ẩm được xác định là 7,81%), chiết bằng phương pháp chiết siêu âm ở nhiệt độ 700C với dung môi ethanol 70% trong 3 giờ (chiết 3 lần, mỗi lần 1500 mL). Các dịch chiết ethanol thu được được lọc qua giấy lọc, gom lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho 95,9g cao chiết tổng ethanol. Cao chiết được hòa tan trong nước cất (500 mL) và tiến hành chiết phân bố lỏng – lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần ether, ethyl acetat và n-butanol (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 500 mL). Các dịch chiết phân đoạn được cất thu hồi dung môi, sấy dưới áp suất giảm thu được 3 cắn tương ứng với từng phân đoạn ether (5,82 g), ethyl acetat (2,70 g) và n-butanol (21,70 g). Quá trình chiết xuất được tiến hành như trong hình 3.1 Hàm lượng cắn 3 phân đoạn trong nguyên liệu khô được trình bày ở bảng 3.1 Bảng 3.1. Hàm lượng cắn các phân đoạn chiết xuất từ Sâm vũ diệp Khối lượng Khối lượng % so với nguyên STT Phân đoạn dược liệu (g) cắn (g) liệu khô 1 Cắn ether 500 5,82 1,26 2 Cắn ethyl acetat 500 2,70 0,59 3 Cắn n-butanol 500 21,70 4,71 Nhận xét: Phân đoạn n-butanol cho khối lượng cắn nhiều nhất trong ba phân đoạn (chiếm 4,71% so với nguyên liệu khô), khối lượng cắn thu được từ phân đoạn ether và ethyl acetat là thấp hơn (tương ứng 1,26% và 0,59%). 16
  25. Thân rễ SVD sau sơ chế 1. Chiết siêu âm DM EtOH 70% 2. Gom dịch chiết, lọc 3. Cất quay áp suất giảm Cao EtOH Phân tán trong 500 mL H2O Dịch nước cao SVD Cất quay áp suất giảm, sấy Ether, lắc, gạn Cắn Ether Dịch còn lại Cất quay áp suất giảm, sấy Ethyl acetat, lắc, gạn Cắn EtOAc Dịch còn lại Cất quay áp suất giảm, sấy n-butanol, lắc, gạn Cắn n-butanol Dịch còn lại Hình 3.1 Quy trình chiết xuất stipuleanosid R2 3.1.2. Phân lập Phân lập các chất có trong phân đoạn BuOH bằng sắc ký cột. Cột sắc ký được làm sạch, lót một lớp bông mỏng dưới đáy cột. Nhồi cột bằng phương pháp nhồi cột ướt với chất nhồi cột silica gel pha thường hay silica gel pha đảo. Ổn định cột trong 24h. Tiến hành phân lập sắc ký sử dụng cột nhồi silica gel (Φ85 mm × 80 mm) với hệ dung môi rửa giải CH2Cl2 - MeOH theo gradient nồng độ từ tỷ lệ CH2Cl2 - MeOH = 5:10:1, v/v, mỗi phân đoạn 600 mL. Kiểm tra các dịch rửa giải bằng sắc ký lớp mỏng và gom các ống có cùng thành phần, loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 4 phân đoạn ký hiệu là B1, B2, B3, B4. 17
  26. Từ phân đoạn B4 (5,1 g) bằng sắc ký cột pha đảo RP18 (Φ50 mm x 350 mm) rửa giải đẳng dòng với hệ pha động MeOH - H2O (1:1, v/v, 1600 mL) loại dung môi thu được hợp chất stipuleanisid R2 (180 mg). Phân đoạn BuOH (21,7 g) Sắc ký cột Silica gel (Φ85 mm × 80 mm) CH2Cl2 - MeOH (5:1 0:1, v/v, 600 mL) B1 B2 B3 B4 840 mg 4,3 g 3,7 g 5,1 g SKC pha đảo C18 (Φ50 mm × 350 mm) MeOH - H2O Stipuleanosid R2 Bột màu trắng, 180 mg Hình 3.2. Sơ đồ phân lập hợp stipuleanosid R2 từ phân đoạn n-butanol 3.1.3. Kiểm tra độ tinh khiết của stipuleanosid R2 phân lập được bằng SKLM Hợp chất stipuleanosid R2 sau khi phân lập được kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM Silicagel RP-18 F254S trên cùng một bản mỏng, triển khai với hệ dung môi Methanol : H2O = 2 : 1, thu được sắc ký đồ như hình 3.3. Hình 3.3. Sắc ký đồ của hợp chất stipuleanosid R2 phân lập được sau khi phun TT H2SO4 10% /EtOH 18
  27. Nhận xét: Sau khi phun thuốc thử, SKĐ của hợp chất stipuleanosid R2 thấy xuất hiện duy nhất vết màu hồng khá đậm, sau đó chuyển sang màu tím đặc trưng cho các dẫn xuất triterpen có hệ số Rf là 0,4. Vì vậy sơ bộ kết luận chất phân lập được là chất tinh khiết. Ngoài ra để xác định độ tinh khiết của stipuleanosid R2 phân lập được chúng tôi còn sử dụng phương pháp chuẩn hóa diện tích bằng HPLC được trình bày ở mục 3.3.2. 3.2. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng stipuleanosid R2 3.2.1. Đặc điểm cảm quan Đặc điểm cảm quan của đối tượng nghiên cứu được quan sát bằng mắt thường dưới ánh sáng ban ngày: bột màu trắng. 3.2.2. Điểm chảy Tiến hành đo điểm chảy theo DĐVN V (PL-168, phương pháp 1 – phương pháp đo trong mao quản). Thu được kết quả là: Bảng 3.2. Kết quả đo điểm chảy của stipuleanosid R2 Lần đo Kết quả (oC) Điểm chảy lý thuyết (oC) 1 213,5 2 211,6 210-215 3 212,1 Trung bình 212,4 ± 1 3.2.3. Kết quả đo phổ Góc quay cực: [α] = +7,5 (c 0,2, MeOH) Phổ ESI-MS: m/z 1087 [M-H]- tương ứng với khối lượng phân tử là M = 1088 1 13 Phổ H-NMR (CD3OD; 500 MHz) và C-NMR (CD3OD; 125 MHz), DEPT: xem bảng 3.3 Bảng 3.3. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR, DEPT của hợp chất stipuleanosid R2 a,c Vị trí δH (độ bội, *δ δ a,b DEPT C C C J=Hz) Aglycon 1 39,8 39,8 CH2 2 26,9 27,0 CH2 3 90,7 90,8 CH 4 40,1 40,7 C 19
  28. 5 57,0 57,0 CH 6 19,3 19,3 CH2 7 33,9 34,0 CH2 8 40,7 40,2 C 9 49,1 49,2 CH 10 37,8 37,9 C 11 24,5 24,5 CH2 12 123,8 123,8 C 5,27 (br s) 13 144,7 144,8 C 14 42,9 42,9 C 15 28,8 28,9 CH2 16 23,9 24,0 CH2 17 48,0 48,0 C 18 42,5 42,6 CH 19 47,2 47,3 CH2 20 31,5 31,5 C 21 34,9 34,9 CH2 22 33,1 33,2 CH2 23 28,5 28,5 CH3 0,95(s) 24 17,0 17,0 CH3 0,93(s) 25 16,0 16,0 CH3 0,81(s) 26 17,7 17,7 CH3 0,85(s) 27 26,3 26,3 CH3 1,17(s) 28 178,0 178,1 COOR 29 33,4 33,5 CH3 1,05(s) 30 24,0 24,0 CH3 0,96(s) Đường GlcA 1ʹ 106,3 106,4 CH 4,01 (d, J = 1,0 Hz) 2ʹ 76,4 76,4 CH 3ʹ 81,9 82,0 CH 4ʹ 79,3 79,4 CH 5ʹ 78,1 78,1 CH 6ʹ 176,5 176,4 COOH Đường Glc I 20
  29. 1ʹʹ 104,5 104,4 CH 4,92 (d, J = 8,0 Hz) 2ʹʹ 75,5 75,6 CH 3ʹʹ 78,3 78,3 CH 4ʹʹ 71,0 71,1 CH 5ʹʹ 78,3 78,3 CH 6ʹʹ 62,4 62,4 CH2 Đường Ara(f) 1ʹʹʹ 108,3 108,3 CH 5,19 (br s) 2ʹʹʹ 82,1 82,1 CH 3ʹʹʹ 75,3 75,3 CH 4ʹʹʹ 87,1 87,1 CH 5ʹʹʹ 62,4 62,4 CH2 Đường Glc II 1ʹʹʹʹ 95,7 95,7 CH 5,40 (d, J = 8,0 Hz) 2ʹʹʹʹ 73,9 73,9 CH 3ʹʹʹʹ 77,9 77,9 CH 4ʹʹʹʹ 71,4 71,1 CH 5ʹʹʹʹ 78,6 78,7 CH 6ʹʹʹʹ 62,2 62,2 CH2 a b c *c của stipuleanosid R2 đo trong CD3OD [25]; Đo trong CD3OD, 125 MHz, 500 MHz. Hợp chất stipuleanosid R2 được phân lập dưới dạng bột màu trắng, năng suất quay cực riêng [α] = +7,5 (c 0,2, MeOH). Hợp chất này phản ứng với H2SO4 10 % trong điều kiện hơ nóng thấy xuất hiện màu hồng khá đậm, sau đó chuyển sang màu tím đặc trưng cho các dẫn xuất triterpen. Từ số liệu phổ 13C NMR và DEPT thấy có 7 nhóm CH3, 10 nhóm CH2, 6 nhóm CH và 6 nguyên tử C bậc 4 cùng 1 nhóm COOR. Phổ 13C NMR của stipuleanosid R2 xuất hiện tín hiệu của 30 carbon đặc trưng cho một saponin có phần aglycon là một triterpene khung oleanan đã được công bố từ sâm vũ diệp [24]. Phổ 1H NMR xuất hiện 7 tín hiệu singlet của của các nhóm methyl bậc ba tại δ 0,81, 0,85, 0,93, 0,95, 0,96, 1,05, 1,17 (7 tín hiệu CH3, s, CH3-25, 26, 24, 23, 30, 29, 27), một nối đôi ở C-12/C-13 với sự có mặt của tín hiệu tại [δ 5,27 (1H, br s, H-12)]. Ngoài ra trên phổ này còn xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng trong vùng từ δ 3,0-4,0 đặc trưng cho sự có mặt của các nhóm 21
  30. oxymetin và oxymethylen của 4 phân tử đường. Bốn phân tử đường bao gồm một đơn vị glucorunic acid (GluA), hai đơn vị glucose (Glc) và một arabifuranose [Ara(f)] được nhận biết bởi các tín hiệu proton anomeric tại δ 4,01 (1H, d, J = 1,0 Hz, H-1ʹ), 4,92 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1ʹʹ), 5,19 (1H, br s, H-1ʹʹʹ), 5,40 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1ʹʹʹʹ). Trên phổ 13C NMR xuất hiện tín hiệu của 53 tín hiệu nguyên tử cacbon, trong đó có 23 tín hiệu được xác định thuộc bốn đơn vị đường [GluA, 2 Glc và Ara(f)] [17] và 30 tín hiệu còn lại thuộc phần aglycon oleanolic acid với một oxymethin tại δ 91,03 (C-3), nối đôi đặc trưng C-12/C-13 tại δ 123,8 và 144,7 ppm cùng với một nhóm carbonyl acid carboxylic tại δ 178,1 (C-28) [23-24]. Hơn nữa, phổ khối ESI-MS của stipuleanosid R2 xuất hiện pic ion tại 1087 [M-H]- phù hợp với công thức phân tử C53H84O23 (M = 1088). Từ những dữ kiện phổ trên kết hợp với so sánh số liệu phổ NMR trong tài liệu đã được công bố [25] cho phép xác định cấu trúc hóa học chính xác là stipuleanosid R2 (hình 3.4). Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất stipuleanosid R2 3.3. Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 tinh chế được bằng HPLC 3.3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký Tham khảo phương pháp nghiên cứu trong đề tài “Nghiên cứu thành phần saponin của thân rễ sâm vũ diệp” – luận văn Thạc sĩ của Nguyễn Thị Thu Thủy và 22
  31. các phương pháp định lượng hợp chất saponin bằng HPLC [26], chúng tôi tiến hành khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký để phân tích như sau: - Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity - Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (ϕ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm) - Detector DAD phát hiện ở bước sóng 203nm - Tốc độ dòng: 0,8mL/phút - Thể thích bơm mẫu: 20µl - Nhiệt độ: 25oC - Dung môi pha mẫu: Methanol - Pha động: Acetonitril (kênh A) : 0,5% acid acetic/H2O (kênh B) với chương trình gradient như bảng 3.4 Bảng 3.4. Chương trình dung môi Thời gian Acetonitril Acid acetic 0,5% (phút) (%) (%) 0-5 20 80 25-15 20→40 80→60 15-20 40 60 20-30 40→100 60→0 30-35 100 0 35-40 100→20 0→80 40-45 20 80 3.3.2. Nhận dạng pic trên sắc ký đồ của stipuleanosid R2 phân lập được Pha mẫu stipuleanosid R2 phân lập được: dùng cân phân tích cân chính xác khoảng 1,0 mg chất rồi pha thành dung dịch tương ứng với nồng độ 1000 µg/mL trong methanol, sau đó siêu âm 10 phút, rồi lọc qua màng lọc 0,45 µm. Pha mẫu thử: dùng cân phân tích cân chính xác khoảng 100,0 mg cao n- butanol thân rễ SVD rồi hòa tan trong methanol với nồng độ 100,0 mg/mL, siêu âm 10 phút, ly tâm lấy dịch chiết rồi lọc qua màng lọc 0,45 µm. Pha mẫu chất chuẩn liên kết stipuleanosid R2: dùng cân phân tích cân chính xác khoảng 1,0 mg stipuleanosid R2 rồi hòa tan trong methanol với nồng độ 400,0 µg/mL, siêu âm 10 phút, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Tiến hành sắc ký HPLC hợp chất phân lập được và cao butanol so sánh với SKĐ thu được của mẫu chất chuẩn. 23
  32. Hình 3.5. SKĐ HPLC của stipuleanosid R2 phân lập được (A), cao BuOH (B)và chất chuẩn đối chiếu (C) Nhận xét: Kết quả phân tích HPLC minh họa cho thấy stipuleanosid R2 là hợp chất thiên nhiên có trong SVD với thông số thời gian lưu trong dung dịch cao butanol được chuẩn bị tại thời điểm chạy sắc ký với điều kiện chiết xuất chuẩn thường quy là lần lượt là 15,565 và 15.564 phút, giá trị này tương đương với thời gian lưu của chất chuẩn là 15.565 phút. 3.3.3. Định lượng stipuleanosid R2 phân lập được Yêu cầu: Hàm lượng không được thấp hơn 95,0% tính theo nguyên trạng. Tiến hành: Pha mẫu hợp chất stipuleanosid R2 phân lập được: dùng cân phân tích cân chính xác 6 mẫu, mỗi mẫu khoảng 10 mg chất phân lập vào bình định mức 20 mL, hòa tan và pha loãng vừa đủ bằng MeOH, sau đó siêu âm 10 phút, rồi lọc qua màng lọc 0,45 µm. Pha mẫu dung dịch đối chiếu stipuleanosid R2: dùng cân phân tích cân chính xác khoảng 10 mg chuẩn stipuleanosid R2 vào bình định mức 20 mL, hòa tan và pha 24
  33. loãng vừa đủ bằng MeOH, siêu âm 10 phút, ly tâm lấy dịch chiết rồi lọc qua màng lọc 0,45 µm. Tiến hành chạy HPLC với điều kiện sắc ký như đã nêu ở mục 3.3.1 Thu được kết quả sắc ký trình bày ở bảng 3.6 Bảng 3.6. Kết quả định lượng nguyên liệu thiết lập chất chuẩn Diện tích pic (mAU*s) Mẫu thử Khối lượng (mg) Hàm lượng (%) Pic chính Tổng pic 1 9,45 1353,027 1411,314 95,87 2 10,17 1428,131 1483,772 96,25 3 9,34 1249,639 1299,271 96,18 4 9,61 1397,682 1444,782 96,74 5 10,28 1442,078 1499,042 96,20 6 10,74 1482,191 1542,503 96,09 Hàm lượng trung bình (%) 96,22 0,11 RSD (%) 0,26 Nhận xét: Các mẫu thử đều có hàm lượng lớn hơn 95,0% (tính theo nguyên trạng), theo lý thuyết là đạt yêu cầu để thiết lập chất chuẩn đối chiếu, tuy nhiên chưa thể kết luận một cách chắc chắn, cần phải tiến hành thêm các phương pháp đặc hiệu và chính xác hơn. 25
  34. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1. Về chiết xuất, phân lập và tinh chế 4.1.1 Chiết xuất Với quy trình chiết xuất dược liệu SVD bằng phương pháp chiết siêu âm sử dụng dung môi ethanol 70o, cất quay thu cắn toàn phần, phương pháp chiết siêu âm có ưu điểm làm tăng tốc độ chiết, giảm nhiệt độ và áp suất khi chiết. Từ cao chiết toàn phần phân đoạn lần lượt bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần: ether, ethyl acetat và n-butanol thu được các cắn phân đoạn với khối lượng ether (1,26 %), EtOAc (0,59 %), BuOH (4,71%) so với nguyên liệu khô ban đầu. Hợp chất stipuleanosid R2 bản chất là một saponin phân cực, chính vì vậy việc chiết lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần nhằm mục đích loại bỏ các thành phần không phân cực và kém phân cực tan trong dung môi ether và ethyl acetat, chuẩn bị cho bước phân lập được tiến hành nhanh và chính xác hơn. 4.1.2 Phân lập và tinh chế Phân đoạn n-butanol thu được với hàm lượng cao nhất và được sử dụng để tiến hành phân lập stipuleanosid R2 bằng sắc ký cột pha thuận với hệ dung môi rửa giải CH2Cl2 – MeOH theo gradient nồng độ. Kết hợp với SKLM để đánh giá từng phân đoạn thu được, cho thấy phân đoạn B4 cho sắc ký đồ trên bản mỏng có một vết màu hồng tím rõ nét phù hợp so với đặc tính của hợp chất cần phân lập. Sau đó chúng tôi đã tiến hành sắc ký cột pha đảo để tinh chế được stipuleanosid R2 trong dược liệu SVD thu được 180 mg bột màu trắng. Kiểm tra độ tinh khiết của chất tinh chế được bằng phương pháp SKLM cho thấy cắn tinh chế được hiện một vết màu hồng sau đó chuyển sang màu tím, đây là đặc trưng của dẫn xuất triterpen. Kết quả này cũng góp phần đánh giá stipuleanosid R2 tinh chế được có độ tinh khiết khá cao, có thể ứng dụng phương pháp này trong việc phân lập hợp chất stipuleanosid R2 trong SVD và các dược liệu khác chứa thành phần này. Như đã trình bày ở phần tổng quan, stipuleanosid R2 có nhiều tác dụng dược lý rất có ý nghĩa trên lâm sàng, có thể sử dụng để điều trị nhiều bệnh trong đó có tác dụng gây độc trên một số dòng tế bào ung thư. Hiện nay các tác dụng này của stipuleanosid R2 chưa được dùng nhiều trên lâm sàng nhưng nếu trong tương lai stipuleanosid R2 được nghiên cứu sử dụng rộng rãi trên người thì phâp lập và tinh chế stipuleanosid R2 là cần thiết phục vụ cho việc nghiên cứu tác dụng sinh học 29
  35. như vậy thì quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế mà chúng tôi đưa ra có thể ứng dụng được. 4.2. Bước đầu xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng Việc xác minh lại cấu trúc của s tipuleanosid R2 tinh chế đượ c trong dược liệu Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và phân tích khối phổ (ESI-MS ) đã khẳ ng định công thức phân tử cũng nh ư cấu trúc của stipuleanosid R2 tinh chế được là phù hợp với lý thuyết. Đồng thời kết quả nhiệt độ nóng ch ảy đo được của chất phân lập được cũng góp phần khẳng định sản phẩm tinh chế của chúng tôi đúng là hợp chất stipuleanosid R2. 4.3. Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 phân lập được bằng HPLC 4.3.1. Xây dựng phương pháp Chúng tôi thực hiện xây dựng phương pháp HPLC với detector DAD để định tính, định lượng stipuleanosid R2 tinh chế được. Đề tài sử dụng phương pháp phân tích định lượng saponin bằng HPLC là phương pháp được Dược điển các nước công nhận đạt yêu cầu về tính tiên tiến so với phương pháp quang phổ hay phương pháp khối lượng của phần lớn các chuyên luận dược liệu hiện nay. Đây là phương pháp có nhiều ưu điểm như có thể ti ế n hành đơn giản từ việ c pha mẫu, chuẩn bị dung môi pha động đến tiến hành sắc ký. Trong khoảng nồng độ khảo sát, giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích có mối tương quan tuyến tính chặt chẽ. Phương pháp còn đảm bảo độ đúng và độ đặc hi ệu cao. Tham khảo một số tài liệu kết hợp với các điều kiện có sẵn, chúng tôi đã lự a chọn được chương trình sắc ký như mô tả ở mụ c 3.3.1. Với điều kiện sắc ký đã l ựa chọn, chất nghiên cứu trong mẫu thử chu ẩn bị t ừ d ịch chiết n-butanol thân rễ SVD và chất phân lập được tách tương đối tốt, pic cân đối, thời gian lưu hợp lý, phù hợ p để định lượng thành phần trong thân rễ SVD . 4.3.2. Phân tích định tính và định lượng stipuleanosid R2 tinh chế được 4.3.2.1. Định tính Kết quả trên SKĐ chạy HPLC của 3 mẫu: stipuleanosid R2 phân lập được, cao BuOH và chất chuẩn đối chiếu đều cho pic ở thời gian lưu ở khoảng phút thứ 15. Theo các tài liệu nghiên cứu cho đến hiện nay, có thể khẳng định thời gian lưu đó là của hợp chất stipuleanosid R2. 4.3.2.2. Định lượng 30
  36. Bằng phương pháp HPLC với detector UV đã xây dựng để định tính, định lượng stipuleanosid R2 và xác định giới hạn tạp chất liên quan của stipuleanosid R2 tinh chế được, chúng tôi đã xác định được chính xác hàm lượng stipuleanosid R2 tinh chế được là 96,22 0,11 (%) > 95,0% (tính theo nguyên trạng), đạt yêu cầu để thiết lập chất chuẩn đối chiếu. Stipuleanosid R2 được tinh chế và xây dựng thành chất đối chiếu sử dụng trong phân tích, xây dựng tiêu chuẩn. Với mục đích xa hơn là thiết lập chất chuẩn phục vụ cho công tác kiểm nghiệm dược liệu SVD, sau khi xác định độ tinh khiết bằng SKLM và HPLC saponin chính phân lập được, do thời gian có hạn, chúng tôi mới dừng lại ở việc chiết xuất, phân lập và tinh chế. Việc thiết lập chất chuẩn stipuleanosid R2 còn cần đánh giá thêm một vài chỉ tiêu khác theo tiêu chí của DĐVN và Dược điển quốc tế. 31
  37. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Với các kết quả thực nghiệm thu được đề tài đã đạt được các mục tiêu đề ra là: 1. Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế Stipuleanosid R2 từ dược liệu sâm vũ diệp. 2. Bước đầu xác minh cấu trúc hóa học, xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng của chất tinh chế được. 3. Định tính, định lượng stipuleanosid R2 phân lập được. Như vậy, việc xây dựng tiêu chuẩn cho hợp chất saponin chính từ thân rễ SVD – stipuleanosid R2 đã góp phần ý nghĩa vào cơ sở dữ liệu về hóa thực vật và tiêu chuẩn hóa dược liệu SVD cũng như làm cơ sở định hướng cho các nghiên cứu hoạt tính sinh học của đối tượng tiềm năng thuộc chi Panax này. Và thêm vào đó các kết quả này còn có ý nghĩa thực tiễn trong công tác kiểm nghiệm thuốc nói chung và kiểm nghiệm dược liệu nói riêng. KIẾN NGHỊ Hướng nghiên cứu tiếp theo, tôi xin phép được kiến nghị: 1. Nghiên cứu thiết lập tiêu chuẩn chất chuẩn stipuleanosid R2 để có tài liệu bổ sung về chất chuẩn đối chiếu trên vào Dược điển Việt Nam xuất bản lần thứ 6. 2. Tiến hành nghiên cứu thiết lập các chất chuẩn đối chiếu khác có nguồn gốc dược liệu phục vụ nhu cầu kiểm tra chất lượng dược liệu cũng như các sản phẩm từ dược liệu. 32
  38. TÀI LIỆU THAM KHẢO A. TIẾNG VIỆT: [1] .Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007) Thực vật học tập 1, NXB Y học, Hà Nội. [2] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong cùng cộng sự (2003), Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt Nam tập 2, Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật, tr. 711 - 714. [3] Bộ y tế (2017), Dược điển Việt Nam V tập 2, Nhà xuất bản y học, tr. PL-113, phụ lục 2. [4] Bộ Y tế, Vụ khoa học và đào tạo (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản Y học, tr. 79-82, 84-110. [5] Nguyễn Thượng Dong, TS. Trần Công Luận, TS. Nguyễn Thị Thu Hương (2007), Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ Nhân sâm, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 263-266. [6] GS.TS.Nguyễn Minh Đức (2013), Tổng quan chất chuẩn, Đại học Y dược TP.Hồ Chí Minh. [7] Đỗ Văn Hào (2017), Nghiên cứu thành phần hóa học của cây sâm vũ diệp thu hái ở Tây Bắc, Khóa luận tốt nghiệp, Khoa Y dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội. [8] Nguyễn Thị Huệ (2017), Phân tích acid oleanolic và saponin tổng số trong rễ cây sâm vũ diệp thu hái ở Sa Pa, Khóa luận tốt nghiệp, Khoa Y dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội. [9] Dương Thị Phượng (2018), Định lượng Stipuleanosid R2 trong thân rễ Sâm vũ diệp, Khóa luận tốt nghiệp, Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. [10] Lê Thị Tâm (2017), Nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của các phân đoạn dịch chiết sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T sai et K. M. Feng) trên in vitro, Khoá luận tốt nghiệp đại học, Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. [11] Nguyễn Văn Tập, Phạm Thanh Huyền, Lê Thanh Sơn (2006), “Kết quả nghiên cứu về phân bố, sinh thái Sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang ở Việt Nam”, Tạp chí dược liệu, 11(5), tr. 177-180. [12] Nguyễn Văn Tập (2005), “Các loài thuộc chi Panax L. ở Việt Nam”, Tạp chí dược liệu, 10(3), tr. 71-76. [13] Ngô Vân Thu, Trần Hùng (2011), Dược liệu học tập 1, NXB Y học – Bộ Y tế, tr. 191-213.
  39. [14] Ngô Vân Thu (1990), Hóa học Saponin, Khoa Dược – Trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, tr. 109-114. [15] Trường Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn hóa phân tích (2006), Hóa phân tích II, tr.17, 99-146, 173-222. [16] Viện nghiên cứu thực vật Vân Nam (1975), “Triterpene trong cây thuộc chi nhân sâm và mối liên quan đến hệ thống phân loại, phân bố địa lý”, Thực vật phân loại học báo cáo, 13(2), 29-44. B. TIẾNG ANH [17] Agrawal PK (1992), "NMR spectroscopy in the structural elucidation of oligossacharides and glycosides", Phytochemistry, 31, pp. 1307-1330. [18] Satinder Ahuja, Elsevier Publiccations (2003), Hand Book of Isolation and Characterization of Impurities In Pharmaceuticals, p.119. [19] Center for Drug Evaluation and Research Food and Drug Administration Department of Health and Human Services (1987), Guideline for submitting supporting documentation in drug applications for the manufacture of drugs substances, p.29. [20] Choi K. T. (2008), "Botanical characteristics, pharmacological effects and medicinal components of Korean Panax ginseng CA Meyer", ActaPharmacologica Sinica, 29(9), 1109 – 1118. [21] Shao-Xing Dai, Wen-Xing Li et al. (2016), "In silico identification of anti- cancer compounds and plants from traditional Chinese medicine database", Scientific Reports, 25462. [22] Y. Fan, D. Y. Guo, Q. Song, and T. Li (2013), "Effect of total saponin of aralia taibaiensis on proliferation of leukemia cells", Zhong Yao Cai, 36(4), pp. 604- 607. [23] Mahato S, Kundu A (1994), "13C NMR spectra of pentacyclic triterpenoids-a complication and some salient features", Phytochemistry, 37, pp. 1517-1575. [24] H. T. Nguyen, H. Q. Tran, T. T. Nguyen, V. M. Chau, K. A. Bui, Q. L. Pham, et al. (2011), "Oleanolic triterpene saponins from the roots of Panax bipinnatifidus", Chem Pharm Bull (Tokyo), 59(11), pp. 1417-1420. [25] C. Liang, Y. Ding, H. T. Nguyen, J. A. Kim, H. J. Boo, H. K. Kang, et al. (2010), "Oleanane-type triterpenoids from Panax stipuleanatus and their anticancer activities", Bioorg Med Chem Lett, 20(23), pp. 7110-7115.
  40. [26] Liu F et al. (2008), Method Development for Gypenosides Fingerprint by High Performance Liquid Chromatography with Diode-Array Detection and the Addition of Internal Standard, pp. 389-393. [27] Y. Satoh, S. Sakai, M. Katsumata, M. Nagasao, M. Miyakoshi, Y. Ida, et al. (1994), "Oleanolic acid saponins from root-bark of Aralia elata", Phytochemistry, 36(1), pp. 147-152. [28] Schwarz M et al (2009), “Herbal Reference Standards”, Planta Med, 75, 689– 703. [29] H. F. Tang, Y. H. Yi, Z. Z. Wang, Y. P. Jiang, and Y. Q. Li (1997), "Oleanolic acid saponins from the root bark of Aralia taibaiensis", Yao XueXue Bao, 32(9), pp. 685-90. [30] Vu Thi Thom et al (2018), “Antithrombotic Activity and Saponin Coposition of the Roots of Panax bipinnatifidus Seem. Growing in Vietnam”, Pharmacognosy Research, 10(4), pp. 333-338. [31] D. Q. Wang, J. Fan, B. S. Feng, S. R. Li, X. B. Wang, C. R. Yang, et al. (1989), "Studies on saponins from the leaves of Panax japonicus var. bipinnatifidus(Seem.)Wu et Feng", Yao Xue Xue Bao, 24(8), pp. 593-599. [32] Y. Weng, L. Yu, J. Cui, Y. R. Zhu, C. Guo, G. Wei, et al. (2014), "Antihyperglycemic, hypolipidemic and antioxidant activities of total saponins extracted from Aralia taibaiensis in experimental type 2 diabetic rats", J Ethnopharmacol, 152(3), pp. 553-560. [33] WHO (1997), A WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirements - Part 2: Validation, Word Health Organization, Geneva. [34] World Health Organization (2006), General guidelines for the establishment, maintenance and distribution of chemical reference substances, Genève, 3-24. [35] Yuchi Zhang et al (2016), “Saponins from Panax bipinnatifidus Seem: New strategy of extraction, isolation, and evaluation of tyrosinase inhibitory activity based on mathematical calculations”, Journal of Chromatography B, 1039:79- 87. C. TRANG WEB [36] [37] [38]
  41. PHỤ LỤC Phụ lục 01. Phiếu kết quả giám định mẫu Phụ lục 02. Sắc ký đồ mẫu trắng (MeOH) Phụ lục 03. Sắc ký đồ cao BuOH sâm vũ diệp nồng độ 100 mg/mL
  42. Phụ lục 01. Phiếu kết quả giám định mẫu
  43. Phụ lục 02. Sắc ký đồ mẫu trắng (MeOH)
  44. Phụ lục 3. Sắc ký đồ cao BuOH sâm vũ diệp nồng độ 100 mg/mL