Khóa luận Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu lá Trà hoa vàng (Camellia hakodae Ninh)

Nội dung text: Khóa luận Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu lá Trà hoa vàng (Camellia hakodae Ninh)

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC    NGUYỄN THỊ THỦY BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU LÁ TRÀ HOA VÀNG (Camellia hakodae Ninh) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2021
2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC    NGUYỄN THỊ THỦY BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU LÁ TRÀ HOA VÀNG (Camellia hakodae Ninh) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH 2016 Y Người hướng dẫn: TS. NGUYỄN THỊ HẢI YẾN HÀ NỘI – 2021
3. LỜI CẢM ƠN Quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp là giai đoạn quan trọng nhất trong cuộc đời của mỗi sinh viên. Luận văn tốt nghiệp là tiền đề để trang bị cho chúng em những kỹ năng, những kiến thức quý báu trước khi chúng em ra trường. Với lòng biết ơn và kính trọng sâu sắc, lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể Ban lãnh đạo Trường Đại học Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và Bộ môn Hóa dược – Kiểm nghiệm đã tạo điều kiện cho em được làm khóa luận tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong trường đã dìu dắt, giúp đỡ em để em có thể hoàn thành hết chương trình học trong suốt 5 năm qua. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và tri ân đến TS. Nguyễn Thị Hải Yến, người trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo, động viên, giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực hiện khóa luận này. Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy, cô trong bộ môn Hóa dược – Kiểm nghiệm, các thầy cô trong bộ môn Bào chế, bộ môn Thực vật – Dược liệu đã đồng hành và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình em làm khóa luận. Em xin gửi lời cảm ơn đến các cán bộ nghiên cứu cùng các anh, chị, các bạn ở Khoa Hóa phân tích – Viện dược liệu đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn quan tâm, động viên và cổ vũ em trong suốt thời gian qua. Dù đã rất cố gắng, song là lần đầu làm nghiên cứu nên em khó tránh khỏi những thiêu sót. Em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của các thầy cô để khóa luận của em được hoàn thiện hơn. Em xin kính chúc các thầy cô luôn mạnh khỏe, hạnh phúc và thành công trong cuộc sống cũng như trong công cuộc truyền đạt tri thức đến các thế hệ mai sau. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 27 tháng 05 năm 2021 Sinh viên Nguyễn Thị Thủy
4. MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1. Tổng quan về các loài Trà hoa vàng thuộc chi Camellia 2 1.1. Đặc điểm sinh trưởng 2 1.2. Một số loài Trà hoa vàng ở Trung Quốc và Việt Nam 2 1.3. Thành phần hóa học 4 1.4. Công dụng 8 2. Tổng quan về loài Trà hoa vàng Camellia Hakodae Ninh 8 2.1. Vị trí phân loại 8 2.2. Đặc điểm thực vật Trà hoa vàng Camellia Hakodae Ninh 9 2.1. Phân bố 10 2.2. Yêu cầu sinh thái 10 2.3. Thành phần hóa học 10 2.4. Tính, vị, quy kinh 11 2.5. Bộ phận dùng 11 3. Tổng quan về dược liệu lá Trà hoa vàng (Caemllia hakodae Ninh) 11 3.1. Mô tả 12 3.2. Thành phần hóa học 12 3.3. Tác dụng dược lí 12 3.4. Độc tính 13
5. 3.5. Dạng bào chế 14 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. Đối tượng nghiên cứu 15 2.2. Dung môi, hóa chất 15 2.3. Dụng cụ, thiết bị 15 2.4. Phương pháp nghiên cứu 15 2.4.1. Mô tả 15 2.4.2. Vi phẫu 16 2.4.3. Soi bột 16 2.4.4. Độ ẩm 16 2.4.5. Tro toàn phần 16 2.4.6. Tro không tan trong acid 17 2.2.7. Định tính 17 2.2.8. Định lượng 20 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 3.1. Kết quả thực nghiệm 22 3.1.1. Mô tả 22 3.1.2. Đặc điểm vi phẫu lá 22 3.1.3. Đặc điểm bột dược liệu 23 3.1.4. Độ ẩm 24 3.1.5. Kết quả xác định tro toàn phần 24 3.1.6. Kết quả xác định tro không tan trong acid 24 3.1.7. Kết quả định tính 25 3.1.8. Kết quả định lượng 31 3.2. Bàn luận 32
6. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO
7. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Viết đầy đủ DĐVN V Dược điển Việt Nam V TCCS Tiêu chuẩn cơ sở SD Độ lệch chuẩn BĐM Bình định mức TT Thuốc thử C Catechin EC epicatechin EGC epigallocatechin GCG gallocatechin gallat GC gallocatechin EGCG epigallocatechin-3- gallate ECG epicatechin gallat CHN chiết xuất của Camellia hakodae Ninh DD Dung dịch ÔN Ống nghiệm
8. DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1. Một số loài Trà hoa vàng ở Trung Quốc và Việt Nam 2 Bảng 2. Độ ẩm của dược liệu lá Trà hoa vàng Hakoda 24 Bảng 3. Tỉ lệ tro toàn phần của dược liệu lá Trà hoa vàng Hakoda 24 Bảng 4. Tỉ lệ tro không tan trong acid của lá Trà hoa vàng Hakoda 25 Bảng 5. Kết quả phản ứng định tính 25 Bảng 6. Độ hấp thụ của dãy chuẩn acid gallic tại λ=765nm 31 Bảng 7. Độ hấp thu của dung dịch 31 Bảng 8. Hàm lượng polyphenol trong lá Trà hoa vàng Hakoda 32
9. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Tên hình Trang Hình 1. Một số polyphenol trong Trà hoa vàng 5 Hình 2. Một số tinh dầu trong Trà hoa vàng 6 Hình 3. Một số acid amin chính trong Trà hoa vàng 7 Hình 4. Hình ảnh về Trà hoa vàng Hakoda 9 Hình 5. Hình ảnh dược liệu lá Trà hoa vàng Hakoda 22 Hình 6: Hình ảnh vi phẫu tiêu bản dược liệu lá Trà hoa vàng Hakoda 23 Hình 7: Cảm quan và vi phẫu bột lá Trà hoa vàng Hakoda 23 Hình 8. Đường chuẩn acid gallic 31
10. MỞ ĐẦU Cuộc sống xã hội ngày càng phát triển, mô hình bệnh tật cũng ngày càng gia tăng và nhu cầu của con người về các sản phẩm chăm sóc sức khỏe và sắc đẹp cũng ngày càng được quan tâm chú trọng. Nhu cầu chăm sóc sức khỏe từ các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên đang là một xu thế mới. Là một đất nước có nguồn tài nguyên dược liệu phong phú và vô cùng quý giá, nước ta có tiềm năng rất lớn trong việc nghiên cứu và phát triển các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu. Trà hoa vàng (Camellia hakodae Ninh) là loài trà có hoa màu vàng thuộc chi Camellia và được xem là một nguồn gen tự nhiên vô cùng quý hiếm. Trên thế giới, đặc biệt là ở Trung Quốc đã có rất nhiều nghiên cứu chuyên sâu về Trà hoa vàng và cũng đã bào chế được nhiều sản phẩm chữa bệnh từ loài cây này. Trong hoa và lá của cây có nhiều thành phần hóa học có hoạt tính quan trọng như flavonoid, saponin, coumarin, acid amin, vitamin Nhờ sự có mặt của những thành phần quan trọng đó, mà Trà hoa vàng có nhiều tác dụng sinh học rất quan trọng như hạ huyết áp, hạ đường huyết, giảm cholesterol máu, giảm mỡ máu, chống u bướu, tăng cường hệ miễn dịch và kéo dài tuổi thọ đồng thời cũng là loài cây mang nhiều giá trị kinh tế cao [1, 2, 8, 9, 11-13]. Ở Việt Nam, các nghiên cứu về thực vật học, thành phần hoá học và tác dụng sinh học còn khá hạn chế bởi vì loài cây này vừa mới được tìm ra cách đây không lâu bởi PGS.TS. Trần Đăng Ninh phối hợp cùng các nhà nghiên cứu Nhật Bản [1]. Hiện tại, Dược điển Việt Nam V chưa có chuyên luận riêng cho dược liệu lá Trà hoa vàng nên vấn đề quản lý và đảm bảo chất lượng của dược liệu này vẫn chưa được thực hiện một cách chặt chẽ. Vì vậy, việc nghiên cứu để đưa ra một số chỉ tiêu của lá Trà hoa vàng là thật sự cần thiết để làm cơ sở xây dựng tiêu chuẩn lá Trà hoa vàng cho Dược điển Việt nam và sử dụng dược liệu lá trà hoa vàng làm nguyên liệu sản xuất một số sản phẩm phục vụ nhu cầu chăm sóc sức khỏe của nhân dân. Từ những lí do trên, đề tài “Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu lá Trà hoa vàng (Camellia hakodae Ninh)” được thực hiện với mục tiêu:  Nghiên cứu, xây dựng một số tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu lá Trà hoa vàng Camellia hakodae Ninh.  Định lượng hàm lượng polyphenol toàn phần có trong lá Trà hoa vàng Camellia hakodae Ninh 1
11. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về các loài Trà hoa vàng thuộc chi Camellia 1.1. Đặc điểm sinh trưởng Các loài Trà hoa vàng là loài cây chịu bóng, chúng chỉ có thể phát triển tốt trong điều kiện bóng râm và thường được tìm thấy trong rừng tự nhiên có độ tàn che từ 30 - 80%. Các loài này thường ưa mọc ở vùng đất ẩm cao và những nơi có độ ẩm không khí cao. Vì vậy, chúng thường được tìm thấy ở các thung lũng, gần suối và các vực có nước, ẩm, chủ yếu ở độ cao 300-700 m. Đôi khi cũng có thể tìm được một số cây trong những vùng đất khô, nhưng chúng phát triển kém, còi cọc và có kích thước tương đối nhỏ. Các loài Trà hoa vàng có kích thước khá đa dạng, cao khoảng từ 2- 20 m; chồi và cành non có thể có lông hoặc không lông, cành già thường trơn nhẵn. Lá cây mọc cách và không có lá kèm, cuống lá tương đối ngắn. Phần lớn các loài Trà hoa vàng đều có cuống lá nhẵn và lõm sâu ở mặt trên, lá có thể phủ lông ở mức độ khác nhau. Kích thước lá và hình thái phiến lá đa dạng, mép lá có răng cưa. Mặt trên lá thường có màu xanh sẫm và láng bóng, mặt dưới lá thường màu xanh sáng, xanh hơi vàng và nhẵn hoặc có lông và có nhiều điểm tuyến màu đen. Giống như các loài khác trong chi Trà (Camellia), hoa của các loài Trà hoa vàng cho hạt có kích thước lớn, chủ yếu là bị phân tán bởi trọng lực [13,15,44]. Do đó, cây con thường được tìm thấy dưới hoặc gần tán của cây mẹ. Hoa mọc thành cụm trong tự nhiên, ở nách lá hoặc đầu cành. Đối với các cá thể trưởng thành, ở những nơi có nhiều ánh sáng mặt trời, hoa sẽ có màu vàng đậm hơn những nơi có ít ánh sáng mặt trời [15]. Do đó, ánh sáng mặt trời có vai trò rất quan trọng trong việc hình thành nụ và hoa của cây. Các loài Trà hoa vàng có hệ thống rễ nông và số lượng rễ mịn hạn chế (rễ có đường kính ≤ 2 mm), chúng hấp thụ nước và chất dinh dưỡng cho sự sống của cây [16] dẫn đến khả năng cạnh tranh thấp đối với độ ẩm, chất dinh dưỡng và sự neo đậu của cây so với các loài cây khác. Ngoài ra, hạt trà cũng là thức ăn cho các loài gặm nhấm và động vật hoang dã khác, điều này có thể làm cho mật độ của cây con trong tự nhiên không cao. Vùng phân bố tập trung chủ yếu của các loài Trà hoa vàng là ở miền Nam Trung Quốc và Việt Nam [17]. 1.2. Một số loài Trà hoa vàng ở Trung Quốc và Việt Nam Bảng 1: Một số loài Trà hoa vàng ở Trung Quốc và Việt Nam [17]. STT Tên khoa học STT Tên khoa học 2
12. 1 Camellia achrysantha Hung 27 Camellia longruiensis S. Y. T.Chang S. Ye Liang Liang & X. J.Dong 2 Camellia aurea H.T. Chang 28 Camellia nitidissima C.W.Chi 3 Camellia chrysantha (Hu) 29 Camellia megasepala Hung T. Tuyama Chang &Tr Ninh 4 Camellia chrysanthoides H.T. 30 Camellia nitidissima var. Chang (C.xiashiensi; phaeopubisperma S. Ye Liang C.longzhouensis) & Z. H.Tang 5 Camellia crassiphylla Ninh & 31 Camellia multipetala S. Ye Hakoda Liang & C. Z. Deng 6 Camellia cucphuongensis 32 Camellia murauchii Ninh & Ninh & Rosmann Hakoda 7 Camellia dalatensis Luong, 33 Camellia longzhouensis J.Y. Tran & Hakoda Luo 8 Camellia dilinhensis Ninh & 34 Camellia micrantha S. Ye V.D. Luong Liang & Y. C. Zhong 9 Camellia flava (Pit.) 35 Camellia parvifolia Makino 10 Camellia euphlebia Merr. ex 36 Camellia parvipetala J. Y. Sealy Liang & Z. M. Su 11 Camellia fascicularis Hung T. 37 Camellia petelotii (Merr.) Chang Sealy 12 Camellia dormoyana (Pierre) 38 Camellia phanii Hakoda et Sealy Ninh 13 Camellia gilbertii (A.Chev.) 39 Camellia pingguoensis D. Sealy Fang 14 Camellia grandis (C.F. Liang 40 Camellia pingguoensis D. & S.L.Mo) H.T. Chang & S. Fang var. terminalis (Liang et Ye Liang (C.ptilosperma) Su) S. Y. Lang 3
13. 15 Camellia hakodae M.Sealy 41 Camellia pubipetala Y. Wan & S. Z. Huang 16 Camellia hamyenensis 42 Camellia quephongensis M.Sealy Hakoda et Ninh 17 Camellia hirsuta Hakoda et 43 Camellia quinqueloculosa Ninh S.L. Mo & Y.C. Zhong 18 Camellia huana T. L. Ming & 44 Camellia flavida var. patens W. J. Zhang (S.L.Mo& Y.C.Zhong) (C.liberofilamenta) T.L.Ming 19 Camellia huulungensis 45 Camellia tamdaoensis Ninh Rosmann & Ninh et Hakoda 20 Camellia impressinervis Hung 46 Camellia terminalis J.Y. T. Chang & S. Ye Liang Liang & Z.M. Su 21 Camellia indochinensis 47 Camellia thanxaensa Hakoda Merrill et Kirino Camellia indochinensis var. Camellia tonkinensis (Pit.) 22 tunghinensis (Hung T. Chang) 48 Cohen-Stuart Camellia T. L. Ming & W. J.Zhang vuquangensis Luong, Tran & (C.tunghinensis) L.T. Nguyen 23 Camellia kirinoi Ninh 49 Camellia tienii Ninh 24 Camellia leptopetala Chang & 50 Camellia tianeensis S.Y. S.Y.Liang Liang & Y.T.Luo 25 Camellia limonia C.F. Liang 51 Camellia vuquangensis & S.L.Mo (C.limonia f. Luong, Tran & L.T. Nguyen obovata S.L. Mo & Y.C. Zhong) 26 Camellia flavida H.T. Chang 52 Camellia rosmannii Ninh 1.3. Thành phần hóa học Quá trình nghiên cứu về các loài Trà hoa vàng đã được thực hiện từ rất lâu ở các nước trên thế giới, và các thành phần hóa học của chúng cũng đã được mô tả tương đối đầy đủ [34]. Các kết quả nghiên cứu cho thấy trong Trà hoa vàng có khoảng 4
14. 120-130 hoạt chất khác nhau, sắp xếp thành các nhóm như: nhómpolyphenol; nhóm pectin; nhóm tinh dầu; protein và acid amin; các sắc tố; các chất vô cơ; vitamin; các enzim; chất nhựa; các chất hữu cơ; tannin, flavonoid [2, 6, 37, 39]. a. Nhóm polyphenol Nhóm polyphenol được coi là nhóm chất quan trọng nhất trong các loài Trà hoa vàng do các tác dụng sinh học nổi bật của chúng [4,24]. Các hợp chất polyphenol của lá Trà hoa vàng rất khác với các hợp chất polyphenol được tìm thấy trong các loại cây khác, trong đó chiếm hàm lượng lớn nhất là các catechin. Nghiên cứu năm 2013 của Jia-Ni Lin và cộng sự trên 6 loài Trà hoa vàng đã phát hiện 8 loại catechin là (+)-catechin (C) (5), (-)-epigallocatechin (EGC) (6), (-)-epigallocatechin gallat (EGCG) (7), (-)-epicatechin gallat (ECG), (-)-epicatechin (EC), (-)-gallocatechin (GC), (-)-gallocatechin gallat (GCG) (10), (-) -catechin gallat (CG) [21]. Bên cạnh đó, các flavonol như myricitin (8), kaempferol (9), quercetin (10), và các glycosid của chúng như myricetin-3-glucosid, kaempferol-3-glucosid, quercetin-3- hamnoglucosid, cũng được tìm thấy, trong đó flavonol glycosid chiếm 2 đến 3% chất rắn chiết xuất tan trong nước của trà [18, 19, 20, 21]. Epigallocatechin (6) Catechin (5) Epigallocatechin gallat (7) Myricitin (8) Kaempferol (9) Quercetin (10) Hình 1: Một số polyphenol trong Trà hoa vàng 5
15. Gần đây, cũng đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học được thực hiện trên các loài Trà hoa vàng. Song và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu và xác định được hàm lượng của polyphenol toàn phần, proanthocyanidin, tannin và flavonoid từ dịch chiết Aceton/EtOH/nước của 6 mẫu Trà hoa vàng bằng phương pháp HPLC và LC–ESI-MS. Kết quả cho thấy các thành phần hóa học trong lá Trà hoa vàng có sự khác biệt rõ rệt so với trà hoa trắng do sự giàu hơn đáng kể về hàm lượng catechin trong Trà hoa vàng, bao gồm EGCG, EGC, ECG, GC, EC, và C [38]. b. Nhóm saponin Saponin được cho là thành phần chính của nhiều loại thuốc từ thực vật và thuốc dân gian, và được coi là nguyên nhân tạo ra nhiều đặc tính dược lý của cây thuốc. Các saponin (triterpenoid saponin) được báo cáo là tìm thấy từ tất cả các bộ phận của Trà hoa vàng, trong đó bộ phận phân lập được nhiều nhất là hạt [24,27]. Một số nghiên cứu về loài Trà hoa vàng Camellia niprisssima chỉ ra chiết xuất metanol của lá C. niprisssima chứa nhiều saponin hơn, lên đến 432,40 mg/g được xác định bằng phương pháp so màu axit vanilin-axit axetic-axit perchloric, so với các bộ phận khác của cây, bao gồm hoa (213 mg/g) và hạt (135,3 mg/g). Ngoài ra, chiết xuất metanol của lá C. niprisssima có hàm lượng saponin cao hơn nhiều so với chiết xuất từ lá của các loài Camellia khác, ví dụ như Camellia chrysanthoides (300,8 mg/g), Camellia impressinervis (362,9 mg/g) và Camellia perpetua (359 mg/g) [39]. c. Nhóm tinh dầu Từ loài C. nitidissima, các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập được 56 chất tinh dầu từ lá và 34 chất từ hoa. Các tinh dầu chính là eudesmol (13), linalool (15), phytol, cis-geranyl aceton, n-hexanal, methyl salicylat (14), [20]. Methyl salicylat (14) Eudesmol (13) Linalool (15) Hình 2: Một số tinh dầu trong Trà hoa vàng c. Nhóm acid amin và nguyên tố khoáng 6
16. Cũng trong nghiên cứu của Jia-Ni Lin và cộng sự đã phát hiện các acid amin trong 6 loài trà hoa vàng như GABA (16), theanin (17), Arg, Tyr (18), Trp (19), Glu (20), Thr (21), [19]. GABA (Gamma-Aminobutyric Acid) là một dẫn truyền thần kinh quan trọng với hoạt động chính trong hệ thống thần kinh trung ương của động vật có vú. Trong nghiên cứu này, C. euphlebia có hàm lượng GABA cao nhất trong số sáu loài [19]. Theanin là một axit amin tự do được tìm thấy độc quyền trong cây trà. Nó là một thành phần chính chịu trách nhiệm cho vị ngọt và hương vị của trà, đồng thời nó còn mang một số tác dụng dược lý. Kết quả nghiên cứu cho thấy C. nitidissima var. microcarpa có hàm lượng theanin cao nhất trong số sáu loài được nghiên cứu [19]. Theanin (17) GABA (16) Tyr (18) Trp ( Tryptophan) (19) Glu (20) Thr (21) Hình 3: Một số acid amin chính trong Trà hoa vàng Thành phần các nguyên tố khoáng trong Trà hoa vàng cũng rất đa dạng. Hiện nay, 18 loại nguyên tố khoáng đã được phát hiện trong C. niprisssima. Các nguyên tố khoáng này bao gồm N, P, K, Ca, Mg, Fe, Zn, Mo, Ge, Na, Cu, Mn, Ni, V, Se, Cr, Al và Co. Hơn nữa, hàm lượng của K và Ca trong các nguyên tố đa lượng và hàm 7
17. lượng Fe, Mn, Zn trong các nguyên tố vi lượng tương đối cao [33]. Trong Trà hoa vàng cũng chứa nhiều vitamin, đặc biệt là vitamin C [34, 35]. 1.4. Công dụng Trà đã được sử dụng như là một phương thuốc trong y học phương đông từ rất lâu.Trà hoa vàng theo truyền thống được sử dụng để làm trà vì các đặc tính có lợi của nó và hoa khô được sử dụng thường xuyên hơn lá [15]. Cả hoa và lá tươi hay khô đều dùng được. Tuy nhiên, các sản phẩm khô được ưa chuộng hơn vì chúng có thể bảo quản được lâu hơn. Ngoài ra, hoa còn được ngâm rượu, được cho là có tác dụng bồi bổ sức khỏe cho người uống. Gần đây, một số mỹ phẩm được làm từ chiết xuất hoa và lá của hoa trà vàng như dầu tơ vàng, dầu hoa trà vàng hữu cơ và kem dưỡng da mặt. Các phát hiện lâm sàng cho thấy hoa trà có thể ức chế ung thư cấy ghép, giảm huyết áp, giảm lipid máu và giảm cholesterol, và ngăn ngừa xơ vữa động mạch [28, 29]. Các loại hoa trà vàng như C. niprisssima đã được sử dụng để điều trị đau họng, tiêu chảy, huyết áp cao, kinh nguyệt không đều và phòng chống ung thư [24]. Các nghiên cứu về C. euphlebia, một loài hoa trà vàng được trồng rộng rãi ở Việt Nam [23], chỉ ra rằng lá có thể được sử dụng để điều trị bệnh kiết lỵ, tăng huyết áp, tiêu chảy, viêm đường ruột và kinh nguyệt không đều [29], trong khi các chất chiết xuất của nó được báo cáo là có tác dụng chống ung thư đặc tính chống oxy hóa, hạ đường huyết, và hạ natri máu [30, 31]. 2. Tổng quan về loài Trà hoa vàng Camellia Hakodae Ninh 2.1. Vị trí phân loại Theo hệ thống phân loại của Takhtajan công bố năm 2009 [14], vị trí phân loại của Trà hoa vàng (Camellia hakodae Ninh) trong giới thực vật như sau: Giới (Kingdom): Thực vật (Plantate) Ngành (Division): Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp (Class): Ngọc lan (Magnoliophyta) Phân lớp (Subclass): Sổ (Dilleniidae) Bộ (Order): Trà (Theales) Họ (Family): Trà (Theaceae) Chi (Genus): Trà (Camellia) 8
18. Loài Camellia hakodae Ninh: Tên khoa học: Camellia hakodae Ninh Tên Việt Nam: Trà hoa vàng Hakoda 2.2. Đặc điểm thực vật Trà hoa vàng Camellia Hakodae Ninh Trà hoa vàng Hakoda là loài cây gỗ nhỏ, thân hình trụ thon đều, thường mọc thẳng, cao khoảng 3-5 m. Vỏ thân nhẵn có màu xám trắng, chồi và cành non có màu nâu nhạt, có lông thưa mịn, đến cành trưởng thành thì nhạt dần đến xám trắng, nhẵn và không có lông [1, 3, 32]. Lá đơn, mọc so le, không có lá kèm. Cuống lá tương đối ngắn. Phiến lá khá to so với lá của các loài Trà hoa vàng khác, màu xanh đậm và láng ở mặt trên, xanh sáng ở mặt dưới, có nhiều điểm tuyến màu đen. Lá dày, gốc lá tròn hoặc tim nông; mép lá có răng cưa nhỏ cách đều nhau, khía răng nông, phía gốc lá gần như không có khía; chóp lá có mũi nhọn. Lá Trà hoa vàng Hakodae có hệ gân lõm ở mặt trên và nổi rõ ở mặt dưới, gân giữa to, gân bên có khoảng 12-16 cặp, giúp cho lá cứng cáp hơn [1, 3, 32]. Cây con Cành mang hoa Hình 4: Hình ảnh về Trà hoa vàng Hakoda Hoa mọc ở đầu cành hoặc nách lá, có màu vàng đậm. Khi nở, đường kính của hoa độ khoảng 6-8 cm. Cuống hoa dài 1-1,2 cm mang 5-6 lá bắc, hình bầu dục rộng hoặc hình lông chim. Lá đài 5, hình vẩy đến gần tròn, mép và mặt trong có lông, phủ ở trên 5-6 lá bắc con, có lông. Tràng hoa gồm 16-17 cánh, gần tròn đến bầu dục, có lông mịn ở mặt trong và thưa dần hơn ở các cánh bên trong, hợp với bộ nhị khoảng 2-3 mm ở gốc hoa. Bộ nhị có nhiều nhị, các chỉ nhị vòng ngoài dính với nhau ở 1/3- 9
19. 1/2 chiều dài của chúng, chỉ nhị bên trong rời, có hình lông tơ. Bộ nhụy gồm 4 hoặc 5 lá noãn hợp thành bầu, không lông; vòi nhụy không có lông [1, 32]. Quả gần dạng cầu, đường kính 5-6 cm, cao 4-4,5 cm, có 3 hạt với 3-4 hạt trong mỗi ô, vỏ quả dày 4,5-6,5 mm. Hạt dài 2,2 -2,4 cm, có 2-3 mặt, không lông và có màu nâu bóng [7]. Mùa hoa: Trà hoa vàng Hakoda ra hoa từ đầu mùa Đông cho tới đầu Xuân. Khả năng tái sinh hạt kém, thụ phấn nhờ gió và côn trùng [32]. 2.1. Phân bố Trừ Vườn quốc gia Tam Đảo, loài này được tìm thấy ở huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên. Đây là loài đặc hữu của Việt Nam. 2.2. Yêu cầu sinh thái - Khí hậu: Cây Trà hoa vàng Hakoda thích hợp sống trong điều kiện có khí hậu nhiệt đới gió mùa, có mùa mưa và mùa khô phân biệt rõ rệt [32] - Ánh sáng: Trà hoa vàng Hakoda ưa ánh sáng tán xạ từ 30-50%, thích hợp với điều kiện phát triển dưới tán rừng, kỵ chiếu ánh sáng mạnh, ánh sáng trực xạ sẽ làm cho chức nặng quang hợp của lá bị thay đổi dẫn đến hiện tượng héo sinh lí [7]. - Nhiệt độ: Trà hoa vàng Hakoda là loài ưa mát, không thích hợp với môi trường có nhiệt độ, ánh sáng cao. Nhiệt độ thích hợp là 23,5 Cͦ , nhưng với các giai đoạn sinh trưởng phát triển khác nhau yêu cầu nhiệt độ khác nhau. Cây sinh trưởng manh nhất khi khí hậu mát mẻ của mùa khô và những mùa nhiệt độ cao cây sinh trưởng rất chậm, nhiệt độ môi trường cao sẽ làm cản trở sự ra hoa của trà [7]. - Nước: Trà hoa vàng Hakoda thích hợp vớ điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, yêu cầu độ ẩm khoảng 81%. Lượng mưa trung bình năm 1526 mm cây sinh trưởng tốt và ít sâu bệnh, ra hoa đẹp, chất lượng cao [7]. - Đất: Nhìn chung, cây sinh trưởng và phát triển tốt trên những loại đất Feralit phát triển trên đá mẹ Macmaxit kết tinh chua, đất hơi chua, pH= 5,17- 5,63 và phải đảm bảo đủ các yếu tố: Đất tơi xốp, đủ ẩm nhưng thoát nước, thông thoáng gió, nhiều mùn, đủ phân bón [7]. 2.3. Thành phần hóa học Cũng như các loài Trà hoa vàng khác, các thành phần hóa học chính có hoạt tính cao thường gặp trong Trà hoa vàng Hakoda là các polyphenol và tinh dầu (Methyl salicylat, Citronellol, ), các loại Flavonoid, Saponin, Acid hữu cơ (Acid oxalic, Acid nitrotinamic, Acid Ascorbic, ), protein, acid amin, pectin và đường khử. Ngoài ra, hạt Trà hoa vàng còn có các acid béo Palmitic, Stearic, Oleic, Myristic và 10
20. Arachidic [5]. Trong các nhóm chất này, nhóm chất luôn được coi là thành phần quan trọng nhất quyết định tính chất của trà là nhóm polyphenol và nhóm tinh dầu. Hàm lượng polyphenol toàn phần trong trà có thể được định lượng bằng phương pháp sắc lý lỏng hiệu năng cao (HPLC). Thành phần và hàm lượng các polyphenol là khác nhau trong các bộ phận khác nhau của cây. Chen Hongjuan và cộng sự đã sử dụng sắc ký lỏng hiệu suất cực cao (HPLC) và xác định được 96 thành phần polyphenol trong hoa Camellia hakodae Ninh [40]. Trong một nghiên cứu phân tích polyphenol có trong Trà hoa vàng của nhóm tác giả Trung Quốc, các tác giả đã sử dụng phương pháp HPLC để xác định 9 thành phần polyphenol có trong Trà hoa vàng. Kết quả nghiên cứu cho thấy trong hoa Camellia hakodae có 7 hợp chất polyphenol chính bao gồm EC, EGC, GCG, C, EGCG, GC và GA. Trong số các thành phần polyphenol được đo trên hoa Camellia hakodae Ninh, hàm lượng EC là cao nhất, và chiếm hơn 50% tổng số polyphenol, tiếp theo là EGC, GCG, ECG, và polyphenol tổng số. Như vậy, có thể thấy hàm lượng các polyphenol trong Trà hoa vàng là khác hẳn so với trong chèn xanh, hàm lượng EGCG trong cây chè là cao nhất, và hàm lượng GA với EGCG trong chè sẫm màu rất cao [41]. Mới đây, một nghiên cứu về Trà hoa vàng Hakodae đã phát hiện và chiết xuất tinh chế thêm được một loại flavonoid mới là (sexangularetin 3- O - (2 ″ - O - ( E ) - p -coumaroyl-β-d- glucopyranoside) mà trong các nghiên cứu trước đây chưa từng thấy sự hiện diện của nó trong Trà hoa vàng [42]. Dầu từ hạt trà đã được biết đến từ lâu với thành phần chính là sterol và acid béo. Theo các nghiên cứu, trong tinh dầu hạt Trà hoa vàng có các chất như canophyllol, 24-methylenecycloartan-3-ol, spinasterol và (-)sitosterol. Ngoài ra, trong tinh dầu cất từ lá trà còn có một lượng nhỏ các chất butyraldehyd, isobutyraldehyd và isovaleraldehyd, cùng với n-hexyl, benzyl, phenylethylalcon, geraniol, linalool, acetophenon và citral [17]. 2.4. Tính, vị, quy kinh Trà hoa vàng Hakodae có vị đắng chát, hơi ngọt, tính bình [5]. Quy kinh: Tâm, can, thận [5]. 2.5. Bộ phận dùng Cũng như các loài Trà hoa vàng khác, lá, hoa và búp Camellia Hakodae Ninh được dùng để làm thuốc. 3. Tổng quan về dược liệu lá Trà hoa vàng (Caemllia hakodae Ninh) 11
21. 3.1. Mô tả Lá Camellia hakodae Ninh thuộc loại lá đơn, mọc so le và không có lá kèm. Cuống lá tương đối ngắn với chiều dài chỉ khoảng 8-15 mm và lõm ở mặt trên cuống. Phiến lá có hình bầu dục hoặc thuôn, có khích thước khá to với chiều dài khoảng 23,5-29 cm, rộng khoảng 8 -12 cm. Lá có màu xanh đậm và láng ở mặt trên, xanh sáng và có nhiều điểm tuyến màu đen ở mặt dưới. Lá tương đối dày, gốc lá có hình tròn hoặc tim nông; mép lá có những răng cưa nhỏ cách đều nhau với những khía răng nông, số lượng răng cưa ít dần về phía gốc lá phía gốc lá và gần như không có khía; chóp lá có mũi nhọn dài khoảng 4-5 mm. Hệ gân lá Camellia hakodae Ninh là hệ gân nổi, lõm ở mặt trên và nổi rõ hơn ở mặt dưới, gân giữa to, gân bên có khoảng 12-16 cặp, giúp cho lá trở nên cứng cáp hơn để có thể nâng đỡ được lá với kích thước lớn hơn các loài Trà hoa vàng khác [1, 3, 32]. 3.2. Thành phần hóa học Hiện nay, các nghiên cứu về thành phần hóa học Trà hoa vàng Camellia hakodae Ninh chủ yếu tập trung trên hoa, các nghiên cứu chi tiết thành phần hóa học có trong lá còn hạn chế. Một số nguyên cứu về lá của một số loài Trà hoa vàng ở Việt Nam đã chỉ ra sự có mặt của mộ số thành phần hóa học quan trọng. Th.S Nguyễn Đức Tùng – Trường Đại học dược Hà Nội đã nghiên cứu và xác định được trong lá Trà hoa vàng Cúc Phương (Camellia cucphuongensis Ninh & Rosmann) có các thành phần bao gồm : flavonoid, tanin, saponin, đường khử, acid amin, acid hữu cơ, sterol và caroten [10]. Nghiên cứu khác của Trần Thị Mai – Đại học Dược Hà Nội cũng chỉ ra trong lá Trà hoa vàng Camellia chrysantha (Hu) Tuyama có các thành phần hóa học này [11]. Theo nghiên cứu của Chen Hongjuan và cộng sự, các nhóm chất xác định được là có mặt ở trong cây và hoa Camellia hakodae Ninh cũng bao gồm các Flavonoid, Saponin, Coumarin, Acid hữu cơ protein, acid amin, pectin, đường khử và acid béo, [40,41]. Như vậy, dự đoán trong lá Trà hoa vàng Camellia hakodae Ninh cũng có thể có những thành phần hóa học nổi bật này và lá Camellia hakodae Ninh hứa hẹn sẽ là một tiềm năng nghiên cứu lớn cho các nhà nghiên cứu sau này. 3.3. Tác dụng dược lí a. Tác dụng chống oxy hóa Thành phần hóa học có hoạt tính chính có trong lá Trà hoa vàng Hakoda là polyphenol. Polyphenol là chất chống oxy hóa có tác dụng khử các gốc tự do trong cơ thể. Các gốc tự do được sinh ra và tích lũy trong cơ thể là nguyên nhân chính dẫn đến bệnh tật và tăng tốc độ lão hóa của con người. Nhờ sự tập trung cao hàm lượng polyphenol mà dược liệu lá Trà hoa vàng Camellia hakodae Ninh có khả năng chống 12
22. oxy hóa nổi trội. Tuy nhiên, hoạt tính chống oxy hóa là khác nhau ở các polyphenol khác nhau. Các chất được xác định có trong lá Camellia hakodae Ninh có tác dụng trung hòa gốc tự do như: epicatechin, vitexin, isovitexin, quercetin-7-O-β-D- glucopyranoside và kaempferol [35]. b. Tác dụng chống ung thư Cũng nhờ thành phần chính có trong lá Camellia hakodae Ninh là polyphenol mà dược liệu có khả năng ức chế sự phát triển của một số dòng tế bào ung thư của người. Một số công trình nghiên cứu đã chứng minh tác dụng kìm hãm của polyphenol trong trà lên sự hình thành, di căn và phát triển của khối u. Tác dụng này chủ yếu là do hiệu quả chống oxy hóa cao và chống tăng sinh khối u của các hợp chất polyphenol trong trà. Các cơ chế chính giải thích tác dụng ức chế sự phát triển tế bào u của EGCG trong lá trà được đề cập là: (1) tác dụng ngăn cản chu kỳ phân chia tế bào, dừng chu kỳ phân chia tế bào ở các pha G1, G2; (2) Thúc đẩy quá trình chết tế bào theo chương trình [26]. Viện Lý Hóa- Viện hàn lâm khoa học Liên Xô (cũ) đã sử dụng những hợp chất Flavonoid hoặc Polyphenol có độc tính thấp như những chất chống oxy hóa để nghiên cứu lâm sàng điều trị môt số dạng ung thư và cho rằng cơ chế chống khối u của Flavonoid không chỉ do khả năng chống oxy hóa mà còn có tác dụng tổng hợp do khả năng phản ứng đa dạng của phân tử Flavonoid [25]. c. Tác dụng kháng khuẩn Nhiều nghiên cứu đac chỉ ra hoạt chất polyphenol trong trà có tác dụng kháng khuẩn, chống viêm [22,43]. d. Tác dụng giảm cân và làm đẹp Nhóm catechin từ lâu đã được biết đến là nhóm nhóm chất chính tạo nên tác dụng giảm cân và làm đẹp của trà. Một nghiên cứu của Chen JH về việc sử dụng catechin liều cao chiết xuất từ Trà trên phụ nữ béo bụng sau hai tuần điều trị cho thấy hiệu quả giảm cân đáng kể, giảm chu vi vòng eo, nồng độ cholesterol và LDL trong huyết tương mà không có bất kỳ tác dụng bất lợi nào được ghi nhận. Trong đó, EGCG là thành phần catechin có hoạt tính sinh học cao nhất trong việc giảm khối lượng cân nặng của cơ thể [23]. 3.4. Độc tính Trong nghiên cứu đánh giá độc tính cấp và mãn tính của dịch chiết lá Camellia hakodae Ninh trên động vật thí nghiệm, đánh giá độc tính cho thấy rằng đối với cả các thử nghiệm độc tính cấp tính và bán mãn tính, chiết xuất C. hakodae (CHN) không tạo ra bất kỳ tác dụng độc hại nào ở chuột nhắt hoặc chuột cống. Trong quá trình nghiên cứu độc tính cấp tính, không có tỷ lệ mắc bệnh hoặc tử vong nào được 13
23. quan sát thấy. Giá trị LD50 của chiết xuất không được xác định, nhưng có khả năng cao hơn 120 g/kg, cho thấy rằng chiết xuất về cơ bản không độc hại và an toàn cho việc uống với liều lượng đã được thử nghiệm. Trong quá trình thử nghiệm độc chất dưới điện tử, không có trường hợp tử vong hoặc các triệu chứng liên quan đến điều trị được quan sát thấy ở bất kỳ nhóm nào. Kiểm tra mô bệnh học của các mẫu gan, thận và lá lách của chuột được điều trị bằng CHN cho thấy cấu trúc cơ quan bình thường, cho thấy không có thay đổi vi thể hoặc rối loạn hình thái do uống CHN, ở cả liều thấp đến liều cao. Điều đặc biệt hơn nữa là không có sự khác biệt đáng kể về lượng thức ăn và nước uống, tăng cân, các thông số sinh hóa hoặc huyết học được quan sát thấy giữa nhóm đối chứng và nhóm được điều trị trong thời gian uống. Do đó, có thể thấy các chất chiết xuất từ nước của lá C. hakodae Ninh tương đối an toàn không gây tử vong hoặc bất kỳ thay đổi bất thường nào trong suốt quá trình nghiên cứu độc tính cấp tính hoặc bán mãn tính [58]. 3.5. Dạng bào chế Hiện nay, trên thị trường đã có một số sản phẩm như trà túi lọc, trà sấy và dầu trà từ nguồn dược liệu lá Trà hoa vàng Hakoda [9]. Với việc quan tâm nghiên cứu về Trà hoa vàng Hakoda, trong tương lai sẽ có thêm nhiều dạng bào chế khác cho thuốc từ nguồn dược liệu quý này. 14
24. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Lá trà hoa vàng (Camellia hakodae Ninh) tươi được cung cấp ở Vĩnh Phúc (Tháng 12/2020) và lá đã sấy khô được cung cấp bởi Cơ sở sản xuất và kinh doanh Trà hỗ trợ sức khỏe bà Ba (Bắc Ninh), sản xuất tháng 11/2020. 2.2. Dung môi, hóa chất Thuốc thử (TT) Mayer, TT Dragendorff, TT Bouchardat, TT diazo mới pha, FeCl3 5%, gelatin 1%, chì acetat 5%, TT Legal, dung dịch natri nitroprussiat, ethanol 96% (EtOH) (Trung Quốc), n-hexan (Hx) (Trung Quốc), nước cất, ethyl acetat (EtOAc) (Trung Quốc), methanol (MeOH) (Merck, Đức), thuốc thử Folin- Ciocalteu (Trung Quốc), natri carbonat (Trung Quốc) đạt tiêu chuẩn tinh khiết. Chất chuẩn acid gallic 99,9% (Cheng du, Trung Quốc), EGCG 98% (Macklin, Trung Quốc). 2.3. Dụng cụ, thiết bị - Kính hiển vi Axioskop 40 (ZEISS, Đức) - Cân kỹ thuật Precisa BJ610C, cân phân tích Precisa 262SMA-SR, cân xác định độ ẩm Precisa HA 60 (Thụy Sĩ) - Máy quang phổ tử ngoại khả kiến UV-VIS Cary 60 (Aligent, Mỹ) - Lò nung dược liệu (Trung Quốc) - Máy siêu âm Ultrasonic Cleaner (MRC- Israel) - Tủ sấy Wiseven Ovn- N105 (Hàn Quốc). - Các dụng cụ thí nghiệm thường quy: cốc có mỏ, bình nón, ống nghiệm, đũa thủy tinh, pipet, bình gạn, phễu lọc, giấy lọc 2.4. Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu, xây dựng các tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu lá trà hoa vàng Camellia hakodae Ninh như mô tả; vi phẫu dược liệu và bột dược liệu; độ ẩm; tro toàn phần; tro không tan trong acid dựa trên các tiêu chí trong Dược điển Việt Nam V [2]. Định tính các thành phần chất béo, sterol, caroten, flavonoid, saponin, coumarin, đường khử, polysaccharid, tanin, alkaloid được tiến hành theo tài liệu tham khảo [3, 5-7]. Định lượng hàm lượng phenol toàn phần trong mẫu thử bằng phương pháp đo màu với thuốc thử Folin Ciocalteu, sử dụng chất chuẩn là acid galic theo TCVN 9745-1- 2013 (ISO 14502-1-2005) và tài liệu tham khảo [4, 10]. 2.4.1. Mô tả 15
25. Quan sát mẫu dược liệu tươi ở ánh sáng thường. Mô tả màu sắc, hình dạng, kích thước, thể chất và mùi vị của dược liệu lá Trà hoa vàng Hakoda. 2.4.2. Vi phẫu Tiến hành theo DĐVN V, phụ lục 12.18 Mẫu dược liệu tươi được tiến hành cắt vi phẫu, cho vào ống nghiệm, thêm dung dịch natri hydroxit 5% pha loãng với nước (1: 1) và đun sôi dưới đèn cồn trong 2 - 5 phút tùy theo độ dày của lá tránh làm mềm quá mạnh, rửa sạch bằng nước 3-4 lần rồi đổ vào đĩa Petri. Dùng nhíp hoặc kẹp lấy dược liệu ra cho lên phiến kính, dùng giấy lọc thấm phần nước còn dư sau đó cho một vài giọt glycerin, đậy lam kính rồi tiến hành sử dụng kính hiển vi để quan sát các đặc điểm vi phẫu của dược liệu. 2.4.3. Soi bột Tiến hành theo DĐVN V, phụ lục 12.18. Lấy một lượng nhỏ bột (qua rây số 250), lên tiêu bản bằng cách cho vào một giọt dung dịch soi ( nước, glycerin ) đã có sẵn trên lam kính, dùng kim mũi mác dàn đều cho bột thấm dung dịch, đậy lam kính, di nhẹ lam kính rồi quan sát dưới kính hiển vi. 2.4.4. Độ ẩm Độ ẩm của dược liệu được xác định theo DDVN V, phụ lục 9.6. Phương pháp: Sử dụng cân xác định độ ẩm Precisa HA 60: Cân chính xác khoảng 1g dược liệu, khởi động máy và đọc kết quả khi máy dừng. Tiến hành lặp lại ba lần. Độ ẩm X (%) của dược liệu được xác định dựa trên công thức sau: m − a ( %) = × 100% m Trong đó: X: độ ẩm của dược liệu (%) m: khối lượng dược liệu trước khi sấy (g) a: khối lượng dược liệu sau khi sấy (g) 2.4.5. Tro toàn phần Tiến hành theo DĐVN V, phụ lục 9.8. Cho 2g đến 3g bột mẫu thử vào một chén sứ hoặc chén platin đã nung và cân bì. Nung ở nhiệt độ không quá 450 °C tới khi không còn carbon, làm nguội rồi cân. Bằng cách này mà tro chưa loại được hết carbon thì dùng một ít nước nóng cho vào khối chất đã than hóa, dùng đũa thủy tinh khuấy đều, lọc qua giấy lọc không tro. Rửa 16
26. đũa thủy tinh và giấy lọc, tập trung nước rửa vào dịch lọc. Cho giấy lọc và cắn vào chén nung rồi nung đến khi thu được tro màu trắng hoặc gần như trắng. Tập trung dịch lọc vào cắn trong chén nung, đem bốc hơi đến khô rồi nung ở nhiệt độ không quá 450 °c đến khi khối lượng không đổi. Tính tỷ lệ phần trăm của tro toàn phần theo dược liệu đã làm khô trong không khí. 2.4.6. Tro không tan trong acid Tiến hành theo DĐVN V, phụ lục 9.7. Cho vào chén nung chứa tro toàn phần hay tro Sulfat 15 ml nước và 10 ml acid hydrocloric (TT). Đậy chén bằng một mặt kính đồng hồ, đun sôi cẩn thận 10 min rồi để nguội. Rửa mặt kính đồng hồ với 5 ml nước nóng rồi cho vào chén nung. Tập trung chất không tan vào một phễu lọc thủy tinh xốp đã cân bì hoặc vào một giấy lọc không trơ, rửa bằng nước nóng tới khi dịch lọc cho phản ứng trung tính. Làm khô rồi nung tới đỏ tối, đế nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Nung tiếp tới khi giữa 2 lần cân khối lượng chênh lệch nhau không vượt quá 1 mg. Tính tỷ lệ phần trăm của tro không tan trong acid so với dược liệu đã được làm khô trong không khí. 2.2.7. Định tính 2.2.7.1. Định tính chất béo, sterol, caroten Chuẩn bị mẫu thử: Ngâm 10g bột dược liệu trong n-hexan vừa đủ để qua đêm. Lọc, thu lấy dịch lọc để làm phản ứng:  Định tính chất béo: Nhỏ 2 giọt dịch chiết lên giấy lọc. Hơ nóng bay hơi hết dung môi, nếu còn vết mờ trên giấy lọc thì dương tính.  Định tính sterol: Cô cách thủy bốc hơi dung môi đến cắn. Thêm vào ống nghiệm 1ml anhydrid acetic, lắc kỹ; nghiêng ống 45 độ, nhỏ từ từ 3 giọt acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm, thấy mặt phân cách có vòng tím đỏ, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá thì dương tính.  Định tính caroten: Cô cách thủy bốc hơi dung môi đến cắn. Thêm 2 giọt H2SO4 đặc vào cắn. Dung dịch có màu xanh đậm thì dương tính. 2.2.7.2. Định tính các thành phần trong dịch chiết cồn Chuẩn bị mẫu thử: Cân khoảng 5g dược liệu vào bình nón có dung tích 50 ml, thêm 50 ml cồn 90 độ, đun sôi cách thủy vài phút. Dịch chiết được lọc và cô còn khoảng 10 ml để làm các phản ứng định tính Flavonoid, coumarin, acid amin và saponin.  Định tính Flavonoid 17
27. - Phản ứng Cyanidin: Cho 2 ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm một ít bột Magie kim loại, rồi nhỏ từ từ 4-5 giọt acid HCl đặc. Đun nóng trên bếp cách thủy sau vài phút nếu xuất hiện màu tím đỏ thì phản ứng dương tính. - Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: Cho 2 ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%, nếu dung dịch xuất hiện màu xanh sẫm thì phản ứng dương tính. - Phản ứng Diazo hóa: Cho 2 ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, kiềm hóa bằng NaOH 10%, thêm vài giọt thuốc thử Diazoni, lắc đều, đun cách thủy vài phút. Phản ứng dương tính khi dung dịch xuất hiện màu đỏ gạch. - Phản ứng với kiềm: Cho 2 ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%, phản ứng dương tính khi màu vàng của dung dịch tăng thêm. Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên giấy lọc. Hơ khô rồi để trên miệng lọ amoniac đặc. Phản ứng dương tính khi màu vàng tăng lên.  Định tính Saponin - Quan sát hiện tượng tạo bọt: Cho 2 ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm 2 ml nước cất. Bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc trong 5 phút, để yên và quan sát. Phản ứng dương tính khi bọt bền sau 10 phút. - Phản ứng Salkowski: Cho 5 ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, bốc hơi đến cắn. Hòa tan cắn bằng 2 ml anhydrid acetic, thêm vào dung dịch 1 ml chloroform. Dùng pipet nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đặc vào thành ống nghiệm. nếu mặt phân cách xuất hiện vòng màu đỏ tím, lắc nhẹ dung dịch có màu đỏ thì phản ứng dương tính. - Phản ứng với dung dịch chì axetat: Cho 1-2 giọt dung dịch chì axetat 10% vào ống nghiệm chứa 1ml dịch chiết mẫu 2, xuất hiện tủa màu vàng. - Phản ứng Lafon: Ống nghiệm chứa 1ml dịch chiết mẫu 2, thêm 1 giọt dung dịch đồng sunfat 10% và 1 ml dung dịch axit-sunfuric đậm đặc, đun nóng nhẹ. Nếu có saponin, dung dịch có màu xanh lam.  Định tính Coumarin - Phản ứng đóng mở vòng lacton: Cho vào hai ống nghiệm mối ống 1 ml dịch chiết cồn. + Ống 1: Thêm 0.5 ml dung dịch NaOH 10% + Ống 2: Để nguyên. Đun sôi cả hai ống nghiệm, để nguội. Quan sát nếu có hiện tượng sau thì dương tính: + Ống 1: Dung dịch có tủa vàng hoặc tủa đục có màu vàng. + Ống 2: Trong. 18
28. Thêm vào cả hai ống nghiệm, mỗi ống 2 ml nước cất. Lắc đều, thấy: + Ống 1: Trong suốt + Ống 2: Có tủa đục. Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, ống 1 sẽ trở lại đục như ống 2. 2.2.7.3. Định tính các thành phần trong dịch chiết nước Chuẩn bị mẫu thử: Cân 5g dược liệu vào bình nón, thêm 20 ml nước cất, đun sôi trực tiếp 5 phút. Lọc lấy dịch, để nguội.  Định tính đường khử - Phản ứng Fehling: Thêm vào ống nghiệm 2ml dịch chiết mẫu 1. Thêm 5 giọt acid H2SO4 đậm đặc đun sôi trong 5 phút. Để nguội, trung hoà acid bằng dd NaOH 10%, sau đó thêm 10 giọt thuốc thử Fehling. Đun cách thủy 10 phút, nếu xuất hiện kết tủa đỏ gạch là dương tính.  Định tính polysaccharid - Cho 2ml dịch chiết 1 và 8 ml rượu 96% vào ống nghiệm. Quan sát nếu xuất hiện tủa bông trắng là dương tính.  Định tính tanin - Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: Cho 2 ml dịch lọc vào một ống nghiệm, thêm 3 giọt dung dịch FeCl3 5%. Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa xanh đen, xanh nâu nhạt. - Phản ứng với dung dịch chì acetat 10%: Cho 2 ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 2 giọt chì acetat 10%. Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa bông. - Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: Cho 2 ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1%. Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa trắng. 2.2.7.4. Định tính alkaloid Chuẩn bị mẫu thử: Cân 0,5g bột dược liệu, cho vào bình nón dung tích 50 ml. Thêm 10 ml acid sulfuric 1N. Đun đến sôi. Lọc nóng dung dịch vào trong bình gạn dung tích 50 ml. Kiềm hóa dịch lọc bằng amoniac 6 N đến pH = 9 – 10 (khoảng 5 ml). Lắc 2 lần, mỗi lần 5 ml cloroform. Gộp các dịch chiết cloroform, chia lām 2 phần: 1 phần dùng để định tính alkaloid bằng thuốc thử chung, 1 phần dùng để thực hiện phản ứng phản ứng Murexid. - Phản ứng Murexid: Lấy 1 phần dịch chiết cloroform cho vào một bát sứ nhỏ, khô. Bốc hơi trên nồi cách thủy đến khô. Nhỏ vào cắn còn lại 3 giọt HCl 6 N và 3 giọt nước oxy già đậm đặc. Láng đều cho hòa tan hết cắn. Bốc hơi trên nồi cách thủy 19
29. cho tới khô, cắn sẽ có màu đỏ. Thêm vào cắn vài giọt amoniac 6N sẽ xuất hiện màu tím. Các phản ứng chung: - Phản ứng với thuốc thử Mayer (K2HgI4-Kalitetraiodomercurat): Lấy 2ml dịch chiết vào ống nghiệm.Thêm 2 - 3 giọt thuốc thử Mayer, nếu thấy xuất hiện tủa trắng thì phản ứng dương tính. - Phản ứng với thuốc thử Bouchardat(iodo-iodid): Lấy 2ml dịch chiết vào ống nghiệm.Thêm 2 - 3 giọt thuốc thử Bouchardat, nếu thấy xuất hiện kết tủa nâu đỏ thì phản ứng dương tính. - Phản ứng với thuốc thử Dragendorff (KBiI4 – Kali tertraiodobismutat III): Lấy 2ml dịch chiết vào ống nghiệm. Thêm 2 - 3 giọt thuốc thử Dragendoff, nếu thấy xuất hiện kết tủa da cam thì phản ứng dương tính. 2.2.8. Định lượng Định lượng polyphenol tổng số: Áp dụng phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số theo TCVN 9745-1-2013 (ISO 14502-1-2005) và tài liệu tham khảo [4,6,10] với chất chuẩn là acid gallic và thuốc thử Folin-Ciocalteu. Chuẩn bị mẫu:  Chuẩn bị mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 10 mg chất chuẩn acid galic cho vào bình định mức (BĐM) 10 ml hòa tan trong khoảng 8 ml nước rồi bổ sung thêm cùng dung môi đến vạch thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ khoảng 1000 μg/ml. Từ dung dịch mẫu chuẩn gốc, pha loãng thành dãy dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là 50, 40, 30, 20 và 15 μg/ml.  Chuẩn bị mẫu thử: Cân chính xác 1,0 g bột dược liệu, cho vào bình định mức, thêm 100 ml dung dịch MeOH 70 %, chiết siêu âm trong 90 phút ở tần số 30 Hz. Lọc lấy dịch lọc. Hút 1 ml dịch lọc vào bình định mức 10 ml, thêm MeOH 70 % đến vạch được dung dịch mẫu thử.  Xác định hàm lượng phenol toàn phần: Tiến hành các phản ứng: - Mẫu chuẩn: (1 ml chuẩn + 5 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu 10%) lắc kỹ, để 5phút + 4 ml Na2CO3 7,5 % . - Mẫu trắng: (1 ml nước cất + 5 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu 10%) lắc kỹ, để 5phút + 4 ml Na2CO3 7,5 %. - Mẫu thử: (1 ml thử + 5 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu 10%) lắc kỹ, để 5phút + 4 ml Na2CO3 7,5 %. 20
30. Lắc đều, ủ tại nhiệt độ phòng 60 phút, sau đó đem đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 765 nm, dựa vào đường chuẩn đã xây dựng để xác định hàm lượng phenol toàn phần. Cuvet thạch anh dộ dày 1 cm. Xử lí số liệu: Hàm lượng polyphenol tổng: Y−b H = + (μg/ml) 100 Trong đó: a,b: Hệ số của phương trình đường chuẩn Y: Độ hấp thụ quang của dung dịch đo quang của mẫu thử ở bước sóng λ =765nm H: Độ tinh khiết của chất chuần (%) Hàm lượng polyphenol toàn phần có trong lược liệu khô tuyệt đối được tính theo công thức: C x 10−3 x V x K X= (mg GAE /g Dl) 푙 x (100− ) x 10−2 Trong đó: C: Nồng độ dung dịch đo quang của mẫu thử ( μg/ml) V: Thể tích dung môi chiết ( V=100ml) K: Hệ số pha loãng (K=10) Mdl: Khối lượng dược liệu (1,000 g) a: Độ ẩm dược liệu (%) 21
31. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả thực nghiệm 3.1.1. Mô tả Hình dưới là ảnh chụp lá Trà hoa vàng Hakoda tươi và khô. Lá mọc so le, cuống dài 8-15mm, có lông, phiến lá hình bầu dục rộng hoặc thuôn, dài 23,5-29 cm, rộng 9 -11,5 cm, màu xanh đậm và láng ở mặt trên, xanh sáng ở mặt dưới, có nhiều điểm tuyến màu đen. Lá dày, gốc lá tròn, chóp lá có mũi nhọn, mép lá có răng cưa nhỏ cách đều nhau, hệ gân lõm ở mặt trên và nổi rõ ở mặt dưới, gân bên 12-16 cặp. Lá tươi vò nát có mùi thơm đặc trưng. Lá khô màu xanh vàng, mùi thơm nhẹ. Mặt trên lá tươi Mặt dưới lá tươi Mặt trên lá khô Mặt dưới lá khô Hình 5: Hình ảnh dược liệu lá Trà hoa vàng Hakoda 3.1.2. Đặc điểm vi phẫu lá Gân giữa: Gân lồỉ cả 2 mặt, mặt dưới lồi rõ. Từ ngoài vào trong gồm: Biểu bì (1) gồm một hàng tế bào hình chữ nhật kích thước không đều, có phủ một lớp cutin mỏng. Lớp mô dày (2) xếp cạnh biểu bì. Mô mểm (3) gồm cốc lớp tế bào hình tròn, xếp lộn xộn để hở nhiều khoảng gian bào. Mô cứng (4) gồm 2-5 lớp tế bào hình đa giác, thành dày hóa gỗ, sắp xếp tạo thành một cung bao quanh bó libe-gỗ. Bó libe- gỗ có gỗ ờ trên, libe phía dướỉ; libe (5) gồm nhiều lớp tế bài hình đa giác kích thước đều, xếp lộn xộn thành từng đám mạch gỗ (6) hình đa giác hay vuông xếp thành dãy xen lẫn với mô mềm gỗ (tể bào hỉnh vuông hay đa giác). Nằm rải rác trong mô mềm là thể cứng (7) kích thước lớn nhánh nhọn, đa hình dạng. Tinh thề calci oxalat (8) hình cầu gai nằm ở mô mềm và libe. Ở một số lá non có thấy có lông che chở (9) ở phần biểu bì trên, được mô tả trong hình 6. 22
32. 2 3 5 4 6 7 9 10 Gân giữa lá Trà hoa vàng Hakoda Chú thích: 1. Biểu bì 4. Mô cứng 7.Thể cứng 9. Lông che chở 2. Mô dày 5. Libe 8.Tinh thể oxalat 10. Vi phẫu lá non 6. Mạch gỗ 3. Mô mềm Hình 6: Hình ảnh vi phẫu tiêu bản dược liệu lá Trà hoa vàng Hakoda 3.1.3. Đặc điểm bột dược liệu Bột lá Trà hoa vàng Hakoda có màu xanh đen, mùi thơm đặc trưng của trà. Soi dưới kính hiển vi, thấy có các thành phần gồm: Mảnh biểu bì, mảnh mạch, lông che chở, thể cứng, tinh thể calci oxalat, được mô tả ở hình 7: Hình 7: Cảm quan và vi phẫu bột lá Trà hoa vàng Hakoda 23
33. 3.1.4. Độ ẩm Tiến hành như mô tả ở mục 2.4, thu được kết quả như trình bày ở bảng 2: Bảng 2: Độ ẩm của dược liệu lá Trà hoa vàng Hakoda Lần thí Khối lượng dược liệu Khối lượng dược Độ ẩm M ± SD nghiệm trước khi sây (g) liệu sau khi sấy (g) (%) (%) 1 1,001 0,903 9,79 2 1.000 0,977 9,77 9,79 ± 0,02 3 1.004 0,985 9,81 Độ ẩm của dược liệu lá Trà hoa vàng Hakoda khoảng từ 9,77 đến 9,81%. Như vậy, dự kiến độ ẩm của dược liệu lá Trà hoa vàng Hakoda không quá 10%. 3.1.5. Kết quả xác định tro toàn phần Tiến hành như mô tả ở mục 2.5, kết quả xác định tro toàn phần của các mẫu dược liệu lá Trà hoa vàng đươc trình bày ở bảng 3: Bảng 3: Tỉ lệ tro toàn phần của dược liệu lá Trà hoa vàng Hakoda Lần thí Khối lượng dược Khối lượng tro Tỉ lệ tro M ± SD nghiệm liệu (g) (g) toàn phần (%) 1 1,9999 0,1298 6,490 2 2,0001 0,1288 6,340 6,449 ± 0,096 3 2,0005 0,1304 6,518 Tỉ lệ tro toàn phần của dược liệu lá Trà hoa vàng trong khoảng từ 6,34% đến 6,518%. Như vậy, dự kiến giới hạn tro toàn phần không quá 7%. 3.1.6. Kết quả xác định tro không tan trong acid Tiến hành theo mô tả ở mục 2.6, kết quả thu được như bảng 4: 24
34. Bảng 4: Tỉ lệ tro không tan trong acid lá Trà hoa vàng Hakoda Lần thí Khối lượng dược Khối lượng Tỉ lệ tro M ± SD nghiệm liệu (g) tro không tan không tan (%) trong acid (g) trong acid 1 1,9999 0,0045 0,225 2 2,0001 0.0043 0,215 0,228 ± 0,015 3 2,0005 0,0049 0,245 Tỉ lệ tro không tan trong acid của dược liệu lá Trà hoa vàng khoảng từ 0,215% đến 0,245%. Như vậy, dự kiến giới hạn tro toàn phần không quá 0,25%. 3.1.7. Kết quả định tính Kết quả định tính bằng các phản ứng hóa học được trình bày ở bảng 5. Bảng 5: Kết quả phản ứng định tính Phản ứng Kết quả Kết luận Phản ứng của Flavonoid Phản Phản ứng ứng dương Cyanidin tính. Dd chuyển màu tím đỏ Phản ứng Phản với dung ứng dịch FeCl3 dương 5% tính. DD chuyển màu xanh sẫm 25
35. Phản Phản ứng ứng Dược liệu Diazo hóa dương chứa tính. Flavonoid. DD chuyển màu đỏ gạch DD tăng màu vàng Phản ứng với kiềm Phản ứng dương tính. Giọt khô vàng hơn Phản ứng của Saponin Phản Quan sát ứng hiện tượng dương tạo bọt tính. Tạo bọt bền sau 10 phút Phản Phản ứng ứng dương Salkowski tính. 26
36. DD chuyển đỏ Phản ứng Dược liệu với dung chứa Phản dịch chì ứng Saponin DD xuất hiện tủa vàng axetat dương tính. Phản ứng Phản Lafon ứng dương DD chuyển màu xanh lam tính thẫm Phản ứng của Coumarin 1 2 Ống nghiệm 1 (ÔN) có tủa vàng, ÔN 2 trong 1 2 a Phản ứng 27
37. Phản ứng ÔN 1 trong, ÔN 2 đục dương Dược liệu đóng mở tính chứa 1 vòng Coumarin lacton ÔN 1 đục Phản ứng của chất béo Dịch chiết Phản Dược liệu trên giấy ứng chứa Chất lọc dương béo tính Có vết mờ trên giấy lọc Phản ứng của sterol Định tính Phản Dược liệu Sterol ứng chứa Sterol dương Mặt phân cách có vòng tính tím đỏ, lớp chất lỏng trên có màu xanh lá Phản ứng của caroten Phản ứng Phản với H2SO4 ứng Dược liệu đặc dương chứa Caroten tính 28
38. DD xanh đậm hơn Phản ứng của đường khử Phản ứng Phản Dược liệu Fehling ứng chứa đường dương khử DD chuyển đỏ, xuất hiện tính tủa đỏ gạch Phản ứng của polysaccharid Phản ứng Dược liệu âm không chứa tính polysaccharid DD trong, không có tủa Phản ứng của tanin Phản ứng Phản với dung ứng dịch FeCl3 dương 5% DD chuyển màu xanh đen tính. có tủa Dược liệu Phản ứng Phản chứa Tanin với dung ứng dịch chì dương acetat 10% tính. 29
39. DD đục màu, có tủa bông Phản ứng với dung Phản dịch ứng gelatin 1% dương tính. DD trong, có tủa trắng Phản ứng của Alkaloid Phản ứng Murexid Phản ứng âm Cắn không đổi màu tính Dược liệu Phản không chứa Phản ứng ứng Alkaloid của TT âm Mayer tính DD không đổi màu, không tủa Phản ứng Phản của TT ứng Bouchar âm dat tính DD đậm màu, không tủa 30
40. Phản ứng Phản của TT ứng Dragend âm off tính DD đậm màu, không tủa 3.1.8. Kết quả định lượng 3.1.8.1. Xây dựng đường chuẩn và phương trình hồi quy tuyến tính của acid gallic Độ hấp thụ của dãy dung dịch chuẩn acid gallic đo tại bước sóng 765 nm được trình bày ở bảng 6: Bảng 6 : Độ hấp thụ của dãy chuẩn acid gallic tại λ=765nm STT Nồng độ lý thuyết (μg/ml) Độ hấp thụ (ABS) 1 20 0,265 2 30 0,336 3 40 0,475 4 50 0,586 5 60 0,706 Dựa trên độ hấp thụ quang của dãy chuẩn acid gallic đo được tại bước sóng λ=765nm, ta xây dựng được đường chuẩn nồng độ acid gallic như hình 7. Hình 8: Đường chuẩn acid gallic 31
41. b. Hàm lượng polyphenol toàn phần trong lá Trà hoa vàng Hakoda Tiến hành đo độ hấp thụ của Trà đã được chuẩn bị 3 lần và lấy giá trị trung bình của 3 lần đo ta thu được kết quả như bảng 7: Bảng 7: Độ hấp thu của dung dịch thử Lần đo Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB Độ hấp thụ (ABS) 0,565 0,564 0,563 0,564 Dựa vào phương trình đương chuẩn của acid galllic: y = 0,0118x – 0,0024 (a=0,0118; b= -0,0024) với hệ số tương quan R2= 0.9893, độ tinh khiết của acid gallic là H= 99,9%, độ ẩm dược liệu 9,79 % và công thức ở mục 2.1.7 ta tính được hàm lượng polyphenol toàn phần có trong lá Trà như bảng 8: Bảng 8: Hàm lượng polyphenol trong lá Trà hoa vàng Hakoda Đại lượng Kết quả Đơn vị Nồng độ polyphenol đo được 143,4496 μg/ml Hàm lượng polyphenol toàn phần 53,006 mg GAE /g DL Như vậy, hàm lượng polyphenol toàn phần trong lá Trà hoa vàng Hakoda là 53,006 mg GAE/g dược liệu. 3.2. Bàn luận Nghiên cứu đã tiến hành khảo sát các chỉ tiêu đánh giá chất lượng của dược liệu lá Trà hoa vàng Hakoda theo các tiêu chí chung được quy định trong DĐVN V, bao gồm mô tả, vi phẫu, soi bột, độ ẩm, tro toàn phần, tro không tan trong acid, định tính một số thành phần có tác dụng sinh học và định lượng polyphenol tổng số. Dược liệu Trà hoa vàng Hakoda chưa có trong chuyên luận riêng của Dược điển, do đó kết quả nghiên cứu này góp phần tạo cơ sở dữ liệu cho nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng cho dược liệu sau này. Về mô tả dược liệu: Kết quả nghiên cứu cho thấy các đặc điểm vi học của lá Camellia hakodae Ninh như lá mọc so le; phiến lá hình bầu dục; lá xanh đậm và láng ở mặt trên, xanh sáng và có nhiều điểm tuyền màu đen ở mặt dưới; hệ gân nổi rõ; [1, 12,17]. Những kết quả nghiên cứu này là phù hợp với các đặc điểm mô tả của lá Trà hoa vàng Hakoa trong nghiên cứu của PGS.TS Trần Ninh [1]. Hình ảnh vi phẫu có thể quan sát thấy rõ cấu tạo, các lớp tế bào trên kính hiển vi và có thể dùng làm tư liệu cho kiểm nghiệm xác định mẫu lá Trà hoa vàng. 32
42. Bằng các phản ứng đặc trưng, để tài đã xác định được các nhóm chất có tác dụng sinh học trong dược liệu: flavonoid, saponin, tanin, coumarin, đường khử, caroten, sterol và chất béo. Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học có trong lá Trà hoa vàng Hakoda trong nghiên cứu này cũng tương đồng với các nghiên cứu trong nước và trên thế giới về các loài Trà hoa vàng. Trần Thị Thơm đã nghiên cứu trên lá trà hoa vàng Cúc Phương (Camellia cucphuongensin Ninh & Rossmann) và đã xác định sự có mặt của những nhóm chất này [8]. Nguyễn Thị Hà Ly cùng nhóm sinh viên Đại học Dược Hà Nội cũng đã chứng minh sự có mặt của những nhóm chất này trong Trà hoa vàng ở Thái Nguyên [12]. Các polyphenol được biết đến với hoạt tính chống oxy hóa nổi trội của nó. Hàm lượng polyphenol tổng số là một tiêu chí quan trọng để đánh giá chất lượng của dược liệu. Phương pháp định lượng giúp xác định được hàm lượng polyphenol toàn phần trong mẫu lá Trà hoa vàng Hakoda. Phương trình đường chuẩn của acid gallic xác định được từ ngiên cứu là một đường thẳng tuyến tính với R2=0.9893 và hệ số tương quan R= 0.995. Như vậy, có thể thấy nghiên cứu đã đáp ứng được yêu cầu về hệ số tương quan của phương trình hồi quy ( ≤ 0.995). Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng polyphenol toàn phần có trong lá Trà hoa vàng Hakoda là 53,006 mg/g dược liệu, tương đương với khoảng 5,301%. Kết quả này đối chiếu với hàm lượng polyphenol toàn phần có trong một số loài Trà hoa vàng khác có một chút khác biệt. Hàm lượng polyphenol trong lá Trà hoa vàng Thái Nguyên là 6,7% và trong lá Trà hoa vàng Camellia chrysanthoides (Quảng Ninh) là 6,2 % [10]. Như vậy, có thể thấy hàm lượng polyphenol toàn phần trong mẫu nghiên cứu là thấp hơn so với một số loài Trà hoa vàng khác. 33
43. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở dược liệu lá Trà hoa vàng Hakoda như sau: - Mô tả: Lá mọc so le, cuống dài 8-15mm, có lông, phiến lá hình bầu dục rộng hoặc thuôn, dài 23,5-29 cm, rộng 9 -11,5 cm, màu xanh đậm và láng ở mặt trên, xanh sáng ở mặt dưới, có nhiều điểm tuyến màu đen. Lá dày, gốc lá tròn, chóp lá có mũi nhọn, mép lá có răng cưa nhỏ cách đều nhau, hệ gân lõm ở mặt trên và nổi rõ ở mặt dưới, gân bên 12-16 cặp. Lá tươi vò nát có mùi thơm đặc trưng. Lá khô màu xanh vàng, mùi thơm nhẹ, vị đắng chát, hơi ngọt. - Vi phẫu: Gân lá có chứa các thành phần: Biểu bì dưới; Mô dày dưới; Mô mềm; Libe; Mạch gỗ; Thể cứng; Mô cứng; Tinh thể calci oxalat; Mô dày trên; Biểu bì trên. - Bột: màu xanh đen, mùi thơm. Quan sát bằng kính hiển vi thấy các đặc điểm: Mảnh biểu bì, mảnh mạch, lông che chở, thể cứng, tinh thể calci oxalat hình cầu gai. - Độ ẩm: Không quá 10%. - Tro: Tro toàn phần không quá 7%, tro không tan trong acid không quá 0,25%. - Định tính: Lá Trà hoa vàng Hakoda có chứa flavonoid, saponin, tanin, coumarin, đường khử, caroten, sterol và chất béo. - Định lượng: Hàm lượng polyphenol toàn phần trong lá Trà hoa vàng Hakoda là 53,006 mg GAE/g dược liệu. Đây là nghiên cứu bước đầu góp phần từng bước hoàn thiện chuyên luận tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu lá Trà hoa vàng Hakoda của DĐVN, góp phần vào công tác kiểm tra phát hiện các dược liệu giả, dược liệu kém chất lượng. Kiến nghị - Đề xuất xây dựng chỉ tiêu định lượng thành phần chính, đặc trưng của lá trà hoa vàng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao góp phần đánh giá chính xác hàm lượng hóa chất thực vật hữu ích có trong lá trà hoa vàng - Đề xuất tiếp tục nghiên cứu và nâng cao bộ tiêu chuẩn dược liệu, cập nhật và sửa đổi phù hợp với sự phát triển của khoa học kỹ thuật. 34
44. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT: [1] Trần Ninh và Hakoda Naotoshi (2010), Các loài trà ở vườn Quốc Gia Tam Đảo, NXB VHTT. [2]. Bộ Y tế (2018), "Dược điển Việt Nam, tập V", NXB Y học [3]. Trần Thị Thu Hà, Vũ Thị Luận (2016), “Nghiên cứu hiện trạng phân bố và đặc điểm tái sinh tự nhiên của Trà hoa vàng Hakoda (Camellia hakodae Ninh, Tr.) tại Vườn Quốc gia Tam Đảo, huyện Đại Từ, huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên”. [4]. Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9745-1:2013 (ISO 14502-1:2005), “Chè - xác định các chất đặc trưng của chè xanh và chè đen - phần 1: hàm lượng polyphenol tổng số trong chè - phương pháp đo màu dùng thuốc thử Folin-Ciocalteu”. [5]. Viện Dược liệu (2006), “Cây thuốc và động vật làm thuốc Việt Nam”, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật [6]. Nguyễn Thị Phương (tháng 12/2014), “Thành phần hóa học, tác dụng sinh học chủ yếu của Trà hoa vàng và khả năng ứng dụng trong Y-Dược học”, Hội thảo Bảo tồn và Phát triển bền vững Trà hoa vàng tại Tam Đảo lần thứ nhất [7]. Bùi Đình Nhạ ( 2016), “ Nghiên cứu nhân giống Trà hoa vàng Camellia hakodae Ninh) bằng phương pháp giâm hom”, Luận văn Thạc sĩ Nông nghiệp. [8] Trần Thị Thơm, “Chiết xuất, phân lập một số hợp chất trong lá trà hoa vàng Cúc Phương (Camellia cucphuongensin Ninh & Rossmann)”, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học, Đại học Quốc gia Hà Nội, Việt Nam, (2019). [9] Bảo chi (2019), “Người đầu tiên sản xuất trà hoa vàng túi lọc ở Việt Nam”, Cổng thông tin giao tiếp điện tử tỉnh Vĩnh Phúc. [10]. Nguyễn Đức Tùng (2019), “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và khả năng chống oxy hóa in vitro của lá Trà hoa vàng Các Phương (Camellia cucphuongensis & Rosmann”, Luận văn Thạc sĩ Dược học, Đại học Dược Hà Nội. [11]. Trần Thị Mai (2020), “Nghiên cứu thành phần hóa học của lá Trà hoa vàng Camellia chrysantha (Hu) Tuyama thu hái tại Thái Nguyên”, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học, Đại học Dược Hà Nội, Việt Nam. [12]. Nguyễn Thị Hà Ly (2016), “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của Trà hoa vàng ở Thái Nguyên”, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội.
45. TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI [13]. Le TC (2012), “Research on ecological characteristics and cutting propagation for Camellia tienii Ninh in Tamdao National park. Master Thesis”, Vietnam Forestry University. [14]. Armen Takhtajan (2009), Flowering plant, Spinger Netherlands. [15]. Tran VD (2018), “Overview of golden camellias in Cao Bang. Scientific Report. Silviculture Research Institute”, Vietnamese Academy of Forest Sciences, Hanoi, Vietnam. [16]. Vogt KA, Vogt DJ, Palmiotto PA, Boon P, Ohara J, Asbjornsen H (1996), “Review of root dynamics in forest ecosystems grouped by climate, climatic forest type and species”, Plant and Soil;187:59–219. [17]. Tran Duc Manh, Nguyen Toan Thang, Hoang Thanh Son, Dang Van Thuyet, Phung Dinh Trung, Nguyen Van Tuan, Dao Trung Duc, Mai Thi Linh, Vu Tien Lam, Nguyen Huu Thinh, Nguyen Thi Thu Phuong và Tran Van Do (2017), “Golden Camellias: A Review’’, Archives of Current Research International, 16(2): 1-8, 2019; Article no.ACRI.46837, ISSN: 2454-7077. [18]. Douglas AB, et al (1997), "The Chemistry of Tea Flavonoids", Critical Reviews in Food Science and Nutrition; 37 (38), pp. 693-704. [19]. Lin JN, et al (2013), "Chemical Constituents and Anticancer Activity of Yellow Camellias against MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells ", Journal of Agricultural and Food Chemistry; 61, pp. 9638−9644. [20]. Wang B, et al (2018), "Essential oils and ethanol extract from Camellia nitidissima and evaluation of their biological activity", Journal of Food Science and Technology; 55 (12), pp. 5075-5081. [21]. Wei JB, et al (2015), "Characterization and determination of antioxidant components in the leaves of Camellia chrysantha (Hu) Tuyama based on composition activity relationship approach", Journal of food and drug analysis; 23 (1), pp. 40-48. [22]. Yong Ye, Ya Guo and Yue Ting (2012), “Anti-Inflammatory and Analgesic Activities of a Novel Biflavonoid from Shells of Camellia oleifera”, Internationl Journal of Molecular Sciences, doi: 10.3390/ijms131012401
46. [23]. Chen IJ, et al (2016), "Therapeutic effect of high-dose green tea extract on weight reduction: A randomized, double-blind, placebo-controlled clinical trial.", Clinical Nutrition; 35 (3), pp. 592-599. [24]. Guangxi Institute of Botany(1991), “Guangxi Flora.Guangxi Science and Technology Press”, Nanning. [25]. George Orel and Peter G. Wilson (2010), "Camellia luteocerata sp. nov. and a new section of (Dalatia) from Vietnam", Nordic Journal of Botany, 28: 280-284. [26]. Qin XM, Lin HJ, Ning EC, Lu W (2008), “ Antioxidative properties of extracts from the leaves of Camellia chrysantha (Hu) Tuyama”, Food Science and Technology; 2008; 2:189e91. [27]. Pereira CG, Barreira L, Bijttebier S, Pieters L, Neves V, Rodrigues MJ, Rivas R, Varela J, Custodio L (2017), “Chemical profiling of infusions and decoctions of Helichrysum italicumsub sp. picardii by UHPLC-PDAMS and in vitro biological activities comparatively with green tea (Camellia sinensis) and rooibos tisane (Aspalathus linearis)”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis;145:295–603. [28]. Huang YL, Chen YY, Wen YX, Li DP, Liang RG, Wei X (2009), “ Effects of the extracts from Camellia nitidssimas leaves on blood lipids”, Lishizhen Medicine and Materia Medica Research;4:5. [29]. He D, Wang X, Zhang P, Luo X, Li X, Wang L, Li S, Xu S (2015), “Evaluation of the anxiolytic and antidepressant activities of the aqueous extract from Camellia euphlebia Merr. ex Sealy in Mice”, Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine; Article ID 618409. [30]. Wan CP, Yu YY, Zhou SR, Cao SW (2013), “Antioxidant and free radical scavenging activity of Camellia nitidissima Chi”, Asian Journal of Chemistry;23:2893–2897. [31]. Lin JL, Lin HY, Yang NS, Li YH, Lee MR, Chuang CH, Ho CT, Kuo SC, Way TD (2013), “Chemical constituents and anticancer activity of yellow camellias against MDAMB-231 human breast cancer cells”, Journal of Agricultural and Food Chemistry;61:9638–9644. [32] Ninh Tr, Le Nguyet Hai Ninh (2013), “The Yellow Camellias of the Tam Dao National Park”.
47. [33]. Dongye He, Xiaoyu Li, Xuan Sai, Lili Wang (2017), “Camellia nitidissima C.W. Chi: a review of botany”, chemistry, and pharmacology”, Springer Nature [34]. Lawrance Peter Wright (2005), “Biochemical analysis for identification of quality in balck tea (Camellia sinensis)”, Doctoral Thesis, University of Pretoria, South Africa. [35]. Wei JB, et al (2015), "Characterization and determination of antioxidant components in the leaves of Camellia chrysantha (Hu) Tuyama based on compositioneactivity relationship approach", Journal of food and drug analysis; 23 (1), pp.40-48 [36]. Nguyen T. Tuyen, Tran Van Hieu, Pham G. Dien, Tran Ninh, Nguyen T. Hung, and Vu D. Hoang (2019), “A New Sexangularetin Derivative From Camellia hakodae”, Natural Product Communications, Volume 14(9): 1–4. [37]. Qin XM, Lin HJ, Ning EC, et al (2008), “Antioxidative properties of extracts from the leaves of Camellia chrysantha (Hu) Tuyama”, Food Sci Technol;2:189 e91. [38]. Song, L.; Wang, X.; Zheng, X.; Huang, D. (2011), “Polyphenolic antioxidant profiles of yellow camellia”, Food Chem; 129, 351-357. [39]. Wang Z. (2006), "The Inhibitive Effect of Camellia chrysantha (Hu) Tuyama and Ginkgo biloba leaves on Hepatocarcinogenesis in vivo and vitro", Master's thesis, Guangxi Medical University., pp. [40]. Chen Hongjuan (2018), “Analysis of polyphenol compounds in Camellia sinensis based on UPLC-ESI-TripleTOF MS [C]”, Summary of the 11th China Life Science Public Platform Development and Management Conference, Pharmaceutical Biotechnology Laboratory, Nanjing University. [41]. Li-na JIANG, Ji-yuan LI, Zheng-qi Fan, Ran TONG, Run-hong MO, Zhi-hui LI, Chang-jie JIANG (2020), “Content Analysis of Polyphenols in Flowers of Yellow Camellia[J]”, Forest Research,, 33(4): 117-126. [42]. Nguyen T. Tuyen, Tran V.Hieu, Pham G. Dien, Tran Ninh, Nguyen T. Hung, and Vu D. Hoang (2019); “A New Sexangularetin Derivative From Camellia hakodae”, Natural Product Communications, The Author(s). [43]. Wang B, et al (2018), "Essential oils and ethanol extract from Camellia nitidissima and evaluation of their biological activity", Journal of Food Science and Technology; 55 (12), pp. 5075-5081.
48. [44]. Le NNH, Uematsu C, Katayama H, Nguyen LT, Tran N, Luong DV, Hoang TS (2017), “Camellia tuyenquangensis (Theaceae), a new species from Vietnam”, Korean Journal of Plant Toxonomy;47:95−99.