›

Khóa luận Sàng lọc in silico các hợp chất flavonoid có tác dụng ức chế enzym chuyển angiotensin định hướng điều trị tăng huyết áp

pdf 66 trang thiennha21 18/04/2022 2940
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Sàng lọc in silico các hợp chất flavonoid có tác dụng ức chế enzym chuyển angiotensin định hướng điều trị tăng huyết áp", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_sang_loc_in_silico_cac_hop_chat_flavonoid_co_tac_d.pdf

Nội dung text: Khóa luận Sàng lọc in silico các hợp chất flavonoid có tác dụng ức chế enzym chuyển angiotensin định hướng điều trị tăng huyết áp

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CAO THỊ XUÂN QUỲNH SÀNG LỌC IN SILICO CÁC HỢP CHẤT FLAVONOID CÓ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM CHUYỂN ANGIOTENSIN ĐỊNH HƯỚNG ĐIỀU TRỊ TĂNG HUYẾT ÁP KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2021
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC Người thực hiện: Cao Thị Xuân Quỳnh SÀNG LỌC IN SILICO CÁC HỢP CHẤT FLAVONOID CÓ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM CHUYỂN ANGIOTENSIN ĐỊNH HƯỚNG ĐIỀU TRỊ TĂNG HUYẾT ÁP KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa : QH.2016.Y Người hướng dẫn : PGS.TS. Bùi Thanh Tùng PGS.TS. Vũ Mạnh Hùng Hà Nội - 2021
  3. LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS. Bùi Thanh Tùng, Trưởng bộ môn Dược lý- Dược lâm sàng, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và PGS.TS. Vũ Mạnh Hùng công tác tại Học viện Quân y là hai người thầy đã tận tình chỉ bảo, động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn em Tạ Thị Thu Hằng, sinh viên lớp K62 Dược học, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Bên cạnh đó, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới lãnh đạo, thầy cô Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi được học tập, nghiên cứu, rèn luyện tại đây trong suốt 5 năm qua và thực hiện đề tài này. Sau cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, anh chị em và bạn bè luôn sát cánh, đồng hành, ủng hộ, động viên tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu hoàn thành khóa luận. Mặc dù đã có nhiều cố gắng, song với kiến thức, kỹ năng và thời gian còn hạn chế, luận văn của tôi khó tránh khỏi những thiếu sót. Tôi rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của các thầy cô để khóa luận của tôi được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn. Hà Nội, ngày 24 tháng 5 năm 2021 Sinh viên Cao Thị Xuân Quỳnh
  4. DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT THA Tăng huyết áp ACE Angiotensin converting enzyme Men chuyển angiotensin GBD The Global Burden of Disease Gánh nặng bệnh tất toàn cầu BMI Body mass index Chỉ số khối cơ thể GPCRs G protein-coupled receptors Thụ thể bắt cặp với G-protein RAA Hệ renin-angiotensin-aldosteron Arg Arginine Ser Serine His Histidin Gln Glutamine Val Valin Glu Glutamate Lys Lysine Tyr Tyrosine Ala Alanin Asp Axit aspartic Phe Phenylalanin Trp Tryptophan Leu Leucin Met Methionin Pro Proline ACEi Angiotensin converting enzyme Chất ức chế men chuyển inhibitor angiotensin AngII Angiotensin II SBVS Structure-based virtual screening Sàng lọc ảo dựa trên cấu trúc NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân ADMET Absorption, Distribution, Hấp thu, Phân bố, Chuyển hóa, Metabolism, Excretion, Toxicity Thải trừ, Độc tính CSDL Cơ sở dữ liệu RMSD Root mean square deviation Độ lệch bình phương trung bình MW Molecular weight Trọng lượng phân tử HBD Hydro bond donor Nhóm cho liên kết hydro HBA Hydro bond acceptor Nhóm nhận liên kết hydro HATT Huyết áp tâm thu LD50 Lethal dose 50% Liều gây chết trung bình
  5. DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1. Hệ renin- angiotensin- aldosteron. 6 Hình 1.2. Cấu trúc chính của sACE và tACE 8 Hình 1.3. Cấu trúc 3D của tACE 9 Hình 1.4. Biểu diễn liên kết của lisinopril với ACE tại vị trí hoạt động 9 Hình 1.5. Các phân nhóm chính của flavonoid 12 Hình 2.1. Cấu trúc 3D của enzym 1O86 được tải về từ CSDL Protein Data Bank. 17 Hình 2.2. Minh họa quá trình re-dock lisinopril đồng kết tinh. 19 Hình 2.3. Thực hiện dự đoán tính giống thuốc và các thông số ADMET bằng công cụ trực tuyến pkCSM. 21 Hình 3.1. Minh họa quá trình sàng lọc in silico. 22 Hình 3.2. RMSD của lisinopril đồng kết tinh trước và sau khi re-dock. 23 Hình 3.3. Minh họa hai chiều các tương tác của lisinopril tại vị trí hoạt động. 23 Hình 3.4. Tương tác của 5 hợp chất với ACE. 30
  6. DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Phân độ tăng huyết áp theo mức huyết áp đo tại phòng khám. 3 Bảng 3.1. Kết quả mô phỏng docking 24 Bảng 3.2. Kết quả các thông số quy tắc 5 Lipinski. 26 Bảng 3.3. Kết quả phân tích các đặc tính hấp thu, phân bố và chuyển hóa. 27 Bảng 3.4. Kết quả phân tích các đặc tính thải trừ và độc tính. 28 Bảng 3.5. Kết quả phân tích mô phỏng docking. 31
  7. MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH VẼ DANH MỤC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về bệnh tăng huyết áp 3 1.1.1. Bệnh tăng huyết áp 3 1.1.2. Điều trị tăng huyết áp 5 1.2. Tổng quan về enzym chuyển angiotensin (ACE) 6 1.2.1. Sơ lược về hệ Renin-angiotensin-aldosteron và ACE 6 1.2.2. Trung tâm hoạt động của ACE 8 1.2.3. Một số chất ức chế ACE (ACEi) 10 1.3. Tổng quan về nhóm hợp chất flavonoid 11 1.4. Tổng quan về nghiên cứu in silico 13 1.4.1. Docking phân tử 13 1.4.2. Quy tắc Lipinski về các hợp chất giống thuốc 15 1.4.3. Dự đoán ADMET các thông số dược động học và độc tính 15 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1. Nguyên liệu và thiết bị 17 2.2. Nội dung nghiên cứu 18 2.3. Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1. Sàng lọc bằng docking phân tử 18 2.3.2. Nghiên cứu các đặc điểm giống thuốc 20 2.3.3. Nghiên cứu các đặc tính dược động học và độc tính (ADMET) 21
  8. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 22 3.1. Mô phỏng protein docking 22 3.1.1. Đánh giá quy trình docking 22 3.1.2. Tìm kiếm các chất tiềm năng từ kết quả docking 23 3.2. Sàng lọc các hợp chất giống thuốc 25 3.3. Dự đoán các thông số ADMET 27 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 32 4.1. Về kết quả 32 4.1.1. Rotenone (ID: 6758) 32 4.1.2. Amorphigenin (ID: 92207) 33 4.1.4. Apigenin (ID: 5280443) 34 4.1.5. Hesperitin (ID: 72281) 34 4.2. Về phương pháp 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
  9. ĐẶT VẤN ĐỀ Tăng huyết áp (THA) là một thách thức lớn đối với sức khỏe cộng đồng do tỷ lệ mắc bệnh cao và có mối liên quan mật thiết với các bệnh tim mạch, bên cạnh sự phức tạp trong sinh lý bệnh và cơ chế bệnh sinh. Theo thống kê năm 2015 của Tổ chức Y tế thế giới, có khoảng 1,13 tỷ người mắc cao huyết áp, trong đó đa số không biết mình mắc bệnh. Tỷ lệ (THA) cao nhất ở những người trên 18 tuổi là ở các nước có thu nhập thấp (28,4%) và các nước có thu nhập trung bình (25,5%). Tỉ lệ mắc ở nam giới (25%) lớn hơn so với nữ giới (20%) [72] . Tăng huyết áp là một yếu tố nguy cơ hàng đầu của các bệnh tim mạch, bao gồm bệnh mạch vành, suy tim, bệnh thận mãn tính, đột quỵ, đau tim và sa sút trí tuệ. Trong năm 2015, có khoảng 10 triệu người tử vong do THA, trong đó 4,9 triệu trường hợp là do bệnh mạch vành và 3,5 triệu trường hợp do đột quỵ [1] . Tại Việt Nam, tỉ lệ chung của tăng huyết áp là 21,1% dựa trên 10 nghiên cứu được công bố từ năm 2005 đến 2018 và 18,4% dựa trên ba cuộc điều tra trên toàn quốc [50] . Khi nghiên cứu trên nhóm người ở độ tuổi 40 đến 69, chỉ có 67,3% tổng số người biết mình mắc cao huyết áp, trong đó số người được điều trị chiếm 33,2% và chỉ 12,2% được kiểm soát tăng huyết áp hiệu quả [33] . Điều đó cho thấy tỉ lệ mắc cao huyết áp ở Việt Nam khá cao trong khi tỉ lệ được điều trị và điều trị có hiệu quả còn thấp. Hệ renin-angiotensin-aldosteron là đích đến quan trọng trong việc điều trị tăng huyết áp. Angiotensin I được phân cắt từ angiotensinogen bằng renin khi huyết áp giảm, sau đó chuyển thành peptide ở dạng hoạt động là angiotensin II nhờ tác dụng của enzym chuyển angiotensin (ACE), làm tăng huyết áp theo nhiều cơ chế khác nhau [22] . Nhiều dược chất đã được phát triển với mục tiêu tác dụng trên hệ thống này, điển hình là các thuốc ức chế ACE như captopril, lisinopril, ramipril được coi như liệu pháp điều trị khởi đầu cho bệnh nhân tăng huyết áp. Bên cạnh những tác dụng có lợi trên hệ tim mạch, các thuốc ức chế men chuyển (ACEi) cũng được chứng minh một số tác dụng không mong muốn khi sử dụng lâu ngày như tăng nồng độ kali máu, ho, phù mạch và chống chỉ định cho phụ nữ có thai [53] . Vì vậy, nhiều nghiên cứu được thực hiện trên các hợp chất từ tự nhiên sàng lọc các ứng cử viên tiềm năng trở thành thuốc hoặc có tác dụng hỗ trợ điều trị tăng huyết áp. Trong số các hợp chất chiết xuất từ thực vật, flavonoid là một nhóm lớn, xuất hiện ở hầu khắp các loài, được cho là có nhiều tác dụng tốt cho cho sức khỏe như chống oxi hóa, chống nhiễm trùng, ức chế khối u, giảm nguy cơ xơ vữa mạch 1
  10. vành [74] . Gần đây, có nhiều nghiên cứu đã cho thấy tiềm năng của flavonoid trong điều trị tăng huyết áp, đặc biệt là tác dụng ức chế enzym chuyển angiotensin [19] . Tuy nhiên, các nghiên cứu tập trung thực hiện in vitro, chưa nhiều nghiên cứu cụ thể về tương tác ở cấp độ phân tử của các hợp chất flavonoid với ACE để giải thích rõ hơn cơ chế ức chế enzym. Trên cơ sở đó, đề tài “Sàng lọc in silico các hợp chất flavonoid có tác dụng ức chế enzym chuyển angiotensin định hướng điều trị tăng huyết áp” được tiến hành với 2 mục tiêu chính: 1. Sàng lọc các hợp chất flavonoid có tác dụng ức chế enzym chuyển angiotensin bằng phương pháp docking phân tử. 2. Dự đoán tính giống thuốc, các thông số dược động học và độc tính của các hợp chất tốt nhất thu được sau quá trình sàng lọc. 2
  11. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về bệnh tăng huyết áp 1.1.1. Bệnh tăng huyết áp Theo Hội Tim mạch học quốc gia Việt Nam và Phân hội Tăng huyết áp: Tăng huyết áp là tình trạng bệnh lý có huyết áp tâm thu ≥ 140 mmHg và/hoặc huyết áp tâm trương ≥ 90 mmHg khi đo tại phòng khám. Chẩn đoán xác định tăng huyết áp sau khi đo chính xác huyết áp tại phòng khám và huyết áp ngoài phòng khám (huyết áp tại nhà và huyết áp liên tục), bao gồm cả việc khai thác tiền sử cá nhân và tiền sử gia đình, khám thực thể và các xét nghiệm cận lâm sàng nhằm xác định nguyên nhân THA thứ phát hay THA tiên phát, đánh giá các yếu tố nguy cơ tim mạch, tổn thương cơ quan đích, và bệnh cảnh lâm sàng đi kèm để phân tầng nguy cơ [70] . Phân độ THA được thể hiện ở bảng 1.1. Bảng 1.1. Phân độ tăng huyết áp theo mức huyết áp đo tại phòng khám. HA tâm thu HA tâm trương (mmHg) (mmHg) Tối ưu <120 và <80 Bình thường 120-129 và/hoặc 80-84 Bình thường cao 130-139 và/hoặc 85-89 THA độ 1 140-159 và/hoặc 90-99 THA độ 2 160-179 và/hoặc 100-109 THA độ 3 ≥180 và/hoặc ≥110 THA tâm thu đơn độc ≥140 và <90 Theo thống kê ở Hoa Kỳ năm 2007-2010, có 81,5% trường hợp biết mình mắc tăng huyết áp và chỉ có 52,5% kiểm soát được bệnh. Phần lớn tăng huyết áp ở người trưởng thành là không rõ nguyên nhân (tăng huyết áp nguyên phát), chỉ có khoảng 10% là có nguyên nhân (tăng huyết áp thứ phát) có thể kể đến là: Bệnh thận cấp hoặc mạn tính (viêm cầu thận cấp/mạn, viên thận kẽ, sỏi thận, thận đa nang, thận ứ nước, suy thận); Hẹp động mạch thận; U tủy thượng thận 3
  12. (Pheocromocytome); Cường Aldosterone tiên phát (Hội chứng Conn); Hội chứng Cushing’s; Bệnh lý tuyến giáp/cận giáp, tuyến yên; Do thuốc, liên quan đến thuốc (kháng viêm non-steroid, thuốc tránh thai, corticoid, cam thảo, hoạt chất giống giao cảm trong thuốc cảm/thuốc nhỏ mũi ); Hẹp eo động mạch chủ; Bệnh Takayasu; Nhiễm độc thai nghén; Ngừng thở khi ngủ; Yếu tố tâm thần [1] . Một số yếu tố nguy cơ trong tăng huyết áp cũng được đề cập như: Thừa cân, béo phì, chế độ ăn quá nhiều muối, hút thuốc, uống rượu bia, ít vận động, tuổi cao, căng thẳng [4, 15] . Điều đó cho thấy những đối tượng này cần tầm soát nguy cơ tăng huyết áp sớm để được chẩn đoán sớm và có kế hoạch theo dõi và điều trị phù hợp. Theo báo cáo của Gánh nặng bệnh tật toàn cầu năm 2010 (GBD 2010), cao huyết áp trở thành yếu tố nguy cơ hàng đầu của các bệnh tim mạch và tỷ lệ tử vong trên thế giới với khoảng 7,6 triệu ca tử vong mỗi năm (chiếm 13,5% tổng số) [44] . Tại Việt Nam, theo thống kê của Hội Tim mạch học quốc gia Việt Nam và Phân hội Tăng huyết áp, năm 2000 có khoảng 16,3% người lớn bị THA, đến năm 2009 tỷ lệ THA ở người lớn là 25,4% và năm 2016 tỷ lệ người lớn bị THA đang ở mức báo động là 48%. Đặc biệt, trong những người bị tăng huyết áp, có 39,1% (8,1 triệu người) không được phát hiện bị tăng huyết áp; có 7,2% (0,9 triệu người) bị tăng huyết áp không được điều trị; có 69,0% (8,1 triệu người) bị tăng huyết áp chưa kiểm soát được (theo báo cáo của GS.TS Nguyễn Lân Việt, Chủ tịch Hội Tim mạch học Việt Nam tại Hội nghị Tăng huyết áp Việt Nam năm 2016). Trên điện tâm đồ hoặc siêu âm tim, có thể đánh giá tình trạng phì đại thất trái, dày thành động mạch cảnh (độ dày > 0,9 mm) hoặc mảng xơ vữa để phân loại chính xác nhóm nguy cơ của bệnh nhân tăng huyết áp [39] . Nghiên cứu dịch tễ học cho thấy phì đại thất trái làm nguy cơ xuất hiện suy mạch vành tăng gấp 3, suy tim gấp 5, tai biến gấp 6 lần; phì đại thất trái có kèm loạn nhịp tim, nhất là nhịp thất (rung thất, ngoại tâm thu thất) nguy cơ đột tử tăng 5-6 lần. Các động mạch não rất dễ bị tổn thương do bệnh tăng huyết áp, các động mạch dày ra, mất độ đàn hồi, biến dạng và dễ làm thành các túi phồng nhỏ, có nguy cơ bị vỡ khi xảy ra cơn tăng huyết áp kịch phát hoặc khi huyết áp tăng rất cao và kéo dài. Cơn THA kịch phát quá cao còn có thể gây phù não và các tổn thương vi thể khác làm ảnh hưởng đến hoạt động của não. Nhiều nghiên cứu cho thấy tăng huyết áp là yếu tố nguy cơ chiếm tần suất cao nhất trong đột quỵ [3] . Ngoài ra, tăng huyết áp còn dẫn đến một số tổn thương cơ quan đích khác như: bệnh mạch máu ngoại vi, bệnh thận (protein niệu, suy giảm chức năng thận, bệnh thận mạn, suy thận ), bệnh về mắt (xuất huyết hoặc xuất tiết võng mạc, phù gai thị ) [18, 52] . 4
  13. 1.1.2. Điều trị tăng huyết áp Tăng huyết áp là bệnh mạn tính nên cần theo dõi đều, điều trị đúng và đủ hàng ngày, điều trị lâu dài, điều trị tích cực ở bệnh nhân có tổn thương cơ quan đích. Mục tiêu điều trị là đạt “huyết áp mục tiêu” (< 140/90 mmHg và thấp hơn nữa nếu người bệnh vẫn dung nạp được) và giảm tối đa “nguy cơ tim mạch” [1] . Người bệnh tăng huyết áp trước hết cần thay đổi lối sống để ngăn ngừa tiến triển bệnh và giảm lượng thuốc cần dùng. Lượng muối ăn được khuyên dùng ít hơn 5 g/ngày, cùng với chế độ ăn bổ sung kali (ngoại trừ mắc bệnh thận mạn hoặc nguyên nhân khác gây tăng kali máu), hạn chế thức ăn có nhiều cholesteron và acid béo no. Người bệnh cần hạn chế uống rượu, bia (ít hơn 14 cốc chuẩn/tuần đối với nam, ít hơn 9 cốc chuẩn/tuần đối với nữ), ngừng hút thuốc lá, thuốc lào bên cạnh việc tăng cường hoạt động thể lực hợp lý (30 phút/ngày), tránh âu lo, căng thẳng thần kinh và duy trì cân nặng lý tưởng (BMI từ 18,5 đến 22,9 kg/m2) [2, 65] . Đối với điều trị tăng huyết áp bằng thuốc theo cá nhân hóa: - Tăng huyết áp độ I với nguy cơ thấp: có thể lựa chọn một thuốc trong số các nhóm: lợi tiểu thiazide liều thấp; ức chế men chuyển; chẹn kênh canxi loại tác dụng kéo dài; chẹn β giao cảm (nếu không có chống chỉ định). - Tăng huyết áp từ độ 1 với nguy cơ trung bình, cao, rất cao hoặc độ II, III: nên phối hợp 2 loại thuốc (lợi tiểu, chẹn kênh canxi, ức chế men chuyển, chẹn thụ thể angiotensin, chẹn β giao cảm. - Nếu chưa đạt huyết áp mục tiêu, cần điều chỉnh liều tối ưu hoặc từng bước phối hợp từ liều thấp các thuốc hạ huyết áp: + Phối hợp 2 thuốc: ức chế men chuyển/chẹn thụ thể angiotensin phối hợp với chẹn kênh canxi hoặc lợi tiểu. + Phối hợp 3 thuốc: ức chế men chuyển/chẹn thụ thể angiotensin phối hợp với chẹn kênh canxi và lợi tiểu. + Phối hợp 4 thuốc (Tăng huyết áp kháng trị): Thêm kháng aldosteron hoặc lợi tiểu khác, chẹn α hoặc chẹn β. - Đối với tăng huyết áp có chỉ định điều trị bắt buộc: + Bệnh mạch vành: Chẹn β + ức chế men chuyển/chẹn thụ thể angiotensin, chẹn kênh canxi. 5
  14. + Suy tim: ức chế men chuyển/chẹn thụ thể angiotensin + chẹn β + kháng aldosteron, lợi tiểu quai khi ứ dịch. + Đột quỵ: ức chế men chuyển + lợi tiểu. + Bệnh thận mạn, đái tháo đường: ức chế men chuyển/chẹn thụ thể angiotensin + lợi tiểu/chẹn kênh canxi [67, 70] . 1.2. Tổng quan về enzym chuyển angiotensin (ACE) 1.2.1. Sơ lược về hệ Renin-angiotensin-aldosteron và ACE Hệ renin-angiotensin-aldosteron (hình 1.1) góp phần đáng kể trong sinh lý bệnh của tình trạng tăng huyết áp, chủ yếu thông qua đặc tính co mạch của angiotensin II và đặc tính giữ natri của aldosterone. Khi huyết áp giảm, renin được giải phóng vào máu, gặp và phân cắt angiotensinogen thành angiotensin I, một decapeptide không hoạt động. Angiotensin I lưu hành trong máu đến phổi, bị enzym chuyển angiotensin ở phổi phân cắt thành octapeptide hoạt động, angiotensin II, bằng cách giải phóng dipeptide histidyl-leucine ở đầu C. Angiotensin II gắn kết với hai thụ thể có lộ trình thông qua GPCRs là AT1 và AT2 ở mô gan, thận và thượng thận gây co mạch, tăng hoạt động của hệ giao cảm (tăng nhịp tim, tăng tuần hoàn, tăng huyết áp) và kích thích tuyến thượng thận tiết aldosteron gây giữ natri. Natri tăng trong tế bào, làm cơ trong thành mạch đáp ứng mạnh hơn với các kích thích của giao cảm. Do đó, khi có một tác nhân làm tăng huyết áp thì theo thời gian, nhiều tác nhân khác sẽ cùng tham gia [36, 42] . Hình 1.1. Hệ renin- angiotensin- aldosteron. 6
  15. Gần đây, các nghiên cứu cho thấy angiotensinogen, renin và angiotensin II cũng được tổng hợp cục bộ tại nhiều mô, bao gồm não, tuyến yên, động mạch chủ, động mạch, tim, tuyến thượng thận, thận, tế bào mỡ, bạch cầu, buồng trứng, tinh hoàn, tử cung, lá lách và da. Hệ RAA ở các mô có khả năng điều hòa trương lực máu tại chỗ nên có vai trò lớn trong huyết áp. Hiểu biết về hệ RAA được mở rộng với một số thành phần mới và các con đường khác để tổng hợp angiotensin II, tạo cơ sở cho các kết quả về sinh lý bệnh trong các bệnh tim mạch và thận [36, 42] . Angiotensin II là peptide angiotensin hoạt động nhất, các tác dụng chính trên hệ tim mạch bao gồm: đáp ứng tăng áp nhanh, đáp ứng tăng áp chậm, sự phì đại và tái cấu trúc tế bào tim và mạch. Sự gia tăng vừa phải nồng độ angiotensin II trong huyết tương vẫn có thể làm tăng huyết áp đáng kể. Nếu tính theo nồng độ hiệu dụng, angiotensin II mạnh hơn norepinephrin khoảng 40 lần. EC50 của angiotensin II để làm tăng huyết áp một cách mạnh mẽ vào khoảng 0,3 nM. Khi tiêm angiotensin II vào tĩnh mạch, huyết áp toàn thân bắt đầu tăng trong vài giây, đạt đỉnh nhanh chóng và trở lại bình thường trong vòng vài phút. Angiotensin II cũng có thể gây ra các đáp ứng chậm giúp ổn định áp suất máu động mạch trong thời gian dài, có thể cần nhiều ngày để đạt hiệu quả tối đa. Hiện tượng đáp ứng chậm này có nền tảng từ sự giảm chức năng bài tiết của thận do angiotensin II làm co trực tiếp mạch máu thận, tăng trương lực giao cảm của thận. Ngoài ra, khi đề cập sâu hơn về tác dụng làm tăng huyết áp động mạch, angiotensin II được cho là tác nhân kích hoạt hiện tượng tái cấu trúc hệ tim mạch, gây phì đại tế bào mạch máu và tế bào tim, tăng sự tổng hợp và lắng đọng collagen bởi các nguyên bào sợi cơ tim. Vì vậy, việc giảm nồng độ angiotensin II trong máu là một hướng đi quan trọng trong việc điều trị tăng huyết áp và hạn chế các tổn thương cơ quan đích [42] . ACE đóng vai trò trung tâm trong hệ RAA điều chỉnh huyết áp, cân bằng nội môi chất lỏng, chức năng thận và mạch máu. ACE là một metalloenzyme phụ thuộc kẽm tìm thấy chủ yếu trong mô, thủy phân peptit bằng cách loại bỏ một dipeptit khỏi đầu tận cùng C. ACE trong cơ thể được giải phóng khỏi bề mặt tế bào nội mô nhờ tác động của ACE-secretase phân cắt liên kết peptit Arg1203-Ser1204 gần vùng xuyên màng, đến gắn với màng và gây tác dụng tại chỗ thông qua những tế bào biểu bì và tế bào nội mạc mạch máu. Một thể khác là ACE huyết tương có thể hòa tan, tuần hoàn trong huyết tương và những dịch khác của cơ thể, tuy nhiên tác dụng sinh lý chưa được biết rõ [5, 7, 20] . Enzym này bên cạnh tác dụng chuyển angiotensin I thành angiotensin II còn có khả năng bất hoạt bradykinin, một chất gây giãn mạch 7
  16. và hạ huyết áp. Gen mã hóa ACE có hiện tượng đột biến thêm/bớt đa hình ở intron 16. Điều này giải thích tại sao có đến 47% trường hợp có sự khác nhau về biểu hiện kiểu hình của ACE trong huyết thanh. Sự mất allele có liên quan đến hiện tượng gia tăng nồng độ ACE trong huyết thanh và tăng chuyển hóa bradykinin có thể là một yếu tố nguy cơ đối với các rối loạn tăng huyết áp, phì đại cơ tim, xơ vữa mạch máu và tiểu đường do bệnh lý thận [71] . 1.2.2. Trung tâm hoạt động của ACE Enzym chuyển angiotensin được phát hiện bởi Leonard T. Skeggs Jr. vào năm 1956 và đến năm 2002, cấu trúc ACE tinh hoàn người được tìm ra và công bố trên tạp chí Nature bởi R. Natesh và cộng sự. Có hai dạng đồng dạng của ACE: ACE tinh hoàn (tACE) và ACE soma (sACE). tACE (701 axit amin) chỉ có ở tinh hoàn nam giới, trong khi sACE (1277 axit amin) phân bố rộng rãi trong các tế bào khác nhau cũng như các chất lỏng ngoại bào như huyết tương. sACE bao gồm hai miền tương đồng (miền N và miền C) trong khi tACE chỉ có một miền, gần giống với miền C của sACE; cả miền C của sACE và tACE đều có trình tự axit amin gần như giống nhau, ngoại trừ tACE chứa thêm trình tự 36 gốc ở đầu cuối N (Hình 1.2) [55] . tACE (miền C của sACE) phân hủy Ang I thành Ang II thông qua mô típ liên kết Zn2+ HEXXH (vị trí hoạt động), nơi hai histidine (His383 và His387), cùng với glutamate phía dưới (Glu411), tạo thành các phối tử liên kết kẽm, cần thiết cho hoạt tính peptidase. Một phân tử nước được hoạt hóa tạo phức với Zn 2+ đóng vai trò là nucleophile để tấn công nhóm cacbonyl của liên kết peptit mục tiêu. Người ta đã chỉ ra rằng miền C có sự phụ thuộc clorua lớn hơn miền N, cả về khả năng thủy phân cơ chất và liên kết với chất ức chế. Vì vậy, vùng C là vị trí chuyển đổi angiotensin chiếm ưu thế, là mục tiêu để kiểm soát huyết áp và chức năng tim mạch [7, 24] . Hình 1.2. Cấu trúc chính của sACE và tACE 8
  17. Cấu trúc của phức hợp tACE-lisinopril được sử dụng để xác định vị trí hoạt động của phân tử. Cấu trúc của tACE chủ yếu là hình xoắn với 27 vòng xoắn (gần như phân bổ đều ở cả hai miền phụ), 20 vòng xoắn α và bảy vòng xoắn 310 vòng. Cấu trúc β duy nhất, chiếm 4% tổng các dư lượng, xuất hiện dưới dạng sáu sợi tương đối ngắn, hai trong số đó nằm gần vị trí hoạt động. Về tổng thể, ACE có hình dạng ellipsoid với một rãnh trung tâm kéo dài khoảng 30 A˚ vào phân tử và chia protein thành hai 'miền phụ', được bao quanh bởi các xoắn α13, α14, α15, α17 và β4 (Hình 1.3). Hình 1.4. Biểu diễn liên kết của Hình 1.3. Cấu trúc 3D của tACE Protein được chia thành hai phần miền lisinopril với ACE tại vị trí hoạt động. phụ I và II (lam, hồng). Ion kẽm ở vị trí hoạt động và lisinopril (lục, vàng) tương ứng. Hai ion clorua (đỏ). Hoạt tính thủy phân peptide của ACE cũng phụ thuộc vào hai ion clorua. Clorua chủ yếu kích hoạt các vị trí hoạt động của ACE và tăng cường sự liên kết của các cơ chất. Phân tử lisinopril được gắn vào sâu khoảng 10 Å bên trong rãnh hoạt động. Vị trí của các dư lượng tại vị trí hoạt động không thay đổi nhiều khi hình thành phức hợp. Cacboxyalkyl cacboxylat của lisinopril được định vị tốt để liên kết với ion kẽm tại vị trí hoạt động và cung cấp một phối tử phối trí. Vị trí của ba phối tử khác (hai histidine và một axit glutamic) là giống nhau trong cả hai cấu trúc. Nguyên tử oxy thứ hai của cacboxylat này cách nguyên tử kẽm 2,6 Å và tạo ra tương tác liên kết H với Glu384 của mô típ HEXXH. Nhóm phenylpropyl S1 tạo ra các tương tác van der Waals với Val518, và lysyl amin tạo thành liên kết H yếu với Glu162 (nguyên tử OE2, 3,4 Å) tại tiểu vùng S1’ của tACE. Cacboxylat ở đầu C 9
  18. liên kết với Lys511 cũng như Tyr 520 (Hình 1.4). Từ đây có thể kết luận, ion Zn2+ cùng với một số axit amin như His383, His387, Glu411, Lys511, Tyr520 đóng vai trò quan trọng, nhắm vào vị trí này có thể ức chế hoạt tính peptidase của ACE [25, 64] . 1.2.3. Một số chất ức chế ACE (ACEi) Hiện nay, có hơn 10 loại thuốc ức chế men chuyển lưu hành trên thị trường và là liệu pháp đầu tay trong điều trị các bệnh tim mạch, bao gồm tăng huyết áp, suy tim và rối loạn chức năng thất trái. Các chất ức chế ACE được chia thành ba nhóm lớn dựa trên nhóm chức: 1. Thuốc ức chế men chuyển chứa sulfhydryl liên quan đến cấu trúc của captopril. 2. Thuốc ức chế men chuyển chứa carboxyl liên quan đến cấu trúc của enalapril (ví dụ: lisinopril, benazepril, quinapril, moexipril, ramipril, trandolapril, perindopril). 3. Các chất ức chế men chuyển chứa phosphinyl có liên quan đến cấu trúc của fosinopril. Một số chất ức chế men chuyển hiện được sử dụng trên lâm sàng dưới dạng tiền chất ethyl- ester, có sinh khả dụng tốt nhưng không có hoạt tính như mong muốn. Chúng được chuyển đổi thành diacid có hoạt tính bởi các esterase trong cơ thể [30, 59] . Captopril là thuốc ức chế men chuyển đầu tiên được sử dụng trên lâm sàng kể từ năm 1981 bởi hiệu quả điều trị đối với tăng huyết áp và sinh khả dụng đường uống cao (75%). Tuy vậy, captopril (hay D-3-mercapto-2-methylpropanoyl-L- proline) có chứa nhóm sulfhydryl tạo phức chelat với ion Zn2+, gây ra một số tác dụng phụ như mất vị giác và phát ban da. Điều này dẫn đến sự ra đời của hai chất ức chế men chuyển khác không chứa nhóm sulfhydryl là enalaprilat và lisinopril. Cả hai về cơ bản đều có cấu trúc tripeptit với nhóm cacboxyl phối hợp kẽm và một phenylalanin chiếm rãnh S1 trong enzym. Lisinopril là một dẫn xuất của enalaprilat, ưa nước hơn và có ái lực đối với ACE lớn hơn enalaprilat. Các hợp chất sau này đều là các biến thể của ba chất ức chế đầu tiên, với hầu hết sự khác biệt nằm ở các nhóm chức liên kết với kẽm ở và túi S2’ [7, 30, 35] . Tất cả các chất ức chế men chuyển đều ngăn chặn sự chuyển đổi Angl thành Angll và có các chỉ định điều trị, tác dụng không mong muốn và chống chỉ định 10
  19. tương tự nhau. Đa số các thuốc đều hấp thu khá tốt qua đường uống (60-75%), ngoại trừ lisinopril và benazeprilat (khoảng 30%). Fosinopril có tính thân dầu lớn nhất và lisinopril ít nhất. ACE được tìm thấy trong nhiều mô, và ngày càng có nhiều bằng chứng về sự khác biệt về khả năng ức chế ACE ở mô giữa các chất. Hầu hết các chất ức chế men chuyển được thải trừ chủ yếu qua thận và ở mức độ ít hơn qua gan. Lisinopril là chất ức chế men chuyển duy nhất không cần chuyển hóa qua gan trong khi các chất còn lại ở dạng tiền thuốc khi được đưa vào cơ thể và thể hiện hoạt tính cao hơn sau khi được chuyển hóa [59] . Mặc dù được chứng minh có nhiều tác dụng tốt trên hệ tim mạch, các thuốc ức chế men chuyển tồn tại một số tác dụng không mong muốn đáng quan tâm tuy là tần số xuất hiện còn thấp. Một tác dụng phụ thường gặp là ho khan, xuất hiện ở 5– 20% bệnh nhân và có thể dẫn đến việc phải ngừng điều trị [75] . Phù mạch ảnh hưởng đến 0,1–0,5% bệnh nhân và có thể đe dọa tính mạng trong trường hợp phù lưỡi hoặc thanh quản gây ngạt thở [9] . Hai tác dụng không mong muốn trên nhìn chung là do nồng độ bradykinin bị thay đổi [7] . Thuốc ức chế men chuyển còn có thể gây tăng kali huyết ở những người có tiền sử suy thận và/hoặc tiểu đường trước đó, sử dụng đồng thời thuốc lợi tiểu giữ kali và/hoặc thuốc bổ sung kali. Chống chỉ định sử dụng thuốc ức chế men chuyển từ ba tháng giữa trở đi của thai kỳ vì chúng có liên quan đến tăng nguy cơ bệnh lý ở chân, bên cạnh một số các tình trạng bao gồm thiểu ối, thai nhi chậm phát triển trong tử cung, suy thận, loạn sản thận, vô niệu, suy thận và sảy thai. Sử dụng thuốc ức chế men chuyển trong ba tháng đầu của thai kỳ có thể khiến trẻ tăng nguy cơ mắc các dị tật bẩm sinh nặng [12, 49] . Do tầm quan trọng của hệ renin-angiotensin-aldosteron và tỉ lệ ngày càng gia tăng của bệnh tăng huyết áp, các nghiên cứu liên tục được thực hiện để tìm kiếm các hợp chất mới có tiềm năng ức chế sản xuất angiotensin II với hoạt tính tốt hơn và hạn chế được các tác dụng không mong muốn cũng như chống chỉ định nhằm cải thiện hiệu quả điều trị tăng huyết áp trên lâm sàng. 1.3. Tổng quan về nhóm hợp chất flavonoid Flavonoid là nhóm lớn nhất các hợp chất polyphenolic tìm thấy được ở thực vật bậc cao, chủ yếu là các phân tử có trọng lượng thấp, cấu trúc cơ bản là 2-phenyl benzopyrone trong đó cầu nối ba cacbon giữa các nhóm phenyl thường là oxy. Flavonoid được chia thành ba phân nhóm chính: euflavonoid (2- phenylbenzopyrans), isoflavonoid (3-benzopyrans) và neoflavonoid (4- benzopyrans) (Hình 1.5). Trong mỗi nhóm này các flavonoid lại được chia thành 11
  20. các nhóm phụ khác nhau dựa vào sự khác biệt trong cấu tạo của vòng C. Một số phân nhóm flavonoid thường gặp là flavanon, flavon, flavonols, isoflavon, flavanols (flavan-3-ol, flavan-4-ol) và anthocyanidin (tạo màu sắc cho thực vật). Các cấu trúc rất đa dạng của flavonoid thể hiện nhiều chức năng trong hệ thống sinh học. Trong thực vật, flavonoid góp phần thu hút hoặc xua đuổi côn trùng thông qua màu sắc của lá, quả và hoa; bảo vệ cây chống lại các bệnh do nhiễm vi rút, nấm, vi khuẩn và tia cực tím; có mặt trong các nốt sần ở rễ cây họ đậu [21] . Hình 1.3. Các phân nhóm chính của flavonoid (A: euflavonoid, B: iso-flavonoid, C: neo-flavonoid). Flavonoid xuất hiện nhiều trong thực phẩm có nguồn gốc từ thực vật và đã được chứng minh nhiều tác dụng có lợi cho sức khỏe. Tác dụng được biết đến nhiều nhất của flavonoid là chống oxi hóa, làm giảm nguy cơ mắc các bệnh tim, mạch vành, ức chế khối u và làm chậm quá trình lão hóa [74] . Với cấu trúc chứa các nhóm hydroxyl liên kết trực tiếp với vòng thơm có khả năng bắt giữ các gốc tự do, flavonoid được chứng minh là chất chống oxi hóa mạnh hơn vitamin C, vitamin E và carotenoids [23] . Ngoài ra, flavonoid còn cho thấy tác dụng ức chế vi sinh vật, chống viêm nhiễm và có khả năng chống ung thư, với một đại diện là quercetin làm giảm đáng kể tình trạng viêm nhiễm gây ra bởi Helicobacter pylori trong niêm mạc dạ dày của chuột bạch và ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư tuyến tụy [10, 14, 29] . Gần đây, người ta quan tâm và thực hiện nhiều nghiên cứu đối với tác dụng trên hệ tim mạch và tiểu đường của flavonoid, được cho là do khả năng ngăn ngừa sự oxi hóa các lipoprotein tỷ trọng thấp, phòng ngừa xơ vữa động mạch, chặn sự kết tụ huyết khối, điều hòa nhịp tim, ngăn ngừa bệnh mạch vành và nhồi máu cơ tim, điều hòa huyết áp. Flavonoid có khả năng tạo phức với kim loại ở trung tâm hoạt động và có thể ức chế đến 50% hoạt động của enzym chuyển angiotensin trong các nghiên cứu in vitro và in vivo [8, 31] . Vì vậy, ngày càng nhiều hơn các nghiên cứu ở mức độ phân tử được công bố nhằm cung cấp hiểu biết về cơ chế của tương tác flavonoid-protein cũng như sàng lọc ra các hợp chất tiềm năng đáp ứng nhu cầu hỗ trợ điều trị tăng huyết áp. 12
  21. 1.4. Tổng quan về nghiên cứu in silico Thuật ngữ in silico có nguồn gốc từ tiếng Latin, dùng để diễn đạt các công việc được thực hiện trên máy tính thông qua các chương trình giả lập dùng để mô phỏng các quá trình tự nhiên và không đề cập đến các tính toán được thực hiện bởi máy tính nói chung. Sau đó, các nhà khoa học đã nhanh chóng mở rộng và ứng dụng phương pháp này để dự đoán khả năng phát triển một hợp chất cho mục đích y học, bao gồm tác dụng dược lý cũng như tác dụng phụ của chúng trên con người. Một trong các ứng dụng đó là sàng lọc các ứng cử viên tiềm năng trở thành thuốc. Sàng lọc ảo dựa trên cấu trúc (Structure-based virtual screening- SBVS) đang trở thành một công cụ thiết yếu trong việc hỗ trợ phát hiện và tối ưu hóa hợp chất tiềm năng nhanh chóng và tiết kiệm chi phí. Việc áp dụng thiết kế thuốc hợp lý, dựa trên cấu trúc được chứng minh là hiệu quả hơn so với cách phát minh thuốc truyền thống vì nó hướng đến việc hiểu biết cơ sở phân tử của bệnh lý và sử dụng kiến thức về cấu trúc ba chiều của mục tiêu sinh học. SBVS dự đoán các liên kết của hợp chất với protein đích thông qua các phương pháp tính toán và cấu trúc 3D tia X, tia NMR và lựa chọn ra một tập các hợp chất có điểm số tốt hơn điểm ngưỡng làm cơ sở cho các thử nghiệm in vitro và in vivo [45] . 1.4.1. Docking phân tử Docking là một phương pháp dự đoán tư thế liên kết của một phân tử với phân tử thứ hai để tạo thành một phức hợp ổn định với năng lượng liên kết thấp nhất. Docking phân tử là một trong số các phương pháp phổ biến nhất trong thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc bởi độ chính xác khá cao khi dự đoán cấu trúc của các phối tử phân tử nhỏ trong vị trí liên kết đích phù hợp [26] . Về cơ bản, mục đích của docking phân tử là đưa ra dự đoán về cấu trúc phức hợp phối tử-thụ thể bằng cách sử dụng các phương pháp tính toán. Docking thường gồm hai phần có liên quan với nhau: lấy mẫu sự tương thích của phối tử trong vị trí hoạt động của protein bằng các thuật toán; sau đó xếp hạng các sự tương thích này bằng cách cho điểm [51] . Nhiều thuật toán lấy mẫu đã được phát triển và sử dụng rộng rãi trong các phần mềm docking phân tử có thể kể đến như: thuật toán so khớp (MA)- dựa trên nguyên tắc về khoảng cách giữa các nhóm chức trong phân tử protein và phối tử; các phương pháp xây dựng tăng dần (IC)- đưa phối tử vào vị trí hoạt động của protein theo kiểu phân mảnh và thêm dần các mảnh; phương pháp Monte Carlo 13
  22. (MC)- tạo ra các tư thế của phối tử thông qua chuyển động quay liên kết, tịnh tiến thân cố định hoặc quay, các thuật toán di truyền (GA) với cảm hứng từ thuyết tiến hóa của Darwin, tạo ra một tập các tư thế của phối tử bằng cách đột biến và trao đổi chéo; mô phỏng động lực học phân tử (MD)- dự đoán sự di chuyển của từng nguyên tử riêng biệt trong trường của các nguyên tử còn lại theo thời gian dựa trên các phương trình động học, thể hiện tính linh hoạt của cả phối tử và protein hiệu quả hơn các thuật toán khác [62] . Chức năng tính điểm được phát triển để mô tả nhanh chóng và chính xác sự tương tác giữa protein và phối tử. Ngoài việc xếp hạng các cấu trúc, định hướng của phối tử khi liên kết với vị trí hoạt động thông qua độ bền của liên kết, chức năng tính điểm còn dự đoán ái lực liên kết protein- phối tử, ứng dụng trong tối ưu hóa hợp chất dẫn đường cũng như sàng lọc các hợp chất tiềm năng đối với một đích trong các cơ sở dữ liệu lớn[34] . Năng lượng tự do của phức hợp protein- phối tử được cho bởi hằng số liên kết (Kd) và năng lượng tự do Gibbs (ΔG), trong đó xét đến các tương tác như van der Waals, liên kết kị nước, liên kết Hydro, liên kết cộng hóa trị, liên kết tĩnh điện. Số lượng các tham số hóa lý càng lớn thì độ chính xác càng cao. Tuy nhiên, thời gian tính toán sẽ lâu nếu số lượng biến lớn. Vì vậy, các hàm tính điểm cần cân bằng giữa độ chính xác và tốc độ để đạt được hiệu quả khi làm việc với các cơ sở dữ liệu lớn. Quy trình docking Quá trình docking được thực hiện thông qua ba bước: chuẩn bị phối tử, chuẩn bị protein, mô phỏng docking. Chuẩn bị phối tử Cấu trúc các phối tử có thể được lấy từ hệ thống dữ liệu có sẵn như ZINC, Pubchem, Asinex database. Trong trường hợp không có sẵn, chúng ta có thể xây dựng cấu trúc phối tử bởi các phần mềm chuyên dụng như ChemDraw, ChemSketch, MarvinSketch Sau khi xây dựng được cấu trúc 3D, phối tử cần chỉnh sửa điện tích, gắn trường lực và tối ưu hóa năng lượng để chuẩn bị cho docking. Chuẩn bị protein Cấu trúc 3D của protein thường có sẵn trên ngân hàng dữ liệu protein (Protein data bank) “ ”. Có thể tự xây dựng cấu trúc 3D của protein theo phương pháp mô hình hóa tương đồng (Homology modeling) nếu cấu trúc protein không có sẵn. Tiếp theo, chuẩn bị protein cho chương trình mô phỏng docking bằng 14
  23. các phần mềm chuyên dụng: loại nước và các phối tử (nếu có), thêm hydro, gắn trường lực và tạo file pdbqt. Mô phỏng docking Trước khi tiến hành mô phỏng docking, cần khoanh vùng tìm kiếm (grid box) cho thuật toán. Kích thước của vùng tìm kiếm cần được cân đối, không nên quá lớn gây tốn kém thời gian và độ lặp lại không cao, cũng không nên quá nhỏ vì phần mềm chỉ tìm kiếm được một vùng rất nhỏ, không có ý nghĩa. Thông thường, vị trí vùng tìm kiếm được đặt ở trung tâm hoạt động của protein. Khi thực hiện docking, phần mềm sẽ tự động tìm kiếm và đưa ra cấu dạng phù hợp với năng lượng thấp nhất. Việc phân tích các tương tác của các cấu dạng thu được thực hiện trên các phần mềm chuyên dụng như MOE, Pymol, Discovery studio [54] 1.4.2. Quy tắc Lipinski về các hợp chất giống thuốc Hầu hết các ứng cử viên làm thuốc thất bại trong các thử nghiệm lâm sàng bởi không đạt các chỉ tiêu về hiệu quả và độc tính. Năm 1997, Christopher Lipinski và các cộng sự đã đưa ra bộ quy tắc số 5 (Rules of 5- RO5) về các hợp chất giống thuốc, theo đó các loại thuốc dùng đường uống thường có đặc tính hóa lý và cấu trúc trong một phạm vi giá trị nhất định. Một dược chất đường uống không vi phạm quá một trong 4 tiêu chí sau: - Trọng lượng phân tử: MW < 500 Dalton. - Số lượng nhóm cho liên kết hydro (Số lượng các nhóm –NH và –OH): HBD < 5. - Số lượng nhóm nhận liên kết hydro (Bao gồm nguyên tử O và N): HBA < 10. - Hệ số phân bố octanol/nước: LogP < 5 [46] . Các thông số hóa lý này liên quan đến khả năng hòa tan trong nước, tính thấm ở ruột và bao gồm các bước đầu tiên trong sinh khả dụng đường uống. Nếu một hợp chất không vượt qua quy tắc RO5, nó sẽ có nguy cơ gặp vấn đề khi sử dụng đường uống. Tuy vậy một chất đáp ứng RO5 không đảm bảo nó sẽ trở thành thuốc, vì RO5 không đề cập đến các đặc điểm cấu trúc hóa học cụ thể được tìm thấy trong thuốc và hợp chất không phải thuốc [47] . 1.4.3. Dự đoán ADMET các thông số dược động học và độc tính Trong các nghiên cứu in silico, việc dự đoán các thông số dược động học như hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ và độc tính đã trở thành một phần quan 15
  24. trọng của quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới. Theo thống kê ở những năm 2000, trong số các thuốc không vượt qua các thử nghiệm lâm sàng, một nửa số trường hợp là do không đáp ứng yêu cầu về dược động học (39%) và độc tính trên động vật (11%) [68] . Ngày nay, cùng với các kho dữ liệu khổng lồ các hợp chất hóa học đang được phát triển và những tiến bộ công nghệ thông tin, việc sàng lọc các ứng cử viên thuốc dựa trên các thông số ADMET đã được thực hiện sớm hơn, trước khi đưa vào đánh giá trên lâm sàng. Kể từ khi xuất hiện các công cụ đánh giá thông số ADMET, chỉ còn 8% các thuốc thất bại do không đáp ứng được các thuộc tính ADMET, giúp tiết kiệm thời gian và tiền bạc, đồng thời đảm bảo tính an toàn và ổn định của thuốc được thiết kế [27] . Trong rất nhiều công cụ dự đoán ADMET, ngoài một số phần mềm thương mại như CASE ULTRA, DEREK, META-PC, METEOR, PASS, GUSAR , còn có các công cụ trực tuyến như ADMETlab, admetSAR, pkCSM, SwissADME khá phổ biến trong các nghiên cứu khoa học vì dự đoán ADMET chính xác và thuận tiện [38] . Công cụ trực tuyến pkCSM là một công cụ dự đoán ADMET mạnh mẽ, cho hiệu suất bằng hoặc cao hơn các công cụ tương tự hiện có. pkCSM dự đoán các thuộc tính ADMET bằng cách sử dụng đồ thị của các đặc tính để phát triển các mô hình dự đoán. Nền tảng này có thể nhanh chóng đánh giá các đặc tính dược động học và độc tính chính cần thiết cho hợp chất giống thuốc và sinh khả dụng chỉ bằng cách cung cấp phân tử đầu vào dưới dạng SMILES. Với bộ dữ liệu lớn gồm hơn 10000 cấu trúc phân tử đối với độc tính trên chuột, 18000 hợp chất đối với các đặc tính chuyển hóa, 14 mô hình hồi quy định lượng các thuộc tính ADMET và 16 mô hình phân loại nhị phân, pkCSM có khả năng xử lý các tập dữ liệu lớn, có thể áp dụng vào các nghiên cứu sàng lọc [38, 60] . 16
  25. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu và thiết bị Cấu trúc protein: Cấu trúc tinh thể tia X của enzym chuyển angiotensin được tải về từ ngân hàng dữ liệu protein (Protein Data Bank- với mã pdb là 1O86 (Hình 2.1). Đây là cấu trúc của ACE được phân lập từ tinh hoàn người được gắn với phối tử đồng kết tinh là lisinopril ở độ phân giải 2,0Å [6] . Hình 2.1. Cấu trúc 3D của enzym 1O86 được tải về từ CSDL Protein Data Bank. Cấu trúc phối tử: Các hợp chất flavonoid được tải về từ cơ sở dữ liệu Pubchem ( Đây là cơ sở dữ liệu lớn nhất thế giới có thể truy cập thông tin miễn phí của các hợp chất hóa học, duy trì bởi Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia, thuộc Thư viện Y khoa Quốc gia Hoa Kỳ. Thiết bị sử dụng: Máy tính Dell Inspiron 15- Hệ điều hành Windows 10. Phần mềm: Các phần mềm và công cụ sử dụng trong nghiên cứu được mua hoặc tải từ các nhà phát triển (trang web) bao gồm: - MGL tools 1.5.6 ( - Autodock Vina 4.2 ( - UCSF Chimera 1.14 ( - Avogadro 1.2.0 ( - Discovery Studio 2020 Client ( - Công cụ online pkCSM ( - Microsoft Office 2016. 17
  26. 2.2. Nội dung nghiên cứu Bước 1: Sàng lọc các hợp chất flavonoid được tải từ cơ sở dữ liệu Pubchem có khả năng ức chế enzym chuyển angiotensin bằng phương pháp docking phân tử. Bước 2: Nghiên cứu đặc điểm giống thuốc của các hợp chất có kết quả sàng lọc docking phân tử tốt nhất, thông qua các thông số hóa lý của hợp chất. Bước 3: Nghiên cứu các đặc tính dược động học và độc tính của các hợp chất thỏa mãn các tiêu chí về đặc điểm giống thuốc, từ đó chọn ra các hợp chất tiềm năng có thể phát triển thành thuốc. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Sàng lọc bằng docking phân tử Re-dock lisinopril Trong phức hợp ACE (pdb: 1O86) chứa sẵn phối tử đồng kết tinh là lisinopril, một chất ức chế ACE được sử dụng rộng rãi để điều trị tăng huyết áp. Vì vậy, re-dock lisinopril là cách để thẩm định tính hợp lý của quy trình docking. Nếu sự sai khác về vị trí của lisinopril trong tinh thể ACE và sau khi re-dock là không đáng kể (RMSD < 1,5 Å) thì có thể kết luận tính phù hợp của quy trình docking đã thực hiện [28] . Ngoài ra, điểm số docking của ligand đồng kết tinh còn được sử dụng làm cơ sở để lựa chọn các hợp chất có tác dụng ức chế ACE. Thực hiện re-dock qua các bước như Hình 2.2: Bước 1: Tách phối tử đồng kết tinh lisinopril của tinh thể ACE, xây dựng file pdbqt. Bước 2: Chuẩn bị protein. Bước 3: Tiến hành dock phối tử đã tách ra vào protein bằng phần mềm Autodock. Bước 4: Biểu diễn phức hợp protein-phối tử sau khi dock bằng phần mềm Discovery studio, tiến hành loại bỏ protein và các phân tử khác, chỉ giữ lại cấu hình ligand có kết quả tốt nhất. Bước 5: Tính toán RMSD giữa phối tử đồng kết tinh khi được tách ra và sau khi thực hiện re-dock bằng phần mềm Chimera. 18
  27. Hình 2.2. Minh họa quá trình re-dock lisinopril đồng kết tinh. Chuẩn bị protein Cấu trúc tinh thể của ACE được tải về từ Protein Data Bank (pdb: 1O86, độ phân giải 2,0 Å), loại phân tử nước, phối tử đồng kết tinh là lisinopril và các phân tử nền (bằng phần mềm Discovery Studio 2020 Client), thêm hydro, tối ưu hóa các hydro phân cực, gắn trường lực Kollman và xây dựng file pdbqt (bằng phần mềm Autodock Tools 1.5.6). Chuẩn bị phối tử Các phối tử sau khi được tải về từ cơ sở dữ liệu Pubchem, được tối ưu hóa năng lượng bằng phần mềm Avogadro sử dụng phương pháp Gradient liên hợp (Conjugate Gradients) và chuyển thành định dạng file pdbqt bằng phần mềm Autodock Tools. Mô phỏng docking Tiến hành docking bằng phần mềm Autodock với kích thước hộp tìm kiếm (grid box) là 60x70x50 Å, khoảng cách giữa các ô lưới là 0,375 Å, tọa độ trục là x= 41.62, y= 31.97, z= 46,62 được đặt dựa theo vị trí của ion Zn2+ và một số axit amin quan trọng ở vị trí hoạt động. Phần mềm Autodock được sử dụng để tìm ra cấu hình liên kết tốt nhất bằng cách sử dụng các đánh giá năng lượng tự do liên kết ∆G và số lượng tương tác vật lý. Kết quả docking được đánh giá thông qua 3 tiêu chí là điểm số docking, khả năng tương tác và RMSD (độ lệch bình phương trung bình gốc). 19
  28. Trong mô phỏng docking, năng lượng liên kết càng thấp được cho là càng gần với trạng thái tự nhiên của phức hợp. Hàm tính điểm của thuật toán docking là phương trình có các tham số cùng với hệ số tuân theo một lý thuyết xác định. Các năng lượng được tính toán là đặc tính năng lượng nội tại của phối tử, năng lượng tự do xoắn và năng lượng giữa các phân tử gồm năng lượng liên kết Van der Walls, năng lượng liên kết hydro, năng lượng từ desolvat và năng lượng tĩnh điện. Mỗi loại tương tác, đều được gán cho 1 miền giá trị, kết quả cuối phản ánh khả năng tương tác mạnh hay yếu của phối tử với enzyme. Quy trình docking này được sử dụng để sàng lọc các hợp chất flavonoid được tải về từ CSDL Pubchem sau khi kết quả re-dock lisinopril cho thấy tính hợp lý của quy trình. Kết quả protein docking sẽ được lựa chọn dựa trên các tiêu chí sau: 1. Điểm số docking thấp hơn kết quả re-dock lisinopril. 2. Cấu dạng có RMSD thấp nhất. 3. Tạo liên kết tốt với các axit amin tại vị trí hoạt động. Biểu diễn liên kết Phân tích kết quả bằng phần mềm Discovery Studio tìm tương tác của các phối tử với cấu trúc tinh thể của ACE. Đây là công cụ cho hình ảnh trực quan 2D và 3D về các tương tác giữa phối tử và các axit amin ở trung tâm hoạt động của protein. 2.3.2. Nghiên cứu các đặc điểm giống thuốc Quy tắc Lipinski 5 được sử dụng để so sánh giữa các hợp chất có đặc tính giống thuốc và không giống thuốc sau khi quá trình docking cho thấy khả năng liên kết của phối tử tốt hơn lisinopril đồng kết tinh. Một hợp chất có thể phát triển thành thuốc dùng đường uống nếu không vi phạm quá một trong 4 tiêu chí sau: - Trọng lượng phân tử: MW < 500 Dalton. - Số lượng nhóm cho liên kết hydro (Số lượng các nhóm –NH và –OH): HBD < 5. - Số lượng nhóm nhận liên kết hydro (Bao gồm nguyên tử O và N): HBA < 10. - Hệ số phân bố octanol/nước: LogP < 5 [46] . Công cụ trực tuyến pkCSM ( được sử dụng để đánh giá quy tắc Lipinski 5. Công thức SMILES của các phối tử được tải về từ cơ sở dữ liệu Pubchem (www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov) và dùng 20
  29. làm dữ liệu đầu vào cho công cụ pkCSM. Sau khi lựa chọn được các hợp chất giống thuốc, tiếp tục tiến hành phân tích các thông số dược động học và độc tính để cho ra kết quả cuối cùng. 2.3.3. Nghiên cứu các đặc tính dược động học và độc tính (ADMET) Sử dụng công cụ trực tuyến pkCSM để dự đoán các đặc tính dược động học và độc tính với dữ liệu đầu vào là công thức SMILES của các hợp chất (Hình 2.3). Kết quả thu được là các thông số về hấp thu (tính tan trong nước, tính thấm màng Caco2, hấp thu ở ruột), phân bố (tính thấm qua hàng rào máu não và hệ thần kinh trung ương ), chuyển hóa (ức chế các enzyme chuyển hóa ở gan), thải trừ ở thận và độc tính (độc tính AMES, độc tính gan ). Một khía cạnh quan trọng trong sự hấp thu chính là tính hấp thu thuốc ở ruột người (HIA) và tính thấm qua màng Caco2. Các hợp chất được cho là hấp thụ kém hoặc hấp thụ vừa hoặc hấp thụ tốt nếu HIA của chúng lần lượt ở trong khoảng 0 đến 20%, 20% đến 70%, và 70% đến 100%. Tính thấm qua màng Caco2 được đánh giá là cao nếu lớn hơn 0.9 (log Papp trong 10 cm/s). Hợp chất có thể thấm qua hàng rào máu não nếu logBB> 0.3 và tương ứng ở hệ thần kinh trung ương (CNS) là trên -2 [57, 66] . Các hợp chất cũng được lựa chọn dựa trên tính không có độc tính của chúng [60] . Hình 2.3. Thực hiện dự đoán tính giống thuốc và các thông số ADMET bằng công cụ trực tuyến pkCSM. Bao gồm 2 bước: nhập công thức SMILES của hợp chất làm dữ liệu đầu vào, sau đó chọn ADMET để tính toán đầy đủ các thông số. 21
  30. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ Hình 3.1. Minh họa quá trình sàng lọc in silico. 3.1. Mô phỏng protein docking 3.1.1. Đánh giá quy trình docking Trước khi sàng lọc các hợp chất, phối tử đồng kết tinh cần được re-dock lại vào vị trí hoạt động của mục tiêu để xác định độ lệch bình phương trung bình gốc (RMSD) từ đó đánh giá tính phù hợp của các thông số docking. Đánh giá sự tương đồng về cấu dạng, xác định giá trị RMSD bằng phần mềm Chimera thu được sự chồng khít về cấu trúc của phối tử đồng kết tinh thể trước và sau khi dock với giá trị RMSD là 1.012 Å < 1.5 Å chứng tỏ kết quả docking phân tử vào mục tiêu là đáng tin cậy (Hình 3.2). 22
  31. Hình 3.2. RMSD của lisinopril đồng kết tinh trước và sau khi re-dock. Kết quả docking lisinopril cho năng lượng liên kết ∆G = -8,4 kCal/mol. Lisinopril tạo liên kết hydro với các axit amin His353, Ala354, Tyr523, liên kết π- cation và π-sigma bền vững với Lys511, His383, Glu411 và ion kẽm tại vị trí hoạt động (Hình 3.3). Điểm số docking -8,4 kCal/mol được dùng làm cơ sở để sàng lọc các hợp chất tiềm năng. Hình 3.3. Minh họa hai chiều các tương tác của lisinopril tại vị trí hoạt động. 3.1.2. Tìm kiếm các chất tiềm năng từ kết quả docking Tiến hành docking 116 hợp chất flavonoid vào vị trí hoạt động của protein tại tọa độ là x= 41.62, y= 31.97, z= 46.62, kích thước hộp tìm kiếm là 60x70x50 Å. Lựa chọn được 86 hợp chất có năng lượng liên kết ∆G ≤ -8,4 kCal/mol là năng lượng liên kết của lisinopril với ACE (Bảng 3.1). 23
  32. Bảng 3.1. Kết quả mô phỏng docking Năng Năng STT Tên hợp chất lượng STT Tên hợp chất lượng (kCal/mol) (kCal/mol) 1 Silybin -10.3 44 Ginkgetin -11.2 2 Rotenone -9.2 45 Carlinoside -9.4 3 Hesperidin -10.6 46 Coumestan -8.4 4 Amorphigenin -9.2 47 Silybin B -10.2 5 Swertisin -9.0 48 Miquelianin -9.6 6 Diphysolone -9.2 49 Quercetin -8.5 7 (+)-Gallocatechin -8.4 50 Apigenin -8.4 8 Brazilin -8.9 51 Apiin -10.2 9 Rutin -9.8 52 Rhoifolin -10.5 10 Iridin -9.2 53 Lonicerin -10.7 11 Tectoridin -9.1 54 Isoginkgetin -10.7 12 Quercimeritrin -9.4 55 Erylatissin B -9.1 13 Glabridin -8.8 56 Licoisoflavone A -9.1 14 Luteolin -8.4 57 Formononetin -8.6 15 Hesperitin -8.4 58 Neobavaisoflavone -9.1 16 Pratensein -8.4 59 Astragalin -8.8 17 Fisetin -8.4 60 Isoquercetin -9.3 18 Glycitin -9.4 61 Ononin -9.4 Neohesperidin Baicalein 7-O- 19 -9.2 62 -9.6 dihydrochalcone glucuronide (-)- Catechin 7-O-beta-D- 20 Epigallocatechin -9.1 63 -9.3 xyloside gallate 2,3- 21 -9.2 64 Phaseollinisoflavan -9.2 Dihydroauriculatin Cyanidin 3-O- Delphinidin 3-O- 22 -9.8 65 -9.5 rutinoside glucoside Catechin 7-O- 3'- 23 -10.0 66 -9.4 gallate Dimethylallylkievitone 2'-Hydroxy-7,4- Quercetin 3-O- 24 -9.0 67 -9.6 dimethoxyisoflavon malonylglucoside Quercetin-3-O- Apigenin-7-O- 25 -9.1 68 -9.8 rhamnoside glucuronide Kaempferol-7- Quercetin 3- 26 -10.0 69 -9.8 neohesperidoside sambubioside Rhamnetin-3- 27 -9.0 70 Apigenin-4'-glucoside -9.6 rhamnoside Quercetin 3- Kaempferol 4'- 28 -9.8 71 -9.4 neohesperidoside glucoside 29 Kaempferol 3,7- -9.8 72 Kaempferol 3-O- -9.5 24
  33. diglucoside gentiobioside (+)- Glycyrrhizaisoflavone 30 -8.5 73 -9.1 Epigallocatechin B Apigenin-7-O- Flavonol 7-O-beta-D- 31 -10.6 74 -9.6 gentiobioside glucoside Apigenin-7-O- Chrysin-7-O- 32 -9.8 75 -9.9 glucoside glucoronide Kaempferol-3-O- Genistein-7-O- 33 -9.5 76 -9.2 glucuronoside glucuronide Quercetin 3,7- Kaempferol 3-O-beta- 34 -10.6 77 -8.8 dirhamnoside D-xyloside Catechin 7-O- 35 -9.7 78 Globularicitrin -10.1 apiofuranoside 5-Deoxykievitone Genistein 4'-O- 36 -8.6 79 -9.9 hydrate glucuronide Apigenin 4'-O- Genistin 7-O- 37 -10.1 80 -10.0 rhamnoside gentiobioside Pelargonidin 3,5- 6"-O- 38 -9.5 81 -9.7 di-beta-D-glucoside molonyltectoridin 7-O-[beta-D- arabinopyranosyl- 4'-Demethyltoxicarol 39 -10.7 82 -8.7 (1->6)-beta-D- isoflavone glucosyl]apigenin Kaempferol-3-O- Quercetin 3-O-alpha- beta- L-rhamnopyranosyl- 40 glucopyranosyl-7- -9.7 83 -9.7 (1->2)-alpha-L- O-alpha- arabinopyranoside rhamnopyranoside Kaempferol 3-O-beta- Rhamnetin 3-O- D-galactopyranosyl-7- 41 beta- -9.3 84 -10.3 O-alpha-L- glucopyranoside rhamnopyranoside Quercetin-3,4'-O- Quercetin 3-O-alpha- 42 di-beta- -10.2 85 -8.9 L-fucopyranoside glucopyranoside 7-hydroxy-8- 7-hydroxyflavanon (morpholin-4- 43 7-O-beta-D- -9.6 86 -9.1 ylmethyl)-3- glucoside phenylchromen-4-one 3.2. Sàng lọc các hợp chất giống thuốc Sử dụng công cụ trực tuyến pkCSM để tính toán các thông số trong quy tắc 5 Lipinski. Bảng 3.2 trình bày kết quả các hợp chất đáp ứng 3/4 tiêu chí của quy tắc. 25
  34. Bảng 3.2. Kết quả các thông số quy tắc 5 Lipinski. Số nhóm Số nhóm Phân tử cho liên kết nhận liên kết STT Tên hợp chất LogP khối hydrogen hydrogen (HBD) (HBA) 1 Silybin 482.441 5 9 2.363 2 Rotenone 394.423 0 6 3.703 3 (+)-Gallocatechin 306.27 6 7 1.252 4 Brazilin 286.283 4 5 1.615 5 Amorphigenin 410.423 1 7 2.6757 6 Phaseollinisoflavan 324.376 2 4 4.0007 7 Diphysolone 356.374 4 6 3.3766 8 Coumestan 236.226 0 3 3.6924 9 Quercetin 302.238 5 7 1.988 10 Apigenin 270.24 3 5 2.5768 11 Glabridin 324.376 2 4 4.0007 12 Erylatissin B 336.343 2 5 4.0554 13 Licoisoflavone A 354.358 4 6 3.791 14 Formononetin 268.268 1 4 3.1742 15 Neobavaisoflavone 322.36 2 4 4.3799 16 Luteolin 286.239 4 6 2.2824 17 Hesperitin 302.282 3 6 2.5185 18 Fisetin 286.239 4 6 2.2824 19 Ononin 430.409 4 9 0.6473 20 Biochanin A 284.267 2 5 2.8798 21 Pratensein 300.266 3 6 2.5854 22 2,3-Dihydroauriculatin 422.477 3 6 4.8552 23 (+)-Epigallocatechin 306.27 6 7 1.2517 2'-Hydroxy-7,4- 24 298.294 1 5 3.1828 dimethoxyisoflavone 3'- 25 424.493 4 6 4.8853 Dimethylallylkievitone Glycyrrhizaisoflavone 26 366.369 2 6 4.064 B Flavonol 7-O-beta-D- 27 416.382 5 9 0.3443 glucoside Chrysin-7-O- 28 430.365 5 9 0.4366 glucoronide 5-Deoxykievitone 29 358.39 4 6 2.8658 hydrate Apigenin 4'-O- 30 416.382 5 9 1.0775 rhamnoside 4'-Demethyltoxicarol 31 396.395 2 7 4.0726 isoflavone 26
  35. 7-hydroxyflavanon 7- 32 402.399 4 8 0.5718 O-beta-D-glucoside 7-hydroxy-8- (morpholin-4- 33 337.375 1 5 2.9978 ylmethyl)-3- phenylchromen-4-one 3.3. Dự đoán các thông số ADMET Phân tích ADMET trên 5 thông số chính về dược động học và độc tính: Hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ và độc tính. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.3 và Bảng 3.4. Bảng 3.3. Kết quả phân tích các đặc tính hấp thu, phân bố và chuyển hóa. Hấp thu Phân bố Chuyển hóa Tên hợp chất Caco2 HIA BBB CNS VDss CYP2D6 CYP3A4 Rotenone 1.415 97.05 0.004 -2.77 -0.09 Không Có (+)-Gallocatechin 0.259 54.13 -1.377 -3.507 1.301 Không Không Amorphigenin 1.29 98.07 -0.749 -3.159 0.011 Không Không 2'-Hydroxy-7,4- dimethoxyisoflavo 0.923 96.13 -0.437 -2.146 -0.232 Không Không ne Quercetin -0.229 77.21 -1.098 -3.065 1.559 Không Không Apigenin 1.007 93.25 -0.734 -2.061 0.822 Không Không (+)- -0.375 54.13 -1.377 -3.507 1.301 Không Không Epigallocatechin 5-Deoxykievitone -0.154 76.73 -1.025 -3.08 1.056 Không Không hydrate Apigenin 4'-O- 0.488 51.28 -1.17 -3.68 1.258 Không Không rhamnoside Licoisoflavone A 0.081 80.93 -0.949 -2.105 0.434 Không Không Formononetin 1.253 96.11 0.157 -1.993 -0.121 Không Không Biochanin A 0.897 93.03 -0.221 -2.115 -0.341 Không Không Luteolin 0.096 81.13 -0.907 -2.251 1.153 Không Không Hesperitin 0.294 70.28 -0.719 -2.976 0.746 Không Không Pratensein 0.005 84.99 -0.928 -2.294 -0.066 Không Không Fisetin 0.058 83.75 -1.039 -2.282 0.718 Không Không Chú thích: Caco2: tính thấm qua màng Caco2 (log Papp trong 10 cm/s); HIA: hấp thu ở ruột (%); BBB: thấm qua hàng rào máu não (log BB); CNS: thấm qua hệ thần kinh trung ương (log PS); VDss: thể tích phân bố trong cơ thể người (log L/kg); CYP2D6: khả năng ức chế CYP2D6; CYP3D4: khả năng ức chế CYP3D4. 27
  36. Bảng 3.4. Kết quả phân tích các đặc tính thải trừ và độc tính. Thải trừ Độc tính Tên hợp chất Clr. OCT2 AMES hERG LD50 Gan Da Rotenone 0.224 Không Không Không 2.64 Không Không (+)-Gallocatechin 0.328 Không Không Không 2.492 Không Không Amorphigenin 0.226 Không Không Không 2.663 Không Không 2'-Hydroxy-7,4- 0.696 Không Không Không 2.011 Không Không dimethoxyisoflavone Quercetin 0.407 Không Không Không 2.471 Không Không Apigenin 0.566 Không Không Không 2.45 Không Không (+)-Epigallocatechin 0.328 Không Không Không 2.492 Không Không 5-Deoxykievitone 0.088 Không Không Không 2.446 Không Không hydrate Apigenin 4'-O- 0.56 Không Không Không 2.393 Không Không rhamnoside Licoisoflavone A 0.316 Không Không Không 2.513 Không Không Formononetin 0.258 Không Không Không 1.946 Không Không Biochanin A 0.247 Không Không Không 1.851 Không Không Luteolin 0.495 Không Không Không 2.455 Không Không Hesperitin 0.044 Không Không Không 2.042 Không Không Pratensein 0.165 Không Không Không 2.205 Không Không Fisetin 0.421 Không Không Không 2.465 Không Không Chú thích: Clr.: Thanh thải toàn phần (log mL/phút/kg); OCT2: cơ chất OCT2 ở thận; hERG: khả năng ức chế kênh kali ở tim; LD50: độc tính cấp tính ở chuột (mol/kg). Tổng cộng 16 hợp chất được chọn ra với tiêu chí ưu tiên là không có độc tính và nhìn chung có tính khả thi nghiên cứu sâu hơn trở thành thuốc. Khả năng hấp thu của hợp chất được phân tích dựa vào các thông số về tính thấm qua màng Caco2 và khả năng hấp thu ở ruột. Tính thấm qua màng Caco2 là tiêu chuẩn được sử dụng rộng rãi trong đánh giá tính thẩm thấu của dược phẩm, với giá trị > 0.9 (log Papp trong 10 cm/s) được coi là tính thấm cao [60] . Bảng 3.3 cho thấy chỉ có 4 hợp chất thấm tốt qua màng Caco2 là Rotenone, Amorphigenin, Apigenin và 2'-Hydroxy- 7,4-dimethoxyisoflavone. Tất cả đều hấp thu tốt ở ruột với giá trị thấp nhất là 51.28% của Apigenin 4'-O-rhamnoside. Các hợp chất được cho là phân bố tốt đến các mô nếu giá trị log VDss > 0.45 và phân bố kém nếu log VDss < -0.15 [60] . Trừ Amorphigenin, 2'-Hydroxy-7,4-dimethoxyisoflavone và Biochanin A, các hợp chất đều cho kết quả phân bố khá tốt. Ngoài ra, hai thông số tính thấm qua hàng rào máu não (BBB) và hệ thần kinh trung ương (CNS) rất quan trọng khi đánh giá tính an 28
  37. toàn đối với hệ thần kinh của dược chất. Kết quả tính toán cho thấy, hầu hết các chất không thấm hoặc ít thấm qua BBB (<-1) và CNS (<-3), trừ Formononetin và Biochanin A. (+)-Gallocatechin, Quercetin, (+)-Epigallocatechin, 5-Deoxykievitone hydrate và Apigenin 4'-O-rhamnoside được coi là an toàn đối với hệ thần kinh khi hoàn toàn không thấm BBB và CNS. Hệ cytochrome P450 là hệ enzym quan trọng trong quá trình chuyển hóa thuốc ở gan. Hai kiểu hình chính của cytochrome P450 là CYP3A4 và CYP2D6. Rotenone và Licoisoflavone A được dự đoán ức chế CYP3A4, vì vậy có khả năng sẽ làm tăng sinh khả dụng của các chất bị chuyển hóa bởi enzym CYP3A4 nếu được sử dụng cùng nhau. Thải trừ thuốc qua thận phụ thuộc vào khối lượng phân tử và tính ưa nước của hợp chất. Tất cả các chất đều không phải cơ chất của OCT2 (chất vận chuyển cation hữu cơ 2), đóng vai trò quan trọng trong quá trình đào thải các dạng ion hóa của thuốc và các hợp chất nội sinh ở thận khi nó chiết xuất các chất từ máu vào tế bào ống thận như là bước đầu tiên trong quá trình thải trừ. Giá trị độ thanh thải toàn phần được trình bày ở Bảng 3.4. Khi xét đến độc tính, tất cả các chất được chọn đều không có khả năng gây ra các độc tính trên tim (ức chế hERG), nguy cơ ung thư (độc tính AMES), độc tính gan và kích ứng da. Sau khi phân tích kết quả ADMET, có 5 chất có các đặc tính dược động học và độc tính tốt nhất là Rotenone, Amorphigenin, Quercetin, Apigenin và Hesperitin. Tương tác giữa 5 phân tử trên với ACE được minh họa hai chiều bằng phần mềm Discovery Studio Visualizer 4.0 ở Hình 3.4. 29
  38. Hình 3.4. Tương tác của 5 hợp chất với ACE. A. Rotenone; B. Amorphigenin; C. Quercetin; D. Apigenin; E. Hesperitin. Xét về khả năng tạo tương tác, các hợp chất đều liên kết tốt tại vị trí hoạt động của ACE khi tương tác với 5 axit amin trở lên. Rotenone, Amorphigenin và Quercetin cho thấy nhiều sự tương đồng hơn với lisinopril về các liên kết. Rotenone tạo liên kết hydro với Gln281 và liên kết C-H với Tyr520, bên cạnh tương tác π-π xếp chồng giữa các vòng thơm với His353, His383 làm tăng độ ổn định của hệ. Quercetin tạo liên kết hydro với His383, Gln281 và Tyr520, liên kết C-H với His353 và liên kết π với Ala354 là các axit amin quan trọng, có liên quan đến ức chế hoạt động của ACE. Amorphigenin thể hiện liên kết tốt nhất với vùng hoạt động khi liên kết His353, Tyr520, Gln281và Glu162, bên cạnh tương tác π-π rất bền vững với His383 và Phe457. Hesperitin liên kết hydro với Gln281 và Ser284, liên kết π ổn định với His383, tương tác Van der Waals yếu với nhiều axit amin xung quanh. Trong cả 5 hợp chất, Apigenin cho thấy khả năng liên kết yếu nhất tại vị trí hoạt 30
  39. động và hầu như không có sự tương đồng với lisinopril ở các liên kết với các axit amin quan trọng. Xét về giá trị điểm tương tác, Amorphigenin và Rotenone cũng cho thấy kết quả tốt nhất (-9.2 kCal/mol), thể hiện phức hợp giữa cơ chất và enzym có khả năng ổn định cao nhất, điều này phù hợp với việc hai chất này tạo được nhiều liên kết bền vững với các axit amin tại trung tâm hoạt động. Quercetin cho năng lượng liên kết là -8.5 kCal/mol, trong khi Apigenin và Hesperitin có cùng điểm số là -8.4 kCal/mol (Bảng 3.5). Vì vậy, có thể khẳng định Amorphigenin, Rotenone và Quercetin, đặc biệt là Amorphigenol có khả năng tương tác tốt nhất với ACE. Bảng 3.5. Kết quả phân tích mô phỏng docking. Năng lượng liên Tên hợp chất ID Axit amin tạo liên kết kết (kCal/mol) Ala354, His353, Tyr520, Gln281, Rotenone 6758 -9.2 His383, Val380, Asp453, Phe457, Trp279. Ala354, Glu162, Tyr520, Val380, Amorphigenin 92207 -9.2 Leu61, Gln281, Trp279, His383, Asp453, Phe457. Ala354, Tyr520, Gln281, His383, Quercetin 5280343 -8.5 Glu162, Val380, Asp415. Ser222, Met223, Lys118, Phe570, Apigenin 5280443 -8.4 Pro407. His383, Gln281, Ser284, Asp453, Hesperitin 72281 -8.4 Val379. Ala354, His353, His513, Tyr520, Lisinopril -8.4 Gln281, Lys511, His383, Glu411, Tyr523, Val518, Zn2+. 31
  40. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1. Về kết quả Flavonoid là nhóm lớn nhất các polyphenol tìm thấy ở thực vật bậc cao, thường là chất tạo màu cho các loại hoa và quả. Vì vậy, flavonoid trở thành nguồn dữ liệu quan trọng để nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên ứng dụng vào chăm sóc và bảo vệ sức khỏe. Tác dụng nổi bật nhất của flavonoid là chống oxi hóa, góp phần phòng chống các bệnh tim mạch, tiểu đường do ngăn ngừa sự oxi hóa các lipoprotein tỷ trọng thấp và khả năng kích thích hoạt động của insulin [74] . Gần đây, khi tỉ lệ tăng huyết áp ngày càng gia tăng, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện trên flavonoid nhằm tìm ra hợp chất tiềm năng có tác dụng chữa tăng huyết áp, trong đó ức chế men chuyển angiotensin là một trong các mục tiêu quan trọng được hướng tới. Trong một số nghiên cứu in vitro và in vivo trước đây đối với các chiết xuất thực vật giàu flavonoid, các phân nhóm của flavonoid như anthocyanin, flavone, flavonol, flavanol có thể ức chế tới 50% hoạt động của ACE trên chuột tăng huyết áp [48, 58] . Tác dụng này được giải thích bởi sự tạo phức chelat với ion kim loại ở trung tâm hoạt động của các protein, dẫn tới sự ức chế hoạt động của các metalloproteinase [17] . Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành sàng lọc ảo 116 hợp chất flavonoid có nguồn gốc thiên nhiên được tải về từ thư viện hóa học Pubchem. Nhiều hợp chất cho thấy khả năng gắn kết tốt hơn chất đối chứng lisinopril do có các vòng thơm tạo tương tác π-π ổn định và nhiều nhóm hydroxy cần thiết cho hoạt động ức chế ACE. Tuy nhiên, chỉ có 33 hợp chất đáp ứng được các tiêu chí của một dược chất đường uống và 5 hợp chất trong số đó cho thấy tính khả quan về mặt dược động học và độc tính là Rotenone, Amorphigenin, Quercetin, Apigenin và Hesperitin. 4.1.1. Rotenone (ID: 6758) Rotenone là một isoflavone có nguồn gốc từ rễ và thân của các loài Lonchocarpus và Derris, được sử dụng rộng rãi như một chất diệt trừ sâu bệnh ở thực vật. Rotenone được biết đến là một chất ức chế mạnh phức hợp I của chuỗi hô hấp ty thể, ức chế sự tăng sinh tế bào trong các bệnh xơ hóa và ung thư [63] . Rotenone cho thấy khả năng liên kết tốt với ACE với điểm số docking là -9.2 kCal/mol, khả năng hấp thu tốt (97.05% qua ruột, tính thấm màng Caco2 là 1.415 log Papp trong 10 cm/s), tuy nhiên có khả năng thấm qua hàng rào máu não và hệ 32
  41. thần kinh trung ương bởi tính ưa lipid của nó. Bên cạnh đó, rotenone được coi là chất độc gây ra stress oxy hóa, gây hại trên hệ thần kinh và thận [11, 37] . Hiện nay, chưa có nghiên cứu thực nghiệm đối với tác dụng ức chế ACE của Rotenone. Vì vậy, mặc dù có khả năng tương tác tốt với enzym đích và có những đặc tính giống thuốc, cần có những nghiên cứu sâu hơn về độc tính của Rotenone đối với cơ thể người. 4.1.2. Amorphigenin (ID: 92207) Amorphigenin là một isoflavone chiết xuất từ rễ loài Amorpha fruticosa L., một loài cây thuộc họ Đậu, có nguồn gốc từ Bắc Mỹ và đông nam Canada [40] . Tác dụng được biết đến chủ yếu của Amorphigenin là diệt khuẩn, diệt ấu trùng muỗi do ức chế phức hợp ty thể I [43] . Amorphigenin có khả năng liên kết tốt nhất với ACE khi năng lượng liên kết âm hơn nhiều so với lisinopril (-9.2 kCal/mol) và tạo được nhiều liên kết với các residue quan trọng ở vị trí hoạt động tương tự như lisinopril. Cấu trúc hợp chất này chứa nhiều nhóm hydroxy nên có thể chui sâu vào rãnh hoạt động, gắn kết với các axit amin và ion kim loại, ức chế hoạt động của ACE. Amorphigenin hấp thu rất tốt ở ruột (98,07%), không gây ra độc tính trên gan, da, tim, không đi vào hệ thần kinh trung ương, tuy nhiên có khả năng thấm một phần qua hàng rào máu não. Hiện nay chưa có nghiên cứu đánh giá tác dụng của Amorphigenin đối với tăng huyết áp. Vì vậy, Amorphigenin cho thấy tiềm năng trở thành một chất ức chế ACE và cần có những đánh giá sâu hơn trên thực nghiệm để chứng minh tác dụng này cũng như khả năng trở thành thuốc của nó. 4.1.3. Quercetin (ID: 5280343) Quercetin là một flavonol xuất hiện nhiều trong các thực phẩm hàng ngày như táo, trà, hành, súp lơ, bắp cải và được chứng minh nhiều tác dụng có lợi cho sức khỏe như cải thiện các bệnh tim mạch, mắt, thấp khớp, ung thư, chống oxi hóa [16, 41] . Quercetin là một ứng cử viên tiềm năng cho phát triển thuốc trên hệ tim mạch khi thể hiện nhiều tác dụng có lợi trong các cuộc thử nghiệm in vivo như giảm nguy cơ xơ vữa động mạch, giảm huyết áp do nhiều cơ chế, trong đó bao gồm ức chế hoạt động của ACE và thụ thể AT1. Trong thử nghiệm mù đôi, ngẫu nhiên, có đối chứng trên 62 phụ nữ (35–55 tuổi) mắc bệnh tiểu đường loại 2, người ta phát hiện ra rằng 500 mg quercetin mỗi ngày làm giảm đáng kể HATT so với giả dược [76] . Khi điều trị cho chuột tăng huyết áp (bằng cách tiêm angiotensin I và bradikinin) bằng captopril và Quercetin, cả hai phương pháp điều trị đều gây ra các đáp ứng hạ huyết áp một cách đáng kể và Quercetin có hiệu quả ngang nhau với 33
  42. captopril khi dùng đường uống hoặc đường tiêm tĩnh mạch [32] . Tuy nhiên, nghiên cứu in vitro và in vivo về việc điều trị dài ngày bằng Quercetin với liều 10 mg/kg lại không cho thấy sự ức chế hoạt động của ACE khi so với nhóm đối chứng Captopril [56] . Trong nghiên cứu này, Quercetin cho thấy khả năng liên kết với ACE tương đương với lisinopril (-8.5 và -8.4 kCal/mol, tương ứng) bởi cấu trúc có ba nhóm hydroxy tạo liên kết bền vững với các axit amin tại vị trí hoạt động. Quercetin cũng cho thấy các đặc tính khả quan về mặt dược động học và độc tính khi không đi qua hàng rào máu não, không ức chế các enzym chuyển hóa tại gan và không gây ra các độc tính trên tim, gan, da, cho thấy tiềm năng phát triển thành thuốc, mặc dù tính hấp thu của Quercetin chưa được thuyết phục (tính thấm qua màng Caco2 < 0.9 log Papp trong 10 cm/s). 4.1.4. Apigenin (ID: 5280443) Apigenin là một flavone xuất hiện nhiều ở thực vật, như cần tây (Apium Tombolens) và cúc mâm xôi (Chrysanthemum morifolium). Trong một thử nghiệm in vitro, Apigenin có khả năng ức chế hoạt động của ACE với IC50 = 280 ± 3.2 µM so với captopril là 0.02 ± 0.0004 µM[48] . Một nghiên cứu khác về liên quan cấu trúc- hoạt động cho rằng, tác dụng ức chế ACE của Apigenin có liên quan đến liên kết đôi C2=C3 ở vòng C, dẫn đến hoạt động hiệu quả hơn một số flavanone như naringenin và hesperitin [31] . Kết quả docking của Apigenin là -8.4 kCal/mol, tuy nhiên các tương tác của nó tại rãnh hoạt động của enzym chưa được thuyết phục. Apigenin có thể hấp thu rất tốt qua ruột (93%) và có thể thấm một phần qua hàng rào máu não và đi vào hệ thần kinh trung ương. Vì vậy, cần có nhiều nghiên cứu hơn về tác dụng ức chế men chuyển angiotensin của Apigenin và các đánh giá sâu hơn về tác động của nó trên hệ thần kinh. 4.1.5. Hesperitin (ID: 72281) Hesperitin xuất hiện nhiều trong vỏ trái cây họ cam quýt và cần tây (Apium Tombolens), thuộc phân nhóm flavanone. Hesperitin cho thấy tác dụng hạ huyết áp tâm thu trên chuột tăng huyết áp tự phát ở mức liều 50 mg/kg với cơ chế được cho là giãn mạch qua trung gian oxit nitric [73] . Trong một nghiên cứu in vitro, sự ức chế ACE với hesperetin thay đổi trong khoảng từ 83% đến 100% thay đổi tùy theo nồng độ (100, 500 và 1000 μM) [61] . 34
  43. Hesperitin liên kết khá tốt với một số axit amin ở vị trí hoạt động của ACE, năng lượng liên kết là -8.4 kCal/mol, bằng với lisinopril. Các thông số phân bố, chuyển hóa, độc tính cho thấy Hesperitin là một hợp chất an toàn, không ảnh hưởng đến chuyển hóa chất khác khi dùng kèm. Tuy nhiên, tính thấm qua màng Caco2 thấp gợi ý về việc cần cải thiện tính hấp thu của Hesperitin nếu phát triển thành thuốc dùng đường uống. Ngoài ra, cần nhiều nghiên cứu hơn về cơ chế tác dụng giảm huyết áp và tác dụng ức chế ACE của Hesperitin. 4.2. Về phương pháp Việc ứng dụng kĩ thuật sàng lọc ảo in silico trong quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc đang trở thành xu thế chung của ngành công nghiệp dược phẩm trên toàn thế giới bởi nhiều ưu điểm so với các phương pháp tổng hợp hóa học truyền thống. Ngày nay, với nhiều CSDL lớn về các hợp chất tự nhiên, tổng hợp được cập nhật liên tục bởi các nhà khoa học trên khắp thế giới, việc dự đoán các tính chất dược lý, dược động học trở nên dễ dàng hơn. Công việc này được khi thực hiện trên máy tính có thể sàng lọc một số lượng lớn các hợp chất trong CSDL, giúp tiết kiệm công sức, thời gian và chi phí nghiên cứu. Về mặt nhược điểm, sàng lọc ảo sử dụng nhiều phễu lọc với nhiều phần mềm khác nhau có thể làm tăng sai số cho quá trình, bên cạnh việc sử dụng các thuật toán học máy phức tạp. Ngoài ra, việc xác định chính xác cấu trúc 3D của protein đích, sự khác biệt giữa mô hình và thực tế diễn ra trong cơ thể người cũng là lý do khiến sàng lọc ảo gặp nhiều khó khăn hơn. Vì vậy, việc phối hợp các kỹ thuật in silico, in vitro, in vivo rất cần thiết trong quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc. Về kỹ thuật docking Docking là một kỹ thuật sàng lọc ảo phổ biến hiện nay để mô phỏng các tương tác giữa protein và phối tử, ứng dụng vào sàng lọc một thư viện lớn các chất để tìm ra hợp chất tiềm năng, thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc, tối ưu hóa hợp chất dẫn đường hay nghiên cứu cơ chế tác dụng của các thuốc ở mức độ phân tử. Phân tích hàm tính điểm (năng lượng liên kết) và các tương tác từ kết quả đầu ra của docking cho phép chúng ta có thể kết luận một cách sơ bộ là chất đó có hay không hoạt tính ức chế protein. Điều này giúp thu hẹp CSDL, loại bỏ các hợp chất không có hoạt tính, cũng như lựa chọn các hợp chất thiết kế có hoạt tính trước khi tiến hành các thử nghiệm về sau. 35
  44. Mặc dù vậy, kết quả docking phụ thuộc vào độ chính xác của phần mềm sử dụng. Nghiên cứu này sử dụng Autodock Vina, một phần mềm học thuật được đánh giá cao về tính chính xác của công suất lấy mẫu và công suất cho điểm, với độ chính xác cao hơn các phần mềm thương mại [69] . Bên cạnh đó, mỗi chất được tiến hành dock ba lần và lấy kết quả trung bình để tăng độ tin cậy của quá trình. Về dự đoán đặc tính hóa lý và các thông số ADMET Việc kết hợp dự đoán tính giống thuốc và các thông số dược động học và độc tính cùng với kĩ thuật docking giúp dự đoán khả năng trở thành thuốc của các hợp chất, thu gọn tập dữ liệu và giảm bớt gánh nặng cho các nghiên cứu thực nghiệm về sau. Các đặc điểm ADMET được dự đoán bằng công cụ trực tuyến pkCSM cho kết quả dựa trên cấu trúc hóa học của hợp chất. Tính thấm qua tế bào Caco2 ở ruột là tiêu chuẩn quan trọng khi đánh giá dược chất đường uống, được FDA khuyến cáo sử dụng trong qua trình phát triển thuốc. Theo mô hình dự đoán PkCSM, một hợp chất được coi là có tính thấm Caco2 cao nếu giá trị dự đoán của nó > 0.9. Mô hình hấp thu ở ruột được sử dụng để dự đoán tỷ lệ phần trăm hấp thu của một loại thuốc uống qua ruột non của con người, mô hình dự đoán PkCSM cho biết rằng một phân tử có độ hấp thu dưới 30% sẽ được coi là một loại thuốc kém hấp thu. Các hợp chất trong bài đều cho thấy khả năng hấp thu tốt qua ruột non của người khi hấp thu trên 50%, một vài chất cho giá trị trên 90%. Khối lượng phân phối càng cao, lượng thuốc đến các mô càng nhiều, giá trị log VDss 0.45 cho thấy khối lượng phân phối cao. Tính thấm qua hàng rào máu não (BBB) cũng là một thông số quan trọng về tính thẩm thấu của hợp chất, cùng với khả năng đi vào hệ thần kinh trung ương (CNS) có thể liên quan đến tính an toàn của dược chất đối với hệ thần kinh. Một dược chất được coi là không thấm qua hàng rào máu não nếu giá trị BBB 0.3. Nếu log PS > -2, hợp chất có thể đi vào hệ thần kinh trung ương và ngược lại nếu có giá trị < -3. Vì hầu hết các loại thuốc được chuyển hóa bởi các enzym cytochrom P450, cho nên cần phải biết liệu chất đó có ức chế hệ enzym này hay không, để xác định khả năng chất đó khi đưa vào cơ thể có ảnh hưởng đến dược động học của thuốc dùng kèm[13] . Trừ Rotenone, các chất trong bài đều không ức chế 2 enzym CYP2D6 và CYP3A4, vì vậy được cho là không ảnh hưởng đến chuyển hóa của các thuốc khác. Chất vận chuyển cation hữu cơ 2 (OCT2) đóng một vai trò quan trọng trong quá trình thải trừ các dạng ion hóa của thuốc và các hợp chất nội sinh ở thận vì nó 36
  45. vận chuyển các chất từ máu vào tế bào ống thận như là bước đầu tiên trong quá trình thải trừ. Việc biết một hợp chất có phải là chất nền cho OCT2 hay không là rất có giá trị, đó là dự đoán kiểu loại bỏ của nó. Dự đoán độc tính của các hợp chất là rất quan trọng để đưa ra ý tưởng về các nguy cơ có thể xảy ra và giúp phát hiện liều lượng an toàn nhất của hợp chất đã cho. Độc tính AMES được dùng để đánh giá khả năng gây đột biến DNA của vi khuẩn S. typhi, có thể gây ung thư. Kênh kali ở tim được mã hóa bởi gen hERG bị ức chế sẽ dẫn đến hội chứng QT dài và có nguy cơ đột tử. Vì vậy, cần tránh những chất có khả năng ức chế hERG. Liều gây chết cấp tính ở chuột được biểu thị bằng LD50 là liều được tiêm cùng một lúc và gây ra cái chết cho 50% số động vật trong thử nghiệm, với mức liều > 2 mol/kg được coi là an toàn [13, 60] . Các hợp chất được chọn đều đáp ứng các tiêu chí an toàn này. 37
  46. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ các kết quả nghiên cứu đã trình bày ở trên, chúng tôi rút ra những kết luận sau: 1. Từ 116 hợp chất flavonoid được tải về từ thư viện hóa học Pubchem, có 86 hợp chất có khả năng liên kết tốt tại vị trí hoạt động của enzym chuyển angiotensin. 2. Trong 86 hợp chất, có 33 hợp chất cho thấy các đặc tính giống thuốc thỏa mãn quy tắc 5 Lipinski. Sau đó, sàng lọc được 5 hợp chất có các đặc tính dược động học và độc tính tốt nhất là: Rotenone (ID: 6758), Amorphigenin (ID: 92207), Quercetin (ID: 5280343), Apigenin (ID: 5280443), Hesperitin (ID: 72281). Phân tích tương tác của các hợp chất này với enzym đích ACE, định hướng điều trị tăng huyết áp. Kiến nghị Kết luận của nghiên cứu này được đưa ra dựa trên kết quả của quá trình sàng lọc ảo in silico, có thể còn nhiều hạn chế như sai số trong quá trình và sự khác biệt giữa mô hình máy tính với thực nghiệm. Vì vậy, để tiếp tục phát triển các kết quả nghiên cứu của khóa luận trong tìm kiếm các hợp chất flavonoid có tác dụng ức chế men chuyển angiotensin định hướng điều trị tăng huyết áp, chúng tôi đề xuất: 1. Tiến hành nghiên cứu thêm về các chất đã sàng lọc được trên in vitro, in vivo: thử hoạt tính, tính an toàn ở các nồng độ hoặc nghiên cứu cải thiện tính thấm của hợp chất. 2. Tiếp tục áp dụng mô hình sàng lọc in silico cho các nghiên cứu phát triển thuốc điều trị tăng huyết áp đối với các đích khác, nhóm hợp chất khác.
  47. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Bộ Y Tế (2010) "Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị tăng huyết áp". 2. Hội Tim mạch học quốc gia Việt Nam (2018), "Khuyến cáo về chẩn đoán và điều trị tăng huyết áp". 3. Hoàng Khánh (2014), "Tăng huyết áp và đột quỵ", Tim mạch học Việt Nam, 66. 4. Tô Mười (2020), "Nghiên cứu tỷ lệ tiền tăng huyết áp và ảnh hưởng lên cơ quan đích ở người trưởng thành tỉnh Quảng Nam". 5. Phạm Quang Tuấn và các cộng sự (2014), "Tác dụng trên bệnh mạch vành của ức chế men chuyển và chẹn thụ thể angiotensin ii ở bệnh nhân tăng huyết áp có điểm gì khác nhau? ", Tim mạch học Việt Nam, 78. Tiếng Anh 6. Natesh R., et al. (2003), "Crystal structure of the human angiotensin- converting enzyme–lisinopril complex", Nature, 421(6922), 551-554. 7. Acharya K., et al. (2003), "Ace revisited: A new target for structure-based drug design", Nature Reviews. Drug Discovery, 2, 891 - 902. 8. Actis-Goretta L., et al. (2006), "Inhibition of angiotensin converting enzyme activity by flavanol-rich foods", Journal of agricultural and food chemistry, 54(1), 229-234. 9. Adam A., et al. (2002), "Aminopeptidase P in individuals with a history of angio-oedema on ACE inhibitors", The lancet, 359(9323), 2088-2089. 10. Angst E., et al. (2013), "The flavonoid quercetin inhibits pancreatic cancer growth in vitro and in vivo", Pancreas, 42(2), 223. 11. Barreca D., et al. (2017), "Neuroprotective effects of phloretin and its glycosylated derivative on rotenone‐induced toxicity in human SH‐SY5Y neuronal‐like cells", BioFactors, 43(4), 549-557. 12. Bateman B. T., et al. (2017), "Angiotensin-converting enzyme inhibitors and the risk of congenital malformations", Obstetrics and gynecology, 129(1), 174. 13. Belal A. (2018), "Drug likeness, targets, molecular docking and ADMET studies for some indolizine derivatives", Die Pharmazie-An International Journal of Pharmaceutical Sciences, 73(11), 635-642. 14. Bondonno N. P., et al. (2019), "Flavonoid intake is associated with lower mortality in the Danish Diet Cancer and Health Cohort", Nature communications, 10(1), 1-10. 15. Booth III J. N., et al. (2017), "Trends in prehypertension and hypertension risk factors in US adults: 1999–2012", Hypertension, 70(2), 275-284. 16. Boots A. W., et al. (2008), "Health effects of quercetin: from antioxidant to nutraceutical", European journal of pharmacology, 585(2-3), 325-337.
  48. 17. Bormann H., et al. (2000), "Inhibition of metallopeptidases by flavonoids and related compounds", Die Pharmazie, 55(2), 129-132. 18. Cheng H.-M., et al. (2017), "Vascular aging and hypertension: implications for the clinical application of central blood pressure", International journal of cardiology, 230, 209-213. 19. Clark J. L., et al. (2015), "Efficacy of flavonoids in the management of high blood pressure", Nutrition reviews, 73(12), 799-822. 20. Coates D. (2003), "The angiotensin converting enzyme (ACE)", The international journal of biochemistry & cell biology, 35(6), 769-773. 21. Corcoran M. P., et al. (2012), "Flavonoid basics: chemistry, sources, mechanisms of action, and safety", Journal of nutrition in gerontology and geriatrics, 31(3), 176-189. 22. Crowley S. D., et al. (2006), "Angiotensin II causes hypertension and cardiac hypertrophy through its receptors in the kidney", Proceedings of the National Academy of Sciences, 103(47), 17985-17990. 23. Dai J., et al. (2010), "Plant phenolics: extraction, analysis and their antioxidant and anticancer properties", Molecules, 15(10), 7313-7352. 24. Fan H., et al. (2019), "Molecular interactions, bioavailability, and cellular mechanisms of angiotensin‐converting enzyme inhibitory peptides", Journal of food biochemistry, 43(1), e12572. 25. Fang L., et al. (2019), "Structural and molecular basis of angiotensin- converting enzyme by computational modeling: Insights into the mechanisms of different inhibitors", PloS one, 14(4), e0215609. 26. Ferreira L. G., et al. (2015), "Molecular docking and structure-based drug design strategies", Molecules, 20(7), 13384-13421. 27. Ferreira L. L., et al. (2019), "ADMET modeling approaches in drug discovery", Drug discovery today, 24(5), 1157-1165. 28. Gohlke H., et al. (2000), "Knowledge-based scoring function to predict protein-ligand interactions", Journal of molecular biology, 295(2), 337-356. 29. González-Segovia R., et al. (2008), "Effect of the flavonoid quercetin on inflammation and lipid peroxidation induced by Helicobacter pylori in gastric mucosa of guinea pig", Journal of gastroenterology, 43(6), 441-447. 30. Guang C., et al. (2012), "Three key proteases–angiotensin-I-converting enzyme (ACE), ACE2 and renin–within and beyond the renin-angiotensin system", Archives of cardiovascular diseases, 105(6-7), 373-385. 31. Guerrero L., et al. (2012), "Inhibition of angiotensin-converting enzyme activity by flavonoids: structure-activity relationship studies", PloS one, 7(11), e49493. 32. Häckl L., et al. (2002), "Inhibition of angiotensin-converting enzyme by quercetin alters the vascular response to bradykinin and angiotensin I", Pharmacology, 65(4), 182-186. 33. Hien H. A., et al. (2018), "Prevalence, awareness, treatment, and control of hypertension and its risk factors in (Central) Vietnam", International journal of hypertension, 2018.
  49. 34. Huang S.-Y., et al. (2010), "Scoring functions and their evaluation methods for protein–ligand docking: recent advances and future directions", Physical Chemistry Chemical Physics, 12(40), 12899-12908. 35. Izzo Jr J. L., et al. (2011), "Angiotensin-converting enzyme inhibitors", Journal of clinical hypertension (Greenwich, Conn.), 13(9), 667-675. 36. Jameson F., Kasper (2018), Harrison's Principles of Internal Medicine 20th edition, McGraw-Hill education, USA. 37. Jiang X.-W., et al. (2017), "Rotenone induces nephrotoxicity in rats: oxidative damage and apoptosis", Toxicology mechanisms and methods, 27(7), 528-536. 38. Kar S., et al. (2020), "Open access in silico tools to predict the ADMET profiling of drug candidates", Expert Opinion on Drug Discovery, 15(12), 1473-1487. 39. Kjeldsen S. E. (2018), "Hypertension and cardiovascular risk: general aspects", Pharmacological research, 129, 95-99. 40. Kozuharova E., et al. (2017), "Amorpha fruticosa–A Noxious Invasive Alien Plant in Europe or a Medicinal Plant against Metabolic Disease?", Frontiers in Pharmacology, 8, 333. 41. Lakhanpal P., et al. (2007), "Quercetin: a versatile flavonoid", Internet Journal of Medical Update, 2(2), 22-37. 42. Laurence L. R. H. (2017), Goodman and Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics 13th edition, McGraw-Hill education, USA. 43. Liang Y., et al. (2015), "Toxicity of amorphigenin from the seeds of Amorpha fruticosa against the larvae of Culex pipiens pallens (Diptera: Culicidae)", Molecules, 20(2), 3238-3254. 44. Lim S. S., et al. (2012), "A comparative risk assessment of burden of disease and injury attributable to 67 risk factors and risk factor clusters in 21 regions, 1990–2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010", The lancet, 380(9859), 2224-2260. 45. Lionta E., et al. (2014), "Structure-based virtual screening for drug discovery: principles, applications and recent advances", Current topics in medicinal chemistry, 14(16), 1923-1938. 46. Lipinski C. A., et al. (1997), "Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings", Advanced drug delivery reviews, 23(1-3), 3-25. 47. Lipinski C. A. (2004), "Lead-and drug-like compounds: the rule-of-five revolution", Drug Discovery Today: Technologies, 1(4), 337-341. 48. Loizzo M. R., et al. (2007), "Inhibition of angiotensin converting enzyme (ACE) by flavonoids isolated from Ailanthus excelsa (Roxb)(Simaroubaceae)", Phytotherapy research: An International Journal Devoted to Pharmacological and Toxicological Evaluation of Natural Product Derivatives, 21(1), 32-36. 49. Lovegrove E., et al. (2020), "Pregnancy protection and pregnancies in women prescribed ACE inhibitors or ARBs: a cross-sectional study in primary care", British Journal of General Practice, 70(700), e778-e784.
  50. 50. Meiqari L., et al. (2019), "Prevalence of hypertension in Vietnam: a systematic review and meta-analysis", Asia Pacific Journal of Public Health, 31(2), 101-112. 51. Meng X.-Y., et al. (2011), "Molecular docking: a powerful approach for structure-based drug discovery", Current computer-aided drug design, 7(2), 146-157. 52. Mensah G. A. (2016), "Hypertension and target organ damage: don’t believe everything you think!", Ethnicity & disease, 26(3), 275. 53. Messerli F. H., et al. (2018), "Angiotensin-converting enzyme inhibitors in hypertension: to use or not to use?", Journal of the American College of Cardiology, 71(13), 1474-1482. 54. Morris G. M., et al. (2008). "Molecular docking" (In Molecular modeling of proteins (pp. 365-382): Springer. 55. Natesh R., et al. (2003), "Crystal structure of the human angiotensin- converting enzyme–lisinopril complex", Nature, 421(6922), 551-554. 56. Neto‐Neves E. M., et al. (2010), "Chronic Treatment with Quercetin does not Inhibit Angiotensin‐Converting Enzyme In Vivo or In Vitro", Basic & clinical pharmacology & toxicology, 107(4), 825-829. 57. Tien N. T., et al. (2018), "Predicting binding modes and affinities for non- nucleoside inhibitors to HIV-1 reverse transcriptase using molecular docking", Science and Technology Development Journal-Natural Sciences, 2(1), 53-58. 58. Ottaviani J. I., et al. (2006), "Procyanidin structure defines the extent and specificity of angiotensin I converting enzyme inhibition", Biochimie, 88(3- 4), 359-365. 59. Piepho R. W. (2000), "Overview of the angiotensin-converting-enzyme inhibitors", American journal of health-system pharmacy, 57(suppl_1), S3- S7. 60. Pires D. E., et al. (2015), "pkCSM: predicting small-molecule pharmacokinetic and toxicity properties using graph-based signatures", Journal of medicinal chemistry, 58(9), 4066-4072. 61. Ruviaro A. R., et al. (2020), "Flavanones biotransformation of citrus by- products improves antioxidant and ACE inhibitory activities in vitro", Food Bioscience, 38, 100787. 62. Sethi A., et al. (2019), "Molecular docking in modern drug discovery: Principles and recent applications", Drug Discovery Develop. New Adv, 27- 39. 63. Shi Y., et al. (2014), "Mitochondrial inhibitor sensitizes non-small-cell lung carcinoma cells to TRAIL-induced apoptosis by reactive oxygen species and Bcl-X L/p53-mediated amplification mechanisms", Cell death & disease, 5(12), e1579-e1579. 64. Sturrock E., et al. (2004), "Structure of angiotensin I-converting enzyme", Cellular and molecular life sciences, 61, 2677-2686.
  51. 65. Svetkey L., et al. (2005), "Effect of lifestyle modifications on blood pressure by race, sex, hypertension status, and age", Journal of human hypertension, 19(1), 21-31. 66. Tung B. T., et al. (2020), "Screening Virtual ACE2 Enzyme Inhibitory Activity of Compounds for COVID-19 Treatment Based on Molecular Docking", VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, 36(4). 67. Umemura S., et al. (2019), "The Japanese Society of Hypertension guidelines for the management of hypertension (JSH 2019)", Hypertension Research, 42(9), 1235-1481. 68. Van De Waterbeemd H., et al. (2003), "ADMET in silico modelling: towards prediction paradise?", Nature Reviews Drug Discovery, 2(3), 192-204. 69. Wang Z., et al. (2016), "Comprehensive evaluation of ten docking programs on a diverse set of protein–ligand complexes: the prediction accuracy of sampling power and scoring power", Physical Chemistry Chemical Physics, 18(18), 12964-12975. 70. Williams B., et al. (2018), "2018 ESC/ESH Guidelines for the management of arterial hypertension: The Task Force for the management of arterial hypertension of the European Society of Cardiology (ESC) and the European Society of Hypertension (ESH)", European heart journal, 39(33), 3021- 3104. 71. Woods D. R., et al. (2000), "The ACE I/D polymorphism and human physical performance", Trends in Endocrinology & Metabolism, 11(10), 416-420. 72. Organization W. H. (2020), "WHO technical specifications for automated non-invasive blood pressure measuring devices with cuff". 73. Yamamoto M., et al. (2008), "Short-term effects of glucosyl hesperidin and hesperetin on blood pressure and vascular endothelial function in spontaneously hypertensive rats", Journal of nutritional science and vitaminology, 54(1), 95-98. 74. Yao L. H., et al. (2004), "Flavonoids in food and their health benefits", Plant foods for human nutrition, 59(3), 113-122. 75. Yılmaz İ. (2019), "Angiotensin-converting enzyme inhibitors induce cough", Turkish thoracic journal, 20(1), 36. 76. Zahedi M., et al. (2013), "Does quercetin improve cardiovascular risk factors and inflammatory biomarkers in women with type 2 diabetes: a double-blind randomized controlled clinical trial", International journal of preventive medicine, 4(7), 777.
  52. PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1. Cấu trúc hóa học của 86 hợp chất flavonoid có điểm số docking tốt. STT Pubchem ID Tên hợp chất Cấu trúc hóa học 1 5213 Silybin 2 6758 Rotenone 3 10621 Hesperidin 4 100157 Amorphigenin 5 124034 Swertisin 6 180589 Diphysolone 7 65084 (+)-Gallocatechin
  53. 8 73384 Brazilin 9 5280805 Rutin OH HO O HO O O 10 5281777 Iridin OH O O OH O O OH 11 5281810 Tectoridin 12 5381351 Quercimeritrin 13 124052 Glabridin 14 5280445 Luteolin
  54. 15 72281 Hesperitin 16 5281803 Pratensein 17 5281614 Fisetin 18 187808 Glycitin Neohesperidin 19 30231 dihydrochalcone (-)-Epigallocatechin 20 65064 gallate 21 163749 2,3-Dihydroauriculatin
  55. Cyanidin 3-O- 22 441674 rutinoside 23 471393 Catechin 7-O-gallate 2'-Hydroxy-7,4- 24 643008 dimethoxyisoflavone Quercetin-3-O- 25 5353915 rhamnoside Kaempferol-7- 26 5483905 neohesperidoside Rhamnetin-3- 27 5491382 rhamnoside
  56. Quercetin 3- 28 5491657 neohesperidoside Kaempferol 3,7- 29 6325460 diglucoside 30 10425234 (+)-Epigallocatechin Apigenin-7-O- 31 10841200 gentiobioside Apigenin-7-O- 32 12304093 glucoside
  57. Kaempferol-3-O- 33 14185731 glucuronoside Quercetin 3,7- 34 15953752 dirhamnoside Catechin 7-O- 35 21676366 apiofuranoside 5-Deoxykievitone 36 44257380 hydrate Apigenin 4'-O- 37 71307301 rhamnoside Pelargonidin 3,5-di- 38 441772 beta-D-glucoside
  58. 7-O-[beta-D- arabinopyranosyl-(1- 39 72193679 >6)-beta-D- glucosyl]apigenin Kaempferol-3-O-beta- glucopyranosyl-7-O- 40 21606527 alpha- rhamnopyranoside Rhamnetin 3-O-beta- 41 14704554 glucopyranoside Quercetin-3,4'-O-di- 42 5320835 beta-glucopyranoside 7-hydroxyflavanon 7- 43 440195 O-beta-D-glucoside
  59. 44 5271805 Ginkgetin 45 442584 Carlinoside 46 638309 Coumestan 47 1548994 Silybin B 48 5274585 Miquelianin 49 5280343 Quercetin 50 5280443 Apigenin
  60. 51 5280746 Apiin 52 5282150 Rhoifolin 53 5282152 Lonicerin 54 5318569 Isoginkgetin 55 11186717 Erylatissin B 56 5281789 Licoisoflavone A
  61. 57 5280378 Formononetin 58 5320053 Neobavaisoflavone 59 5282102 Astragalin 60 5280804 Isoquercetin 61 442813 Ononin 62 64982 Baicalein 7-O- glucuronide
  62. 63 73533 Catechin 7-O-beta-D- xyloside 64 162412 Phaseollinisoflavan 65 443650 Delphinidin 3-O- glucoside 66 480785 3'- Dimethylallylkievitone 67 5282159 Quercetin 3-O- malonylglucoside 68 5387370 Apigenin-7-O- glucuronide
  63. 69 5487635 Quercetin 3- sambubioside 70 5491384 Apigenin-4'-glucoside H H O O O O O O HO O OH H OH 71 5491693 Kaempferol 4'- glucoside 72 9960512 Kaempferol 3-O- gentiobioside 73 10546844 Glycyrrhizaisoflavone B
  64. 74 11954210 Flavonol 7-O-beta-D- HO glucoside O O O O HO O O H H HO 75 14135334 Chrysin-7-O- glucoronide 76 15940724 Genistein-7-O- glucuronide 77 21310440 Kaempferol 3-O-beta- D-xyloside 78 24832108 Globularicitrin
  65. 79 45782816 Genistein 4'-O- glucuronide 80 90657741 Genistin 7-O- gentiobioside 81 135398025 6"-O- molonyltectoridin 82 14057034 4'-Demethyltoxicarol isoflavone 83 21722036 Quercetin 3-O-alpha- L-rhamnopyranosyl- (1->2)-alpha-L- arabinopyranoside
  66. 84 57390614 Kaempferol 3-O-beta- D-galactopyranosyl-7- O-alpha-L- rhamnopyranoside 85 5359430 Quercetin 3-O-alpha- L-fucopyranoside 86 5310763 7-hydroxy-8- (morpholin-4- ylmethyl)-3- phenylchromen-4-one