Khóa luận Bước đầu khảo sát thành phần hóa học của cây bổ béo bốn nhị Gomphandra tetrandra (Wall.) Sleumer., họ thụ đào (Icacinaceae)

Nội dung text: Khóa luận Bước đầu khảo sát thành phần hóa học của cây bổ béo bốn nhị Gomphandra tetrandra (Wall.) Sleumer., họ thụ đào (Icacinaceae)

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN MẠNH KHOA BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY BỔ BÉO BỐN NHỊ Gomphandra tetrandra (Wall.) Sleumer., HỌ THỤ ĐÀO (Icacinaceae) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2020
2. ĐẠ I HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN MẠNH KHOA BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY BỔ BÉO BỐN NHỊ Gomphandra tetrandra (Wall.) Sleumer., HỌ THỤ ĐÀO (Icacinaceae) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: QH.2015.Y NGƯỜI HƯỚNG DẪN: PGS.TS. ĐỖ THỊ HÀ TS. VŨ ĐỨC LỢI HÀ NỘI - 2020
3. LỜI CÁM ƠN Khóa luận này là kết quả của quá trình học tập, rèn luyện của em tại Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và quá trình nghiên cứu, thực hành tại Khoa Hóa Thực vật – Viện Dược liệu. Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu từ các Thầy Cô của Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và các nhà khoa học của Viện Dược liệu cùng gia đình và bạn bè. Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết sâu sắc tới PGS.TS. Đỗ Thị Hà và TS. Vũ Đức Lợi - những người Thầy đã hết lòng tận tình, chỉ bảo em trong quá trình làm khóa luận. Em cũng xin gửi lời cám ơn chân thành đến ThS. Nguyễn Thị Thu, ThS. Vũ Thị Diệp và các cán bộ nghiên cứu tại Khoa Hóa Thực vật – Viện Dược liệu đã giúp đỡ và hướng dẫn em trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn Ban Chủ nhiệm Khoa Y Dược, Bộ môn Dược liệu – Dược học cổ truyền và các Thầy Cô Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho em được thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Em xin gửi lời cám ơn tới ông Đinh Gia Thuyết, phòng Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn huyện Minh Hóa, tỉnh Quảng Bình đã cũng cấp dược liệu và sự tài trợ một phần kinh phí từ đề tài Nghị định thư Việt - Hàn "Nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư và điều hòa miễn dịch của một số cây thuốc Việt Nam" để em thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp này. Cuối cùng, em xin gửi lời cám ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong quá trình học tập cũng như làm đề tài tốt nghiệp. Trong quá trình làm khóa luận không tránh khỏi thiếu sót, em rất mong nhận được sự góp ý của các Thầy Cô để khóa luận của em được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 07 tháng 06 năm 2020 Sinh viên Nguyễn Mạnh Khoa
4. MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT, CÁC KÍ HIỆU DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1.1. Đặc điểm phân bố và thực vật của chi Gomphandra 2 1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của một số loài thuộc chi Gomphandra ở Việt Nam 3 1.1.3. Thành phần hóa học 5 1.1.4. Tác dụng sinh học 6 1.1.5. Công dụng của một số loài thuộc chi Gomphandra 7 1.2.1. Vị trí phân loại của Bổ béo bốn nhị 8 1.2.2. Đặc điểm thực vật và vị trí phân bố 9 1.2.3. Thành phần hóa học 11 1.2.4. Tác dụng sinh học 12 1.2.5. Công dụng 12 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.2.1. Hóa chất 13 2.2.2. Thiết bị 14
5. 2.3.1. Phương pháp định tính các nhóm chất thường gặp bằng phản ứng hóa học 14 2.3.2. Phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất 19 2.3.3. Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất 20 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.3.1. Hợp chất GT-1A2 24 3.3.2. Hợp chất GT-8C1 26 3.4.1. Về định tính 27 3.4.2. Về chiết xuất 27 3.4.3. Về phân lập và xác định cấu trúc hợp chất 28 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
6. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT, CÁC KÍ HIỆU Tên viết tắt Tên viết đầy đủ Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 1H-NMR (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) 5-HMF 5-Hydroxymethyl-2-furfural Cacbon 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 13C-NMR (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13) AARS Aminoacyl-tRNA synthetase ABTS 2,20-Azino-bis-(3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid) AMP Adenosine monophosphate ATP Adenosine triphosphat BmAsnRS Brugia malayi asparaginyl-tRNA synthetase BuOH Butanol CD3OD Deuterated methanol COSY Correlation Spectroscopy DCM Dicloromethane DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DLA Daltons lymphoma ascites DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl EAC Ehrlich’s Ascites Carcinoma Electronspray Ionization Mass Spectrum ESI-MS (Phổ khối ion hóa phun mù điện tử) EtOH Ethanol EtOAc Ethyl acetate
7. Heteronuclear Multiple Bond Correlation HMBC (Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết) High Performance Liquid Chromatography HPLC (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) Heteronuclear Single Quantum Correlation HSQC (Phổ tương tác dị hạt nhân lượng tử đơn) IC50 50% Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế 50%) IL Interleukin m/z Khối lượng/ điện tích MCP-1 Monocyte Chemoattractant Protein-1 MDA Malondialdehyde MeOH Methanol mRNA Messenger RNA (ARN thông tin) TLC Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng) TNF-α Tumor Necrosis Factor-α (Yếu tố hoại tử khối u alpha) tRNA Transfer RNA (ARN vận chuyển) UTI Urinary Tract Infection (Nhiễm trùng đường tiết niệu) v/v Thể tích/ thể tích v/v/v Thể tích/ thể tích/ thể tích
8. DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Đặc điểm thực vật của chi Gomphandra. 3 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của campothecin (1) 5 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của quercetin (2) và luteolin (3) 6 Hình 1.4. Đặc điểm thực vật của mẫu nghiên cứu 10 Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của apigenin-7-O-β-ᴅ-apiofuranosyl-(1->6)-β-ᴅ- glucopyranosid (4) và apigenin-7-O-β-ᴅ-glucopyranosid (5) 11 Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của gonocaryosid A 11 Hình 2.1. Rễ của Bổ béo bốn nhị 13 Hình 3.1. Quy trình chiết xuất cao tổng và các cao phân đoạn từ rễ Bổ béo bốn nhị 23 Hình 3.2. Sắc ký đồ của cao tổng và các cao phân đoạn từ rễ Bổ béo bốn nhị 23 Hình 3.3. Sơ đồ quy trình phân lập các hợp chất từ rễ Bổ béo bốn nhị 24 Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất GT-1A2 25 Hình 3.5. Cấu trúc hóa học của hợp chất GT-8C1 26 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất có trong rễ của dược liệu 21 Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GT-1A2 25 Bảng 3.3. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GT-8C1 27
9. MỞ ĐẦU Việt Nam có một hệ sinh thái phong phú và đa dạng, có tiềm năng to lớn về tài nguyên cây thuốc với 4000 loài cây thuốc, hơn 50 loài tảo biển, 75 loài khoáng vật và gần 410 động vật làm thuốc [2]. Vì vậy, từ xa xưa, ông cha ta đã sử dụng những bài thuốc cổ truyền từ các loại cây để chữa trị một số bệnh thường gặp cũng như nâng cao sức khỏe. Những bài thuốc này được sử dụng rất rộng rãi và cho thấy tính hiệu quả tốt, tuy nhiên đa số chỉ dựa trên kinh nghiệm dân gian mà chưa có cơ ởs khoa học vững chắc. Trong những thập kỷ gần đây, con người dần có xu hướng sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc thảo dược để phòng và trị bệnh. Nền y học cổ truyền ngày càng được quan tâm và phát triển. Với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, ngày càng nhiều loài cây và dược liệu được nghiên cứu sâu về thành phần hóa học, tác dụng sinh học, Những kết quả nghiên cứu đó sẽ là nguồn cung cấp các hợp chất tiềm năng để thử hoạt tính sinh học, phục vụ cho nhiều lĩnh vực khoa học, đặc biệt là y học. Bổ béo bốn nhị (Gomphandra tetrandra (Wall.) Sleumer.) là một trong số các loài cây được sử dụng phổ biến trong dân gian với công dụng chống mệt mỏi, giải khát, tăng cường sức khỏe và chữa viêm tủy xương, viêm dạ dày cấp tính [5, 6]. Các tác dụng sinh học bao gồm chống oxy hóa, dọn dẹp gốc tự do và ức chế enzym lipoxygenase đã được chứng minh bằng thử nghiệm in vitro [39]. Tuy nhiên, hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam, các nghiên cứu về loài này còn khá khiêm tốn. Do vậy, để góp phần cung cấp cơ sở khoa học về thành phần hóa học cho các nghiên cứu về loài này trong tương lai, khóa luận đã được triển khai với đề tài: “Bước đầu khảo sát thành phần hóa học của cây Bổ béo bốn nhị Gomphandra tetrandra (Wall.) Sleumer., họ Thụ đào (Icacinaceae)” với 2 mục tiêu: 1. Định tính được các nhóm chất thường gặp bằng phản ứng hóa học của rễ cây Bổ béo bốn nhị. 2. Chiết xuất, phân lập và xác định được cấu trúc của một số hợp chất từ rễ cây Bổ béo bốn nhị. 1
10. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Tổng quan về chi Gomphandra 1.1.1. Đặc điểm phân bố và thực vật của chi Gomphandra Chi Gomphandra có khoảng 33 loài ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của châu Á, từ vùng Malesia đến New Guinea, quần đảo Solomon và Santa Cruz, cũng như đông bắc Úc và vùng Melanesia. Hai loài xuất hiện ở Ceylon [18]. Một tài liệu khác cho rằng chi Gomphandra có 60 loài phân bố ở Ấn Độ, Trung Quốc và Solomon [46]. Ở Việt Nam, chi Gomphandra có 5 loài, trong đó có 2 hoặc 3 loài có rễ và củ được dùng để làm thuốc [1]. Chi Gomphandra là dạng cây bụi đến cây thân gỗ cỡ trung bình. Cụm hoa mọc ở nách lá, lá mọc đối hoặc lá mọc cuối. Hoa đơn tính. Đài hoa hình chén, liền toàn bộ đến nhọn hoặc chia thùy. Hoa có 4 đến 5 cánh, riêng rẽ hoặc liên kết với nhau. Hoa đực có 4 -5 nhị hoa, các chỉ nhị dẹt và mở rộng ra ở phía trên, nhẵn hoặc thường có lông tơ mọc ở trung tâm, mặt lưng và / hoặc tại vị trí liên kết; bầu nhụy nhỏ chưa phát triển, hình trụ, hình nón hoặc hình trứng. Hoa cái: nhị lép có đặc điểm giống nhị hoa đực, đôi khi có lông tơ; bầu nhụy hình trụ, đôi khi có phần nhô lên ở gốc nhưng không có phần phụ bên, nhụy hoa không có cuống, giống hình đầu ghim, thường chia thùy hoặc đỉnh, cùng phát triển. Quả không phẳng, quả chứa hạt, hình dạng khác nhau, lớp thịt quả mỏng, bên trong lớp vỏ quả giữa thường có 8-13 đường dọc, rãnh nổi bật ở một bên [46]. 2
11. Hình 1.1. Đặc điểm thực vật của chi Gomphandra [46]. A: Cành với cụm hoa cái; B: Cụm hoa đực; C: Quả (mặt lưng và mặt bụng); D: Hoa đực; E: Bầu nhụy với đầu nhụy; F: Nhị hoa (mặt bụng); G: Tràng hoa (đỉnh cánh hoa cụp vào trong). 1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của một số loài thuộc chi Gomphandra ở Việt Nam 1.1.2.1. Bổ béo Gomphandra tonkinensis Gagnep. Bổ béo có tên khoa học là Gomphandra tonkinensis Gagnep. hoặc Gomphandra mollis Merr. còn được gọi là bùi béo, cây béo trắng, trai đang, tiết hùng, lô nội, mao hùng mềm. Đặc điểm là tiểu mộc hoặc đại mộc nhỏ, cao 2-4 m. Rễ mọc thẳng, mập, mềm và nạc, màu trắng ngà, hơi ngọt và đắng. Cành non có lông mịn. Lá có phiến tròn dài, mọc so le, hình ngọn giáo, mép nguyên, chiều dài 15-25 cm, mặt trên nhẵn màu lục sẫm, mặt dưới màu xanh nhạt, có nhiều lông mịn, gân phụ 8-13 cặp; cuống 10-12 mm, có cuống ngắn. Cụm hoa hình ngù kép, hoa nhỏ, màu trắng, phát hoa ở chót nhánh hoặc đối diện với lá; tán kép to 1,5 cm; hoa 5 phân; lá đài 1 mm; vành cao 3-14 mm, 5 tai; tiểu nhụy 5, chỉ cao 4 mm, có lông dài ở 1/3 trên, bao phấn có hai móng; nhụy cái lép ở 3
12. hoa đực. Quả hình thoi có lông, dài 3 cm, đài tồn lại. Mùa hoa quả từ tháng 5 đến tháng 9 [1, 5]. Một tài liệu khác thì cho rằng mùa hoa quả từ tháng 5 đến tháng 7 [8]. Phân bố, sinh thái: Bổ béo là cây ưa ẩm, chịu bóng, thường mọc dưới tán rừng kín thường xanh nguyên sinh hoặc thứ sinh. Đôi khi gặp ở rừng núi đá vôi ẩm hoặc bờ nương rẫy sát bìa rừng. Độ cao phân bố từ vài chục mét đến trên 1000 m. Phân bố chủ yếu ở Thái Nguyên, Bắc Kạn, Cao Bằng, Lạng Sơn, Yên Bái, Tuyên Quang, Hòa Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh [1], Bắc Giang, Phú Thọ, Kon Tum, Lào Cai, Hà Nội, Lâm Đồng [5]. Ở các tỉnh phía Nam thấy ít hơn. Ngoài ra còn ở Trung Quốc và Lào [1]. 1.1.2.2. Gomphandra quadrifida (Bl.) Sleum. var. quadrifida Gomphandra quadrifida (Bl.) Sleum. var. quadrifida còn được gọi mao hùng, chẻ tư. Đặc điểm là cây bụi cao 1 m; nhánh mảnh, tròn, không lông. Lá có phiến tròn dài, kích thước 10-15 x 4-6 cm, đầu có mũi, gân phụ 6-8 cặp, mỏng, không lông, máu nâu lợt lúc khô; cuống dài 1,5 cm. Tụ tán chẻ hai nhiều lần, thành tụ tán bò cạp kép; hoa đực có 4-5 tiểu nhụy, chỉ rời nhau. Quả nhân cứng hình bầu dục, kích thước 8 x 6-7 mm; nội quả bì mỏng, có xơ [8]. Phân bố ở Đồng Nai, Việt Nam [8]. 1.1.2.3. Gomphandra dongnaiensis (Gagn.) Sleum. Gomphandra dongnaiensis (Gagn.) Sleum. còn được gọi là mao hùng Đồng Nai. Đặc điểm là cây đại mộc cao 15 m; nhánh non có lông như nhungsô - cô-la. Lá có phiến to, tròn dài, kích thước đến 20 x 12 cm, đầu có mũi nhọn, mặt trên không lông, mặt dưới như nhung vàng, gân phụ 7-9 cặp, mảnh, xéo; cuống 8 mm. Phát hoa ở nách lá, như đầu trên cọng ngắn; đài cao 3 mm, có ôl ng; cánh hoa 5, dày; tiểu nhụy 5, lưng bao phấn và đầu chỉ có lông dài, nhụy cái lép ở hoa đực. Quả hình thoi, dài 3,5 cm. Mùa hoa quả vào tháng 3 [8]. Phân bố ở thành phố Đà Lạt và huyện Di Linh, Lâm Đồng, Việt Nam [8]. 4
13. 1.1.3. Thành phần hóa học 1.1.3.1. Các alcaloid Nghiên cứu thành phần hóa họcalcaloid ở Úc, kết quả trích dẫn ở 3 mức (cao, trung bình và thấp) cho thấy, Gomphandra montana (Schellenb) Sleum. có hàm lượng alcaloid thấp ở lá và quả; Gomphandra papuana (Becc.) Sleum có hàm lượng alcaloid trung bình ở lá [13]. Khảo sát thành phần hóa học alcaloid ở Malaysia với 3 thuốc thử acid silico tungstic, Meyer và Wagner đã xác đinh được loài Gomphandra affinis có chứa alcaloid ở lá và vỏ thân [11]. Một nghiên cứu khác về tổng hợp các loài chứa alcaloid đã được tiến hành ở Malaysia. Các alcaloid được phát hiện bằng thuốc thử Mayer hoặc Dragendorff hoặc bằng TLC. Kết quả thử nghiệm được đánh giá ở các mức cao, trung bình, thấp hoặc (+) trong trường hợp thu được kết quả dương tính nhưng không xác định được hàm lượng. Gomphandra affinis có chứa hàm lượng alcaloid cao ở lá, hạt và rễ. Gomphandra quadrifida (Bl.) Sleumer var. quadrifida có chứa hàm lượng alcaloid thấp ở lá [28]. Năm 2013, B. Rahesha đã định lượng hàm lượng camptothecin (1) trong các loài G. comosa, G. coriacea, G. polymorpha và G. tetrandra. Kết quả định lượng HPLC cho thấy, hàm lượng camptothecin ở G. comosa là 0,0032% trong quả, G. coriacea là 0,0032 % trong lá, 0,0021% trong cành và 0,0286% trong rễ, G. polymorpha là 0,011% trong quả và G. tetrandra là 0,00045% trong lá và 0,06% trong vỏ thân [47]. Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của campothecin (1) 5
14. 1.1.3.2. Các flavonoid Nghiên cứu một số loài của chi Gomphandra về thành phần flavonoid cho thấy sự có mặt của hợp chất quercetin (2) ở G. quadrifida (BI.) Sleum. var. angustifolia (King) Sleum, G. quadrifida (BI.) Sleum var. ovalifolia (Rid.) Sleum, G. quadrifida (BI.) Sleum var. quadrifida (BI.) Sleum và luteolin (3) ở G. quadrifida (BI.) Sleum. var. angustifolia (King) Sleum. [26]. (2) (3) Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của quercetin (2) và luteolin (3) 1.1.3.3. Các hợp chất khác Năm 2007, Andrzej Marczewski và cộng sự xác định được poly-cis- prenol ở lá cây G. hainanensis bằng sắc ký lớp mỏng trên các tấm silica gel với hàm lượng từ 0,1 đến 1,0% trọng lượng khô. Chiều dài chuỗi polypren của ester carboxylic thay đổi từ 16 đến 40 đơn vị isopren [37]. Khảo sát thành phần hóa học saponin ở Malaysia với thí nghiệm tạo bọt đã xác định có một loài thuộc chi Gomphandra chứa thành phần saponin ở vỏ thân [11]. Ngoài ra, saponin còn có trong lá của G. lysipetala [21]. Năm 2011, Đinh Thị Thanh Mai tiến hành các phản ứng định tính sơ bộ, đã xác định trong rễ cây G. tonkinensis Gagnep. có chứa saponin, đường tự do, chất béo, steroid, polysaccharid và acid amin [9]. 1.1.4. Tác dụng sinh học Năm 2019, Lourdes J. Cruz và cộng sự thực hiện nghiên cứu tìm kiếm các chất ức chế tRNA synthetase chống lại ký sinh trùng. Nghiên cứu này dựa trên thực tế là aminoacyl – tRNA synthetase (AARS) sinh vật nhân chuẩn đóng vai trò quan trọng trong bước đầu tiên của quá trình tổng hợp protein. Chức năng chính của AARS là tạo ra aminoacylat hoặc gắn các tRNA với các acid amin chính xác bằng một phản ứng thuận nghịch hai bước và ester hóa acid 6
15. amin đơn thành tRNA cùng nguồn gốc tương ứng. Đầu tiên, ATP hoạt hóa acid amin để tạo thành một phân tử trung gian aminoacyl adenylat bằng một phản ứng thuận nghịch tạo ra sản phẩm phụ pyrophosphat. Bước thứ hai, acid amin được chuyển chính xác đến tRNA và giải phóng AMP. Nghiên cứu sử dụng Malachite Green để định lượng phosphat được tạo ra bởi AARS trong bước đầu tiên bằng cách thêm pyrophosphatase của vi khuẩn trong hỗn hợp phản ứng, phosphat vô cơ được sản xuất từ pyrophosphat sẽ phản ứng với Malachite Green. AARS được sử dụng trong nghiên cứu là một tRNA synthetase đặc hiệu tái tổ hợp asparagine có nguồn gốc từ giun tròn ký sinh ở người (BmAsnRS) có liên quan chặt chẽ với asparaginyl-tRNA synthetase của con người, là một mục tiêu được công nhận cho phát triển thuốc chống ung thư ở người. Kết quả thu được, cao chiết nước của Gomphandra oblongifolia ức chế hoạt động của BmAsnRS 100% trong khi đó hoạt động ức chế pyrophosphatase của vi khuẩn là không đáng kể [16]. Năm 2008, Liza S. Fernandez và cộng sự khảo sát khả năng chống sốt rét của cao chiết từ cây G. papuana (Becc.) Sleum ở Papua New Guinean và Úc chống lại Plasmodium falciarum. Ở nồng độ 78 μg/mL, cao chiết này có khả năng ức chế > 90% sự phát triển đối với chủng Plasmodium falciparum 3D7 nhạy cảm với chloroquin [24]. 1.1.5. Công dụng của một số loài thuộc chi Gomphandra G. quadrifida được sử dụng ở bán đảo Malaysia, thuốc sắc của rễ hoặc lá được dùng làm thuốc bảo vệ sau khi sinh con. Thuốc sắc của rễ cũng được áp dụng để điều trị bệnh thấp khớp. Trước đây, nhựa gỗ từ thân cây được sử dụng để làm đen răng. Ở Malaysia, thuốc sắc của lá G. quadrifida (Bl.) Sleum. var. angustifolia (King) Sleum. được uống để hỗ trợ phục hồi sau khi sinh [15]. G. oblongifolia đã được báo cáo công dụng trong điều trị rối loạn tiết niệu, sốt và nhiễm khuẩn [16]. Cao thuốc có công dụng hỗ trợ cai nghiện ma túy của N. Radin Supakhan bao gồm: Thanh táo, mắc cỡ, muồng trầu, trầm hương, ô rô biển, một loài bổ béo (Gomphandra sp.), một loài găng (Randia sp.). Mỗi lần dùng 1 muỗng 7
16. canh, ngày đầu tiên 10-15 lần, các ngày sau tối thiểu 5 lần, uống trong 1 tuần lễ. Sau đó dùng ngày 2 lần sau bữa ăn trưa và chiều [49]. Ở vùng Siddapur, Uttara Kannada, Karnataka, Ấn Độ, các cộng đồng dân tộc sử dụng bài thuốc bao gồm: vỏ cây Antidesma acidum, lá cây G. axillaris, lá cây Actinodaphne hookeri và hạt cây Vigna mungo để chữa viêm khớp. Các thành phần trên được nghiền với đường thốt nốt thành bột nhão với đường dùng dạng uống [12]. Ở Bán đảo Malaysia, người dân sử dụng cây G. lanceolata King. để nhuộm răng đen bằng cách sử dụng nhiệt để tách nhựa gỗ và các chất của thân cây sau đó dùng để bôi lên răng [57]. Người dân làng ở Kampung Jeram Kedah, Negeri Sembilan, Malaysia uống thuốc sắc của rễ cây G. lanceolata King. để điều trị sốt, sưng tấy cơ thể [44], sốt cho thanh thiếu niên [43]. Ở Việt Nam, rễ củ của G. mollis Merr. được sử dụng như một loại thuốc bổ, thuốc dạ dày, gây thèm ăn, lợi sữa, lợi tiểu và nhuận tràng. Nó được dùng dưới dạng thuốc sắc, thuốc rượu ngâm hoặc bột [14]. Ngoài ra còn có tác dụng giải khát, giải nhiệt, đồng thời chống mệt mỏi. Theo kinh nghiệm dân gian, rễ bổ béo được dùng làm thuốc bổ, uống lâu ngày người sẽ béo khỏe. Mỗi ngày dùng 10-12 g rễ khô, dưới dạng thuốc sắc hoặc tán bột, trộn mật làm thành viên. Có thể ngâm rượu uống. Bài thuốc chữa kém ăn, mất ngủ, cơ thể mệt mỏi, phụ nữ sau sinh bao gồm rễ bổ béo (20 g), cây ké hoa vàng (20 g), cành lá dạ cẩm (20 g), nhân hạt quả giun (10 g) với dạng dùng là thuốc sắc. Bài thuốc lợi sữa bao gồm rễ bổ béo (20 g), thân cây ớt làn lá to (10 g), rễ xích đồng nam (10 g), rễ hà thủ ô trắng (10 g) với dạng dùng là thuốc sắc. Nhiều loài khác như G. annamensis Gagnep., G. hainanensis Merr. cũng cho rễ với công dụng tương tự. Các loài này là cây nhỏ hơn và lá có ít lông ở mặt dưới [1]. Bổ béo bốn nhị – Gomphandra tetrandra 1.2.1. Vị trí phân loại của Bổ béo bốn nhị Bổ béo bốn nhị hay còn gọi là Mao hùng, Tứ hùng có tên khoa học là Gomphandra tetrandra (Wall.) Sleumer hoặc Lasianthera tetrandra Wall., Gomphandra annamensis Gagnep [8]. Bổ béo bốn nhị có vị trí phân loại như sau [5, 52]: 8
17. Giới Thực vật: Plantae Ngành Ngọc lan: Magnoliophyta Lớp Ngọc lan: Magnoliopsida Bộ Nhựa ruồi: Aquifoliales Họ Thụ đào: Icacinaceae Chi: Gomphandra Loài: Gomphandra tetrandra. 1.2.2. Đặc điểm thực vật và vị trí phân bố Cây bụi hoặc cây thân gỗ nhỏ, cao từ 2 đến 10 m. Vỏ cây màu xám; cành non màu xanh lá cây, có lông tơ màu vàng dày đặc hoặc thưa thớt. Cuống lá dài 0,5-1,5 cm, có lông tơ nhỏ; phiến lá sáng bóng, mặt dưới có màu lục nhạt, mặt trên màu lục sẫm, hình ngọn giáo hẹp hoặc hình elip hẹp hoặc rộng, kích thước 6-15 × 2-6 cm, có màng khi còn non, nhẵn hoặc có lông tơ màu vàng ở mặt dưới, gân chính nổi bật rõ rệt ở mặt dưới, gân phụ có từ 6 đến 8 cặp, không đối xứng tăng dần, gân phụ hình mạng lưới không rõ ràng, gốc lá hình nêm nhọn, đầu lá thuôn dài hoặc có đuôi [8]. Cụm hoa hình xim mọc ở lá đối diện, đôi khi nách lá, kích thước 2-4 cm, lông tơ dày màu trắng vàng; cuống dài 2-5 mm. Hoa đực màu vàng trắng hoặc trắng xanh, có 5 cánh hoa, kích thước 5 mm; đài hoa ngắn, dài đến 0,5 mm, có 5 thùy nông; tràng hoa hình chuông, kích thước 3-4 mm; thùy tựa hình tam giác, đỉnh có mũi nhọn đột ngột, uốn cong; nhị hoa dài hơn một chút so với cánh hoa, kích thước 3,5-4,5 mm; tua nhị phẳng, rộng 1 mm, nhiều nhựa, đỉnh màu trắng hình chùy có lông; bao phấn màu trắng vàng, hình trứng, kích thước 0,5 mm; bầu nhụy chưa phát triển, nhỏ, kích thước 0,5 - 1 mm. Hoa cái màu vàng trắng, kích thước 5 mm; đài hoa giống hoa đực; tràng hoa hình chuông, kích thước 5 mm; thùy hẹp hình tam giác, rìa uốn cong, đỉnh nhọn; nhị hoa chưa phát triển, ngắn hơn tràng hoa; chỉ nhị như trong hoa đực; buồng trứng hình trụ và thon dần, nhẵn hoặc đôi khi có lông tơ; đầu nhụy nhỏ, chia 5 thùy đến bầu nhụy. Quả mọng chứa 1 hạt, thay đổi từ màu xanh lá cây sang màu vàng sang màu trắng, hình elip, kích thước 9
18. (1,2-)2-2,5 cm × (5-)7-12 cm, có đường gân dọc rõ ràng khi khô; cuống quả hơi có lông tơ [53]. Mùa hoa và quả từ tháng 2 đến tháng 10 [8]. Hình 1.4. Đặc điểm thực vật của mẫu nghiên cứu 1: Cành mang lá, rễ; 2: Lá; 3, 4: Hoa và Cụm hoa Bổ béo bốn nhị phân bố ở rừng thưa, rừng rậm, bụi rậm ven đường, thung lũng; độ cao 500 – 2200 m. Bổ béo bốn nhị có ở Trung Quốc (Quảng Đông, Quảng Tây, Quý Châu, Hải Nam, Vân Nam), Campuchia, Ấn Độ, Lào, Myanmar, Sri Lanka, Thái Lan và Việt Nam [53]. Ở Việt Nam, cây phân bố ở Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hà Nội (Ba Vì), Quảng Trị, Thừa Thiên Huế (Bạch Mã), Đà Nẵng (Bà Nà), Phú Yên, Khánh Hòa [8]. 10
19. 1.2.3. Thành phần hóa học Năm 2002, C. Kamperdick và cộng sự đã phân lập được 3 hợp chất từ lá của G. tetrandra bằng sắc ký cột. Tất cả các hợp chất là glycosid. Hợp chất (4) và (5) đều là flavon glycosid với aglycon giống hệt nhau là apigenin- 7-O-β-ᴅ-apiofuranosyl-(1->6)-β-ᴅ-glucopyranosid (4) và apigenin-7-O-β-ᴅ- glucopyranosid (5). Hợp chất (5) có tên là cosmosiin được biết đến như là một tác nhân chống HIV. Gonocaryosid A (6) thuộc secoiridoid monoterpenoid [29]. (4): R = -Glc6 -api (5): R = -Glc Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của apigenin-7-O-β-ᴅ-apiofuranosyl-(1->6)-β-ᴅ- glucopyranosid (4) và apigenin-7-O-β-ᴅ-glucopyranosid (5) Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của gonocaryosid A Năm 2007, Andrzej Marczewski và cộng sự xác định được poly-cis- prenol ở lá cây G. tetrandra bằng TLC trên các tấm silica gel với hàm lượng polyprenol không vượt quá 0,1% trọng lượng khô [37]. Năm 2013, B. Ramesha và cộng sự định lượng được alcaloid camptothecin (1) với hàm lượng trong lá là 0,00045% và trong vỏ thân 0,006% [47]. 11
20. 1.2.4. Tác dụng sinh học 1.2.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào Cao chiết methanol của lá G. tetrandra có tác dụng ức chế 28% đối với các tế bào DLA in vitro và 24,2% đối với các tế bào EAC in vitro ở nồng độ 500 µg/mL [39]. 1.2.4.2. Hoạt tính chống oxy hóa, dọn gốc tự do Các thử nghiệm in vitro đã được thực hiện và cho kết quả, cao chiết methanol của lá G. tetrandra ức chế 50% các gốc tự do superoxid, DPPH, ABTS và hydroxyl lần lượt ở nồng độ 90 ± 7,9; 257 ± 12,3; 65 ± 4,4 và 180 ± 3,1 µg/mL. Dịch chiết ức chế sự tạo thành MDA với giá trị IC50 ở 79 ± 3,4 µg/mL. Hoạt tính khử sắt của 2 µg dịch chiết xuất methanol của lá cây G. tetrandra tương đương với khả năng khử của 0,32 ± 0,13 µmol/ml FeSO4.7H2O [39]. 1.2.4.3. Hoạt tính ức chế enzym lipoxygenase Cao chiết methanol của lá G. tetrandra cho thấy tác dụng ức chế lipoxygenase in vitro phụ thuộc nồng độ với giá trị IC50 là 98,23 ± 1,6 g/ml đối với G. tetrandra và 60,02 ± 2,1 g/ml đối với thuốc chuẩn acid ascorbic [39]. 1.2.5. Công dụng Trong y học cổ truyền, rễ Bổ béo bốn nhị có vị ngọt, hơi đắng, tính bình, có tác dụng thanh nhiệt lợi thấp, giải độc; được sử dụng làm thuốc chữa viêm tủy xương, viêm dạ dày ruột cấp tính [5]. Rễ tươi Bổ béo bốn nhị được sử dụng để chống mệt mỏi, giải khát và tăng cường sức khỏe. Thuốc sắc hoặc cao chiết ethanol của rễ khô khi sử dụng một thời gian dài làm tăng sự khỏe mạnh và hạnh phúc [6]. 12
21. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là rễ của cây Bổ béo bốn nhị (Hình 2.1) thu hái tại huyện Minh Hóa, tỉnh Quảng Bình vào ngày 22/04/2019. Tên khoa học của mẫu nghiên cứu được ThS. Nguyễn Văn Hiếu và ThS. Nguyễn Quỳnh Nga, Viện Dược liệu giám định là Gomphandra tetrandra (Wall.) Sleumer, họ Thụ đào (Icacinaceae), tên Việt Nam là Bổ béo bốn nhị, Tiết hùng nam. Mẫu được lưu tại Phòng Tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dược liệu – Viện Dược liệu với số hiệu: DL-220419. Dược liệu được thái nhỏ, sấy khô và bảo quản trong túi nilon để nơi khô ráo, tránh ẩm. Hình 2.1. Rễ của Bổ béo bốn nhị Hóa chất, thiết bị 2.2.1. Hóa chất + Hóa chất dùng trong định tính: Thuốc thử Mayer, Dragendorff, Bouchardat, diazo, FeCl3 5%, geletin 1%, chì acetat 5%, n-hexan, dicloromethan (DCM), ethyl acetat (EtOAc), methanol (MeOH), ethanol (EtOH), n-butanol (BuOH), toluen, acid acetic, acid formic, . + Dung môi: EtOH, EtOAc, MeOH, DCM, aceton, n-hexan, 13
22. + Dung dịch H2SO4 10% trong EtOH 96% để phát hiện vết chất trên bản mỏng. + Silica gel (0,040-0,063 mm, Merck). + Bản mỏng tráng DC-Alufolien 60G F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm). 2.2.2. Thiết bị + Cân phân tích 4 chữ số Precisa 262SMA-FR. + Bếp đun cách thủy Memmert. + Máy siêu âm. + Đèn UV Camag. + Máy cất quay Buchi. + Tủ sấy Memmert, Binder-FD115. + Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AM 500 FT-NMR spectrometer với chất chuẩn nội là tetramethyl silan (Brucker, Đức). + Sắc ký cột: Các loại cột sắc kí có kích cỡ khác nhau. + Các dụng cụ thí nghiệm thường quy: Ống nghiệm, bình nón, bình gạn, phễu thủy tinh, cốc có mỏ, pipet + Các thiết bị khác: Tủ hút, bếp điện, máy chụp ảnh UV Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp định tính các nhóm chất thường gặp bằng phản ứng hóa học Một số nhóm chất thường gặp trong dược liệu được định tính bằng các phản ứng hóa học theo các tài liệu [3, 4]. 2.3.1.1. Định tính alcaloid Cho 2 g bột dược liệu vào bình cầu dung tích 50 ml. Thêm 15 ml dung dịch H2SO4 1N. Đun cách thủy 30 phút. Để nguội. Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100 ml. Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch ammoniac 6N (khoảng 8 ml) đến pH 9-10 (thử bằng giấy quỳ). Chiết alcaloid base bằng chloroform (chiết 3 lần, mỗi lần 5 ml). Gộp các dịch chiết chloroform. Lắc dịch chiết 14
23. chlorofrom với acid H2SO4 1N (2 lần, mỗi lần 5 ml). Gộp các dịch chiết acid, cho vào 3 ống nghiệm nhỏ, mỗi ống nghiệm 1 ml, để làm các phản ứng sau: Phản ứng với thuốc thử Mayer: Thêm 2 - 3 giọt thuốc thử Mayer, nếu thấy xuất hiện tủa trắng thì phản ứng dương tính. Phản ứng với thuốc thử Bouchardat: Thêm 2 - 3 giọt thuốc thử Bouchardat, nếu thấy xuất hiện kết tủa nâu đỏ thì phản ứng dương tính. Phản ứng với thuốc thử Dragendorff: Thêm 2 - 3 giọt thuốc thử Dragendorff, nếu thấy xuất hiện kết tủa da cam thì phản ứng dương tính. 2.3.1.2. Định tính glycosid tim Lấy 10 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 250 ml, thêm 100 ml ethanol 25% rồi ngâm trong 24h. Lọc dịch chiết vào cốc có mỏ, thêm khoảng 3 ml chì acetat 30%, khuấy đều. Lọc loại tủa, thử dịch lọc vẫn còn tủa với chì acetat, cho thêm 1 ml chì acetat nữa vào dịch chiết, khuấy và lọc lại. Tiếp tục thử đến khi dịch chiết không còn tủa với chì acetat. Cho toàn bộ dịch lọc vào bình gạn và lắc kỹ với chloroform (3 lần, mỗi lần 5 ml), gạn lấy lớp chloroform vào cốc có mỏ khô sạch. Chia dịch chiết vào các ống nghiệm nhỏ, bốc hơi dung môi, cho từ trên nồi cách thuỷ cho đến khô. Cắn còn lại để làm các phản ứng định tính sau: Phản ứng Liebermann-Burchardat: Hòa tan cắn trong ống nghiệm 1 bằng 1 ml anhydrid acetic, lắc đều. Nghiêng ống 45o cho từ từ theo thành ống 1 ml H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Quan sát nếu thấy mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện vòng màu tím đỏ, lớp chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp trên màu xanh lá thì phản ứng dương tính. Phản ứng Baljet: Hòa tan cắn trong ống nghiệm 2 bằng khoảng 1 ml ethanol 90%, lắc đều, nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha (1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%) nếu thấy xuất hiện màu đỏ cam thì phản ứng dương tính. Phản ứng Legal: Hòa tan cắn trong 0,5 ml ethanol 90%, lắc kỹ. Nhỏ 1 giọt thuốc thử Natrinitroprussiat 1% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%. Lắc đều, nếu thấy xuất hiện màu đỏ cam thì phản ứng dương tính. 15
24. 2.3.1.3. Định tính saponin Quan sát hiện tượng tạo bọt: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết ethanol. Thêm nước cất đến khoảng 10 ml, bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc 5 phút, để yên và quan sát cột bọt thấy cột bọt bền sau 15 phút thì dương tính. Phản ứng Salkowski: Lấy 2 ml dịch chiết ethanol cho vào ống nghiệm, o nghiêng ống 45 , cho từ từ 2 - 3 giọt H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm, mặt phân cách xuất hiện vòng ỏđ tím, lắc nhẹ dung dịch có màu ỏđ thì dương tính. 2.3.1.4. Định tính Flavonoid Phản ứng cyanidin: Cho 2 ml dịch chiết ethanol vào một ống nghiệm, thêm một ít bột magie kim loại, rồi thêm vài giọt HCl đặc. Đun nóng trên bếp cách thủy sau vài phút thấy xuất hiện màu tím đỏ thì dương tính. Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: Cho 2 ml dịch chiết ethanol vào một ống nghiệm, thêm 2 - 3 giọt FeCl3 5% , dung dịch có màu xanh sẫm thì dương tính. Phản ứng với kiềm: + Nhỏ vài giọt dịch chiết ethanol lên một mảnh giấy lọc, hơ khô rồi đặt mảnh giấy lên miệng lọ amoniac đặc thấy màu vàng hiện rõ, khi soi dưới đèn tử ngoại thấy có màu vàng sáng thì dương tính. + Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết ethanol. Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% sẽ thấy xuất hiện tủa vàng, thêm 1 ml nước cất, tủa tan và màu vàng của dung dịch tăng lên thì dương tính. 2.3.1.5. Định tính Coumarin: Phản ứng mở và đóng vòng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết ethanol: + Ống 1: Thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10% + Ống 2: Để nguyên Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi. Để nguội rồi quan sát. 16
25. + Ống 1: Có màu vàng hoặc tủa đục màu vàng thì phản ứng dương tính. + Ống 2: Trong Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml nước cất. Lắc đều rồi quan sát + Ống 1: Trong suốt thì phản ứng dương tính. + Ống 2: Có tủa đục Phản ứng diazo hóa: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết. Thêm vào 2 ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thủy đến sôi rồi để nguội. Nhỏ vài giọt thuốc thử diazo mới pha, xuất hiện màu đỏ gạch thì phản ứng dương tính. 2.3.1.6. Định tính Anthranoid: Cho vào ống nghiệm 2 g dược liệu. Thêm 5 ml dung dịch H2SO4 1N. Đun trực tiếp trên nguồn nhiệt đến sôi. Lọc nóng dịch chiết vào bình gạn dung tích 50 ml. Làm nguội dịch lọc. Chiết với chloroform (5 ml). Giữ lớp chloroform để làm phản ứng: Phản ứng Borntraeger: + Lấy 1ml dịch chiết chloroform, thêm 1 ml dung dịch amoniac. Lắc nhẹ, lớp nước có màu đỏ sim. Nếu lớp chloroform có màu vàng chứng tỏ trong dược liệu có chứa acid chrysophanic. Thêm tiếp từng giọt dung dịch NaOH 10%. Lắc nhẹ. Lớp chloroform mất màu, lớp nước màu đỏ đậm hơn lúc ban đầu. + Lấy 1 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm. Thêm 1 ml dung dịch NaOH 10%. Lắc nhẹ. Lớp nước có màu ỏđ sim thì phản ứng dương tính. 2.3.1.7. Định tính acid hữu cơ Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết ethanol và cô tới cắn. Hòa tan cắn trong 1ml nước và thêm vài tinh thể natri carbonat thấy có bọt khí nổi lên thì dương tính. 2.3.1.8. Định tính acid amin Lấy 3 ml dịch chiết ethanol cho vào ống nghiệm. Thêm 1 - 3 mảnh ninhydrin, đun sôi 2 phút, dung dịch chuyển màu tím thì dương tính. 17
26. 2.3.1.9. Định tính Tannin Lấy 2 g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 20 ml nước cất, đun sôi 2 phút. Để nguội, lọc. Dịch lọc dùng để định tính. Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch lọc. Thêm 2-3 giọt dung dịch FeCl3 5%, xuất hiện màu hoặc tủa xanh đen hoặc xanh nâu nhạt thì phản ứng dương tính. Phản ứng với dung dịch Pb(CH3COO)2 10%: Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch lọc. Thêm 2 giọt dung dịch Pb(CH3COO)2 10%, xuất hiện tủa bông thì phản ứng dương tính. Phản ứng với dung dịch Gelatin 1%: Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1%, xuất hiện tủa bông trắng thì dương tính. 2.3.1.10. Định tính đường khử Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết nước. Thêm vào 0,5 ml dung dịch Fehling A và 0,5 ml dung dịch Fehling B. Đun sôi cách thủy vài phút thấy xuất hiện tủa đỏ gạch thì phản ứng dương tính. 2.3.1.11. Định tính chất béo Nhỏ vài giọt dịch chiết ethanol lên giấy lọc, hơ khô thấy để lại vết mờ trên giấy thì phản ứng dương tính. 2.3.1.12. Định tính carotenoid Cho vào ống nghiệm một ít cắn ethanol khô. Thêm 1- 2 giọt H2SO4 đặc, thấy xuất hiện màu xanh ve thì phản ứng dương tính. 2.3.1.13. Định tính polysaccharid Hòa tan cắn ethanol vào 4 ml nước nóng, lọc nóng thu được dịch lọc. Cho vào 2 ống nghiệm: Ống 1 gồm 4 ml nước cất + 5 giọt thuốc thử Lugol, ống 2 gồm 4 ml dịch lọc + 5 giọt thuốc thử Lugol. Quan sát màu ống 2 đậm hơn ống 1 thì phản ứng dương tính. 18
27. 2.3.1.14. Định tính phytosterol Cho vào ống nghiệm một ít cắn ethanol khô, hòa tan trong 2 ml chloroform và 1 ml anhydrid acetic. Để ống nghiệm nghiêng 45°, thêm từ từ H2SO4 đậm đặc theo thành ống nghiệm thấy mặt phân cách có vòng tím đỏ, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá thì phản ứng dương tính. 2.3.2. Phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất Rễ cây Bổ béo bốn nhị được chiết xuất với EtOH 80% ở nhiệt độ phòng sau đó loại bã dược liệu, gộp các dịch chiết và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao toàn phần. Cao toàn phần được phân tán trong nước nóng và chiết phân đoạn lần lượt với dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, EtOAc và BuOH thu được các phân đoạn tương ứng. Phân lập các hợp chất bằng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel (0,040-0,063 mm, Merck) kết hợp với sắc ký lớp mỏng. Sắc ký cột được tiến hành như sau: + Khảo sát cao tổng bằng sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi khác nhau, chọn hệ dung môi có khả năng tách tốt nhất để làm dung môi chạy cột. + Chuẩn bị cột: Cột sắc ký khô, sạch, lắp thẳng đứng trên giá cố định. Nhồi một lớp bông xuống đáy cột. Cân một lượng chất nhồi cột thích hợp vào cốc, tiếp theo thêm dung môi thích hợp vào khuấy đều cho hết bọt khí. Đưa từ từ hỗn hợp chất nhồi cột lên cột, gõ nhẹ, đều tránh bọt khí. Sau đó, tiếp tục cho dung môi chảy liên tục qua cột đến khi cột ổn định. + Nạp mẫu: Dùng pipet đưa mẫu vào cột. Sau đó, sử dụng dung môi rửa giải chạy qua cột cho đến khi ổn định, đặt một miếng bông lên để bảo vệ bề mặt cột. + Khai triển cột: Sử dụng hệ dung môi thích hợp để khai triển cột. + Theo dõi các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng. Phát hiện các chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm, 366 nm và quan sát dưới ánh sáng thường sau khi phu thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH 96% và hơ nóng. 19
28. + Thu gom các phân đoạn có sắc ký ồđ giống nhau. + Kiểm tra độ sạch của các chất phân lập được bằng sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi phù hợp. 2.3.3. Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên tính chất vật lý và các phương pháp phổ bao gồm [4]: + Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H, 13C, DEPT, HSQC, HMBC, COSY), + Phổ khối ion hóa phun mù điện tử (ESI-MS) + Kết hợp với tính chất vật lý và so sánh với các dữ liệu phổ đã công bố trong tài liệu tham khảo. 20
29. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết quả định tính các nhóm chất Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp trong mẫu nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất có trong rễ của dược liệu STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Phản ứng Cyanidin - 1 Flavonoid Phản ứng với FeCl3 5% + Phản ứng với kiềm - Phản ứng mở và đóng vòng lacton - 2 Coumarin Phản ứng với thuốc thử diazo - Phản ứng tạo bọt ++ 3 Saponin Phản ứng Salkowski +++ Phản ứng với thuốc thử Mayer - 4 Alcaloid Phản ứng với thuốc thử Bouchardat - Phản ứng với thuốc thử Dragendorff - Phản ứng với dd FeCl3 5% + 5 Tanin Phản ứng với dd chì acetat 10% + Phản ứng với dd gelatin 1% - 6 Anthranoid Phản ứng Borntraeger - Phản ứng Liebermann + 7 Glycosid tim Phản ứng Baljet - Phản ứng Legal - 8 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 - 21
30. Phản ứng với thuốc thử Fehling A và 9 Đường khử ++ thuốc thử Fehling B 10 Acid amin Phản ứng với Ninhydrin 3% - 11 Polysaccharid Phản ứng với thuốc thử Lugol - 12 Chất béo Tạo vết mờ trên giấy - 13 Carotenoid Phản ứng với H2SO4 đặc + 14 Phytosterol Phản ứng Liebermann + Ghi chú: (+): Dương tính, (++): Dương tính rõ, (+++): Dương tính mạnh, (-): Âm tính Nhận xét: Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học cho thấy trong rễ Bổ béo bốn nhị có các nhóm chất saponin, đường khử, carotenoid và phytosterol. Kết quả chiết xuất và phân lập các hợp chất Rễ Bổ béo bốn nhị (1,0 kg) được ngâm lạnh ở nhiệt độ phòng với dung môi EtOH 80%, 3 lần x 4 ngày. Lọc loại bã dược liệu, gộp các dịch chiết và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 262,83 g cao tổng EtOH 80%. Phân tán cao tổng (200,72 g) trong nước nóng và chiết phân đoạn với các dung môi có ộđ phân cực tăng dần: n-hexan, EtOAc và BuOH. Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các cao phân đoạn tương ứng: Cao n-hexan (6,62 g), EtOAc (5,23 g), BuOH (23,39 g) và cắn nước (136,23 g). Quy trình chiết xuất cao tổng và các cao phân đoạn được tóm tắt ở sơ đồ hình 3.1. 22
31. Rễ Bổ béo bốn nhị (1 kg) 1. Chiết EtOH 80%, 3 lần x 4 ngày 2. Loại bã dược liệu, gộp dịch chiết 3. Cất thu hồi dung môi Cao tổng (260,83 g) 1. Phân tán trong nước nóng 2. Chiết phân đoạn lần lượt với n- hexan, EtOAc và BuOH 3. Cất thu hồi dung môi Cắn n-hexan Cao EtOAc BuOH Cắn nước (6,62g) (5,23 g) (23,39g) (136,23 g) Hình 3.1. Quy trình chiết xuất cao tổng và các cao phân đoạn từ rễ Bổ béo bốn nhị Sắc ký ồđ của cao tổng và cao phân đoạn được thể hiện qua hình 3.2. A B C Hình 3.2 Sắc ký ồđ của cao tổng và các cao phân đoạn từ rễ Bổ béo bốn nhị (Hệ dung môi triển khai EtOAc-MeOH-H2O 80:15:5, v/v/v; A: UV 254 nm, B: UV 366 nm; C: Quan sát ở ánh sáng thường sau khi phu thuốc thử H2SO4 10%/ EtOH 96% và hơ nóng) 23
32. Cao BuOH (20,42 g) được phân tách bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi rửa giải gradient là EtOAc-MeOH-H2O (90:9:1-70:25:5, v/v/v) thu được 9 phân đoạn (1A-1I). Phân lập phân đoạn 1A (290,0 mg) bằng sắc ký cột silica gel với dung môi rửa giải gradient là DCM-EtOAc (9:1-6:4, v/v) thu được hợp chất GT-1A2 (10,0 mg). Hợp chất GT-8C1 (10,0 mg) thu được từ phân đoạn 1B (500,0 mg) bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi rửa giải là EtOAc-MeOH-H2O (90:9:1, v/v/v) và DCM-MeOH (9:1, v/v). Quy trình phân lập các hợp chất từ cao BuOH được tóm tắt ở hình 3.3. Cao BuOH (20,42 g) Sắc ký cột Hệ dung môi EtOAc-MeOH-H2O (90:9:1-70:25:5, v/v/v) 1B 1A 1C-1I (290 mg) (500 mg) Sắc ký cột Sắc ký cột DCM-EtOAc (9:1-6:4, v/v) EtOAc-MeOH-H2O (90:9:1, v/v/v) và DCM-MeOH (9:1, v/v) GT-1A2 GT-8C1 (10,0 mg) (10,0 mg) Hình 3.3. Sơ đồ quy trình phân lập các hợp chất từ rễ Bổ béo bốn nhị Kết quả xác ịđ nh cấu trúc của các hợp chất 3.3.1. Hợp chất GT-1A2 Hợp chất GT-1A2 thu được dưới dạng bột màu vàng; 1H-NMR (500 Hz, 13 CD3OD) và C-NMR (125 Hz, CD3OD): Bảng 3.2; ESI-MS m/z: 143,2 + [M+NH3] (positive). Phổ 1H-NMR của hợp chất GT-1A2 có 2 tín hiệu của proton olefin xuất hiện dưới dạng pic doublet ở độ chuyển dịch δH 6,60 (1H, d, J = 3,5 Hz) và 7,40 24
33. (1H, d, J = 3,5 Hz), một proton của nhóm carbaldehyd tại δH 9,56 (1H, s) và 2 13 proton của nhóm hydroxymethylen tại δH 4,63 (2H, s). Phổ C-NMR và phổ DEPT của hợp chất GT-1A2 xuất hiện tín hiệu của 6 carbon trong đó có 4 carbon có ộđ chuyển dịch từ 110,9 đến 163,2 ppm nằm trong vùng thơm hoặc liên kết đôi C=C bao gồm 2 carbon không liên kết với hydro [δC 153,9 (C-2) và 163,2 (C-5)] và 2 carbon methin [δC 125,0 (C-3) và 110,9 (C-4)]. Tín hiệu carbon của nhóm -C=O và nhóm -CH2 đính với nguyên tử oxy xuất hiện ở độ chuyển dịch lần lượt là 179,4 và 57,7 ppm. Dựa vào tất cả dữ kiện phổ có thể khẳng định GT-1A2 là hợp chất hữu cơ thơm, có vòng furan bị thế bởi hai nhóm thế; một nhóm carbaldehyd và một nhóm hydroxymethyl. Phổ ESI-MS + cho pic ion giả phân tử ở m/z: 143,2 [M+NH3] (positive) phù hợp với công thức phân tử C6H6O3 (M = 126). Từ những dữ liệu trên đối chiếu với tài liệu đã công bố, hợp chất GT- 1A2 được xác định là 5-(hydroxymethyl)furan-2-carbaldehyd hay hydroxymethylfurfural (Hình 3.4) [7]. Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất GT-1A2 Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GT-1A2 a,c a,b C/H δH (độ bội, J = Hz) δC δC 2 153,9 153,9 3 7,40 (1H, d, 3,5) 125,0 124,8 4 6,60 (1H, d, 3,5) 110,9 110,9 5 163,2 163,2 2-CHO 9,56 (1H, s) 179,4 179,4 5-CH2OH 4,63 (2H, s) 57,7 57,6 a δC của hydroxymethylfurfural đo trong CD3OD [7]; Đo trong CD3OD, b 125 MHz, c 500 MHz. 25
34. 3.3.2. Hợp chất GT-8C1 Hợp chất GT-8C1 thu được dưới dạng chất rắn màu vàng; 1H-NMR (500 13 MHz, CD3OD) và C-NMR (125 MHz, CD3OD): Bảng 3.3. Phổ 1D-NMR của GT-8C1 cho thấy sự xuất hiện của 1 vòng p- hydroxyphenyl với các tín hiệu theo cặp tại δH 6,98 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2, H- 6); 6,71 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3, H-5) và δC 119,4 (C-2, C-6), 116,6 (C-3, C-5) cùng với các tín hiệu của carbon không liên kết với hydro tại δC 152,4 (C-1) và 153,9 (C-4). Ngoài ra, phổ 1H-NMR còn cho thấy sự có mặt của gốc đường β- ᴅ-glucopyranosid trong cấu trúc của GT-8C1 với sự xuất hiện của proton anomeric tại δH 4,75 (1H, d) với hằng số ghép lớn (J = 7,5) và các tín hiệu nằm trong vùng 3,40 - 3,90 ppm. Phổ 13C-NMR cũng cho thấy sự có mặt của gốc đường trong cấu trúc của GT-8C1 với sự xuất hiện của 6 tín hiệu carbon tại δC 103,6 (C-1ʹ), 75,0 (C-2ʹ), 78,0 (C-3ʹ), 71,4 (C-4ʹ), 78,0 (C-5ʹ) và 62,6 (C-6ʹ). Tương tác giữa H-1ʹ (δH 4,75) với C-1 (δC 152,4) cho phép xác định vị trí của gốc đường tại C-1. Từ những dữ liệu trên đối chiếu với hợp chất arbutin trong tài liệu [42] đã công bố, GT-8C1 được xác định là arbutin (Hình 3.5). Hình 3.5. Cấu trúc hóa học của hợp chất GT-8C1 26
35. Bảng 3.3. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GT-8C1 a,c a,b * C/H δH (độ bội, J = Hz) δC δC 1 - 152,4 153,4 2, 6 6,98 (2H, d, 8,5) 119,4 121,4 3, 5 6,71 (2H, d, 8,5) 116,6 119,2 4 - 153,9 154,2 1ʹ 4,75 (1H, d, 7,5) 103,6 104,3 2ʹ 75,0 75,9 3,44 (2H, m) 3ʹ 78,0 79,0 4ʹ 71,4 72,4 3,40 (2H, m) 5ʹ 78,0 78,5 3,90 (1H, dd, 1,0; 12,0) 6ʹ 62,6 63,5 3,71 (1H, m) * a b c δC của arbutin [42]; Đo trong CD3OD, 125 MHz, 500 MHz. Bàn luận 3.4.1. Về định tính Phương pháp định tính 14 nhóm chất hữu cơ thường gặp trong dược liệu nhằm đánh giá sơ bộ các nhóm chất có thể có trong mẫu nghiên cứu. Từ đó có thể lựa chọn các phương pháp chiết xuất và phân lập phù hợp. Phương pháp này đơn giản, dễ thao tác, phù hợp với nhiều mẫu nghiên cứu. Kết quả định tính cho thấy rễ Bổ béo bốn nhị có chứa các nhóm chất saponin, carotenoid, đường khử và phytosterol. 3.4.2. Về chiết xuất Dược liệu được chiết xuất bằng phương pháp ngâm lạnh với dung môi là EtOH 80%. Đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm. EtOH là dung môi chiết được nhiều nhóm hoạt chất, an toàn với môi trường và giá thành rẻ. Cao chiết tổng sau đó được phân tán trong nước 27
36. nóng và chiết thành các cao phân đoạn với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, EtOAc, BuOH để phân tách các hợp chất một cách thuận lợi. 3.4.3. Về phân lập và xác định cấu trúc hợp chất Quá trình phân lập các chất hóa học sử dụng phương pháp sắc ký cột thường quy, phương pháp này dễ thực hiện, chi phí thấp và phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm. Sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để lựa chọn phân đoạn, thăm dò ệh dung môi rửa giải, định tính các chất trong phân đoạn và theo dõi các chất trong quá trình phân lập. Với phương pháp sắc ký và hệ dung môi rửa giải phù hợp, kết quả là đã phân lập được 2 hợp chất GT-1A2 và GT-8C1. Dựa vào dữ liệu phổ MS, 1H- NMR, 13C-NMR, DEPT, HSBC, COSY, HMBC và đối chiếu với các tài liệu đã được công bố, đã xác định cấu trúc của các chất trên lần lượt là: Hydroxymethylfurfural và arbutin. Hai hợp chất trên được phân lập lần đầu tiên từ cây Bổ béo bốn nhị và chi Gomphandra. Một số loài thực vật khác cũng cho thấy sự xuất hiện của hai hợp chất này với các tác dụng dược lý khác nhau đã được nghiên cứu. 3.4.3.1. Hợp chấtHydroxymethylfurfural Hydroxymethylfurfural hay còn được gọi là 5-hydroxymethyl-2-furfural được tìm thấy trong mật ong, trái cây sấy khô, sản phẩm có chứa caramel, nước ép táo, bia, rượu mạnh, sữa, cà phê, [41, 48]. Nghiên cứu in vitro cho thấy 5-hydroxymethyl-2-furfural hình thành liên kết cơ sở Schiff có ái lực cao với hồng cầu hình liềm và ức chế hình thành hồng cầu hình liềm bằng cách chuyển dịch đường cong cân bằng oxy về phía bên trái. Nghiên cứu trên chuột hồng cầu liềm chuyển gen (Tg) cho thấy 5-HMF dùng đường uống hấp thụ nhanh vào máu qua đường tiêu hóa mà không bị phá hủy. 5-HMF đi qua màng tế bào hồng cầu, đồng thời gắn và biến đổi các phân tử HbS ở với tỉ lệ 90%. Ngoài ra, 5-HMF ức chế sự hình thành tế bào hình liềm và kéo dài đáng kể thời gian sống trong tình trạng thiếu oxy nghiêm trọng của chuột so với những con chuột không được điều trị (chết trong vòng 15 phút do sự cô lập phổi phụ thuộc vào tế bào liềm) [10]. 28
37. Nghiên cứu tác dụng in vitro của 5-HMF ở các nồng độ khác nhau đối với ái lực oxy và sự ổn định của hồng cầu trong máu của tình nguyện viên khỏe mạnh và bệnh nhân thiếu máu hồng cầu hình liềm có hoặc không điều trị bằng hydroxyurea. Kết quả cho thấy các tế bào hồng cầu từ bệnh nhân thiếu máu hồng cầu hình liềm được điều trị bằng hydroxyurea có ái lực với oxy cao hơn đáng kể so với các bệnh nhân không được điều trị bằng hydroxyurea. 5-HMF làm tăng ái lực oxy trong hồng cầu hình liềm phụ thuộc nồng độ và tác dụng này nổi bật hơn khi kết hợp với hydroxyurea. 5-HMF ở nồng độ cao giúp ổn định các tế bào hồng cầu chống lại áp lực biến dạng in vitro [38]. Sử dụng xét nghiệm vi lỏng trong trường hợp thiếu oxy để theo dõi tế bào hình liềm và định lượng tác dụng chống liềm của 5-HMF ở nồng độ millimol (mM) trong máu của bệnh nhân hồng cầu hình liềm khi điều trị bằng hydroxyurea hoặc không điều trị bằng hydroxyurea. Kết quả là đã xác nhận hiệu quả khả năng chống tế bào hình liềm của 5-HMF đối với mẫu bệnh nhân có hoặc không có điều trị hydroxyurea đều phụ thuộc vào liều dùng [22]. Nghiên cứu tính an toàn, dung nạp và dược động học của liều 5-HMF uống một lần trong thử nghiệm mù đôi, nhóm đối chứng giả dược, tăng liều ở bệnh nhân trưởng thành bị thiếu máu hồng cầu hình liềm khi điều trị bằng hydroxyurea và không điều trị bằng hydroxyurea trên 18 bệnh nhân tham gia thử nghiệm. Kết quả cho thấy 5-HMF được dung nạp an toàn mà không có biến chứng nặng trong khoảng 13 lần liều uống. Một nghiên cứu ngẫu nhiên có kiểm soát giai đoạn 2 về 5-HMF và giả dược được thực hiện với liều dùng hàng ngày trong 28 ngày ở bệnh nhân thiếu máu hồng cầu hình liềm [30]. Tuy nhiên nghiên cứu đã kết thúc trước khi hoàn thành do không làm mù giữa sản phẩm nghiên cứu và nhóm giả dược cho người tham gia. Ngoài ra, 5-HMF đã được chứng minh là có nhiều tác dụng khác như chống oxy hóa [55], chống dị ứng [54], chống viêm [31], chống chấn thương do thiếu oxy [34], tác dụng chống tăng acid uric máu [36]. 3.4.3.2. Hợp chấtArbutin Arbutin được tìm thấy trong các loài thuộc họ Asteraceae, Rosaceae, Lamiaceae và Apiaceae; đặc biệt cao chiết có chứa arbutin từ lá của 29
38. Arctostaphyllos uva-ursi (Ericaceae) là liệu pháp thực vật được sử dụng trong nhiều thế kỷ. Nó xuất hiện ở các loài thuộc chi Origanum, lê, các sản phẩm lúa mì, cà phê và trà [40]. Cao chiết nước và ethanol của các thực vật có chứa arbutin được sử dụng trong điều trị nhiễm trùng đường tiết niệu chủ yếu là các thành phần của các loại thuốc chứa hỗn hợp thảo dược [40]. Hydroquinon như một aglycon của arbutin chịu trách nhiệm cho tác dụng kháng khuẩn của cao chiết thực vật, có đặc tính kháng khuẩn, làm se và chống oxy hóa. Trong cơ thể, arbutin được hấp thu ở dạng gần như không thay đổi ở ruột và bị phân hủy bởi β-glucosidase trong gan thành hydroquinon và glucose [20]. Theo hướng dẫn của cơ quan Dược phẩm châu Âu, sử dụng arbutin với liều 400-800 mg/ ngày dùng trong 2-3 ngày có hiệu quả trong điều trị nhiễm trùng đường tiết niệu (UTI), tương ứng với thuốc sắc chứa từ 5 đến 10 g lá A.uva-ursi. Thuốc sắc có hiệu quả chủ yếu là chống lại vi khuẩn E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis và Staphylococcus aureus [23]. Sử dụng các cao chiết có chứa arbutin kết hợp với các tác nhân hóa trị liệu có hiệu quả hơn và ít độc hơn trong điều trị UTI, so với chỉ dùng hóa trị liệu [25]. Arbutin tác động đến sắc tố da, giảm sinh tổng hợp melanin bằng cách ức chế hoạt động của tyrosinase nhưng không ảnh hưởng đến sự biểu hiện và tổng hợp mRNA của tyrosinase (tyrosinase là một enzym chủ yếu xúc tác cho sự tổng hợp melanin trong tế bào melanocytes) [35]. Ngoài ra, arbutin ức chế hoạt động 5,6-dihydroksyindol-2-carboxylic acid polymerase và ngăn chặn quá trình trùng hợp oxy hóa của các chất trung gian melanogen [45]. Một nghiên cứu khác chỉ ra rằng, arbutin là chất chống oxy hóa tương đương hoặc thậm chí mạnh hơn so với hydroquinon. So với hydroquinon, arbutin thể hiện hoạt động mạnh hơn đối với ABTS và yếu hơn đối với DPPH. Hoạt động chống oxy hóa của arbutin kéo dài hơn so với hydroquinon. Tác dụng chống oxy hóa cũng được xác nhận trên tế bào hồng cầu và nguyên bào sợi da [51]. Arbutin có tác dụng chống viêm, làm giảm sản xuất oxit nitric và biểu hiện nitric oxide synthase của cyclooxygenase-2 (COX-2) trong các dòng tế 30
39. bào vi mô chuột BV2 được kích thích bởi lipopolysaccharid. Cơ chế hoạt động là do ức chế các cytokinin gây viêm IL-1β, TNF-α và MCP-1 [32]. Đặc tính chống viêm của arbutin đã được xác nhận trong các nghiên cứu in vivo trên chuột và xét nghiệm in vitro sử dụng các dòng tế bào loét dạ dày. Kết quả cho thấy rằng, arbutin thể hiện tác dụng bảo vệ niêm mạc dạ dày, giảm hàm lượng niêm mạc, khu vực loét và viêm. Đặc tính chống viêm bao gồm ức chế peroxid hóa lipid, điều chỉnh nồng độ TNF-α, IL-6 và IL-10 [50]. Các nghiên cứu in vitro chỉ ra hoạt động chống ung thư của arbutin. Nghiên cứu tác dụng của arbutin trên tế bào u ác tính B16 của chuột cho thấy, arbutin làm giảm đáng kể khả năng sống của tế bào, thúc đẩy quá trình chết theo chương trình của tế bào, gây ra sự bắt giữ chu kỳ tế bào G1 và gây ra sự phá vỡ ty thể trong các tế bào u ác tính B16 [27]. Ở một nghiên cứu khác, arbutin ức chế kinase điều hòa tín hiệu ngoại bào (extracellular signal-regulated kinase) và tăng biểu hiện của protein p21. Do đó, ức chế tăng sinh tế bào ung thư bàng quang TCCSUP ở người [33]. Với nồng độ arbutin tối ưu có thể kéo dài tuổi thọ và tăng cường khả năng chống lại stress oxy hóa của Caenorhabditis elegans [56]. Một nghiên cứu khác chỉ ra rằng, arbutin cải thiện biểu hiện hành vi, giảm stress oxy hóa và nitro hóa trong mô hình động vật bị bệnh Parkinson do 1-methyl-4-phenyl- 1,2,3,6-tetrahydropyridin [17]. Arbutin cải thiện trí nhớ không gian, bảo vệ não chống suy giảm trí nhớ, giảm stress oxy hóa và nitro hóa, giảm tổn thương oxy hóa ở vùng hải mã trong mô hình động vật mắc bệnh Alzheimer gây ra bởi streptozotocin [19]. 31
40. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Sau quá trình nghiên cứu thực nghiệm, đề tài khóa luận đã thu được một số kết quả như sau : + Đã định tính được các nhóm chất bằng phản ứng hóa học đặc trưng, kết quả cho thấy trong rễ cây Bổ béo bốn nhị có chứa các nhóm chất saponin, carotenoid, đường khử và phytosterol. + Đã chiết xuất, phân lập và xác định được cấu trúc của 2 hợp chất từ cao EtOH 80% của rễ cây Bổ béo bốn nhị là: Hydroxymethylfurfural và arbutin. Đây là lần đầu tiên 2 hợp chất này được phân lập từ cây Bổ béo bốn nhị và chi Gomphandra. Đề xuất + Tiếp tục triển khai phân lập các hợp chất khác từ rễ cây Bổ béo bốn nhị. + Nghiên cứu và đánh giá một số hoạt tính sinh học của các cao chiết phân đoạn và các hợp chất đã được phân lập để bổ sung thêm vào cơ sở dữ liệu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Bổ béo bốn nhị. 32
41. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu (2004), Cây thuốc và ộđ ng vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, Tập 1, 249-251. 2. Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội (2016), "Thực trạng nghiên cứu, phát triển dược liệu ở nước ta và trên thế giới", 01. 3. Bộ môn Dược liệu (2010), Thực tập Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội. 4. Bộ Y tế (2011), Dược liệu học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, Tập 1 và 2. 5. Võ Văn Chi (2012),T ừ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Tập 1, 229-230. 6. Võ Văn Chi (1999),T ừ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, 118. 7. Đỗ Thị Hà, Phùng Thanh Long, Lê Thị Loan, Nguyễn Thị Thu, Lê Vũ Ngọc Hân, Nguyễn Thị Ngọc Loan, Phạm Thị Thúy, Nguyễn Minh Khởi (2014), "Thành phần hóa học của phần dưới mặt đất cây Đạm trúc diệp", Tạp chí Dược liệu, 19(6). 8. Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất bản Trẻ, Tập 2, 174-175. 9. Đinh Thị Thanh Mai (2011), "Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây Bổ béo (Gomphandra tonkinensis Gagnep.)", Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học, Đại học Dược Hà Nội.
42. Tiếng Anh 10. Abdulmalik O., Safo M. K., Chen Q., Yang J., Brugnara C., Ohene‐ Frempong K. (2005), "5‐hydroxymethyl‐2‐furfural modifies intracellular sickle haemoglobin and inhibits sickling of red blood cells", British Journal of Haematology, 128(4), 552-561. 11. Amarasingham R. D., Bisset N. G., Millard A. H., Woods M. C. (1964), "A phytochemical survey of Malaya Part III. Alkaloids and saponins", Economic Botany, 18(3), 270-278. 12. Bhat S., Mulgund G. S., Bhat P. (2019), "Ethnomedicinal practices for the treatment of arthritis in Siddapur Region of Uttara Kannada District, Karnataka, India", Journal of Herbs, Spices & Medicinal Plants, 25(4), 316-329. 13. Bick I. R. C. (1996), "Alkaloids from Australian Flora", Alkaloids: Chemical and biological perspectives, Elsevier, Vol 10, 1-154. 14. Brink M., Escobin R. P. (2003), Plant resources of South-East Asia, Backhuys Publ., Vol 12. 15. Christophe W. (2006), Medicinal Plants Of The Asia-pacific: Drugs For The Future?, World Scientific. 16. Cruz L., Sia I., Ramirez B., Fe G., Yu G., Kron M. (2019), "Medicinal plants as sources of novel anti-parasite tRNA synthetase inhibitors", Asian Journal of Ethnopharmacology and Medicinal Foods Philippine 5(3), 25-30. 17. Dadgar M., Pouramir M., Z. Dastan, Ghasemi-Kasman M., Ashrafpour M., Moghadamnia A. A., Khafri S., Pourghasem M. (2018), "Arbutin attenuates behavioral impairment and oxidative stress in an animal model of Parkinson's disease", Avicenna Journal of Phytomedicine, 8(6), 533.
43. 18. Dassanayake M. D., Larsen K. (1996), A revised handbook to the Flora of Ceylon, Vol 10. 19. Dastan Z., Pouramir M., Ghasemi-Kasman M., Ghasemzadeh Z., Dadgar M., Gol M., Ashrafpour M., Pourghasem M., Moghadamnia A. A., Khafri S. (2019), "Arbutin reduces cognitive deficit and oxidative stress in animal model of Alzheimer's disease", International Journal of Neuroscience, 129(11), 1145-1153. 20. De Arriba S. G., Naser B., Nolte K. U. (2013), "Risk assessment of free hydroquinone derived from Arctostaphylos Uva-ursi folium herbal preparations", International Journal of Toxicology, 32(6), 442-453. 21. Din L. B., Yusoff N. I., Samsudin M. W., Suki U., Salleh K. M., Ibrahim A. Z., Latiff A., Said I. M. (2002), "A preliminary phytochemical survey of plants in Crocker range, Sabah, Malaysia", ASEAN Review of Biodiversity and Envenmental Conservation. 22. Du E., Mendelsohn L., Nichols J. S., Dao M., Kato G. J. (2014), "Quantification of anti-sickling effect of Aes-103 in sickle cell disease using an in vitro microfluidic assay", Blood Journal, 124(21), 2699. 23. EMA. (2012), "Assessment report on Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng., folium", European Medicines Agency, 44, 1-34. 24. Fernandez L. S., Jobling M. F., Andrews K. T., Avery V. M. (2008), "Antimalarial activity of natural product extracts from Papua New Guinean and Australian plants against Plasmodium falciparum", Phytotherapy Research, 22(10), 1409-1412. 25. Geetha R. V., Roy A., Lakshmi T. (2011), "Nature’s weapon against urinary tract infections", International Journal of Drug Development and Research, 3(3), 85-100.
44. 26. Haron N. W., Ping S. T. (1997), "Distribution and taxonomic significance of flavonoids in the Olacaceae and Icacinaceae", Biochemical Systematics and Ecology, 25(3), 263-265. 27. L. Jiang, Wang D., Zhang Y., Li J., Wu Z., Wang Z. (2018), "Investigation of the pro-apoptotic effects of arbutin and its acetylated derivative on murine melanoma cells", International Journal of Molecular Medicine, 41(2), 1048-1054. 28. Kam T. S. (1999), "Alkaloids from Malaysian flora", Alkaloids: Chemical and biological perspectives, Elsevier, Vol 14, 285-435. 29. Kamperdick C., Tran Van Sung (2002), "Constituents from Gomphandra tetranda (Icacinaceae)", Vietnam Journal of Chemistry, 40(3), 108-110. 30. Kato G. J., Lawrence M. P., Mendelsohn L. G., Saiyed R., Wang X., Conrey A. K., Starling J. M., Grimes G., Taylor J. G., McKew J., Minniti C. P., Stern W. (2013), "Phase 1 clinical trial of the candidate anti-sickling agent Aes-103 in adults with sickle cell anemia", Blood Journal, 122(21), 1009. 31. Kitts D. D., Chen X-M., Jing H. (2012), "Demonstration of antioxidant and anti-inflammatory bioactivities from sugar–amino acid Maillard reaction products", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 60(27), 6718-6727. 32. Lee H. J., Kim K. Won. (2012), "Anti-inflammatory effects of arbutin in lipopolysaccharide-stimulated BV2 microglial cells", Inflammation Research, 61(8), 817-825. 33. Li H., Jeong Y. M., Kim S. Y., Kim M. K., Kim D. S. (2011), "Arbutin inhibits TCCSUP human bladder cancer cell proliferation via up- regulation of p21", Pharmazie, 66(4), 306-309.
45. 34. Li M. M., Wu L. Y., Zhao T., Xiong L., Huang X., Liu Z. H., Fan X. L., Xiao C. R., Gao Y., Ma Y. B. (2011), "The protective role of 5- HMF against hypoxic injury", Cell Stress and Chaperones, 16(3), 267- 273. 35. Lim Y. J., Lee E. H., Kang T. H., Ha S. K., Oh M. S., Kim S. M., Yoon T. J., Kang C., Park J. H., Kim S. Y. (2009), "Inhibitory effects of arbutin on melanin biosynthesis of α-melanocyte stimulating hormone- induced hyperpigmentation in cultured brownish guinea pig skin tissues", Archives of Pharmacal Research, 32(3), 367-373. 36. Lin S. M., Wu J. Y., Su C., Ferng S., Lo C. Y., Chiou R. Y. Y. (2012), "Identification and mode of action of 5-hydroxymethyl-2-furfural (5- HMF) and 1-methyl-1, 2, 3, 4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid (MTCA) as potent xanthine oxidase inhibitors in vinegars", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 60(39), 9856-9862. 37. Marczewski A., Ciepichal E., Swiezewska E., Chojnacki T., Le Xuan Canh, Tran The Bach (2007), "The search for polyprenols in dendroflora of Vietnam", Acta Biochimica Polonica, 54(4), 727-732. 38. Mendelsohn L. G., Pedoeim L., Van Beers E. J., Saiyed R., Nichols J., Wang Xunde., Kato G. J. (2012), "Effect of Aes-103 anti-sickling agent on oxygen affinity and stability of red blood cells from patients with sickle cell anemia", Blood Journal, 120(21), 85. 39. Menon D. (2016), "Biospectrum analysis of allied taxa of Nothapodytes found in Kerala with special reference to anticancer properties". 40. Migas P., Krauze-Baranowska M. (2015), "The significance of arbutin and its derivatives in therapy and cosmetics", Phytochemistry Letters, 13, 35-40.
46. 41. Murkovic M., Pichler N. (2006), "Analysis of 5‐hydroxymethylfurfual in coffee, dried fruits and urine", Molecular Nutrition & Food Research, 50(9), 842-846. 42. Nycz J. E., Malecki G., Morag M., Nowak G., Ponikiewski L., Kusz J., Switlicka A. (2010), "Arbutin: Isolation, X-ray structure and computional studies", Journal of Molecular Structure, 980(1-3), 13-17. 43. Ong H. C., Ahmad N., Milow P. (2011), "Traditional medicinal plants used by the Temuan villagers in Kampung Tering, Negeri Sembilan, Malaysia", Studies on Ethno-Medicine, 5(3), 169-173. 44. Ong H. C., Chua S., Milow P. (2011), "Ethno-medicinal plants used by the Temuan villagers in Kampung Jeram Kedah, Negeri Sembilan, Malaysia", Studies on Ethno-Medicine, 5(2), 95-100. 45. Park K. C., Huh S. Y., Choi H. R., Kim D. S. (2010), "Biology of melanogenesis and the search for hypopigmenting agents", Dermatologica Sinica, 28(2), 53-58. 46. Potgieter M. J., Schori M., Utteridge T. M. A. (2016), Flowering Plants. Eudicots, Springer, 367-376. 47. Ramesha B. T., Suma H. K., Senthilkumar U., Priti V., Ravikanth G., Vasudeva R., Kumar T. S., Ganeshaiah K. N., Shaanker R. U. (2013), "New plant sources of the anti-cancer alkaloid, camptothecine from the Icacinaceae taxa, India", Phytomedicine, 20(6), 521-527. 48. Shapla U. M., Solayman M., Alam N., Khalil M. I., Gan S. H. (2018), "5-Hydroxymethylfurfural (HMF) levels in honey and other food products: effects on bees and human health", Chemistry Central Journal, 12(1), 35. 49. Soepadmo E. (1989), Malaysian Traditional Medicine: Proceedings of the Seminar on Malaysian Traditional Medicine, Kuala Lumpur, June 10-11th, 1988, Institute of Advanced Studies University of Malaya.
47. 50. Taha M. M. E., Salga M. Saleh., Ali H. Mohd., Abdulla M. A., Abdelwahab S. I., Hadi A. H. A. (2012), "Gastroprotective activities of Turnera diffusa Willd. ex Schult. revisited: Role of arbutin", Journal of Ethnopharmacology, 141(1), 273-281. 51. Takebayashi J., Ishii R., Chen J., Matsumoto T., Ishimi Y., Tai A. (2010), "Reassessment of antioxidant activity of arbutin: multifaceted evaluation using five antioxidant assay systems", Free Radical Research, 44(4), 473-478. 52. Takhtajan Armen. (2009), Flowering plants, Springer Science & Business Media. 53. Wu Z. Y., Raven P. H., Hong D. Y. (2008), Flora of China. Vol. 11: Oxalidaceae through Aceraceae, Science Press, Beijing, and Missouri Botanical Garden Press, St. Louis. 54. Yamada P., Nemoto M., Shigemori H., Yokota S., Isoda H. (2011), "Isolation of 5-(hydroxymethyl) furfural from Lycium chinense and its inhibitory effect on the chemical mediator release by basophilic cells", Planta Medica, 77(05), 434-440. 55. Zhao L., Chen J., Su J., Li L., Hu S., Li B., Zhang X., Xu Z., Chen T. (2013), "In vitro antioxidant and antiproliferative activities of 5- hydroxymethylfurfural", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 61(44), 10604-10611. 56. Zhou L., Fu X., Jiang L., Wang L., Bai S., Jiao Y., Xing S., Li W., Ma J. (2017), "Arbutin increases Caenorhabditis elegans longevity and stress resistance", PeerJ, 5, e4170. 57. Zumbroich T. J. (2009), "The ethnobotany of teeth blackening in Southeast Asia", Ethnobotany Research and Applications, 7, 381-398.
48. PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1. KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC PHỤ LỤC 2. DỮ LIỆU PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT Phụ lục 2.1. Dữ liệu phổ của hợp chất GT-1A2 Phụ lục 2.2. Dữ liệu phổ của hợp chất GT-8C1
49. PHỤ LỤC 1. KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC
50. PHỤ LỤC 2.1. DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT GT-1A2 Cấu trúc hóa học của hợp chất GT-1A2 1 Phụ lục 2.1.1. Phổ H-NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất GT-1A2 13 Phụ lục 2.1.2. Phổ C-NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất GT-1A2 Phụ lục 2.1.3. Phổ DEPT của hợp chất GT-1A2 Phụ lục 2.1.4. Phổ ESI-MS của hợp chất GT-1A2
51. 1 Phụ lục 2.1.1. Phổ H-NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất GT-1A2
52. 13 Phụ lục 2.1.2. Phổ C-NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất GT-1A2
53. Phụ lục 2.1.3. Phổ DEPT của hợp chất GT-1A2 Phụ lục 2.1.4. Phổ ESI-MS của hợp chất GT-1A2
54. PHỤ LỤC 2.2. DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT GT-8C1 Cấu trúc hóa học của hợp chất GT-8C1 1 Phụ lục 2.2.1. Phổ H-NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất GT-8C1 13 Phụ lục 2.2.2. Phổ C-NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất GT-8C1 Phụ lục 2.2.3. PhổHMBC của hợp chất GT-8C1 Phụ lục 2.2.4. Phổ HSQC (500/125 MHz, CD3OD) của hợp chất GT-8C1 Phụ lục 2.2.5. Phổ COSY (500/500 MHz, CD3OD) của hợp chất GT-8C1
55. 1 Phụ lục 2.2.1. Phổ H-NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất GT-8C1
56. 13 Phụ lục 2.2.2. Phổ C-NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất GT-8C1
57. Phụ lục 2.2.3. PhổHMBC của hợp chất GT-8C1 Phụ lục 2.2.4. Phổ HSQC (500/125 MHz, CD3OD) của hợp chất GT-8C1
58. Phụ lục 2.2.5. Phổ COSY (500/500 MHz, CD3OD) của hợp chất GT-8C1