Khóa luận Ảnh hưởng của ánh sáng và nitơ lên sự tăng trưởng, hàm lượng protein tổng, acid amin và khả năng chống oxy hóa của Spirulina sp

67 trang thiennha21 18/04/2022 4090

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Ảnh hưởng của ánh sáng và nitơ lên sự tăng trưởng, hàm lượng protein tổng, acid amin và khả năng chống oxy hóa của Spirulina sp", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

khoa_luan_anh_huong_cua_anh_sang_va_nito_len_su_tang_truong.pdf

Nội dung text: Khóa luận Ảnh hưởng của ánh sáng và nitơ lên sự tăng trưởng, hàm lượng protein tổng, acid amin và khả năng chống oxy hóa của Spirulina sp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC ẢNH HƯỞNG CỦA ÁNH SÁNG VÀ NITƠ LÊN SỰ TĂNG TRƯỞNG, HÀM LƯỢNG PROTEIN VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA CỦA TẢO SPIRULINA SP. Chuyên ngành: Sản xuất và phát triển thuốc KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC Hướng dẫn khoa học: TS. Võ Hồng Trung Tp HCM – 2018
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan bài khóa luận này là của riêng tôi; các kết quả và số liệu trong báo cáo khóa luận tốt nghiệp không sao chép bất kỳ nguồn nào khác. Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về sự cam đoan này. TP. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2018 Sinh viên Nguyễn Thị Bích Ngọc
LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy TS. Võ Hồng Trung – Trưởng Bộ môn Hóa sinh – Độc chất, trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Tôi xin trân trọng cảm ơn quý Thầy, Cô và Cán bộ trong khoa Dược, trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Tôi chân thành cảm ơn các bạn moniter trong Bộ môn Độc chất – Hóa sinh: Trần Huỳnh Phong, Lưu Thi Đan, Vũ Thị Thu Hồng và Đào Thu Hiền đã tận tình giúp đỡ, động viên để tôi có thể hoàn thành tốt khóa luận này. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè và những người thân đã ở bên tôi, tạo điều kiện cả về vật chất lẫn tinh thần trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. , ngày tháng năm 2018
Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Giới thiệu về Spirulina sp. 3 1.2. Đặc điểm sinh học của Spirulina sp. 3 1.2.1. Phân loại 3 1.2.2. Đặc điểm hình thái và cấu trúc tế bào Spirulina sp. 4 1.2.3. Đặc điểm sinh lý 6 1.2.4. Đặc điểm sinh hóa 7 1.3. Protein của Spirulina sp. 9 1.4. Khả năng chống oxy hóa của Spirulina sp. 9 1.5. Ứng dụng nuôi trồng của Spirulina sp. 10 1.6. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng tảo Spirulina sp. 12 1.6.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 12 1.6.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong nước 12 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 14 2.1. Chủng Spirulina sp. 14 2.2. Các phương pháp phân tích 14 2.2.1. Quan sát hình thái tế bào Spirulina sp. 14 2.2.2. Xác định sinh khối tế bào Spirulina sp. 15 2.2.3. Xác định tốc độ tăng trưởng đặc hiệu 15 2.2.4. Xác định hàm lượng protein của Spirulina sp. bằng phương pháp Bradford15 2.2.5. Xác định hàm lượng phenolic tổng 16 2.2.6. Xác định hàm lượng chất oxy hóa tổng 16 2.2.7. Xác định hàm lượng các acid amin theo hệ thống Pico – Tag 17 2.3. Phương pháp thiết kế thí nghiệm 17 2.3.1. Thí nghiệm 1: Lựa chọn điều kiện ánh sáng nuôi cấy thích hợp 17 2.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố nitơ lên sự tăng trưởng và hàm lượng protein ở Spirulina sp. 18 2.3.3. Thí nghiệm 3: Nuôi cấy, thu sinh khối và phân tích thành phần acid amin 20 i SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp 2.4. Xử lý số liệu 21 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 22 3.1. Kết quả 22 3.1.1. Lựa chọn điều kiện ánh sáng nuôi cấy thích hợp 22 3.1.2. Ảnh hưởng của yếu tố nitơ lên sự tăng trưởng và hàm lượng protein ở Spirulina sp. 27 3.1.3. Nuôi cấy, thu sinh khối và phân tích thành phần acid amin 32 3.2. Biện luận 41 3.2.1. Lựa chọn điều kiện ánh sáng nuôi cấy thích hợp 41 3.2.2. Ảnh hưởng của yếu tố nitơ lên sự tăng trưởng và hàm lượng protein ở Spirulina sp. 42 3.2.3. Nuôi cấy, thu sinh khối và phân tích thành phần acid amin 44 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 4.1. Kết luận 47 4.2. Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO ii SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT    Kí hiệu Chú thích % Phần trăm µg Microgam µL Microlít g/L Gam/Lít mcg Microgam mg/L Miligam/Lít mmol/L Milimol/Lít UI International Unit iii SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học của tảo Spirulina so với % trọng lượng khô 7 Bảng 1.2 Thành phần vitamin của tảo Spirulina so với % trọng lượng khô 8 Bảng 1.3 Thành phần chất khoáng của tảo Spirulina so với% trọng lượng khô 8 Bảng 3.1 Thành phần của môi trường Zarrouk 14 Bảng 3.1 Khối lượng sinh khối khô Spirulina theo từng loại ánh sáng 24 Bảng 3.2 Nồng độ protein tổng (g/L) theo từng loại ánh sáng 26 Bảng 3.3 Hàm lượng protein (%) tổng theo từng loại ánh sáng 26 Bảng 3.4 Khối lượng sinh khối khô Spirulina theo từng nồng độ NaNO3 khác nhau 29 Bảng 3.5 Khả năng tích lũy protein theo từng nồng độ NaNO3 khác nhau 31 Bảng 3.6 Khối lượng sinh khối khô của 2 chủng 34 Bảng 3.7 Hàm lượng protein tổng của các chủng Spirulina sp. 35 Bảng 3.8 Hàm lượng thành phần acid amin của Spirulina sp. 37 Bảng 3.9 Hàm lượng phenolic tổng của 2 chủng 39 Bảng 3.10 Hàm lượng chất chống oxy hóa tổng của 2 chủng Spirulina sp. 40 iv SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình thái tế bào Spirulina sp. 4 Hình 1.2 Một phần của trichome xoắn ốc của Spirulina platensis; trong đó p là độ cao và d đường kính ngoài của xoắn ốc 5 Hình 1.3 Sơ đồ vòng đời của tảo Spirulina 7 Hình 2.1 Spirulina sp. nuôi cấy trong môi trường Zarrouk 18 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nuôi cấy Spirulina trong các điều kiện 18 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nuôi cấy Spirulina ở các điều kiện NaNO3 khác nhau 19 Hình 2.4 Các bình chứa dịch tảo trong hệ thống thí nghiệm 20 Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nuôi cấy các chủng Spirulina sp. ở điều kiện NaNO3 5 g/L 21 Hình 3.1 Hình thái tế bào Spirulina sp. trong các điều kiện nuôi cấy ánh sáng đỏ, ánh sáng xanh dương và ánh sáng trắng 22 Hình 3.2 Màu sắc dịch nuôi ngày thứ 10 trong điều kiện nuôi cấy ánh sáng đỏ, ánh sáng xanh dương và ánh sáng trắng 23 Hình 3.3 Sinh khối của Spirulina sp. trong các điều kiện ánh sáng khác nhau 23 Hình 3.4 Tốc độ tăng trưởng đặc hiệu của Spirulina sp. trong các điều kiện ánh sáng khác nhau 24 Hình 3.5 Hàm lượng protein tổng của Spirulina trong các điều kiện ánh sáng khác nhau 25 Hình 3.6 Sinh khối của Spirulina sp. trong các nồng độ NaNO3 khác nhau 28 Hình 3.7 Tốc độ tăng trưởng đặc hiệu của Spirulina sp. trong các nồng độ NaNO3 khác nhau 28 Hình 3.8 Hàm lượng protein tổng của Spirulina trong các nồng độ NaNO3 khác nhau 30 Hình 3.9 Hình thái của 2 chủng Spirulina sp. Mỹ và Nhật 32 Hình 3.10 Màu sắc dịch nuôi cấy ngày thứ 5 trong môi trường Zarrouk chứa NaNO3 5,0 g/L của 2 chủng Spirulina sp. Nhật và Sprulina sp. Mỹ 33 v SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.11 Sinh khối của 2 chủng Spirulina sp. Mỹ và Nhật 33 Hình 3.12 Hàm lượng protein tổng (g/L) của 2 chủng Spirulina sp. ở nồng độ NaNO3 5,0 g/L 34 Hình 3.13 Hàm lượng phần trăm protein tổng của 2 chủng Spirulina sp. ở nồng độ NaNO3 5,0 g/L 35 Hình 3.14 Hàm lượng phenolic tổng của 2 chủng Spirulina sp. ở nồng độ NaNO3 5,0 g/L 38 Hình 3.15 Hàm lượng chất chống oxy hóa tổng của 2 chủng Spirulina sp. ở nồng độ NaNO3 5,0 g/L 39 vi SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - Năm học 2013– 2018 ẢNH HƯỞNG CỦA ÁNH SÁNG VÀ NITƠ LÊN SỰ TĂNG TRƯỞNG, HÀM LƯỢNG PROTEIN VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA CỦA TẢO SPIRULINA SP. Nguyễn Thị Bích Ngọc Hướng dẫn khoa học: TS. Võ Hồng Trung Mở đầu: Spirulina sp. là sản phẩm thiên nhiên có giá trị dinh dưỡng và sinh học cao, đáp ứng nhu cần vừa là thức ăn, vừa là dược phẩm chữa bệnh. Điều kiện nuôi cấy là yếu tố quan trọng quyết định đến chất lượng sản phẩm từ Spirulina. Đối tượng: Tảo Spirulina sp. Phương pháp nghiên cứu: phương pháp Bradford, xác định hàm lượng chất oxy hóa tổng, hệ thống Pico – Tag và một số phương pháp khác. Kết quả: Sinh khối cực đại ở ánh sáng đỏ (0,84 g/L) cao hơn so với điều kiện ánh sáng trắng và ánh sáng xanh dương (0,57 g/L và 0,28 g/L) p<0,05. Spirulina tích lũy protein cao trong điều kiện ánh sáng xanh dương khoảng 40,66% sinh khối khô, cao hơn gấp đôi trong ánh sáng trắng và đỏ (17,42 và 15,91% ) (p<0,05). Trong môi trường có nồng độ NaNO3 (5,0 g/L) cho sinh khối đạt (0,60 g/L) và hàm lượng protein (34,41%) cao hơn so với khối lượng sinh khối và hàm lượng protein được tạo ra khi nuôi cấy trong điều kiện nồng độ NaNO3 thấp (1,25 g/L và 2,5 g/L). Kết luận: Chất lượng ánh sáng và nồng độ NaNO3 trong môi trường nuôi cấy có tác động mạnh mẽ lên hình thái, sự tăng trưởng và tích lũy protein ở Spirulina sp. Khả năng chống oxy hóa, tích lũy protein và thành phần acid min đều cao ở cả 2 chủng Spirulina sp. Mỹ và Nhật trong điều kiện nuôi cấy có nồng độ NaNO3 5,0 g/L. Ngoài ra, hàm lượng phenolic tổng và khả năng chống oxy của hai chủng Spirulina sp. này có mối tương quan dương với nhau. Từ khóa: Spirulina sp., phương pháp Bradford, nitrate, protein, amino acid, chống oxy hóa. vii SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Final assay for the degree of BS Pharm - Academic year: 2013-2018 EFFECT OF LIGHT QUALITY AND NITROGEN ON GROWTH, PROTEIN CONTENT AND ANTIOXIDANT CAPACITY OF THE SPIRULINA SP. Nguyen Thi Bich Ngoc Supervisor: Dr. Trung Vo Hong Introduction: Spirulina sp. is natural product known as a natural source of nutraceuticals and bioactive compounds, responding to the demand of both food and medicinal products. Cultural conditions are the key point to determine the quality of Spirulina’s products. Materials: Spirulina sp. Methods: Bradford method, total oxidant quantitation, Pico - Tag system and other methods. Results: Maximum biomass under red light (0.84 g/L) was higher than those under white and blue light conditions (0.57 g/L and 0.28 g/L) p <0.05. Protein contents obtained from Spirulina sp. under the blue light condition was about 40.66% dry biomass, twice as much as those under white and red light conditions (17.42 and 15.91%) (p <0.05). Under the high NaNO3 concentration supplied Zarrouk medium (5.0 g/L), the dry biomass (0.60 g/L) and protein content (34.41%) were higher than those under low NaNO3 concentration supplied medium (1.25 g/L and 2.5 g/L). Conclusion: The light quality and NaNO3 concentration in the culture medium strongly influenced morphology, growth and protein content in Spirulina sp. The antioxidant capacity, protein content and amino acid profiles were obtained high in both strains of Spirulina sp. from USA and Japan under culture condition in which NaNO3 concentration was of 5.0 g/L. In addition, there was a positive correlation between the total phenolic content and the antioxidant capacity of the two strains of Spirulina sp. Key words: Spirulina sp., Bradford method, nitrate, protein, amino acid, antioxidant capacity. viii SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Đặt vấn đề ĐẶT VẤN ĐỀ Khi đứng trên cao của sự phát triển của khoa học và công nghệ, con người dần có xu hướng trở về với thiên nhiên. Vì thế mà các nhà khoa học không ngừng cho ra đời những công trình nghiên cứu các loài thực vật, động vật trong tự nhiên nhằm tìm ra những hoạt chất quý ứng dụng trong y học, để chữa những căn bệnh nguy hiểm như ung thư, bệnh truyền nhiễm. Bên cạnh đó, tiếp nối những thành công trong những thế kỷ trước, chúng ta đã tìm ra những nguồn thực phẩm giàu dinh dưỡng từ tự nhiên như các loại bánh tảo, thực phẩm chức năng. Đồng thời dựa vào thiên nhiên chúng ta cũng tìm ra nguồn chiết xuất ra các hoạt chất trong ngành mỹ phẩm. Spirulina là một trong những loài tảo được nghiên cứu nhiều nhất và cũng đem lại rất nhiều lợi ích cho con người trong ngành thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm. Các loài Spirulina có hoạt tính sinh học đa dạng và ý nghĩa về dinh dưỡng do chúng có hàm lượng cao các chất dinh dưỡng tự nhiên, có vai trò điều hòa chức năng sinh học và miễn dịch. Spirulina là loại vi tảo được tiêu thụ nhiều nhất do hàm lượng protein cao và các lợi ích dinh dưỡng bổ sung, bao gồm chống tăng huyết áp, bảo vệ thận, chống tăng lipid máu và chống tăng đường huyết [75]. Nhiều Spirulina ảnh hưởng lên hệ thống miễn dịch thông qua tăng hoạt tính của đại thực bào, kích thích tạo ra kháng thể, cytokine, tăng tích lũy tế bào NK (Natural Killer Cell) trong các mô, tăng sự hoạt động và di chuyển của tế bào T và B [46]. Spirulina là một nguồn giàu protein, chứa hàm lượng cao acid hypocholesterolemic γ-linoleic (GLA), vitamin B và các phycobiliprotein tự do [71]. Do đó nó đã được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) gán danh hiệu là “siêu thực phẩm” [46]. Như một minh chứng cho điều này, Spirulina có lượng canxi nhiều hơn 180% so với sữa, protein nhiều hơn 670% so với đậu hũ, hơn 3100% β-carotene so với cà rốt và chất sắt nhiều hơn 5100% rau bina [20]. Nắm bắt được tiềm năng kinh tế cũng như giá trị dinh dưỡng từ Spirulina nhiều nghiên cứu từ quy mô nhỏ như trong phòng thí nghiệm đến quy mô lớn như sản xuất trong công nghiệp được thực hiện nhằm tìm ra phương pháp nuôi trồng để đạt được hiệu suất cao nhất. Điển hình như: môi trường MS, Zarrouk là một trong những 1 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Đặt vấn đề môi trường mang lại hiệu quả cao và tiết kiệm với những điều kiện chuẩn về chế độ dinh dưỡng, pH, nhiệt độ, ánh sáng [27], [46]. Hiện nay, đã có nhiều công trình trong nghiên cứu về các điều kiện nuôi trồng Spirulina mang lại hiệu suất tối ưu. Tuy nhiên, ở Việt Nam còn rất nhiều hạn chế về lĩnh vực này. Dựa vào cơ sở đó, đề tài “Ảnh hưởng của ánh sáng và nitơ lên sự tăng trưởng, hàm lượng protein tổng, acid amin và khả năng chống oxy hóa của Spirulina sp.” thực hiện với mục đích:  Xác định điều kiện ánh sáng, nồng độ nitơ thích hợp cho tăng trưởng và tích lũy protein ở Spirulina sp.  Xác định khả năng chống oxy hóa và hàm lượng acid amin ở các chủng Spirulina sp. 2 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Tổng quan CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về Spirulina sp. Tảo Spirulina hay tảo xoắn Spirulina là tên gọi do nhà tảo học Deurben (Đức) đặt vào năm 1827 dựa trên hình thái tảo Spirulina. Do hình dạng “xoắn lò xo” với khoảng 5-7 vòng đều nhau không phân nhánh dưới kính hiển vi nên được gọi là Spirulina với tên khoa học là tảo Spirulina platensis (bắt nguồn từ chữ spire, spiral có nghĩa là “xoắn ốc”) và trước đây được coi là thuộc chi Spirulina. Spirulina thuộc vi khuẩn lam (Cyanobacteria) nên chúng thuộc sinh vật nhân sơ hay nhân nguyên thủy (Prokaryote)[22]. Cũng vào năm 1827, Turpin lần đầu tiên phân lập được tảo Spirulina từ nguồn nước tự nhiên. Năm 1960, Tiến sĩ Clement người Pháp tình cờ phát hiện loại tảo này khi đến hồ Tchad ở Trung Phi. Nhà khoa học này không khỏi kinh ngạc khi vùng đất cằn cỗi, đói kém quanh năm nhưng những thổ dân ở đây rất cường tráng và khỏe mạnh. Khi Clement tìm hiểu về thức ăn của họ, bà phát hiện trong mùa không săn bắn, họ chỉ dùng một loại bánh màu xanh mà nguyên liệu chính là thứ họ vớt lên từ hồ. Qua phân tích, bà phát hiện ra loại bánh có tên Dihe này chính là tảo Spirulina. Năm 1963, bà đã nghiên cứu thành công việc nuôi Spirulina ở qui mô công nghiệp [32]. Năm 1973, Tổ chức Nông lương Quốc tế (FAO) và Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã chính thức công nhận tảo xoắn Spirulina là nguồn dinh dưỡng và dược liệu quý, đặc biệt trong chống suy dinh dưỡng và chống lão hóa [6]. Năm 1977, Viện sinh vật học là nơi tiên phong trong việc nuôi trồng Spirulina ở Việt Nam theo mô hình ngoài trời, không mái che, có sục khí CO2 tại xí nghiệp nước suối Vĩnh Hảo (Bình Thuận). 1.2. Đặc điểm sinh học của Spirulina sp. 1.2.1. Phân loại Tảo (algae) là một nhóm vi sinh vật, nhưng chúng khác với vi khuẩn và nấm men ở chỗ chúng có diệp lục và có khả năng tổng hợp được các chất hữu cơ từ các chất vô cơ dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời [1]. 3 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Tổng quan Tảo Spirulina thuộc [2]: Lãnh giới (domain): Bacteria Ngành (phylum): Cyanophyta Lớp (class): Cyanophyceae Bộ (ordo): Oscillatoriales Họ (familia): Oscillatoniaceae (Nostocales) Chi (genus): Spirulina Có hai loài quan trọng là Spirulina maxima và Spirulina platensis. 1.2.2. Đặc điểm hình thái và cấu trúc tế bào Spirulina sp. Tảo lam được xếp vào nhóm vi khuẩn lam, loài vi sinh vật đầu tiên có khả năng quang hợp và sinh ra khí oxy được phát hiện từ 3,5 tỷ năm trước [45]. Spirulina là tảo đa bào, dạng sợi xoắn lò xo khoảng 5-7 vòng đều nhau không phân nhánh. Đường kính xoắn khoảng 35 – 50 µm, bước xoắn 60 µm, chiều dài thay đổi có thể đạt 250 µm. Nhiều trường hợp tảo Spirulina có kích thước lớn hơn (hình 1.1 và hình 1.2). Hình 1.1 Hình thái tế bào Spirulina sp. [43] 4 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Tổng quan Hình 1.1 Một phần của trichome xoắn ốc của Spirulina platensis; trong đó p là độ cao và d đường kính ngoài của xoắn ốc [30] Thành tế bào Spirulina có cấu trúc nhiều lớp, không chứa cellulose mà chứa mucopolyme pectin và các loại polysaccharide khác. Màng tế bào nằm sát ngay bên dưới thành tế bào và nối với màng quang hợp nằm rải rác trong nguyên sinh chất [1]. Tế bào tảo Spirulina chưa có nhân điển hình, vùng nhân là vùng giàu acid nucleic chưa có màng nhân bao bọc, phân bố trong nguyên sinh chất. Ngoài ra, tế bào Spirulina không có không bào thực, chỉ có không bào chứa khí làm chức năng điều 5 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Tổng quan chỉnh tỷ trọng tế bào. Nhờ có không bào chứa khí và hình dạng xoắn mà Spirulina có thể nổi lên mặt nước [3]. Mặc dù không có ty thể và mạng lưới nội chất song tế bào Spirulina vẫn có ribosom và một số thể vùi như các hạt polyphotphat, glycogen, phycocyanin, carboxysome và hạt mesosome [1]. 1.2.3. Đặc điểm sinh lý Tảo Spirulina có thể phân bố rộng rãi trong đất, đầm lầy, nước sạch, nước mặn, nước biển và suối nước nóng [4]. Do là một vi sinh vật quang dưỡng bắt buộc nên ngoài hàm lượng chất dinh dưỡng cần thiết cho tảo là nguồn carbon và nguồn nitơ, photpho; sự sinh trưởng của Spirulina còn phụ thuộc vào các yếu tố vật lý như sau: - Yếu tố ánh sáng: là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển của tảo. Spirulina ít bị chi phối bởi chu kỳ sáng/tối và đạt giá trị sinh khối cao khi được chiếu sáng liên tục. Cường độ ánh sáng thích hợp khoảng: 25,000 - 30,000 lux [1]. - Yếu tố nhiệt độ: Spirulina phát triển ở nhiệt độ khá cao. Người ta phát hiện chúng sống ở những suối nước nóng đến 690C. Chúng có khả năng phát triển ở khoảng nhiệt độ 350C - 370C ở điều kiện phòng thí nghiệm. Spirulina phát triển rất chậm dưới 250C [66]. - Yếu tố pH: Spirulina phát triển trong khoảng pH từ 8,3 – 11. Tuy nhiên, pH của môi trường tối ưu cho sinh trưởng và phát triển của tảo là từ 8,5 – 9,0. Tại khoảng pH này, nguồn carbon vô cơ được đồng hóa nhiều nhất [67]. Ở pH= 10 – 11, tảo vẫn phát triển nhưng rất chậm. Nếu pH ≤ 7: khí CO2 được đưa vào môi trường, tảo có thể sự dụng CO2 hòa tan là chủ yếu. - 2- Nếu pH ≤ 9: CO2 hòa tan sẽ chuyển sang HCO3 và CO3 + + 2- CO2 H2CO3 H + HCO3 2H + CO3 Nếu pH = 10 – 11: các nguồn carbon trên lại trở về trạng thái ban đầu 2- - CO3 + H2O CO2 + 2OH OH- được giải phóng sẽ làm tăng pH. 6 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Tổng quan - 2- - Nếu pH quá cao tất cả HCO3 và CO3 sẽ tạo thành CO2 và OH . Chu kỳ phát triển của tảo rất ngắn, thường xảy ra trong 24 giờ như tảo Chlorella. Tảo lam Spirulina có hai hình thức sinh sản: - Sinh sản sinh dưỡng: thực hiện bằng cách đứt từng khúc ở chỗ có tế bào dị hình trên sợi tảo, từ đó tạo ra sợi mới (hình 1.3). - Sinh sản vô tính: thực hiện bằng cách tạo bào tử giống ở vi khuẩn trong điều kiện không thuận lợi. Hình 1.2 Sơ đồ vòng đời của tảo Spirulina [23] 1.2.4. Đặc điểm sinh hóa Tảo Spirulina chứa hàm lượng protein rất cao, cao hơn cả tảo Chlorella. Ngoài ra chúng còn chứa đầy đủ các vitamin và khoáng chất [3] (bảng 1.1, 1.2 và 1.3). Bảng 1.1 Thành phần hóa học của tảo Spirulina so với % trọng lượng khô STT Thành phần % so với trọng lượng khô 1 Protein tổng 60 – 70 2 Glucid 13 – 16 3 Lipid 7 – 8 4 Acid nucleic 4,29 5 Diệp lục 0,76 6 Caroten 0,23 7 Tro 4 – 5 7 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Tổng quan Bảng 1.2 Thành phần vitamin của tảo Spirulina so với % trọng lượng khô[32] STT Thành phần Trọng lượng trong 100g 1 Vitamin A(100% β-carotene) 352,000 IU 2 Vitamin K 1090 mcg 3 Thiamine HCl (Vitamin B1) 0,5 mg 4 Riboﬂavin (Vitamin B2) 4,53 mg 5 Niacin (Vitamin B3) 14,9 mg 6 Vitamin B6 (Pyridox. HCl) 0,96 mg 7 Vitamin B12 162 mcg Bảng 1.3 Thành phần chất khoáng của tảo Spirulina so với% trọng lượng khô[32] STT Thành phần Trọng lượng trong 100g 1 Caxi 468 mg 2 Sắt 87,4 mg 3 Photpho 961 mg 4 Iod 142 mcg 5 Magie 319 mg 6 Kẽm 1,45 mg 7 Selen 25,5 mcg 8 Đồng 0,47 mg 9 Mangan 3,26 mg 10 Clo <400 mcg 11 Kali 1,660 mg 12 Natri 641 mg Tuy nhiên, hàm lượng các thành phần hóa học của tảo thay đổi tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy [4]. 8 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Tổng quan Các acid béo bão hòa và không bão hòa cũng có mặt trong thành phần của Spirulina và chiếm tới 1,95g/100g chất khô. Hàm lượng cholesterol nhỏ hơn khoảng 0,1mg/100g chất khô, trong khi đó hàm lượng cholesterol trong 100 g chất khô của trứng lên đến 600 mg. Điều này giải thích tại sao bột Spirulina được dùng bổ sung thức ăn cùng với protein đồng thời nó kiểm soát việc tăng trọng lượng quá mức [3]. 1.3. Protein của Spirulina sp. Đặc điểm sinh hóa nổi bật của Spirulina là có hàm lượng protein rất cao, chiếm khoảng 55 – 70% trọng lượng khô của tế bào, trong khi các thực phẩm được coi là giàu chất đạm như đậu nành, thịt bò, photmat cũng chỉ có 18 – 37 % đạm. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng protein trong Spirulina hoàn toàn không có hại. Tốc độ đồng hóa protein rất cao: sau 18 giờ thì 58% protein được tiêu hóa và đồng hóa [3]. Protein của tảo Spirulina có chứa acid amin thiết yếu và acid amin không thiết yếu và tỷ lệ của các acid amin này khá cân đối. Trong số các acid amin có 4 loại không thể thay thế và có vai trò quan trọng như: lysine, methionine, phenylanalin, tryptophan. Ngoài ra, trong thành phần protein của Spirulina còn chứa các phycobiliprotein – một loại protein tan trong nước - một loại sắc tố lam có vai trò quan trọng trong quá trình quang hợp của Tảo lam, Tảo đỏ [33]. Hàm lượng phycobiliprotein chiếm đến 20 – 25% trong tổng lượng protein của tế bào; bao gồm 2 loại sắc tố: C-phycocyanin và allophycocyanin [16]. Chất này có hoạt tính sinh học cao đã được nghiên cứu và thử nghiệm trong lĩnh vực Y-học. Một số bằng sáng chế liên quan đến hoạt tính sinh học có lợi của phycobiliprotein cũng đã được công bố về các ứng dụng sinh học như chống oxy hóa, chống viêm, chống virus, chống khối u, bảo vệ thần kinh và các hoạt động bảo vệ gan [15], [49]. 1.4. Khả năng chống oxy hóa của Spirulina sp. Những năm gần đây, người ta đã bắt đầu nghiên cứu một số hoạt tính sinh học ở tảo Spirulina và ứng dụng của chúng. Một trong số đó, khả năng chống oxy là hoạt tính đang được chú ý nhiều nhất. 9 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Tổng quan Do protein của Spirulina chứa phycobiliprotein có khả năng phát huỳnh quang nên chúng được ứng dụng để đánh dấu các kháng thể đơn dòng trong việc chuẩn đoán và phát hiện một số bệnh. Điều đáng được biết thêm là phycobiliprotein trong Spirulina đã được phát hiện như là một tác nhân chống ung thư tuyến tụy ở chuột đực nhờ khả năng chống oxy hóa và chống tăng sinh tế bào [49]. Vấn đề này đang được các nhà khoa học quan tâm thí nghiệm ở các đối tượng khác. Một nhóm hoạt chất có tác dụng sinh học quan trọng khác của Spirulina là các carotenoid, tổng lượng chất này là 346mg/100g trọng lượng chất khô [64]. Tảo Spirulina có tới 10 carotenoid khác nhau: oscillaxanthin, epoxy--carotene, myxoxanthophyll, zeaxantin, -carotene, cismyxoxanthophyll, -cryptoxantin, echinenone và hydroxyl-echinenone [38]. Trong đó đáng lưu ý là myxoxanthophyll, zeaxantin, -carotene, echinenone là nhóm carotenoid đặc trưng cho cả ngành Tảo Lam. Đặc biệt, tảo Spirulina là loại thực vật chứa hàm lượng -carotene cao, chiếm 52% trong tổng hàm lượng carotenoid (tiền Vitamin A), gấp 10 lần hàm lượng - carotene có trong cà rốt, được biết đến như loại rau quả thông dụng giàu -carotene nhất trong thực phẩm hàng ngày [63]. Beta – carotene trong Spirulina là chất chống oxy hóa mạnh, giúp tiêu diệt các gốc tự do là nguyên nhân của nhiều bệnh tật. Dùng liều cao -carotene trong khẩu phần dinh dưỡng hằng ngày sẽ rất hiệu quả trong việc phòng chống các dạng ung thư [50]. Một nhóm các nhà khoa học ở trường Đại học Haward (Mỹ) nhận thấy chế phẩm “Phycoten” về bản chất là tập hợp các carotenoid và diệp lục tố a chiết từ tảo Spirulina có tác dụng rất tốt đối với hệ thống miễn dịch cơ thể người trong chống bệnh ung thư [72]. 1.5. Ứng dụng nuôi trồng của Spirulina sp. Hiện nay, Spỉrulina được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau. Ngoài những ứng dụng về dinh dưỡng và y tế trong một vài nghiên cứu, loài tảo này được nuôi trồng ứng dụng trong các mô hình tiết kiệm chi phí và bảo vệ môi trường như: 10 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Tổng quan sử dụng các nguồn carbon, nitơ hay photpho có sẵn trong tự nhiên để phát triển sinh khối và một số hoạt chất. Điển hình như một mô hình đã được khảo sát tại Braxil, Spirulina được nghiên cứu để nuôi trồng trên mô hình sử dụng nguồn CO2 có trong không khí kết hợp với monoethanolamine (MEA) – một chất hấp thụ CO2 và chuyển đổi thành bicarbonate vừa góp phần giảm thải lượng carbon gây ô nhiễm môi trường vừa có thể thu lại lượng sinh khối cao thu hoạch làm phân bón hoặc thức ăn cho gia cầm và thủy sản. Kết quả của thí nghiệm này khá khả thi, ở nồng độ MEA 0,10; 0,20 và 0,41 mmol/L Spirulina tăng trưởng cao hơn và có hàm lượng protein cao hơn 17% so với sử dụng NaOH làm chất hấp thụ CO2 [69]. Ở Việt Nam, nhiều cơ sở nuôi trồng, sản xuất và chế biến các sản phẩm từ tảo Spirulina được thành lập với công nghiệp nuôi tảo trên các bể cấy nông bằng xi măng và sử dụng khí CO2 từ công nghệ tạo nguồn carbon, nguồn CO2 lấy trực tiếp tại các nhà máy bia, cồn, rượu được nén hóa lỏng vào bình chứa. Đó là các cơ sở ở Vĩnh Hảo (Bình Thuận), Châu Cát, Lòng Sông (Thuận Hải), Suối Nghệ (Đồng Nai), Nguồn CO2 từ lò nung vôi (sau khi lọc bụi) và các hầm chứa khí biogas cũng được nghiên cứu tận dụng để phát triển nuôi trồng tảo và cũng đã thu được một số kết quả. Thử nghiệm nuôi trồng Spirulina bằng nước thải hầm biogas không chỉ là biện pháp mở rộng sản xuất và hạ giá thành sản phẩm, mà còn giải quyết các vấn đề về môi trường sinh thái cho nông thôn. Tảo này còn được sử dụng để xử lý nước thải giàu NH4 từ nhà máy sản xuất urê thuộc xí nghiệp Liên hiệp Phân đạm Hóa chất Hà Bắc, kết quả cho thấy nước thải sau khi pha loãng và bổ sung thêm một số khoáng chất cần thiết rồi dùng nuôi Spirulina đã mang lại năng suất cao và có tác dụng bảo vệ môi trường [5], [7]. Tuy nhiên, trong quá trình nuôi cấy Spirulina thường gặp một vài hạn chế cần khắc phục để tránh ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của tảo. Điển hình như việc dư thừa hoặc thiếu bicarbonate hay thiếu lượng nitơ trong môi trường nuôi cấy dẫn đến việc sản xuất lượng đường quá mức trong quá trình quang hợp. Khi nồng độ chất này trở nên dư thừa trong tế bào, chúng sẽ tiết ra môi trường. Vì những chất đường nhầy nên 11 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Tổng quan khi sợi tảo trườn lên sẽ tạo sinh khối nhầy. Điều này có thể làm hỏng quá trình nuôi cấy vì như vậy tảo sẽ tránh xa môi trường có dinh dưỡng nên chúng sẽ bị chết vì đói. Ngoài ra ánh sáng, nhiệt độ, một số vi sinh vật như: vi khuẩn, động vật chân chèo, động vật nguyên sinh và nhiễm một số loài tảo khác cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của Spirulina. Việc thu hoạch tảo cũng gặp khá nhiều khó khăn bởi tế bào Spirulina nhỏ dẫn đến việc lọc thu sinh khối bị hạn chế bởi lượng tảo có thể mất nhiều trong quá trình lọc. 1.6. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng tảo Spirulina sp. 1.6.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước Từ những giá trị dinh dưỡng và sinh học trên, tảo Spirulina đã được WHO và các Bộ Y tế của nhiều quốc gia trên thế giới công nhận không chỉ là nguồn thực phẩm sạch mà còn là giải pháp cho phòng và điều trị bệnh của thế kỷ 21. Đáng lưu ý trước hết là công trình nghiên cứu phòng chống ung thư gây ra bởi tia phóng xạ hạt nhân cho các nạn nhân của sự cố Nhà máy Điện hạt nhân Chernobul đã thu được kết quả tốt khi điều trị bằng Spirulina nguyên chất. Khi uống Spirulina, lượng chất phóng xạ đã được đào thải khỏi đường tiểu của người bị nhiễm xạ rất cao. Kết quả này đã được biểu dương tại hội nghị quốc tế về tảo năm 1998 ở cộng hòa Czech [8]. Nhờ những tác dụng có lợi cho cơ thể, tảo Spirulina đang chứng minh hiệu quả vượt trội của nó trong vai trò là một loại thực phẩm chức năng hữu hiệu, cũng như một loại sản phẩm bổ sung tuyệt vời để tăng cường hoạt chất của các loại thuốc chữa bệnh. Các yếu tố cấu tạo nên Spirulina gồm 75% là chất hữu cơ và 25% là khoáng chất. Vì thế tảo chứa các chất căn bản trong việc trị liệu. Các đặc tính trị liệu của tảo rất nhiều như tái bổ sung nước, muối khoáng và dinh dưỡng cho cơ thể. 1.6.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong nước Trong những năm 1985 – 1995, đã có những nghiên cứu cấp Nhà nước thuốc lĩnh vự công nghệ sinh học như nghiên cứu của GS.TS Nguyễn Hữu Thước và các cộng sự (Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) với đề tài “ Công nghiệp nuôi trồng và sử dụng tảo Spirulina”; hay đề tài cấp thành 12 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Tổng quan phố của Bác sĩ Nguyễn Thị Kim Hưng (Tp. Hồ Chí Minh) và cộng sự với tiêu đề “Nghiên cứu sản xuất và sử dụng thức ăn có tảo Spirulina trong dinh dưỡng điều trị”. Từ nhiều năm nay, Nhà nước đã chú trọng vào việc nuôi trồng và thử nghiệm vi tảo Spirulina, bước đầu thành công ở một số nơi như Vĩnh Hảo, Đắc Lắc, Đồng Nai. Từ nguồn nguyên liệu Spirulina đạt chất lượng cao và ổn định, các nhà khoa học đã sản xuất thành công một số loại thuốc như: Linavina, Lactogil (Xí nghiệp Mekophar); Cốm bổ, Bột dinh dưỡng Enalac (Trung Tâm Dinh Dưỡng Trẻ Em Thành Phố Hồ Chí Minh), Gelule Spilina (Lebo, Helvinam, Trường Đại Học Y Dược). Nhìn chung, lịch sử nghiên cứu và nuôi trồng tảo Spirulina ở nước ta đã thu được nhiều kết quả ban đầu đáng khích lệ. Tuy nhiên cho đến nay việc nuôi trồng tảo vẫn mang tính nhỏ lẻ, lạc hậu, không đáp ứng được nhu cầu sử dụng tảo ngày càng tăng cao. Vì vậy, trước những giá trị về mọi mặt mà tảo Spirulina mang lại, cần phải tiến hành cải thiện, thúc đẩy ngành công nghiệp nuôi trồng tảo nhằm đáp ứng nhu cầu trong nước và xuất khẩu. Thí nghiệm này thực hiện nhằm mục đích khảo sát các yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng lên khả năng tăng trưởng, xác định hàm lượng protein tổng, các acid amin và khả năng chống oxy hóa của Spirulina sp. 13 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Vật liệu và phương pháp CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Chủng Spirulina sp. Chủng tảo Spirulina được cung cấp bởi Tiến sĩ Trần Ngọc Đức, Phòng Công nghệ Tảo, Trường Đại học Quốc tế, Đại học Quốc gia TP. HCM. Spirulina được nuôi cấy trên môi trường Zarrouk, pH = 8,5 - 9,0 [60]. Pha môi trường Zarouk theo bảng 3.1 và chỉnh pH = 8,5, rồi đem đi hấp tiệt trùng, chú ý không cho muối bicarbonate. Pha stock muối bicarbonate với nồng độ 1M, pH = 8,5 lọc tiệt khuẩn bằng màng lọc sợi thủy tinh, bổ sung vào môi trường đã tiệt khuẩn vừa đủ 1L. Bảng 3.1 Thành phần của môi trường Zarrouk [53] Hóa chất Lượng (g/L) NaNO3 2,5 K2HPO4 0,5 K2SO4 1 NaCl 1 MgSO4.7H2O 0,2 CaCl2.2H2O 0,04 FeSO4.7H2O 0,01 EDTA 0,08 NaHCO3 16,8 Nguyên tố vi lượng 1mL Nước cất vừa đủ 1L Dung dịch nguyên tố vi lượng: H3BO3: 2,86; MnCl2.4H2O: 1,81; ZnSO4.4H2O: 0,222; CuSO4.5H2O: 0,079 (g/L). 2.2. Các phương pháp phân tích 2.2.1. Quan sát hình thái tế bào Spirulina sp. Hình thái tế bào Spirulina sp. được quan sát bằng kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400x sau các ngày nuôi cấy. 14 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Vật liệu và phương pháp 2.2.2. Xác định sinh khối tế bào Spirulina sp. Lấy 10 mL dịch nuôi cấy tảo lọc qua màng sợi thủy tinh, với đường kính màng là 47 mm, đường kính lỗ 0,7 µm. Sau đó tảo được rửa với 20 mL nước cất hấp vô trùng, và sấy khô ở 103°C suốt 6 tiếng hoặc cho đến khi trọng lượng khô không đổi [A(g)]. Trọng lượng khô này tiếp tục được đốt ở 550oC để tạo tro [B(g)] (khoáng chất). Sinh khối [C(g)]: C=A-B (g) [87]. 2.2.3. Xác định tốc độ tăng trưởng đặc hiệu Sinh khối tế bào ở hai thời điểm khác nhau trong quá trình tăng trưởng của mẫu tảo được dùng để tính tốc độ tăng trưởng đặc hiệu (µ: g/L/ngày) trong khoảng thời gian đó theo công thức [52]: 푙푛 ( 푖표 / 푖표 ) µ = 2 1 푡2 − 푡1 Trong đó: Bio1, Bio2: Sinh khối tế bào tại thời điểm 1 và 2 t1, t2: thời điểm 1 và 2 2.2.4. Xác định hàm lượng protein của Spirulina sp. bằng phương pháp Bradford Pha thuốc thử: cân 10 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 hòa tan trong 50 mL ethanol 95%. Thêm 100 mL H3PO4 85%, thêm nước cất vừa đủ 1000 mL [17]. Xác định hàm lượng protein tổng: Lấy 1,0 mL dung dịch tảo ly tâm 10.000 vòng trong 15 phút, loại bỏ dịch, cắn được rửa nhiều lần với 1 mL nước cất (hấp vô trùng) bằng cách ly tâm 10.000 vòng trong 15 phút. Thêm 1 mL ethanol tuyệt đối vào cắn, trộn đều, đun cách thủy 5 phút ở nhiệt độ 50 – 600C, sau đó làm nguội bằng nước lạnh đến nhiệt độ phòng. Ly tâm 5000 vòng trong 5 phút, loại bỏ dịch lấy cắn. Tiếp tục cho 200 µl nước cất hấp vô trùng, thêm 1 mL thuốc thử trộn đều và ủ 10 phút. Đo quang ở bước sóng 595 nm [17]. Đường chuẩn protein: Sử dụng nồng độ protein chuẩn 10 đến 120 µg/mL được pha từ Bovine serum albumin và xác định nồng độ protein trong mẫu Spirulina sp. bằng phương trình y = 0,003x + 0,0124; R² = 0,9951. 15 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Vật liệu và phương pháp 2.2.5. Xác định hàm lượng phenolic tổng  Xác định hàm lượng phenolic tổng [34], [37], [51]: . Lấy 1,0 mL dung dịch tảo ly tâm 10.000 vòng trong 15 phút, loại bỏ dịch, cắn được rửa nhiều lần với 1mL nước cất (hấp vô trùng) bằng cách ly tâm 10.000 vòng trong 15 phút. Thêm 1mL methanol tuyệt đối vào cắn, trộn đều. Ly tâm 5000 vòng trong 5 phút, bỏ cắn thu được dịch chiết. . Lấy 0,5 mL dịch chiết cho vào eppendorf 2 mL, cho thêm 0,5 mL thuốc thử Folin-Ciocalteu’s phenol, tiếp tục cho từ từ 0,5 mL dung dịch Na2CO3 10%. . Ủ 90 phút trong tối. . Đo quang ở bước sóng 750 nm.  Đường chuẩn phenolic: Sử dụng nồng độ acid gallic chuẩn 10 đến 200 mg/L và xác định nồng độ phenolic tổng trong mẫu Spirulina sp. bằng phương trình: y = 30,263x – 0,0638; R² = 0,9948. 2.2.6. Xác định hàm lượng chất oxy hóa tổng  Pha thuốc thử DPPH: pha dung dịch thuốc thử DPPH với nồng độ 0,004% trong methanol [79], [86].  Lấy 1,0 mL dung dịch tảo ly tâm 10.000 vòng trong 15 phút, loại bỏ dịch, cắn được rửa nhiều lần với 1mL nước cất (hấp vô trùng) bằng cách ly tâm 10.000 vòng trong 15 phút. Thêm 1mL ethanol tuyệt đối vào cắn, trộn đều và ủ 4 tiếng ở 40C. Ly tâm 5000 vòng trong 5 phút, bỏ cắn lấy dịch chiết.  Lấy 0,5 mL dịch chiết cho vào eppendorf 2 mL, cho thêm 1 mL thuốc thử DPPH trộn đều. Ủ 30 phút trong tối, ở nhiệt độ phòng. Đo quang ở bước sóng 517nm.  Khả năng chống oxy hóa (I%) được tính theo công thức [13], [79], [86]: − I% = ẫ 푡 ắ푛𝑔 ẫ 푡ℎử 100 ẫ 푡ℎử Trong đó: I%: Tỷ lệ phần trăm ức chế (Percentage inhibition) A Mẫu trắng: độ hấp thu của mẫu trắng tại bước sóng 517 nm A Mẫu thử: độ hấp thu của mẫu thử tại bước sóng 517 nm 16 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Vật liệu và phương pháp 2.2.7. Xác định hàm lượng các acid amin theo hệ thống Pico – Tag Sau 5 ngày nuôi cấy, tiến hành thu sinh khối Spirulina bằng cách lọc dịch tảo qua túi lọc nylon monofilament với đường kính lỗ lọc là 25 µm. Sau đó rửa tảo nhiều lần với nước cất hấp vô trùng, lấy tảo trải đều trên giấy bạc và sấy khô ở nhiệt độ 600C. Tảo sau khi sấy khô được bảo quản trong falcon có quấn giấy bạc, để vào tủ đông -200C. Mẫu Spirulina đã sấy khô sẽ được gửi đến Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường (Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh) phân tích các thành phần và hàm lượng các acid amin thiết yếu bằng phương pháp Pico – Tag. 2.3. Phương pháp thiết kế thí nghiệm 2.3.1. Thí nghiệm 1: Lựa chọn điều kiện ánh sáng nuôi cấy thích hợp Chất lượng ánh sáng có ảnh hưởng đến sự tăng trưởng, quang hợp và chuyển hóa carbon ở hai loài tảo biển, Cyclotella nana (Hustedt) và Dunaliella tertiolecta (Butcher) [27]. Spirulina là một trong những loài sinh vật tự dưỡng bằng cách quang hợp, chính vì thế ánh sáng ảnh hưởng đến sự phát triển của tảo [81]. Trong tảo Spirulina có chứa diệp lục tố a và b – sắc tố hấp thu ánh sáng và nhạy với bước sóng ánh sáng xanh dương và ánh sáng đỏ. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, tảo lam phát triển tốt hơn ở ánh sáng xanh dương và ánh sáng đỏ. Bên cạnh đó, cường độ ánh sáng và chu kỳ sáng tối cũng như yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và sinh khối của tảo [73]. Spirulina sp. Mỹ đạt giai đoạn tăng trưởng sau khoảng 5 ngày nuôi cấy trên môi trường Zarrouk; pH = 8,5 – 9,0 [60]; được chiếu sáng liên tục với cường độ ánh sáng 30 µmol/phonton/m2/s, nhiệt độ 25 ± 20C sử dụng để bố trí thí nghiệm (hình 2.1). Thí nghiệm sử dụng bình tam giác 250 mL bao gồm: dịch tảo trong đạt giai đoạn tăng trưởng và vừa đủ 100 mL môi trường Zarrouk, chiếu sáng ở cường độ ánh sáng 30 µmol photon/m2/s liên tục với ánh sáng trắng, đỏ (600-700 nm), xanh dương (400- 500 nm) bằng hệ thống đèn LED. Sau 5 ngày nuôi cấy, tiến hành phân tích các nghiệm thức (hình 2.2): Hình thái tế bào. 17 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Vật liệu và phương pháp Sinh khối tế bào. Tốc độ tăng trưởng đặc hiệu. Hàm lượng protein tổng. Hình 2.1 Spirulina sp. nuôi cấy trong môi trường Zarrouk Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nuôi cấy Spirulina trong các điều kiện ánh sáng khác nhau 2.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố nitơ lên sự tăng trưởng và hàm lượng protein ở Spirulina sp. Trong nuôi cấy tảo nói chung, nguồn tảo giống, chất dinh dưỡng và điều kiện môi trường nuôi cấy là những yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến sự tăng trưởng và thành phần sinh hóa của tảo. Các thành phần dinh dưỡng đa lượng (carbon, nitơ, photpho) và vi lượng ảnh hưởng rất lớn đến tăng trưởng của tảo, đặc biệt trong điều kiện nuôi với mật độ cao [26], [67]. Tất cả các quá trình sinh tổng hợp hình thành sản phẩm, 18 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Vật liệu và phương pháp tái tạo và bảo trì tế bào rất cần yếu tố nitơ. Đặc biệt, quá trình sản xuất các sản phẩm chính (protein và carbohydrate) và các chất chuyển hóa của vi sinh vật bị ảnh hưởng rất lớn bởi điều kiện tăng trưởng [10]. Spirulina sp. Mỹ đạt giai đoạn tăng trưởng sau khoảng 5 ngày nuôi cấy trên môi trường Zarrouk; pH = 8,5 – 9,5 [60]; được chiếu sáng liên tục với cường độ ánh sáng 30 µmol/phonton/m2/s, nhiệt độ 25 ± 20C được sử dụng để bố trí thí nghiệm (hình 2.1). Thí nghiệm thực trên các bình nhựa 5L bao gồm: dịch tảo đạt giai đoạn tăng trưởng và thể tích môi trường Zarruok vừa đủ 3,5L; sục khí liên tục và được chiếu sáng ở cường độ 100 µmol photon/m2/s (với chu kỳ sáng: tối, 12 giờ: 12 giờ) trong điều kiện ánh sáng cho hiệu suất tối ưu với 3 nồng độ NaNO3 như sau: 1,25 g/L; 2,5 g/L; 5,0 g/L. Sau mỗi 2 ngày nuôi cấy, tiến hành phân tích các nghiệm thức (hình 2.3 và 2.4): Sinh khối tế bào. Tốc độ tăng trưởng đặc hiệu. Hàm lượng protein tổng. Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nuôi cấy Spirulina ở các điều kiện NaNO3 khác nhau 19 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Vật liệu và phương pháp Hình 2.4 Các bình chứa dịch tảo trong hệ thống thí nghiệm 2.3.3. Thí nghiệm 3: Nuôi cấy, thu sinh khối và phân tích thành phần acid amin Spirulina sp. Mỹ và Spirulina sp. Nhật đạt giai đoạn tăng trưởng sau khoảng 5 ngày nuôi cấy trên môi trường Zarrouk; pH = 8,5 – 9,5 [60]; được chiếu sáng liên tục với cường độ ánh sáng 30 µmol/phonton/m2/s, nhiệt độ 25 ± 20C được sử dụng để bố trí thí nghiệm (hình 2.1). Thí nghiệm thực trên các bình nhựa 5L bao gồm: dịch tảo đạt giai đoạn tăng trưởng và vừa đủ 3,5L môi trường Zarrouk, sục khí liên tục và được chiếu sáng ở cường độ 100 µmol photon/m2/s (với chu kỳ sáng: tối, 12 giờ: 12 giờ) trong điều kiện ánh sáng và nồng độ NaNO3 cho hiệu suất tối ưu ở thí nghiệm 1 và 2 (hình 2.5). Vào ngày nuôi cấy thứ 3,4,5 phân tích các nghiệm thức và các nghiệm thức lặp lại 3 lần: Hình thái tế bào. Sinh khối tế bào. Tốc độ tăng trưởng đặc hiệu. Hàm lượng protein tổng. Hàm lượng phenolic tổng. Hàm lượng chất chống oxi hóa tổng. Sau 5 ngày nuôi cấy tiến hành thu sinh khối tảo. Lọc dịch tảo qua túi lọc nylon monofilament với đường kính lỗ lọc là 25 µm. Sau đó rửa tảo nhiều lần với nước cất hấp vô trùng, lấy tảo trải đều trên giấy bạc và sấy khô ở nhiệt độ 600C. Tảo sau khi sấy khô được bảo quản trong falcon có quấn giấy bạc, để vào tủ đông -200C. 20 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Vật liệu và phương pháp Mẫu Spirulina đã sấy khô sẽ được gửi đến Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường (Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh) phân tích các thành phần và hàm lượng các acid amin thiết yếu bằng phương pháp Pico – Tag. Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nuôi cấy các chủng Spirulina sp. ở điều kiện NaNO3 5 g/L 2.4. Xử lý số liệu Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Số liệu được xử lý bằng Microsoft office Excel 2013 và phân tích one way ANOVA bằng phần mềm SPSS 20.0 với sai số ý nghĩa p < 0,05. Tất cả các số liệu trong thí nghiệm được trình bày dưới dạng: Trung bình (Mean) ± Sai số chuẩn (SE). 21 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và biện luận CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Kết quả 3.1.1. Lựa chọn điều kiện ánh sáng nuôi cấy thích hợp 3.1.1.1. Hình thái tế bào Spirulina sp. Kết quả thí nghiệm cho thấy chất lượng ánh sáng ảnh hưởng rõ rệt lên hình thái, màu sắc và số lượng tế bào. Cụ thể sau 5 ngày nuôi cây, Spirulina ở cả 3 điều kiện ánh sáng đều giãn xoắn và số lượng tế bào bắt đầu tăng. Ở điều kiện ánh sáng đỏ và ánh sáng trắng từ ngày nuôi cấy thứ 5 trở đi tế bào chuyển từ màu xanh qua màu vàng cam; số lượng tế bào giảm sau 10 ngày nuôi cấy. Riêng ánh sáng xanh dương, màu sắc tế bào hầu như không thay đổi vẫn giữ màu xanh và số lượng tế bào duy trì sau 15 ngày nuôi cấy (hình 3.1). Hình 3.1 Hình thái tế bào Spirulina sp. trong các điều kiện nuôi cấy ánh sáng đỏ (I), ánh sáng xanh dương (II) và ánh sáng trắng (III) 22 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và biện luận Dịch nuôi cấy Spirulina sp. chuyển sang màu vàng cam sau 5 ngày nuôi cấy ở điều kiện ánh sáng đỏ và ánh sáng trắng. Dưới điều kiện ánh xanh dương, dịch tế bào có màu xanh (hình 3.2). Hình 3.2 Màu sắc dịch nuôi ngày thứ 10 trong điều kiện nuôi cấy ánh sáng đỏ (a), ánh sáng xanh dương (b) và ánh sáng trắng (c) 3.1.1.2. Sự tăng trưởng của Spirulina sp. Sự tăng trưởng của Spirulina sp. cho thấy ở hình 4.3, ở điều kiện ánh sáng đỏ và ánh sáng trắng tảo tăng trưởng mạnh với lượng sinh khối tích lũy cực đại sau 5 ngày nuôi cấy. Trong khi đó trong điều kiện ánh sáng xanh dương tảo đạt sinh khối cực đại vào ngày 10 và có sự tăng trưởng ổn định sau đó. Khối lượng sinh khối cực đại ở ánh sáng đỏ (0,84g/L) cao hơn 1,4 lần so với điều kiện ánh sáng trắng và gấp 3 lần so với điều kiện ánh sáng xanh dương (0,57 g/L và 0,28g/L) p<0,05 (bảng 3.1). Ánh sáng đỏ 1,0 Ánh sáng xanh dương 0,9 0,84 Ánh sáng trắng 0,8 0,7 0,60 0,57 0,6 0,5 0,4 Sinh khối (g/L) khối Sinh 0,3 0,2 0,1 0,0 0 5 10 15 20 Ngày Hình 3.3 Sinh khối của Spirulina sp. trong các điều kiện ánh sáng khác nhau 23 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và biện luận Tốc độ tăng trưởng của Spirulina sp. trong điều kiện nuôi cấy ánh sáng đỏ cao hơn so với các điều kiện ánh sáng khác (p < 0,05). Cụ thể, ở điều kiện ánh sáng đỏ, tốc độ tăng trưởng đạt 0,32 (g/L/ngày) cao gấp 2,5 lần tốc độ tăng trưởng đặc hiệu ở điều kiện ánh sáng xanh dương (0,13 g/L/ngày) và gấp 1,3 lần ở điều kiện ánh sáng trắng (0,25 g/L/ngày). Qua các kết quả trên, ta thấy chất lượng ánh sáng có ảnh hưởng lên sự tích lũy sinh khối và tốc độ tăng trưởng của tảo Spirulina sp. (hình 3.4). 0,40 0,32 0,35 0,25 0,30 0,25 0,20 0,13 /ngày) 0,15 L 0,10 (g/ 0,05 0,00 Tốc độ tăng tăng độ đặc hiệu Tốc trưởng Ánh sáng đỏ Ánh sáng xanh Ánh sáng trắng dương Điều kiện ánh sáng Hình 3.4 Tốc độ tăng trưởng đặc hiệu của Spirulina sp. trong các điều kiện ánh sáng khác nhau Bảng 3.1 Khối lượng sinh khối khô Spirulina theo từng loại ánh sáng Khối lượng sinh khối khô (g/L) của Spirulina sp. Điều kiện ánh sáng Ngày 0 Ngày 5 Ngày 10 Ngày 15 Ngày 20 0,16667 ± 0,84000 ± 0,57000 ± 0,38667 ± 0,36000 ± Đỏ 0,018561a 0,011553c 0,1457223a 0,0352812a 0,0550812a Xanh 0,16667 ± 0,28000 ± 0,60333 ± 0,50667 ± 0,66000 ± dương 0,018561a 0,011552a 0,017644a 0,029633a 0,011554b 0,16667 ± 0,57000 ± 0,47667 ± 0,48000 ± 0,45000 ± Trắng 0,018561a 0,011552b 0,056082a 0,032152a 0,017322a Các số trung bình trong hàng với các mẫu tự số khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05 Các số trung bình trong cột với các mẫu tự chữ khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05 24 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và biện luận 3.1.1.3. Hàm lượng protein của Spirulina sp. Spirulina sp. tích lũy hàm lượng protein (g/L) cực đại sau 10 ngày nuôi cấy sau đó giảm dần ở điều kiện ánh sáng xanh dương và ánh sáng trắng ( 0,103 g/L và 0,112 g/L). Ở điều kiện ánh sáng đỏ, hàm lượng protein được tích lũy cực đại sau 5 ngày nuôi cấy (0,109 g/L) và bắt đầu giảm vào ngày thứ 10 sau khi nuôi cấy. Tuy nhiên, không có sự khác biệt về hàm lượng protein tổng (g/L) được tích lũy cực đại khi nuôi cấy Spirulina ở 3 điều kiện ánh sáng trên; p>0,05 (hình 3.5.a, bảng 3.2). 0,14 a 0,103 Ánh sáng đỏ 0,112 0,12 0,109 Ánh sáng xanh dương 0,10 Ánh sáng trắng 0,08 0,06 0,04 Hàm lượng lượng protein(g/L) Hàm 0,02 0,00 0 5 10 15 20 Ngày 50,0 b Ánh sáng đỏ 45,0 40,7 Ánh sáng xanh dương 40,0 35,0 Ánh sáng trắng 30,0 25,0 17,4 20,0 15,9 15,0 (% khô) khối (% /sinh Hàm lượng lượng protein Hàm 10,0 5,0 0,0 0 5 10 15 20 Ngày Hình 3.5 Hàm lượng protein tổng (g/l) (a) và phần trăm (%) (b) của Spirulina trong các điều kiện ánh sáng khác nhau 25 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và biện luận Mặc khác, quan sát hình 3.5.b cho thấy khả năng tích lũy protein bị ảnh hưởng bởi các chất lượng ánh sáng khác nhau, tỷ lệ phần trăm protein tổng so với khối lượng sinh khối khô của Spirulina sp. trong các điều kiện ánh sáng khác nhau đạt cực đại sau 5 ngày nuôi cấy và giảm dần sau đó. Trong đó, Spirulina tích lũy protein cao trong điều kiện ánh sáng xanh dương khoảng 40,66% sinh khối khô, cao hơn gấp đôi trong ánh sáng trắng và đỏ (17,42 và 15,91% ) (p<0,05) (hình 3.5.b, bảng 3.3). Bảng 3.2 Nồng độ protein tổng (g/L) theo từng loại ánh sáng Điều kiện Nồng độ protein(g/l) của Spirulina sp. ánh sáng Ngày 0 Ngày 5 Ngày 10 Ngày 15 Ngày 20 0,00253 ± 0,10853 ± 0,09198 ± 0,04298 ± 0,02487 ± Đỏ 0,000691a 0,021412a 0,0119612a 0,0128312a 0,0050112a Xanh 0,00253 ± 0,09787 ± 0,10364 ± 0,08664 ± 0,05287 ± dương 0,000691a 0,0063423a 0,007063a 0,0134523a 0,004162b 0,00253 ± 0,10964 ± 0.11242 ± 0,07864 ± 0,03909 ± Trắng 0,000691a 0,018582a 0,011042a 0,019682a 0,007221ab Các số trung bình trong hàng với các mẫu tự số khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05 Các số trung bình trong cột với các mẫu tự chữ khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05 Bảng 3.3 Hàm lượng protein (%) tổng theo từng loại ánh sáng Điều kiện Hàm lượng protein(%) của Spirulina sp. ánh sáng Ngày 0 Ngày 5 Ngày 10 Ngày 15 Ngày 20 2,3899 ± 15,9152 ± 12,0896 ± 7,3112 ± 6,7636 ± Đỏ 0,65711a 2,72243a 1,652323a 1,949812a 1,444912a Xanh 2,3899 ± 40,6618 ± 22,7506 ± 13,0606 ± 7,3397 ± dương 0,65711a 3,36544b 2,5002 3b 2,212423a 0,458112a 2,3899 ± 17,4220 ± 15,1703 ± 13,0642 ± 8,3539 ± Trắng 0,65711a 2,9817 4a 1,0966 23ab 2,7835 1a 0,894112a Các số trung bình trong hàng với các mẫu tự số khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05 Các số trung bình trong cột với các mẫu tự chữ khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05 26 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và biện luận Các kết quả về hình thái tế bào, sinh khối, protein cho thấy Spirulina sp. trong điều kiện ánh sáng đỏ có tốc độ tăng trưởng sau 5 ngày nuôi cấy, tuy nhiên hàm lượng protein được tích lũy khá thấp. Trong khi đó ở điều kiện ánh sáng trắng và xanh dương tốc độ tăng trưởng thấp hơn nhưng hàm lượng protein đạt cao nhất sau 5 ngày nuôi cấy (hình 3.3, 3.4 và 3.5). Như vậy dưới điều kiện ánh sáng đỏ Spirulina sp. tăng hiệu quả cố định CO2 tốt hơn so với các điều kiện ánh sáng còn lại sau 5 ngày nuôi cấy. Ngược lại điều kiện ánh sáng trắng và xanh dương kích thích tế bào Spirulina sp. tổng hợp protein cao và hiệu quả cố định CO2 thấp hơn sau 5 ngày nuôi cấy. Từ thí nghiệm trên, ta thấy điều kiện ánh sáng xanh dương Spirulina sp. có hiệu suất tối ưu về hàm lượng protein. Tuy nhiên, để áp dụng với quy mô công nghiệp ánh sáng trắng phù hợp hơn về sự tiện dụng và chi phí. Vì thế, ánh sáng trắng là điều kiện nuôi cấy Spirulina cho thí nghiệm 2. Thí nghiệm này, nhằm mục đích xác định lượng nitơ cần thiết mang lại hiệu xuất tối ưu về hàm lượng protein. 3.1.2. Ảnh hưởng của yếu tố nitơ lên sự tăng trưởng và hàm lượng protein ở Spirulina sp. 3.1.2.1. Sự tăng trưởng của Spirulina sp. Kết quả thí nghiệm cho thấy, nồng độ NaNO3 trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng lên sự tăng trưởng của quần thể tảo Spirulina sp. Tảo được nuôi cấy trong môi trường có nồng độ NaNO3 cao (5,0 g/L) cho sinh khối đạt (0,60 g/L) sau 13 ngày nuôi cấy cao hơn so với khối lượng sinh khối được tạo ra khi nuôi cấy trong điều kiện nồng độ NaNO3 thấp (1,25 g/L và 2,5 g/L) (0,50 g/L và 0,51 g/L). Sinh khối của Spirulina trong các điều kiện nuôi cấy có nồng độ NaNO3 khác nhau tại các ngày nuôi cấy thứ 9, 11, 13 hầu như bằng nhau vì thế có thể tiến hành thu sinh khối vào các thời điểm này (hình 3.6, bảng 3.4). Nồng độ nitơ cũng ảnh hưởng lên tốc độ tăng trưởng của Spirulina sp., tốc độ tăng trưởng đặc hiệu đạt cao nhất (0,21 g/L/ngày) khi nuôi cấy ở điều kiện môi trường có nồng độ NaNO3 so với 2 điều kiện còn lại có nồng độ NaNO3 thấp hơn (0,20 g/L/ngày và 0,19 g/L/ngày) (hình 3.7). 27 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và biện luận Tuy nhiên, không có sự khác biệt ý nghĩa về sinh khối và tốc độ tăng trưởng đặc hiệu của Spirulina sp. trong các điều kiện nuôi cấy với những nồng độ NaNO3 khác nhau (p > 0,05) nhưng ta có thể nhận thấy một xu hướng chung là, khi tăng nồng độ NaNO3, sinh khối của tảo có khuynh hướng tăng dần (hình 3.6 và 3.7, bảng 3.4.). 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 1,25 g/L Sinh khối (g/L) khối Sinh 0,2 2,5 g/L 0,1 5 g/L 0,0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Ngày Hình 3.6 Sinh khối của Spirulina sp. trong các nồng độ NaNO3 khác nhau 0,26 0,24 0,21 0,20 0,22 0,19 0,20 0,18 (g/L/ngày) 0,16 0,14 Tốc độ tăng tăng độ đặc hiệu Tốc trưởng 0,12 0,10 1,25 g/l 2,5 g/l 5 g/l Nồng độ NaNO3 Hình 3.7 Tốc độ tăng trưởng đặc hiệu của Spirulina sp. trong các nồng độ NaNO3 khác nhau 28 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và biện luận Bảng 3.4. Khối lượng sinh khối khô Spirulina theo từng nồng độ NaNO3 khác nhau Điều kiện về nồng độ NaNO3 (g/L) 1,25 2,50 5,0 sp. 0,04000 ± 0,04000 ± 0,04000 ± Ngày 0 0,010001a 0,010001a 0,010001a 0,06333 ± 0,07667 ± 0,08333 ± Spirulina Ngày 2 a 0,018561a 0,018561a 0,018561a ủ 0,14667 ± 0,13667 ± 0,17667 ± Ngày 4 0,024041a 0,014531a 0,0033312a 0,32333 ± 0,30333 ± 0,29667 ± Ngày 6 0,032832a 0,037562a 0,0437223a 0,38000 ± 0,38000 ± 0,49000 ± Ngày 9 0,0152823a 0,0208223a 0,0404134a ng sinh khói khô (g/L) c ợ 0,40667 ± 0,40333 ± 0,50667 ± i lư Ngày 11 ố 0,0466723a 0,0290623a 0,053644a Kh 0,50000 ± 0,51000 ± 0,60000 ± Ngày 13 0,066583a 0,058593a 0,072344a Các số trung bình trong hàng với các mẫu tự chữ khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05. Các số trung bình trong cột với các mẫu tự số khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05. 3.1.2.2. Hàm lượng protein của Spirulina trong các điều kiện nồng độ NaNO3 khác nhau Sự tích lũy hàm lượng protein (g/L) của Spirulina ở trong 3 điều kiện nồng độ NaNO3 khác nhau có xu hướng tăng dần. Sau 13 ngày nuôi cấy, nồng độ protein ở 3 điều kiện NaNO3 1,25 g/L; 2,5 g/L và 5,0 g/L lần lượt là: 0,14 g/L; 0,11 g/L và 0,13 g/L, p>0,05 (hình 3.8.a, bảng 3.5). Ở nồng độ NaNO3 cao nhất (5 g/L) hàm lượng protein đạt được là lớn nhất (34,41%) sau 6 ngày nuôi cấy, hai nồng độ NaNO3 thấp hơn (1,25 g/L và 2,5 g/L) có hàm lượng protein thấp hơn (33,02% sau 11 ngày nuôi cấy và 33, 45% sau 4 ngày 29 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và biện luận nuôi cấy) (hình 3.8.b, bảng 3.5). Tuy không có sự khác biệt ý nghĩa về hàm lượng protein giữa các nồng độ NaNO3 khác nhau (p > 0,05) nhưng kết quả phân tích hàm lượng protein của Spirulina nuôi ở các nồng độ nitơ khác nhau cho thấy, hàm lượng protein phụ thuộc chặt chẽ vào các nồng độ nitơ có trong môi trường nuôi cấy với xu hướng chung là sự gia tăng các nồng độ NaNO3 tỷ lệ thuận với hàm lượng protein. 0,18 1,25 g/L a 0,16 2,5 g/L 0,14 5 g/L 0,12 0,1 protein (g/L) protein 0,08 0,06 0,04 Hàm lượng lượng Hàm 0,02 0 0 2 4 6 9 11 13 Ngày 45,0 1,25 g/L b 2,5 g/L 40,0 34,4 33,5 5 g/L 35,0 33,0 30,0 25,0 20,0 15,0 (%/sinh khối khô) khối (%/sinh Hàm lượng lượng protein Hàm 10,0 5,0 0,0 0 2 4 6 9 11 13 Ngày Hình 3.8 Hàm lượng protein tổng (g/L) (a) và phần trăm protein (%) (b) của Spirulina trong các nồng độ NaNO3 khác nhau 30 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và biện luận Bảng 3.5 Khả năng tích lũy protein theo từng nồng độ NaNO3 khác nhau Điều kiện nồng độ NaNO3 1,25 (g/L) 2,50 (g/L) 5,0 (g/L) Protein/ Protein/ Protein/ Protein/ Protein/ Protein/ Ngày thể tích sinh khối thể tích sinh khối thể tích sinh khối (g/L) (%) (g/L) (%) (g/L) (%) 0,00498 ± 14,60000 ± 0,00498 ± 14,60000 ± 0,00498 ± 14,60000 ± 0 0,000511a 4,417191a 0,000511a 4,417191a 0,000511a 4,417191a 0,01742 ± 22,85450 ± 0,02342 ± 28,20423 ± 0,02109 ± 27,53704 ± 2 12a 12a 12a 1a 12a 0,000511a 1,56898 0,00328 3,45895 0,00088 0,79888 0,03076 ± 22,83879 ± 0,04464 ± 33,45376 ± 0,04742 ± 26,91552 ± 4 12a 23ab 2a 2b 12a 0,003601a 5,83680 0,00153 3,77079 0,00424 2,72403 0,07331 ± 23.59100 ± 0,06909 ± 23,45816 ± 0,09709 ± 34,41058 ± 6 12a 34a 12a 3b 2a 0,005752a 4,54250 0,00166 2,88192 0,00270 5,81339 0,09953 ± 26,28715 ± 0,09687 ± 25,66152 ± 0,10353 ± 21,35815 ± 9 12a 45a 12a 3a 12a 0,000592a 1,17230 0,00059 1,56545 0,00796 2,16083 0,13398 ± 33,02183 ± 0,10287 ± 25,62498 ± 0,11353 ± 22,94755 ± 11 2b 5a 12ab 34ab 12a 0,014153b 0,73682 0,01070 2,53442 0,00416 2,67359 0,14342 ± 29,33401 ± 0,11220 ± 22,72727 ± 0,13320 ± 22,90335 ± 13 12a 5a 12a 4a 12b 0,009793a 2,91935 0,01052 3,56129 0,00304 3,04004 Các số trung bình trong hàng với các mẫu tự số khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05 Các số trung bình trong cột với các mẫu tự chữ khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05 Tóm lại, ta có thể thấy nồng độ NaNO3 trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng khá rõ lên sự tăng trưởng và tích lũy protein của Spirulina. Khi tăng nồng độ NaNO3 trong môi trường Zarrouk từ 1,25 g/L đến 5 g/L thì sinh khối, tốc độ tăng trưởng đặc hiệu và hàm lượng protein tổng của Spirulina tăng theo. Vì thế, ở thí nghiệm 3 sử dụng nồng độ NaNO3 5 g/L để nuôi cấy 2 chủng Spirulina sp. Mỹ và Nhật tiến hành xác định hàm lượng protein tổng, khả chống oxy hóa, thu sinh khối và định lượng các acid amin thiết yếu sau 5 ngày nuôi cấy. 31 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và biện luận 3.1.3. Nuôi cấy, thu sinh khối và phân tích thành phần acid amin 3.1.3.1. Hình thái của các chủng Spirulina sp. Màu sắc và kích thước tế bào của cả 2 chủng Spirulina không thay đổi, vẫn giữ màu xanh từ ngày nuôi cấy đầu tiên đến ngày thứ 5. Mức độ xoắn của các sợi ở cả 2 chủng hầu như không thay đổi trong 5 ngày nuôi cấy (hình 3.9). Dịch nuôi cấy của 2 chủng Spirulina có màu xanh sau 5 ngày nuôi cấy (hình 3.10). Ở điều kiện môi trường có nồng độ NaNO3 5 g/L, cả 2 chủng Spirulina sp. đều duy trì màu sắc và hình thái tế bào. Spirulina sp. Mỹ Spirulina sp. Nhật Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Hình 3.9 Hình thái của 2 chủng Spirulina sp. Mỹ và Nhật 32 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và biện luận a b Hình 3.10 Màu sắc dịch nuôi cấy ngày thứ 5 trong môi trường Zarrouk chứa NaNO3 5,0 g/L của 2 chủng Spirulina sp. Nhật (a) và Sprulina sp. Mỹ (b) 3.1.3.2. Sự tăng trưởng của các Spirulina sp. Sinh khối của 2 chủng Spirulina sp. tăng dần từ ngày nuôi cấy thứ 3 đến ngày nuôi cấy thứ 5 và gần như bằng nhau. Chủng Spirulina sp. Nhật cho sinh khối đạt 0,207 g/L và tốc độ tăng trưởng đặc hiệu đạt 0,33 g/L/ngày; chủng Spirulina sp. Mỹ cho sinh khối 0,183 g/L và tốc độ tăng trưởng đặc hiệu đạt 0,32 g/L/ngày. Tuy không có sự khác biệt về sinh khối cũng như tốc độ tăng trưởng nhưng kết quả thí nghiệm cho thấy, cả 2 chủng đểu tăng trưởng tốt trong điều kiện nồng độ NaNO3 5,0 g/L (p > 0,05) (hình 3.11, bảng 3.6). 0,25 Spirulina sp. Nhật Spirulina sp. Mỹ 0,207 0,20 0,127 0,15 0,100 0,183 0,10 0,117 Sinh khối (g/l) khối Sinh 0,107 0,05 0,00 3 4 5 Ngày Hình 3.11 Sinh khối của 2 chủng Spirulina sp. Mỹ và Nhật 33 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và biện luận Bảng 3.6 Khối lượng sinh khối khô của 2 chủng Khối lượng sinh Spirulina sp. Nhật Spirulina sp. Mỹ khối khô (g/l) Ngày 3 0,10667 ± 0,01155a 0,10000 ± 0,02517a Ngày 4 0,11667 ± 0,00882a 0,12667 ± 0,00882a Ngày 5 0,20667 ± 0,00333b 0,18333 ± 0,00000b Các số trung bình trong cột với các mẫu tự chữ khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05. 3.1.3.3. Hàm lượng protein tổng và thành phần acid amin của các chủng Spirulina  Hàm lượng protein tổng Hàm lượng protein tổng của cả 2 chủng có nồng độ cao tăng dần cho đến ngày nuôi thứ 5. Ở chủng Spirulina sp. Mỹ cho hàm lượng protein tổng đạt 0,068 g/L và 37,63% so với sinh khối khô, chủng Spirulina sp. Nhật đạt 0,056 g/L và 27,36% sau 5 ngày nuôi cấy (hình 3.12, bảng 3.7) và kết quả này gần như tương so với thí nghiệm thứ 2. Điều này cho thấy, cả 2 chủng có thể tích lũy protein cao ở môi trường có nồng độ NaNO3 5,0 g/L. 0,08 Spirulina sp. Nhật 0,068 0,07 Spirulina sp. Mỹ 0,056 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 Hàm lượng (g/L) lượng protein Hàm 0,01 0,00 3 4 5 Ngày Hình 3.12 Hàm lượng protein tổng (g/L) của 2 chủng Spirulina sp. ở nồng độ NaNO3 5,0 g/L 34 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và biện luận 40,0 Spirulina sp. Nhật 37,63 Spirulina sp. Mỹ 35,0 30,0 27,36 25,0 20,0 15,0 (%/sinh khối khô) khối (%/sinh Hàm lượng protein lượng Hàm 10,0 5,0 0,0 3 4 5 Ngày Hình 3.13 Hàm lượng phần trăm protein tổng của 2 chủng Spirulina sp. ở nồng độ NaNO3 5,0 g/L Bảng 3.7 Hàm lượng protein tổng của các chủng Spirulina sp. Spirulina sp. Nhật Spirulina sp. Mỹ Hàm lượng protein tổng g/L % /sinh khối g/L %/sinh khối 0,01709 ± 16,17683 ± 0,02431 ± 26,67196 ± Ngày 3 0,00161a 1,38535a 0,00116a 5,67247a 0,02898 ± 24,89394 ± 0,03676 ± 29,70774 ± Ngày 4 0,00147a 1,54978ab 0,00404a 5,08785a 0,05576 ± 27,36040 ± 0,06787 ± 37,62956 ± Ngày 5 0,00676b 3,151152b 0,01100b 7,67100a Các số trung bình trong cột với các mẫu tự chữ khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05. 35 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và biện luận  Thành phần acid amin của các chủng Spirulina sp. Kết quả cho thấy hai chủng Spirulina sp. Mỹ và Nhật được nuôi cấy trong môi trường Zarrouk có sự đa dạng về thành phần acid amin gồm acid amin thiết yếu, bán thiết yếu và không thiết yếu. Ở chủng Spirulina sp. Nhật có hàm lượng các acid amin (%) cao hơn so với chủng Spirulina sp. Mỹ. Ở cả 2 chủng Spirulina sp., hàm lượng của 2 acid amin: L – Alanine và L – Proline cao nhất (khoảng từ 9,95% đến 15,16%) (bảng 4.8). Hai acid min này là một trong những loại acid amin không thiết yếu. L – Alanine có vai trò hỗ trợ quá trình chuyển hóa glucose, phát triển cơ bắp, điều tiết glycogen và được sử dụng như là nguồn năng lượng khi glycogen bị cạn kiệt chính. Vì thế L – Alanine thường được tìm thấy trong hầu hết các loại đồ uống trong lĩnh vực thể thao [31]. L - Proline được cơ thể tổng hợp bởi sự phân hủy của L – Glutamate và một số acid amin khác. Nó có vai trò sửa chữa mô, hình thành collagen, phòng ngừa xơ cứng động mạch và duy trì huyết áp [24], [84]. Nhóm acid amin chiếm hàm lượng cao thứ 2 là: L – Isoleucine, L – Leucine, L – Lysine và L – Phenylalanine (thuộc nhóm acid amin thiết yếu) chiếm hàm lượng khoảng từ 7,10% đến 10,29% (bảng 4.8). Các acid amin thiết yếu là những loại acid amin không được tổng hợp bởi cơ thể con người mà được cung cấp bởi thức ăn. L – Isoleucine và L – Leucine có vai trò rất quan trọng trong qua trình phục hồi sức khỏe và điều hòa lượng glucose trong máu. L – Phenylaline có chức năng bồi bổ não, tăng cường trí nhớ và tác động trực tiếp đến mọi hoạt động của não bộ [42]. Cuối cùng là những acid amin còn lại thuộc nhóm thiết yếu, bán thiết yếu và không thiết chứa hàm lượng thấp hơn (bảng 3.8). Vì vậy, hàm lượng nitơ trong nuôi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rõ rệt lên hàm lượng protein và thành phần acid amin của các chủng Spirulina sp. khác nhau. Trong đó môi trường nuôi cấy Zarrouk bổ sung NaNO3 5 g/L cả 2 chủng Spirulina sp. Mỹ và Nhật có hàm lượng protein và thành phần acid amin cao. 36 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và biện luận Bảng 3.8 Hàm lượng thành phần acid amin của Spirulina sp. Spirulina sp. Mỹ Spirulina sp. Nhật STT Các acid amin mg/g % protein mg/g % protein Thiết yếu 1 L – Isoleucine 27,35 7,36 27,70 10,24 2 L – Leucine 27,48 7,40 27,84 10,29 3 L – Lysine 22,40 6,03 25,44 9,40 4 L – Methionine 8,32 2,24 9,48 3,50 5 L – Phenylalanine 26,40 7,10 26,73 9,88 6 L – Threonine 16,93 4,56 17,78 6,57 7 L – Valine 7,85 2,11 8,95 3,31 Bán thiết yếu 8 L – Arginine 4,17 1,12 8,14 3,01 9 L – Histidine 16,70 4,49 21,11 7,80 Không thiết yếu 10 L – Aspartic acid 18,25 4,91 21,29 7,87 11 L – Alanine 38,76 10,43 42,98 15,89 12 L – Cystine 12,87 3,46 15,48 5,72 13 L – Glutamic acid 13,25 3,57 15,45 5,71 14 Glycine 12,82 3,45 15,44 5,71 15 L – Proline 36,97 9,95 41,00 15,16 16 L – Serine 17,95 4,83 21,61 7,99 17 L – Tyrosine 24,52 6,60 27,96 10,34 3.1.3.4. Khả năng chống oxy hóa của các chủng Spirulina sp.  Hàm lượng phenolic tổng của Spirulina sp. Nồng độ NaNO3 có ảnh hưởng đến khả năng tích lũy phenolic của cả 2 chủng Spirulina sp. Hình 3.14 cho thấy, khi nuôi cấy cả 2 chủng Spirulina ở môi trường Zarouk có nồng độ NaNO3 5,0 g/L thì lượng phenolic được tích lũy khá cao. Chủng 37 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và biện luận Spirulina sp. Mỹ hàm lượng phần trăm phenolic cao sau 3 ngày nuôi cấy (2,79%) và sau đó giảm dần, chủng Spirulina sp. Nhật cao sau 4 ngày nuôi cấy (2,68%) và cũng giảm dần (hình 3.14, bảng 3.9). Kết quả này cao hơn gần 4 lần so với thí nghiệm của Abd El-Baky và cộng sự (2009) khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ NaNO3 và phenylalanine lên hàm lượng phenolic và flavonoid của Spirulina maxima. Trong thí nghiệm này, Spirulina được nuôi cấy trong môi trường Zarrouk với lượng NaNO3 lầm lượt 2,5 g/L; 3,125 g/L; 3,777 g/L cho kết quả phenolic tương ứng 0,45%; 0,52%; 0,65% [11], thấp hơn rất nhiều so với khi nuôi ở nồng độ NaNO3 5,0 g/L. 0,005 a Spirulina sp. Nhật Spirulina sp. Mỹ 0,004 0,003 (g/L) 0,002 0,001 Hàm lượng lượng phenolic tổng Hàm 0,000 3 4 5 Ngày 4,0 b Spirulina sp. Nhật 3,5 2,68 Spirulina sp. Mỹ 3,0 2,79 2,5 2,0 1,5 1,0 (%/ sinh khô) khối (%/ Hàm lượng lượng phenolic tổng Hàm 0,5 0,0 3 4 5 Ngày Hình 3.14 Hàm lượng phenolic tổng (g/L) (a) và phần trăm phenolic (%) (b) của 2 chủng Spirulina sp. ở nồng độ NaNO3 5,0 g/L 38 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và biện luận Bảng 3.9 Hàm lượng phenolic tổng của 2 chủng Hàm lượng Spirulina sp. Nhật Spirulina sp. Mỹ phenolic tổng g/L %/sinh khối g/L %/ sinh khối 0,00262 ± 2,50242 ± 0,00257 ± 2,78729 ± Ngày 3 0,00005a 0,22172b 0,00009a 0,55206 a 0,00313 ± 2,68327 ± 0,00303 ± 2,42637 ± Ngày 4 0,00008b 0,06583b 0,00020a 0,25404a 0,00286 ± 1,41569 ± 0,00317 ± 1,74324 ± Ngày 5 0,00020ab 0,11495a 0,00013a 0,17169a Các số trung bình trong cột với các mẫu tự chữ khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05.  Hàm lượng chất chống oxy hóa tổng Qua kết quả ở hình 3.15, cho thấy Spirulina sp. có khả năng chống oxy hóa. Cụ thể, đối với Spirulina sp. Nhật có hàm lượng chất chống oxy hóa tổng cao sau 4 ngày nuôi cấy (11,04 %), Spirulina sp. Mỹ sau 3 ngày nuôi cấy (11,13 %). Hàm lượng phenolic và hoạt tính chống oxy hóa (ức chế triệt tiêu gốc tự do của DPPH) của Spirulina sp. có mối tương quan với nhau (hình 3.14 và hình 3.15). 14,0 Spirulina sp. Nhật Spirulina sp. Mỹ 12,0 11,04 10,0 7,39 8,0 6,0 4,0 oxy tổng (I%/mL) hóa oxy Hàm lượng chất chống lượng chất chống Hàm 2,0 0,0 3 4 5 Ngày Hình 3.15 Hàm lượng chất chống oxy hóa tổng của 2 chủng Spirulina sp. ở nồng độ NaNO3 5,0 g/L 39 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và biện luận Bảng 3.10. Hàm lượng chất chống oxy hóa tổng của 2 chủng Spirulina sp. Khả năng chống oxy hóa Spirulina sp. Nhật Spirulina sp. Mỹ (%I/mL) a a Ngày 3 1,62539 ± 0,27907 7,39099 ± 0,85480 b a Ngày 4 11,03690 ± 0,65725 5,69338 ± 0,93708 b a Ngày 5 10,18258 ± 1,73549 5,44062 ± 0,91922 Các số trung bình trong cột với các mẫu tự chữ khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05. 40 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và biện luận 3.2. Biện luận 3.2.1. Lựa chọn điều kiện ánh sáng nuôi cấy thích hợp Tế bào và dịch nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng đỏ và ánh sáng trắng có màu vàng điều này chứng tỏ ở điều kiện ánh sáng đỏ và trắng kích thích tế bào Spirulina sp. tạo carotenoid cao sau 5 ngày nuôi cấy nhiều hơn so với ánh sáng xanh dương. Theo Olaizola và Duerr (1990), Spirulina platensis (UTEX 1928) có sự thay đổi hàm lượng carotenoid trong điều kiện ánh sáng khác nhau. Riêng carotenoid, đặc biệt β- carotene và myxoxanthophyll thể hiện rõ những thay đổi với phổ ánh sáng khác nhau. Hàm lượng β-carotene và echinenone cao ở cả trong điều kiện cường độ ánh sáng cao và thấp. Hàm lượng myxoxanthophyll và lutein/zeaxanthin không thay đổi ở trong các phổ ánh sáng giống nhau. Ở điều kiện ánh sáng đỏ và xanh dương hàm lượng myxoxanthophyll giảm, trong khi β-carotene tăng, lutein/zeaxanthin và echinenone thay đổi ít. Hàm lượng diệp lục tố a ở điều kiện ánh sáng đỏ chỉ khoảng 2/3 so với điều kiện ánh sáng trắng. Kết quả này có thể là do tăng hiệu quả hấp thụ ánh sáng của phycobiliprotein trong điều kiện ánh sáng đỏ. Ở điều kiện ánh sáng xanh dương, chỉ có một sự thay đổi trong thời gian ngắn của hàm lượng diệp lục tố a [58]. Ở vi tảo Ulva pertusa sự phát triển cấu trúc màng thylakoid của tế bào thì ánh sáng xanh dương có hiệu quả cao hơn so với ánh sáng đỏ. Quá trình duy trì cấu trúc tế bào là cần thiết nhất cho quá trình tăng trưởng và phân chia tế bào, cho thấy ánh sáng xanh dương là hiệu quả hơn. Hơn nữa, cấu trúc tế bào Ulva phát triển tương đối tốt trong điều kiện nuôi cấy ánh sáng xanh dương so với ánh sáng đỏ và ánh sáng trắng. Toàn bộ phần ánh sáng trắng cung cấp năng lượng cho hoạt động của phytochrome và thụ thể ánh sáng (photoreceptor) tạo ra nguồn năng lượng cao cho sự duy trì và tăng trưởng tối ưu của tế bào. Điều này cho thấy phần phổ ánh sáng đỏ không đủ để kích thích tăng trưởng, nhưng không ức chế tăng trưởng hoặc duy trì cấu trúc tế bào. Tuy nhiên năng lượng này là không đủ cho các quá trình chuyển hóa khác [55]. Chất lượng ánh sáng có ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của tảo lam. Theo Hultberg và các cộng sự (2014) đã chỉ ra rằng ở vi tảo Chlorella vulgaris chất lượng 41 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và biện luận ánh sáng ảnh hưởng tương đối lên khả năng sản xuất sinh khối, hàm lượng lipid tổng và các loại acid béo [40]. Cả cường độ và chất lượng ánh sáng đều ảnh hưởng đến thành phần và cấu trúc hóa học, tốc độ hấp thu carbon và tổng hợp polymer. Ở tất cả cường độ ánh sáng hàm lượng diệp lục tố a ở điều kiện ánh sáng xanh dương và trắng cao hơn ánh sáng đỏ. Tốc độ tổng hợp protein, hấp thu carbon và hô hấp ở điều kiện ánh sáng xanh dương và đỏ cao hơn ánh sáng trắng trong điều kiện bằng mức năng lượng [68]. Trong điều kiện nuôi cấy ánh sáng xanh dương tảo tăng trưởng gấp đôi so với rong điều kiện ánh sáng trắng. Mặt khác, một số loài tảo cũng đáp ứng với phổ ánh sáng khi được nuôi dưới điều kiện ánh sáng trắng bằng cách tăng sản xuất lượng diệp lục tố [12]. Theo Niizawa và cs. (2014), ở vi tảo tốc độ hấp thu bức xạ ánh sáng xanh dương cao hơn ánh sáng đỏ. Tuy nhiên bức xạ ánh sáng đỏ tạo ra hiệu quả năng lượng cho sản xuất sinh khối cao hơn so với ánh sáng xanh dương [56]. Hàm lượng protein được tích lũy ở điều kiện ánh sáng xanh dương cao gần gấp 2 lần so với ánh sáng đỏ và trắng. Điều này có thể giải thích do hàm lượng protein có mối quan hệ âm tính với hàm lượng diệp lục tố. Phycobiliprotein được tổng hợp nhiều hơn so với diệp lục tố ở các bước sóng đặc hiệu. Vì thế hàm lượng protein trong điều kiện ánh sáng xanh lục cao hơn ở điều kiện ánh sáng xanh dương và ánh sáng đỏ. Điều kiện tăng trưởng tối ưu được thể hiện chặt chẽ với hàm lượng protein cao. Phycobiliprotein ở tảo lam có vai trò như các chất thu nhận ánh sáng trong quang hợp cũng như chất dự trữ nitơ nội bào [36]. Các loài thực vật tăng trưởng ở điều kiện ánh sáng xanh dương tổng hợp nhiều acid amin và protein hơn ở điều kiện ánh sáng trắng hoặc ánh sáng đỏ [82]. 3.2.2. Ảnh hưởng của yếu tố nitơ lên sự tăng trưởng và hàm lượng protein ở Spirulina sp. Tảo biển là nguồn thực phẩm tiềm năng mang lại giá trị dinh dưỡng và sinh học cao chẳng hạn như protein, lipid, carbohydrat và carotenoid. Sinh khối và quá trình tăng trưởng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố hóa lý như chất dinh dưỡng, chất lượng và cường độ ánh sáng, nhiệt độ, độ pH và độ mặn [14], [47], [88]. Trong số các yếu tố dinh dưỡng, nitơ được coi là một trong những chất dinh dưỡng quan trọng cho sự 42 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và biện luận tăng trưởng, vì nó là một thành phần trong tất cả các protein cấu trúc và chức năng như peptide, enzyme, diệp lục tố, phân tử truyền năng lượng và vật chất di truyền trong tế bào tảo [19]. Đặc biệt nguồn nitơ ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tăng trưởng, tích lũy protein và lipid của tảo [57], [83]. Tảo Tetraselmis sp. được nghiên cứu sử dụng các nguồn nitơ hữu cơ như dịch chiết nấm men (yeast extract – YE), glycine và urê cho hiệu suất cao về tăng trưởng tế bào. Tảo được nuôi cấy trong môi trường chứa nguồn nitơ là nitrat tăng trưởng tốt hơn là amoni. Trong số 9 nguồn nitơ khác nhau (NaNO3, KNO3, NH4NO3, NH4HCO3, NH4Cl, CH3COONH4, urê, glycine và YE), YE cho năng suất lipid cao nhất, theo sau là urê và nitrat [48]. Tuy nhiên, khi áp dụng canh tác đại trà cho sản xuất công nghiệp thì urê và nitrat sẽ phù hợp hơn so với YE về khả năng kinh tế. Đặc biệt, nguồn nitơ nitrat ít gây độc và bền vững hơn so với urê và amoni [28]. Các nồng độ nitơ khác nhau trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng lớn đến sự tăng trưởng của tảo nói chung và tảo Spirulina sp. nói riêng đã được đề cập trong nhiều nghiên cứu. Dư thừa hay thiếu hụt nitơ đều làm giảm sự tăng trưởng, khả năng trao đổi chất, chất lượng dinh dưỡng của nhiều loài tảo trong đó có tảo Spirulina sp. [9],[18],[62]. Trong thí nghiệm này, môi trường nuôi cấy có nồng độ NaNO3 5 g/L cho sinh khối và tốc độ tăng trưởng cao hơn so với các nồng độ NaNO3 còn lại. Điều này chứng tỏ, nitơ là một yếu tố thiết yếu cho sự tăng trưởng và năng suất sinh khối cao. Ngoài ra, tất cả các quá trình sinh tổng hợp hình thành sản phẩm, tái tạo và duy trì tế bào rất cần yếu tố nitơ. Đặc biệt, quá trình sản xuất các sản phẩm chính như protein, carbohydrate và các chất chuyển hóa của vi sinh vật bị ảnh hưởng rất lớn bởi điều kiện tăng trưởng [10]. Nitơ là thành phần cơ bản cấu tạo các acid amin và các phân tử protein trong tế bào nên khi cung cấp đầy đủ nitơ, quá trình sinh tổng hợp protein được tăng cường và tảo tăng trưởng nhanh [76]. Ngược lại, thiếu hụt nitơ trong môi trường nuôi là nguyên nhân làm giảm sinh khối, chậm tốc độ tăng trưởng tế bào, tăng hàm lượng lipid hoặc carbohydrate và giảm tổng hợp protein trong tế bào tảo [62]. Sự gia tăng hàm lượng protein (30,02 - 34,41%) tương ứng với sự gia tăng 43 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và biện luận các mức nitơ (1,25 – 5,0 g/L) trong nghiên cứu này là phù hợp với xu hướng chung của các kết quả nghiên cứu trước đó [35], [39]. 3.2.3. Nuôi cấy, thu sinh khối và phân tích thành phần acid amin Đối với tảo lam khi được nuôi cấy trong điều kiện thiếu nitơ, số lượng và kích thước các lục lạp nhỏ hơn so với điều kiện có đủ lượng nitơ. Bởi vì lục lạp thường chứa một lượng lớn các sắc tố (diệp lục tố a và b, và  - carotene) và các glycolipid (MGDGs – Monogalactosyldiacylglycerol, DGDGs – Digalactosyldiacylglyerols, SQDGs – Sulfoquinovosyldiacylglycerols) giống như màng thylakoid [78], lượng chất béo và lipid giảm tương ứng với giảm kích thước lục lạp [41] . Thiếu hụt nitơ là nguyên nhân làm giảm tốc độ sinh trưởng, sinh khối, thời gian duy trì mật độ cực đại, hàm lượng sắc tố, protein, lipid, axít béo không no, vitamin, carotenoids, phycocianin, enzyme, ở nhiều loài tảo trong đó có tảo Spirulina sp. [59] [80]. Ngoài ra, trong điều kiện thiếu hụt lượng nitơ, số lượng các chất chuyển hóa giảm đáng kể xuống còn 1/20 hoặc ít hơn so với điều kiện đủ lượng nitơ [41]. Cũng chính vì thế, khi nuôi cấy Spirulina sp. trong môi trường có nồng độ NaNO3 5,0 g/L sau 5 ngày nuôi cấy, cả 2 chủng duy trì ở pha tăng trưởng và dịch tảo vẫn có màu xanh. Ở tảo, một số các chất chuyển hóa (Arg, Gln, Asn, Citrulline, Pro, Ornithine và Asp) đã tham gia vào quá trình đồng hóa nitơ và chuyển hóa N- vận chuyển. Khi môi trường nuôi cấy bị thiếu hụt dinh dưỡng về nguồn nitơ thì các amin tham gia vào quá trình tổng hợp de novo acid amin tự do bị giảm mạnh dẫn làm giảm hàm lượng protein và các acid amin [41]. Vì thế, hàm lượng một số các acid amin thiết yếu có trong protein của 2 chủng Spirulina được nuôi cấy trong môi trường nồng độ NaNO3 5,0 g/L cao hơn rất nhiều so với môi trường có nồng độ NaNO3 2,5 g/L tương tự như thí nghiệm thực hiện bởi Choi và cộng sự (2003) [21]. Hàm lượng amino acid thiết yếu của 2 chủng Spirulina sp. được nghiên cứu trong thí nghiệm cao hơn rất nhiều so với giá trị tối thiểu theo yêu cầu của FAO với Isoleucine, Leucine, Lysine và Phenylalanine vượt qua gấp 1,5 lần (Spirulina sp. Mỹ) và 2,4 lần (Spirulina sp. Nhật). Tuy nhiên, hàm lượng Valine khá thấp đạt 2,11% (Spirulina sp. Mỹ) và 3,31% 44 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và biện luận (Spirulina sp. Nhật), trong khi yêu cầu của FAO hàm lượng Valine cung cấp tối thiểu là 4,2% [74]. Hệ thống chống oxy hóa của thực vật và tảo lam có hai loại: hệ thống chống oxy hóa bằng enzyme và không enzyme [77], [85]. Các hệ thống chống oxy hóa bằng enzyme bao gồm: superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) và glutathione reductase (GR); hệ thống chống oxy hóa không enzyme là các chất chống oxy hóa có trọng lượng phân tử thấp như: acid ascorbic, glutathione, proline, carotenoid, acid phenolic, flavonoid, và chất chuyển hóa thứ cấp có trọng lượng phân tử cao như tannin [44]. Ở tảo Spirulina sp. có chứa các chất chống oxy hóa như carotenoid và phycobiliprotein [49], [72]. Khả năng chống oxy hóa của tảo cũng bị ảnh hưởng rất nhiều bởi yếu tố nitơ được cung cấp trong môi trường nuôi cấy. Theo Miranda và cộng sự (1998), các hợp chất phenolic chính được tìm thấy trong Spirulina là: salicylic, trans-cinnamic, synaptic, chlorogenic, acid quimic và caffeic. Tuy nhiên, sự trao đổi chất và con đường cho sự hình thành của các hợp chất trong tảo lam và tầm quan trọng của chúng vẫn chưa được xác định [54]. Ngoài ra, Spirulina còn chứa 1 số hoạt chất chống oxi hóa khác như: -carotene, α – ocopherol và các phycobiliprotein. Đối với thực vật, phenylalanine có thể được chuyển hóa bởi amoniac lyase và acid trans-cinnamic lần lượt thành acid cumaric, acid caffeic [65]. Những hợp chất này là được sử dụng để sản xuất flavonoid và các chất chống oxy hóa khác. Các con đường sinh tổng hợp dẫn đến sự hình thành flavonol và phenylpropanols trong thực vật có liên quan đến chu trình pentose- phosphate (Calvin) và lượng tổng hợp là đặc tính của mỗi sinh vật [29]. Ở điều kiện đủ nitơ, các chất chống oxi hóa tăng do Ribose 1,5-bisphosphate và fructose 1,6- diphosphate trong chu trình cố định carbon (Calvin) hoặc đường pentose phosphate tăng tương ứng 15 và 11 lần [41]. Hàm lượng phenolic và hoạt tính chống oxy hóa của Spirulina sp. có mối tương quan với nhau. Theo Sahu và cộng sự (2013) chỉ ra rằng có sự tương quan đáng kể giữa hàm lượng phenolic và khả năng khử các gốc tự do ở các loài thực vật qua đó 45 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và biện luận cho thấy khả năng khử các gốc tự do có thể liên quan đến nồng độ của nhóm hydroxyl phenolic. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các polyphenol góp phần đáng kể vào hoạt động chống oxy hóa và khử gốc tự do, chủ yếu là do đặc tính chống oxy hóa của chúng, đóng một vai trò quan trọng trong việc hấp phụ và trung hòa các gốc tự do, dập tắt các oxy hóa trị 1 và hóa trị 3 hoặc phân hủy peroxit [70]. Các hợp chất phenolic không chỉ làm tăng thời hạn sử dụng của thực phẩm mà còn hoạt động như chất chống oxy hóa trong nhiều hệ thống sinh học. Phenolic có khả năng chống oxy hóa và tương tác với các gốc tự do; hợp chất này có thể ức chế sự oxy hóa lipid trong in vitro bằng cách loại bỏ gốc tự do và hoạt động như chelat kim loại [25]. Estrada (2001) đã chứng minh phycobiliprotein; phycocyanin và allophycocyanin từ dịch chiết của Spirulina có hoạt tính chống oxy hóa mạnh và ức chế quá trình oxy hóa lipid tế bào [61]. Dịch chiết methanol chứa phenol của S. platensis đông khô làm giảm lượng màu nâu của guayacol gây ra peroxidase . Ngoài ra, số lượng hợp chất phenolic được sản xuất bởi S. platensis có liên quan đến tiềm năng chống oxy hóa, họ kết luận rằng nồng độ phenol càng cao thì càng ít có màu nâu và tiềm năng chống oxy hóa cao hơn [25]. 46 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
Khóa luận tốt nghiệp Kết luận và kiến nghị CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Chất lượng ánh sáng có tác động mạnh mẽ lên hình thái, sự tăng trưởng và tích lũy protein ở Spirulina sp. Ở điều kiện ánh sáng xanh dương, màu sắc và dịch nuôi cấy tế bào có màu xanh và hàm lượng protein tổng được tích lũy cao hơn so với điều kiện ánh sáng đỏ và ánh sáng trắng. Tuy nhiên ở hai điều kiện ánh sáng này lại kích thích tổng hợp carotenoid dẫn đến màu sắc tế bào và dịch nuôi cấy có màu vàng cam, sinh khối và tốc độ tăng trưởng cao hơn so với ánh sáng xanh dương. Nồng độ NaNO3 trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng khá rõ lên sự tăng trưởng và tích lũy protein của Spirulina. Khi tăng nồng độ NaNO3 trong môi trường Zarrouk từ 1,25 g/L đến 5 g/L thì sinh khối, tốc độ tăng trưởng đặc hiệu và hàm lượng protein tổng của Spirulina tăng. Ở môi trường nuôi cấy có nồng độ NaNO3 5,0 g/L Spirulina cho sinh khối và hàm lượng protein tổng nhiều hơn so với 2 nồng độ NaNO3 1,25 g/L và 2,5 g/L. Cả hai chủng Spirulina sp. Mỹ và Nhật đều tăng trưởng tốt, tích lũy hàm lượng protein và thành phần acid amin cao trong môi trường nuôi cấy Zarrouk bổ sung NaNO3 5 g/L. Ngoài ra, hàm lượng phenolic tổng và khả năng chống oxy của hai chủng Spirulina sp. này đạt giá trị cao và có mối tương quan dương với nhau. 4.2. Kiến nghị Nghiên cứu ảnh hưởng của nitơ và photpho khi sử dụng phân bón NPK trong môi trường nuôi cấy Zarrouk để tăng năng suất và giảm giá thành. Sử dụng ánh sáng xanh dương trong nuôi cấy để tăng tốc độ tăng trưởng, khả năng tích lũy protein và các hợp chất chống oxy hóa ở Spirulina sp. 47 SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Đặng Đình Kim, Đặng Hoàng Phước Hiền (1999), Công nghệ sinh học vi tảo, NXB Nông nghiệp, tr. 18-20. 2. PGS.TS Dương Thanh Liêm, ThS Lê Thanh Hải, ThS Vũ Thủy Tiên (2010), Thực phẩm chức năng và sức khỏe bền vững, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 409-410. 3. Trương Văn Lung (2004), Công nghệ sinh học một số loại tảo kinh tế, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 15-18. 4. Nguyễn Đức Lượng (2002), Công nghệ vi sinh, tập 2 - Vi sinh vật học công nghiệp, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia, Tp. Hồ Chí Minh, pp. 124-125. 5. Hoàng Nghĩa Sơn (2001), Nghiên Cứu Quy Trình Nuôi Trồng Và Sản Xuất tảo Spirulina Platensis Ở Quy Mô Gia Đình Sử Dụng Trong Chăn Nuôi, Gia Súc, Gia Cầm, NXB Khoa học Và Kỹ Thuật, Hà Nội, tr. 70-75. 6. Đặng Thỵ Sy (2005), Tảo học, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội, tr. 25-29. 7. Mai Ngọc Thảo (2008), Ứng Dụng Spirulina Vào Sản Xuất Bánh Mì Ngọt và Nhạt, Luận văn Thạc sĩ, Đại học Bách Khoa, tr. 10-12. 8. Nguyễn Hữu Thước (2004), Tảo Spirulia Nguồn Dinh Dưỡng Và Dược Liệu Quý, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội, tr. 13-15. 9. Abd El-Baky H H, El-Baz F K, El Baroty G S (2010), "Enhancing antioxidant availability in wheat grains from plants grown under seawater stress in response to microalgae extract treatments", Journal of the Science of Food and Agriculture, 90 (2), pp. 299-303. 10. Abd El Baky H, El baroty G (2016), Optimization of Growth Conditions for Purification and Production of L-Asparaginase by Spirulina maxima, Hindawi Publishing Corporation, Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, pp. 3-4.
11. Adb El Baky H, K. El Baz F, El baroty G (2009), "Production of phenolic compounds from Spirulina maxima microalgae and its protective effects in vitro toward hepatotoxicity model", African journal of pharmacy and pharmacology, 3 (4), pp. 133-139. 12. Al-Qasmi M., Talebi S., Al-Rajhi S., Al-Barwani T. (2012), "A Review of Effect of Light on Microalgae Growth", Proceedings of the World Congress on Engineering, 1, pp. 608-610. 13. Albayrak S, Aksoy A, Sagdic O, Hamzaoglu E (2010), "Compositions, antioxidant and antimicrobial activities of Helichrysum (Asteraceae) species collected from Turkey", Food Chemistry, 119 (1), pp. 114-122. 14. Bartley M L, Boeing W J, Daniel D, Dungan B N, et al (2016), "Optimization of environmental parameters for Nannochloropsis salina growth and lipid content using the response surface method and invading organisms", Journal of Applied Phycology, 28 (1), pp. 15-24. 15. Bashandy S A E, El Awdan S A, Ebaid H, Alhazza I M (2016), "Antioxidant Potential of Spirulina platensis Mitigates Oxidative Stress and Reprotoxicity Induced by Sodium Arsenite in Male Rats", Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2016, pp. 7174351. 16. Bermejo R., Talavera E.M., Alvarez-pez J.M., Orte J.C. ( 1997), "Chromatographic purification of biliproteins from Spirulina Platensis: High performance liquid chromatographic separation of their a and b sub units", Journal of Chromatography A, 778 (1), pp. 441–450. 17. Bradford M M (1976), "A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding", Anal Biochem, 72, pp. 248-254. 18. Bulut Y. ( 2009), "The investigations on the possibility of increase lipid content of Chlorella (Master Thesis)", Institute of Science and Technology, pp. 62.
19. Cai T, Park S Y, Li Y (2013), "Nutrient recovery from wastewater streams by microalgae: Status and prospects", Renewable and Sustainable Energy Reviews, 19 pp. 360-369. 20. Capelli B, Cysewski G R (2010), "Potential health benefits of Spirulina microalgae", Nutrafoods, 9 (2), pp. 19-26. 21. Choi A, Kim S-G, Yoon B-D, Oh H-M (2003), "Growth and amino acid contents ofSpirulina platensis with different nitrogen sources", Biotechnology and Bioprocess Engineering, 8 (6), pp. 368-372. 22. Ciferri O, Tiboni O (1985), "The biochemistry and industrial potential of Spirulina", Annu Rev Microbiol, 39, pp. 503-526. 23. Ciferri O. (1983), "Spirulina the edible microorganism", Microbiol Rev, 47 (4), pp. 551 - 578. 24. Clair R W, Toma J J, Jr., Lofland H B (1975), "Proline hydroxylase activity and collagen content of pigeon aortas with naturally-occurring and cholesterol- aggravated atherosclerosis", Atherosclerosis, 21 (2), pp. 155-165. 25. Colla L, Badiale-Furlong E, Costa J A (2007), "Antioxidant properties of Spirulina (Arthospira) platensis cultivated under different temperatures and nitrogen regimes", Brazilian Archives Of Biology And Technology, 50 (1), pp. 26. Costa J A, Colla L M, Duarte Filho P (2003), "Spirulina platensis growth in open raceway ponds using fresh water supplemented with carbon, nitrogen and metal ions", Z Naturforsch C, 58 (1-2), pp. 76-80. 27. D. G. Wallen, G. H. Geen (1971), "Light quality in relation to growth, photosynthetic rates and carbon metabolism in two species of marine plankton algae", Marine Biology, 10, pp. 33-34. 28. Donald D B, Bogard M J, Finlay K, Leavitt P R (2011), "Comparative effects of urea, ammonium, and nitrate on phytoplankton abundance, community composition, and toxicity in hypereutrophic freshwaters", Limnology and Oceanography, 56 (6), pp. 2161-2175.
29. Duval B, Shetty K (2001), "The stimulation of phenolics and antioxidant activity in pea (pisum sativum) elicited by genetically transformed anise root extract", Journal of Food Biochemistry, 25 (5), pp. 361-377. 30. Eykelenburg, C.V (1979), " The ultrastructure of Spirulina platensis in relation to temperature and light intensity", Antonie van Leeuwenhoek, 45, pp. 369-390. 31. Felig P, Pozefsky T, Marliss E, Cahill G F, Jr. (1970), "Alanine: key role in gluconeogenesis", Science, 167 (3920), pp. 1003-1004. 32. Gershwin M. E., Amha Belay (2007), Spirulina in Human Nutrition and Health, CRC Press, Boca Raton, pp. 20 -25. 33. Glazer A N (1994), "Phycobiliproteins — a family of valuable, widely used fluorophores", Journal of Applied Phycology, 6 (2), pp. 105-112. 34. Goiris K, Muylaert K, Fraeye I, Foubert I, et al (2012), "Antioxidant potential of microalgae in relation to their phenolic and carotenoid content", Journal of Applied Phycology, 24 (6), pp. 1477-1486. 35. Guillard RRL. (1973), Culture Methods and Growth Measurements, Chambridge University Pres, Chambridge, pp. 289-311. 36. H R P, H R D, Claire J-C, Arsène I, et al (2008), "Influence of light quality and intensity in the cultivation of Spirulina platensis from Toliara (Madagascar) in a closed system", Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 83 (6), pp. 842-848. 37. Hajimahmoodi M, Faramarzi M A, Mohammadi N, Soltani N, et al (2010), "Evaluation of antioxidant properties and total phenolic contents of some strains of microalgae", Journal of Applied Phycology, 22 (1), pp. 43-50. 38. Hanaa H.abd El-Baky, Faouk K. El Baz, Gamal S. El-Baroty (2003), "Spirulina Species as a Source of Carotenoids and a-Tocopherol and its Anticarcinoma Factors", Biotechnology,Asian Network for Scientific Information, pp. 222-240. 39. Ho S H, Ye X, Hasunuma T, Chang J S, et al (2014), "Perspectives on engineering strategies for improving biofuel production from microalgae a critical review", Biotechnol Adv, 32 (8), pp. 1448-1459.
40. Hultberg M, Jönsson H L, Bergstrand K-J, Carlsson A S (2014), "Impact of light quality on biomass production and fatty acid content in the microalga Chlorella vulgaris", Bioresource Technology, 159, pp. 465-467. 41. Ito T, Tanaka M, Shinkawa H, Nakada T, et al (2013), "Metabolic and morphological changes of an oil accumulating trebouxiophycean alga in nitrogen-deficient conditions", Metabolomics, 9 (1), pp. 178-187. 42. Jonker R, Engelen M P, Deutz N E (2012), "Role of specific dietary amino acids in clinical conditions", Br J Nutr, 108 Suppl 2 pp. S139-148. 43. Kamata K, Piao Z, Suzuki S, Fujimori T, et al (2014), "Spirulina-templated metal microcoils with controlled helical structures for THz electromagnetic responses", Sci Rep, 4 (1), pp. 4919. 44. Kasote D M, Katyare S S, Hegde M V, Bae H (2015), "Significance of Antioxidant Potential of Plants and its Relevance to Therapeutic Applications", Int J Biol Sci, 11 (8), pp. 982-991. 45. Kawata Y. (2006), "Studies on recombinant DNA techniques for cyanobacterium Spirulina platensis", Doctoral Thesis Kyoto University, pp. 46. 46. Khan Z, Bhadouria P, Bisen P S (2005), "Nutritional and therapeutic potential of Spirulina", Curr Pharm Biotechnol, 6 (5), pp. 373-379. 47. Kim D G, Bum Hur S (2013), "Growth and fatty acid composition of three heterotrophic Chlorella species", Algae, 28 (1), pp. 101-109. 48. Kim G, Mujtaba G, Lee K (2016), "Effects of nitrogen sources on cell growth and biochemical composition of marine chlorophyte Tetraselmis sp. for lipid production", ALGAE, 31 (3), pp. 257-266. 49. Konickova R, Vankova K, Vanikova J, Vanova K, et al (2014), "Anti-cancer effects of blue-green alga Spirulina platensis, a natural source of bilirubin-like tetrapyrrolic compounds", Ann Hepatol, 13 (2), pp. 273-283. 50. Kulshreshtha A, Zacharia A J, Jarouliya U, Bhadauriya P, et al (2008), "Spirulina in health care management", Curr Pharm Biotechnol, 9 (5), pp. 400- 405.
51. Lim S N, Cheung P C, Ooi V E, Ang P O (2002), "Evaluation of antioxidative activity of extracts from a brown seaweed, Sargassum siliquastrum", J Agric Food Chem, 50 (13), pp. 3862-3866. 52. M. Levasseur M., Thompson P. A., Harrison P. J. (1993), "Physiological acclimation of marine phytoplankton to different nitrogen sources", J Phycol, 29 (5), pp. 587-595. 53. Madkour F F, Kamil A E-W, Nasr H S (2012), "Production and nutritive value of Spirulina platensis in reduced cost media", The Egyptian Journal of Aquatic Research, 38 (1), pp. 51-57. 54. Miranda M S, Cintra R G, Barros S B, Mancini Filho J (1998), "Antioxidant activity of the microalga Spirulina maxima", Braz J Med Biol Res, 31 (8), pp. 1075-1079. 55. Muthuvelan B., Noro T., K. N (2002), "Effect of light quality on the cell integrity in marine alga Ulva pertusa (Chlorophyceae)", Indian Journal of Geo-Marine Sciences, 31 (1), pp. 21-25. 56. Niizawa I, Heinrich J M, Irazoqui H A (2014), "Modeling of the influence of light quality on the growth of microalgae in a laboratory scale photo-bio-reactor irradiated by arrangements of blue and red LEDs", Biochemical Engineering Journal, 90 (15), pp. 214-223. 57. Norici A, Dalsass A, Giordano M (2002), "Role of phosphoenolpyruvate carboxylase in anaplerosis in the green microalga Dunaliella salina cultured under different nitrogen regimes", Physiol Plant, 116 (2), pp. 186-191. 58. Olaizola M., Duerr E.O. (1990), "Effects of light intensity and quality on the growth rate and photosynthetic pigment content of Spirulina platensis", Journal of Applied Phycology, 2, pp. 97-104. 59. Olguin E J, Galicia S, Angulo-Guerrero O, Hernandez E (2001), "The effect of low light flux and nitrogen deficiency on the chemical composition of Spirulina sp. (Arthrospira) grown on digested pig waste", Bioresour Technol, 77 (1), pp. 19-24.
60. Pandey J.P., Tiwari A., R.M. M (2010), "Evaluation of Biomass Production of Spirulina maxima on Different Reported Media", J Algal Biomass Utln, 1 (3), pp. 70-81. 61. Pinero Estrada J E, Bermejo Bescos P, Villar del Fresno A M (2001), "Antioxidant activity of different fractions of Spirulina platensis protean extract", Farmaco, 56 (5-7), pp. 497-500. 62. Pruvost J, Van Vooren G, Cogne G, Legrand J (2009), "Investigation of biomass and lipids production with Neochloris oleoabundans in photobioreactor", Bioresource Technology, 100 (23), pp. 5988-5995. 63. R. H (1994), "Earth Food Spirulina", Ronore Enterprise USA, pp. 25-43. 64. R. Todd Lorenz, D. P (1998), "A Review of Spirulina as a Carotenoid and Vitamin Source for Cultured Shrimp", Spirulina Pacifica Technical Bulletin, pp. 3. 65. Rechner A R, Spencer J P, Kuhnle G, Hahn U, et al (2001), "Novel biomarkers of the metabolism of caffeic acid derivatives in vivo", Free Radic Biol Med, 30 (11), pp. 1213-1222. 66. Richmond A (1986), Outdoor Mass Cultures of Microalgae, CRC Press, INC. Boca Raton, pp. 285-329. 67. Richmond A, J.U. Grobbelaar (1986), "Factors affecting the output rate of Spirulina platensis with reference to mass cultivation", Biomass, 10 (4), pp. 253-264. 68. Rivkin R. B. (1989), "Influence of irradiance and spectral quality on the carbon metabolism of phytoplankton", Marine ecology progress series, 55, pp. 291- 304. 69. Rosa G M d, Moraes L, de Souza M d R A Z, Costa J A V (2016), "Spirulina cultivation with a CO2 absorbent: Influence on growth parameters and macromolecule production", Bioresource Technology, 200, pp. 528-534.
70. Sahu R, Kar M, Routray R (2013), "DPPH Free radical scavenging activity of some leafy vegetables used by tribals of Odisha. India", Journal of Medicinal Plants Studies, 4 (1), pp. 21-27. 71. Sajilata M G, Singhal R S, Kamat M Y (2008), "Fractionation of lipids and purification of γ-linolenic acid (GLA) from Spirulinaplatensis", Food Chemistry, 109 (3), pp. 580-586. 72. Schwartz J., G. S, Suda D. Growth (1988), "Inhibition and destruction of oral cancer cells by extracts from Spirulina", Cancer & Nutrition, 11 (2), pp. 127- 134. 73. Singh S P, Singh P (2015), "Effect of temperature and light on the growth of algae species: A review", Renewable and Sustainable Energy Reviews, 50, pp. 431-444. 74. Spies J R (1967), "Determination of tryptophan in proteins", Anal Chem, 39 (12), pp. 1412-1416. 75. Spolaore P, Joannis-Cassan C, Duran E, Isambert A (2006), "Commercial applications of microalgae", J Biosci Bioeng, 101 (2), pp. 87-96. 76. Sukenik A, Zmora O, Carmeli Y (1993), "Biochemical quality of marine unicellular algae with special emphasis on lipid composition. II. Nannochloropsis sp", Aquaculture, 117 (3), pp. 313-326. 77. Sunda W, Kieber D J, Kiene R P, Huntsman S (2002), "An antioxidant function for DMSP and DMS in marine algae", Nature, 418 (6895), pp. 317-320. 78. Thompson G A (1996), "Lipids and membrane function in green algae", Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Lipids and Lipid Metabolism, 1302 (1), pp. 17-45. 79. Tran D, Doan N, Louime C, Giordano M, et al (2014), "Growth, antioxidant capacity and total carotene of Dunaliella salina DCCBC15 in a low cost enriched natural seawater medium", World J Microbiol Biotechnol, 30 (1), pp. 317-322.
80. Uslu L, Isik O, Koç K, Göksan T (2011), "The effects of nitrogen deficiencies on the lipid and protein contents of Spirulina platensis", African Journal of Biotechnology, 10 (3), pp. 386-389. 81. Vonshak A, Kancharaksa N, Bunnag B, Tanticharoen M (1996), "Role of light and photosynthesis on the acclimation process of the cyanobacteriumSpirulina platensis to salinity stress", Journal of Applied Phycology, 8 (2), pp. 119-124. 82. Wallen D G, Geen G H (1971), "Light quality in relation to growth, photosynthetic rates and carbon metabolism in two species of marine plankton algae", Marine Biology, 10 (1), pp. 34-43. 83. Wan M-X, Wang R-M, Xia J-L, Rosenberg J N, et al (2012), "Physiological evaluation of a new Chlorella sorokiniana isolate for its biomass production and lipid accumulation in photoautotrophic and heterotrophic cultures", Biotechnology and Bioengineering, 109 (8), pp. 1958-1964. 84. Williamson M P (1994), "The structure and function of proline-rich regions in proteins", Biochem J, 297 (Pt 2), pp. 249-260. 85. Yadav P, Kumar S, prathap reddy K, Yadav T, et al (2014). Oxidative Stress and Antioxidant Defense System in Plants, Biotechnology. Studium Press LLC, USA, pp. 262-281. 86. Yaltirak T, Aslim B, Ozturk S, Alli H (2009), "Antimicrobial and antioxidant activities of Russula delica Fr", Food Chem Toxicol, 47 (8), pp. 2052-2056. 87. Zhu C. J., K. L Y (1997), "Determination of biomass dry weight of marine microalgae", Journal of Applied Phycology, 9 (2), pp. 189-194. 88. Yen H-W, Hu I C, Chen C-Y, Chang J-S (2014). Chapter 2 - Design of Photobioreactors for Algal Cultivation In: Pandey A, Lee D-J, Chisti Y, et al., Biofuels from Algae. Elsevier, Amsterdam, pp. 23-45.