›

Đồ án Khảo sát quá trình trích ly thu nhận Flavonoid từ củ cải trắng

pdf 59 trang thiennha21 14/04/2022 5000
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát quá trình trích ly thu nhận Flavonoid từ củ cải trắng", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_khao_sat_qua_trinh_trich_ly_thu_nhan_flavonoid_tu_cu_c.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát quá trình trích ly thu nhận Flavonoid từ củ cải trắng

  1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA VŨNG TÀU VIỆN KỸ THUẬT - KINH TẾ BIỂN ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TRÍCH LY THU NHẬN FLAVONOID TỪ CỦ CẢI TRẮNG GVHD: ThS. Phạm Thị Kim Ngọc Sinh viên: Lê Thị Ánh Nguyệt Trình độ đào tạo: Đại học Hệ đào tạo: Chính quy Khóa: 2013 - 2017 Lớp: DH13TP MSSV: 13030202 Vũng Tàu, tháng 06 năm 2017
  2. TRƯỜNG ĐH BÀ RỊA VŨNGTÀU CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM VIỆN KỸ THUẬT – KINH TẾ BIỂN Độc lập - Tự do - Hạnh phúc Vũng Tàu, ngày 20 tháng 03 năm 2017 NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN Họ và tên sinh viên: Lê Thị Ánh Nguyệt Giới tính: Nữ Ngày, tháng, năm sinh: 10/02/1995 Nơi sinh: BR-VT Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm. Khoá: 2013 - 2017 1- Tên đề tài: Khảo sát quá trình trích ly thu nhận Flavonoid từ củ cải trắng 2- Nhiệm vụ đồ án: - Khảo sát các thông số của quá trình trích ly thu nhận flavonoid từ củ cải trắng gồm: loại dung môi, nồng độ dung môi, tỉ lệ dung môi và nguyên liệu, nhiệt độ trích ly, thời gian trích ly. - Tối ưu hóa quá trình trích ly nhằm xác định các điều kiện phù hợp nhất để thu nhận flavonoid từ củ cải trắng. 3- Ngày giao nhiệm vụ: 19/02/2017 4- Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 21/06/2017 5- Giáo viên hướng dẫn: ThS. Phạm Thị Kim Ngọc GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN (Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên) TRƯỞNG BỘ MÔN VIỆN TRƯỞNG (Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)
  3. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là quá trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của Th.S Phạm Thị Kim Ngọc. Các nội dung nghiên cứu, kết quả số liệu trong bài này là trung thực. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo. Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
  4. LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án này, tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trường Đại học Bà Rịa Vũng Tàu đã giảng dạy, truyền đạt cho chúng tôi những kiến thức, kinh nghiệm trong suốt thời gian qua và tạo mọi điều kiện để tôi có thể thực hiện tốt đồ án tốt nghiệp. Đặc biệt tôi xin gởi lời cám ơn đến Th.S Phạm Thị Kim Ngọc đã tận tình giúp đỡ, trực tiếp chỉ bảo, góp ý và hỗ trợ hướng dẫn tôi trong suốt quá trình làm đồ án. Trong thời gian làm việc với Cô, ngoài việc tiếp thu thêm nhiều kiến thức bổ ích, tôi còn học tập được tinh thần làm việc, thái độ nghiên cứu khoa học nghiêm túc, hiệu quả. Đây là những điều rất cần thiết cho tôi trong quá trình học tập và làm việc sau này. Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn đến Thầy phụ trách phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện thuận lợi nhất về phòng thí nghiệm cũng như các dụng cụ, và thiết bị để tôi có thể hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp. Xin ghi nhận sự giúp đỡ nhiệt tình của các bạn sinh viên khoá DH13TP dành cho tôi trong quá trình thực hiện đồ án . Do thời gian nghiên cứu hạn hẹp, kiến thức còn hạn chế nên vẫn còn nhiều thiếu sót trong quá trình thực hiện đồ án. Tôi kính mong nhận được ý kiến đóng góp quý báu của quý thầy cô để hoàn thiện hơn nữa đề tài đồ án tốt nghiệp này. Tôi xin chân thành cảm ơn Vũng Tàu, ngày 20 tháng 06 năm2017 Sinh viên Lê Thị Ánh Nguyệt
  5. MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH III DANH MỤC BẢNG IV DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT V LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1 Giới thiệu về củ cải trắng 2 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm sinh học 2 1.1.2 Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng 3 1.1.3 Các hợp chất thứ cấp trong củ cải trắng 4 1.1.4 Công dụng của củ cải 6 1.2 Hợp chất flavonoid 7 1.2.1 Khái niệm 7 1.2.2 Phân loại 7 1.2.3 Tính chất lý hóa 8 1.2.4 Giá trị sinh học của flavonoid 9 1.2.5 Phương pháp thu nhận flavonoid 12 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 15 2.2 Nguyên liệu, dụng cụ thiết bị và hóa chất 15 2.2.1 Nguyên liệu 15 2.2.2 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Nội dung nghiên cứu 16 2.3.2 Bố trí thí nghiệm 16 2.3.3 Phương pháp phân tích 18 I
  6. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 25 3.1 Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện trích ly. 25 3.1.1 Ảnh hưởng của loại dung môi 25 3.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi 26 3.1.3 Ảnh hưởng tỉ lệ dung môi và nguyên liệu 27 3.1.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ 29 3.1.5 Ảnh hưởng của thời gian 30 3.2 Tối ưu quá trình trích ly flavonoid từ củ cải trắng bằng phương pháp bề mặt đáp ứng SRM 31 CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 4.1 Kết luận 36 4.2 Kiến nghị 36 Tài liệu tham khảo 37 PHỤ LỤC 40 Kết quả xử lý ANOVA cho các thí nghiệm 40 1. Khảo sát dung môi trích ly 40 2. Khảo sát nồng độ trích ly 42 3. Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu và dung môi 44 4. Khảo sát nhiệt độ trích ly 46 5. Khảo sát thời gian trích ly 48 II
  7. DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Củ cải trắng 2 Hình 1.2 Khung sườn cơ bản của flavonoid 8 Hình 1.3 Các phân nhóm chính của flavonoid 8 Hình 1.4 Cơ chế ức chế của catechol với gốc tự do peroxy 11 Hình 1.5 Các vị trí của flavonoid có thể liên kết với các ion kim loại 11 Hình 2.1 Bột củ cải 17 Hình 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 Hình 2.3 Đường chuẩn queretin dùng xác định TFC 21 Hình 2.4 Phản ứng tạo màu khi xây dựng đường chuẩn quercein 21 Hình 2.5 Phản ứng tạo màu khi xây dựng đường chuẩn galic 23 Hình 2.6 Đường chuẩn galic dung để xác định TPC 24 Hình 2.7 Đường chuẩn trolox dùng xác định khả năng khử ABTS* 23 Hình 3.1 Ảnh hưởng của dung môi trích ly 28 Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ dung môi trích ly 29 Hình 3.3 Ảnh hưởng tỷ lệ : dung môi trích ly 30 Hình 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ trích ly 32 Hình 3.5 Ảnh hưởng của thời gian trích ly 33 Hình 3.6 Mô hình bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi và nhiệt độ đến TFC 37 Hình 3.7 Mô hình bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi, nhiệt độ và thời gian trích ly đến TFC 38 III
  8. DANH MỤC BẢNG Bảng 1. 1 Giá trị dinh dưỡng trong 100g của cải 3 Bảng 2.1 Các bước xây dựng đường chuẩn acid galic 22 Bảng 2.2 Kết quả đường chuẩn galic 24 Bảng 2.3 Quá trình xây dựng đường chuẩn với dung dịch trolox chuẩn 23 Bảng 3.1 Kết quả thí nghiệm khảo sát loại dung môi 27 Bảng 3.2 Kết quả thí nghiệm khảo sát nồng độ dung môi 29 Bảng 3.3 Kết quả thí nghiệm khảo sát tỷ lệ dung môi:nguyên liệu 31 Bảng 3.4 Kết quả thí nghiệm khảo sát nhiệt độ 32 Bảng 3.5 Kết quả thí nghiệm khảo sát thời gian 33 Bảng 3.6 Các yếu tố dung trong SRM 35 Bảng 3.7 Kế hoạch thực nghiệm và kết quả theo RSM để tối ưu TFC 35 Bảng 3.8 Phân tích phương sai của mô hình hồi quy 36 IV
  9. DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT ABTS: Khả năng khử gốc tự do ABTS (mmol TEAC/g chất khô) GAE (Galic Acid Equivalents): Tương đương acid galic QE (Quercetin Equivalents): Tương đương quercetin TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity): Khả năng chống oxi hóa tương đương trolox SRM: Reponse Surface Methods TFC (Total Flavonoid Content): Hàm lượng flavonoid tổng (mg QE/g chất khô) TPC (Total Phenolic Content): Hàm lượng phenolic tổng (mg GAE/g chất khô) V
  10. LỜI MỞ ĐẦU Cuộc sống ngày càng hiện đại, nhu cầu thực phẩm của con người ngày càng được nâng cao. Việc lựa chọn thực phẩm không đơn thuần là đáp ứng cho việc ăn no, ăn ngon mà còn cần phải tốt cho sức khỏe hay có tác dụng làm đẹp. Gần đây các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu các loại thực phẩm có chứa chất chống oxy hóa, một hợp chất tốt cho sức khỏe, có thể ngăn ngừa các bệnh tim mạch hay chống lão hóa, mang lại hiệu quả đáng kể cho việc làm đẹp. Một trong những hợp chất có hiệu quả trong việc chống oxy hóa là flavonoid. Ngoài ra flavonoid còn có các hoạt tính sinh học khác như kháng khuẩn, kháng viêm, giảm đau, an thần Flavonoid có nguồn gốc từ tự nhiên trong nhiều loại trái cây, rau quả, Việt Nam là một nước khí hậu nhiệt đới vì vậy rau củ cũng đa dạng và phong phú. Củ cải trắng (Raphanus sativus L.) là loại củ phổ biến, rẻ tiền và ngày càng được dùng nhiều ở Việt Nam. Nhận thức được đây là một loại nguyên liệu rẻ tiền và có giá trị về mặt dược liệu nhưng nước ta vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về củ cải trắng cũng như thu nhận các hợp chất flavonoid trong củ cải trắng vì vậy chúng tôi đã tiến hành đề tài “Khảo sát quá trình trích ly thu nhận flavonoid từ củ cải trắng” nhằm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và tìm ra điều kiện tối ưu nhất để thu nhận các hợp chất flavonoid trong củ cải trắng phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. 1
  11. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về củ cải trắng 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm sinh học Củ cải có tên khoa học là Raphanus sativus L., là một loại rau ăn củ thuộc họ Cải đã được thuần hóa ở châu Âu trước thời La Mã, được trồng và tiêu thụ trên toàn thế giới. Phân loại theo tên khoa học như sau: Giới: Plantae Ngành: Angiosperms Lớp: Magnoliopsida Bộ: Brassicales Họ:Brassicaceae Chi: Raphanus Loài: R. sativus Hình 1.1 Củ cải trắng Củ cải trắng là loại rau được trồng quanh năm, có thể thu hoạch sau 45-55 ngày gieo trồng. Được trồng chủ yếu ở bán cầu bắc, nhất là Địa Trung Hải. Củ dài đến 40 cm. Lá chụm ở đất, chùm đứng, hoa trắng hay đỏ, 4 tiểu nhụy dài, 2 ngắn. Có thể dùng để lấy củ, ăn sống, làm dưa muối Củ cải có nhiều giống, chúng khác nhau về kích thước, màu sắc, độ dài và thời gian canh tác. Củ cải có hình tròn đến hình trụ với màu sắc khác nhau, từ màu trắng đến màu đỏ. Hình dạng rễ củ phình to, dài lên đến 15 cm, thích hợp cho việc nấu ăn, trong khi đó, rễ củ hình tròn nhỏ hơn thường được ăn sống trong món salad. Thịt củ ban đầu có vị ngọt nhưng sẽ bị đắng nếu ở lại trong đất quá lâu [20]. 2
  12. Củ cải là loại rau ăn củ dễ trồng, thời gian sinh trưởng ngắn, nhanh cho thu hoạch và có thể trồng nhiều vụ trong năm. Phần thu hoạch chính của củ cải trắng là củ, vì vậy để đạt được năng suất cao cần tạo điều kiện để củ cải sinh trưởng tốt nhất. Chọn nơi có nhiệt độ khoảng 18-290C, đất thịt nhẹ hoặc cát pha, tơi xốp, nhiều mùn hoặc đất phù sa, thoát nước tốt. Tùy theo giống nhưng thường 45 - 50 ngày sau gieo là có thể thu hoạch, nếu thu hoạch quá muộn củ cải sẽ bị giảm chất lượng. 1.1.2 Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của củ cải được thể hiện ở Bảng 1.1. Củ cải có chứa nhiều carbohydrat, kali, magiê, đồng, canxi, vitamin, các hợp chất có hoạt tính sinh học bao gồm anthocyanin, glucosinolat, isothiocyanat, các flavonoid và nhiều loại hợp chất phenolic khác [32]. Bảng 1.1 Giá trị dinh dưỡng trong 100 g của cải Giá trị dinh dưỡng trong 100g Năng lượng 16 kcal Carbohydrat 3,4 g Đường 1,86 g Chất xơ 1,6 g Chất béo 0,1 g Protein 0,68 g Vitamin Thiamine (B1) 0,012 mg Riboflavin (B2) 0,039 mg Niacin (B3) 0,254 mg Acid Pantothennic (B5) 0,165 mg Vitamin B6 0,071 mg Folate (B9) 25 mg Vitamin C 14,8 mg Chất khoáng Canxi 25 mg Sắt 0,34 mg 3
  13. Magie 10 mg Mangan 0,069 mg Photpho 20 mg Kali 233 mg Kẽm 0,28 mg Florua 6 µg Cacbonhydrat: Củ cải có chứa một số loại đường như glucose, một lượng nhỏ fructose và saccharose. Lipid: Củ cải chứa ít chất béo bão hòa và rất ít cholesterol. Lipid tổng chiếm 0,1% trong 100 g củ cải tươi. Protein: Protein tổng chiếm 0,68% trong 100 g củ cải tươi. Acid amin chính là proline, methionine và cystine. Vitamin và khoáng chất: Hàm lượng vitamin C chiếm khoảng 0,015% trong 100 g củ cải tươi. Hàm lượng vitamin C trong rễ củ cải bị ảnh hưởng nhiều với điều kiện chiếu sáng và phân bón [19]. Củ cải là một nguồn giàu vitamin B9, B6, B3, B2, Rễ củ cải muối có chứa nguyên tố vi lượng như: nhôm, bari, lithium, mangan, silic, titan, flo và i-ốt [25]. 1.1.3 Các hợp chất thứ cấp trong củ cải trắng Các nghiên cứu đã công bố cho thấy trong củ cải trắng có chứa nhiều hợp chất thứ cấp có lợi cho sức khỏe con người. Enzyme: trong củ cải trắng đã tìm thấy sự hiện diện của các enzyme invertase, cellulase, ß-galactosidase, protease, peroxidase, catalase, sucrase, amylase, alcohol dehydrogenase, pyruvic carboxylase, glutathione reductase [26] và raphanin [19]. Trong số này, catalase và glutathione reductase là 2 enzyme có tác dụng như những chất chống oxi hóa bậc 2, góp phần ngăn chặn sự tạo thành các gốc tự do. Ngoài ra, raphanin, một protease trung tính có khả năng kháng khuẩn và kháng nấm mạnh cũng được tìm thấy trong củ cải trắng. Acid hữu cơ: chủ yếu gồm acid oxalic, acid malic, acid malonic, acid erythorbic, acid erucic, acid gentisic, acid hydrocinnamic, acid salicylic và acid vanillic [28]. 4
  14. Các hợp chất phenolic: các flavonoid được tìm thấy trong củ cải trắng gồm quercetin, kaempferol, myricetin, apigenin, luteolin, catechin và rutin [21]. Các acid phenolic có mặt trong củ cải trắng bao gồm caffeic, p-coumaric, ferulic, hydroxycinnamic, p-hydroxybenzoic, vanillic, salicylic, acid gentisic [29], acid syringic và phenyl pyruvic [19]. Anthocyanidin cũng được tìm thấy trong củ cải trắng nhưng với hàm lượng nhỏ, ngoại trừ pelargonidine, delphinidin và cyanidine, là những chất tạo màu cho củ cải đỏ, hồng hoặc tía [29]. Các hợp chất isothiocyanate: gồm 4-methylthio-3-butenyl isothiocyanate (raphasatin), 4-(methylthio) butyl isothiocyanate (erucin) [23], allyl isothiocyanate, benzyl isothiocyanate và phenethyl isothiocyanate đã được ghi nhận là có mặt trong thành phần của củ cải trắng. Ngoài các thành phần trên, trong củ cải trắng còn có các hợp chất tannin, alkaloid, coumarin, gibberellin và các hợp chất có chứa lưu huỳnh. Koo Hui Miean và cộng sự (2001) đã nghiên cứu hàm lượng các flavonoid phổ biến gồm myricetin, quercetin, kaempferol, luteolin và apigenin trong 62 loại thực vật ăn được, bao gồm cả củ cải trắng. Mẫu thực vật được rửa sạch, sấy khô, xay nhỏ thành bột. Trích ly bằng dung môi methanol 50% có pha 1,2M HCl (để thực hiện quá trình thủy phân các flavonoid ở dạng glycoside thành dạng aglycon) trong 2 giờ ở 900C bằng phương pháp trích ly hồi lưu. Dịch sau trích được lọc, thu dịch, định mức lên 50 ml, lọc lại qua giấy lọc 0,45 µm. Dịch sau lọc dùng làm mẫu phân tích HPLC để xác định hàm lượng các flavonoid. HPLC pha đảo được tiến hành trên cột Nova-Pak C18, đường kính 3,9 mm, dài 150 mm, sử dụng hệ dung môi pha động là methanol/nước (1:1, v/v), pH 2,5 với acid triflouroacetic, đầu dò UV 365 nm, tốc độ dòng 1 ml/phút. Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng flavonoid tổng trong củ cải trắng là 65 mg/kg, trong đó quercetine là 17,5 ± 0,05 mg/kg, luteolin 9,0 ± 0,07 mg/kg và kaempferol là 31,5 ± 0,05 mg/kg. R. Jakmatakul và cộng sự (2009) đã so sánh khả năng ức chế tyrosinase và hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết methanol và nước ép từ củ cải trắng Thái Lan lạnh đông chậm nhằm xác định tiềm năng làm trắng da và chống lão hóa trong các ứng dụng mỹ phẩm. Kết quả nghiên cứu công bố cho thấy nước ép từ củ cải lạnh đông chậm có hàm lượng các hợp chất phenolic, flavonoid và acis ascorbic cao hơn trong dịch chiết methanol, khả năng khử các gốc tự do (DPPH, superoxide, oxi đơn) 5
  15. và ức chế tyrosinase của nước ép cũng cao hơn so với dịch chiết methanol. Nghiên cứu cũng đã xác định được giá trị IC50 cho khả năng ức chế tyrosinase của dịch chiết methanol là 9,62 mg/ml và và của nước ép là 3,09 mg/ml. Do đó, tác giả cũng đề nghị về việc xem xét hướng nghiên cứu sử dụng R.sativus vào công nghệ mỹ phẩm dưỡng da. Ali Ghasemzadeh và cộng sự (2012) cũng đã nghiên cứu thành phần flavonoid và hoạt tính chống oxi hóa của một số loài cây nhiệt đới ở Malaysia gồm bắp cải, ớt xanh, ớt đỏ, rau dền, củ cải trắng, xả và nghệ. Flavonoid tổng được xác định bằng phương pháp của Chen (1998), các flavonoid thành phần được xác định bằng HPLC. Kết quả cho thấy trong củ cải trắng Malaysia có hàm lượng flavonoid tổng là 0,098 ± 0,012 mg/g chất khô [30] với ít nhất 5 loại flavonoid gồm quercetin, catechin, kaemferol, apigenin và rutin với hàm lượng lần lượt là: 0,016; 0,057; 0,039; 0,014 và 0,012 mg/g chất khô. Một kết quả cao hơn đã được ghi nhận trong nghiên cứu của D. Marinava và cộng sự (2005) trên một số loài rau và trái cây của Bulgari. Theo đó, trong củ cải trắng Bulgari có chứa các hợp chất phenolic và flavonoid với hàm lượng tương ứng là 160 mg/g và 48,5 mg/g. 1.1.4 Công dụng của củ cải Củ cải cung cấp nhiều lợi ích về sức khỏe và dinh dưỡng. Củ cải là một trong những loại rau củ rất ít calo. Củ tươi chỉ cung cấp 16 calo trên 100 gram. Tuy nhiên, nó là một nguồn tuyệt vời của chất chống oxi hóa, chất điện giải, chất khoáng và vitamin. Củ cải giòn và ngon ngọt, thường dùng để ăn sống và đang được dùng rất phổ biến trong món salad, nấu chín hoặc hấp. Củ cải được nấu chín cùng với các loại rau quả khác hoặc sử dụng làm nguyên liệu nhồi cho món mooli parantha ở Ấn Độ. Kim chi củ cải là một đặc sản của truyền thống Hàn Quốc. Các phần khác nhau của củ cải được sử dụng trong y học để điều trị các bệnh khác nhau như rối loạn chức năng gan, các bệnh truyền nhiễm, viêm phế quản, trị bỏng, vết bầm tím và mùi hôi ở bàn chân Hoạt tính sinh học của củ cải được khuyến khích để điều trị các bệnh khác nhau, bao gồm bệnh ho gà, bệnh ung thư, khó tiêu, các vấn đề túi mật, viêm khớp, sỏi mật, sỏi thận, bệnh giang mai, ký sinh trùng đường ruột và được sử dụng trong việc chữa các chứng rối loạn khác nhau của dạ dày. 6
  16. Tại khu vực Đông Nam Á, củ cải được nghiền và sử dụng như một loại thuốc đắp để điều trị đau thấp khớp, bỏng hoặc vết bầm tím. Nước ép củ cải được xem như là một phương thuốc trị ho và tiêu chảy. 1.2 Hợp chất flavonoid 1.2.1 Khái niệm Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo màu cho rất nhiều loại rau, hoa và quả. Flavonoid tồn tại phổ biến trong thực vật, được tìm thấy trong tất cả các bộ phận của thực vật: lá, hoa, rễ, hạt, quả. Hình 1.2 Khung sườn cơ bản của flavonoid Flavonoid có cấu trúc cơ bản là 1,3-diphenylpropan, nghĩa là gồm 2 vòng benzen (vòng A và B) nối với nhau qua 1 dây 3 carbon (vòng pyron - vòng C), nên thường được gọi là khung cacbon C6-C3-C6. Trừ một số trường hợp mạch 3C hở như chalcone, đa số trường hợp mạch 3C đóng vòng với vòng A và tạo nên dị vòng C chứa oxy [32]. 1.2.2 Phân loại Flavonoid được chia thành ba phân nhóm chính: euflavonoid (2- phenylbenzopyrans), isoflavonoid (3-benzopyrans) và neoflavonoid (4- benzopyrans). Trong mỗi nhóm này các flavonoid lại được chia thành các nhóm phụ khác nhau dựa vào sự khác biệt trong cấu tạo của vòng C [33]. Hình 1.3 Các phân nhóm chính của flavonoid 7
  17. (A: euflavonoid, B: iso-flavonoid, C: neo-flavonoid) Phân nhóm của euflavonoid gồm các nhóm phụ: flavan, flavan 3-ol (catechin), flavan 4-ol, flavan 3,4-diol, anthocyanidin, flavanone, flavone, flavonol, 3-hydroxy flavanon, chalcon, dihidrochalcon, aurone. Phân nhóm isoflavonoid gồm các nhóm phụ: iso flavan, iso flavan-4-ol, isoflavon, isoflavanon, rotenoid Thường gặp nhất là isoflavon trong cây họ đậu. Neoflavon chỉ giới hạn trong một số cây gồm các nhóm phụ 4-aryl-chroman, 4-aryl-coumarin, dalbergion. Ngoài ra, người ta còn phân loại flavonoid thành flavonoid, biflavonoid, triflavonoid và flavonlignan [33]. 1.2.3 Tính chất lý hóa Trong thực vật, flavonoid tồn tại ở 2 dạng: dạng tự do (gọi là aglycon) và dạng liên kết với đường (glycoside). Các glycoside khi bị thủy phân bằng acid hoặc enzyme sẽ giải phóng ra đường và aglycon. Các đường thường gặp nhất là D- glucose, D-galactose, L-rhamnose, L-arabinose, D-xylose, D-apiose [33]. Tính tan: aglycon kém tan trong dung môi kém phân cực (hexan, benzen, ether dầu hỏa), tan trong dung môi phân cực vừa và mạnh (ethyl acetate, dimethyl ether, methanol, ethanol), tan trong kiềm loãng, kém tan trong dung dịch acid. Glycoside: tan trong ethanol, methanol. Các glycoside càng có nhiều nhóm đường và mạch đường càng dài thì tan tốt trong nước nóng. Các flavonoid glycoside có nhóm -OH tại vị trí C7 còn tan được trong dung dịch NaOH, Na2CO3, NaHCO3 do có tính acid. Các flavonoid dạng aglycon thường dễ kết tinh, trong khi các glycoside thường khó kết tinh hơn [33]. Các flavonoid thường có màu. Flavon có màu vàng nhạt hoặc màu cam; flavonol có màu vàng đến vàng nhạt; chalcon có màu vàng đến cam đỏ. Các isoflavon, flavanon, flavanonol, leucoanthocyanidin, catechin kết tinh không màu. Anthocyanidin thường hiện diện ở dạng glycosid: pelargonidin, cyanidin, delphinidin tạo màu xanh dương, đỏ, tím cho hoa và trái [32,33]. Các flavonoid dễ tạo muối tan trong nước với các hydroxyd kiềm, nhạy cảm với pH, nhiệt độ và ánh sáng. Có khả năng tạo phức với các ion kim loại cho sản phẩm có màu đặc trưng. 8
  18. Hệ thống nối đôi liên hợp tạo ra bởi 2 vòng benzen và vòng pyron làm cho flavonoid có khả năng hấp thụ tia tử ngoại. Thường thu được 2 dải hấp thu cực đại, dải 1 có λmax = 320 - 380 nm, dải 2 có λmax = 240 - 280 nm [33]. 1.2.4 Giá trị sinh học của flavonoid 1.2.4.1 Hoạt tính chống oxi hóa Gần đây, các hợp chất flavonoid đã được coi là chất chống oxi hóa mạnh mẽ trong ống nghiệm và được chứng minh là chất chống oxi hóa mạnh hơn vitamin C, vitamin E và carotenoids [35]. Chất chống oxi hóa là các hợp chất có thể trì hoãn, ức chế, hoặc ngăn chặn quá trình oxi hóa gây ra bởi các gốc tự do và giảm bớt tình trạng stress oxi hóa [35, 36]. Stress oxi hóa là một trạng thái mất cân bằng do số lượng gốc tự do sản sinh quá nhiều vượt qua khả năng chống oxi hóa nội sinh, dẫn đến quá trình oxi hóa của một loại đại phân tử sinh học, như các enzym, protein, DNA và lipid [10,11]. Stress oxi hóa là nguyên nhân quan trọng trong sự phát triển của các bệnh thoái hóa mãn tính bao gồm bệnh mạch vành tim, ung thư và lão hóa [31,35]. Khả năng chống oxi hóa của flavonoid có thể được giải thích dựa vào các đặc điểm cấu trúc phân tử của chúng: Trong phân tử flavonoid có chứa các nhóm hydroxyl liên kết trực tiếp với vòng thơm có khả năng nhường hydro giúp chúng có thể tham gia vào các phản ứng oxi hóa khử, bắt giữ các gốc tự do; Chứa các vòng thơm và các liên kết bội (liên kết C=C, C=O) tạo nên hệ liên hợp giúp chúng có thể bắt giữ, làm bền hóa các phần tử oxi hoạt động và các gốc tự do. Chứa nhóm có thể tạo phức chuyển tiếp với các ion kim loại như catechol giúp làm giảm quá trình sản sinh ra các phần tử oxi hoạt động [31,35]. Quá trình chống oxi hóa của flavonoid chủ yếu theo 3 cơ chế sau: Khử và vô hoạt các gốc tự do nhờ thế oxi hóa khử thấp: các hợp chất flavonoid nhờ thế oxi hóa khử thấp nên có thể khử các gốc tự do bằng cách nhường ngyên tử hidro hoặc một electron cho gốc tự do [34]. 9
  19. Hình 1.4 Cơ chế ức chế của catechol với gốc tự do peroxy [31] Ức chế sự hình thành các gốc tự do bằng cách liên kết với các ion kim loại lượng tham gia vào quá trình sản xuất các gốc tự do[34]. Hình 1.5 Các vị trí của flavonoid có thể liên kết với các ion kim loại [31] Ức chế sự hình thành các gốc tự do bằng cách ức chế một số enzyme tham gia vào quá trình sản xuất các gốc tự do [34]. Hoạt tính chống oxi hóa của các flavonoid chịu ảnh hưởng từ đặc điểm cấu tạo của chúng: số lượng và vị trí của các nhóm hydroxyl và các nhóm thế khác trên các vòng, loại nhóm thế. Ví dụ: hydro nằm ở vị trí ortho của vòng B có khả năng cho hydro cao nhất, tạo gốc tự do ổn định; nhóm thế CH2=CH-COOH sẽ giúp tăng cường hoạt tính chống oxi hóa hơn nhóm thế -COOH; sự hiện diện của catechol ở vòng B cũng giúp tăng cường hoạt tính chống oxi hóa [32, 36]. Nghiên cứu của Bùi Hữu Trung và Nguyễn Thị Thanh Mai (2009) về hoạt tính ức chế gốc tự do NO. với cấu trúc của các hoạt chất cô lập từ hoa cúc trắng đã ghi 10
  20. nhận sự liên quan giữa cấu trúc của flavonoid với khả năng ức chế gốc tự do NO Cụ thể, nếu nhóm -OH nằm ở vị trí B3' và B4' cho hoạt tính ức chế cao hơn các vị trí còn lại. Đối với các chất mà phân tử có nhóm đường thì hoạt tính chống oxi hóa giảm hẳn. Đặc biệt nhóm -OH tại vị trí B4' có hoạt tính lớn hơn hẳn so với B3'. Khi . nhóm -OH hiện diện cả hai vị trí B3', B4' thì hoạt tính ức chế NO rất mạnh. Đặc biệt, khi so sánh với chất chuẩn quercetin, cho thấy nhóm -OH nằm ở vị trí C3 làm tăng . hoạt tính ức chế NO rất mạnh với IC50 là 18.3 μM. Ngoài ra, nối đôi giữa C2 và C3 cũng làm tăng hoạt tính. Trong khi đó, thì nhóm metoxy ở các vị trí trên vòng B làm tăng hoạt tính của các hợp chất khảo sát. Nhóm -OH trên vòng A hầu như có hoạt tính ức chế NO. rất thấp. Nhìn chung, khả năng ức chế gốc tự do của nhóm flavonoid là nhờ vào số lượng và vị trí nhóm -OH trên vòng B quyết định. Đồng thời, nó còn chịu ảnh hưởng do cấu trúc cộng hưởng kéo dài của các vòng phenol [38]. 1.2.4.2 Tác dụng ức chế vi sinh vật, chống viêm nhiễm Dịch chiết flavonoid từ quả mơ cho thấy khả năng ức chế đối với sự phát triển của S.aureus, Shigella sonnei, Shigella flexneri, Candida albicans với đường kính vòng ức chế tương ứng là 23, 21, 26 và 29 mm. Kết quả tương tự đối với dịch chiết flavonoid của cây diếp cá trên sự phát triển của E.coli, P.aeruginosa, B.subtilis và S.aureus với giá trị MIC lần lượt là 100, 200, 200 và 50 µg/ml. Các flavonoid 5,7- dimethoxyflavanone-4’-O-β-D-glucopyranoside; nicotiflorin; rutin; naringenin-7- O-β-D-glucopyranoside; 5,7-dimethoxyflavanone 4’-O-[2’’-O-(5’’’-O-trans- cinnamoyl)--D-glucopyranoside; và 5, 7, 3’-trihydroxy-flavanone-4’-O-β-D- glucopyranoside có khả năng ức chế đối với sự phát triển của 10 chủng Klebsiella pneumoniae khác nhau ở nồng độ 32 - 64 μg/ml, trong khi đó mẫu đối chứng dùng ampicillin không làm được điều này. Quercetin làm giảm đáng kể tình trạng viêm nhiễm và sự peroxyd lipid gây ra bởi Helicobacter pylori trong niêm mạc dạ dày của chuột bạch [37]. 1.2.4.3 Tác dụng đối với enzyme Dẫn xuất 6-hydroxy luteolin của luteolin có thể ức chế sự hoạt động của enzyme α-glucosidase đến 92% ở nồng độ 500 μM. Một số flavonoid cũng đã cho 11
  21. thấy hoạt tính ức chế đối với enzyme xanthine oxidase, enzyme xúc tác cho sự oxi hóa xanthine và hypoxanthine thành acid uric [36]. 1.2.4.4 Tác dụng đối với các bệnh tim mạch, tiểu đường Tác động bảo vệ của các flavonoid đối với tim mạch có thể do khả năng của chúng trong việc ngăn ngừa sự oxi hóa các lipoprotein tỷ trọng thấp, phòng ngừa xơ vữa động mạch, chặn sự kết tụ huyết khối, điều hòa nhịp tim, ngăn ngừa bệnh mạch vành và nhồi máu cơ tim, điều hòa huyết áp Các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng các flavonoid tự nó có vai trò như chất kích thích insulin hay bắt chước chức năng của insulin; ngoài ra chúng còn có sự ảnh hưởng đến hoạt động của các enzyme trong quá trình chuyển hóa đường [36]. 1.2.4.5 Tác dụng đối với ung thư Với nỗ lực nhằm nghiên cứu khả năng chống ung thư của các hợp chất flavonoid, gần đây nhiều tác giả trên thế giới đã tiếp tục thử nghiệm tác dụng in vitro và in vivo của flavonoid lên các dòng tế bào ung thư khác nhau. Quercetin có tác dụng ức chế sự phát triển của các tế bào ung thu tuyến tụy, chế độ ăn bổ sung quercetin cũng có tác dụng làm giảm khả năng phát triển của các khối u. Naringenin và kaempferol-3-O- (2”, 6”-di-O-p-trans-coumaroyl) glucoside thu nhận từ hoa của Melastoma malabathricum L. cũng đã được tìm thấy là có khả năng ức chế sự tăng sinh của dòng tế bào ung thư vú MCF7 với giá trị IC50 lần lượt là 0,28 µM và 1,3 µM [30]. 1.2.5 Phương pháp thu nhận flavonoid Quy trình chung của quá trình thu nhận flavonoid từ thực vật được thể hiện trong sơ đồ hình 1.6. Đầu tiên, mẫu thực vật dùng nghiên cứu sau khi thu gom sẽ trải qua quá trình sơ chế chuẩn bị để có dạng mẫu phù hợp cho nghiên cứu. Quá trình sơ chế chủ yếu là rửa sạch, loại các phần hư hỏng và tạp chất, cắt nhỏ mẫu. 12
  22. Hình 1.1 Quy trình thu nhận flavonoid từ thực vật Sau đó mẫu sẽ qua quá trình chuẩn bị mẫu và xử lý mẫu. Quá trình chuẩn bị mẫu chủ yếu là tạo mẫu ở dạng tươi hay khô. Bảo quản lạnh mẫu nếu mẫu nghiên cứu là mẫu tươi (bảo quản lạnh thường và bảo quản lạnh đông) hoặc sấy khô mẫu nếu mẫu nghiên cứu là mẫu khô (sấy đối lưu, sấy chân không, sấy thăng hoa). Ngoài ra, một số quy trình còn có quá trình xử lý mẫu như: chần hoặc hấp để ức chế một số enzyme có trong mẫu, nghiền nhỏ mẫu, xử lý với các enzyme pectinase, cellulase, protease, amylase để phá vỡ thành tế bào và một số liên kết hóa học nhất định, giải phóng các chất hòa tan bên trong hoặc lên men rồi đưa vào trích ly để thu nhận flavonoid. Quá trình trích ly có thể thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau, gồm: Các phương pháp truyền thống: chiết bằng thiết bị Soxhlet, chiết ngấm kiệt và chiết ngâm dầm. Trong đó, chiết ngấm kiệt có đối lưu dòng dung môi và ngâm dầm có khuấy trộn có ưu điểm là thiết bị đơn giản, đồng thời trích ly được một lượng mẫu lớn và có thể đạt hiệu suất trích ly cao đối với chất hòa tan cũng như các hoạt chất sinh học. Tuy nhiên, lại cần nhiều thời gian, tốn dung môi, dung môi sử 13
  23. dụng phải tinh khiết, nồng độ chất nghiên cứu trong dịch chiết thu được thấp, phải tốn nhiều thời gian và công sức để loại dung môi ra khỏi dịch chiết để thu cao. Chiết bằng thiết bị soxhlet có ưu điểm tiết kiệm dung môi hơn, ít tốn thời gian, nồng độ chất chiết trong dịch trích ly cao. Tuy nhiên, không thể tiến hành cùng lúc một lượng lớn mẫu cùng lúc và hợp chất có thể bị ảnh hưởng do nhiệt độ cao trong quá trình trích ly.  Các phương pháp hiện đại: trích ly có sự hỗ trợ của: Sóng siêu âm (UAE) Xung điện (PEF) Enzyme (EAE) Vi sóng (MAE) Áp suất cao (PLE) Chất lỏng siêu tới hạn (SFE) Các phương pháp trích ly hiện đại sẽ rút ngắn được thời gian trích ly, giảm lượng dung môi phải sử dụng nhưng hiệu quả thu hồi vẫn gần bằng và cao hơn so với phương pháp trích ly chỉ dùng nhiệt độ và dung môi đối lưu. Hiệu quả quá trình còn phụ thuộc vào các thông số kỹ thuật đặc trưng của từng phương pháp. Tuy nhiên, nhược điểm của các phương pháp trích ly hiện đại là đòi hỏi phải có thiết bị phù hợp và chi phí cũng cao hơn. Dịch sau trích ly được đem cô giảm áp để loại dung môi, thu cao chiết thô chứa flavonoid. Cao này sau cùng sẽ trải qua các quá trình tinh chế để tách riêng phần flavonoid. Có một số phương pháp khác nhau để thực hiện quá trình này, chủ yếu dựa trên kỹ thuật chiết lỏng lỏng hoặc kỹ thuật chiết pha rắn (SPE: solid phase extraction). Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi thiết bị nhưng có nhược điểm là hiệu quả thu hồi thấp, dễ gây sai số, tốn thời gian và dung môi. Ngày nay, SPE được sử dụng phổ biến vì tốn ít thời gian, cho kết quả nhanh, tiện lợi, hiệu quả về mặt kinh tế và có thể hoàn toàn tự động [35]. 14
  24. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu Địa điểm: thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm của ngành Công nghệ Thực phẩm, viện Kỹ thuật và Kinh tế Biển, trường Đại học Bà Rịa-Vũng Tàu. Thời gian thực hiện: 06/02/2017 - 19/06/2017 2.2 Nguyên liệu, dụng cụ thiết bị và hóa chất 2.2.1 Nguyên liệu Nguyên liệu sử dụng là củ cải trắng, thu mua từ thị trấn Liên Nghĩa, huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng. Nguyên liệu sau khi thu hái được rửa sạch, cắt lát dày 0,5cm, rồi cắt thành sợi sau đó được chần qua nước nóng ở 800C trong 3 phút, để ráo, sấy ở nhiệt độ 600C trong 24 giờ đến độ ẩm khoảng 8%, sau đó xay nhỏ (0,5-1 mm) và bảo quản trong bao PE, tránh ánh sáng ở -200C. Hình 2.1 Bột củ cải 2.2.2 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất  Thiết bị - dụng cụ Cân phân tích Tủ sấy 15
  25. Máy đo quang Bể điều nhiệt Lọc chân không. Các dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm.  Hóa chất Trolox, acid gallic, quercetin, ABTS (Sigma) Thuốc thử Folin – Ciocalteu (Sigma) Putassium persulfate Nhôm clorua Natri cacbonat Kali acetat Các dung môi: ethanol, ethyl acetate, methanol, chloroform 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Nội dung nghiên cứu Loại dung môi Nồng độ dung môi Thông số quá trình trích ly Tỷ lệ NL : DM Khảo sát quá trình trích ly thu nhận Flavonoid từ củ cải Nhiệt độ trích ly trắng Tối ưu quá trình Thời gian trích ly trích ly Hình 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.3.2 Bố trí thí nghiệm Các yếu tố sau đây đươc cố định trong toàn bộ nghiên cứu: phương pháp trích ly sử dụng là phương pháp chưng ninh, lượng mẫu cho mỗi một thí nghiệm là 1g. 16
  26. 2.3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi Yếu tố khảo sát: loại dung môi sử dụng gồm ethanol 900, methanol, chlorofom và ethyl acetate. Yếu tố cố định + Thời gian trích ly: 4 giờ + Nhiệt độ trích ly: 600C + Tỉ lệ nguyên liệu: dung môi = 1:20 (g/ml) + Nồng độ dung môi: nguyên chất Yếu tố đo đạc: hàm lượng flavonoid tổng (TFC), phenolic tổng (TPC) và khả năng khử gốc tự do ABTS* (ABTS). 2.3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung môi sử dụng Yếu tố khảo sát: nồng độ dung môi phù hợp cho trích ly gồm các mức là 100, 75, 50, 25, 0 (v/v). Yếu tố cố định + Thời gian trích ly: 4 giờ + Nhiệt độ trích ly: 600C + Tỉ lệ nguyên liệu: dung môi = 1:20 (g/ml) + Loại dung môi: từ kết quả 2.3.2.1 Yếu tố đo đạc: TFC, TPC và ABTS. 2.3.2.3 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu và dung môi Yếu tố khảo sát: tỉ lệ nguyên liệu: dung môi ở 4 mức 1:10, 1:20, 1: 30, 1: 40 (g/ml) Yếu tố cố định + Thời gian trích ly: 4 giờ + Nhiệt độ trích ly: 600C + Loại dung môi: từ kết quả 2.3.2.1 + Nồng độ dung môi từ kết quả 2.3.2.2 Yếu tố đo đạc: TFC, TPC và ABTS. 2.3.2.4 Khảo sát nhiệt độ trích ly Yếu tố khảo sát: nhiệt độ trích ly ở 5 mức 400C, 500C, 600C, 700C 17
  27. Yếu tố cố định + Thời gian trích ly: 4 giờ + Loại dung môi: từ kết quả 2.3.2.1 + Nồng độ dung môi từ kết quả 2.3.2.2 + Tỉ lệ nguyên liệu và dung môi từ kết quả 2.3.2.3 Yếu tố đo đạc: TFC, TPC và ABTS. 2.3.2.5 Khảo sát thời gian trích ly Yếu tố khảo sát: nhiệt độ trích ly ở 5 mức 2; 2,5; 3; 3,5 và 4 giờ Yếu tố cố định + Loại dung môi: từ kết quả 2.3.2.1 + Nồng độ dung môi từ kết quả 2.3.2.2 + Tỉ lệ nguyên liệu và dung môi từ kết quả 2.3.2.3 + Nhiệt độ trích ly từ kết quả 2.3.2.4 Yếu tố đo đạc: TFC, TPC và ABTS. 2.3.2.6 Tối ưu hóa trích ly flavonoid từ củ cải trắng Các thí nghiệm đơn yếu tố được tiến hành nhằm sơ bộ xác định các điểm tại tâm. Quá trình tối ưu các thông số của quá trình trích ly được thực hiện bằng phương pháp quy hoạch thực ngiệm theo mô hình Box-Wilson dạng CCC. 2.3.3 Phương pháp phân tích 2.3.3.1 Xác định hàm lượng flavonoid tổng (TFC) [10] Tổng flavonoid được xác định theo phương pháp so màu như miêu tả của Chan và cộng sự (2002) dựa trên nguyên tắc: flavonoid tạo phức màu vàng với dung dịch AlCl3. Cường độ màu tỷ lệ thuận với hàm lượng flavonoid được xác định ở bước sóng 415 nm. Quercetin được dùng làm chất chuẩn tham chiếu.  Xây dựng đường chuẩn quercetin: Pha dung dịch quercetin 100 ppm trong dung dịch cồn 80%. Từ dung dịch chuẩn quercetin 100pm, tiếp tục pha ra thành các dung dịch có nồng độ 75, 50, 25, 12,5, 6,25 và 3,125 ppm. Ứng với mỗi nồng độ dung dịch pha loãng hút 0,5 ml cho vào ống nghiệm sau đó cho vào: 1,5 ml ethanol 95%; 0,1ml AlCl310%; 0,1 ml CH3COOK 1M; và 2,8 ml nước cất. 18
  28. Lắc đều để yên ở nhiệt độ phòng 30 phút. Đo màu ở 415 nm, mẫu trắng thực hiện tương tự nhưng thay AlCl3 bằng nước cất. 0.12 0.1 y = 0,00997x 0.08 R² = 0,988 415 0.06 OD OD 0.04 0.02 0 0 2 4 6 8 10 12 Quercetin (ppm) Hình 2.3 Đường chuẩn queretin dùng xác định TFC a. MHìnhẫu trư 2.ớ4c Phkhiả nph ứảngn ứtạngo màu khi xây db.ự ngM ẫđưu sauờng khi chu phẩnả querceinn ứng Xác định TFC trong mẫu: Lấy 0,5 ml dịch chiết củ cải, làm tương tự các bước xây dựng đường chuẩn. TFC trong mẫu được tính như sau: aV n TFC .10 3 (mg quercetin/g) m Trong đó: a:hàm lượng quercetin xác định từ đường chuẩn (ppm) V:tổng thể tích dịch chiết (ml) 19
  29. n:hệ số pha loãng m:khối lượng mẫu(g) 2.3.3.2 Xác định phenolic tổng Các polyphenol trong dịch chiết được xác định bằng đo màu, dùng thuốc thử Folin. Thuốc thử này chứa chất oxi hóa là axit phospho-vonframic, trong quá trình khử, các nhóm hydroxyl phenol dễ bị oxi hóa, chất oxi hóa này sinh ra màu xanh có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 760 nm. Phản ứng này là do sự hình thành màu xanh của vonfarm và molypden. Các thuốc thử Folin phản ứng với nhiều hợp chất polyphenol và mặc dù có thể có đáp ứng khác nhau với các hợp chất đơn lẻ, thì việc lựa chọn acid gallic làm chất chuẩn hiệu chuẩn cũng giúp ích cho việc thu được dữ liệu polyphenol tổng số. Pha dung dịch acid galic chuẩn 1000ppm trong nước cất từ chất chuẩn acid galic: cân 0,1 g acid galic hòa tan vào nước cất và định mức lên 100 ml. Pha loãng thành các dung dịch có nồng độ 0, 10, 20, 30, 40 và 50 ppm từ dung dịch acid galic chuẩn 1000 ppm. + Tiến hành thêm các dung dịch theo như trong bảng: Bảng 2.1 Các bước xây dựng đường chuẩn acid galic Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Nồng độ acid galic 0 10 20 30 40 50 Thể tích acid galic 0,5 ml Thể tích folin 10% 2,5 ml Để yên trong 5 phút Thêm vào 2ml Na2CO3 Để yên trong 2 giờ đo màu ở bước sóng 760 nm 20
  30. a. Mẫu trước khi cho Na2CO3 b. Mẫu vừa cho Na2CO3 vào c Mẫu sau khi phản ứng Hình 2.5 Phản ứng tạo màu khi xây dựng đường chuẩn galic Xây Kết quả đường chuẩn: Bảng 2.2 Kết quả đường chuẩn galic Dung dịch galic gốc (ppm) 10 20 30 40 50 60 ppm trong ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 OD 0,118 0,231 0,3415 0,4715 0,5895 0,679 21
  31. 0.8 0.7 y = 0,1155x R² = 0,998 0.6 0.5 0.4 OD 0.3 0.2 0.1 0 0 2 4 6 8 Nồng độ galic (ppm) Hình 2.6 Đường chuẩn galic dung để xác định TPC  Xác định trên mẫu khảo sát: làm tương tự nhưng thay 0,5 ml dung dịch chuẩn acid galic bằng dung dịch chiết của mẫu khảo sát. Dựa vào đường chuẩn để tính kết quả. Kết quả được quy tương đương theo số milligam acid galic/1 gam mẫu nguyên liệu. 2.3.3.3 Xác định khả năng khử gốc tự do ABTS* [37] Xác định hoạt tính chống oxi hóa là phương pháp dựa trên khả năng làm giảm độ hấp thu của gốc tự do cation ABTS* bởi các hoạt chất có hoạt tính chống oxi hóa ở bước sóng 734 nm. Cường độ màu của ABTS* tỷ lệ nghịch với các chất chống oxi hóa và thời gian phản ứng. Dựa vào đường chuẩn troxlox với thuốc thử sẽ tính được hoạt tính chống oxi hóa của mẫu phân tích. ABTS được pha trong nước cất đến nồng độ 7nM (dung dịch A) K2S2O8 pha trong nước cất đến 2,54 mM (dung dịch B) Gốc tự do cation ABTS* được tạo ra bằng phản ứng giữa dung dịch A và B theo tỷ lệ 1:1 về thể tích, phản ứng diễn ra trong bóng tối từ 12-16 giờ ở nhiệt độ phòng (dung dịch stock). Pha loãng dung dịch stock bằng nước cất để đạt độ hấp thu 0,7±0,02 A ở 734 nm (dung dịch C). Dung dịch C được chuẩn bị mới cho từng phép thử.  Xây dựng đường chuẩn trolox: Pha dung dịch trolox 1000 µM sau đó pha loãng ra thành các nồng độ 100, 200, 300, 400, 500 và 600 µM. 22
  32. Bảng 2.3 Quá trình xây dựng đường chuẩn với dung dịch trolox chuẩn Ốngnghiệm 0 1 2 3 4 5 6 Nồngđộtrolox(µM) 0 100 200 300 400 500 600 Tổngthểtích(ml) 3,04 3,04 3,04 3,04 3,04 3,04 3,04 DungdịchC(ml) 3 Thểtíchtrolox (ml) 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 Lắc đều và ủ nhiệt độ phòng trong 6 phút trong bong tối Đo độ hấp thu ở bước song 734 nm 50 45 y = 4,469 x + 4,792 40 R² = 0,946 35 30 25 20 15 10 Độ giảm Độđộ giảm hấpthu (%) 5 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 Nồng độ trolox (micro mol) Hình 2.7 Đường chuẩn trolox dùng xác định khả năng khử ABTS* Đối với mẫu thí nghiệm: hút 3 ml dung dịch C cho vào ống nghiệm sau đó hút 0,04 ml mẫu cho vào ống nghiệm. Lắc đều ủ ở nhiệt độ phòng trong 6 phút trong bóng tối lắc đều và đo độ hấp thu ở 734 nm. Mẫu trắng được chuẩn bị bằng cách thay 3 ml dung dịch C bằng 3ml nước cất. Phần trăm độ giảm độ hấp thu của mẫu thử (%) tính bằng công thức: Asample %1 OD Acontrol 23
  33. Trongđó: Asample: độ hấp thu của mẫu thí nghiệm Acontrol: độ hấp thu của ABTS* không có pha mẫu ( thay 0,04 ml mẫu bằng nước cất). 2.4 Phương pháp xử lý số liệu Tất cả các thí nhiệm đều được lặp lại 3 lần. Kết quả thể hiện trong báo cáo là trung bình của 3 lần lặp lại ± độ lệch chuẩn. Sử dụng phần mềm StaraphicCenturionXI để xử lý ANOVA và phân tích sự khác biệt về mặt thống kê thông qua LSD. Phần mềm Modde5.0để bố trí thí nghiệm tối ưu và xửlísốliệutối ưuhóa. 24
  34. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện trích ly. 3.1.1 Ảnh hưởng của loại dung môi Mức độ hòa tan của một chất trong các hệ dung môi khác nhau là khác nhau. Vì vậy trong nghiên cứu này đầu tiên chúng tôi chọn thí nghiệm khảo sát các loại dung môi trước tiên để chọn được loại dung môi thích hợp cho quá trình trích ly về sau. Để khảo sát sự ảnh hưởng của dung môi chúng tôi tiến hành thực hiện thí nghiệm như mô tả ở mục 2.3.2.1. Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở hình 3.1, bảng 3.1 và bảng Phụ lục 1. Dựa vào kết quả xử lý ANOVA, nhận thấy P-value <0,05 điều đó có nghĩa là có sự khác biệt giữa các loại dung môi. Bảng 3.1 Kết quả thí nghiệm khảo sát loại dung môi Loại dung môi TFC (mgQE/g) TPC (mgGAE/g) ABTS (mgTEAC/g) Etyl acetat 1,083b ± 0,429 1,464b ± 0.618 1,774c ± 0,261 Chloroform 0,158b ± 0,098 0,261c ± 0,055 0,635d ± 0,215 Methanol 2,851ab ± 1,511 5,803a ± 1,039 3,857a ± 0,256 Con 900 3,950a ± 2,459 6,733a ± 0,109 3,287b ± 0,135 TFC TPC ABTS 8 4.5 4 7 6 3.5 3 5 2.5 4 2 3 1.5 2 1 (mg/g) TEAC TPC, TFC (mg/g) TFC TPC, 1 0.5 0 0 etyl acetat chlorofom methanol con 90 Dung môi (ml) Hình 3.1 Ảnh hưởng của dung môi trích ly 25
  35. Theo bảng 3.1 ta nhận thấy hàm lượng TFC ở dung môi ethanol đạt 3,950a ± 2,459 mg QE/g, đạt giá trị cao nhất trong quá trình trích ly, trong khi đó methanol chỉ đạt 2,851ab ± 1,51mg QE/g, etyl acetat đạt 1,083b ± 0,429mg QE/g và thấp nhất là chloroform với 0,158b ± 0,098mg QE/g. Các loại dung môi có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất trích ly các hợp chất tự nhiên. Hiệu suất trích ly của các hợp chất phụ thuộc vào độ phân cực của các dung môi. Ở đây do chloroform là dung môi không phân cực nên hiệu suất của quá trình trích ly là thấp nhất. trong các dung môi còn lại do ethanol có tính phân cực mạnh và có khả năng hòa tan tốt các nhóm hơp chất nên hiệu suất cao hơn. Do vậy chúng tôi chọn dung môi ethanol cho quá trình trích ly. Trong nghiên cứu trong nghiên cứu của Zhang et al. (2008) [25], tác giả đã thu được hàm lượng flavonoid tổng là 3,152% khi sử dụng phương pháp chiết động ở áp suất cao với dung môi là ethanol. Ngoài ra việc sử dụng dung môi ethanol cũng sẽ không gây độc nên an toàn hơn các dung môi khác. 3.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi Chúng ta cần khảo sát yếu tố nồng độ vì ở các nồng độ dung môi khác nhau nó sẽ ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất trích ly thu được. Vì khi được pha loãng với nước sẽ tăng tính phân cực của dung môi giúp thu nhận nhiều hợp chất chống oxy hóa có tính phân cực hơn. Kết quả dưới đây cho ta thấy sự khác biệt giữa các nồng độ cồn khác nhau. Bảng 3.2 Kết quả thí nghiệm khảo sát nồng độ dung môi TL DM:nước(v/v) TFC( mgQE/g) TPC (mg GAE/g) ABTS(mgTEAC/g) 0:1 2,667c± 0,362 5,529d ± 0,156 1,988c ± 0,548 1:3 3,080bc ± 0,284 6,121c ± 0,079 2,264a ± 0,83915 1:1 2,930bc ± 0,789 7,060b ± 0,099 2,455ab ± 0,06309 3:1 4,883a ± 0,455 7,963a ± 0,261 4,137a ± 0,51641 1:0 3,832b ± 0,789 6,435c ±0,422 3,287bc ± 0,13506 26
  36. TFC TPC ABTS 9 4.5 8 4 7 3.5 6 3 5 2.5 4 2 3 1.5 2 1 TPC, TFC (mg/g) TFC TPC, 1 0.5 (mgTEAC/g) ABTS 0 0 0 25 50 75 100 Nồng độ (độ) Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ dung môi trích ly Nhìn vào bảng 3.2 cũng như biểu đồ hình 3.2 ta thấy rằng ở nồng độ 0 – 75 hàm lượng TEAC, TPC, TFC hầu như đều tăng. Tuy nhiên ở nồng độ là 75 thì cho kết quả TPC, TFC, ABTS cao hơn hẳn so với các mức khảo sát khác. Vì vậy nồng độ 750 là nồng độ thích hợp cho để tiến hành cho các thí nghiệm sau. Trong nghiên cứu của Hoàng Văn Tuấn và cộng sự (2013) trong nghiên cứu tách chiết hợp chất flavonoid từ cây diếp cá cũngsửdụngcồn ở mức 700 để trích ly [1]. Kết quả này cũng gần tương tự với thí nghiệm củachúng tôi. 3.1.3 Ảnh hưởng tỉ lệ dung môi và nguyên liệu Động lực của quá trình trích ly là do sự chênh lệch gradiant nồng độ giữa cấu tử trích ly trong nguyên liệu và dung môi. Sự vận chuyển chất tan từ bên trong tế bào thực vật ra bên ngoài dung môi qua con đường khuếch tán là chủ yếu. Sự khuếch tán này sẽ giúp cho quá trình chiết rút các cấu tử cần trích ly từ trong nguyên liệu vào dung môi xảy ra nhanh và triệt để hơn. Do đó lượng dung môi khác nhau sẽ dẫn đến hàm lượng chất tan được chiết rút ra là khác nhau. Vì vậy chúng ta cần khảo sát tỉ lệ nguyên liệu và dung môi để chọn tỉ lệ thích hợp nhất cho ra hiệu suất trích ly cao nhất. Bảng 3.3 và hình 3.3 là kết quả thí nghiệm mà chúng tôi thu được khi khảo sát về tỉ lệ dung môi. 27
  37. Bảng 3.3 Kết quả thí nghiệm khảo sát tỷ lệ dung môi:nguyên liệu Tỷ lệ (g/ml) TFC(mgQE/g) TPC(mgGAE/g) ABTS(mgTEAC/g) 1:10 3,261c ± 0,234 7,099c ± 0,645 2,685b ± 0,294 1:20 4,125b ± 0,438 7,402c ± 0,284 3,487b ± 0,0336 1:30 5,069a ± 0,451 8,294b ± 0,496 5,404a ± 0,75363 1:40 5,067a ± 0,425 8,319a ± 0,120 5,355a ± 1,06098 TFC TPC ABTS 9 6 8 5 7 6 4 5 3 4 3 2 2 (mg/g) TEAC TPC, TFC (mg/g) TFC TPC, 1 1 0 0 1:10 1:20 1:30 1:40 Tỉ lệ (g/ml) Hình 3.3 Ảnh hưởng tỉ lệ : dung môi trích ly Kết quả thí nghiệm cho thấy tỉ lệ từ 1:10 -1:30 (g/ml)hàm lượng TPC, TFC, TEAC, đều tăng lên khi tăng thêm lượng dung môi. Tuy nhiên khi tăng lên tỉ lệ 1:40 (g/ml) thì hàm lượng TFC và TEAC đã giảm xuống. Cụ thể ở tỉ lệ 1:30 (g/ml) hàm lượng TFC 5,069a ± 0,451 (mg/g) và TEAC 5,404a ± 0,75363 (mg/g) còn 1:40 (g/ml) TFC 5,067a ± 0,425 (mg/g) và TEAC 5,355a ± 1,06098 (mg/g) . Qua đây ta thấy rằng khi lượng dung môi ít dẫn đến quá trình trích ly chưa triệt để và khi tăng lượng dung môi thì sự chênh lệch gradiant nồng độ càng lớn làm cho các cấu tử trích ly bên trong nguyên liệu tiếp xúc với dung môi nhiều hơn dẫn đến khả năng khuếch tán tăng cao. Tuy nhiên, khi quá trình trích ly đạt trạng thái cân bằng, sự chênh lệch gradiant nồng độ giữa chất tan và dung môi không còn nhiều cho nên TPC, TFC và ABTS không tăng thêm nữa. 28
  38. Từ phân tích trên chúng tôi đã chọn tỉ lệ nguyên liệu và dung môi là 1:30 (g/ml) cho quá trình trích ly để thu hiệu quả tốt nhất 3.1.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ Khảo sát nhiệt độ trong quá trình trích ly là cần thiết. Bởi vì nhiệt độ làm tăng khả năng hòa tan và khuếch tán của các hợp chất, làm giảm độ nhớt dung môi, tăng khả năng truyền khối và xâm nhập của dung môi vào trong tế bào. Tuy nhiên không phải tăng nhiệt độ càng cao thì quá trình trích ly càng tốt. Dựa vào kết quả khi tiến hành xử lý ANOVA, nhận thấy P-value <0,05 điều đó có nghĩa là có sự khác biệt giữa các nhiệt độ khác nhau ở mức ý nghĩa 95% và được thể hiện ở Bảng 3.4 và phụ lục. Bảng 3.4 Kết quả thí nghiệm khảo sát nhiệt độ Nhiệt độ (0C) TFC(mgQE/g ) TPC(mgGAE/g) ABTS(mgTEAC/g) 40 4,032b ± 0,229 7,732b ± 0,101 3,579b ± 0,330 50 4,793ab ± 0,335 8,232b ± 0,444 4,197ab ± 0,18007 60 5,259a ± 0,260 9,116a ± 0,185 5,109a ± 1,06885 70 5,109a ± 0,781 9,173a ± 0,642 4,388ab ± 0,95296 80 5,259a ± 0,260 9,170a ± 0,462 4,257ab ± 0,37976 TFC TPC ABTS 10 6 9 5 8 7 4 6 5 3 4 3 2 TEAC (mg/g) TEAC TPC, TFC (mg/g) TFC TPC, 2 1 1 0 0 40 50 60 70 80 (Nhiệt độ 0C) Hình 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly 29
  39. Biểu đồ hình 3.4 và bảng 3.4 cho thấy, nhiệt độ càng tăng thì hàm lượng TPC và TFC càng tăng lên nhưng không đáng kể. Tuy nhiên khi càng tăng nhiệt độ lên cao thì hoạt tính chống oxi hóa lại giảm cụ thể ở nhiệt độ 600C hàm lượng TEAC là 5,109a ± 1,06885 (mg/g) nhưng khi đến nhiệt độ 700C thì hàm lượng này đã giảm đi đáng kể 4,388ab ± 0,95296 (mg/g), và lên tới 800C thì chỉ còn 4,257ab ± 0,37976 (mg/g). Chính vì thế nhiệt độ 600C là nhiệt độ thích hợp nhất cho quá trình trích ly. Kết quả này được ý giải là khi nhiệt độ tăng đến một mức nhất định có thể sẽ làm phân hủy những hợp chất sinh học mà chúng ta mong muốn.Ngoài ra nhiệt độ tăng còn gây thất thoát dung môi, làm thay đổi tỷ lệ dung môi : nguyên liệu đã tìm ra trong khảo sát trước đó, tăng chi phí cho quá trình trích ly mà không ai mong muốn. 3.1.5 Ảnh hưởng của thời gian Cũng như nhiệt độ, thời gian trích ly cũng gây ảnh hưởng đến hiệu suất quá trình trích ly cũng như khả năng chống oxi hóa của dịch chiết flavonoid. Bảng 3.5 Kết quả thí nghiệm khảo sát thời gian Thời gian (giờ) TFC(mgQE/g) TPC(mgGAE/g) ABTS(mgTEAC/g) 2 4,473b ± 1,391 7,450b ± 0,334 3,546b ± 0,071 2,5 5,771ab ± 0,803 8,072b ± 0,791 4,314b ± 0,09446 3 6,631a ± 0,075 9,384a ± 0,305 5,766a ± 0,50961 3,5 6,654a ± 0,100 9,240a ± 0,240 5,839a ± 0,52025 4 6,401a ± 0,092 9,179a ± 0,578 5,857a ± 0,60536 30
  40. TFC TPC ABTS 10 7 9 6 8 7 5 6 4 5 4 3 TEAC (mg/g) TEAC 3 2 TPC, TFC (mg/g) TFC TPC, 2 1 1 0 0 2 giờ 2,5 giờ 3 giờ 3,5 giờ 4 giờ Thời gian Hình 3.5 Ảnh hưởng của thời gian trích ly Thời gian trích ly càng dài thì hàm lượng các chất càng tăng. Trong khảo sát này, dựa vào biểu đồ 3.5 và bảng 3.5 ta thấy hàm lượng TFC, ABTS tăng khi tăng thời gian từ 2giờ đến 3 giờ. Trong khoảng thời gian từ 3 giờ – 4 giờ hàm lượng TFC, TPC, TEAC có chênh lệch. Cụ thể TFC ở 3,5 giờ đạt 6,654a ± 0,100 mg/g đến 4 giờ giảm xuống còn 6,401a ± 0,092 mg/g, tương tự TPC ở 3 giờ đạt 9,240a ± 0,240 mg/g đến 4 giờ cũng giảm còn 9,179a ± 0,578, riêng TEAC ở 3 giờ đạt 5,839a ± 0,52025 mg/g đến 4 giờ vẫn tăng lên đạt giá trị 5,857a ± 0,60536 mg/g. Tuy nhiên như ta thấy thì sự chênh lệch này không đáng kể. Trong quá trình trích ly thời gian trích ly quá ngắn sẽ không bảo đảm được hiệu suất tách chiết các hợp chất chống oxi hóa. Ngược lại, nếu thời trích ly quá dài sẽ làm tăng khả năng phân hủy các chất. Ngoài ra thời gian quá dài cũng làm thất thoát lượng dung môi dẫn đến sai số cũng như tốn kém về mặt kinh tế. Vì thế ta chọn thời gian là 3 giờ cho quá trình trích ly. 3.2 Tối ưu quá trình trích ly flavonoid từ củ cải trắng bằng phương pháp bề mặt đáp ứng SRM Quá trình trích ly chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố tỉ lệ dung môi và nguyên liệu,nhiệt độ, thời gian, loại dung môi, nồng độ dung môi sử dụng. Các yếu tố khi kết hợp với nhau lại có tác động ít hay nhiều theo từng mức độ khác nhau, do vậy tối ưu quá trình sẽ giúp tìm ra điều kiện tối ưu khi có sự tương tác của các yếu tố. Các thí nghiệm trong mục 3.1 chỉ khảo sát đơn biến theo các hàm mục tiêu khác 31
  41. nhau. Trong phạm vi cho phép (về thời gian). chúng tôi tiến hành thực nghiệm tối ưu các thông số của quá trình trích ly đến hàm mục tiêu là lượng flavonoid tổng trong dịch chiết củ cải trắng và theo hướng hàm mục tiêu đạt cực đại. Chúng tôi chọn ra 3 yếu tố khảo sát của quá trình tối ưu như sau: Tỉ lệ nguyên liệu và dung môi (g/ml): X1. 0 Nhiệt độ ( C): X2 . Thời gian (phút): X3. Hàm mục tiêu Y là lượng flavonoid tổng trong dịch chiết (mg Quercetin/g) Từ kết quả của các thí nghiệm trước, chúng tôi chọn được giá trị tại tâm (mức cơ sở) và các mức trên và dưới ở bảng 3.6. Bảng 3.6 Các yếu tố dùng trong SRM Mức dưới Mức cơ Mức trên (-1) sở (0) (1) Tỉ lệ nguyên liệu và dung môi (g/ml) X1 1/25 1/30 1/35 0 Nhiệt độ ( C) X2 55 60 65 Thời gian (phút) X3 165 180 195 Bảng 3.7 Kế hoạch thực nghiệm và kết quả theo RSM để tối ưu TFC Thời Công Thời Công STT Tỉ lệ Tỉ lệ TFC gian suất gian suất 1 -1 -1 -1 25 55 165 5.935 2 1 -1 -1 35 55 165 6.461 3 -1 1 -1 25 65 165 6.01 4 1 1 -1 35 65 165 6.987 5 -1 -1 1 25 55 195 6.085 6 1 -1 1 35 55 195 6.611 7 -1 1 1 25 65 195 6.386 8 1 1 1 35 65 195 7.137 9 -1,682 0 0 21.59 60 180 5.785 10 1,682 0 0 38.41 60 180 7.137 11 0 -1,682 0 30 51.59 180 5.935 32
  42. 12 0 1,682 0 30 68.41 180 7.137 13 0 0 -1,682 30 60 154.77 6.611 14 0 0 1,682 30 60 205.23 7.588 15 0 0 0 30 60 180 8.715 16 0 0 0 30 60 180 7.738 17 0 0 0 30 60 180 7.813 Mô hình toàn phương bậc 2 đã được xác định bằng phương pháp hồi quy đa biến.thu được như sau: 2 2 2 Y = 8,099 + 0,370X1 + 0,253X2– 0,612X1 –0,585X2 – 0,386X3 Bảng 3.8 Phân tích phương sai của mô hình hồi quy TFC DF SS MS F p SD (variance) Total 17 803.075 47.2397 Constant 1 792.499 792.499 Total Corrected 16 10.5764 0.661026 0.813035 Regression 9 9.66177 1.07353 8.21595 0.006 1.03611 Residual 7 0.914649 0.130664 0.361475 Lack of Fit 5 0.323396 0.064679 0.218787 0.926 0.254321 (Model Error) Pure Error 2 0.591253 0.295626 0.543715 (Replicate Error) Cond. no. N = 17 Q2 = 0.642 = 4.9932 DF = 7 R2 = 0.914 Y-miss = 0 R2 Adj. = 0.802 RSD = 0.3615 Kiểm tra khả năng giải thích số liệu và dự đoán của mô hình dựa vào các hệ số R2 và Q2 một mô hình hồi quy tốt và có khả năng dự đoán chính xác từ số liệu thực nghiệm khi Q2 >0,5 và R2 >0,8 và |R2– Q2| nằm trong khoảng 0,2 đến 0,3 [38]. Từ bảng 3.8 ta được R2 = 0,914 và Q2 = 0,642 thỏa mãn điều kiện vừa nêu. Vì vậy 33
  43. phương trình hồi quy tương thích với số liệu thực nghiệm thu thập được. Tiến hành tối ưu hóa bằng phần mềm Modde5, chúng tôi thu được kết quả như sau: TFC thu nhận được là 8,209 mg/g tại điều kiện tối ưu là: tỉ lệ nguyên liệu: dung môi là 1:32 (g/ml), thời gian 183 phút, nhiệt độ 610C. Mô hình bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát lên hàm lượng flavonoid tổng thu được trong dịch trích ly được mô phỏng trên hình 3.6 và 3.7. Chúng tôi tiến hành thực hiện thí nghiệm kiểm tra theo các thông số tối ưu hóa thì thu nhận được TFC thực nghiệm là: 8,115 mg/g, kết quả này sai số không quá 5% so với dự đoán của mô hình. Hình 3.6 Mô hình bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi và nhiệt độ đến TFC 34
  44. Hình 3.7 Mô hình bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi, nhiệt độ và thời gian trích ly đến TFC 35
  45. CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Sau quá trình khảo sát trích ly để thu nhậndịch chiết giàu hoạt tính chống oxy hóa từ bột củ cải trắng (Raphanus sativus L.), chúngtôi thu được các kết quả sau: Điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly là: Dung môi sử dụng: ethanol Nồng độ dung môi: ethanol 750 Tỷ lệ dung môi : nguyên liệu : 1:30 (g/ml) Nhiệt độ trích ly: 600C Thời gian trích ly: 3 giờ Mô hình toàn phương bậc 2 đã được xác định bằng phương pháp hồi quy đa biến. thu được như sau: 2 2 2 Y = 8,099 + 0,370X1 + 0,253X2 – 0,612X1 – 0,585X2 – 0,386X3 Hàm lượng TFC thu nhận được thực nghiệm là: 8,115 mg/g TFC thu nhận được là 8,209 mg/g tại điều kiện tối ưu là: tỉ lệ nguyên liệu: dung môi là 1:32 (g/ml), thời gian 183 phút, nhiệt độ 610C. 4.2 Kiến nghị Quá trình nghiên cứu này được thực hiện trong quy mô phòng thí nghiệm và với thời gian hạn chế. Do đó, chúng em xin đưa ra một số kiến nghị như sau: Nên nghiên cứu sử dụng thêm các các phương pháp khác như: sử dụng các loại enzyme, dùng sóng siêu âm hay vi sóng, để quá trình trích ly hợp chất flavonoid trong củ cải trắng đạt hiệu quả cao hơn nữa. Đánh giá hoạt tính sinh học của hợp chất flavonoid đã tách chiết từ củ cải trắng. Định danh một số hợp chất khác trong củ cải trắng để đánh giá khả năng dược liệu của cây này. 36
  46. Tài liệu tham khảo 1. Dương Thị Phượng Liên, Phan Thị Bích Trâm và Hà Thanh Toàn, ảnh hưởng quá trình trích ly đến hàm lượng polyphenol và khả năng chống oxy hóa từ đậu nành, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 2014 2. Nguyễn Minh Thắng, Polyphenol và hoạt đọ ức chế một số serine proteinase từ thân, hạt gỗ vang (caesalpinia sappan l.) và một số cây thuốc khác, luận văn thạc sĩ khoa học, đại học quốc gia Hà Nội 2009. 3. Lại Thị Ngọc Hà và Vũ Thị Thư, Stress oxi hóa và các chất chống oxi hóa tự nhiên, tạp chí khoa học và phát triển 2009 4. Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB y học 2004 5. Dương Thị Phương Liên, Phan Thị Bích Trâm và Hà Thanh Toàn, Ảnh hưởng quá trình trích ly đến hàm lượng polyphenol và khả năng chống oxi hóa từ đậu nành, Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ 2014 6. Nguyễn Thu Hằng, Bài giảng dược liệu chứa flavonoid 7. Nguyễn Khắc Quỳnh Chi, Nguyễn Tuấn Dũng, Chiết xuất dược liệu, NXB Đại học Y dược, TP.Hồ Chí Minh 8. Phụng, N.K.P., Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ. 2007: NXB ĐH quốc gia Tp.HCM. 9. Thu, N.V. and T. Hùng, Dược liệu học. 2011, Nhà xuất bản Y học, Bộ Y tế. 10. Hà, L.T.N. and V.T. Thư, Stress oxi hóa và các chất chống oxi hóa tự nhiên. tạp chí Khoa học và Phát triển 2013, 2009. 7(5): p. 667-677. 11. Dai, J. and R.J. Mumper, Plant Phenolics: Extraction, Analysis and Their Antioxidant and Anticancer Properties. Molecules 2010. 15: p. 7313-7352. 12. Gulcin, Antioxidant activity of food constituents: an overview. Arch Toxicol, 2012. 86: p. 345–391. 13. J.B. Harborne and C.A. Williams, review: Advances in flavonoid research since 1992. Phytochemistry, 2000. 55: p. 481 -504. 14. Özçelik, B., et al., Antimicrobial Activity of Flavonoids against Extended- Spectrum β-Lactamase (ESβL)-Producing Klebsiella pneumonia. Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 2008. 7(4): p. 1151-1157. 37
  47. 15. Segovia, R.G., et al., Effect of the flavonoid quercetin on inflammation and lipid peroxidation induced by Helicobacter pylori in gastric mucosa of guinea pig. J. Gastroenterol 2008. 43: p. 441-447. 16. Nishioka, T., et al., Baicalein, an α-glucosidase inhibitor from Scutellaria baicalemis II. Journal of Natural Products, 1998. 61: p. 1413-1415. 17. Susanti, D., et al., Antioxidant and cytotoxic flavonoids from the flowers of Melastoma malabathricum L. Food Chemistry, 2007. 103: p. 710-716. 18. Harborn, J.B., “Biochermistry of phenolic compounds”, Academic press, London and New york, 1964. 19. Sanaa T. El-Sayed, Purification and characterization of Raphanin, a neutral protease,from raphanus sativus leaves, Pakistan journal of Biological sciences, 4, pp.564-568, 2001. 20. Perry, M.L.,Medicinal Plants of East and Southeast Asia, MIT Press, Cambridge, 1980. 21. A. Lugasi & J. Hovari, Flavonoid aglycons in foods of plant origin . I. Vegetables,Acta Aliment, vol. 29, pp. 345-352, 2000. 22. Consolacion Y. Ragasaa, Ma. Carmen S. Tanb, Marissa G. Noelb and Chien- Chang Shenc, Isothiocyanates, sterol and triglycerides from Raphanus sativus,Der PharmaciaLettre, vol.17, pp. 293-296, 2015. 23. Consolacion Y. Ragasaa, Ma. Carmen S. Tanb, Marissa G. Noelb and Chien- ChangShenc, Isothiocyanates, sterol and triglycerides from Raphanus sativus, Der PharmaciaLettre, vol.17, pp. 293-296, 2015. 24. Kerry Hosmer Caffall and Debra Mohnen, The structure, function, and biosynthesis ofplant cell wall pectic polysaccharides, Carbohydrate Research, vol.344, pp.1879-1900, 2009. 25. Zhang Y., Li S.F., .Wu X.W., 2008. Pressurized liquid extraction of flavonoid from Houttuynia cordata Thunb. Separation and Purification Technology, 58: 305-310. 26. Meejung Ahn Taekyun Shin, Gi Ok Kim, Sang Un Park, Biological activity of variousradish species, Orient Pharm Exp Med, vol. 15, pp. 105-111, 2015. 27. Yeung, H.C.Handbook of Chinese Herbs and Formulas, Institute of Chinese Medicine, Los Angeles, 1985. 38
  48. 28. M. Pieroth, D. Strack, H. Scharf & V. Sharma, Tissue distribution of phenylpropanoidmetabolism in cotyledons of Raphanus sativus L, Planta, pp. 507-511, 1985. 29. Rosa Martha Perez Gutierrez and Rosalinda L Perez, Raphanus sativus (Radish):Their Chemistry and Biology, The Scientific Word journal, vol. 4, pp. 811-837, 2004 30. Ghasemzadeh, A., et al., Flavonoid compounds and their antioxidant activity in extract of some tropical plants. Journal of Medicinal Plants Research 2012. 6(13): p. 2639-2643. 31. Shin, T., et al., Biological activity of various radish species. Orient Pharm Exp Med 2015. 15: p. 105-111. 32. Singh, P. and J. singh, Medicinal and therapeutic utilities of Raphanus sativus. Internationa Journal of plant, animal and environmental sciences, 2013. 3(2): p. 103-105. 33. Jahan, M.G.S., et al., Correlation between â-amylase activity and starch content in different cultivars of radish (Raphanus sativus L.). Biotechnology, 2014. 9(7): p. 298-302. 34. Jahan, M.G.S., et al., Screening of some enzyme and nutrients in radish (Raphanus sativus L.) root. Philiip. J. Anim. Sci., 2011. 37: p. 89-100. 35. Hồng T.T, et al., Nghiên cứu phương pháp sử dụng enzyme peroxidase tách chiết từ củ cải trắng để xác định hàm lượng thủy ngân trong nước ô nhiễm. Tạp chí Khoa học ĐH Quốc gia Hà Nội, Khoa học Tự nhiên & Công nghệ, 2008. 24: p. 23-27. 36. El-sayed, S.T., Purification and characterization of Raphanin, a neutral protease, from raphanus sativus leaves. Pakistan journal of Biological sciences, 2001. 4(5): p. 564-568. 37. Strack, D., et al., Tissue distribution of phenylpropanoid metabolism in cotyledons of Raphanus sativus L. Planta, 1985. 164(507-511). 38. 39. 39
  49. PHỤ LỤC Kết quả xử lý ANOVA cho các thí nghiệm 1. Khảo sát dung môi trích ly Kết quả phân tích anova cho TPC thu được giữa khi thay đổi loại dung môi Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 91.1199 3 30.3733 82.28 0.0000 groups Within groups 2.95317 8 0.369146 Total (Corr.) 94.073 11 So sánh sự khác biệt giữa các loại dung môi cho TPC DM phe Count Mean Homogeneous Groups chlorofom 3 0.261117 X etylacetat 3 1.46391 X methanol 3 5.80265 X con 90 3 6.73296 X Kết quả phân tích anova cho TFC thu được giữa khi thay đổi loại dung môi Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 26.276 3 8.75868 4.11 0.0488 groups Within groups 17.0493 8 2.13117 Total (Corr.) 43.3254 11 40
  50. So sánh sự khác biệt giữa các loại dung môi cho TFC DM fla Count Mean Homogeneous Groups chlorofom 3 0.157987 X etylacetat 3 1.08333 X methanol 3 2.85128 XX con 90 3 3.94966 X Kết quả phân tích anova cho ABTS thu được giữa khi thay đổi loại dung môi Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 19.2473 3 6.41578 129.72 0.0000 groups Within groups 0.395654 8 0.0494567 Total (Corr.) 19.643 11 So sánh sự khác biệt giữa các loại dung môi cho ABTS DM ABTS Count Mean Homogeneous Groups chlorofom 3 0.63482 X etylacetat 3 1.77403 X con 90 3 3.28704 X methanol 3 3.85664 X 41
  51. 2. Khảo sát nồng độ trích ly Kết quả phân tích ANOVA cho TPC thu được khi thay đổi nồng độ Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 10.4127 4 2.60317 45.49 0.0000 groups Within groups 0.572228 10 0.0572228 Total (Corr.) 10.9849 14 So sánh sự khác biệt giữa các nồng độ cho TPC Ndo phe Count Mean Homogeneous Groups 0 3 5.52877 X 25 3 6.12114 X 100 3 6.43513 X 50 3 7.05987 X 75 3 7.96298 X Kết quả phân tích ANOVA cho TFC thu được khi thay đổi nồng độ Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 9.64869 4 2.41217 7.25 0.0052 groups Within groups 3.3272 10 0.33272 Total (Corr.) 12.9759 14 42
  52. So sánh sự khác biệt giữa các nồng độ cho TFC NDo fla Count Mean Homogeneous Groups 0 3 2.66707 X 50 3 2.93003 XX 25 3 3.08027 XX 100 3 3.83157 X 75 3 4.8834 X Kết quả phân tích ANOVA cho ABTS thu được khi thay đổi nồng độ Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 9.26539 4 2.31635 8.95 0.0024 groups Within groups 2.58787 10 0.258787 Total (Corr.) 11.8533 14 So sánh sự khác biệt giữa các nồng độ cho ABTS Ndo abts Count Mean Homogeneous Groups 0 3 1.98733 X 25 3 2.26367 X 50 3 2.455 XX 100 3 3.287 XX 75 3 4.137 X 43
  53. 3. Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu và dung môi Kết quả phân tích anova cho TPC thu được giữa khi thay đổi tỉ lệ nguyên liệu dung môi Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 3.48394 3 1.16131 6.14 0.0180 groups Within groups 1.5141 8 0.189262 Total (Corr.) 4.99804 11 So sánh sự khác biệt giữa tỉ lệ nguyên liệu:dung môi cho TPC TL phe Count Mean Homogeneous Groups 1:10 3 7.09918 X 1:20 3 7.40179 X 1:30 3 8.29441 X 1:40 3 8.31865 X Kết quả phân tích anova cho TFC thu được giữa khi thay đổi tỉ lệ nguyên liệu:dung môi Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 6.79135 3 2.26378 14.36 0.0014 groups Within groups 1.26159 8 0.157699 Total (Corr.) 8.05294 11 44
  54. So sánh sự khác biệt giữa tỉ lệ nguyên liệu:dung môi cho TFC TL fla Count Mean Homogeneous Groups 1:10 3 3.26137 X 1:20 3 4.12537 X 1:40 3 5.06727 X 1:30 3 5.0694 X Kết quả phân tích anova cho ABTS thu được giữa khi thay đổi tỉ lệ nguyên liệu:dung môi Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 16.7498 3 5.58326 12.53 0.0022 groups Within groups 3.56416 8 0.44552 Total (Corr.) 20.3139 11 So sánh sự khác biệt giữa tỉ lệ nguyên liệu:dung môi cho ABTS TL AB Count Mean Homogeneous Groups 1:10 3 149.165 X 1:20 3 184.49 X 1:40 3 260.634 X 1:30 3 311.37 X 45
  55. 4. Khảo sát nhiệt độ trích ly Kết quả phân tích anova cho TPC thu được giữa khi thay đổi nhiệt độ Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 5.31902 4 1.32975 6.24 0.0088 groups Within groups 2.13248 10 0.213248 Total (Corr.) 7.45149 14 So sánh sự khác biệt giữa nhiệt độ cho TPC ND phe Count Mean Homogeneous Groups 40 3 7.73168 X 50 3 8.23247 X 60 3 9.11556 X 80 3 9.17019 X 70 3 9.17348 X Kết quả phân tích anova cho TFC thu được giữa khi thay đổi nhiệt độ Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 10.11 4 2.5275 4.86 0.0195 groups Within groups 5.20596 10 0.520596 Total (Corr.) 15.316 14 46
  56. So sánh sự khác biệt giữa nhiệt độ cho TFC TG fla Count Mean Homogeneous Groups 2h 3 4.473 X 2.5h 3 5.771 XX 3h 3 6.40067 X 3.5h 3 6.63167 X 4h 3 6.65367 X Kết quả phân tích anova cho ABTS thu được giữa khi thay đổi nhiệt độ Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 13.8121 4 3.45302 18.97 0.0001 groups Within groups 1.82054 10 0.182054 Total (Corr.) 15.6326 14 So sánh sự khác biệt giữa nhiệt độ cho ABTS TG abts Count Mean Homogeneous Groups 2h 3 3.54633 X 2.5h 3 4.31433 X 3h 3 5.76633 X 3.5h 3 5.83833 X 4h 3 5.86767 X 47
  57. 5. Khảo sát thời gian trích ly Kết quả phân tích anova cho TFC thu được giữa khi thay đổi thời gian Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 10.11 4 2.5275 4.86 0.0195 groups Within groups 5.20596 10 0.520596 Total (Corr.) 15.316 14 So sánh sự khác biệt giữa thời gian cho TFC TG fla Count Mean Homogeneous Groups 2h 3 4.473 X 2.5h 3 5.771 XX 3h 3 6.40067 X 3.5h 3 6.63167 X 4h 3 6.65367 X Kết quả phân tích anova cho TPC thu được giữa khi thay đổi thời gian Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 8.81666 4 2.20417 8.97 0.0024 groups Within groups 2.45657 10 0.245657 Total (Corr.) 11.2732 14 48
  58. So sánh sự khác biệt giữa thời gian cho TPC TG phe Count Mean Homogeneous Groups 2h 3 7.45033 X 2.5h 3 8.072 X 3h 3 9.17867 X 3.5h 3 9.24033 X 4h 3 9.384 X Kết quả phân tích anova cho ABTS thu được giữa khi thay đổi thời gian Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 13.8121 4 3.45302 18.97 0.0001 groups Within groups 1.82054 10 0.182054 Total (Corr.) 15.6326 14 So sánh sự khác biệt giữa thời gian cho ABTS TG abts Count Mean Homogeneous Groups 2h 3 3.54633 X 2.5h 3 4.31433 X 3h 3 5.76633 X 3.5h 3 5.83833 X 4h 3 5.86767 X 49