›

Khóa luận Nghiên cứu quy trình xác định đồng thời Auramine O và Rhodamine B trong một số mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối detector tử ngoại khả kiến

pdf 79 trang thiennha21 16/04/2022 4270
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu quy trình xác định đồng thời Auramine O và Rhodamine B trong một số mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối detector tử ngoại khả kiến", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_nghien_cuu_quy_trinh_xac_dinh_dong_thoi_auramine_o.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu quy trình xác định đồng thời Auramine O và Rhodamine B trong một số mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối detector tử ngoại khả kiến

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC NGUYỄN THANH THƠI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI AURAMINE O VÀ RHODAMINE B TRONG MỘT SỐ MẪU THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KẾT NỐI DETECTOR TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN CỬ NHÂN NGÀNH SƯ PHẠM HÓA HỌC TP. HỒ CHÍ MINH - THÁNG 05/2018
  2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC NGUYỄN THANH THƠI – 40.201.091 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI AURAMINE O VÀ RHODAMINE B TRONG MỘT SỐ MẪU THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KẾT NỐI DETECTOR TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN CỬ NHÂN NGÀNH SƯ PHẠM HÓA HỌC GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN: ThS. HUỲNH THỊ NHÀN ThS. NGUYỄN THỊ TUYẾT NHUNG TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2018 i
  3. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐHSP TP. HCM Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc TP. HCM, ngày 05 tháng 05 năm 2018 NHẬN XÉT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên khóa luận: NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI AURAMINE O VÀ RHODAMINE B TRONG MỘT SỐ MẪU THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KẾT NỐI DETECTOR TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN Sinh viên thực hiện: Cán bộ phản biện: Nguyễn Thanh Thơi 40.201.091 ThS. Phan Thị Hoàng Yến Đánh giá Khóa luận 1. Về cuốn báo cáo: Số trang ___ Số chương ___ Số bảng số liệu ___ Số hình vẽ ___ Số tài liệu tham khảo ___ Sản phẩm ___ 2. Nhận xét của chủ tịch hội đồng: Điểm khóa luận: Nguyễn Thanh Thơi: /10 Chủ tịch Hội đồng ii
  4. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐHSP TP.HCM Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI AURAMINE O VÀ RHODAMINE B TRONG MỘT SỐ MẪU THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KẾT NỐI DETECTOR TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN Cán bộ hướng dẫn: ThS. HUỲNH THỊ NHÀN ThS. NGUYỄN THỊ TUYẾT NHUNG Thời gian thực hiện: Từ tháng 7/2017 đến tháng 5/2018. Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THANH THƠI – 40201091 Nội dung đề tài: . Mục tiêu: Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích đồng thời Auramine O và Rhodamine B trong một số mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối detector tử ngoại khả kiến. Sử dụng quy trình đề xuất phân tích một số mẫu thực tế. . Phạm vi: Phân tích trên nền một số mẫu thực phẩm (cải chua, măng, thịt gà). . Phương pháp: Sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối detector tử ngoại khả kiến. . Kết quả mong đợi của đề tài: Nghiên cứu đề xuất điều kiện HPLC tối ưu để phân tích đồng thời Auramine O và Rhodamine B, đề xuất được quy trình xử lý một số mẫu thực phẩm và phân tích trên một số nền mẫu thực tế. TP. HCM, ngày 05/05/2018 Sinh viên iii
  5. LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến cô Nguyễn Thị Tuyết Nhung và cô Huỳnh Thị Nhàn đã hướng dẫn em tận tình, hỗ trợ và giúp đỡ em từ những ngày đầu thực hiện đến khi hoàn thành đề tài: “Nghiên cứu quy trình xác định Auramine O và Rhodamine B trong một số mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối detector tử ngoại khả kiến”. Em xin gửi lời cảm ơn đến Trung tâm Khoa học Công nghệ Dược Sài Gòn (Sapharcen), cô Lê Thị Hồng Vân (giảng viên Bộ môn Dược liệu, Khoa Dược – Trường Đại học Y dược Thành Phố Hồ Chí Minh), thầy Huỳnh Lời, anh Lê Văn Huấn đã hỗ trợ và hướng dẫn em sử dụng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối detector PDA và cho em những lời khuyên bổ ích trong quá trình thực hiện đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy Nguyễn Thành Lộc, thầy Trần Bửu Đăng, cô Văn Thị Cẩm Duyên, cô Phạm Thị Thảo Uyên, thầy Võ Công Minh, thầy Nguyễn Ngọc Hưng đã giúp đỡ em trong quá trình tiến hành thực nghiệm và các thầy cô Khoa Hóa – trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã truyền cho em những kiến thức quý báu trong những năm tháng em học ở trường. Cuối cùng, em gửi lời cảm ơn đến gia đình, anh chị, bạn bè và tất cả những người luôn ở bên cạnh em, động viên, ủng hộ, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài này. Đặc biệt, em muốn cảm ơn bạn Phan Thị Ngọc Trinh đã cùng em thực hiện đề tài. Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 05 năm 2018 Nguyễn Thanh Thơi iv
  6. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU AOAC (Assosiation of Official Analytical Chemists): Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thức. PDA (Photodiode array): Đầu dò diode quang. LC-MS (Liquid chromatography mass spectrometry): Sắc ký lỏng khối phổ. HPLC (High performance liquid chromatography): Sắc ký lỏng hiệu năng cao. ICH (International Conference on Harmonization): Hội nghị quốc tế về hài hòa hóa. ISO (International Organization for Standardization): Tổ chức Quốc tế về tiêu chuẩn hóa. LOD (Limit of Detection): Giới hạn phát hiện. LOQ (Limit of Quantitation): Giới hạn định lượng. S (Signal to noise ratio): Tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu. N TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam. STT: Số thứ tự. AO: Auramine O. RB: Rhodamine B. v
  7. DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Phân loại sắc ký theo pha tĩnh 9 Bảng 2.1. Danh mục chất chuẩn 18 Bảng 2.2. Danh mục dung môi tinh khiết chuyên dùng cho HPLC 18 Bảng 2.3. Danh mục hóa chất tinh khiết 19 Bảng 2.4. Thông số thẩm định phương pháp không tiêu chuẩn ICH, USP, FDA 24 Bảng 2.5. Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC) 28 Bảng 2.6. Lấy mẫu và thông tin mẫu 28 Bảng 3.1. Kết quả bước sóng và độ hấp thụ cực đại của các chất phân tích trong MeOH và trong ACN 32 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát dung môi pha động 33 Bảng 3.3. Khảo sát các giá trị pH sử dụng acid acetic 33 Bảng 3.4. Khảo sát pH = 3 sử dụng acid formic 34 Bảng 3.5. Khảo sát pH = 2,3 và 2,6 sử dụng H3PO4 35 Bảng 3.6. Chương trình gradient khảo sát tốc độ dòng 37 Bảng 3.7. Khảo sát tỉ lệ dung môi ban đầu 39 Bảng 3.8. Chương trình gradient tối ưu 39 Bảng 3.9. Dữ liệu nồng độ và diện tích AO, RB thu được khi tiến hành chạy sắc ký 40 Bảng 3.10. Độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn 42 Bảng 3.11. Hệ số dung lượng và hệ số không đối xứng của AO 43 Bảng 3.12. Hệ số dung lượng và hệ số không đối xứng của RB 43 Bảng 3.13. Diện tích của các chất phân tích và giá trị B' tương ứng ở mỗi nồng độ 44 i Bảng 3.14. Bảng các giá trị Ftính của các chất phân tích 44 Bảng 3.15. Khảo sát độ lặp lại của phép đo 46 Bảng 3.16. Thể tích chiết và diện tích peak sắc ký 47 Bảng 3.17. Kết quả phân tích mẫu măng 49 Bảng 3.18. Hệ số thu hồi AO, RB của mẫu măng 49 Bảng 3.19. Kết quả phân tích mẫu cải chua 52 Bảng 3.20. Hệ số thu hồi AO, RB của mẫu cải chua 52 Bảng 3.21. Kết quả phân tích mẫu thịt gà 53 vi
  8. Bảng 3.22. Hệ số thu hồi AO và RB của mẫu thịt gà 53 vii
  9. DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Auramine O 3 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Rhodamine B 4 Hình 1.3. Minh họa a) quá trình sắc ký b) Sắc ký đồ 8 Hình 1.4. Hệ thống sắc ký khí 9 Hình 1.5. Hệ thống sắc ký lỏng 9 Hình 1.6. Hình ảnh minh họa sắc ký đồ 10 Hình 1.7. Hình ảnh minh họa peak sắc ký 10 Hình 1.8. Hình ảnh minh họa peak sắc ký theo phân bố Gauss 12 Hình 1.9. Hình ảnh minh họa cột sắc ký và các đĩa lý thuyết 13 Hình 1.10. Hình ảnh minh họa sự tách hai peak sắc ký 14 Hình 1.11. Hình ảnh minh họa sơ đồ hệ thống HPLC 15 Hình 2.1. Chương trình gradient pha động – Khảo sát chọn loại dung môi 21 Hình 2.2. Gradient pha động – Khảo sát pH 2,3 và 2,6 22 Hình 2.3. Hình ảnh minh họa xác định LOD bằng cách tính S 26 N Hình 2.4. Khảo sát thể tích dung môi chiết 29 Hình 3.1. Sắc đồ khảo sát pH = 3 sử dụng acid acetic 34 Hình 3.2. Sự phụ thuộc của hệ số không đối xứng theo pH 34 Hình 3.3. Sắc đồ khảo sát pH = 3,0 sử dụng acid formic 35 Hình 3.4. Sắc đồ khảo sát pH = 2,6 sử dụng acid phosphoric 35 Hình 3.5. Sắc đồ chạy đẳng dòng với dung môi MeOH – HCOOH (pH = 3) 36 Hình 3.6. Sắc đồ chạy đẳng dòng với dung môi ACN – HCOOH (pH = 3) 36 Hình 3.7. Sắc đồ chạy đẳng dòng với dung môi ACN – đệm acetate 37 Hình 3.8. Sắc đồ AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,6 mL/phút 37 Hình 3.9. Sắc đồ AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,7 mL/phút 38 Hình 3.10. Sắc đồ AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,85 mL/phút 38 Hình 3.11. Sắc đồ AO và RB ứng với tốc độ dòng 1 mL/phút 38 Hình 3.12. Quan hệ tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ Auramine O 41 Hình 3.13. Quan hệ tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ Rhodamine B 41 viii
  10. Hình 3.14. Sắc đồ xác định LOD của AO và RB ở nồng độ 0,02 ppm 45 Hình 3.15. Sắc đồ xác định LOQ của AO và RB ở nồng độ 0,05 ppm 46 Hình 3.16. Sự phụ thuộc của diện tích peak vào các lần chiết AO (a) và RB (b) 47 Hình 3.17. Quy trình xử lý mẫu tối ưu 48 Hình 3.18. Các sắc ký đồ phân tích mẫu măng 50 Hình 3.19. Bước sóng ứng với hấp thụ cực đại của AO 51 Hình 3.20. Bước sóng ứng với hấp thụ cực đại của RB 51 ix
  11. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU v DANH MỤC BẢNG BIỂU vi MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Auramine O 3 1.1.1. Cấu tạo 3 1.1.3. Ứng dụng 3 1.1.4. Độc tính 3 1.2. Rhodamine B 4 1.2.1. Cấu tạo 4 1.2.2. Tính chất 4 1.2.3. Ứng dụng 5 1.2.4. Độc tính 5 1.4. Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký 7 1.4.1. Khái niệm sắc ký 7 1.4.2. Phân loại 8 1.4.3. Lý thuyết về sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 9 1.5. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 14 1.5.1. Bình chứa pha động 15 1.5.2. Bộ phận khử khí 15 1.5.3. Bơm cao áp 16 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 18 2.1. Hóa chất và dụng cụ 18 2.1.1. Hóa chất 18 2.1.1.1. Chất chuẩn 18 2.1.1.2. Dung môi 18 2.1.1.3. Các hóa chất khác 19 2.1.2. Trang thiết bị và dụng cụ phục vụ nghiên cứu 19 x
  12. 2.1.2.1. Trang thiết bị 19 2.1.2.2. Dụng cụ 20 2.2. Nội dung nghiên cứu 20 2.2.1. Khảo sát các điều kiện tối ưu cho hệ thống HPLC 20 2.2.1.1. Khoảng bước sóng của detector PDA 20 2.2.1.2. Thăm dò thứ tự tách các chất phân tích trên cột sắc ký pha đảo C18 20 2.2.2. Tối ưu hóa pha động 21 2.2.2.1. Khảo sát dung môi pha động 21 2.2.2.2. Khảo sát pH 22 2.2.2.3. Khảo sát chương trình hóa dung môi pha động 23 2.2.2.4. Tốc độ pha động 23 2.2.3. Thẩm định phương pháp 23 2.2.3.1. Tính đặc hiệu/chọn lọc 24 2.2.3.2. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 25 2.2.3.3. Giới hạn phát hiện 26 2.2.3.4. Giới hạn định lượng 27 2.2.3.5. Độ đúng 27 2.2.4. Quy trình xử lý mẫu thực phẩm 28 2.2.4.1. Lấy mẫu và bảo quản mẫu 28 2.2.4.2. Quy trình xử lý mẫu thực phẩm 29 2.2.5. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả 29 2.2.5.1. Xử lý kết quả dựa trên đường chuẩn 29 2.2.5.2. Xử lý thống kê các số liệu thực nghiệm 30 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1. Điều kiện phân tích HPLC 32 3.1.1. Bước sóng và độ hấp thụ cực đại của các chất phân tích trong các dung môi 32 3.1.2. Tối ưu hóa pha động 32 3.1.2.1. Khảo sát dung môi pha động 32 3.1.2.2. Khảo sát pH pha động 33 3.1.2.3. Khảo sát chương trình dung môi pha động với chế độ đẳng dòng 36 xi
  13. 3.1.2.3. Khảo sát tốc độ dòng 37 3.2. Thẩm định phương pháp 40 3.2.1. Tính đặc hiệu/chọn lọc 40 3.2.2.1. Xây dựng đường chuẩn của AO và RB 40 3.2.2.2. Độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn 42 3.2.2.3. Hệ số dung lượng và hệ số không đối xứng 42 3.2.2.4. Kiểm tra sai số hệ thống của phương pháp 43 3.2.3. Giới hạn phát hiện 44 3.2.4. Giới hạn định lượng 45 3.2.5. Khảo sát độ lặp lại của phép đo 46 3.3. Ứng dụng quy trình phân tích mẫu thực tế 47 3.3.1. Quy trình chiết mẫu 47 3.3.2. Mẫu măng 48 3.3.2.1. Phân tích mẫu măng và xác định hệ số thu hồi 48 3.3.2.2. Tính chọn lọc AO và RB đối với phân tích mẫu măng 50 3.3.3. Mẫu cải chua 51 3.3.3.1. Phân tích cải chua và xác định hệ số thu hồi 51 3.3.3.2. Tính chọn lọc AO và RB đối với phân tích mẫu cải chua 52 3.3.4. Mẫu thịt gà 53 3.3.4.1. Phân tích mẫu gà và xác định hệ số thu hồi 53 3.3.4.2. Tính chọn lọc AO và RB đối với phân tích mẫu thịt gà 53 3.3.5. Kết quả khảo sát mẫu thực tế 54 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 4.1. Kết luận 55 4.2. Kiến nghị 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC 60 xii
  14. MỞ ĐẦU Ngày nay, vấn đề an toàn thực phẩm là một trong những vấn đề thời sự của xã hội và mang tính chất toàn cầu. Thực phẩm trên thị trường rất đa dạng và có nhiều nguồn gốc khác nhau (thực phẩm trong nước, thực phẩm được nhập khẩu từ nhiều nước khác trên thế giới). Trong thực phẩm, ngoài các thành phần tự nhiên có sẵn thì người cung ứng thường bổ sung thêm các chất gọi là phụ gia thực phẩm để bảo quản hoặc tạo màu sắc sản phẩm. Tuy nhiên, một số cá nhân, tổ chức vì lợi nhuận kinh tế hoặc do hiểu biết còn hạn chế đã thêm những chất không được phép vào thực phẩm gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe của người tiêu dùng. Trong những năm gần đây, vấn nạn thực phẩm nhiễm Auramine O và Rhodamine B được phát hiện ngày càng nhiều, không chỉ xảy ra ở Việt Nam mà còn một số quốc gia khác trên thế giới, chẳng hạn như Trung Quốc. Auramine O và Rhodamine B là các chất được sử dụng chủ yếu trong công nghiệp nhuộm. Phân tử của các chất này chứa nhiều hệ liên hợp, trong đó có vòng benzene. Khi ăn phải các thực phẩm nhiễm Auramine O hoặc Rhodamine B dù với hàm lượng lớn hay nhỏ đều gây ra những biến đổi không tốt đối với cơ thể và có thể để lại những hậu quả lâu dài. Vì thế, yêu cầu phân tích định tính và định lượng hai chất này trong thực phẩm đang rất được quan tâm. Trong nước, số lượng tác giả nghiên cứu phân tích đồng thời Auramine O và Rhodamine B trong thực phầm hầu như chưa có. Các đề tài phân tích riêng rẽ Rhodamine B và đặc biệt là Auramine O còn rất hạn chế mặc dù các chất màu này đã được nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu. Qua những tài liệu, những bài báo đã công bố trên các tạp chí uy tín, chúng tôi thấy rằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp tốt để định tính và định lượng hai thành phần này trong các mẫu thực phẩm. Vì vậy, dựa trên thực tế đó cùng với những trang thiết bị hiện đại và cơ sở vật chất vốn có của phòng thí nghiệm Bộ môn Hóa Phân Tích – trường Đại học Sư phạm Thành Phố Hồ Chí Minh và Trung tâm khoa học Công nghệ Dược Sài Gòn (Sapharcen) – trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu quy trình xác định đồng thời Auramine O và Rhodamine B trong một số mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối detector tử ngoại khả kiến”. 1
  15. Đề tài này nhằm mục đích nghiên cứu xây dựng một phương pháp xác định đồng thời hai chất màu này trong thực phẩm và tiến hành phân tích trên một số mẫu thực tế. 2
  16. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Auramine O Auramine O (Vàng ô) là tên gọi thương mại của chất thuộc phân nhóm ketoimine[2]. 1.1.1. Cấu tạo Tên IUPAC: bis[4-(dimethylamin)phenyl]methanimium chloride Tên khác: Basic yellow 2, pyocatanium auremine, pyoktanin yellow, canary yellow, pyoktanin, C.I Công thức phân tử: C17H22N3Cl Khối lượng mol: 303,84 gam/mol Công thức cấu tạo: NH.HCl N N Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Auramine O Ở điều kiện thường, Auramine O là tinh thể hình kim vàng[2]. Auramine O tan tốt trong nước, ethanol[2] và một số dung môi hữu cơ khác. Điểm nóng chảy: 267oC (513oF và 540K) pKa: 9,8 và 10,7 [19][20][21] Bước sóng hấp thụ ( max ) cực đại: 370 nm và 435 nm Bước sóng phát xạ: 550nm 1.1.3. Ứng dụng Auramine O là chất nhuộm hữu cơ, được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp nhuộm vải, gỗ, giấy, . [2]. 1.1.4. Độc tính Theo Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế của Tổ chức y tế thế giới (WHO/IARC), chất vàng ô là chất đứng hàng thứ 5 trong 116 chất có khả năng gây ung thư hàng đầu trên thế giới. Khi thí nghiệm trên động vật sống, Auramine O được báo cáo là gây tổn thương DNA trong tế bào gan, thận và tủy xương. Sau khi thực hiện thí nghiệm DNA nhiễm Auramine O của dòng tế bào người trong ống nghiệm thì các nhà khoa học phát hiện rằng DNA bị hư hại nghiêm trọng. 3
  17. Auramine O dễ tan trong nước, ethanol. Nó là một loại thuốc nhuộm có tính base. Một số cá nhân, tổ chức vì lợi nhuận kinh tế đã thêm Auramine O vào đậu nành, thức ăn cho cá để làm thay đổi màu sắc sản phẩm[23], làm chất phụ gia trong chế biến thức ăn gia súc và làm chất tạo màu trong công nghiệp thực phẩm[2]. Các dữ liệu về độc tính cho thấy rằng Auramine O kích thích nhẹ đến niêm mạc da, có thể gây ra viêm kết mạc, và gây kích ứng đường hô hấp trên. Khi con người hít phải hoặc tiếp xúc với Auramine O thì có thể bị ngộ độc, gây ung thư, với hàm lượng lớn có thể phá hủy DNA, tế bào gan, thận và tủy[2]. 1.2. Rhodamine B 1.2.1. Cấu tạo COOH H3C N O N CH3 Cl- H3C CH3 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Rhodamine B Tên IUPAC: [9-(2-carboxyphenyl)-6-diethylamino-3-xanthenylidene]diethylammonium cloride Tên khác: Rhodamine 610, CI pigment Violet 1, Basic Violet 10 Công thức phân tử: C28H31N2O3Cl Khối lượng phân tử: 479,01 (gam/mol) 1.2.2. Tính chất Ở điều kiện thường, Rhodamine B là chất dạng bột màu đỏ. Rhodamine là phân tử chứa nhóm azo (chất có liên kết –N=N– trong cấu tạo phân tử) nên tan được trong dầu[3], trong nước (50 mg/mL tạo dung dịch màu tím đỏ) và dung môi hữu cơ như methanol (70 mg/mL), ethanol, tan nhẹ trong acetone[3]. Nhiệt độ nóng chảy của Rhodamine B là 210°C – 211°C[3]. Tỉ trọng tương đối: 0,79 g/cm3 [3] [23] Bước sóng hấp thụ cực đại ( max ): 550 nm ; 520 nm ; bước sóng hấp thụ cực [3] đại trong ethanol 526 nm 4
  18. pK3,2 (Cl0,1M, 25C) o a,[R][H][RH]+++ Bước sóng phát xạ: 580 nm. 1.2.3. Ứng dụng Rhodamine B được sử dụng để tạo màu và nhộm màu trong công nghiệp sợi, nhuộm màu trong phòng thí nghiệm[3][13], nhuộm màu trong xét nghiệm tế bào (do khả năng bền màu và phát quang màu tím đỏ). Rhodamine B phát huỳnh quang nên được ứng dụng nhiều trong công nghệ sinh học như kính hiển vi huỳnh quang, đếm tế bào dòng chảy, quang phổ huỳnh quang Tuy nhiên, nếu dùng Rhodamine B để nhuộm thực phẩm sẽ gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người. 1.2.4. Độc tính Theo Ủy ban an toàn thực phẩm của Châu Âu, nhiều thuốc nhuộm màu thuộc nhóm azo có khả năng gây ung thư. Năm 2005, Ủy ban Châu Âu đã quy định rõ các chất nhuộm màu nhóm azo không được dùng trong thực phẩm và mỹ phẩm nên không có giới hạn cho phép đối với nhóm chất nhuộm này[6]. Rhodamine B cũng đã được cảnh báo là chất có thể gây độc cấp tính và mãn tính. Những nghiên cứu trong nước và trên thế giới cho thấy rằng Rhodamine B có thể gây ung thư, đột biến nếu da tiếp xúc trực tiếp với chất này. Nếu Rhodamine B dính vào người, nó có thể gây dị ứng hoặc làm mẩn ngứa da mắt Nếu hít phải hơi chất này thì sẽ gây ra triệu chứng ho, ngứa cổ, khó thở đau ngực. Nếu ăn phải thức ăn chứa Rhodamine B, nó gây nôn mửa, gây hại cho gan, thận, hệ sinh sản, hệ thần kinh cũng như có thể gây ung thư[4][6]. Thực nghiệm trên chuột cho thấy Rhodamine B gây ung thư với liều lượng 89,5 mg/kg qua đường ăn uống hoặc tiêm vào tĩnh mạch. Rhodamine B đi vào cơ thể, nó có thể bị chuyển hóa thành amine thơm tương ứng, chất này có phần độc hại hơn Rhodamine B và đây cũng chính là nguyên nhân gây ung thư. Khi Rhodamine B chuyển hóa thành các dẫn xuất và tồn tại trong cơ thể thì nó và các dẫn xuất của nó sẽ tác động mạnh mẽ đến các quá trình sinh hóa của tế bào gây ung thư gan[6]. Một số thực nghiệm khác cho thấy Rhodamine B tác động phá vỡ cấu trúc DNA và nhiễm sắc thể khi đưa vào nuôi cấy tế bào. Do tính độc hại của Rhodamine B rất lớn nên hầu hết các quốc gia trên thế giới đều cấm sử dụng chất này trong thực phẩm. 5
  19. 1.3. Lịch sử nghiên cứu Auramine O và Rhodamine B trong và ngoài nước Công trình số 27 trong danh mục tài liệu tham khảo[27] nhóm tác giả đã nghiên cứu phương pháp xác định Rhodamine B có trong ớt khô, nước ép trái cây và rượu vang đỏ. Các chất phân tích có trong ớt khô, nước ép trái cây, rượu vang đỏ đã được chiết với acetonitrile. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối đầu dò huỳnh quang (HPLC – Flu) được sử dụng để xác định các chất phân tích. Thành phần pha động gồm đệm phosphate có nồng độ 3 g/mol và methanol (3:7, tỉ lệ thể tích), pH được điều chỉnh để đạt giá trị 7,0 bằng acid orthophosphoric. Kết quả đường chuẩn tuyến tính với khoảng nồng độ chất chuẩn từ 1-100 ppb. LOD của Rhodamine B là 0,1 ppb trong ớt khô; 0,2 ppb trong cả hai loại thức uống là nước ép trái cây và rượu vang đỏ. LOQ của Rhodamine B đối với ớt khô là 0,6 ppb, nước ép trái cây 0,5 ppb và rượu vang đỏ 0,5 ppb. Hệ số thu hồi trung bình của Rhodamine B là 98,2% – 110,3% trong ớt khô, 94,6% – 102,2% trong nước ép trái cây, và 90,4% –104,6% trong rượu vang đỏ. Độ lệch chuẩn tương đối của phương pháp này là 2,3% – 9,0%. Công trình số 23[23] trong danh mục tài liệu tham khảo, các tác giả đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với đầu dò UV-Vis để xác định 7 loại phẩm màu không được có trong thực phẩm bao gồm Auramine O, Basic Orange, Acid Orange II, Acid Orange, Rhodamine B, Para Red và Sudan I. Các mẫu thực phẩm như đậu nành, thịt được chiết bằng acetonitrile, methanol và kiềm. Các mẫu gia vị được chiết bằng acid acetic và acetonitrile 70%, cột sắc ký (250mm x 4,6mm x 5µm), pha động methanol – 50 mmol/L amonium acetate (dùng H3PO4 điều chỉnh pH đến 4,5). LOD trong khoảng 0,01 – 0,1 mg/L; LOQ trong khoảng 0,175 – 1,25 mg/kg. Hệ số thu hồi trung bình lớn hơn 80%; độ lệch chuẩn tương đối (RSD, n = 3) trong phạm vi 2,04% – 5,66%. Công trình “Xác định Rhodamine B trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao”[6] của nhóm các tác giả Bùi Thị Ngoan, Trần Thắng, Bùi Thị Kim Ngân (Viện dinh dưỡng quốc gia). Các tác giả đã phân tích các mẫu bột ớt, bột cà ri, bột sa tế sử dụng phương pháp HPLC. Trong đề tài này, Rhodamine B trong mẫu được hòa tan trong hỗn hợp acetonitrile/acetone, dịch chiết được lọc, ly tâm, lấy dung dịch xác định bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với đầu dò UV – Vis ở bước sóng 550 nm, cột pha đảo RP C18 (150mm x 4,6mm x 5µm). LOD thu được 0,2 ppm, LOQ là 0,6 ppm. Bài báo cũng chỉ ra các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân tích mẫu bao gồm: 6
  20. + Sử dụng thiết bị siêu âm để chiết Rhodamine B từ nền mẫu cho thấy Rhodamine B không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ không quá 70oC. + Thời gian chiết tách và chạy sắc ký tốt nhất được thực hiện trong ngày, sang các ngày tiếp theo nồng độ Rhodamine B có giảm nhưng không đáng kể, ngày thứ 4 thì nồng độ Rhodamine B giảm đi một nửa. Tác giả Lê Thị Hường Hoa đã “Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và xác định hàm lượng một số chất bị cấm sử dụng trong mỹ phẩm”[3] – trong luận án tiến sĩ dược học của mình. Rhodamine B là một trong số các chất mà tác giả đã phân tích. Đối tượng phân tích của tác giả này là mỹ phẩm. Điều kiện sắc ký là cột sắc ký Hypersil ODS (C18), (5µm x 200mm x 4,6 mm) hoặc tương đương, nhiệt độ cột là 30oC, tốc độ dòng là 1 ml/phút. Bước sóng phát hiện Rhodamine B là 535 nm, vùng quét phổ 275 – 760 nm, thể tích tiêm mẫu: 10 µl. Thời gian sắc ký 35 phút. Pha động được sử dụng là dung dịch tetrabutylammonium (TBA) 0,005 M – nước (75 : 25, theo thể tích). LOD của Rhodamine B là 0,8 ppm. Tác giả không đề cập đến LOQ. 1.4. Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký[4][5] 1.4.1. Khái niệm sắc ký Sắc ký là một kỹ thuật tách các chất ra khỏi hỗn hợp dựa trên sự tương tác của các hợp chất với hai pha là pha động và pha tĩnh. Các thành phần của hệ sắc ký bao gồm pha động, pha tĩnh và chất phân tích. Pha động là một hệ dung môi chảy qua vật liệu nhồi, pha tĩnh là một lớp phủ trên vật liệu nhồi và tương tác với các chất phân tích, vật liệu nhồi là một bề mặt rắn mà trên đó pha tĩnh liên kết với nhau. Các chất phân tích tương tác mạnh mẽ nhất với pha tĩnh sẽ mất nhiều thời gian để đi qua hệ thống hơn so với những chất tương tác với pha tĩnh yếu hơn. Những tương tác này xảy ra trong một hệ thống sắc ký thường là các tương tác mang bản chất hóa học, nhưng trong một số trường hợp, tương tác vật lý cũng có thể được sử dụng trong sắc ký. 7
  21. Hình 1.3. Minh họa a) quá trình sắc ký b) Sắc ký đồ 1.4.2. Phân loại Sắc ký có thể được phân loại dựa trên loại pha động, pha tĩnh và vật liệu nhồi. 1.4.2.1. Phân loại theo hệ pha Việc phân chia các kỹ thuật sắc ký đầu tiên dựa trên loại pha động được sử dụng trong hệ thống. Theo cách phân chia này, có hai loại sắc ký là sắc ký khí (GC) với pha động là chất khí và sắc ký lỏng (LC) với pha động là chất lỏng. Việc phân chia các kỹ thuật sắc ký cũng có thể dựa trên loại pha tĩnh trong hệ thống. Hai cách phân chia này có thể được tóm tắt trong bảng sau: 8
  22. Bảng 1.1. Phân loại sắc ký theo pha tĩnh Loại sắc ký Tên phương pháp SẮC KÝ KHÍ Sắc ký khí – rắn Sắc ký khí – lỏng Sắc ký liên kết pha khí Hình 1.4. Hệ thống sắc ký khí SẮC KÝ LỎNG Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn) Sắc ký phân bố Sắc ký trao đổi ion Hình 1.5. Hệ thống sắc ký lỏng Sắc ký rây phân tử 1.4.2.2 Phân loại theo vật liệu nhồi Các kỹ thuật sắc ký cũng có thể phân loại dựa trên vật liệu nhồi được sử dụng trong hệ thống. Với cách phân loại này, có các kỹ thuật sắc ký cột nhồi, sắc ký mao quản, sắc ký bản mỏng. 1.4.3. Lý thuyết về sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 1.4.3.1. Khái niệm sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một dạng của sắc ký lỏng. Đây là một kỹ thuật mà theo đó một mẫu hỗn hợp các chất được tách thành các thành phần để định tính, định lượng và tinh chế. Trong HPLC, khả năng tách chất dựa vào sự tương tác của chất phân tích với các thành phần của pha động và pha tĩnh, trong đó tương tác giữa chất phân tích với pha động là quan trọng[5]. 9
  23. 1.4.3.2. Các đặc trưng của sắc ký lỏng hiệu năng cao i) Sắc ký đồ Sắc ký đồ là một đáp ứng điển hình thu được bằng phương pháp sắc ký. Sắc ký đồ cho thấy sự phụ thuộc của nồng độ so với thời gian rửa giải. Hình 1.6. Hình ảnh minh họa sắc ký đồ Trong đó, tR được gọi là thời gian lưu; tM (hoặc to) là thời gian chết; Wb là độ rộng đường nền trong một đơn vị thời gian lưu; Wh là độ rộng bán phổ (tức là độ rộng của peak sắc ký ở chiều cao bằng nửa chiều cao của peak sắc ký) trong một đơn vị thời gian. ii) Peak sắc ký Chiều rộng peak và vị trí peak xác định sự phân tách các chất trong kỹ thuật sắc ký. Hình 1.7. Hình ảnh minh họa peak sắc ký Sự phân tách của các chất trong sắc ký phụ thuộc vào hai yếu tố là sự khác biệt trong việc giữ lại các chất phân tích (tức là sự khác biệt về thời gian lưu hoặc thể tích cần thiết cho sự rửa giải chúng) và bề rộng của mỗi peak sắc kí phải hẹp. iii) Thời gian lưu Thời gian lưu (tR) của chất phân tích hoặc thể tích lưu (VR) trong sắc ký có liên quan trực tiếp đến độ mạnh trong sự tương tác giữa chất phân tích với các pha động và pha tĩnh. 10
  24. Sự lưu giữ chất phân tích trên một cột nhất định liên quan đến các chi tiết của hệ thống sắc ký đó bao gồm kích thước của cột, tốc độ dòng của pha động. Trong đó, tốc L độ dòng trung bình của pha động có thể được tính thông qua biểu thức: v với L là tR chiều dài của cột sắc ký. iv) Hệ số dung lượng k' Hệ số dung lượng ( k ' ) là một “thước đo” phổ biến hơn của thời gian lưu, được ' ttRM xác định từ tR theo biểu thức: k . Vì vậy, hệ số dung lượng cũng liên quan t M trực tiếp đến độ mạnh của sự tương tác giữa một chất phân tích với các pha tĩnh và pha động. Hệ số dung lượng rất hữu ích trong việc so sánh kết quả thu được trên các hệ thống sắc ký khác nhau vì hệ số này không phụ thuộc vào chiều dài cột và tốc độ dòng chảy. Ngoài ra, giá trị của hệ số dung lượng cũng rất hữu ích trong việc tìm hiểu các cơ chế lưu giữ chất phân tích, vì theo như định nghĩa cơ bản của k’ là: mol A k' s.p mol A m.p Với mol As.p đại diện cho lượng chất phân tích có mặt trong pha tĩnh và mol Am.p đại diện cho lượng chất phân tích có mặt trong pha động ở trạng thái cân bằng. Ở vị trí tâm của peak sắc ký sẽ là nơi mà cân bằng đạt được hoặc nơi đó chính là lân cận của cân bằng. Biểu thức hệ số dung lượng chỉ ra rằng nếu càng nhỏ thì tR càng nhỏ và sự tách trong trường hợp này kém. Ngược lại, nếu lớn thì tR lớn khi đó peak bị doãng. Trong thực tế, đối với hỗn hợp ít cấu tử, dao động trong đoạn từ 1 đến 5 là tối ưu. Còn đối với hỗn hợp nhiều cấu tử dao động trong nửa khoảng từ 1 đến 10. v) Hiệu năng tách Về măṭ lý thuyết, hiệu năng tách liên quan đến các quá trình động học khác nhau bao gồm sự lưu giữ chất phân tích và sự vận chuyển các chất trong cột sắc ký. Về măṭ thưc̣ nghiêṃ , hiệu năng tách liên quan đến độ rộng peak sắc ký của chất phân tích. Hiệu năng tách có thể được đánh giá thông qua việc xác định độ rộng hoặc độ lệch chuẩn (  ) của các peak. Một kỹ thuật tách với hiệu năng cao sẽ tạo ra những 11
  25. peak sắc ký hẹp (peak sắc ký hẹp có nghĩa là có sự khác biệt nhỏ trong tương tác tách hai chất phân tích). Hình 1.8. Hình ảnh minh họa peak sắc ký theo phân bố Gauss Giá trị  có thể được xác định từ độ rộng của các peak nếu chúng ta giả sử hình  dạng của peak tuân theo phân bố Gauss (phân bố chuẩn). Khi đó, Wb = 4 và Wh = 2,354  . Giá trị này phụ thuộc vào thời gian chất phân tích lưu giữ trong cột ( k ' hoặc tR). vi) Số đĩa lý thuyết Số đĩa lý thuyết (N) dùng để so sánh hiệu năng của một hệ thống đối với các chất phân tích có thời gian lưu giữ khác nhau. N được xác định từ tR và  thông qua biểu t thức: N() R 2 . Đối với các peak sắc ký có hình dạng Gauss, N có thể được xác định  2 2 t t bằng biểu thức: N16 R hoặc N5,54 R . Ngoài ra, giá trị N cũng có thể Wb Wh được tính thông qua thời gian lưu (tR), chiều cao đĩa lý thuyết (H) và diện tích peak sắc tH 2 ký (Speak) theo biểu thức: N2() R . Speak Giá trị N đối với một cột càng lớn thì khả năng tách hai chất của cột đó càng cao. N phụ thuộc vào chiều dài của cột sắc ký, không phụ thuộc vào sự lưu giữ chất phân tích. 12
  26. Hình 1.9. Hình ảnh minh họa cột sắc ký và các đĩa lý thuyết vii) Chiều cao đĩa lý thuyết Chiều cao tương đương của một đĩa lý thuyết (HFTP) hay nói một cách ngắn gọn là chiều cao đĩa (H) được sử dụng để so sánh hiệu năng tách chất của các cột có độ dài L khác nhau: H với L là chiều dài cột sắc ký và N là số đĩa lý thuyết tương ứng với N cột sắc ký đó. H có thể hiểu đơn giản là chiều dài của một cột sắc ký tương đương với một đĩa lý thuyết. Chiều cao đĩa mô tả mức độ phân tán đỉnh gây ra do sự pha trộn của chất phân tích với pha động. Sự mở rộng peak là kết quả của 4 quá trình xảy ra trong quá trình chuyển chất phân tích đi qua cột tách. Vì vậy, chiều cao của đĩa được hình thành từ 4 sự đóng góp mà tổng hợp các sự đóng góp này xác định độ phân tán peak. Bốn sự đóng góp đó là Hdiff mô tả đóng góp từ sự khuếch tán theo chiều dọc; Hconv mô tả đóng góp từ hỗn hợp đối lưu; Hex, m mô tả đóng góp có nguồn gốc từ quá trình động học của sự truyền khối từ pha động đến bề mặt phân cách giữa pha động và pha tĩnh; Hex, s mô tả đóng góp có nguồn gốc từ quá trình động học của sự truyền khối từ pha tĩnh. Như vậy, tổng chiều cao của đĩa là sự đóng góp của 4 yếu tố trên: HHHHH diffconvex,mex,s viii) Hệ số chọn lọc và độ phân giải Hệ số chọn lọc được ký hiệu bởi chữ . Đây là một tham số được sử dụng để mô tả cách thức hai chất phân tích được tách ra bằng một hệ thống sắc ký. Giá trị hệ số k' chọn lọc được xác định bởi biểu thức 2 . Trong đó, k ' là hệ số dung lượng của ' 1 k1 chất thứ nhất và k ' là hệ số dung lượng của chất thứ hai, k ' > k ' . Khi giá trị của 2 2 1 > 1,1 thường là dấu hiệu cho biết quá trình tách sắc ký tốt. Hệ số chọn lọc không xem xét hiệu năng của cột hoặc độ rộng đỉnh mà nó chỉ liên quan đến thời gian lưu giữ. 13
  27. Hình 1.10. Hình ảnh minh họa sự tách hai peak sắc ký Độ phân giải được ký hiệu là Rs. Độ phân giải giữa hai peak là một thước đo thứ hai cho thấy cách thức hai peak được tách ra như thế nào. ttR 2R1 Độ phân giải được xác định bởi biểu thức R2s . Trong đó, tR1 và WWb2b1 Wb1 tương ứng là thời gian lưu và độ rộng đường nền đối với sự rửa giải peak thứ nhất; tR2 và Wb2 tương ứng là thời gian lưu và độ rộng đường nền đối với sự rửa giải peak thứ hai. Độ phân giải (Rs) được sử dụng rộng rãi hơn so với hệ số chọn lọc ( ) vì nó giữ lại cả hai đặc trưng là thời gian lưu (tR) và hiệu năng cột (Wb) được xem xét trong việc xác định khả năng tách của các peak. Nếu hai peak là hai tam giác cân thì Rs = 1 là đủ để tách riêng hai peak sắc ký ra khỏi nhau. Nếu hai peak là các phân bố Gauss thì RS > 1,5 là cần thiết để các peak tách nhau một cách hoàn toàn. Sự tách là lý thưởng khi Rs đạt giá trị độ phân giải đường nền (Rs = 1,5). 1.5. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) HPLC là một dạng của sắc ký lỏng dùng để tách các hợp chất được hòa tan trong dung dịch. Vì vậy, hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) phải bao gồm các bộ phận cơ bản như được mô tả như trong hình dưới: 14
  28. Hình 1.11. Hình ảnh minh họa sơ đồ hệ thống HPLC 1: Bình chứa pha động 5: Cột sắc ký (pha tĩnh) 2: Bộ phận khử khí 6: Đầu dò 3: Bơm cao áp 7: Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, 4: Bộ phận tiêm mẫu xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống 8: Hệ thống để in dữ liệu 1.5.1. Bình chứa pha động Hệ dung môi rửa giải thường được cho vào các bình chứa được làm bằng chất liệu trơ, thường là bằng thủy tinh[5]. Trong mỗi bình, có một ống dẫn dung môi từ bình vào hệ thống sắc ký. Các máy HPLC hiện nay thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp. Điều này cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn và tổng tỉ lệ của 4 đường là 100%. Tất cả các dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết sử dụng cho HPLC. Tất cả các hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu và pha hệ đệm đều phải là hóa chất tinh khiết dùng cho phân tích. Việc sử dụng hóa chất tinh khiết nhằm tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo nên các peak tạp trong quá trình phân tích. 1.5.2. Bộ phận khử khí Mục đích sử dụng bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động, tránh xảy ra hiện tượng tỉ lệ pha động của các đường dung môi không đúng làm cho thời gian lưu của peak thay đổi. Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì bơm cao áp có thể không hút được dung môi, khi đó ảnh hưởng đến áp suất và hoạt động của cả hệ thống HPLC. 15
  29. Trong các trường hợp trên đều dẫn đến sai kết quả phân tích. 1.5.3. Bơm cao áp Mục đích của bơm cao áp là để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký. Bơm phải chịu được áp suất 400 bar cho HPLC thường và đến 1300 bar cho UPLC, tốc độ dòng từ 0,01 đến 10 mL/phút. Bơm cao áp được thiết kế để giảm xung khi piston vận hành. Một bơm tốt phải thỏa được các yêu cầu là chịu được nhiều loại dung môi hữu cơ; các dung dịch đệm, tốc độ dòng ổn định; ít bị ăn mòn và thể tích chết càng nhỏ càng tốt[5]. Một máy bơm có thể cung cấp một thành phần pha động không đổi (đẳng dòng) trong suốt quá trình phân tích hoặc gradient có thành phần pha động thay đổi (gradient) trong quá trình phân tích. 1.5.4. Bộ phận tiêm mẫu Để đưa mẫu vào cột phân tích. Có 2 cách đưa mẫu vào cột là tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động. 1.5.5. Cột sắc ký và tiền cột (cột bảo vệ) Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao. Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột thay đổi từ 5 – 25 cm đường kính trong 2,1 – 4,6 mm[5], hạt nhồi cỡ 0,3 – 5 µm, Chất nhồi cột phụ thuộc vào loại cột và kiểu sắc ký. Pha động được bơm vào cột sắc ký bằng một bơm cao áp. Trước khi pha động đi vào cột phân tích, nó phải được cho ngang qua một cột bảo vệ để lọc bỏ những tạp chất bẩn còn sót lại[5]. 1.5.6. Đầu dò Đầu dò (hay detector) là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Sự lựa chọn loại đầu dò tùy vào việc nhà phân tích muốn làm việc, nghiên cứu trên những hợp chất nào và các hợp chất đó có các đặc trưng hóa học nào. Từ tính chất các hợp chất muốn phân tích mà nhà phân tích sẽ chọn loại đầu dò tương tích. Dưới đây là một số loại đầu dò[5]: – Đầu dò quang phổ hấp thu ̣ phân tử bao gồm các loai:̣ tử ngoaị (UV), tử ngoại khả kiến (UV – Vis), diode quang (PDA). – Đầu dò phát huỳnh quang (RF). – Đầu dò chỉ số khúc xạ. 16
  30. – Đầu dò amper kế. – Đầu dò đo độ dẫn điện. – Đầu dò quang phổ hồng ngoaị (IR). – Đầu dò khối phổ (MS). 1.5.7. Bộ phận ghi nhận tín hiệu Bộ phận này ghi tín hiệu do đầu dò phát hiện. Đối với các hệ thống HPLC hiện đại, phần này được phần mềm trong hệ thống ghi nhận, lưu các thông số, sắc ký đồ, các thông số liên quan đến peak như tính đối xứng, hệ số phân giải, Đồng thời tính toán, xử lý các thông số liên quan đến kết quả phân tích. 1.5.8. In dữ liệu Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ được in ra qua máy in kết nối với máy tính có cài phần mềm điều khiển. 17
  31. CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất và dụng cụ 2.1.1. Hóa chất 2.1.1.1. Chất chuẩn Bảng 2.1. Danh mục chất chuẩn Tên chất STT Nhà sản xuất Tiêu chuẩn Hàm lượng chuẩn Sigma-Aldrich 1 Auramine O Dùng cho HPLC 85% USA Sigma-Aldrich 2 Rhodamine B Dùng cho HPLC 95% India Dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm được chuẩn bị từ việc cân chính xác lượng chất chuẩn và hòa tan trong methanol tinh khiết loại dùng cho HPLC, được bảo quản trong tủ mát. Các dung dịch làm việc được pha từ dung dịch chuẩn gốc bằng methanol. Các dung dịch loãng chỉ sử dụng trong ngày. 2.1.1.2. Dung môi Bảng 2.2. Danh mục dung môi tinh khiết chuyên dùng cho HPLC Hàm lượng STT Tên dung môi Nhà sản xuất Tiêu chuẩn nguyên trạng (%) Merck KGaA Đức 99,8% 1 Methanol Dùng cho HPLC Labscan 99,9% 2 Acetonitrile Merck KGaA Đức Dùng cho HPLC 99,8% 18
  32. 2.1.1.3. Các hóa chất khác Bảng 2.3. Danh mục hóa chất tinh khiết Hàm lượng STT Tên hóa chất Nhà sản xuất Tiêu chuẩn nguyên trạng (%) Acid acetic 1 Merck KGaA - Đức Dùng cho HPLC 100% (băng) 2 Acid chlohidric Merck KGaA - Đức Dùng cho HPLC 37% Scharlau, Scharlab 3 Acid formic Dùng cho HPLC 98-100% S.L – Spain Scharlau, Scharlab 4 Acid phosphoric Dùng cho HPLC 85% S.L – Spain Sodium 5 Merck KGaA - Đức Dùng cho HPLC 99% hydroxide Ammonium 6 Merck KGaA - Đức Dùng cho HPLC 98% acetate 7 Ethyl acetate Fisher Scientific UK Dùng cho HPLC 99,98% 8 Hexane Fisher Scientific UK Dùng cho HPLC > 99% 9 Acetone Merck KGaA - Đức Dùng cho HPLC 10 Ethanol Merck KGaA - Đức Dùng cho HPLC 96% Guangdong 12 Ammonia Guanghua Sci-Tech 25-28% Co., Ltd 2.1.2. Trang thiết bị và dụng cụ phục vụ nghiên cứu 2.1.2.1. Trang thiết bị + Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao với bơm của hãng Waters 2996, detector PDA. + Bình đựng dung môi 4 kênh (Pyrex 1000 L, Germany) + Bộ lọc dung môi dùng màng lọc 0,45 micromet. + Máy deion (Water Pro PS, LABCONCO) + Cột sắc ký C18 (Zorbax Eclipse XDB – C18, 5  m 4,6 mm 250 mm, Agilent – USA) và tiền cột (Eclipse XDB – C18 4 – Pack, Agilent – USA) + Cân phân tích (Sartorius – CPA225D) 19
  33. + Máy cất nước hai lần (Hamilton Laboratory Class Limited – Sartorius) + Máy xay mẫu + Máy siêu âm (S100H Elmasonic, Elma – Germany) + Máy ly tâm (DNA concentrator) + Máy đo phổ hấp thụ phân tử UV – Vis (Lambda 25 UV/Vis Spectrometor, Perkin Elmer) 2.1.2.2. Dụng cụ – Các loại bình định mức, các cốc thủy tinh, các loại ống đong, ống nhỏ giọt, bình tia, phễu lọc, giấy lọc – Pipet, micropipet – Vial – Ống ly tâm 50 mL 2.2. Nội dung nghiên cứu 2.2.1. Khảo sát các điều kiện tối ưu cho hệ thống HPLC 2.2.1.1. Khoảng bước sóng của detector PDA Phương pháp nghiên cứu được lựa chọn là sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng đầu dò PDA. Việc đo để phát hiện các chất phân tích Auramine O và Rhodamine B vẫn dựa trên cơ sở tính chất hấp thụ quang phân tử của chất trong dung dịch tại một bước sóng nào đó. Để thu được peak đủ điều kiện định lượng cần phải đo ở bước sóng ứng với cực đại hấp thụ. Các hợp chất Auramine O và Rhodamine B hấp thụ bức xạ trong vùng khả kiến, nên đầu tiên ta tiến hành khảo sát phổ hấp thụ ánh sáng trong vùng khả kiến Vis trên máy đo quang UV – Vis (Lambda 25 UV/Vis Spectrometor, Perkin Elmer). Dung dịch đo là chuẩn đơn Auramine O, chuẩn đơn Rhodamine B và chuẩn hỗn hợp (Auramine O và Rhodamine B) với: Nồng độ chất phân tích 2 ppm đối với mỗi chất Dung môi 100% MeOH; 100% ACN Khoảng quét phổ 300 – 600 nm 2.2.1.2. Thăm dò thứ tự tách các chất phân tích trên cột sắc ký pha đảo C18 Vấn đề đầu tiên để bắt đầu khảo sát các điều kiện sắc ký là phải khảo sát thời gian lưu. Như chúng tôi đã nêu ở Chương 1, thời gian lưu được tính từ lúc nạp mẫu vào cột tách sắc ký cho đến lúc chất phân tích được rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại. Thời gian lưu liên hệ mật thiết với: 20
  34. + Pha tĩnh (loại, cỡ hạt, độ xốp, cấu trúc xốp, ) + Pha động chương trình chạy sắc ký (loại dung môi, tỉ lệ dung môi, tốc độ ) + Chất phân tích (bản chất, cấu trúc) + Môi trường pha động (đệm, pH) Khảo sát thời gian lưu để xác định chất nào ra trước, chất nào ra sau và dự đoán ảnh hưởng của độ phân cực của dung môi với khả năng tách riêng từng chất trong hỗn hợp. Thời gian lưu được khảo sát bằng cách pha một dung dịch chuẩn hỗn hợp (Auramine O và Rhodamine B) với nồng độ mỗi chất là 2,0 ppm trong dung môi methanol. Tiến hành phân tích sắc ký với chương trình nhiệt độ là 35oC 5oC, tốc độ pha động là 1 mL/phút, detector PDA với khoảng bước sóng khảo sát từ 400 – 600 nm. 2.2.2. Tối ưu hóa pha động Với mục đích tìm kiếm điều kiện tối ưu cho pha động, chúng tôi khảo sát bằng cách thay đổi từng yếu tố, theo thứ tự: 1. Khảo sát dung môi pha động 2. Khảo sát pH của pha động 3. Khảo sát chương trình hóa dung môi (đẳng dòng, gradient) 4. Khảo sát tốc độ dòng 5. Khảo sát tỉ lệ dung môi pha động ban đầu Sau khi khảo sát xong các mức trong cùng một yếu tố, chọn ra mức tối ưu để khảo sát các yếu tố tiếp theo. 2.2.2.1. Khảo sát dung môi pha động Dung môi được lựa chọn để khảo sát là acetonitrile và methanol. Chương trình sắc ký với pha tĩnh là RP – C18, nhiệt độ cột tách là 35oC 5oC, nồng độ hai chất phân tích là 2,0 ppm, bước sóng khảo sát từ 400 – 600 nm, tốc độ dòng là 1 mL/phút. Chương trình gradient pha động[23] theo đồ thị Hình 2.1: 100 80 60 40 20 0 0 5 10 15 20 25 %MeOHhoặc %ACN Thời gian (phút) Hình 2.1. Chương trình gradient pha động – Khảo sát chọn loại dung môi 21
  35. Thực hiện phân tích sắc ký, thiết lập các mối quan hệ về hệ số dung lượng, hệ số không đối xứng, độ phân giải hai peak sắc ký để chọn dung môi pha động. 2.2.2.2. Khảo sát pH [19] Dựa vào giá trị pKa của AO và RB, để hạn chế tồn tại đồng thời nhiều dạng AO, RB trên cột và loại bỏ sự kéo đuôi của peak AO, RB trong quá trình tách sắc ký thì pH < 7. Ngoài ra, cột pha đảo C18 chịu đựng được pH trong khoảng 2 – 9 nên chúng tôi chọn các acid và đệm cho chương trình dung môi pha động bao gồm: + Acid acetic có pH bằng 3,0; 3,6; 4,0 và 4,5 + Acid formic có pH bằng 3,0 + Acid phosphoric có pH bằng 2,3 và 2,6 + Dung dịch đệm acetate có pH bằng 4,2 Chương trình sắc ký với pha tĩnh là RP – C18, nhiệt độ cột tách là 35oC 5oC, nồng độ hai chất phân tích là 2,0 ppm, bước sóng khảo sát từ 400 – 600 nm, tốc độ dòng là 1 mL/phút. Đối với các giá trị pH từ 3,0 đến 4,5 ta sử dụng chương trình gradient pha động[23] tiến hành với các tỉ lệ theo đồ thị Hình 2.1. Đối với các giá trị pH 2,3 và 2,6 ta sử dụng chương trình gradient pha động tiến hành với các tỉ lệ theo đồ thị Hình 2.2. và tốc độ dòng là 0,7 mL/phút: 100 90 80 70 60 50 40 % MeOH % 30 20 10 0 0 5 10 15 20 Thời gian (phút) Hình 2.2. Gradient pha động – Khảo sát pH 2,3 và 2,6 Thực hiện phân tích sắc ký, thiết lập các mối quan hệ về hệ số dung lượng, hệ số không đối xứng, độ phân giải hai peak sắc ký để chọn loại acid (hoặc đệm) thích hợp cho pha động. 22
  36. 2.2.2.3. Khảo sát chương trình hóa dung môi pha động Tỉ lệ thành phần dung môi tạo ra pha động có ảnh hưởng đến quá trình rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột tách. Khi tỉ lệ thành phần pha động thay đổi thì lực rửa giải của pha động thay đổi, tức làm thay đổi thời gian lưu của chất phân tích ra khỏi cột và do đó làm thay đổi hệ số dung lượng của chất phân tích.  Khảo sát chương trình đẳng dòng (isocratic) Thực hiện phương pháp phân tích sắc ký với một số chương trình đẳng dòng như sau: + Chương trình đẳng dòng sử dụng dung môi MeOH và HCOOH (pH = 3) theo tỉ lệ 40:60. + Chương trình đẳng dòng sử dụng dung môi ACN và HCOOH (pH = 3) theo tỉ lệ 40:60. + Chương trình đẳng dòng sử dụng dung môi ACN và đệm acetate (pH = 4,2) theo tỉ lệ 80:20.  Khảo sát chương trình gradient Lựa chọn các đoạn gradient và đặt tỉ lệ thành phần dung môi ở đầu mỗi đoạn gradient. Các mức được chọn khảo sát: + Mức 1: t = 0 (30% MeOH hoặc ACN) + Mức 2: t = 0 (43,7% MeOH hoặc ACN) Chương trình sắc ký dùng để khảo sát sử dụng pha tĩnh là RP – C18, nhiệt độ cột tách là 35oC 5oC, nồng độ hai chất phân tích là 2,0 ppm, bước sóng quét phổ của đầu dò PDA từ 400 – 600 nm, tốc độ dòng là 1 mL/phút. 2.2.2.4. Tốc độ pha động Cùng với các yếu tố như thành phần pha động, tỉ lệ thành phần pha động, pH thì tốc độ pha động khi chạy sắc ký cũng có thể ảnh hưởng đến kết quả phân tách sắc ký. Tốc độ pha động quá nhỏ sẽ gây ra hiện tượng doãng peak sắc ký, thời gian rửa giải các chất lâu nên sẽ tăng chi phí cho phép phân tích, không có tính kinh tế. Tốc độ pha động quá lớn có thể làm cho các chất trong hỗn hợp mẫu không kịp tách ra khỏi nhau. Tiến hành khảo sát tốc độ pha động ở 4 mức 0,6; 0,7; 0,85 và 1,0 mL/phút với các điều kiện tối ưu đã tiến hành khảo sát ở trên và lựa chọn tốc độ dòng thích hợp. 2.2.3. Thẩm định phương pháp Phương pháp do chúng tôi đề xuất được tham khảo từ các bài báo công bố trên các tạp chí trong và ngoài nước đồng thời nghiên cứu khảo sát và thay đổi một số điều kiện trong quá trình thực hiện (thiết bị phân tích, nền mẫu, người tiến hành phân tích, 23
  37. ). Vì vậy, phương pháp mà chúng tôi đề xuất không phải là phương pháp tiêu chuẩn. Do đó, theo yêu cầu của ISO 17025[8][11][12][16] , phương pháp phân tích này phải được thẩm định nhằm mục đích kiểm tra và cung cấp bằng chứng khách quan chứng tỏ phương pháp đề xuất đáp ứng được các yêu cầu đặt ra và kết quả phân tích thu được là đáng tin cậy. Dựa vào Bảng 2.4, chúng tôi lựa chọn ra các thông số thẩm định bao gồm: độ đúng, độ đặc hiệu/chọn lọc, LOD, LOQ, độ tuyến tính. Bảng 2.4. Thông số thẩm định phương pháp không tiêu chuẩn ICH, USP, FDA Các thông số thẩm Phân tích Phân tích Phân tích Xác định giới định định tính vi lượng đa lượng hạn tạp chất Độ đúng – + + – Độ chụm – + + – Độ đặc hiệu, chọn lọc + + + + LOD + + +/– + LOQ – + +/– – Độ tuyến tính – + + – Độ vững (ổn định) – + + – Trong đó, kí hiệu (+) Cần thực hiện thẩm định và (–) Không cần thực hiện thẩm định 2.2.3.1. Tính đặc hiệu/chọn lọc[14] Đối với sắc ký lỏng sử dụng detector PDA thì tính chọn lọc trong sắc ký lỏng có thể đạt được thông qua việc việc lựa chọn cột tối ưu, điều kiện sắc ký tối ưu, nhiệt độ cột và bước sóng. Ngoài việc thay đổi điều kiện sắc ký thì giai đoạn xử lý mẫu cũng phải tối ưu để đạt được tính chọn lọc cao nhất. Trong sắc ký, cần xác định rằng peak sắc ký có phải là một peak đơn hay có lẫn các tạp chất khác. Đối với các hệ thống sắc ký có detector PDA có thể xác định được tính chọn lọc thông qua xác định độ tinh khiết của peak. Khảo sát tính đặc hiệu/chọn lọc trong phân tích AO, RB được thực hiện bằng cách chuẩn bị ba mẫu gồm dung dịch chuẩn, một mẫu thực tế cần phân tích không có thêm chuẩn, một mẫu thực tế cần phân tích có thêm chuẩn hỗn hợp hai chất AO và RB. Các mẫu được xử lý theo quy trình xử lý đã tối ưu hóa. Tính chọn lọc AO và RB trong phân tích các mẫu thực phẩm được đánh giá dựa vào hai tiêu chí. Tiêu chí thứ nhất: sự tương đồng về thời gian lưu các peak mục tiêu (AO, RB) của mẫu thực tế có thêm chuẩn với mẫu chỉ chứa dung dịch chuẩn, sự tương 24
  38. đồng các peak tạp của mẫu thực tế không thêm chuẩn và mẫu thực tế có thêm chuẩn. Tiêu chí thứ 2: độ tinh khiết của peak sắc ký. 2.2.3.2. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn[10] Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được (diện tích hoặc chiều cao peak sắc ký) vào nồng độ chất phân tích. Để xác định khoảng tuyến tính cần thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ. Sau đó, vẽ đường cong phụ thuộc giữa tín hiệu đo vào nồng độ và quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính. Tuy nhiên, trong thực tế để tiết kiệm thời gian và hóa chất, chúng tôi không xây dựng toàn bộ đường tuyến tính mà chỉ xây dựng đường chuẩn và xác định hệ số hồi quy tương quan. Dựa trên các dữ liệu từ các bài báo và dự đoán hàm lượng các chất phân tích có thể có trong mẫu thực tế mà chúng tôi sẽ tiến hành phân tích, chúng tôi xây dựng đường chuẩn trong khoảng nồng độ từ 0,05 ppm đến 2,00 ppm. Chúng tôi chọn cách xây dựng đường chuẩn với chất chuẩn tinh khiết (Auramine O – tinh khiết HPLC 85% và Rhodamine B – tinh khiết HPLC 95%) được pha trong MeOH. Các chuẩn này mua từ hãng Sigma đạt được các yêu cầu của ISO 17025[11]. Sau khi chuẩn bị xong các chuẩn có nồng độ đã tính trước, chúng tôi xác định các giá trị đo được Y (diện tích hoặc chiều cao peak sắc ký) theo nồng độ X. Mỗi nồng độ chuẩn được tiến hành đo lặp lại 2 đến 3 lần và lấy giá trị trung bình. Trong khoảng nồng độ khảo sát, nếu sự phụ thuộc giữa các đại lượng là tuyến tính, đường biểu diễn là một phương trình bậc nhất có dạng như sau: Y = A + BX, với A là điểm cắt trục tung của đường chuẩn và B là giá trị hệ số góc (độ dốc của đường chuẩn). Các dữ liệu thu thập được trong tiến trình chạy sắc ký được xử lý thống kê bằng phần mềm Origin 8.5.1 để xác định được các giá trị A, B cũng như hệ số tương quan R. Một đường chuẩn được chấp nhận khi thỏa mãn các yêu cầu về hệ số tương quan R và độ chệch của các điểm nồng độ dùng để xây dựng đường chuẩn. Hệ số tương quan R được xem như là chỉ tiêu đầu tiên của một đường chuẩn đạt yêu cầu. Giá trị R phải nằm trong đoạn 0,995 ≤ R ≤ 1 hay 0,99 ≤ R2 ≤ 1. Độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn. Sau khi lập đường chuẩn xong cần kiểm tra bằng phương pháp tính ngược lại nồng độ của các điểm 25
  39. chuẩn sử dụng để xây dựng đường chuẩn từ đó tính các giá trị độ chệch theo công thức sau: C t Cc i 100 Cc Trong đó: i : Độ chệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn C t : Nồng độ tính ngược theo đường chuẩn của các điểm chuẩn C c : Nồng độ của các điểm chuẩn Theo quy định của nhiều tổ chức của Mỹ, Canada, châu Âu, giá trị không được vượt quá 15% cho tất cả các nồng độ, riêng ở nồng độ LOQ có thể chấp nhận giới hạn 20%[16]. 2.2.3.3. Giới hạn phát hiện Theo IUPAC và ISO, LOD được xem là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích mà phương pháp phân tích có thể phát hiện được[10]. LOD được xác định tương đối dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn 3S y của tín hiệu đo thông qua biểu thức: LOD . Trong đó Sy là độ lệch chuẩn của B tín hiệu của mẫu trắng, cũng được xác định bằng phương trình hồi quy và B là độ dốc (hệ số góc) trong phương trình hồi quy[10]. Sau khi thu được LOD bằng cách tính theo đường chuẩn, chúng tôi pha loãng dung dịch chuẩn đến nồng độ LOD vừa tính được. Tiến hành phân tích sắc ký với các điều kiện đã được tối ưu và dựa vào tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu ( S ) để xác định lại N LOD. LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2–3 lần nhiễu đường nền, thông thường thường lấy S = 3. Theo Hình 2.3[10], công thức tính tín N H hiệu trên nhiễu là: S N h 2 Hình 2.3. Hình ảnh minh họa xác định LOD bằng cách tính S N 26
  40. 2.2.3.4. Giới hạn định lượng LOQ được xem là nồng độ thấp nhất của một chất có trong mẫu mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm mong muốn. LOQ có thể được xác định bằng nhiều cách khác nhau. Tùy thuộc vào từng phương pháp phân tích cụ thể mà lựa xem xét, lựa chọn cho phù hợp. LOQ trong nhiều trường hợp có thể là điểm thấp nhất của khoảng tuyến tính. Đối với phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), LOQ cũng có thể được xác định dựa vào tín hiệu trên nhiễu ( S ). LOQ được chấp nhận tại N nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10-20 lần nhiễu đường nền, thông thường thường lấy = 10. LOQ cũng có thể dược tính dựa vào đường chuẩn giống như LOD nhưng theo 1 0 S công thức sau: L O Q y B 2.2.3.5. Độ đúng Theo tiêu chuẩn quốc tế (ISO 5725 1-6:1994)[15] và tiêu chuẩn quốc gia Việt Nam (TCVN 6910 1-6:2005)[8] , độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng (μ). Độ đúng được xác định thông qua xác định hệ số thu hồi của phương pháp. Theo cách này, chúng tôi thêm một lượng chất chuẩn xác định vào mẫu phân tích, tiến hành phân tích các mẫu thêm chuẩn đó, làm lặp lại tối thiểu 3 lần bằng phương pháp khảo C C sát, tính hệ số thu hồi theo công thức sau: R%100% mcm Cc Trong đó, R%: hệ số thu hồi, %; Cm+c: nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn; Cm: nồng độ chất phân tích trong mẫu thử; Cc: nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết). Sau khi đánh giá hệ số thu hồi, so sánh kết quả với các giá trị cho trong các bảng có kèm theo ở phần Phụ lục 1. 2.2.3.6. Khảo sát độ lặp lại của phép đo Độ lặp lại của hệ thống sắc ký có thể được khảo sát bằng cách tiêm lặp 7 lần cùng một mẫu chuẩn hỗn hợp chứa đồng thời hai chất cần phân tích (với nồng độ phải nằm trong khoảng tuyến tính) vào hệ thống sắc ký với các điều kiện tối ưu đã khảo sát ở Mục 2.2.1. Kết quả độ chụm được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD(%)) của diện tích peak sắc ký và của thời gian lưu. Một phương pháp được chấp nhận khi RSD(%) không được vượt quá giá trị có trong Bảng 2.5. 27
  41. Bảng 2.5. Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC)[15] TT Hàm lượng % Tỉ lệ chất Đơn vị RSD% 1 100 1 100% 1,3 2 10 10-1 10% 1,8 3 1 10-2 1% 2,7 4 0,1 10-3 0,1 % 3,7 5 0,01 10-4 100 ppm 5,3 6 0,001 10-5 10 ppm 7,3 7 0,0001 10-6 1 ppm 11 8 0,00001 10-7 100 ppb 15 9 0,000001 10-8 10 ppb 21 10 0,0000001 10-9 1 ppb 30 2.2.4. Quy trình xử lý mẫu thực phẩm 2.2.4.1. Lấy mẫu và bảo quản mẫu Mẫu măng, cải chua được mua ở chợ Nhật Tảo, quận 10, Thành Phố Hồ Chí Minh vào lúc 17 giờ 15 phút ngày 19/04/2018. Mẫu măng màu vàng nhạt, mẫu cải chua có màu xanh đậm. Mẫu măng mua về được xay nhuyễn, để ráo nước và bảo quản trong tủ đông. Mẫu thịt gà (phần ức gà và đùi gà) được mua ở Lotte Mart, Phú Thọ, quận 10, Thành Phố Hồ Chí Minh vào lúc 20 giờ ngày 22/04/2018. Mẫu thịt gà khi mua về có màu vàng nhạt. Mẫu được xay nhuyễn và bảo quản trong tủ đông. Bảng 2.6. Lấy mẫu và thông tin mẫu Mẫu Thời gian Địa điểm Hình ảnh 17 giờ 15 phút Chợ Nhật Tảo, quận 10, Măng Ngày 19/04/2018 TP. Hồ Chí Minh 17 giờ 15 phút Chợ Nhật Tảo, quận 10, Cải chua Ngày 19/04/2018 TP. Hồ Chí Minh Lotte Mart Phú Thọ, 20 giờ Thịt gà quận 10, TP. Hồ Chí Ngày 22/04/2018 Minh 28
  42. 2.2.4.2. Quy trình xử lý mẫu thực phẩm Theo tài liệu số 21[21], 22[22], 23[23], 25[25], 26[26] trong danh mục tài liệu tham khảo, lựa chọn dung môi chiết là acetonitrile kiềm vì acetonitrile có tác dụng kết tủa tốt các protein hòa tan trong nước. Ngoài ra, tài liệu chỉ ra rằng nước amoniac (0,5%, v/v) và acetonitrile có thể sử dụng là 70% acetonitrile và 30% nước amoniac (theo thể tích, v/v) để chiết mẫu. Quy trình khảo sát thể tích dung môi chiết được thể hiện trong Hình 2.4. • Cân khoảng 5 gam mẫu (chính xác đến 0,00001 g) trên cân phân tích Bước 1 • Cho mẫu vào ống ly tâm 50 mL • Thêm vào ống ly tâm 10 mL dung môi chiết ACN - NH3 (0,5%, v/v) theo tỉ lệ (70:30) • Lắc ống ly tâm trong 10 phút • Siêu âm trong 10 phút (ở 40oC) Bước 2 • Ly tâm trong 10 phút • Thu lấy phần dung dịch phía trên và cho vào bình định mức 10 mL, định mức đến vạch bằng dung môi chiết. • Thêm tiếp vào ống ly tâm 5 mL dung môi chiết ACN - NH3 (0,5%, v/v) theo tỉ lệ (70:30) • Lắc ống ly tâm trong 10 phút • Siêu âm trong 10 phút (ở 40oC) Bước 3 • Ly tâm trong 10 phút • Thu lấy phần dung dịch phía trên và cho vào bình định mức 5 mL, định mức đến vạch bằng dung môi chiết. • Lặp lại bước 3 cho đến khi nào chiết hoàn toàn AO và RB. Bước 4 Hình 2.4. Khảo sát thể tích dung môi chiết 2.2.5. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả 2.2.5.1. Xử lý kết quả dựa trên đường chuẩn Với kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao thì thông số thời gian lưu tR là đại lượng đặc trưng để phát hiện chất. Vì vậy, chúng ta có thể dựa vào thông số này để định tính Auramine O và Rhodamine B thông qua mẫu chuẩn. Sau đó dựa vào các tín hiệu phân tích thu được là diện tích peak hoặc chiều cao peak để định lượng chúng vì các đại lượng này liên quan chặt chẽ đến nồng độ của chất phân tích. 29
  43. Phương trình biểu diễn mối quan hệ của sự phụ thuộc chiều cao peak (H) hoặc diện tích peak (S) được cho như sau: H k C b S k C b Trong đó: H: chiều cao peak sắc ký S: diện tích peak sắc ký k: hằng số của điều kiện thực nghiệm tách sắc ký b: hằng số bản chất, 0<b 1 Ở vùng nồng độ nhỏ thì b=1, sự phụ thuộc của chiều cao (H) hoặc diện tích (S) theo nồng độ (C) là tuyến tính: HkCf(C) 1 S k C f (C)2 Sử dụng các mối quan hệ trên để xác định nồng độ chất phân tích theo phương pháp đường chuẩn hoặc phương pháp thêm chuẩn. Tùy thuộc vào nền mẫu mà chúng tôi sẽ tiến hành theo phương pháp đường chuẩn hoặc phương pháp thêm chuẩn. Nếu thành phần của mẫu không quá phức tạp thì phép phân tích được tiến hành theo phương pháp đường chuẩn để thu được kết quả nhanh, đơn giản. Tùy thuộc vào đặc điểm của peak sắc ký mà người phân tích có thể chọn cách biểu diễn tương quan của diện tích peak hay chiều cao peak sắc ký theo nồng độ. Với các peak sắc ký có hiện tượng kéo đuôi thì việc xác định diện tích peak sẽ chính xác hơn so với chiều cao peak. Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích. 2.2.5.2. Xử lý thống kê các số liệu thực nghiệm Các số liệu thu được từ thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp toán thống kê với các đặc trưng sau[8]: 1 n + Giá trị trung bình: xx  i n i1 n (x x)2 + Độ lệch chuẩn:  i SD i1 n1 SD + Độ lệch chuẩn tương đối: RSD(%) CV% 100 x 30
  44. SD + Khoảng tin cậy:  xt n Trong đó, + n là số thí nghiệm lặp lại của tập số liệu. + SD là độ lệch chuẩn. + RSD(%) là độ lệch chuẩn tương đối, CV% là hệ số biến thiên. + t(P=0,95; f) là cận tích phân của phân phối student hai phía với mức ý nghĩa α = 0,05 và bậc tự do f. 31
  45. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Điều kiện phân tích HPLC 3.1.1. Bước sóng và độ hấp thụ cực đại của các chất phân tích trong các dung môi Trong khảo sát này, chúng tôi lựa chọn methanol và acetonitrile làm dung môi để hòa tan các chất phân tích gồm Auramine O và Rhodamine B. Kết quả thu được từ quá trình đo độ hấp thụ quang của các chất phân tích trong dung môi MeOH và ACN được tóm tắt trong Bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả bước sóng và độ hấp thụ cực đại của các chất phân tích trong MeOH và trong ACN Dung Nồng độ Bước sóng hấp thụ cực Độ hấp thụ Chất phân tích môi (ppm) đại (λ, nm) (A) AO 1,0 430,70 0,3355 RB 1,0 545,34 0,5007 MeOH AO: 1,0 430,25 0,3512 Hỗn hợp (AO, RB) RB: 1,0 545,28 0,5094 AO 1,0 440,99 0,3255 RB 1,0 555,33 0,4022 ACN AO: 1,0 440,64 0,3689 Hỗn hợp (AO, RB) RB: 1,0 555,21 0,4114 Như vậy, dựa vào kết quả khảo sát bước sóng và độ hấp thu cực đại của chất phân tích trong các dung môi MeOH, ACN được chỉ ra trên Bảng 3.1 chúng tôi chọn MeOH làm dung môi hòa tan chất chuẩn và chọn vùng quét phổ đối với đầu dò PDA từ 400 – 600 nm. 3.1.2. Tối ưu hóa pha động 3.1.2.1. Khảo sát dung môi pha động Dung môi được lựa chọn để khảo sát là acetonitrile và methanol được điều chỉnh pH bằng acid acetic pH = 4,5. Chương trình sắc ký với pha tĩnh là RP – C18, nhiệt độ cột tách là 35oC 5oC, nồng độ hai chất phân tích là 2,0 ppm, bước sóng khảo sát từ 400 – 600 nm, tốc độ dòng là 1mL/phút. Chương trình gradient pha động[23] theo đồ thị Hình 2.1. Kết quả phân tích sắc ký AO và RB với dung môi pha động ACN – CH3COOH và MeOH – CH3COOH được cho trong Bảng 3.2. 32
  46. Bảng 3.2. Kết quả khảo sát dung môi pha động Dung môi MeOH – CH3COOH Dung môi ACN – CH3COOH Thông số AO RB AO RB Thời gian lưu, tR 7,92 13,83 7,30 10,05 Hệ số dung 1,96 4,16 1,65 2,97 lượng, k' Hệ số không đối 13,62 1,17 4,63 12,52 xứng, T Chiều cao peak 14955 34647 13224 10622 sắc ký Dựa vào Bảng 3.2, chúng ta thấy nếu sử dụng ACN làm dung môi rửa giải thì thời gian phân tích ngắn. Tuy nhiên, nếu sử dụng ACN làm dung môi pha động thì chiều cao của AO và RB đều thấp hơn so với dùng MeOH , ảnh hưởng đến LOD của phương pháp. Ngoài ra, nếu sử dụng ACN làm dung môi pha động thì peak sắc ký của AO và RB đều bị kéo đuôi trên một khoảng rất rộng, kết hợp tham khảo ở các tài liệu[21][23][26] chúng tôi chọn dung môi pha động là MeOH. Sử dụng MeOH làm dung môi pha động, theo kết quả khảo sát được thì ta thấy rằng peak sắc ký của RB hẹp nhưng peak sắc ký của AO kéo đuôi. Vì vậy, cần khảo sát pH thích hợp để loại bỏ sự kéo đuôi của AO. 3.1.2.2. Khảo sát pH pha động Kết quả khảo sát pH được thể hiện trong các bảng sau: Bảng 3.3. Khảo sát các giá trị pH sử dụng acid acetic Acid acetic Thông số pH = 3,0 pH = 3,6 pH = 4,0 pH = 4,5 AO RB AO RB AO RB AO RB tR 6,83 7,78 7,17 7,93 6,58 8,52 6,75 8,02 k' 2,25 2,71 1,24 1,52 3,33 5,41 2,21 2,82 T 1,37 1,07 6,57 5,06 4,30 1,78 2,33 1,92 Rs AO và RB 2,00 0,32 1,55 1,50 Khi sử dụng acid acetic điều chỉnh pH của pha động thì đường nền không ổn định. Vùng nền phía trước peak AO thường bị dâng nền, vùng nền phía sau peak RB bị sụt nền. 33
  47. Hình 3.1. Sắc đồ khảo sát pH = 3 sử dụng acid acetic 8 6 T 4 2 0 3 3.5 4 4.5 5 pH Hình 3.2. Sự phụ thuộc của hệ số không đối xứng theo pH Từ đồ thị Hình 3.2., chúng ta có thể dự đoán để thu được peak sắc ký đối xứng cao thì nên giảm pH của pha động. Bảng 3.4. Khảo sát pH = 3 sử dụng acid formic Acid formic Thông số pH = 3,0 AO RB tR 6,50 7,97 k' 1,60 2,19 T 2,00 1,66 Rs của AO và RB 1,47 Khi sử dụng acid formic điều chỉnh pH của pha động thì đường nền không ổn định, peak sắc ký của AO kéo đuôi (Hình 3.3.). 34
  48. Hình 3.3. Sắc đồ khảo sát pH = 3,0 sử dụng acid formic Bảng 3.5. Khảo sát pH = 2,3 và 2,6 sử dụng H3PO4 Acid phosphoric Thông số pH = 2,6 (H3PO4 0,03%) pH = 2,3 (H3PO4 0,072%) AO RB AO RB Thời gian 16,42 19,38 16,24 19,17 lưu, tR Hệ số dung 4,78 5,83 4,52 5,79 lượng, k’ Hệ số không 1,00 1,19 1,38 1,19 đối xứng, T Sắc đồ chuẩn AO và RB (nồng độ 2 ppm) khi sử dụng acid phosphoric 0,03% làm thành phần pha động được chỉ ra ở Hình 3.4. Hình 3.4. Sắc đồ khảo sát pH = 2,6 sử dụng acid phosphoric Như vậy, khi sử dụng acid H3PO4 để điều chỉnh pH pha động thì các peak sắc ký AO và RB tách tốt, độ phân giải Rs > 1,5 đường nền ổn định, hệ số không đối xứng (T) của AO và RB nằm trong khoảng 0,9 – 1,2 nên peak AO và RB có tính đối xứng cao (lý tưởng). 35
  49. Khi sử dụng acid phosphoric 0,072% cho kết quả tương đồng với acid phosphoric 0,03%. Giá trị các thông số về thời gian lưu, hệ số dung lượng, hệ số không đối xứng không khác nhau nhiều. Vì vậy, chúng tôi chọn acid H3PO4 0,03% để ổn định pH pha động và bảo vệ cột. Tuy nhiên, thời gian lưu của AO và RB quá lâu nên cần khảo sát chương trình dung môi pha động (gradient rửa giải) và tốc độ dòng để giảm thời gian lưu nhằm đạt được tính kinh tế trong quá trình phân tích. 3.1.2.3. Khảo sát chương trình dung môi pha động với chế độ đẳng dòng Sau khi tiến hành phân tích sắc ký với chương trình đẳng dòng sử dụng dung môi MeOH và HCOOH (pH = 3) theo tỉ lệ 40:60, chúng tôi thu được sắc đồ như Hình 3.5. Hình 3.5. Sắc đồ chạy đẳng dòng với dung môi MeOH – HCOOH (pH = 3) Sau khi tiến hành phân tích sắc ký với chương trình đẳng dòng sử dụng dung môi ACN và HCOOH (pH = 3) theo tỉ lệ 40:60, chúng tôi thu được sắc đồ như Hình 3.6. Hình 3.6. Sắc đồ chạy đẳng dòng với dung môi ACN – HCOOH (pH = 3) Sau khi tiến hành phân tích sắc ký với chương trình đẳng dòng sử dụng dung môi ACN và đệm acetate (pH = 4,2) theo tỉ lệ 80:20, chúng tôi thu được sắc đồ như Hình 3.7. 36
  50. Hình 3.7. Sắc đồ chạy đẳng dòng với dung môi ACN – đệm acetate Kết quả cho thấy, khi tiến hành khảo sát chương trình dung môi pha động với chế độ đẳng dòng thì các peak AO và RB đều không đủ tiêu chuẩn định lượng. Vì vậy, để định lượng AO và RB cần thực hiện chương trình dung môi pha động với chế độ gradient. 3.1.2.3. Khảo sát tốc độ dòng Chúng tôi khảo sát 4 mức tốc độ dòng là 0,6 mL/phút; 0,7 mL/phút; 0,85 mL/phút và 1,0 mL/phút với chương trình sau: Bảng 3.6. Chương trình gradient khảo sát tốc độ dòng Thời gian %MeOH %H3PO4 (0,03%) 0 43,7 56,3 5 43,7 56,3 13 80 20 20 30 70 Sau khi thực hiện chương trình sắc ký với các điều kiện trên, chúng tôi thu được các sắc đồ: Hình 3.8. Sắc đồ AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,6 mL/phút 37
  51. Hình 3.9. Sắc đồ AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,7 mL/phút Hình 3.10. Sắc đồ AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,85 mL/phút Hình 3.11. Sắc đồ AO và RB ứng với tốc độ dòng 1 mL/phút Với tốc độ dòng nhỏ, các peak có thể bị doãng và peak AO kéo đầu nhiều. Khi tốc độ dòng lớn, cường độ tín hiệu có giảm nhưng thời gian lưu AO và RB ngắn hơn. Do đó, chúng tôi chọn tốc độ dòng đối với sự phân tách AO và RB là 1 mL/phút. 3.1.2.4. Khảo sát tỉ lệ dung môi ban đầu Tốc độ dòng tối ưu được lựa chọn là 1 mL/phút. Với tốc độ dòng này, chúng tôi lựa chọn tỉ lệ dung môi ban đầu ở 2 mức: 30% MeOH và 43,7% MeOH. 38
  52. Bảng 3.7. Khảo sát tỉ lệ dung môi ban đầu Tốc độ dòng 1 mL/phút Thời % H3PO4 Thời % H3PO4 % MeOH % MeOH gian (0,03%) gian (0,03%) 0 30 70 0 43,7 56,3 5 30 70 5 43,7 56,3 16 80 20 13 80 20 20 30 70 20 30 70 - Peak sắc ký AO và RB thon, gọn. - Peak sắc ký RB thon, gọn nhưng peak sắc ký AO bị kéo đầu. - Đường nền phía sau RB bị dâng nền. - Cường độ tín hiệu AO thấp.  Kết luận Sau khi tối ưu hóa dung môi pha động, pH (loại acid/ đệm) và chương trình gradient pha động. Đồng thời kiểm tra cường độ tín hiệu, sự nhiễu nền, tR lớn hơn 5 phút, chúng tôi thu được các kết quả tối ưu như sau: - Dung môi pha động: Methanol – Acid H3PO4 (0,03%). - Chương trình hóa dung môi pha động: chạy gradient Bảng 3.8. Chương trình gradient tối ưu Tốc độ dòng Thời gian %MeOH %H3PO4 (0,03%) (mL/phút) 0 30 70 1 5 30 70 1 16 80 20 1 20 30 70 1 39
  53. 3.2. Thẩm định phương pháp 3.2.1. Tính đặc hiệu/chọn lọc Khảo sát với các chuẩn hỗn hợp chứa đồng thời hai chất phân tích Auramine O và Rhodamine B thì thấy rằng peak sắc ký của Auramine O bị ảnh hưởng nhiều bởi nền hơn so với Rhodamine B. Đồng thời, với nồng độ Auramine O và Rhodamine B thấp hơn 0,1 ppm thì diện tích các peak sắc ký nhỏ lại bị ảnh hưởng nhiều bởi nền nên gây ra khó khăn trong quá trình cắt peak. 3.2.2. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 3.2.2.1. Xây dựng đường chuẩn của AO và RB Bảng 3.9. Dữ liệu nồng độ và diện tích AO, RB thu được khi tiến hành chạy sắc ký Diện tích peak sắc ký Nồng độ (ppm) Lần đo AO RB Lần 1 113,989 93,910 Lần 2 113,710 124,479 0,05 Lần 3 117,010 119,236 Trung bình 114,903 112,542 Lần 1 245,700 240,125 0,10 Lần 2 246,130 236,670 Trung bình 245,915 238,398 Lần 1 521,200 561,683 0,20 Lần 2 521,292 561,241 Trung bình 521,246 561,462 Lần 1 1437,478 1498,623 0,50 Lần 2 1433,890 1488,640 Trung bình 1435,684 1493,632 Lần 1 2950,071 2971,18 1,00 Lần 2 2956,904 2982,394 Trung bình 2953,488 2976,706 Lần 1 6004,887 5855,801 2,00 Lần 2 5976,327 5837,512 Trung bình 5990,607 5846,657 40
  54. Dựa vào Bảng 3.9, sử dụng phần mềm Origin 8.5.1 của hãng Microcal và Microsoft Excel xây dựng đường chuẩn. Kết quả đường chuẩn của AO và RB được trình bày trong hình. 6000 5000 y = 3022,8x - 62,647 R² = 0,9999 4000 3000 2000 Diện Diện (AU) tích 1000 0 0 0.5 1 1.5 2 Nồng độ AO (ppm) Hình 3.12. Quan hệ tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ Auramine O Kết quả tính toán được chỉ ra bởi phần mềm như sau: Y=A+BX Hệ số Giá trị Sai số chuẩn A -62,6469 10,59115 B 3022,78556 11,26622 R SD N P 0,99997 18,95969 5 <0,0001 6000 5000 y = 2949.4x - 20.993 R² = 0.9997 4000 3000 2000 Diện Diện (AU) tích 1000 0 0 0.5 1 1.5 2 Nồng độ RB (ppm) Hình 3.13. Quan hệ tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ Rhodamine B Kết quả tính toán được chỉ ra bởi phần mềm như sau: Y=A+BX 41
  55. Hệ số Giá trị Sai số chuẩn A -20,99349 22,36225 B 2949,4444 23,78761 R SD N P 0,99987 40,03168 5 <0,0001 3.2.2.2. Độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn Phương trình đường chuẩn đầy đủ (chưa xét độ lệch chuẩn hệ số A và B) của AO và RB như sau: Hệ số tương quan hồi quy Chất phân tích Phương trình đường chuẩn (R) AO Y= -62,6469+ 3022,78556X 0,99997 RB Y= -20,99349+2949,4444X 0,99987 Với các hệ số hồi quy tương quan trên, đường chuẩn AO và RB đạt yêu cầu về hệ số tương quan (0,995 ≤ R ≤ 1) Bảng 3.10. Độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn AO RB Nồng độ Nồng độ AO Nồng độ RB (ppm) của STT (ppm) tính Độ chệch (ppm) tính Độ chệch các điểm theo phương ( i ,%) theo phương ( ,%) chuẩn trình hồi quy trình hồi quy 1 0,05 0,059 17,474 0,045 -9,452 2 0,10 0,102 2,079 0,088 -12,053 3 0,20 0,193 -3,418 0,197 -1,260 4 0,50 0,496 -0,864 0,514 2,706 4 1,00 0,998 -0,220 1,016 1,636 6 2,00 2,003 0,127 1,989 -0,530 Các giá trị tính được đối với các điểm chuẩn AO và RB thỏa mãn quy định về độ chệch của các tổ chức Mỹ, Châu Âu. Như vậy, đường chuẩn AO và RB đủ yêu cầu để tiến hành phân tích định lượng. 3.2.2.3. Hệ số dung lượng và hệ số không đối xứng Các kết quả về hệ số dung lượng ( k') và hệ số không đối xứng (T) của các chất phân tích ở các giá trị nồng độ khác nhau được cho trong các Bảng 3.11 và Bảng 3.12: 42
  56. Bảng 3.11. Hệ số dung lượng và hệ số không đối xứng của AO Nồng độ (ppm) Hệ số dung lượng k' Hệ số không đối xứng T 0,05 4,81 1,38 0,30 4,81 1,38 0,50 4,78 1,17 0,75 4,78 1,00 1,00 4,78 1,00 1,50 4,78 1,38 2,00 4,78 1,38 Bảng 3.12. Hệ số dung lượng và hệ số không đối xứng của RB Nồng độ (ppm) Hệ số dung lượng Hệ số không đối xứng T 0,05 5,83 1,19 0,30 5,83 1,19 0,50 5,80 1,20 0,75 5,84 1,20 1,00 5,84 1,20 1,50 5,79 1,19 2,00 5,83 1,19 3.2.2.4. Kiểm tra sai số hệ thống của phương pháp Phương pháp tiến hành sắc ký xây dựng đường chuẩn AO và RB có thể mắc sai số hệ thống. Để kiểm tra phương pháp có mắc sai số hệ thống hay không thì ta cần tiến hành kiểm tra sự khác nhau giữa giá trị a và giá trị 0 có ý nghĩa thống kê hay không với độ tin cậy thống kê P= 0,95. Phương trình đầy đủ của đường chuẩn có dạng: Y (A tS)(P,f N 2)A(P,f(B tS)X N 2)B Tra bảng phân phố chuẩn với P=0,95; f=4 ta được t(0,95;4)=2,776. Nếu xem A0 thì phương trình Y A BX được viết thành YBX ' . Thay các ' giá trị Yi và Xi vào phương trình ta sẽ được các giá trị Bi và khi đó ta tính  Bi được B i với N là số điểm trên đường chuẩn, có tính đến điểm có nồng độ bằng i N1 0. Phương trình đầy đủ khi a0 có dạng Y (B' t S )X. (P,f N 2) B' 43
  57. Kiểm tra sự sai khác giữa giá trị a với giá trị 0 theo chuẩn F (Ftính > 1) và so sánh giá trị này với F(P, f1, f2) với P = 0,95; f1 = N – 3 = 3; f2 = N – 2 = 4. Các kết quả được chỉ ra trong bảng dưới đây: Bảng 3.13. Diện tích của các chất phân tích và giá trị B' tương ứng ở mỗi nồng độ i Nồng AO RB B' B' độ (Xi) Diện tích (Yi) i Diện tích (Yi) i 0,05 114,90 2298,00 112,54 2250,84 0,10 245,92 2459,20 238,40 2383,98 0,20 521,25 2606,25 561,46 2807,31 0,50 1435,70 2871,40 1493,63 2987,26 1,00 2953,50 2953,50 2976,71 2976,71 2.00 5990,60 2995,30 5846,66 2923,33 Bảng 3.14. Bảng các giá trị Ftính của các chất phân tích Chất Phương trình hồi quy Phương sai Ftính Fbảng Y= (-63 29)+ (3023 31)X Sy=40,03 AO 6,44 9,12 1 ' Y= (2697 32.10 )X S15,77y Y= (-21 62)+(2949 66)X Sy= 18,96 RB 1,10 9,12 1 ' Y=(2722 37.10 )X S18,11y Từ kết quả tính toán ở Bảng 3.6. nhận thấy các giá trị Ftính < Fbảng nên sự khác nhau giữa giá trị A và giá trị 0 là không có ý nghĩa thống kê. Như vậy, phương pháp tiến hành sắc ký không mắc sai số hệ thống. Do đó, chúng tôi lựa chọn điều kiện này để phân tích các mẫu thực phẩm. 3.2.3. Giới hạn phát hiện Giới hạn phát hiện Auramine O, Rhodamine B bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối đầu dò PDA theo đường chuẩn: S 18,95969 LOD330,01882 y (ppm) AO B3022,78556 S 40,03168 LOD 3 y 3 0,04072 (ppm) RB B 2949,4444 Dựa trên LOD tính được theo đường chuẩn, chúng tôi pha loãng AO và RB đến nồng độ 0,02 ppm, sau đó tiến hành sắc chạy HPLC và xác định LOD dựa vào tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N). Kết quả thu được như sau: 44
  58. Nồng độ SH Chất phân tích H h N h (ppm) 2 AO 0,02 392 308 2,545 RB 0,02 645 442 2,919 Như vậy, LOD đối với Auramine O: 0,02 ppm và LOD đối với Rhodamine B: 0,02 ppm. Hình bên dưới chỉ ra sắc đồ hỗn hợp AO và RB ở giới hạn phát hiện trên nền mẫu thật. Hình 3.14. Sắc đồ xác định LOD của AO và RB ở nồng độ 0,02 ppm 3.2.4. Giới hạn định lượng Giới hạn định lượng Auramine O, Rhodamine B được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối đầu dò PDA dựa vào tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) trên nền mẫu thật. Kết quả thu được như sau: Nồng độ Chất phân tích H h (ppm) AO 0,05 1042 200 10,420 RB 0,05 1321 274 9,642 Như vậy, LOQ đối với AO: 0,05 ppm và LOQ đối với RB: 0,05 ppm. Hình bên dưới chỉ ra sắc đồ AO và RB ở giới hạn định lượng. 45
  59. Hình 3.15. Sắc đồ xác định LOQ của AO và RB ở nồng độ 0,05 ppm 3.2.5. Khảo sát độ lặp lại của phép đo Độ lặp lại của hệ thống sắc ký được khảo sát bằng cách tiêm lặp 7 lần cùng 1 mẫu chuẩn hỗn hợp (AO và RB) có nồng độ 2,0 ppm vào hệ thống HPLC với điều kiện tối ưu hóa đã khảo sát. Kết quả được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích peak sắc ký và thời gian lưu tR. Bảng 3.15. Khảo sát độ lặp lại của phép đo Thời gian lưu Diện tích peak Lần AO RB AO RB 1 14,467 17,400 5664,660 5588,101 2 14,450 17,383 5753,625 5646,242 3 14,450 17,383 5787,972 5693,114 4 14,450 17,383 5761,298 5711,542 5 14,450 17,383 5812,427 5704,386 6 14,450 17,383 5802,885 5776,700 7 14,433 17,367 5800,698 5748,406 Trung bình 14,5 9,1.10-3 17,4 9,1.10-3 5769 59 5695 49 RSD% 6,8.10-1 % 5,5.10-2 % 8,8.10-1 % 1,1% Các kết quả tính RSD% đều không vượt quá 1,8% nên theo tiêu chuẩn AOAC hệ thống HPLC có độ lặp lại tốt. Đối với phép phân tích định lượng, RSD% đối với AO 46
  60. là 8,8.10-1 % và đối với RB là 1,1 %. Quy trình phân tích ổn định và có thể sử dụng để phân tích mẫu thật. 3.3. Quy trình phân tích mẫu thực tế 3.3.1. Quy trình chiết mẫu Cân khoảng 5 gam măng, cho vào ống ly tâm 50 mL, thêm vào mẫu 0,25 mL dung dịch chuẩn hỗn hợp AO và RB nồng độ 100 ppm để mẫu ở trong tủ đông 12 giờ. Thực hiện chiết theo quy trình đã đề xuất trong phần thực nghiệm. Kết quả thu được như trong Bảng 3.16. sau đây: Bảng 3.16. Thể tích chiết và diện tích peak sắc ký Diện tích peak Lần chiết Thể tích chiết (mL) AO RB 1 10 2003,40 2334,98 2 5 453,56 690,34 3 5 134,33 205,41 4 5 97,75 111,87 a) b) 2500 2500 2000 2000 1500 1500 1000 1000 500 500 0 0 (AU) RB tích Diện 1 2 3 4 Diện tích AO (AU) AO tích Diện 1 2Lần chiết3 4 Lần chiết Hình 3.16. Sự phụ thuộc của diện tích peak vào các lần chiết AO (a) và RB (b) Như vậy, sau khi khảo sát quy trình chiết, chúng tôi thấy rằng với thể tích chiết 25 mL (chiết 3 lần theo thứ tự 10 mL, 5mL, 5mL) sẽ chiết hoàn toàn AO và RB có trong mẫu thực phẩm. Vì vậy, chúng tôi đề xuất quy trình xử lý mẫu như Hình 3.17: 47
  61. • Cân khoảng 5 gam mẫu (chính xác đến 0,00001 g) trên cân phân tích Bước 1 • Cho mẫu vào ống ly tâm 50 mL • Thêm vào ống ly tâm 10 mL dung môi chiết ACN - NH3 (0,5%, v/v) theo tỉ lệ (70:30) • Lắc ống ly tâm trong 10 phút Bước 2 • Siêu âm trong 10 phút (ở 40oC) • Ly tâm trong 10 phút • Thu lấy phần dung dịch phía trên và cho vào bình định mức 25 • Thêm tiếp vào ống ly tâm 5 mL dung môi chiết ACN - NH3 (0,5%, v/v) theo tỉ lệ (70:30) • Lắc ống ly tâm trong 10 phút • Siêu âm trong 10 phút (ở 40oC) Bước 3 • Ly tâm trong 10 phút • Thu lấy phần dung dịch phía trên và cho vào bình định mức 25 mL ở bước 2. • Lặp lại bước 3 thêm hai lần • Tất cả dịch chiết thu được vào bình định mức 25 mL, định mức đến vạch Bước 4 bằng dung môi chiết. • Lọc qua màng lọc 0,45 micromet trước khi tiêm vào hệ thống HPLC Hình 3.17. Quy trình xử lý mẫu tối ưu 3.3.2. Mẫu măng Tiến hành xử lý và phân tích thử một mẫu măng đã được chuẩn bị, kết quả thu được mẫu măng không có AO và RB. Kết quả đã được phân tích đối chứng bởi Công ty TNHH một thành viên Khoa học và Công nghệ Hoàn Vũ. Phương pháp do Công ty sử dụng để phân tích AO và RB là LC/MS/MS với LOD đối với AO là 0,005 ppm và LOD đối với RB là 0,05 ppm. Kết quả mẫu măng do Công ty phân tích đối chứng cũng không chứa AO và RB. Vì vậy, chúng tôi thực hiện xác định hệ số thu hồi và phân tích mẫu đồng thời để kiểm tra độ đúng của phương pháp mà chúng tôi nghiên cứu. 3.3.2.1. Phân tích mẫu măng và xác định hệ số thu hồi Cân khoảng 5 gam mẫu măng trên cân phân tích (chính xác đến 0,00001) và cho vào ống ly tâm 50 mL. Các ký hiệu mẫu, khối lượng mẫu, thể tích, diện tích peak sắc ký được chỉ ra trong Bảng 3.17. Trong đó A, B, C, D, E, F được lấy từ cùng 1 mẫu măng và A, B, C là các mẫu được thêm chuẩn; D, E, F là các mẫu không thêm chuẩn. 48
  62. Bảng 3.17. Kết quả phân tích mẫu măng Thể tích (µL) Thể tích (mL) Diện tích Ký hiệu Khối lượng chuẩn 100 dung dịch thu mẫu mẫu (g) AO RB ppm được A 5,01213 250 25 2298,05 2720,85 B 5,01042 250 25 2076,22 2503,52 C 5,14266 250 25 2003,40 2334,98 D 5,17497 0 25 0 0 E 5,03305 0 25 0 0 F 5,10954 0 25 0 0 Do các mẫu thực không thêm chuẩn không cho tín hiệu AO và RB nên chúng tôi pha chuẩn hỗn hợp 1,0 ppm trong dung môi chiết để khảo sát hệ số thu hồi. Bảng 3.18. Hệ số thu hồi AO, RB của mẫu măng Diện tích Hệ số thu hồi (%) Mẫu AO RB AO RB Chuẩn 1,0 ppm 2651,37 3162,76 - - A 2298,05 2720,85 86,67 86,03 B 2076,22 2503,52 78,31 79,16 C 2003,40 2334,98 75,56 73,83 TRUNG BÌNH 80 14 80 15 49
  63. 3.3.2.2. Tính chọn lọc AO và RB đối với phân tích mẫu măng Hình 3.18. Các sắc ký đồ phân tích mẫu măng a) Mẫu có thêm chuẩn, b) Dung dịch chuẩn 1,0 ppm, c) Mẫu không thêm chuẩn Kết quả khảo sát tính chọn lọc chỉ ra rằng có sự tương đồng về thời gian lưu của AO và RB trong các mẫu thêm chuẩn và không thêm chuẩn. Ngoài ra, các peak tạp trong mẫu có thêm chuẩn và mẫu không thêm chuẩn cũng có sự tương đồng về thời gian lưu. Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết peak của đầu dò PDA cho thấy peak AO và RB đối với mẫu có thêm chuẩn có độ tinh khiết 100%. Kiểm tra bước sóng của các peak có cường độ cực đại, kết quả cho thấy các cực đại hấp thụ này có bước sóng tương đồng với bước sóng hấp thụ cực đại của AO và RB đã khảo sát. Như vậy, quy trình định lượng AO, RB có tính chọn lọc. 50
  64. Hình 3.19. Bước sóng ứng với hấp thụ cực đại của AO Hình 3.20. Bước sóng ứng với hấp thụ cực đại của RB 3.3.3. Mẫu cải chua 3.3.3.1. Phân tích cải chua và xác định hệ số thu hồi Cân khoảng 5 gam mẫu cải chua trên cân phân tích (chính xác đến 0,00001g) và cho vào ống ly tâm 50 mL. Các ký hiệu mẫu, khối lượng mẫu, thể tích, diện tích peak sắc ký được chỉ ra trong Bảng 3.19. Trong đó A, B, C, D, E, F được lấy từ cùng 1 mẫu cải chua và A, B, C là các mẫu được thêm chuẩn; D, E, F là các mẫu không thêm chuẩn. 51
  65. Bảng 3.19. Kết quả phân tích mẫu cải chua Thể tích Diện tích Thể tích (µL) Ký hiệu Khối lượng (mL) dung chuẩn 100 mẫu mẫu (g) dịch thu AO RB ppm được A 5,04444 250 25 2287,67 2767,33 B 5,12013 250 25 2412,13 2902,54 C 5,00030 250 25 2062,043 2851,95 D 5,01767 0 25 0 0 E 5,01375 0 25 0 0 F 5,22954 0 25 0 0 Do các mẫu thực không thêm chuẩn không cho tín hiệu AO và RB nên chúng tôi pha chuẩn hỗn hợp 1,0 ppm trong dung môi chiết để khảo sát hệ số thu hồi. Bảng 3.20. Hệ số thu hồi AO, RB của mẫu cải chua Diện tích peak Hệ số thu hồi (%) Mẫu AO RB AO RB Chuẩn 1,0 ppm 2658,38 3169,699 - - A 2287,67 2767,33 86,06 87,31 B 2412,13 2902,54 90,74 91,57 C 2062,043 2851,95 77,57 89,98 TRUNG BÌNH 85 17 89,6 5,3 3.3.3.2. Tính chọn lọc AO và RB đối với phân tích mẫu cải chua Kết quả khảo sát tính chọn lọc chỉ ra rằng có sự tương đồng về thời gian lưu của AO và RB trong các mẫu thêm chuẩn và không thêm chuẩn. Ngoài ra, các peak tạp trong mẫu có thêm chuẩn và mẫu không thêm chuẩn cũng có sự tương đồng về thời gian lưu. Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết peak của đầu dò PDA cho thấy peak AO và RB đối với mẫu có thêm chuẩn có độ tinh khiết 100%. Như vậy, quy trình định lượng AO, RB có tính chọn lọc. 52
  66. 3.3.4. Mẫu thịt gà 3.3.4.1. Phân tích mẫu gà và xác định hệ số thu hồi Cân khoảng 5 gam mẫu thịt gà trên cân phân tích (chính xác đến 0,00001g) và cho vào ống ly tâm 50 mL. Các ký hiệu mẫu, khối lượng mẫu, thể tích, diện tích peak sắc ký được chỉ ra trong Bảng 3.21. Trong đó A, B, C, D, E, F được lấy từ cùng 1 mẫu thịt gà và A, B, C là các mẫu được thêm chuẩn; D, E, F là các mẫu không thêm chuẩn. Bảng 3.21. Kết quả phân tích mẫu thịt gà Thể tích (mL) Diện tích peak Ký hiệu Khối lượng Thể tích (µL) dung dịch thu AO RB mẫu mẫu (g) chuẩn 100 ppm được A 5,03029 250 25 2307,74 2902,54 B 5,00266 250 25 2362,03 2941,80 C 5,02111 250 25 2427,96 2501,03 D 5,00842 0 25 0 0 E 5,01430 0 25 0 0 F 5,14600 0 25 0 0 Do các mẫu thực không thêm chuẩn không cho tín hiệu AO và RB nên chúng tôi pha chuẩn hỗn hợp 1,0 ppm trong dung môi chiết để khảo sát hệ số thu hồi. Bảng 3.22. Hệ số thu hồi AO và RB của mẫu thịt gà Diện tích peak Hệ số thu hồi (%) Mẫu AO RB AO RB Chuẩn 1,0 ppm 2651,37 3162,76 - - A 2307,74 2902,54 89,18 92,86 B 2362,03 2941,80 87,04 91,77 C 2427,96 2501,3 89,09 93,01 TRUNG BÌNH 88,4 3,0 92,6 1,7 3.3.4.2. Tính chọn lọc AO và RB đối với phân tích mẫu thịt gà Kết quả khảo sát tính chọn lọc chỉ ra rằng có sự tương đồng về thời gian lưu của AO và RB trong các mẫu thêm chuẩn và không thêm chuẩn. Ngoài ra, các peak tạp trong mẫu có thêm chuẩn và mẫu không thêm chuẩn cũng có sự tương đồng về thời gian lưu. 53
  67. Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết peak của đầu dò PDA cho thấy peak AO và RB đối với mẫu có thêm chuẩn có độ tinh khiết 100%. Như vậy, quy trình định lượng AO, RB có tính chọn lọc. 3.3.5. Kết quả khảo sát mẫu thực tế Hàm lượng chất phân tích được tính thông qua biểu thức sau: mg C()o 1 L 1000 g X (mg ) L 25 (mL) kg mo (g) 1000 mL 1 kg Trong đó: Co là nồng độ chất phân tích tính theo phương trình đường chuẩn, mo là khối lượng mẫu phân tích. Sau khi tiến hành phân tích các mẫu thực phẩm (măng, cải chua, thịt gà) sử dung̣ quy trình đươc̣ đề xuất, chúng tôi không phát hiện AO và RB trong thành phần của mẫu. 54
  68. CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Sau quá trình nghiên cứu, khảo sát các điều kiện thực nghiệm, sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) kết nối đầu dò PDA để xác định đồng thời Auramine O và Rhodamine B trong một số mẫu thực phẩm, chúng tôi đã hoàn thành những công việc sau: 1. Khảo sát được điều kiện tối ưu cho phương pháp phân tích sắc ký tách Auramine O và Rhodamine B o Cột tách: Cột Zorbax Eclipse XDB – C18 o Detector: PDA với vùng quét phổ từ 400 – 600 nm o Thành phần dung môi pha động: Methanol – H3PO4 (0,03%) o Chương trình hóa dung môi: Gradient Thời gian %MeOH %H3PO4 Tốc độ dòng (mL/phút) Curve 0 30 70 1 1 5 30 70 1 6 16 80 20 1 6 20 30 70 1 1 2. Thẩm định phương pháp Khoảng đường chuẩn Auramine O và Rhodamine B: 0,05 ppm – 2,00 ppm Giới hạn phát hiện Auramine O và Rhodamine B: 0,02 ppm Giới hạn định lượng Auramine O và Rhodamine B: 0,05 ppm Hệ số biến thiên: với nồng độ 2,00 ppm, RSD% diện tích AO là 8,8.10-1 % và RB 1,1% . 3. Thực hiện khảo sát các mẫu thực tế Đã đề xuất được quy trình thích hợp để xử lý một số mẫu thực phẩm (thịt gà, măng, cải chua), hệ số thu hồi các chất phân tích trong các mẫu măng, cải chua, thịt gà đạt từ 79,67% – 92,55% Sử dung̣ quy trình đề xuất để phân tích 3 mẫu (măng, cải chua, thịt gà). Kết quả phân tích không phát hiện Auramine O, Rhodamine B trong các mẫu đươc̣ khảo sát. Đã gửi mẫu măng đến Công ty TNHH một thành viên Khoa học Công nghệ Hoàn Vũ để phân tích đối chứng bằng phương pháp LC – MS/MS. Kết quả phân tích đối chứng phù hợp kết quả phòng thí nghiệm. 55
  69. Với những kết quả đã đạt được, chúng tôi nhận thấy rằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối đầu dò PDA có độ nhạy cao, phù hợp phân tích đồng thời Auramine O và Rhodamine B trong các mẫu thực phẩm, quy trình xử lý mẫu đơn giản, thời gian xử lý và phân tích mẫu ngắn. 4.2. Kiến nghị Trong quá trình thực hiện đề tài, do hạn hẹp về thời gian và điều kiện thiết bị còn hạn chế nên một số giai đoạn phân tích chưa thể tiến hành phân tích lặp, chưa bố trí đầy đủ các thí nghiệm khảo sát độ chính xác của phương pháp phân tích (độ đúng, độ chụm). Vì vậy, để nâng cao độ tin cậy của phương pháp nên tiến hành bố trí thêm các thí nghiệm khảo sát độ chụm, độ đúng (hệ số thu hồi) của quy trình phân tích. Sử dụng quy trình phân tích được đề xuất để phân tích trên nhiều mẫu hơn. 56
  70. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Nguyễn Huỳnh Tuấn Anh, Mai Thanh Bình, Đinh Thị Hạ Long, Đỗ Vũ Phương Thảo, Vương Quang Huy, Nguyễn Vũ Khí, Phạm Thị Ánh, Diệp Ngọc Sương, Chu Phạm Ngọc Sơn. (n.d.). Phân tích phụ gia thực phẩm và các chất có liên quan tại công ty dịch vụ khoa học công nghệ Sắc ký Hải Đăng. Thành Phố Hồ Chí Minh: Công ty cổ phần dịch vụ khoa học công nghệ Sắc Ký Hải Đăng. 2. Phạm Tuấn Anh, Nguyễn Thị Kim Thường. (2017, 9-10). Nghiên cứu xác định hàm lượng Auramine O trong mẫu thực phẩm bằng phương pháp Volt - Ampere hòa tan hấp thụ xung vi phân. Thử nghiệm ngày nay, 6-10. 3. Lê Thị Hường Hoa. (2013). Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và xác định hàm lượng một số chất bị cấm sử dụng trong mỹ phẩm . Hà Nội. 4. Trần Tứ Hiếu, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung, Từ Vọng Nghi. (2003). Hóa học phân tích- Phần 2 (Các phương pháp phân tích công cụ) . Hà Nội: Đại học Quốc Gia Hà Nội. 5. Nguyễn Kim Phi Phụng. (2007). Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ. Hồ Chí Minh: NXB Đại học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh. 6. Bùi Thị Ngoan, Trần Thắng, Bùi Thị Kim Ngân. (2010). Xác định Rhodmine B trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Y học thực hành (732). 7. QCVN 4-10/2010. Quy chuẩn Quốc Gia về phụ gia thực phẩm – phẩm màu. 8. TCVN ISO/IEC 17025:2005. Yêu cầu chung về năng lực của phòng thử nghiệm và hiệu chuẩn. 9. TCVN 6910 1-6. (2005). Độ chính xác(độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và các kết quả. 10. Tạ Thị Thảo. (2005). Thống kê trong hoá phân tích. Đại học Quốc gia Hà Nội. Tiếng Anh 11. AOAC International. (2007). How to meet ISO 17025 requirements for method verification, USA. 12. AOAC International. (1990). Official methods of analysis, USA. 13. Chen, H.-s. (2007). Identifcation of Rhodamine 6g and Rhodamine B dyes. Forensic Science Journal. 6(1), 21-37. 57
  71. 14. Hewlett Packard (HP). (1993). Peak purity analysis in HPLC and CE using diode array technology. Germany. 15. ISO 5725 1 – 6. (1994). Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results. 16. ISO/IEC 17025. (2005). General requirements for the competence of testing and calibration laboratories. 17. ICH. (1996). Validation of Analytical Procedures: Text and methodology. ICH Hamonised Tripartite Guideline. 18. Jared Anderson. (2015). Analytical Separation Science, Wiley –VCH, December. 19. Jie Liu, Xiashi Zhu. (2014). Ionic liquid-immobilized silica solid phase extraction coupled with high performance liquid chromatography for the analysis rhodamine B. Open Science Journal of Analytical Chemistry, 10-16. 20. KM Gray, MJ Walker, MJS Burn, M Mazur, K Niedzwiedzka, K Liszka and D Thorburn Burns. (2016). Illegal Dyes in Food and Spices – A 2006 LGC LC- UV/Visible Method Reviewed and. Journal of the Association of Public Analysts, 18-39. Tiếng Trung Quốc 21. 张海琪, 梁丽军, 何中央, 等.(2010). 水产品中碱性嫩黄 O 残留量的液相色 谱—串联质谱定[J]. 质谱学报. 31(1), 48 52. Lin Q. (2010). Simultaneous determination of chrysoidine and auramine O in bean products by ultra performance liquid chromatography [J]. Chin J Chromatogry. 31(1), 48 52. 22. 罗美中, 李碧芳, 何小青. (2005). 高效液相色谱-二极管阵列法测定豆制品中 的碱性嫩黄 O 的含量[J]. 分析实验室. 26(8), 166 170. Luo MZ, Li BF, He XQ, et al. (2005). Determination of soy auramine O content by high performance liquid chromatography combined with diode array [J]. Chin J Anal Lab. 26(8), 166 170. 23. 范文锐, 吴 青, 劳 扬, 卢玉珊. (2012). 高效液相色谱法同时测定食品中7 种 非食用色素 .分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究 . 40(2), 292 – 297. FAN Wen-Rui, WU Qing , LAO Yang, LU Yu-Shan. (2012). Determination of 58
  72. Seven Inedible Pigmentsin Food Using High Performance Liquid Chromatography. Chinese Journal of Analytical Chemistry. 40(2), 292 – 297. 24. 林清荷，陈鑫，吴忠兴. (2012). 辣椒粉中罗丹明 B 液相色谱检测方法的研 究. 农产品加工·学刊, 157-164. 25. 牛华，牛之瑞，冯雷，鲁燕骅，马雪涛，谭建林，张学忠，俸金梅. (2014). 高效相色谱法测定辣椒粉中罗丹明B的测量不确定度评估. 35 (18), 165-168. NIU Hua, NIU Zhi-rui, FENG Lei, LU Yan-hua, MA Xue-tao, TAN Jian-lin, ZHANG Xue-zhong, FENG Jin-mei. (2014). Evaluation of Uncertainty in Rhodamine B Determination in Chili Powder by HPLC. 35(18), 165-168. 26. 杨 爽, 俞子萱, 王永芳, 葛宝坤. (2015). 低温离心净化-高效液相色谱法快速 测定腐竹中的碱性橙 II 和碱性嫩黄 O.食 品 安 全 质 量 检 测 学 报. 6(2), 427 - 431. YANG Shuang, YU Zi-Xuan, WANG Yong-Fang, GE Bao-Kun. (2015). Rapid determination of chrysoidine II and auramine O in dried bean curd. Journal of Food Safety and Quality. 6(2), 427 - 431. 27. 卫兰兰, 晏嫣, 康学军 . (2017). 纳米固相微萃取应用于干红辣椒、 水果饮料 及红酒中罗丹明 Ｂ 的定量分. 38(6), 935-941.WEI Lanlan YAN Yan KANG Xuejue .(2017). Application of Packed-nanofibers Solid-phase Extraction for Determination of Rhodamine B in Dry Chilli, Fruit Drink and Red Wine. Chemical Journal of Chinese Universities. 38(6), 935-941. 59
  73. PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1 Bảng 1. Hệ số thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau (theo AOAC) STT Hàm lượng (%) Tỉ lệ chất Đơn vị Hệ số thu hồi (%) 1 100 1 100% 98-102 2 10 10-1 10% 98-102 3 1 10-2 1% 97-103 4 0,1 10-3 0,1 % 95-105 5 0,01 10-4 100 ppm 90-107 6 0,001 10-5 10 ppm 80-110 7 0,0001 10-6 1 ppm 80-110 8 0,00001 10-7 100 ppb 80-110 9 0,000001 10-8 10 ppb 60-115 10 0,0000001 10-9 1 ppb 40-120 Bảng 2. Quy định về hệ số thu hồi của hội đồng châu Âu STT Hàm lượng chất Đơn vị Hệ số thu hồi (%) 1 ≤ 1 μg/kg ≤ 1 ppb 50%-120% 2 > 1 μg/kg đến < 10 μg/kg 1-10 ppb 70%-110% 3 10 μg/kg 10ppb 80%-110% PHỤ LỤC 2. Quang phổ hấp thụ của chuẩn AO và RB trong MeOH Hình 1. Quang phổ hấp thụ của chuẩn đơn AO 60
  74. Hình 2. Quang phổ hấp thụ của chuẩn đơn RB Hình 3. Quang phổ hấp thụ của chuẩn hỗn hợp RB và AO 61
  75. Hình 4. Quang phổ chuẩn đơn AO, chuẩn đơn RB và chuẩn hỗn hợp PHỤ LỤC 3. Quang phổ hấp thụ của các chất chuẩn AO,RB trong ACN Hình 5. Quang phổ hấp thụ của chuẩn đơn AO 62
  76. Hình 6. Quang phổ hấp thụ của chuẩn đơn RB Hình 7. Quang phổ hấp thụ của chuẩn hỗn hợp RB và AO 63
  77. Hình 8. Quang phổ chuẩn đơn AO, chuẩn đơn RB và chuẩn hỗn hợp PHỤ LỤC 4. Một số sắc ký đồ của chuẩn hỗn hợp AO và RB ở các nồng độ 2 ppm qua nhiều lần đo lặp (n = 7) ở điều kiện tối ưu (khảo sát RSD(%)) Hình 9. Sắc đồ chuẩn hỗn hợp (AO, RB) nồng độ 2 ppm (đo lần 1) Hình 10. Sắc đồ chuẩn hỗn hợp (AO, RB) nồng độ 2 ppm (đo lần 2) 64
  78. Hình 11. Sắc đồ chuẩn hỗn hợp (AO, RB) nồng độ 2 ppm (đo lần 3) Hình 12. Sắc đồ chuẩn hỗn hợp (AO, RB) nồng độ 2 ppm (đo lần 4) Hình 13. Sắc đồ chuẩn hỗn hợp (AO, RB) nồng độ 2 ppm (đo lần 5) Hình 14. Sắc đồ chuẩn hỗn hợp (AO, RB) nồng độ 2 ppm (đo lần 6) Hình 15. Sắc đồ chuẩn hỗn hợp (AO, RB) nồng độ 2 ppm (đo lần 7) 65
  79. PHỤ LỤC 5. Hình 16. Sắc đồ phân tích mẫu cải chua a) thêm chuẩn 1 ppm b) không thêm chuẩn Hình 17. Sắc đồ phân tích mẫu gà a) thêm chuẩn 1ppm b) không thêm chuẩn 66