Nghiên cứu kỹ thuật bào chế, đánh giá khả năng kháng khuẩn trên in vitro của chế phẩm kem Silver Sulfa 1%

Nội dung text: Nghiên cứu kỹ thuật bào chế, đánh giá khả năng kháng khuẩn trên in vitro của chế phẩm kem Silver Sulfa 1%

1. Trần văn quang nghiên cứu kỹ thuật bào chế, đánh giá khả năng kháng khuẩn trên in vitro của chế phẩm kem Silver sulfa 1% Ngời hớng dẫn : TS. Nguyễn Thị Lộc
2. Đặt vấn đề Bỏng là một bệnh ngoại khoa khá quan trọng Để điều trị bỏng các chế phẩm của sulfadiazin bạc có nhiều u điểm đã đợc chứng minh trong lâm sàng. Viêc cung ứng thuốc có khó khăn. Các mục tiêu cụ thể của khóa luận : 1. Nghiên cứu kỹ thuật bào chế kem Silver sulfa 1%. 2. Nghiên cứu độ giải phóng hoạt chất của chế phẩm. 3. Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn trên in vitro có so sánh với với chế phẩm Silvirin 1% (ấn Độ).
3. Phần I Tổng quan tài liệu 1. Tỷ lệ mắc bệnh bỏng. Thời bình : 1,8% - 10% so với chấn thơng ngoại khoa. Trong chiến tranh : 3% - 10% tổng số thơng binh và có thể lên tới 70% - 85%. 2. Thuốc mỡ sát khuẩn điều trị vết bỏng tại chỗ * Kem maduxin;* Mỡ cao vàng;* Damcream . * Chế phẩm chứa hoạt chất sulfadiazin bạc nh : Sivadene (Mỹ), Flammazin (Pháp), Silvirin (ấn Độ), Slivin (Pakistan)
4. 3. chế phẩm thuốc mỡ có hoạt chất sulfadiazin bạc. 3.1. Công thức hoá học. Sulfadiazin bạc là muối bạc của N1- pyrimidin - 2 - yl - sulfanilamid (AgC10H9N4O2S) KLPT = 357,1. Độ hoà tan trong nớc < 1/10.000.
5. O N(6) H2N S N(1) N(2) O(2) Ag Hình 1 : Công thức hoá học của sulfadiazin bạc
6. 3.2 Cơ chế tác dụng. * sulfadiazin có tác dụng kìm khuẩn: do cạnh tranh ức chế với PABA. * Ion bạc: Ion bạc chuyển cầu nối giữa 2 nitơ thuộc 2 nhân purin đối diện .Do vậy đã làm mất khả năng sinh sản phân đôi của vi khuẩn. Phối hợp: nhân pyrimidin sẽ dễ dàng làm vận chuyển ion bạc qua màng vi khuẩn. * Cơ chế tác dụng khác với các hợp chất bạc khác, khác với sulfadiazin đơn độc.
7. 3.3. Tác dụng kháng khuẩn. Bảng 1: Khả năng kháng khuẩn trên invitro của sulfadiazin bạc Nồng độ sulfadiazin bạc Họ và loài 50 g/ml 100 g/ml Ps. Aeruginosa 130/130 130/130 E. cloacae 24/24 24/24 Klebsiella pneumoniae 53/54 54/54 Escherichia coli 63/63 63/63 S. aureus 100/101 101/101 S. epidermidis 51/51 51/51 Enterococus (nhóm D) 52/53 52/53 Candia albicans 43/50 50/50
8. 3.4. Hấp thu thuốc. * Các nghiên cứu về hấp thu với Ag111 cho thấy hầu hết thuốc tích tụ ở lớp biểu bì (có tác dụng tại chỗ). Khoảng 10% lợng sulfadiazin bôi tại chỗ đợc hấp thu Để đo sulfadiazin và các chất chuyển hoá đặc hiệu cần dùng phơng pháp HPLC. * Lợng bạc đợc hấp thu trong cơ thể khoảng dới 1%. Đo bằng quang phổ hấp phụ nguyên tử. 3.5. Những u điểm trong điều trị lâm sàng. - Có phổ kháng khuẩn rộng - Có thể làm mềm mô bỏng đông cứng. - Không gây đau khi bôi. - Không gây rối loạn điện giải hay kiềm toan. - Không làm bẩn y phục hay vải trải giờng.
9. Phần II Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu 1. Vật liệu trang thiết bị. 1.1. Vật liệu hoá chất. - Bạc sulfadiazin đạt tiêu chuẩn USP 24. - Các tá dợc cần thiết đạt tiêu chuẩn DĐVN III. - Các chất bảo quản, các chất chống ôxy hoá đạt tiêu chuẩn DĐVN III. - Các dung môi dùng cho SKLM, HPLC-pp. - Màng nhân tạo cellophan. - Các hoá chất khác cần thiết.
10. 1.2. Dụng cụ, trang thiết bị. - Cân phân tích độ chính xác 0,1mg của Trung Quốc . - Máy ly tâm của Nhật Bản. - Tủ điều nhiệt giữ đợc nhiệt độ ở 400C, Trung Quốc - Bản mỏng Silicagel 60 F254 ,VKN cung cấp. - Đèn huỳnh quang soi ở bớc sóng 254 nm. - Thạch Muller - Hinton. - Các chủng vi khuẩn: S. aureus, P. aeruginosa, E. coli. - Dụng cụ nghiên cứu khả năng giải phóng dợc chất ra khỏi tá dợc thuốc mỡ. - Máy sắc ký lỏng cao áp hiệu năng cao Shimadzu. - Các dụng cụ cần thiết khác trong phòng thí nghiệm.
11. 2. Phơng pháp nghiên cứu. 2.1. Định tính hoạt chất . *Định tính Sulfadiazin - Theo DĐVN I:Dùng phơng pháp SKLM : + Hệ dung môi triển khai : Methanol : NH4OHđặc = 100 : 1,5 . +Thể tích chấm 10l. + Soi đèn huỳnh quang ở bớc sóng 254nm. + Giá trị Rf chuẩn : 6,4. 2.2. *Định lợng sulfadiazin bạc trong kem. Phơng pháp đo nitrit : 1 ml natri nitrit 35,71mg sunfadiazin bạc.
12. 2.3. Các bớc nghiên cứu mô hình kem Silver sulfa 1%. Xây dựng các công thức bào chế NC sơ bộ độ bền vững Loại bớt CT kém bền vững Kiểm tra độ giải phóng hoạt chất Loạibớt CT có độ trên invitro giải phóng kém Kiểm tra độ kháng khuẩn Hình 4: Các bớc nghiên cứu mô hình kem Sliver sulfa 1%
13. 2.3.1 (Bớc 1): Xây dựng các công thức bào chế. * Xây dựng các công thức cốt tá dợc + Trong tất cả các công thức sử dụng chất bảo quản là hỗn hợp nipagin: nipason =95: 5. + Các tá dợc phối hợp trong công thức phải đem lại giá trị HLB thích hợp (8 - 18) HLB hỗn hợp HLBc = sum @ (f x HLBn) HLB yêu cầu %A = [100 (X - HLBb)] / (HLBa - HLBb) %B = 100 - %A.
14. * Nghiên cứu tìm chất chống ôxy hoá Ion bạc trong công thức hoạt chất rất dễ bị ôxy hoá. -Nghiên cứu với 4 chất chống ôxy hoá sau: Natri sulfit ,natri bisulfit,natri metasulfit,hydro quinon. - Hàm lợng : 0,05%; 0,10% và 0,15%. - Thời điểm: t0: ngay sau khi bào chế t1 sau khi bào chế 1 ngày, t2 sau khi bào chế 3 ngày, t3 sau khi bào chế 7 ngày. - Phơng pháp đánh giá : xem xét sự thay đổi màu sắc.
15. Chuẩn bị tá dợc Chuẩn bị dợc chất Làm thuốc mỡ đặc Phối hợp tá dợc Kiểm nghiệm bán thành phẩm Làm đồng nhất Kiểm nghiệm thành phẩm Đóng lọ, dán nhãn Hình 5: Sơ đồ quy trình bào chế kem Silver sulfa 1%
16. 2.3.2. (Bớc 2): Nghiên cứu sơ bộ độ bền vững. - Điều kiện 1: Ly tâm thuốc mỡ mới bào chế trong vòng 5 phút với tốc độ 600v/phút ở nhiệt độ 20 10C. Quan sát sự phân lớp của thuốc mỡ. - Điều kiện2: Đặt thuốc mỡ ở 40 10C trong vòng 1 ngày đêm. Quan sát sự thay đổi của thuốc mỡ. -Lựa chọn ba công thức bền vững nhất nghiên cứu độ giải phóng hoạt chất
17. 2.3.3. (Bớc 3): Nghiên cứu độ giải phóng hoạt chất qua màng cellophan *Khuếch tán thuốc qua màng: - Ngăn trên : 3g thuốc mỡ - Môi trờng khuếch tán : 25ml dung dịch NH4OH 2,5% - Thời gian t1, t2, t3, t4 đã định sẵn. * Định tính hoạt chất giải phóng: SKLM(DĐVN I)để xác định đã có hoạt chất giải phóng và xác định t1. *Định lợng nồng độ : phơng pháp HPLC. - Với mỗi CT, ở 1 thời điểm t, khuếch tán 5 mẫu để tính lợng hoạt chất giải phóng qua màng bằng phơng pháp HPLC.
18. - Xây dựng đờng chuẩn: bằng phơng pháp bình phơng tối thiểu. - Các thông số của phơng pháp HPLC: + Pha động là một hệ dung môi A: B = 28 : 72 với . Dung môi A là hỗn hợp : Acetolnitrile có H3PO4 (1/900). . Dung môi B là hỗn hợp : Nớc cất có H3PO4 (1/900). + Thể tích mẫu tiêm 50 l. + Tốc độ dòng 1ml/phút. + Cột: RP18, Sopam (250 x 4,6mm,5m). + Đo ở bớc sóng 266nm.
19. 2.3.4. (Bớc 4): Nghiên cứu độ kháng khuẩn. Sử dụng phơng pháp khuếch tán trên gel thạch: Thạch Muller - Hinton đổ đĩa đờng kính 9cm, đục 2 lỗ đối xứng có đờng kính 1cm, 1 lỗ cho Silver sulfa 1% (công thức có độ giải phóng hoạt chất tốt nhất tìm đợc ở bớc 3), lỗ còn lại cho thuốc đối chứng Silvirin 1%. Sử dụng 3 đĩa thạch cho 3 chủng vi khuẩn. S. aureus; P. aeruginosa; E. coli (theo quy định của DĐVN). Các chủng vi khuẩn thuần đợc làm thành hỗn dịch 108 VK/ml cấy láng trên bề mặt thạch, đợi khô mặt thạch cho thuốc vào lỗ thử và lỗ chứng tơng ứng. Các đĩa thạch đợc ủ 370C trong 24 giờ. Đọc kết quả bằng cách đo đờng kính vòng vô khuẩn xung quanh lỗ thử và lỗ chứng.
20. Phần III Kết quả và bàn luận 1. Kết quả xây dựng công thức bào chế. Xây dựng công thức: CT 1: Sulfadiazin bạc 1,0g Acid stearic 24,0g Triethanolamin 1,0g Glycerin 13,0g Chất bảo quản 0,50g Nớc tinh khiết vđ 100ml
21. CT 2 CT 4: Sulfadiazin bạc 1,0g Sulfadiazin bạc 1,0g Sorbitan stearat 1,4g Alcol stearylic 15,0g Polysorbat 80 0,6g Sáp ong 8,0g Alol cetostearic 6,5g Tween 80 3,8g Triglycorides 11,0g Span 80 1,2g Glycrol 0,4g Sorbitol 8,0g Chất bảo quản 0,5g Chất bảo quản 0,2g Nớc tinh khiết vđ 100ml Nớc tinh khiếtvđ 100ml CT 3: CT 5: Sulfadiazin bạc 1,0g Sulfadiazin bạc 1,0g Alcol cetostearic 8,0g Alcol cetylic 3,0g Glycerin monostearat 0,4g Dầu paraffin 20,0g Vaselin 6,0g Glycerol stearat 2,9g Paraffin 0,5g Polysorbat 80 3,1g Tween 60 0,6g Glycol propylen 7,0g Chất bảo quản 0,2g Chất bảo quản 0,2g Nớc tinh khiết vđ 100ml Nớc tinh khiết vđ 100ml
22. Lựa chọn chất chống oxy hoá. Bảng 2: Hiệu lực bảo vệ chống ôxy hoá của natri bisulfit. Thời điểm t0 t1 t2 t3 Hàm lượng 0,05% - - + 0,10% - - - + 0,15% - - - - Chọn chất chống ôxy hoá là natri bisulfit , hàm lợng 0,15%,
23. 2. Kết quả nghiên cứu sơ bộ độ bền vững. Bảng 3: Kết quả nghiên cứu sơ bộ độ ổn định Điều kiện CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 ĐK 1 ++ - + ++ - ĐK 2 ++ - - +++ ++ Chọn các công thức: CT2, CT3, CT5 để đo giải phóng hoạt chất qua màng.
24. 3. Kết quả đo giải phóng hoạt chất 3.1. Kết quả định tính hoạt chất giải phóng qua màng: Bảng 4: Kết quả định tính bằng SKLM Thời điểm lấy mẫu CT2 CT3 CT5 30 phút - - - 60 phút + + - 90 phút + ++ + Chọn các thời điểm t1 = 90phút, t1 =120phút, t3 =180phút, t 4=360 phút để đo lợng hoạt chất giải phóng qua màng bằng HPLC.
25. 3.2.Kết quả định lợng dợc chất giải phóng qua màng . 3.2.1. Kết quả xây dựng đờng chuẩn. - Sắc ký đồ dung môi của cốt tá dợc. - Các đờng chuẩn: + Chuẩn 1: nồng độ hoạt chất 2,12g/ml. + Chuẩn 2: nồng độ hoạt chất 5,30g/ml. + Chuẩn 3: nồng độ hoạt chất 10,60g/ml. Kết quả đợc phơng trình tuyến tính y = 5,9118.e - 0,06.x + 0. Hệ số tơng quan r = 0,999833 1. Cho thấy có sự tơng quan khá chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ.
26. 3.2.2.Nhận biết pic của sulfadiazin bạc. Sử dụng hệ thống HPLC kết hợp detecter diode array: - Thời gian lu tR. - Hệ số Match =1. 3.2.3. Tính nồng độ dợc chất giải phóng qua màng. *Kết quả tính nồng độ dợc chất giải phóng qua màng:
27. Bảng 5: Nồng độ dợc chất giải phóng qua màng theo thời gian của CT3(n = 5;SD = 0,0018) Các thời điểm tR (giây) S(mAU) Nồng độ (g/ml) t1 3,389 626244 3,138 t2 3,448 974704 4,912 t3 3,517 1055665 5,320 t4 3,408 1692586 8,532 *Tính tỷ lệ% dợc chất giải phóng qua màng: Công thức tính tỷ lệ% dợc chất giải phóng qua màng: 250C 25C x% 100 3.104 30
28. Bảng 6: Tỷ lệ % hoạt chất đợc giải phóng qua màng của các CT theo thời gian t CT2 CT3 CT5 t1 1,198 2,614 1,488 t2 2,567 4,093 2,766 t3 3,566 4,459 3,650 t4 4,816 7,111 6,285
29. 80 70 60 50 CT2 40 CT3 30 CT5 20 10 0 90 120 180 360 Hình 6: Đồ thị so sánh tỷ lệ % hoạt chất đợc giải phóng qua màng của các CT theo thời gian (các tỷ lệ % đều đợc gấp lên 10 lần) Chọn CT3 để xác định khả năng kháng khuẩn trên invitro.
30. Bảng 7: Tỷ lệ % hoạt chất đợc giải phóng qua màng của Silvirin 1% theo thời gian(n = 5;SD = 0,0018) Thời gian tR S(mAU) C x% t1 3,460 628819 3,002 2,502 t2 3,358 657693 4,831 4,026 t3 3,448 1048732 5,017 4,182 t4 3,444 1328906 7,544 6,287
31. Bảng 8: So sánh tỷ lệ % hoạt chất đợc giải phóng qua màng của CT3 với Silvirin 1% theo thời gian Nồng độ giải phóng qua Tỷ lệ nồng độ giải màng (x%) phóng qua màng CT3 / Silvirin 1% CT3 Silvirin 1% 2,614 2,502 1.045 4,093 4,026 1.017 4,459 4,182 1.043 7,111 6,287 1.131 Khả năng giải phóng hoạt chất qua màng của CT3 và Silvirin 1% là tơng đơng
32. 5. Kết quả đo kháng khuẩn trên invitro. Bảng 9:So sánh khả năng khuẩn trên invitrô giữa CT3 và Silvirin 1% Đường kính vùng ức chế (mm) Vi khuẩn CT3 Silvirin 1% S.aureus 10 10 P.aeruginosa 6 6 E.coli 12 10 Kết quả kháng khuẩn trên invitrô giữa CT3 và Silvirin 1% là tơng đơng
33. Kết luận - Đã xây dựng đợc công thức kem Silver sulfa 1% (CT3) có hình thức cảm quan đạt yêu cầu, có độ ổn định bền vững trong điều kiện bình thờng vì đã ổn định trong điều kiện khắc nghiệt. - Khả năng giải phóng hoạt chất qua màng của CT3 và Silvirin 1% là tơng đơng nhau. Nh vậy kem Silver sulfa 1% có độ giải phóng hoạt chất tốt, cốt tá dợc không cản trở khả năng giải phóng hoạt chất của kem - Khả năng kháng khuẩn của CT3 là tơng đơng với Silvirin 1% trên invitro.
34. Kiến nghị. Tiếp tục nghiên cứu các tính chất khác của kem Silver sulfa 1%: * Nghiên cứu độ ổn định lâu dài. * Nghiên cứu độ giải phóng hoạt chất và kháng khuẩn trên invivo. * Nghiên cứu độc tính cấp và trờng diễn. * Nghiên cứu hiệu lực điều trị của kem.
35. Xin chân thành cảm ơn các quý vị đại biểu các thầy cô giáo và toàn thể các bạn sinh viên!