Khóa luận Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)

Nội dung text: Khóa luận Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NÔNG MỸ HOA XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2019
2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NÔNG MỸ HOA XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2014.Y Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Hữu Tùng Hà Nội - 2019 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
3. LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn thành luận văn là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành của mình với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Đầu tiên tôi xin gửi lời cám ơn đến toàn thể Ban Giám hiệu Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội và Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc đã tạo điều kiện cho tôi được làm khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong trường đã dìu dắt, giúp đỡ tôi hoàn thành chương trình học tập suốt 5 năm qua. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc và tri ân tới GVHD, TS Nguyễn Hữu Tùng, người đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi cũng xin cảm ơn tập thể lớp Dược học khóa QH.2014.Y đặc biệt là các bạn Hà, Nhung, Thảo, Vân đã luôn đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian qua. Đồng thời xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thành viên trong nhóm nghiên cứu của tôi chị Đặng Thị Ngần, Nguyễn Thị Thu Thủy người đã nhiệt tình giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi cũng xin cảm ơn đề tài cấp Nhà nước: “Ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ hai loài cây thuốc Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng) vùng Tây Bắc”,mã số: KHCN- TB.07C/13-18, 2015- 2017 (Chương trình Tây Bắc) của PGS.TS Dương Thị Ly Hương chủ nhiệm đã tài trợ kinh phí để tôi thực hiện nội dung nghiên cứu này. Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình đã nuôi dạy, khích lệ và sát cánh, giúp tôi có thêm động lực cố gắng để có kết quả như ngày hôm nay. Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn! @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
4. Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Nông Mỹ Hoa @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
5. DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT SVD Sâm vũ diệp HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performace liquid chromatography) UV Ultra violete FLD Đầu dò huỳnh quang DAD Detector mảng điốt (Detector Diod Array) Rf Hệ số di chuyển RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) R2 Hệ số tương quan tuyến tính LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation) SKLM Sắc ký lớp mỏng @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
6. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các hợp chất saponin đã phân lập từ Sâm vũ diệp 7 Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm của các mẫu Sâm vũ diệp 22 Bảng 3.2. Kết quả xác định tro toàn phần của các mẫu Sâm vũ diệp 22 Bảng 3.3. Kết quả xác định độ tro không tan trong acid của các mẫu 23 Sâm vũ diệp Bảng 3.4. Chương trình dung môi 25 Bảng 3.5. Tính thích hợp của hệ thống. 26 Bảng 3.6. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của stipuleanosid R2 29 Bảng 3.7. Khảo sát độ thu hồi 30 Bảng 3.8. Hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu Sâm vũ diệp 31 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
7. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Hình ảnh Sâm vũ diệp 3 Hình 1.2. 10 hợp chất saponin tách từ rễ của cây Sâm vũ diệp 6 Hình 2.1. Mẫu Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái 11 tại Sa Pa, Lào Cai Hình 3.1. Vi phẫu thân rễ Sâm vũ diệp 21 Hình 3.2. Bột thân rễ Sâm vũ diệp 21 Hình 3.3. Sắc ký đồ TLC định tính dược liệu Sâm vũ diệp 23 Hình 3.4. Sắc ký đồ dung dịch mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử. 27 Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của stipuleanosid R2. 29 Hình 3.6. Sắc ký đồ HPLC của stipuleanosid R2 (A) và dược liệu 31 Sâm vũ diệp (B) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
8. MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP 3 1.1.1. Tên khoa học 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật 3 1.1.3. Đặc điểm phân bố và sinh thái 4 1.1.4. Thành phần hóa học 5 1.1.5. Tác dụng dược lý 8 1.1.6. Công dụng 8 1.2. TỔNG QUAN VỀ TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU 8 CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 11 2.1.1. Nguyên liệu 11 2.1.2. Dung môi, hóa chất 12 2.1.3. Máy móc, thiết bị 12 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.2.1. Mô tả 13 2.2.2. Vi phẫu 13 2.2.3. Soi bột @ School of Medicine and 13 Pharmacy, VNU
9. 2.2.4. Độ ẩm 13 2.2.5. Tro toàn phần 13 2.2.6. Tro không tan trong acid 14 2.2.7. Tạp chất 14 2.2.8. Định tính 15 2.2.9. Định lượng 16 3.1. Mô tả 20 3.2. Vi phẫu 20 3.3. Soi bột 21 3.4. Độ ẩm 21 3.5. Tro toàn phần 22 3.6. Tro không tan trong acid 22 3.7. Định tính 23 3.8.Định lượng 24 3.9. Bàn luận 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC I: PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC PHỤ LỤC II: DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU SÂM VŨ DIỆP @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
10. ĐẶT VẤN ĐỀ Sâm là dược liệu quý có giá trị cao được sử dụng trong nhiều bài thuốc y học cổ truyền. Hiện nay, nhiều loài trong chi Sâm (Panax), đặc biệt là các loài nhân sâm (Panax ginseng C.A. Meyer), sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), tam thất (Panax notoginseng (Burk.) F.H. Chen ex C.Y. Wu et K.M. Feng; syn.: P. pseudoginseng all.), sâm Nhật (Panax japonicus C.A.Meyer), sâm Mỹ (Panax quynquefolius L.), sâm Siberia (AcanthoPanax senticosus (Rupr. et Maxim.) Harms; syn.: Eleutherococcus senticosus Maxim.) , là những cây thuốc quý, được ưa chuộng, rất nổi tiếng và có giá trị cao. Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) là một cây thuốc quý đang được sử dụng trong các bài thuốc truyền thống và có tiềm năng để phát triển thành sản phẩm chăm sóc sức khỏe như các loài khác cùng chi [2,14]. Ngày nay, xu hướng sử dụng các sản phẩm chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc tự nhiên ngày càng tăng kèm theo đó là sự làm hàng giả, hàng nhái, hàng kém chất lượng cũng tăng theo. Điều này gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người và gây mất lòng tin của người sử dụng đối với thuốc và các sảm phẩm từ dược liệu. Để có thể sử dụng dược liệu làm nguyên liệu làm thuốc thì đòi hỏi cần phải xây dựng các tiêu chuẩn chất lượng, đồng thời xây dựng các phương pháp thử để đánh giá các tiêu chuẩn đó. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)”. Đề tài này là một phần trong đề tài cấp bộ “Ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ hai loài cây Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.)” của Khoa Y Dược Đại Học Quốc Gia Hà Nội. Mục tiêu đề tài: xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của dược liệu Sâm vũ diệp. Để đạt được mục tiêu trên, đề tài thực hiện với các nội dung sau: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 1
11. 1. Khảo sát đưa ra các tiêu chí của dược liệu SVD theo tiêu chuẩn chế biến dược liệu thân rễ quy định trong DĐVN V. 2. Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn cơ sở dược liệu SVD. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 2
12. CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP 1.1.1. Tên khoa học SVD có tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem., họ Nhân sâm (Araliaceae) [1,3]. SVD còn có tên gọi khác là Tam thất xẻ lá, Vũ diệp tam thất, Trúc tiết nhân sâm, Ngật đáp thất [1,3]. 1.1.2. Đặc điểm thực vật Là cây thảo sống nhiều năm, cao 0,3 – 0,5 m. Thân rễ mập, phân nhánh, nằm ngang và thường nổi trên mặt đất; rễ củ dài, nhiều đốt và mang nhiều vết sẹo do thân tàn lụi để lại, đầu rễ có hình con quay [1,15]. Thân mảnh, thường đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa, có vạch dọc [1], đường kính thân từ 0,3 - 0,6 cm [3]. Lá kép chân vịt, mọc vòng ở ngọn, thường gồm 2 - 3 cái [3]. Lá kép có 3 - 7 lá chét, thuôn dài 2,5 - 14 cm, rộng 1,5 - 4 cm, gốc tròn, đầu thuôn thành mũi nhọn, xẻ thùy lông chim không đều, mép khía răng, có lông [1]. Hình 1.1. Hình ảnh Sâm vũ diệp [15] @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 3
13. Cụm hoa tán đơn, mọc ở ngọn; cuống cụm hoa 5 - 10 cm, mang từ 20 - 90 hoa; cuống hoa mảnh, dài 1 - 1,5 cm. Hoa màu trắng lục, 5 lá dài nhỏ, 5 cánh hoa, 5 nhị, bầu 2 - 3 ô, đầu vỏ nhụy chẻ đôi. Quả mọng, hình cầu hơi dẹt, đường kính 0,6 - 1,2 cm, khi chín màu đỏ, có chấm đen to ở đầu. Chứa 2 - 3 hạt, hình cầu, màu xám trắng, vỏ cứng, có rốn hạt [1,3]. 1.1.3. Đặc điểm phân bố và sinh thái SVD đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, mọc rải rác dưới tán rừng kín thường xanh núi cao, ở độ cao từ 1600 – 2300 m [3]. SVD sinh trưởng và phát triển mạnh trong mùa mưa ẩm. Hàng năm vào cuối tháng 2 đầu tháng 3, từ phần đầu mầm thân rễ phân nhánh ngang nằm sát mặt đất sẽ mọc lên một hoặc vài chồi thân (tùy thuộc vào số đầu mầm thân rễ phân nhánh). Chồi này sinh trưởng nhanh trong vòng một tháng đã ra lá và gần đạt được chiều cao cực đại. Đến tháng 4, mỗi thân mang lá có thể cho ra một cụm hoa. Quả xanh quan sát được vào cuối tháng 4 – 6, đến tháng 7 quả đã chín và rụng xuống xung quanh gốc cây mẹ. Do quả chín đúng vào thời kì có lượng mưa lớn tháng 7 – 8 nên hạt giống thường bị cuốn trôi, ảnh hưởng đến khả năng tái sinh tự nhiên của SVD. Sau khi quả chín, từ tháng 9 đến tháng 10, toàn bộ phần thân trên mặt đất tàn lụi qua mùa đông để lộ ra những vết sẹo trên thân rễ khá rõ – dấu hiệu giúp cho xác định tuổi của cây. Cũng vào lúc này chồi mới bắt đầu hình thành ở phía đầu thân rễ. Phương thức sinh trưởng này làm cho phần thân rễ ngày một phát triển thêm về chiều dài [1]. Trong tự nhiên, SVD phân bố ở Trung Quốc, Ấn Độ, Nê Pan ( vùng cận Himalaya) và điểm phân bố cuối cùng của sâm vũ diệp về phía nam là Sa Pa của Việt Nam, ở khu vực núi Hoàng Liên Sơn ( Sa Pa, Bát Xát, Than Uyên, ). Do hậu quả của nạn phá rừng và khai thác bừa bãi, vùng phân bố SVD ở nước ta đã bị thu hẹp dần, SVD đang phải đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng và việc bảo vệ đang được ưu tiên ở Việt Nam [1,16]. Hiện nay, SVD đang được trồng thử nghiệm ở Sa Pa (Lào Cai) và Hà Giang và cho những kết quả khả quan [15,16]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 4
14. 1.1.4. Thành phần hóa học Nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự năm 2002, kết quả định tính sơ bộ cho thấy trong thân rễ và rễ củ SVD có chứa hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin cùng với acid béo, acid amin [7,12]. Saponin là thành phần hoạt chất chính trong lá và thân SVD. Trong đó bao gồm saponin khung oleanan với hàm lượng tương đối cao cùng với một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp hơn [21,25,26]. Năm 1989, nhóm nghiên cứu Trung Quốc công bố phân lập 13 saponin khung dammaran từ lá của cây này ở Trung Quốc trong đó bao gồm một số ginseng saponin đặc trưng như ginsenosid F, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re, Rb3, 24(S)-pseudoginsenosid F11, panasenosid, majorosid F1 và bipinnatifidusosid F1, F2 [23,24]. Rễ SVD chứa saponin thuộc nhóm oleanan gồm những chất như chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginsenosid R0, Rb1, Rd, Re, Rg1 và Rg2 [1]. Nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc năm 2011, phân lập một nhóm 10 saponin khung oleanan (hình 1.2) từ dịch chiết methanol của rễ SVD thu hái ở núi Hoàng Liên Sơn, Việt Nam, trong đó có 3 chất mới bifinosid A-C và bảy hợp chất được biết bao gồm narcissiflorin methyl este, chikusetsusaponin IVa, pseudoginsenosid RP1 methyl este, stipuleanosid R1, pseudoginsenosid RT1 methyl este, momordin IIe và stipuleanosid R2 methyl este [22]. Năm 2018, nhóm nghiên cứu Việt Nam đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 2 saponin từ thân rễ SVD là stipuleanosid R2, aralosid A methyl ester [16]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 5
15. Comp. R1 R2 R3 R4 R5 1: Ara(p) H H Me H 2: H Xyl(1-6)glc H Me H 3: Xyl Ara(p) H Me Glc 4: Ara(p) H Ara(p) Me H 5: Ara(p) H H Me Glc 6: Xyl H H Me H 7: H Glc Ara(f) H H 8: Xyl H H Me Glc 9: Xyl Ara(p) H H Glc 10: H Glc Ara(f) Me Glc Me : methyl Ara(f) : -L-arabinofuranosyl Ara(p) : -L-arabinopuranosyl Glc : -D-glucopyranosyl Xyl : -D-xylopyranosyl Hình 1.2. 10 hợp chất saponin tách từ rễ của cây Sâm vũ diệp [22] @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 6
16. Bảng 1.1. Các hợp chất saponin đã phân lập từ Sâm vũ diệp STT Hợp chất TLTK 1 24(S)-pseudoginsenosid F11 [24] 2 Bifinosid A [22] 3 Bifinosid B [22] 4 Bifinosid C [22] 5 Bipinnatifidusosid F1 [24] 6 Bipinnatifidusosid F2 [24] 7 Chikusetsusaponin Iva [22] 8 Ginsenosid F [24] 9 Ginsenosid F2 [24] 10 Ginsenosid F3 [24] 11 Ginsenosid Rb1 [24] 12 Ginsenosid Rb3 [24] 13 Ginsenosid Rd [24] 14 Ginsenosid Re [24] 15 Ginsenosid Rg1 [24] 16 Ginsenosid Rg2 [24] 17 Majorosid F1 [24] 18 Momordin IIe [22] 19 Narcissiflorin methyl este [22] 20 Panasenosid [24] 21 Pseudoginsenosid RT1 methyl este [22] 22 Stipuleanosid R1 [22] 23 Stipuleanosid R2 methyl este [22] 24 Stipuleanosid R2 [8] 25 Aralosid A methyl ester [8] @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 7
17. Hiện nay, đã có 25 hợp chất saponin được xác định từ thành phần cây SVD. 1.1.5. Tác dụng dược lý Tính vị, công năng: SVD có vị đắng, ngọt, tính hơi ấm, có tác dụng dưỡng huyết, hoạt lạc, chỉ huyết, tán ứ [1]. SVD thường được dùng trong một số bài thuốc truyền thống ở nước ta và Trung Quốc, nhưng chưa có nhiều tài liệu và công trình khoa học nghiên cứu về tác dụng dược lý được công bố. Một số nghiên cứu về tác dụng dược lý của SVD trên động vật thí nghiệm cho thấy SVD có tác dụng tăng cường chức năng sinh lý, ảnh hưởng tốt đến hệ thần kinh trung ương, tăng sức dẻo dai của cơ thể, tăng sức đề kháng, tác dụng tán huyết [1], chống stress, chống trầm cảm, bảo vệ gan, tăng cường hệ miễn dịch, có hoạt tính ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư [9-11,13,18-20]. 1.1.6. Công dụng Theo đông y, SVD có công dụng hoạt huyết khứ ứ, tiêu đờm, giảm đau, thũng trướng tích tụ, đau gân cốt, rắn độc cắn, tâm vị khí thống, thổ huyết, chảy máu mũi, xuất huyết dạ dày,[1,3] , một vị thuốc quý có tác dụng chống ung thư, chống oxy hóa, bổ dưỡng, tăng trí nhớ [15], tốt cho phụ nữ sau đẻ và người cao tuổi. SVD còn được dùng để ngâm rượu rồi chiết dưới dạng tinh sâm hoặc nấu cao rồi pha với nước hoặc rượu để uống có tác dụng kích thích sinh dục [1]. 1.2. TỔNG QUAN VỀ TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU Tiêu chuẩn cơ sở được xây dựng dựa trên các kết quả nghên cứu khoa học và công nghệ, tiến bộ kỹ thuật, kinh nghiệm, nhu cầu và khả năng thực tiễn. Những quy định chung về tiêu chuẩn dược liệu bao gồm việc mô tả, định tính, các phép thử tinh khiết, xác định hàm lượng chất chiết được và định lượng hoạt chất trong dược liệu [4]: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 8
18. • Mô tả: Bao gồm những mô tả về hình thái, kích thước, màu sắc, mùi vị, các đặc điểm của bề mặt, vết bẻ hay mặt cắt của dược liệu hoặc đặc điểm thể chất của dược liệu. • Định tính: Là những phương pháp dùng đề nhận biết dược liệu, bao gồm các kinh nghiệm truyền thống, phương pháp vi học và các phương pháp lý hóa. - Nhận biết dược liệu dựa theo kinh nghiệm bằng phương pháp đơn giản và truyền thống như sự chìm hay nổi trong nước, tiếng nổ, màu của ngọn lửa hay khói và mùi khi đốt cháy dược liệu v.v - Định tính dược liệu bằng phương pháp vi học là việc quan sát đặc điểm của các tế bào, các mô của lát cắt, của bột hay của bề mặt dược liệu dưới kính hiển vi. - Định tính lý học là việc xác định các chỉ số như độ tan, tỉ trọng, chiết xuất, năng suất quay cực, v.v của các dược liệu. - Định tính hóa học là phép thử một vài thành phần trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học. Phương pháp tiến hành được trình bày ở các chuyên luận dược liệu cụ thể. - Định tính sắc ký là việc sử dụng các phương pháp sắc ký như sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao,,,, để phát hiện một số thành phần có trong dược liệu; so sánh với chất chuẩn hay thành phần trong dược liệu chuẩn. - Định tính huỳnh quang là quan sát sự phát huỳnh quang của bề mặt hay mặt cắt dược liệu hay của dịch chiết dược liệu ở điều kiện thường hay sau khi cho tác dụng với acid, kiềm hay thuốc thử. Trừ khi có quy định riêng trong chuyên luận, mẫu thử được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365 nm, cách nguồn sáng khoảng 10 cm. - Định tính vi thăng hoa thường được tiến hành như sau: Đặt một vòng kim loại đường kính khoảng 2 cm, cao khoảng 8 mm lên một tấm kim loại @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 9
19. mỏng có kích thước hơi lớn hơn. Trải một lớp mỏng bột dược liệu trong vòng kim loại và đậy kín bằng một phiến kính bên trên có đặt một miếng bông tẩm nước lạnh. Đặt tấm kim loại đã có dược liệu này lên một lưới amiant có 1 lỗ tròn đường kính khoảng 2 cm sao cho vòng kim loại có dược liệu nằm trên lỗ này. Đun nóng nhẹ phía dưới lỗ cho đến khi bột dược liệu bị cháy xém. Nhấc phiến kính ra và để nguội. Quan sát hình dạng và màu sắc của tinh thể chất được thăng hoa đọng lại trên phiến kính bằng kính hiển vi và/hoặc tiến hành phản ứng hóa học thích hợp đối với chất đã được thăng hoa. • Thử tinh khiết: Là cách kiểm tra độ tinh khiết của dược liệu, tùy từng dược liệu mà có thể bao gồm một số hay tất cả các chỉ tiêu sau: - Mất khối lượng do làm khô. - Tro toàn phần và tro không tan trong acid hydrochloric. - Các tạp chất hữu cơ, các bộ phận khác của dược liệu, các dược liệu bị biến màu, hư thối. - Tỉ lệ vụn nát của dược liệu. - Hàm lượng kim loại nặng. - Dư lượng các chất bảo vệ thực vật. - Xác định chất chiết được là xác định hàm lượng các chất trong dược liệu có thể chiết được bằng dung môi (nước, ethanol hay một dung môi khác). • Định lượng: Là việc xác định hàm lượng một hay một số chất có trong dược liệu bằng phương pháp hóa học, lý học hoặc sinh học. Định lượng bao gồm cả việc xác định hàm lượng chất béo, tinh dầu và xác định hoạt lực bằng các phép thử sinh học. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 10
20. CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1. Nguyên liệu Cây Sâm vũ diệp trồng ở huyện Sa Pa, Lào Cai 6 năm tuổi được thu vào ngày 15/07/2016. Mẫu được giám định tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem., họ Nhân sâm (Araliaceae) bởi ThS. Nguyễn Quỳnh Nga, Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu. Mẫu tiêu bản (DL - 150716) được lưu giữ Phòng tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu. Mô tả đối tượng nghiên cứu: Thân rễ sâm vũ diệp có nhiều đốt và những vết sẹo, cong ngoằn ngoèo, dài 7-12 cm, đường kính 1,2-1,8 cm. Thể chất cứng chắc, giòn, dễ bẻ, mặt bẻ lởm chởm, màu vàng nâu nhạt. Mùi thơm nhẹ, vị đắng, hơi ngọt. Xử lí mẫu: thân rễ SVD rửa sạch, để khô, thái lát mỏng, sấy khô ở 500C đến hàm ẩm đạt dưới 10%, bảo quản trong túi nilong kín, để nơi khô ráo, thoáng mát để sử dụng trong nghiên cứu. Hình 2.1. Mẫu Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sa Pa, Lào Cai @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 11
21. 2.1.2. Dung môi, hóa chất Hóa chất, dung môi sử dụng trong nghiên cứu và phân tích đều đạt tiêu chuẩn công nghiệp và được chưng cất lại trước khi dùng. - Dung môi hóa chất: Methanol (CH3OH), ethanol (EtOH), ethyl acetat (EtOAc), acetonitrile (CH3CN), acid acetic (CH3COOH), nước cất hai lần, dùng cho phân tích. - Thuốc thử: Acid sulfuric (Meck), acid acetic (CH3COOH) (Meck). - Bản mỏng: Silica gel 60 RP-18 F254s (Meck). - Chất chuẩn stipuleanosid R2. 2.1.3. Máy móc, thiết bị - Hệ thống sắc ký HPLC Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Mỹ). - Tủ sấy Memmert (Memmert – Đức). - Máy siêu âm Power sonic 405(Powersonic-Hàn Quốc). - Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (BUchi, Thụy Sĩ). - Phễu lọc Buchner, bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,2 μm. - Cân kỹ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR (sai số 0,0001g, Precisa – Thụy Sĩ). - Cân xác định độ ẩm Precisa HA 60. - Hệ thống chiết hồi lưu dung tích bình cầu 1000ml. - Bình chạy sắc ký lớp mỏng. - Máy ly tâm HSCEN- 204- MRC. - Bếp điện, bếp đun cách thủy. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 12
22. - Kính hiển vi điện tử. - Máy ảnh. - Các dụng cụ thủy tinh khác: Bình định mức, pipet, ống đong 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu SVD dựa trên các tiêu chí chung được quy định trong DĐVN V tại phụ lục 12.2 gồm: Mô tả, vi phẫu, soi bột, độ ẩm dược liệu, tro toàn phần, tạp chất, định tính, định lượng, 2.2.1. Mô tả Kiểm tra về hình thái, màu sắc, mùi vị bằng cảm quan và kiểm tra kích thước bằng cách đo. 2.2.2. Vi phẫu Mẫu dược liệu SVD được tiến hành cắt vi phẫu, tẩy sáng trong dung dịch Cloramin 5 – 10%, rồi nhuộm màu bằng phương pháp nhuộm kép với đỏ son phèn và xanh methylene. Lên tiêu bản, sử dụng kính hiển vi để soi các đặc điểm vi phẫu của dược liệu [4]. 2.2.3. Soi bột Dược liệu được làm khô rồi nghiển thành bột, lên tiêu bản bằng một giọt dung dịch soi, quan sát các được điểm của bột bằng kính hiển vi [4]. 2.2.4. Độ ẩm Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.6: cân chính xác khoảng 3g dược liệu đã cắt nhỏ, sấy trong tủ sấy ở 105°C, áp suất thường trong 5 giờ. 2.2.5. Tro toàn phần Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.8. Tỷ lệ % tro toàn phần của dược liệu được tính theo công thức: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 13
23. 100 × X % = × 100 ×(100− ) Trong đó: m: Khối lượng tro (g) M: Khối lượng mẫu thử (g) B: Độ ẩm của mẫu thử (%) 2.2.6. Tro không tan trong acid Xác định theo DĐVN V, phụ lục 9.7: Cho 25 ml dung dịch acid hydrocloric 2 M vào tro toàn phần, đun sôi 5 phút, lọc để tập trung những chất không tan vào một giấy lọc không tro, rửa bằng nước nóng rồi đem nung ở 500°C đến khối lượng không đổi (nung trong 4 giờ). Tỉ lệ % tro không tan trong acid của dược liệu được tính tương tự như tro toàn phần. 2.2.7. Tạp chất Thử theo DĐVN V, phụ lục 12.11: Cân khoảng 50g dược liệu dàn mỏng trên tờ giấy, quan sát bằng mắt thường hoặc kính lúp. Cân phần tạp chất và tính phần trăm: X % = × 100 Trong đó: a: Khối lượng tạp chất tính bằng gam. p: Khối lượng mẫu thử tính bằng gam. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 14
24. 2.2.8. Định tính Phương pháp sắc ký bản mỏng với điều kiện: Pha động: Chọn một hệ dung môi đặc trưng cho nhóm saponin sau: CH3OH-H2O (3:1, v/v) (Hệ I) CH3CN-H2O (2:1, v/v) (Hệ II) CH3OH-CH3CN-H2O (2:1:1, v/v/v) (Hệ III) Pha tĩnh: Bản mỏng đế nhôm Silica gel 60 RP-18 F254S đã được hoạt hóa ở nhiệt độ 105°C trong 60 phút trước khi dùng. Thuốc thử phát hiện: Acid sulfuric 10% trong ethanol. Chuẩn bị mẫu: + Dung dịch thử: Lấy 1g bột mẫu thử, thêm 10ml methanol : nước (4:1), siêu âm 15 phút, lọc, dịch lọc dùng chấm sắc ký. + Dung dịch đối chiếu 1: Lấy 1g mẫu bột SVD (mẫu chuẩn) thêm 10ml methanol : nước (4:1), tiếp tục tiến hành giống dung dịch thử. + Dung dịch đối chiếu 2: Hòa tan một lượng stipuleanosid R2 chuẩn trong methanol để được dung dịch có nồng độ 0,5 mg/ml. Cách tiến hành: Trên bản mỏng silica gel 60 RP-18 F254S, đã hoạt hóa ở 105°C trong 60 phút, chấm riêng biệt mỗi 5 µl mỗi dung dịch thử và các dung dịch đối chiếu, tiến hành sắc ký theo DĐVN V, phụ lục 5.4. Sau khi triển khai hệ dung môi được khoảng 8 cm, lấy bản mỏng ra, để bay hơi hết dung môi, phun thuốc thử. Sấy bản mỏng ở 105°C trong 5 phút. Quan sát bản mỏng dưới ánh sang tử ngoại UV 365 nm và ánh sáng thường. Kết quả: Sắc ký đồ của dung dịch thử và dung dịch đối chiếu được chụp ảnh lưu giữ. Các giá trị hệ số di chuyển (Rf) của stipuleanosid R2 và các @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 15
25. vết chính được tính bằng tỷ số giữa đường đi của các vết đó trên đường đi của pha động. 2.2.9. Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, theo DĐVN V, phụ lục 5.3. a) Xây dựng phương pháp Chuẩn bị dung dịch thử, dung dịch chuẩn: Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 1g bột dược liệu cho vào bình tam giác dung tích 100 ml, thêm chính xác 50 ml hỗn hợp methanol : nước tỷ lệ 70 : 30, cân, siêu âm 30 phút, để nguội, bổ sung bằng hỗn hợp dung môi trên lượng đã mất, lọc qua màng lọc kích cỡ 0,45 µm được dung dịch để tiêm sắc ký. Dung dịch mẫu chuẩn: Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 trong methanol có các điểm nồng độ chính xác gồm: 18,75 µg/ml, 37,5 µg/ml, 75 µg/ml, 150 µg/ml, 200 µg/ml, 300 µg/ml và 400 µg/ml. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký: Tham khảo một số tài liệu và điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm, tiến hành khảo sát định lượng thành phần saponin trong thân rễ SVD như sau: Cột sắc ký: Tiến hành khảo sát trên các cột C18 pha đảo. Pha động: Qua tham khảo tài liệu, khảo sát các loại pha động với thành phần, tỷ lệ, tốc độ dòng khác nhau. Detector: Lựa chọn sử dụng detector thích hợp trong 3 loại detector UV, FLD, DAD để đảm bảo vừa phát hiện được được chất phân tích, vừa tiện lợi cho quá trình phân tích và phù hợp trong điều kiện phòng thí nghiệm. Thể tích tiêm mẫu: Khảo sát để lựa chọn thể tích tiêm mẫu phù hợp nhất. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 16
26. b)Thẩm định và đánh giá phương pháp Thẩm định các điều kiện định lượng một saponin chính trong thân rễ SVD với chất đối chiếu của chất đó đã qua nhận dạng cấu trúc và xác định tổng tạp chất bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích. Quy trình được đánh giá theo hướng dẫn của các tài liệu [5-7,25] bằng việc khảo sát các chỉ tiêu sau đây: Độ đặc hiệu Độ đặc hiệu là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần như tạp chất hoặc các chất cản trở khác. Yêu cầu: - Sắc ký đồ các mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ các mẫu chuẩn. - Sắc ký đồ mẫu trắng không được xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn. Độ tương thích hệ thống Tính thích hợp của hệ thống phân tích là độ chính xác của thiết bị, được xác định bằng cách đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã được xử lý. Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn, ghi lại các giá trị về thời gian lưu, diện tích pic. Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng giá trị RSD (%) của các đáp ứng phân tích. Yêu cầu: RSD ≤ 5,0 %. Độ tuyến tính Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất phân tích (x). Độ tuyến tính được biểu thị bằng phương trình y = ax + b và hệ số tương quan tuyến tính R2. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 17
27. Cách xác định: Chuẩn bị một dãy chất đối chiếu gồm 6 mẫu có nồng độ tăng dần trong khoảng thích hợp. Xác định sự tuyến tính giữa đáp ứng của pic và nồng độ chất cần phân tích trong mẫu thử bằng phương trình hồi quy tuyến tính. Yêu cầu: R2 > 0,998. Độ lặp lại Độ lặp lại của phương pháp phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết quả thử riêng biệt theo quy trình thử nghiệm được áp dụng lặp đi lặp lại trên cùng một mẫu, được xác định bằng cách phân tích lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu nhưng các lần lặp lại phải được thực hiện từ công đoạn đầu tiên (cân, pha, xử lý mẫu ) đến công đoạn cuối cùng của quy trình phân tích. Tiến hành: Pha 6 mẫu thử riêng biệt theo quy trình chuẩn bị mẫu thử rồi tiêm vào hệ thống sắc ký, tiêm lặp lại nhiều lần, lấy giá trị trung bình. Độ lặp lại được biểu thị bằng giá trị RSD (%) của các đáp ứng phân tích. Yêu cầu: RSD ≤ 5,0 % Độ đúng Độ đúng của phương pháp là chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng. Tiến hành: Pha dung dịch thử và dung dịch chuẩn theo quy trình chuẩn bị mẫu. Thêm vào mẫu thử những lượng chất chuẩn khác nhau (lượng chất chuẩn thêm vào không nên quá 40% lượng hoạt chất đã có sẵn và tổng lượng hoạt chất có trong mẫu nằm trong khoảng tuyến tính) rồi tiến hành định lượng để xác định hàm lượng của các chất trong mẫu thử và mẫu thử có thêm chất chuẩn dựa trên phương trình đường chuẩn, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Độ đúng sẽ được tính bằng tỷ lệ phần trăm giữa lượng chất chuẩn tìm được so với lượng chất chuẩn thêm vào. Yêu cầu: Độ thu hồi nằm trong @ kho Schoolảng từ 95,0% of đ Medicineến 105,0%. and Pharmacy, VNU 18
28. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp, là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được. Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ đúng và độ chính xác mong muốn. Tiến hành: Xác định LOD và LOQ dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu đường nền (S/N). Pha loãng dung dịch đối chiếu từ nồng độ ban đầu đến nồng độ thấp nhất có thể phát hiện được bằng sắc ký. Đo tín hiệu liên tục từ mẫu trắng và mẫu thử. Thiết lập tỷ số S/N. LOD: Là nồng độ tối thiểu của chất phân tích mà tại đó có tín hiệu bằng 3 lần nhiễu đường nền (S/N =3/1). LOQ: Là nồng độ tối thiểu chất phân tích tại đó có tín hiệu bằng 10 lần nhiễu đường nền (S/N =10/1). c) Phương pháp xử lý số liệu. Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích với các đại lượng đặc trưng kết hợp với sự hỗ trợ tính toán của Microsoft Office Excel. Hàm lượng stipuleanosid R2 có trong dược liệu Sâm vũ diệp (%) tính theo dược liệu khô được tính bằng công thức: ×50 ×100 X (%) = ×(100− )×100 Trong đó: C: Nồng độ của stipuleanosid R2 trong dung dịch mẫu thử (µg/ml) mc: Khối lượng mẫu thử (mg) a: Độ ẩm mẫu thử (%) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 19
29. CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Mô tả Dược liệu là thân rễ SVD. Thân rê ̃ SVD nhiều đố t, cong ngoằ n ngoèo, dài 7-12 cm, đườ ng kính 0,5-1,5 cm. Măṭ ngoài màu nâu, có những vết nhăn doc,̣ mảnh; những vết vân ngang nổi rõ chia thân rê ̃ thành nhiều đố t, có nhiều seọ do thân khí sinh hàng năm tàn luị để lai.̣ Thể chấ t cứ ng chắ c, giòn, dê ̃ bẻ, măṭ bẻ lở m chở m, màu vàng nâu nhat.̣ Mùi thơm nhe ̣đăc̣ trưng, vi ̣đắ ng, hơi ngot.̣ 3.2. Vi phẫu Lớ p bầ n gồ m 5 - 6 hàng tế bào hình chữ nhât,̣ thành hơi cong, màu luc,̣ lớp ngoài bi ̣bong rách ra. Mô mềm vỏ gồ m những tế bào hình nhiều canḥ dày lên ở góc, chứ a nhiều ố ng tiết và tinh thể calci oxalat hình cầ u gai. Các bó libe-gỗ xếp thành bó riêng lẻ, kéo dài theo hướng xuyên tâm, phân cách nhau bở i tia ruột rông.̣ Gỗ gồ m những tế bào thành dày, đăṭ trong mô mềm gỗ ít hóa gỗ. Tầ ng phát sinh libe-gỗ nằm giữa libe cấp hai và gỗ cấp hai, gồm nhiều lớp tế bào nhỏ hình chữ nhật có màng mỏng, xếp thành dãy đều đặn. Tia ruột rông̣ gồ m nhiều tế bào xếp theo hướ ng xuyên tâm. Ruôṭ cấ u taọ bởi các tế bào để hở những khoảng gian bào, ố ng tiết ở vi ̣ trí ứ ng với các bó libe-gỗ ở cả phía trong lâñ phía ngoài. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 20
30. Hình 3.1. Vi phẫu thân rễ Sâm vũ diệp 3.3. Soi bột Màu vàng nâu. Soi kính hiển vi thấ y: những haṭ tinh bôṭ hình bầu dục, kích thước không đều, rố n haṭ là môṭ vach.̣ Mảnh bầ n vớ i những tế bào hình nhiều canh,̣ thành dày màu vàng nâu. Mảnh mô mềm gồ m những tế bào màng mỏng, màu trắ ng. Mảnh macḥ vach,̣ macḥ mang.̣ Rải rác có chấ t tiết màu nâu đen. Tinh thể calci oxalat hình cầ u gai. Bần Mô mềm Mô mềm chứa tinh bột Mảnh mạch Đám tinh bột Chất tiết Tinh thể calci oxalate Hình 3.2. Bột thân rễ Sâm vũ diệp 3.4. Độ ẩm Tiến hành xác định độ ẩm của các mẫu dược liệu SVD theo phương pháp mục 2.2.4, kết quả thu được ở b ả@ng 2School: of Medicine and Pharmacy, VNU 21
31. Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm của các mẫu Sâm vũ diệp TT Tên mẫu Hàm ẩm (% ) 1 Mẫu 1 8,3 2 Mẫu 2 8,2 3 Mẫu 3 8,0 Trung bình 8,17 % Nhận xét: Độ ẩm các mẫu dược liệu SVD trung bình khoảng 8,17%, nằm trong ngưỡng an toàn theo qui định của DĐVN. Để tránh cho dược liệu nhanh bị mốc do ẩm, qui định hàm ẩm dược liệu SVD không quá 10%. 3.5. Tro toàn phần Tiến hành xác định tro toàn phần của các mẫu dược liệu kết quả được trình bày tại bảng 3: Bảng 3.2. Kết quả xác định tro toàn phần của các mẫu Sâm vũ diệp TT Tên mẫu Tro toàn phần (% ) 1 Mẫu 1 7,80 2 Mẫu 2 7,14 3 Mẫu 3 7,65 Trung bình 7,53% Nhận xét: Từ bảng trên cho thấy tỷ lệ tro toàn phần của dược liệu SVD trung bình là 7,53%, mẫu cao nhất là trên 7,8%. Do vậy, qui định tỷ lệ tro toàn phần dược liệu không quá 8%. 3.6. Tro không tan trong acid Sau khi tiến hành như mô tả ở mục 2.2.6, kết quả xác định được độ tro không tan trong acid của các mẫu dược liệu SVD như trình bày ở bảng 4 như sau: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 22
32. Bảng 3.3. Kết quả xác định độ tro không tan trong acid của các mẫu Sâm vũ diệp TT Tên mẫu Tro không tan trong acid (%) 1 Mẫu 1 1,54 2 Mẫu 2 1,57 3 Mẫu 3 1,58 Trung bình 1,57 % Nhận xét: Kết quả cho thấy độ tro không tan trong acid trung bình của ba mẫu dược liệu SVD là 1,57%. Dự kiến quy định độ tro không tan trong acid của dược liệu SVD không được quá 2,0%. 3.7. Định tính Tiến hành chạy SKLM với bản mỏng pha đảo, hệ dung môi và chất thử, chất đối chiếu được chuẩn bị như mục 2.2.8. Kết quả: Quan sát dưới ánh sáng thường, sắc ký đồ bản mỏng của dung dịch thử (I) phải có các vết cùng màu, cùng Rf với sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (II) và có một vết ở khoảng Rf 0,3 đến 0,5 có cùng màu và cùng Rf với sắc ký đồ của dung dịch chất chuẩn stipuleanosid R2 (III) (Hình 6). Hình 3.3. Sắc ký đồ TLC định tính dược liệu Sâm vũ diệp (Ký hiệu: I: mẫu thử; II: mẫu dược liệu SVD @ đSchoolối chiếu; III:of stipuleanosidMedicine R2)and Pharmacy, VNU 23
33. 3.8. Định lượng Chương trình tiến hành dưới đây tiến hành theo phương pháp đã được nhóm nghiên cứu của thạc sĩ Nguyễn Thị Thu Thủy xây dựng như sau [17]: a) Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký Chúng tôi xây dựng được chương trình sắc ký sử dụng hệ thống HPLC Agilent 1260 Infinity như sau: - Pha tĩnh: Agilent Eclipse Plus C18 (Φ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm). - Detector UV: bước sóng 203 nm. - Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút, điều chỉnh nếu cần thiết. - Thể tích tiêm: 20 µL. - Pha động: Acetonitril (A) và 0,5% acid acetic/ H2O (B). Pha động được rửa giải theo chương trình như sau: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 24
34. Bảng 3.4. Chương trình dung môi Thời gian A (%, v/v) B (%, v/v) Kiểu rửa giải (phút) 0-5 20 80 Đẳng dòng 5-15 20→40 80→60 Gradient 15-20 40 60 Đẳng dòng 20-25 40→20 60→80 Gradient 25-30 20 80 Đẳng dòng b) Thẩm định phương pháp phân tích Chuẩn bị mẫu Dung dịch mẫu trắng: dung dịch MeOH Pha dung dịch mẫu thử: dùng cân phân tích cân chính xác khoảng 0,1 g cao ethanol thân rễ sâm vũ diệp (độ ẩm 4,7%) cho vào bình định mức 10 ml, thêm 7 ml methanol, lắc siêu âm 10 phút để hòa tan, thêm methanol vừa đủ tới vạch. Lắc đều, ly tâm lấy dịch chiết rồi lọc qua màng lọc 0,45 µm. Pha dung dịch đối chiếu stipuleanosid R2: dùng cân phân tích cân chính xác khoảng 1,0 mg stipuleanosid R2 rồi pha thành dung dịch gốc tương ứng với nồng độ 1000 μg/mL trong methanol, sau đó siêu âm 10 phút, ly tâm lấy dịch chiết rồi lọc qua màng lọc 0,45 µm. Pha loãng dung dịch chuẩn gốc với MeOH để thu được các dung dịch có nồng độ thích hợp để xây dựng dãy dung dịch chuẩn. Tính thích hợp hệ thống Tiến hành phân tích 01 dung dịch chuẩn của stipuleanosid R2 lặp lại 06 lần. Tiến hành sắc ký, ghi lại các sắc ký đồ và xác định giá trị thời gian lưu, diện tích pic, hệ số đối xứng. Kết quả cho thấy độ lệch chuẩn tương đối về thời gian lưu, diện tích pic và hệ số bất đối lần lượt là 0,15%; 2,75% và 1,21% đều thấp hơn 3% (Bảng 6). Điều đó cho thấy các điều kiện sắc ký đã @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 25
35. lựa chọn và hệ thống sắc ký HPLC sử dụng là ổn định, phù hợp cho phép phân tích stipuleanosid R2 trong dược liệu sâm vũ diệp. Bảng 3.5. Tính thích hợp của hệ thống STT Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU*s) Hệ số bất đối 1 15,707 424,728 0,90 2 15,698 421,771 0,89 3 15,674 449,195 0,92 4 15,658 419,380 0,90 5 15,680 418,038 0,92 6 15,729 440,903 0,91 TB 15,691 429,003 0,913 RSD (%) 0,15 2,75 1,21 Tính đặc hiệu Tiến hành sắc ký các loại mẫu trắng, mẫu chuẩn stipuleanosid R2 và mẫu thử theo quy trình phân tích ở trên. Ghi lại sắc ký đồ, xác định thời gian lưu và phổ UV của pic stipuleanosid R2 trong sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn. Kết quả thu được được trình bày trong các hình 7 sau: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 26
36. Hình 3.4. Sắc ký đồ dung dịch mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử. Kết quả cho thấy: trên sắc ký đồ của dung môi pha mẫu không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của stipuleanosid R2 trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. Sắc ký đồ của dung dịch thử cho 1 pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của stipuleanosid R2 trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn. Độ tuyến tính Chuẩn bị các dung dịch chuẩn bằng cách pha loãng từ một dung dịch chuẩn gốc ban đầu với các hệ số pha loãng khác nhau. Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn (mỗi dung dịch tiêm 3 lần) ghi lại sắc ký đồ và xác định đáp ứng của pic. Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn trong mẫu so và đáp ứng pic thu được trên sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương @ School tối thiểu. of K ếMedicinet quả cho thấy andtương Pharmacy, VNU 27
37. quan tuyến tính giữa diện tích pic trên sắc ký đồ và nồng độ stipuleanosid R2 trong dung dịch theo phương trình y = 2,6081x + 49,1185 với hệ số tương quan R2 = 0,9988 (Bảng 7 và hình 8). Trong khoảng nồng độ khảo sát 15,625 – 400 µg/ml có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ stipuleanosid R2 với hệ số tương quan rất cao. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 28
38. Bảng 3.6. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của stipuleanosid R2 Nồng độ STT Diện tích pic (mAU*s) (µg/ml) 1 15,625 90,65283 2 37,5 154,6339 3 75 239,247 4 150 418,038 5 200 589,441 6 300 836,676 7 400 1087,77 Đồ thị đường chuẩn của stipuleanosid R2 1200 1000 y = 2.6081x + 49.1185 R² = 0.9988 800 600 400 200 0 Diện tích pic tích (mAU*s) Diện 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Nồng độ (µg/ml) Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của stipuleanosid R2 Độ đúng Khi thêm các lượng stipuleanosid R2 chuẩn khác nhau, phương pháp đều cho độ thu hồi nằm trong khoảng và độ lệch chuẩn tương đối RSD. Kết quả này chứng tỏ phương pháp xây dựng có độ thu hồi tốt, phù hợp với định lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu Sâm vũ diệp. Kết quả được trình bày ở bảng 8. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 29
39. Bảng 3.7. Khảo sát độ thu hồi Lượng Lượng có Diện tích pic Lượng tìm Độ thu hồi STT thêm vào sẵn (µg) (mAU*s) lại (µg) (%) (µg) 1 711,754 75 2094,160 72,358 96,48 2 711,754 75 2093,725 72,191 103,68 3 711,754 100 2167,998 100,668 100,67 4 711,754 100 2175,860 103,683 96,25 5 711,754 200 2416,990 196,137 98,07 6 711,754 200 2451,260 209,277 104,64 Trung bình 99,96 RSD (%) 3,31 Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ Tiến hành pha loãng dung dịch hỗn hợp chuẩn và phân tích HPLC đến khi tín hiệu của chất định phân tích trên sắc ký đồ có tỉ lệ S/N (tín hiệu/ nhiễu) đạt khoảng từ 2-3, trong đó S là chiều cao pic chất phân tích, N là chiều cao tín hiệu nhiễu trên nền lớn nhất. Nồng độ xác định được là giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp ứng với chất định phân tích Giới hạn định lượng LOQ: Giới hạn định lượng của phương pháp được xác định dựa trên giới hạn phát hiện LOQ = 3,3 x LOD. Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp có giới hạn phát hiện là LOD = 1,953 µg/ml, giới hạn định lượng LOQ = 3,3 x LOD = 6,445 µg/ml. Kết quả cho thấy phương pháp đã xây dựng có giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng tương đối phù hợp để xác định hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu sâm vũ diệp. c) Kết quả định lượng Ta có sắc ký đồ HPLC của stipuleanosid R2 và của dược liệu SVD (Hình 9) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 30
40. Hình 3.6. Sắc ký đồ HPLC của stipuleanosid R2 (A) và dược liệu Sâm vũ diệp (B). Kết quả định lượng thành phần stipuleanosid R2 trong các mẫu SVD được trình bày tại bảng 9: Bảng 3.8. Hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu Sâm vũ diệp TT Tên mẫu Hàm lượng % stipuleanosid R2 tính theo khối lượng khô tuyệt đối 1 Mẫu 1 0,338 2 Mẫu 2 0,334 3 Mẫu 3 0,332 Trung bình 0,335 % ± 0,003 Nhận xét: Ta thấy hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu thử nằm trong khoảng từ 0,332 % đến 0,338 % trung bình 0,335 % ± 0,003. Giới hạn hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu SVD qui định trong tiêu chuẩn không được thấp hơn 0,3 %. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 31
41. 3.9. Bàn luận 3.9.1. Về mô tả dược liệu Nghiên cứu thực hiện trên mẫu dược liệu đã được giám định tên khoa học thu hái tại Sa Pa – Lào Cai năm 2016. Kết quả sẽ tốt hơn nếu thực hiện quan sát trên nhiều mẫu thu hái ở các vùng khác nhau. 3.9.2. Về khảo sát các chỉ tiêu theo quy định trong Dược điển Việt Nam Khi xây dựng tiêu chuẩn cho một dược liệu nghiên cứu đã đánh giá các chỉ tiêu về độ ẩm, tỷ lệ tro toàn phần, tỷ lệ tro không tan trong acid là những chỉ số đặc trưng giúp đánh giá chất lượng của dược liệu SVD trước khi đưa vào sử dụng. Do thời gian và kinh phí không cho phép nên một số chỉ tiêu chưa thực hiện được như các tạp chất lẫn trong dược liệu, tỷ lệ vụn nát dược liệu, hàm lượng kim loại nặng, hàm lượng các chất có thể chiết đượctrong dược liệu bằng dung môi (nước, ethanol, ). 3.9.3. Về định tính Định tính chúng tôi sử dụng phương pháp SKLM: Khi phun thuốc thử H2SO4 10% trong ethanol rồi hơ nóng bản mỏng thấy có xuất hiện các vết chất ở cùng khoảng Rf và cùng màu với nhau cho thấy sự có mặt của chất stipuleanosid R2. Nghiên cứu đã đề xuất được hệ dung môi phù hợp để định tính thành phần stipuleanosid R2 trong dược liệu SVD bằng phương pháp SKLM. 3.9.4. Về định lượng Chúng tôi đã xác định được hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu dược liệu SVD thu hái ở Sa Pa bằng phương pháp HPLC. Kết quả thu được như sau: Hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu thử nằm trong khoảng từ 0,332 % đến 0,338 %. Do đó, giới hạn hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu SVD qui định trong tiêu chuẩn không được thấp hơn 0,3 %. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 32
42. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đề tài đã thực hiện được các mục tiêu nghiên cứu đã đề ra như sau: - Đã khảo sát các tiêu chí của dược liệu SVD theo tiêu chuẩn chế biến dược liệu thân rễ quy định trong DĐVN V, gồm: mô tả hình thái, vi phẫu, soi bột, độ ẩm, tro toàn phần, tro không tan trong acid, định tính, định lượng. - Khảo sát, xây dựng được quy trình định lượng saponin bằng phương pháp HPLC tính theo stipuleanosid R2. - Đây là nghiên cứu bước đầu góp phần từng bước hoàn thiện chuyên luận tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu SVD của DĐVN trong tương lai. Trên cơ sở kết quả đạt được, nhóm nghiên cứu đề xuất dự thảo tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu SVD (phụ lục II).Trong đó, độ ẩm: không quá 10,0%; tro toàn phần: không quá 8,0%; tro không tan trong acid: không quá 2,0%; định lượng: hàm lượng stipuleanosid R2 không được thấp hơn 0,3 %. KIẾN NGHỊ 1. Đề xuất xác định tỉ lệ tạp chất trong dược liệu, tỉ lệ vụn nát và xác định hàm lượng kim loại nặng cho dược liệu SVD. 2. Đề xuất tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu SVD để bổ sung một chuyên luận mới về dược liệu SVD trong Dược điển Việt Nam. 3. Đề xuất thầm định tiêu chuẩn cơ sở dược liệu SVD. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 33
43. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong cùng cộng sự (2003), Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt Nam tập 2, Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật, tr. 711 – 714. [2] Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007), Thực vật học, NXB Y học, tr. 285- 286. [3] Bộ Khoa học và Công nghệ (2007), Sách đỏ Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội, tr. 85 – 87. [4] Bộ Y Tế (2018), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất bản Y học. [5] Bộ Y tế (2009), Hướng dẫn của Asean về thẩm định quy trình phân tích Phụ lục 7 - Thông tư 22/2009 TT-BYT Quy định về đăng ký thuốc. [6] Bộ Y tế, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2007), Đảm bảo chất lượng thuốc và một số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, tr. 107-113, 216-250. [7] Nguyễn Thượng Dong, TS. Trần Công Luận, TS. Nguyễn Thị Thu Hương (2007), Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ Nhân sâm, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 326 – 338. [8] Phạm Xuân Đà (2010), Thẩm định phương pháp phân tích trong hóa học và vi sinh vật, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, tr. 19-58. [9] Nguyễn Thị Thu Hương và và cộng sự (2001), Công trình nghiên cứu Khoa học 1987-2000, Tác dụng kích thích miễn dịch của sâm Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr. 464 - 466. [10] Nguyễn Thị Thu Hương, Lương Kim Bích và Đoàn Thị Ngọc Hạnh (2005), "Nghiên cứu tác dụng của sâm Việt Nam và đinh lăng trên trí nhớ", Tạp chí Dược liệu, 10(6), tr.@ 196 School-200. of Medicine and Pharmacy, VNU
44. [11] Nguyễn Thị Thu Hương và Trần Mỹ Tiên, (2001), "Nghiên cứu tác dụng chống stress và chống trầm cảm của sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv. Araliaceae) và hoạt chất chính majonosid-R2", Tạp chí Dược liệu, 6(1), tr. 25-27. [12] Trần Công Luận (2002), Phân tích thành phần hóa học và một số tác dụng dược lý của hai loài sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng), Đề tài cấp Bộ, tr. 1- 65. [13] Trần Công Luận, Lưu Thảo Nguyên, Nguyễn Tập (2009), “Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng dược lý của hai loài sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng)”, Tạp chí dược liệu, 14(1), tr. 17-23. [14] Lã Đình Mỡi và các cộng sự (2013), "Họ nhân sâm(Araliaceae Juss.)- nguồn hoạt chất sinh học đa dạng và đầy triển vọng ở Việt Nam", Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 5, tr. 1152-1158. [15] Nguyễn Văn Tập (2005), “Các loài thuộc chi Panax L. ở Việt Nam”, Tạp chí dược liệu, 10(3), tr. 71-76. [16] Nguyễn Văn Tập, Phạm Thanh Huyền, Lê Thanh Sơn (2006), “Kết quả nghiên cứu về phân bố, sinh thái sâm vũ diệp và Tam thất hoang ở Việt Nam”, Tạp chí dược liệu, 11(5), tr. 177-180. [17] Nguyễn Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Huệ, Đặng Thị Thùy, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Dương Thị Phượng, Phạm Thị Tuyết Nhung, Hà Vân Oanh, Dương Thị Ly Hương, Nguyễn Hữu Tùng (2018), “Nghiên cứu thành phần saponin của thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidius Seem.) thu hái ở Sa Pa, Lào Cai”, Tạp chí Dược liệu, 2(23), tr. 82-88. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
45. [18] Trần Mỹ Tiên và Nguyễn Thị Thu Hương (2006), "Xây dựng thử nghiệm tránh né thụ động để nghiên cứu tác dụng của sâm Việt Nam trên trí nhớ", Tạp chí Dược liệu, 11(5), tr. 202-206. [19] Trần Mỹ Tiên và Nguyễn Thị Thu Hương (2005), "Nghiên cứu một số tác dụng dược lý của lá sâm Việt Nam - Tác dụng chống stress và tác dụng chống oxy hóa", Tạp chí Dược liệu, 10(1), tr. 27-32. Tiếng Anh [20] Shao-Xing Dai, Wen-Xing Li et al. (2016), "In silico identification of anticancer compounds and plants from traditional Chinese medicine database", Scientific Reports, 25462, pp. [21] Gurung B, Bhardwaj PK et al. (2018), "Major ginsenoside contents in rhizomes of Panax sokopayensis and Panax bipinnatifidus", Nat Prod Res, 33(2), pp. 234-238. [22] H. T. Nguyen, H. Q. Tran, T. T. Nguyen, V. M. Chau, K. A. Bui, Q. L. Pham, et al. (2011), "Oleanolic triterpene saponins from the roots of Panax bipinnatifidus", Chem Pharm Bull (Tokyo), 59(11), pp. 1417-1420. [23] D. Q. Wang, J. Fan, B. S. Feng, S. R. Li, X. B. Wang, C. R. Yang, et al. (1989), "Studies on saponins from the leaves of Panax japonicus var. bipinnatifidus(Seem.)Wu et Feng”, Yao Xue Xue Bao, 24(8), pp. 593-599. [24] Wang D.Q., Feng B.S. et al. (1989), "Further study on dammarane saponins of leaves of Panax japonicus var. major collected in Quinling Mountains China", Yao Xue Xue Bao, 24(8), pp. 633 – 636. [25] WHO (1997), A WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirements - Part 2: Validation, Word Health Organization, Geneva. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
46. [26] Zhang Y, Shi C et al. (2016), "Saponins from Panax bipinnatifidus Seem.: New strategy of extraction, isolation, and evaluation of tyrosinase inhibitory activity based on mathematical calculations", J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 1039, pp. 79-87. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
47. PHỤ LỤC I: PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
48. PHỤ LỤC II: DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU SÂM VŨ DIỆP Sâm vũ diệp (thân rễ) Panax bipinnatifidus Seem. Trúc tiết nhân sâm, Tam thất xẻ lá, Vũ diệp tam thất, Ngật đáp thất. Thân rễ đã phơi và sấy khô của cây Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.), ho ̣Nhân sâm (Araliaceae). Mô tả Thân rê ̃ thường nhiều đố t, cong ngoằ n ngoèo, dài 7-12 cm, đườ ng kính 0,5-1,5 cm. Măṭ ngoài màu nâu, có những vết nhăn doc,̣ mảnh; những vết vân ngang nổi rõ chia thân rê ̃ thành nhiều đố t, có nhiều seọ do thân khí sinh hàng năm tàn luị để lai.̣ Thể chấ t cứ ng chắ c, giòn, dê ̃ bẻ, măṭ bẻ lởm chở m, màu vàng nâu nhat.̣ Mùi thơm nhe ̣đăc̣ trưng, vi ̣đắ ng, hơi ngot.̣ Vi phẫu Lớ p bầ n gồ m 5 - 6 hàng tế bào hình chữ nhât,̣ thành hơi cong, màu luc,̣ lớp ngoài bi ̣bong rách ra. Mô mềm vỏ gồ m những tế bào hình nhiều canḥ dày lên ở góc, chứ a nhiều ố ng tiết và tinh thể calci oxalat hình cầ u gai. Các bó libe-gỗ xếp thành bó riêng lẻ, kéo dài theo hướng xuyên tâm, phân cách nhau bởi tia ruột rông.̣ Gỗ gồ m những tế bào thành dày, đăṭ trong mô mềm gỗ ít hóa gỗ. Tầ ng phát sinh libe-gỗ nằm giữa libe cấp hai và gỗ cấp hai, gồm nhiều lớp tế bào nhỏ hình chữ nhật có màng mỏng, xếp thành dãy đều đặn. Tia ruột rông̣ gồ m nhiều tế bào xếp theo hướng xuyên tâm. Ruôṭ cấ u taọ bởi các tế bào để hở những khoảng gian bào, ố ng tiết ở vi ̣trí ứ ng vớ i các bó libe-gỗ ở cả phía trong lâñ phía ngoài. Bột Màu vàng nâu. Soi kính hiển vi thấ y: những haṭ tinh bôṭ hình bầu dục, kích thước không đều, rố n haṭ là môṭ vach.̣ Mảnh bầ n vớ i những tế bào hình nhiều canh,̣ thành dày màu vàng nâu. Mảnh mô mềm gồ m những tế bào màng @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
49. mỏng, màu trắ ng. Mảnh macḥ vach,̣ macḥ mang.̣ Rải rác có chấ t tiết màu nâu đen. Tinh thể calci oxalat hình cầ u gai. Định tính Phương pháp sắc ký lớp mỏng (phụ lục 5.4). Bản mỏng: Silica gel 60 RP-18 F254S. Dung môi khai triển: CH3OH-H2O (3:1, v/v). Dung dicḥ thử: Lấy 1g bột mẫu thử, thêm 10 ml methanol: nước (4:1), siêu âm 15 phút, lọc, dịch lọc dùng chấm sắc ký. Dung dịch đối chiếu (1): Lấy 1g bột SVD (mẫu chuẩn) thêm 10 ml methanol: nước (4:1), tiếp tục tiến hành giống dung dịch thử. Dung dịch đối chiếu (2): Hòa tan một lượng stipuleanosid R2 chuẩn trong methanol để được dung dịch có nồng độ 0,5 mg/ml. Cá ch tiế n hà nh: chấ m riêng biêṭ lên bản mỏng 5 µl cho mỗi dung dicḥ thử và các dung dịch đối chiếu. Sau khi khai triển xong, lấ y bản mỏng ra để khô ở nhiêṭ đô ̣ phòng, phun dung dicḥ acid sulfuric 10% trong ethanol (TT). Sấ y bản mỏng ở 105°C cho đến khi hiện vết. Các vết trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có màu sắc và giá trị Rf giống các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu. Định lượng Cân chính xác khoảng 1,0 g bột dược liệu cho vào bình tam giác dung tích 100 ml, thêm chính xác 50,0 ml hỗn hợp methanol – nước tỷ lệ (70: 30), cân, siêu âm 30 phút, để nguội, bổ sung bằng hỗn hợp dung môi trên lượng đã mất, lọc qua màng lọc kích cỡ 0,45 m được dung dịch để tiêm sắc ký. Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 trong methanol có các điểm nồng độ chính xác gồm: 18,75 g/ml, 37,5 g/ml, 75 g/ml, 150 g/ml, 200 g/ml, 300 g/ml và 400 g/ml. Điều kiện sắc ký: Pha tĩnh: Agilent Eclipse Plus C18 (ϕ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm). Detector UV: bước sóng 203 nm. Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút, điều chỉnh nếu cần thiết. Thể tích tiêm: 20 µL. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
50. Pha động: Acetonitril (A) và 0,5% acid acetic/ H2O (B). Cách tiến hành: Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn có nồng độ chính xác khoảng 75 µg/ml đã chuẩn bị ở trên, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của các diện tích pic đáp ứng từ 6 lần tiêm lặp lại không được lớn hơn 2,0 %. Tiêm riêng biệt các dung dịch chuẩn, tiến hành sắc ký, ghi nhận các sắc ký đồ. Thiết lập đường chuẩn của stipuleanosid R2 giữa nồng độ dung dịch (µg/ml) và diện tích pic tương ứng theo phương trình y = ax + b. Tiêm dung dịch thử, tiến hành sắc ký, ghi nhận sắc ký đồ. Tính nồng độ stipuleanosid R2 trong dung dịch thử (µg/ml) dựa trên phương trình đường chuẩn đã xây dựng. Hàm lượng stipuleanosid R2 có trong dược liệu SVD (%) tính theo dược liệu khô kiệt được tính bằng công thức: C × 50 × 100 X (%) = mc × (100 – a) × 1000 Trong đó: C: nồng độ của stipuleanosid R2 trong dung dịch mẫu thử (g/ml). mc: lượng cân mẫu thử (mg). a: Độ ẩm mẫu thử (%). Hàm lượng saponin tổng không thấp hơn 0,3% tính theo dược liệu khô kiệt. Độ ẩm Không quá 10,0% ( phụ lục 9.6) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
51. Tro toàn phần Không quá 8,0% (phụ lục 9.8) Tro không tan trong acid Không quá 2,0% (phụ lục 9.7) Chế biến Thu hoạch thân rễ vào tháng 3 - 4, lấy về rửa sạch, phơi khô hoặc sấy nhiệt độ dưới 50ºC. Bảo quản Để nơi khô thoáng, tránh ẩm mốc. Tính vị, quy kinh Sâm vũ diệp có vị đắng, ngọt, tính hơi ấm. Công năng, chủ trị Có tác dụng dưỡng huyết, hoạt lạc, chỉ huyết, tán ứ. Chủ trị: dùng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cường sinh lực, chống stress @ School of Medicine and Pharmacy, VNU