Khóa luận Nghiên cứu khả năng tăng trưởng và tích lũy các chất chống oxy hóa của vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 dưới ảnh hưởng của các điều kiện ức chế

81 trang thiennha21 18/04/2022 3650

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu khả năng tăng trưởng và tích lũy các chất chống oxy hóa của vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 dưới ảnh hưởng của các điều kiện ức chế", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

khoa_luan_nghien_cuu_kha_nang_tang_truong_va_tich_luy_cac_ch.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu khả năng tăng trưởng và tích lũy các chất chống oxy hóa của vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 dưới ảnh hưởng của các điều kiện ức chế

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH CHU NGỌC PHƯỢNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TĂNG TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY CÁC CHẤT CHỐNG OXY HÓA CỦA VI TẢO DUNALIELLA BARDAWIL DCCBC 15 DƯỚI ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN ỨC CHẾ Chuyên ngành: Quản lý và cung ứng thuốc KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC Hướng dẫn khoa học: TS. Võ Hồng Trung TPHCM – 2018
LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan đây là báo cáo khóa luận của riêng em. Các thông tin, số liệu sử dụng phân tích và kết quả nghiên cứu được nêu trong khóa luận là trung thực, khách quan, có nguồn gốc rõ ràng, hoàn toàn được hình thành và phát triển trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu của em tại Bộ môn Hóa sinh – Độc chất trường Đại học Nguyễn Tất Thành, dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Võ Hồng Trung. Các luận điểm, dữ liệu được trích dẫn đầy đủ nếu không là ý tưởng hoặc kết quả tổng hợp của chính bản thân em. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 02 tháng 10 năm 2018 Sinh viên ký tên CHU NGỌC PHƯỢNG
LỜ I CẢ M ƠN Sau môṭ thời gian thưc̣ hiêṇ khóa luâṇ tốt nghiêp̣ đến nay, moị công viêc̣ liên quan đến khóa luâṇ đã hoàn tất. Trong suốt thời gian này, em đa ̃ nhâṇ đươc̣ nhiều sư ̣ giúp đỡ. Ở phần đầu tiên của khóa luân,̣ cho phép em có đôi điều gởi đến những người mà em vô cùng biết ơn. Em xin chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô Khoa Dược Trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã tận tình giảng dạy cho chúng em trong suốt quá trình học tập tại trường. Đăc̣ biêt,̣ em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Võ Hồng Trung, Trưởng Bô ̣ môn Hóa sinh - Đôc̣ chất, Khoa Dươc̣ Trường Đaị hoc̣ Nguyễn Tất Thành, người đã trực tiếp hướng dẫn, tâṇ tâm truyền đạt cho em nhiều kiến thức thực tế quý báu về nghiên cứ u khoa hoc̣ và giúp đỡ cho em trong suốt quá trình thưc̣ hiêṇ khóa luâṇ tốt nghiêp̣ taị Bô ̣môn. Bên canḥ đó, em muốn bày tỏ lòng biết ơn đến Quý Thầy Cô Bô ̣ môn Hóa sinh - Đôc̣ chất, Khoa Dươc̣ Trường Đaị hoc̣ Nguyễn Tất Thành, đăc̣ biêṭ là ThS. Nguyễn Thi ̣Hồng Phúc đã nhiệt tình hỗ trợ, giúp đỡ và tạo nhiều thuận lợi cho em trong quá trình thực hiêṇ khóa luâṇ tốt nghiêp̣ này. Sau cùng, xin chân thành cảm ơn các baṇ cùng khóa Dươc̣ 2013 và các em sinh viên khóa Dươc̣ 2014 đang thưc̣ hiêṇ các đề tài nghiên cứ u khoa hoc̣ taị Bô ̣ môn Hóa sinh - Đôc̣ chất, những người luôn sát cánh cùng em, đông̣ viên, chia sẻ những kiến thứ c, tình cảm, giúp đỡ em trong suốt quá trình hoc̣ tâp̣ và nghiên cứ u.
MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC HÌNH ẢNH iv DANH MỤC BẢNG vi ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Tổng quan về Dunaliella 3 1.1.1. Giới thiệu vi tảo Dunaliella 3 1.1.2. Hình dạng và cấu trúc tế bào Dunaliella 3 1.1.3. Các chất có hoạt tính sinh học ở Dunaliella 4 1.1.4. Cơ chế sinh tổng hợp carotenoid ở Dunaliella 6 1.1.5. Các điều kiện ức chế ảnh hưởng lên sự tổng hợp carotenoid 10 1.1.6. Mối quan hệ giữa con đường tổng hợp carotenoid và lipid 16 1.2. β-carotene và vai trò đối với sức khỏe 19 1.2.1. Giới thiệu β-carotene 19 1.2.2. Vai trò của β-carotene đối với sức khỏe 20 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. Chủng Dunaliella bardawil DCCBC 15 và môi trường nuôi cấy 22 2.2. Phương pháp phân tích 22 2.2.1. Quan sát hình thái tế bào 22 2.2.2. Xác định mật độ tế bào và tốc độ tăng trưởng đặc hiệu 22 2.2.3. Xác định hàm lượng carotene tổng và diệp lục tố 23 2.2.4. Xác định khả năng chống oxy hóa 23 2.2.5. Xác định hàm lượng phenolic tổng 24 2.2.6. Xác định trọng lượng khô 24 2.2.7. Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp sulfo-phospho-vanillin 24 2.2.8. Thu hoạch sinh khối tảo phân tích β-carotene 25 i
2.3. Phương pháp thiết kế thí nghiệm 25 2.3.1. Khảo sát sự tăng trưởng của vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl 25 2.3.2. Khảo sát sự tăng trưởng và tích lũy carotenoid của vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau 26 CHƯƠNG 3. KẾ T QUẢ VÀ BÀ N LUÂṆ 28 3.1. Kết quả 28 3.2. Bàn luận 54 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 4.1. Kết luận 60 4.2. Kiến nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt µg/mL Microgram/mL µL Microlit µM Micromol/lít AS Ánh sáng g/l Gram/lít M Mol/lít NPK Nitơ – Phosphor – Kali pg/tb Picogram/tế bào ROS Reactive oxygen species Gốc tự do oxy hóa tb/mL Tế bào/mL và cs. Cộng sự iii
DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Tế bào Dunaliella bardawil chụp dưới kính hiển vi điện tử [11] 4 Hình 1.2. Sơ đồ sinh tổng hợp isoprenoid ở vi tảo Dunaliella salina [54] 8 Hình 1.3. Các con đường tổng hợp carotenoid ở các sinh vật tự dưỡng tạo oxy [54] 10 Hình 1.4. Các cơ chế đáp ứng của tế bào D.salina đối với các ức chế môi trường [54] 13 Hình 1.5. Chu trình glycerol ở Dunaliella [11] 14 Hình 1. 6. Cấu trúc phân tử β-carotene 20 Hình 3.1. Hình thái của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl 28 Hình 3.2. Mật độ tế bào và trọng lượng khô của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl 29 Hình 3.3. Hàm lượng diệp lục tố a trên thể tích (a) và trên tế bào (b) của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl 31 Hình 3.4. Hàm lượng diệp lục tố tổng trên thể tích (a) và trên tế bào (b) của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl 32 Hình 3.5. Hàm lượng carotenoid trên thể tích (a), trên tế bào (b) và tỷ lệ carotenoid/ diệp lục tố (c) của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl 34 Hình 3.6. Hình thái của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau 36 Hình 3.7. Mật độ tế bào của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau 37 Hình 3.8. Trong̣ lương̣ khô của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau 37 Hình 3.9. Hàm lượng diệp lục tố a trên thể tích (a) và trên tế bào (b) của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau 40 Hình 3.10. Hàm lượng diệp lục tố tổng trên thể tích (a) và trên tế bào (b) của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau 41 iv
Hình 3.11. Hàm lượng carotenoid trên thể tích (a), trên tế bào (b) và tỷ lệ carotenenoid/diệp lục tố (c) của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau 44 Hình 3.12. Hàm lượng β-carotene của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiện nuôi cấy ức chế khác nhau 47 Hình 3.13. Hàm lượng lipid trên thể tích (a) và trên tế bào (b) của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau 48 Hình 3.14. Hàm lượng phenolic trên thể tích (a) và trên tế bào (b) của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau 50 Hình 3.15. Khả năng chống oxy hóa trên thể tích (a) và trên tế bào (b) của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau 52 v
DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Thí nghiệm ảnh hưởng của các điều kiện ức chế khác nhau lên sự tích lũy carotenoid của D.bardawil DCCBC 15 27 Bảng 3.1. Mật độ tế bào và trọng lượng khô của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl 30 Bảng 3.2. Hàm lượng diệp lục tố a, diệp lục tố tổng trên thể tích và trên tế bào của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl 33 Bảng 3.3. Hàm lượng carotenoid trên thể tích, trên tế bào và tỷ lệ carotenoid/diệp lục tố của D.bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl 35 Bảng 3.4. Mật độ tế bào của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau 38 Bảng 3.5. Trong̣ lương̣ khô của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau 39 Bảng 3.6. Hàm lượng diệp lục tố a trên thể tích và trên tế bào của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau 42 Bảng 3.7. Hàm lượng diệp lục tố tổng trên thể tích và trên tế bào của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau 42 Bảng 3.8. Hàm lượng carotenoid trên thể tích của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau 45 Bảng 3.9. Hàm lượng carotenoid trên tế bào của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau 45 Bảng 3.10. Tỷ lệ carotenoid/diệp lục tố của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau 46 Bảng 3.11. Hàm lượng β-carotene của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiện kiện nuôi cấy ức chế khác nhau 47 Bảng 3.12. Hàm lượng lipid tổng trên thể tích và trên tế bào của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau 49 vi
Bảng 3.13. Hàm lượng phenolic trên thể tích và tế bào của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau 51 Bảng 3.14. Khả năng chống oxy hóa trên thể tích và trên tế bào của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau 53 vii
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học – Năm học 2013 – 2018 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TĂNG TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY CÁC CHẤT CHỐNG OXY HÓA CỦA VI TẢO DUNALIELLA BARDAWIL DCCBC 15 DƯỚI ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN ỨC CHẾ Chu Ngọc Phượng Hướng dẫn khoa học: TS. Võ Hồng Trung TÓ M TẮ T Mở đầu: Nhu cầu sử dụng β-carotene trên thế giới ngày càng cao nhưng nguồn cung cấp chủ yếu là từ tổng hợp hóa học do đó Dunaliella bardawil DCCBC 15 được xem là nguồn sản xuất β-carotene tự nhiên tốt và có khả năng đáp ứng cao vì chứa các hợp chất có ứng dụng quan trọng trong dược phẩm như β-carotene, glycerol và các chất màu khác. Đố i tương̣ và phương pháp nghiên cứ u: Chủng tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 được sử dụng để khảo sát sự tăng trưởng trong môi trường MD4 1,5M NaCl và ảnh hưởng của ức chế H2O2 riêng rẽ và H2O2 kết hợp với ánh sáng cao, độ muối cao lên sự tăng trưởng, tích lũy các chất chống oxy hóa, đặc biệt là hàm lượng β-carotene tích lũy trong vi tảo. Kết quả: Dunaliella bardawil DCCBC 15 tăng trưởng tốt trong môi trường MD4 1,5M NaCl, hàm lượng diệp lục tố tăng cao trong phase tăng trưởng, hàm lượng carotenoid tăng mạnh khi vi tảo đạt phase ổn định hoặc suy vong do cạn kiệt dinh dưỡng. Trong các điều kiện ức chế, sự tăng trưởng của Dunaliella bardawil DCCBC 15 bị ức chế, hàm lượng diệp lục tố duy trì ổn định, trong khi đó tăng tổng hợp lipid và các chất chống oxy hóa như carotenoid và phenolic. Trong đó ở điều kiện ức chế cạn kiệt dinh dưỡng và kết hợp vớ i cườ ng đô ̣chiếu sáng manḥ thi ̀ hàm lượng β-carotene cao hơn so với các điều kiện còn lại. Kết luân:̣ Dunaliella bardawil DCCBC 15 là vi tảo lục đơn bào có khả năng tổng hợp lượng lớn β-carotene và các chất chống oxy hóa dưới các điều kiện ức chế ánh sáng cao và cạn kiệt dinh dưỡng. Do đó việc sản xuất β-carotene từ vi tảo này là một hướng nghiên cứu mới đầy tiềm năng, đồng thời tận dụng dải bờ biển dài của nước ta cho việc nuôi trồng loài vi tảo biển này. Từ khóa: Dunaliella bardawil DCCBC 15, môi trường MD4, β-carotene, khả năng chống oxy hóa. viii
Final assay for the degree of BS Pharm - Academic year: 2013 - 2018 STUDY ON THE GROWTH AND ACCUMULATION OF ANTIOXIDANTS OF DUNALIELLA BARDAWIL DCCBC 15 UNDER THE INFLUENCE OF INHIBITORY CONDITIONS Chu Ngọc Phượng Supervisor: Vo Hong Trung, Ph.D ABSTRACT Introduction: The demand for β-carotene in the world is increasing but the source of supply is mainly from chemical synthesis. Dunaliella bardawil DCCBC 15 is considered to be a good natural source of β-carotene production and highly responsive because it contains important pharmaceutical ingredients such as β-carotene, glycerol and other pigments. Materials and methods: Dunaliella bardawil DCCBC 15 was used to investigate growth in 1.5M NaCl MD4 medium and the effect of stress culturing conditions including separate H2O2 supplement and combination of H2O2 supplement with high light intensity and salt concentration on the growth and accumulation of antioxidants, especially β-carotene content in the microalgae. Results: Dunaliella bardawil DCCBC 15 in 1.5M NaCl MD4 medium was high growth rate, high chlorophyll content at exponental phase and carotenoid content reaching high level at stationary phase or death phase due to nutrient starvation of cultural medium. Under stress conditions, the growth of Dunaliella bardawil DCCBC 15 was inhibited and stable chlorophyll content while the biosynthesis of lipid and antioxidants such as carotenoids and phenolic increased. Under the stress conditions, the nutrient starvation and combination of high light intensity, the content of β-carotene is higher than the other stress conditions. Conclusion: Dunaliella bardawil DCCBC 15 is a unicellular green microalgae, be able to accumulate large amount of β-carotene and antioxidants under stress conditions such as nutrition starvation and high light intensity. Therefore, the β-carotene production from the microalgae is one of the studied prospects in future, expecially Viet Nam has long coastline. Keywords: Dunaliella bardawil DCCBC 15, MD4 medium, β-carotene, antioxidant capacity. ix
ĐẶT VẤN ĐỀ Carotenoid được biết đến như là chất chống oxy hóa mạnh có nguồn gốc tự nhiên giúp ngăn cản các tế bào bình thường chuyển thành các tế bào gây ung thư, làm chậm lại sự phát triển của khối u, ngăn cản sự tạo thành các chất gây ung thư. Ngoài ra, carotenoid còn đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn ngừa và điều trị các bệnh như tim mạch, viêm thấp khớp, chứng loạn dưỡng cơ, bệnh đục thủy tinh thể và một số rối loạn về thần kinh. β-carotene là đồng phân quan trọng của carotenoid, thuộc nhóm các sắc tố hữu cơ tự nhiên. β-carotene có thể chuyển hóa thành vitamin A trong cơ thể và được xem là tiền chất tốt nhất của vitamin A trong các loại carotenoid. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng β-carotene là một sắc tố tự nhiên có khả năng chống oxy hóa rất cao, kích thích tế bào miễn dịch, phối hợp với các chất chống oxy hoá khác như vitamin C và vitamin E làm giảm các nguy cơ nhiễm trùng, làm chậm quá trình lão hóa, giảm tác hại của ánh sáng mặt trời, cũng như giảm nguy cơ một số bệnh về tim mạch và ngăn ngừa một số bệnh ung thư [1]. Hiện nay, chủng tảo Dunaliella được xem là nguồn sản xuất β-carotene tự nhiên tốt nhất do có chứa tỉ lệ cao đồng phân 9-cis-β-carotene, được chứng minh là có hoạt tính chống oxy hóa tốt hơn nhiều đồng phân all-trans-β-carotene. Trong khi đó, β-carotene tổng hợp chỉ chứa đồng phân all-trans-β-carotene. Mặt khác, việc sản xuất carotenoid từ nguồn có sẵn trong tự nhiên được cho là an toàn hơn vì ít tạo ra các dạng đồng phân cấu trúc có khả năng ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người so với từ con đường tổng hợp hóa học. Vi tảo biển Dunaliella bardawil DCCBC 15 là nhóm vi tảo lục đơn bào thuộc Ngành Tảo lục - Họ Dunaliellaceae có giá trị kinh tế cao bởi nó có chứa các hợp chất có ứng dụng quan trọng trong dược phẩm như β- carotene, glycerol và các chất màu khác [1]. Loài tảo này chẳng những xuất hiện ở châu Phi, Đại Tây Dương và Địa Trung Hải, mà còn có mặt ở Biển Chết, các đại dương, biển, hồ khác - những nơi nước rất mặn, ánh nắng mạnh và nhiệt độ cao. Nhu cầu sử dụng β-carotene trên thế giới ngày càng cao nhưng nguồn cung 1
cấp β-carotene chủ yếu là từ tổng hợp hóa học (chiếm 84,8%), trong khi đó β- carotene ly trích từ tảo chỉ chiếm 8,5% và từ thực vật chiếm 6,7%. Do đó, việc sản xuất β-carotene từ vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 là một hướng nghiên cứu mới đầy tiềm năng và có khả năng đáp ứng cao, mở rộng khả năng cung ứng nguồn β-carotene có hoạt tính tốt, đồng thời tận dụng dải bờ biển dài của nước ta cho việc nuôi trồng loài vi tảo biển này [1]. Với những lợi ích đã trình bày trên, việc nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy làm tăng khả năng tăng trưởng và khả năng tích lũy β-carotene của vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 là rất quan trọng và cần thiết. Đây cũng chính là mục tiêu nghiên cứu của đề tài “Nghiên cứu khả năng tăng trưởng và tích lũy các chất chống oxy hóa của Vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 dưới ảnh hưởng của các điều kiện ức chế”. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU - Khảo sát sự tăng trưởng của vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 và sự tăng trưởng của vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiện ức chế. - Xác định hàm lượng carotenoid tổng, khả năng chống oxy hóa, hàm lượng phenolic tổng, hàm lượng lipid, diệp lục tố và trọng lượng khô của vi tảo. - Xác định hàm lượng β-carotene tích lũy trong vi tảo. 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về Dunaliella 1.1.1. Giới thiệu vi tảo Dunaliella Vi tảo là một cấu thành quan trọng của sinh vật phù du (plankton), đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì và phát triển hệ sinh thái dưới nước. Vi tảo là thức ăn tươi sống đặc biệt quan trọng cho sự phát triển ấu trùng của hầu hết các loài tôm, cá, ốc và cho các động vật phù du; tính ưu việt của vi tảo là không gây ô nhiễm môi trường, cung cấp đầy đủ các vitamin, chất khoáng, vi lượng, đặc biệt là chúng chứa rất nhiều loại acid béo không no. Chúng có giá trị dinh dưỡng rất cao và phạm vi ứng dụng rộng rãi [2]. Dunaliella là nhóm vi tảo lục đơn bào thuộc Ngành Tảo lục - Họ Dunaliellaceae. Các loài Dunaliella hiện diện trong các môi trường nước biển, các hồ muối trên khắp thế giới và có khả năng chống chịu với các độ muối khác nhau. Loài tảo này chẳng những xuất hiện ở Châu Phi, Đại Tây Dương và Địa Trung Hải, mà còn có mặt ở Biển Chết, các đại dương, biển, hồ khác - những nơi nước rất mặn, có ánh sáng mạnh và nhiệt độ cao. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng chúng có khả năng thay đổi hình dạng và thể tích để đáp ứng với sự thay đổi áp suất thẩm thấu ngoại bào. Đây là sinh vật hiếm hoi có thể sinh tồn trong môi trường nước rất mặn, nhờ chứa nồng độ cao carotenoid bảo vệ chúng khỏi ánh sáng và chứa lượng glycerol cao giúp chúng giữ độ ẩm. Ngoài ra, chúng cũng rất giàu vitamin C và E [2]. 1.1.2. Hình dạng và cấu trúc tế bào Dunaliella Dunaliella là vi tảo lục đơn bào, có hình cầu, hình trứng, hình ellips, hình trụ hay hình quả lê tùy theo các giai đoạn tăng trưởng cũng như môi trường dinh dưỡng khác nhau trong nuôi cấy, có kích thước rộng 4-15 μm và dài 6-25 μm [16], [9]. Tế bào di động do có 2 roi, không có vách cellulose mà chỉ có lớp nhầy bên ngoài gọi là glycocalyx [14], chỉ có một lục lạp với tâm tạo bột ở giữa [22], [7]. Các tế bào 3
Dunaliella không có vách giúp tế bào có thể nhanh chóng thay đổi thể tích tế bào đế đáp ứng với những thay đổi áp suất thẩm thấu ngoại bào [3], [11] (hình 1.1). Tế bào Dunaliella có các bào quan điển hình của tảo lục: nhân bao bọc bởi màng nhân nằm ở phần đầu của tế bào [5], ty thể, không bào, bộ máy Golgi và một điểm mắt [3], [12]. Hình 1.1. Tế bào Dunaliella bardawil chụp dưới kính hiển vi điện tử [11] 1.1.3. Các chất có hoạt tính sinh học ở Dunaliella Vi tảo có thể sản xuất một lượng lớn các chất chống oxy hóa và các sắc tố (carotenoid gồm fucoxanthin, lutein, β-carotene, astaxanthin và phycobilliprotein), LC-PUFA, protein (các acid amin thiết yếu như methionin, threonin và tryptophan), hợp chất phenolic, hợp chất sulfate và vitamin với ứng dụng rộng rãi trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, nông nghiệp và các ngành công nghiệp dược phẩm [3], [40], [45]. Vi tảo đơn bào là một nguồn các chất chống oxy hóa đầy hứa hẹn gồm nhiều 4
loài khác nhau Botryococcus, Chlorella, Dunaliella, Nostoc, Phaeodactylum, Spirulina, Haematococcus và Chaetoceros. Nhóm hợp chất chống oxy hóa chính và được biết đến nhiều từ vi tảo là carotenoid. Carotenoid đóng một vai trò quan trọng trong việc dập tắt các gốc tự do (ROS) tạo ra trong quá trình quang hợp, đặc biệt là oxy singlet. Ngoài ra, các hợp chất phenolic cũng là chất chống oxy hóa quan trọng ở vi tảo. Hàm lượng các hợp chất phenolic trong sinh khối tảo tăng khi tiếp xúc với các điều kiện ức chế khác nhau (như ánh sáng, nhiệt độ, độ muối, cạn kiệt dinh dưỡng ) cho thấy chúng thật sự đóng một vai trò quan trọng trong đáp ứng với các ức chế này [3], [23]. Dunaliella là một trong những loài tảo lục chịu mặn có thể sản xuất và tích lũy ba sản phẩm có giá trị cao về thương mại là glycerol, β-carotene và acid béo [8]. D.salina được nuôi cấy trong điều kiện ức chế khác nhau tăng sản xuất carotene và dịch trích chứa carotene này có hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn và chống ung thư cao [60]. Milko (1963) đã đề cập đến khả năng tạo ra lượng lớn β-carotene ở Dunaliella sp. Sau đó, nhiều nhà khoa học như Ben-Amotz và Avron (1983), Borowitzka (1988) đã chứng minh Dunaliella sinh ra nhiều β-carotene để làm chất bảo vệ cho bộ máy quang hợp dưới các điều kiện môi trường bất lợi. Các yếu tố môi trường như cường độ ánh sáng cao, điều kiện dinh dưỡng giới hạn, nồng độ muối cao và nhiệt độ cao đều tác động đến các quang thụ quan cảm nhận ánh sáng hay kênh vận chuyển, làm giảm tính ổn định của chúng, qua đó làm tăng các stress oxy hóa và nồng độ oxy đơn bội. Các stress này có thể làm cho sự tăng trưởng của Dunaliella bị giảm nhưng lại tăng cường sự tích lũy carotenoid. Từ đó, các nhà khoa học nhận thấy Dunaliella chính là nguồn nguyên liệu chứa β-carotene tự nhiên tốt nhất với các đồng phân 9-cis (chiếm 41%), all-trans (42%), 15-cis (10%) và đồng phân khác (7%). Chính vì vậy, từ đầu những năm 1960, người ta đã bắt đầu sản xuất Dunaliella để thu β-carotene tự nhiên và đến cuối những năm 1980, việc nuôi trồng D.salina trên quy mô công nghiệp cũng đã bắt đầu được triển khai tại Australia, Israel, Hoa Kỳ, Trung Quốc, Kuwait, Iran 5
Việc sản xuất carotenoid từ nguồn có sẵn trong tự nhiên được cho là an toàn hơn vì ít tạo ra các dạng đồng phân cấu trúc có khả năng ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người so với từ con đường tổng hợp hóa học. Vi tảo biển, đặc biệt là loài D.salina, trong các điều kiện nhất định, có khả năng tổng hợp nguồn β-carotene rất hữu hiệu [9]. Trên thế giới, mô hình làm giàu β-carotene trong sinh khối của D.salina đã được nghiên cứu trên quy mô phòng thí nghiệm và sản xuất thương mại [28]. Để tích lũy β-carotene cần độ mặn cao, nhiệt độ cao và cường độ chiếu sáng mạnh, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng ở độ mặn trên 27% NaCl D.salina có thể tích lũy được lượng carotenoid lên tới trên 14% trọng lượng khô [2]. Nước ta có đường bờ biển dài, cường độ chiếu sáng mạnh quanh năm, vào mùa khô nhiệt độ luôn duy trì ở mức ổn định 25-35oC, hơn nữa có hệ thống các ruộng muối có độ mặn cao, vì vậy là điều kiện rất tốt để vừa xen canh làm muối, vừa nuôi trồng vi tảo biển sinh carotenoid như Dunaliella. 1.1.4. Cơ chế sinh tổng hợp carotenoid ở Dunaliella Carotenoid là isoprenoid được tổng hợp bởi tất cả sinh vật quang hợp, một số nấm và vi khuẩn không quang hợp [18]. Hơn 750 carotenoids đã được xác định cấu trúc [65]. Ở các sinh vật quang hợp, carotenoid gắn với các protein màng thykaloid nơi mà chúng tham gia vào hấp thu ánh sáng và bảo vệ cho bộ máy quang hợp chống lại những tổn thương quang oxy hóa [18]. Quá trình sinh tổng hợp carotenoid trong các sinh vật quang hợp được thực hiện qua hai giai đoạn: + Sinh tổng hợp tiền chất isoprenoid (IPP). + Sinh tổng hợp carotenoids từ tiền chất IPP. Carotenoid được tổng hợp đầu tiên là các tiền chất C5-terpenoid; isopentyl diphosphat (IPP), hợp chất này sau đó chuyển thành geranyl diphosphat (C20). Hai phân tử này kết hợp với nhau tạo thành phytoene sau đó tiếp tục khử hydro tạo thành phytofluene, zeta-carotene và neurosporence để cho ra lycopene. Tiếp theo 6
đó là sự tạo vòng, sự khử hydro và sự oxy hóa để tạo ra các carotenoid riêng biệt thường gặp trong tự nhiên, tuy nhiên có một số ít các hợp chất được biết có sự chuyển hóa cấu trúc cuối cùng dẫn đến hình thành hàng trăm các carotenoid khác nhau. Một lượng lớn các chất biến dưỡng thứ cấp như isoprenoid hay terpenoid gồm một vài hợp chất có giá trị sinh học và kinh tế như carotenoid. Ở các sinh vật quang hợp, isoprenoid được tổng hợp từ isopentyl diphosphate (IPP) và dimethylallyl diphosphate (DMAPP) từ con đường mevalonate trong tế bào chất (MVA) hoặc con đường 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate (MEP) trong lục lạp (con đường không MVA hoặc 1-desoxy-D-xylulose-5-phosphate [DXP]). Ở tảo lục chỉ có con đường MEP trong lục lạp cung cấp các tiền chất cho sinh tổng hợp tất cả isoprenoid [3], [54]. Ở tảo lục (Chlorophyta) (như D.bardawil DCCBC 15) dường như thiếu con đường MVA trong tế bào chất. Ngược với con đường MVA trong tế bào chất cần 3 phân tử acetyl-coenzyme A (acetyl-CoA) để tạo IPP, con đường MEP sử dụng pyruvate và glyceraldehyde-3-phosphate làm cơ chất và 8 enzyme nằm trong lục lạp sử dụng các cofactor và ion kim loại khác nhau (hình 1.2) [54]. 7
Hình 1.2. Sơ đồ sinh tổng hợp isoprenoid ở vi tảo Dunaliella salina [54] GA-3P, glyceraldehyde-3-phosphate; DXS, 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase; DXR, 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase; MCT, 2-C- methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidylyltransferrase; CMK, 4-(cytidine 5’- diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol kinase; MDS, 2-C-methyl-D-erythritol 2,4- cyclodiphosphate synthase; HDS, 4-hydroxy 3-methylbut-2-enyl diphosphate synthase; HDR, 4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase; IPP, isopentenyl diphosphate; DMAPP, dimethylallyl diphosphate; IPI1 & 2, isopentenyl pyrophosphate isomerase; GPP, geranyl diphosphate; GPS, GPP synthase; FPP, farnesyl diphosphate; FPS, FPP synthase; GGPP, geranyl geranyl diphosphate; 8
GGPS, GGPP synthase; PSY, phytoene synthase; PDS, phytoene desaturase; CrtISO, carotenoid isomerase; ZDS, ζ-carotene desaturase; ZISO, 15-cis-ζ- isomerase; LCY-b, lycopene β-cyclase; LCY-e, lycopene ε-cyclase; CHY1, carotene β-hydroxylase; CHY2, carotene ε-hydroxylase; VDE, violaxanthin deepoxidase; ZE, zeoxanthin epoxidase; NSY, neoxanthin synthase. Ở lục lạp, sau khi hình thành IPP từ con đường MEP, ba phản ứng kết hợp liên tiếp được xúc tác bởi prenyltransferase hình thành geranylgeranyl diphosphate (GGPP) là tiền chất của tất cả các catenoids. Bước đầu tiên của sinh tổng hợp carotenoid gồm sự kết hợp của hai phân tử GGPP (C20) nhờ enzym phytoene synthase (PSY) thành phytoene. Các bước tiếp theo liên quan đến các enzyme gắn trên màng thực hiện một chuỗi phản ứng khử bão hóa (phytoene desaturase [PDS] và  -carotene desaturase [ZDS] và sự đồng phân hóa (carotenoid isomerase [CrtISO] và 15-cis- -isomerase [ZISO] tạo thành lycopene. Sau đó hình thành vòng nhờ cyclase (lycopene  -cyclase [LCY-e] hoặc lycopene  -cyclase[LCY-b]) tổng hợp - carotene và  − carotene và tiếp tục các phản ứng hydroxyl hóa tạo thành lutein hoặc violaxanthin mà từ đó các carotenoid - sản phẩm cuối có thể được hình thành (hình 1.3) [54]. 9
Hình 1.3. Các con đường tổng hợp carotenoid ở các sinh vật tự dưỡng tạo oxy [54] Tuy giữa hai con đường MVA và MEP có sự tách biệt về sinh lý trong các phần khác nhau của tế bào nhưng cũng có sự liên kết giữa chúng. Với chỉ con đường MEP hoạt động trong D.salina để cung cấp các tiền chất IPP và DMAPP cho sinh tổng hợp isopren, sự liên kết này cần thiết để cân bằng nhu cầu biến dưỡng giữa các phần khác nhau của tế bào. Hơn nữa sự liên kết này cần thiết không chỉ giữa tế bào chất và lục lạp mà còn giữa con đường biến dưỡng isopren và lipid khi carotenoid thứ cấp ở D.salina được cô lập trong các hạt lipid trong lục lạp, trong khi triglyceride được dự trữ trong các thể dầu trong tế bào chất [19], [54]. 1.1.5. Các điều kiện ức chế ảnh hưởng lên sự tổng hợp carotenoid Dưới những điều kiện ức chế như ánh sáng, nhiệt độ, độ muối cao và cạn kiệt dinh dưỡng, một số chủng Dunaliella có khả năng tích lũy trên 10% β-carotene 10
(all-trans và 9-cis β-carotene) so với trọng lượng khô của tế bào [12], [34]. D.salina được cho là nguồn cung cấp β-carotene tự nhiên cao nhất trong hầu hết các sinh vật quang hợp [15]. Beta-carotene là tiền vitamin A được ứng dụng nhiều trong thực phẩm chức năng, mỹ phẩm và dược phẩm [15], [21]. Dinh dưỡng Nitrogen (N) là một trong những nguyên tố thiết yếu trong môi trường đối với sự tăng trưởng của bất kỳ tế bào nào. Điều kiện thiếu hoặc hạn chế nitrogen được xem như là ức chế đối với sinh vật. Sự hiện diện của nitrogen có ảnh hưởng đến sự tích lũy carotenoid ở một số vi tảo. Trong điều kiện giới hạn của nitrogen làm tăng hàm lượng β-carotene ở Dunaliella và astaxanthin ở Haematococcus. Mặt khác, nồng độ nitrogen cao thích hợp cho sự tích lũy lutein ở Muriellopsis sp. [20]. D.salina ngừng tăng trưởng hàm lượng diệp lục tố giảm (do phân tử diệp lục tố chứa 4 nguyên tử nitrogen trong cấu trúc) khi nitrogen không được cung cấp vào môi trường, hàm lượng β-carotene tăng gấp 4 lần so với bình thường. Sự tăng hàm lượng β-carotene trong các tế bào bị thiếu hụt nitrogen là do sự hình thành nhiều gốc tự do trong điều kiện ức chế. β-carotene có các đặc tính chống oxy hóa dập tắt các gốc tự do, khôi phục trạng thái cân bằng sinh lý, bảo vệ tế bào để tiếp tục tăng trưởng [3], [51]. Phosphor (P) là một chất dinh dưỡng đa lượng đóng vai trò quan trọng trong các quá trình biến dưỡng của tế bào do cấu thành nhiều thành phần cấu trúc, chức năng cần thiết cho sinh trưởng và phát triển bình thường của vi tảo. Trong điều kiện cạn kiệt phosphor, các tế bào Dunaliella tích lũy β-carotene, Haematococcus tích lũy astaxanthin nhưng không rõ so với sự cạn kiệt nitrogen [55]. Sự cạn kiệt nitrate và sulfate gây ra sự tích tụ β-carotene trong các loài hoang dại [6]. Sự giới hạn nitrogen và phosphor ảnh hưởng đến bộ máy quang hợp của D.tertiolecta, nồng độ phophor tối ưu cho sự tăng trưởng của D.salina và D.viridis khoảng từ 0,002 g/L đến 0,025 g/L KH2PO4 và nồng độ cao (> 5 g/L) ức chế sự tăng trưởng [41]. Sắt (Fe) là một trong những yếu tố vi lượng thiết yếu đóng vai trò quan trọng trong các thành phần sinh hóa của tế bào do đặc tính oxy hóa khử của nó và gắn 11
liền với nhiều quá trình cơ bản như quang hợp, hô hấp, cố định nitrogen và tổng hợp ADN. Thiếu Fe sẽ cảm ứng nhiều thay đổi sinh hóa, C-phycocyanin và diệp lục tố a bị suy thoái khi Fe trở nên giới hạn. Fe2+ có thể có chức năng như một yếu - 1 - - tố tạo OH hoặc các gốc oxy hoạt động (ROS) ( O2, O2 , H2O2 hoặc AO2 ) đóng vai trò quan trọng trong việc tăng cường tổng hợp carotenoid ở tảo [55]. Ảnh hưởng của nồng độ cadimium (Cd) lên sự tăng trưởng (số lượng tế bào và hàm lượng diệp lục tố) và sự tổng hợp β-carotene của D.salina, tăng nồng độ cadimium làm giảm số lượng tế bào, hàm lượng diệp lục tố, Mg2+ và Ca2+ nhưng làm tăng hàm lượng β-carotene trong tế bào. Điều này xảy ra có thể là do sự hình thành các gốc tự do và sự thiếu hụt các yếu tố thiết yếu như Mg2+ và Ca2+ gây ra bởi nồng độ cao của cadimium trong môi trường (lên đến 0,5 mg/L) [59]. Độ muối Các tế bào D.salina đáp ứng nhanh (thay đổi thể tích tế bào) với sự thay đổi trong áp suất thẩm thấu. Sự tích lũy β-carotene trong tế bào ở các độ muối khác nhau từ 1,5 - 5M (NaCl) được nghiên cứu. Mật độ tế bào giảm ở độ muối 4M (NaCl), ở 5M (NaCl) tế bào trắng hoàn toàn sau 2 ngày bổ sung muối. Nồng độ muối cao tạo ra môi trường ưu trương làm cho các tế bào bị co lại, cuối cùng làm phá vỡ cấu trúc và thành phần của tế bào (plasmolysis). Ở môi trường có độ muối 1,5M (NaCl), độ muối thấp tạo nên môi trường nhược trương làm cho tế bào căng phồng lên và phá vỡ tế bào. Ở độ muối 2M (NaCl) đạt được sinh khối tối đa, là nồng độ tối ưu cho sự tăng trưởng của tế bào. Khi tế bào bị thiếu nước do nồng độ muối cao, quang hợp bị ảnh hưởng mạnh. Vì thế hàm lượng diệp lục tố giảm khi độ muối tăng. Khi độ muối tăng, nó hoạt động như một yếu tố ức chế làm tăng sản xuất β-carotene. Hàm lượng diệp lục tố giảm và β-carotene tăng ở độ muối trung bình. Các tế bào chống chịu được với độ muối cao là do có sự hiện diện của glycerol có khả năng cân bằng ức chế thẩm thấu ngoại bào. Nồng độ glycerol nội bào cao gần 50% và đủ để phát triển áp suất thẩm thấu tương ứng để cân bằng với áp suất thẩm thấu ngoại bào [3], [51]. Sự đáp ứng của D.salina đối với ức chế muối (hình 1.4a) có thể chia làm hai 12
giai đoạn [54]: (i) Sự điều chỉnh nhanh chóng nồng độ glycerol và glycine betaine giống với cơ chế điều hòa áp suất thẩm thấu phổ biến ở nấm và thực vật bậc cao. (ii) Sự đáp ứng dài hạn gồm sự tổng hợp lipid trung tính và tích lũy nhiều carotenoid. Những thay đổi bất thường trong áp suất thẩm thấu của môi trường dẫn đến những thay đổi trật tự lipid màng tế bào, vì thế gây ra sự hoạt hóa một loạt các protein kinase và cuối cùng dẫn đến sự biến đổi tinh bột thành glycerol trong lục lạp. Tín hiệu được truyền từ tế bào chất vào lục lạp chưa biết rõ. Ngược lại sự đáp ứng dài hạn đối với độ muối cao bao gồm những thay đổi trong biểu hiện gene thông qua một hay nhiều nhân tố phiên mã chưa được xác định, tiếp theo là sự tổng hợp protein de novo. Những sản phẩm gene được cảm ứng bởi ức chế muối gồm các sản phẩm phiên mã và protein liên quan đến sự đồng hóa carbon và sắt cũng như sinh tổng hợp carotenoid [54]. Hình 1.4. Các cơ chế đáp ứng của tế bào D.salina đối với các ức chế môi trường [54] 13
Cơ chế thích nghi với nồng độ muối khác nhau là sự điều hòa áp suất thẩm thấu. Dunaliella điều hòa áp suất thẩm thấu bằng cách thay đổi nồng độ glycerol nội bào. Khi Dunaliella tăng trưởng trong môi trường có nồng độ muối khác nhau, nồng độ glycerol nội bào tỷ lệ thuận với nồng độ muối ngoại bào và đủ để cân bằng áp suất thẩm thấu [11], [17]. Shock thẩm thấu bắt đầu tổng hợp hay thoái hóa glycerol, quá trình này kết thúc khi tế bào trở về với thể tích ban đầu. Sự tổng hợp và thoái hóa glycerol phụ thuộc vào sự tổng hợp protein và có thể xảy ra ngoài sáng hay trong tối [11], [17]. Cơ chế kiểm soát quá trình tổng hợp và thoái hóa glycerol ở Dunaliella được cho là một chu trình “chu trình glycerol” duy nhất liên quan đến một số enzyme mới (hình 1.4) [11]. Hình 1.5. Chu trình glycerol ở Dunaliella [11] 14
Ánh sáng Cường độ ánh sáng có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sự tích lũy β- carotene ở tế bào tảo. Sự chiếu sáng liên tục ở 2300 lux được sự sử dụng trong suốt ức chế ánh sáng. Hàm lượng diệp lục tố thấp và hàm lượng β-carotene cao khi cường độ ánh sáng cao. Sự tích lũy β-carotene liên quan đến vai trò bảo vệ chống lại sự sản xuất oxy singlet trong điều kiện ánh sáng cao. Sự tích lũy các hạt β- carotene trong các khoảng gian màng thylakoid của lục lạp và giúp chống lại tổn thương gây ra bởi cường độ ánh sáng cao trong điều kiện tăng trưởng bị giới hạn. Ở cường độ ánh sáng 4000 lux và nhiệt độ 35oC số lượng tế bào giảm có thể là do nhiệt độ cao. D.bardawil và D.salina có thể sống sót và tăng trưởng ở cường độ ánh sáng lên đến 4000 lux. Ở cường độ ánh sáng 6000 lux và 35oC hàm lượng diệp lục tố giảm trong 2 ngày đầu, có thể là do sự tiếp xúc đột ngột với cường độ ánh sáng cao. Tuy nhiên, hàm lượng diệp lục tố tăng lên sau 2 ngày và hàm lượng β-carotene tăng lên gấp 5 lần [3], [51]. Sự ức chế ánh sáng được tạo ra khi cường độ ánh sáng tới lớn hơn cường độ ánh sáng cần để quang hợp bão hòa. Dunaliella tích lũy lượng lớn β-carotene giúp tế bào vượt qua điều kiện ức chế ánh sáng và ức chế hoạt tính quang hô hấp cao dưới điều kiện ánh sánh xanh, trung bình dưới điều kiện ánh sáng trắng và không tồn tại dưới điều kiện ánh sáng đỏ [12]. Khi tiếp xúc với ánh sáng xanh cường độ cao trình tự các sự kiện xảy ra như sau: quang hô hấp, quang phân hủy carotenoid theo thứ tự 9-cis-β-carotene, all-trans-β-carotene, diệp lục tố và cuối cùng là sự phá hủy tế bào [12]. Sự tích lũy các β-carotene (tỷ lệ đồng phân 9-cis/all-trans) phụ thuộc vào cường độ ánh sáng mà tế bào Dunaliella tiếp xúc trong một chu kỳ phân chia [36]. Tỷ lệ này cao ở cường độ ánh sáng thấp (20 - 50 µmol photon/m2/s) hơn ở cường độ ánh sáng cao (200 - 1250 µmol photon/m2/s) [47]. Sự tích lũy của β- carotene và tỷ lệ đồng phân của nó phụ thuộc nhiều vào cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng được sử dụng [57]. Ngoài các bước sóng nhìn thấy, bức xạ tia cực tím (UV) cũng ảnh hưởng đến sự tích lũy β-carotene. Ánh sáng nhìn thấy gồm 9% tia UV gần (UV-A và UV-B: 15
290 - 400 nm) tại bề mặt trái đất, trong đó UV-B được hấp thụ bởi ozone ở tầng bình lưu còn lại các tia UV-A chiếu đến trái đất. Quang hợp ở nhiều loài thực vật phù du bị ức chế bởi các bức xạ UV tự nhiên, đặc biệt UV-A đã được nghiên cứu [30]. Khi bức xạ UV-A kết hợp với PPFD cao tỷ lệ carotenoid và diệp lục tố trên protein tăng lên 80 – 310 % [32]. Trong điều kiện tiếp xúc với UV-A trong 84 giờ kích thích sự gia tăng hàm lượng carotene tổng, trong đó lutein và zeaxanthin tăng gấp 3 – 5 lần. Bức xạ UV-A có lợi thế là ứng dụng dễ dàng nhưng trong các nuôi cấy hệ thống mở việc kiểm soát nó sẽ trở nên khó khăn [3], [56]. Sự đáp ứng của tế bào với các điều kiện tổng hợp carotenoid như tăng độ muối (hình 1.4a) liên quan đến đáp ứng sớm, nhanh với các thay đổi trong tính thẩm thấu mà không cần đến cảm ứng quá trình phiên mã. Sự đáp ứng này dẫn đến sự tích lũy nhanh các chất tan thích hợp như glycerol. Thứ hai là sự đáp ứng chậm đối với ức chế muối (hình 1.4a), sự giới hạn dinh dưỡng và ánh sáng cao (hình 1.4b) liên quan đến sự tiếp nhận tín hiệu bởi các chất cảm ứng sơ cấp và hoạt hóa các con đường truyền tín hiệu trên màng tế bào và bộ máy quang hợp, lần lượt thay đổi sự biểu hiện gene trong nhân và tế bào chất. Các sản phẩm gene được dịch mã (như enzyme) được đưa vào lục lạp dẫn đến việc sản xuất lipid trung tính và isoprenoid tăng, sau đó qua con đường MEP (con đường 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate) trong lục lạp. Đồng thời cảm ứng con đường sinh tổng hợp carotenoid dẫn đến sự tích lũy carotenoid trong các hạt lipid trong stroma, trước hết là vùng lân cận thylakoid. Các kinase, yếu tố phiên mã (TF), các nhóm oxy hoạt động (ROS) và những thay đổi trong trạng thái oxy hóa của tế bào (như giảm quá mức gốc plastoquinone [PQ] khi tiếp xúc với ánh sáng cao) cùng với các nhân tố chưa được biết rõ (X) có thể là một phần của mạng lưới phân tử điều hòa đáp ứng của Dunaliella đối với các ức chế môi trường [3], [54]. 1.1.6. Mối quan hệ giữa con đường tổng hợp carotenoid và lipid Các loài vi tảo là những nguồn tiềm năng về nhiên liệu sinh học, các chất chuyển hóa có giá trị cao và quá trình sản xuất chúng phụ thuộc vào sự tăng trưởng của vi tảo. Các sinh vật tự dưỡng và dị dưỡng đã được chứng minh có khả năng sản 16
xuất chất béo cũng như các sản phẩm có giá trị (đặc biệt là carotenoid) dưới ảnh hưởng của các điều kiện ức chế lý hóa. Bên cạnh một số sắc tố, một số loài vi tảo có thể tổng hợp các acid béo không bão hòa mạch rất dài (VL-PUFA, > 20C) như acid Docosahexaenoic và Eicosapentaenoic [42]. Ở H. pluvialis hơn 90% các phân tử astaxanthin được ester hóa với các acid béo. Acid oleic là loại acid béo chính liên kết với các phân tử astaxanthin, điều này cho thấy sinh tổng hợp astaxanthin và acid béo diễn ra đồng thời trong tế bào, phản ứng ester hóa astaxanthin phải gắn liền với hai con đường này. Acyl-CoA là một tiền chất của sự ester hóa astaxanthin, khi dư thừa nó có thể ức chế ngược enzym acetyl-CoA carboxylase, một enzym giới hạn tốc độ tổng hợp acid béo. Ester hóa astaxanthin là điểm quan trọng cho sự kiểm soát con đường sinh tổng hợp này. Nhiều vi tảo tổng hợp triglyceride cao dưới điều kiện ức chế không sinh học và được ứng dụng làm nguyên liệu cho nhiên liệu sinh học [67]. Hiện nay, việc kết hợp sản xuất lipid và carotenoid từ sinh khối của nhiều vi tảo đã trở thành một chiến lược đầy hứa hẹn, sự tổng hợp lipid phụ thuộc vào sự tích lũy carotenoid dưới điều kiện ánh sáng cao và sự sản xuất acid béo gắn liền với sự tích lũy carotenoid [69]. Ở H.pluvialis, sự tích lũy carotenoid phụ thuộc vào sự sản xuất triglyceride [26]. Tương tự, D. salina sự tích lũy carotenoid (β-carotene) và lipid tăng dưới điều kiện ức chế ánh sáng và độ muối [50]. Có thể thấy rằng, các phân tử kỵ nước như carotenoid, đặc biệt là carotene, không thể tích lũy trong tế bào chất hoặc chất nền ưa nước của tế bào mà không có các cấu trúc hoặc thể phù hợp [46]. Carotenoid thứ cấp được tích lũy trong các cấu trúc riêng: hạt lipid (plastoglobuli) và thể dầu (OB-oil body). Tất cả các cấu trúc này được hình thành với sự tham gia của các chất béo trung tính, chủ yếu là các triacylglycerol (TAG) và protein, oleoresin [49]. Hơn nữa, xanthophyll như astaxanthin được ester hóa bởi acid béo. Như vậy, H.pluvialis và các loài của chi Chlorella có khả năng tổng hợp carotenoid ở những bước cuối cùng của sự hình thành bào tử, hơn 95 % xanthophyll thứ cấp được ester hóa với acid béo (chủ yếu là C18). Điều này cho thấy, một lượng lớn xanthophyll phân cực tích lũy trong môi 17
trường kỵ nước của OB [63]. Các kích thích sinh tổng hợp carotenoid thứ cấp ở H.pluvialis và các vi tảo có khả năng tổng hợp carotenoid khác luôn gắn với sự tích lũy TAG nhanh chóng. Cuối cùng, ở các vi tảo này TAG chiếm hơn 95 % tổng số lipid trong tế bào được biểu hiện bởi TAG của OB chứa carotenoid thứ cấp. Vì vậy, ở vi tảo tồn tại mối liên hệ chặt chẽ giữa sinh tổng hợp carotenoid thứ cấp và lipid, đặc biệt là sinh tổng hợp FA và TAG [69]. Sự ức chế gây ra tích lũy lipid trung tính trong các thể lipid trong tế bào chất hoặc chất nền là điều kiện tiên quyết cho sự tích lũy carotenoid thứ cấp trong các tế bào tảo [3]. Các yếu tố ức chế tự dưỡng (như ánh sáng, nhiệt độ, nitrate, phosphate, độ muối ) và dị dưỡng (như glucose, glycerol, ure) được sử dụng nhiều và các yếu tố ức chế lý hóa ảnh hưởng lên sự chuyển hóa của vi tảo đã được xác định. Những yếu tố ức chế được sử dụng phổ biến để tăng sự tích lũy lipid là ánh sáng, nhiệt độ và nitrate [42]. Nhiệt độ là yếu tố ức chế ảnh hưởng mạnh lên sự tăng trưởng và tích lũy carotenoid, lipid và thành phần acid béo ở nhiều loài vi tảo. Sự tăng trưởng và các con đường chuyển hóa ở vi tảo thay đổi với sự thay đổi của nhiệt độ [33]. Ánh sáng có thể mang lại những thay đổi trong thành phần hóa học của vi tảo. Ánh sáng cần thiết cho quang hợp và chu kỳ ánh sáng cũng là yếu tố quan trọng cho sự tăng trưởng của vi tảo. Ở Mychonastes homosphaera, Chlorella vulgaris, Raphidocelis subcapitata và Scenedesmus sp. sự sản xuất lipid tăng khi tăng cường độ ánh sáng [24]. Theo Khotimchenko và Yakovleva (2005) hàm lượng acid béo không bão hòa (PUFA) cao, tuy nhiên ở cường độ ánh sáng cao thì sự tích lũy lượng acid béo bão hòa và acid béo không bão hòa có một liên kết đôi. Nitrate là một trong những dinh dưỡng đa lượng quan trọng trong các môi trường nuôi cấy, nitrogene chiếm khoảng 1-10% sinh khối khô của vi tảo, là chất dinh dưỡng quan trọng nhất ảnh hưởng lên sự tăng trưởng và tích lũy lipid ở vi tảo [25]. Ở một số vi tảo sự tích lũy lipid tăng trong điều kiện cạn kiệt dinh dưỡng nitrogene như sự sản xuất lipid tăng gấp đôi ở Neochloris oleoabundans. Sự cạn kiệt nitrogene cũng ảnh hưởng lên con đường tổng hợp carbohydrate như hàm 18
lượng carbohydrate tăng gấp 4 lần ở Tetraselmis subcordiformis và khoảng 29% ở Scenedesmus obliquus [70], [31]. Tuy nhiên, sự tích lũy lipid tăng khi tăng nồng độ nitrate ở Auxenochlorella pyrenoidosa và Scenedesmus sp., ngược lại ở Auxenochlorella protothecoides và C. Vulgaris sự tích lũy lipid cao ở nồng độ nitrate thấp [52]. Phosphor chiếm ít hơn 1% sinh khối của vi tảo (khoảng 0.03 - 0.06%) nhưng là một phần thiết yếu trong môi trường cho sự tăng trưởng và phát triển ổn định của vi tảo. Sự thiếu phospho trong môi trường dẫn đến ức chế quang hợp, ảnh hưởng lên sự tăng trưởng và chuyển hóa của vi tảo. Sự giới hạn phosphate dẫn đến sự tăng tích lũy lipid ở tế bào vi tảo như ở Scenedesmus sp. LX1 nước ngọt và Botryococcus braunii, sự tích lũy lipid tăng khi bị giới hạn phosphor. Những nghiên cứu khác cũng cho thấy hàm lượng carbohydrate tăng từ 11 đến 67% ở Spirulina, Arthrospira platensis trong điều kiện giới hạn phosphor [39]. Độ muối là một yếu tố ức chế phức tạp ảnh hưởng lên sự tích lũy lipid và loại acid béo ở vi tảo. Nhiều loại vi tảo có khả năng chống chịu với ức chế muối ở phổ rộng. Dunaliella sp. là một trong những loài có khả năng chống chịu với độ muối cao, tạo ra lượng lớn lipid và sinh khối như ở D. tertiolecta ATCC 30929 tích lũy hàm lượng lipid cao lên đến 70% trong điều kiện độ muối cao. Tuy nhiên, độ muối quá cao trong môi trường nuôi cấy gây ra ức chế quang hợp làm giảm sinh khối và hàm lượng lipid [64]. 1.2. β-carotene và vai trò đối với sức khỏe 1.2.1. Giới thiệu β-carotene β-carotene là một dạng sắc tố hữu cơ có tự nhiên trong thực vật và các loài sinh vật quang hợp khác như là tảo, một vài loài nấm và một vài loài vi khuẩn [1]. o β-carotene có công thức phân tử là C40H56 , điểm nóng chảy là 180 C, khối lượng phân tử là 536,8726 g/mol. Công thức cấu tạo của β-carotene: 19
Hình 1.6. Cấu trúc phân tử β-carotene β-carotene là tiền chất của vitamin A. Khi hấp thu vào cơ thể, β-carotene sẽ chuyển hóa thành vitamin A. β-carotene là chất chống oxy hóa mạnh, ngăn chặn tế bào ung thư, chống sự hình thành cục máu đông trong thành mạch máu. Sau khi chuyển thành vitamin A có tác dụng bảo vệ niêm mạc mắt, tăng cường miễn dịch cơ thể [1]. β-carotene có nhiều dạng đồng phân nhưng các loại β-carotene tổng hợp chỉ chứa các đồng phân all-trans-β-carotene. Trong khi đó đồng phân 9-cis lại là thành phần chống oxy hóa chủ yếu của β-carotene và nó chỉ có trong β-carotene tự nhiên, thường thấy trong các loại trái cây và rau quả có màu vàng và xanh đậm như cà rốt, gấc, khoai lang, rau ngót chiếm khoảng 0,001% - 0,01% sinh khối khô; trong các cơ quan động vật như gan cá, trứng Một số loài vi sinh vật như nấm sợi Blakeslea, nấm men Rhodotorula cũng chứa hàm lượng đáng kể β-carotene 0,05% - 0,2% sinh khối khô. Ở vi tảo, β-carotene thường chiếm khoảng 0,1% sinh khối khô. Tuy nhiên, ở một số loài, β-carotene có thể chiếm tới5% sinh khối khô như vi tảo Amphidinium carterea, hoặc thậm chí tới 10% sinh khối khô như vi tảo D.salina [1]. 1.2.2. Vai trò của β-carotene đối với sức khỏe Đối với người lớn - β-carotene là nguồn bổ sung vitamin A cho những người ăn chay thuần. - β-carotene giúp loại bỏ tế bào chết dư thừa trên da, nhờ đó có công dụng trong làm đẹp. - β-carotene còn là một chất có khả năng chống oxy hóa mạnh, ngăn chặn quá trình lão hóa và cả phòng ngừa ung thư. 20
Đối với trẻ nhỏ - β-carotene rất quan trọng cho trẻ nhỏ để có được đôi mắt thêm sáng và tinh anh, ngăn chặn mù lòa. - Ngoài ra, β-carotene còn tốt cho hệ miễn dịch của trẻ. Đối với phụ nữ mang thai - β-carotene rất quan trọng trong quá trình phát triển của cả tim, gan, phổi, thận, mắt, xương và hệ thần kinh trung ương của thai nhi. - Ngoài ra, β-carotene còn hỗ trợ sự phục hồi của phụ nữ sau sinh mổ. 21
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Chủng Dunaliella bardawil DCCBC 15 và môi trường nuôi cấy Vi tảo được sử dụng trong nghiên cứu này là chủng tảo Dunaliella salina var. bardawil DCCBC 15 (Dunaliella bardawil DCCBC 15) được cung cấp bởi TS. Juergen E.W.Polle, phòng Sinh học, trường Đại học Brooklyn, New York, Hoa Kỳ. Tảo được nuôi trong môi trường MD4 1,5M NaCl có các thành phần gồm: NPK 0,1 g/L, MgSO4 1,86 g/L, EDTA 8,76 mg/L, FeCl3 0,49 mg/L, MnCl2 1,89 o mg/L, NaHCO3 50 mM, pH = 7.5, ở 25 C với cường độ ánh sáng 50 μmol photon/m2/s, chu kỳ sáng : tối = 12 : 12 giờ. 2.2. Phương pháp phân tích 2.2.1. Quan sát hình thái tế bào Hình thái tế bào được quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400X sau mỗi 2-3 ngày. 2.2.2. Xác định mật độ tế bào và tốc độ tăng trưởng đặc hiệu Lấy 100 µL dịch tảo được cố định bởi dung dịch Lugol (5% Iod và 10% muối KI). Mật độ tế bào được xác định bằng cách đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu mỗi 2-3 ngày, sử dụng kính hiển vi quang học với buồng đếm có độ sâu 0,1 mm và diện tích ô vuông 1 mm2. Mật độ tế bào trong 1 mL được tính theo công thức [27]: D = × 104 × hệ số pha loãng Trong đó: n: tổng số tế bào đếm được i: diện tích ô đếm D: mật độ tế bào Mật độ hoặc sinh khối tế bào ở hai thời điểm khác nhau trong giai đoạn tăng trưởng của mẫu được dùng để tính tốc độ tăng trưởng đặc hiệu (µ: tế bào/ngày) trong khoảng thời gian đó theo công thức [44]: 22
µ = Trong đó: N1, N2: mật độ tế bào tại ngày 1 và ngày 2 t1, t2: thời điểm ngày 1 và ngày 2 2.2.3. Xác định hàm lượng carotene tổng và diệp lục tố Lấy 1 mL dịch nuôi cấy, ly tâm ở 5000 vòng trong 5 phút, phần tảo bên dưới được ly trích với 3 mL ethanol: hexane (2:1 v/v). Thêm vào 2 mL nước và 4 mL hexane, vortex. Hỗn hợp ly trích này được ly tâm 5000 vòng trong 5 phút. Lớp sắc tố có hexane bên trên được đọc ở các bước sóng 450 nm, 645 nm, 662 nm. - Hàm lượng carotenoid tổng có trong 1 mL mẫu phân tích được xác định theo công thức [58], [53]: Carotenoid (µg/mL) = A450 × 25,2 - Hàm lượng diệp lục tố được xác định theo công thức [36]: Diệp lục tố a (µg/mL) = 11,75 (A662) - 2,35 (A645) Diệp lục tố b (µg/mL) = 18,61 (A645) - 3,96 (A662) Diệp lục tố tổng = diệp lục tố a + diệp lục tố b Trong đó: A450 là độ hấp thu tại bước sóng 450 nm A645 là độ hấp thu tại bước sóng 645 nm A662 là độ hấp thu tại bước sóng 662 nm 2.2.4. Xác định khả năng chống oxy hóa - Thuốc thử DPPH được pha loãng bằng cách hòa tan 0,004 g DPPH (2,2-diphenyl- 1-picrylhydrazyl) trong 100 mL methanol [21], [52]. - Lấy 1,0 mL dung dịch tảo ly tâm 5.000 vòng trong 5 phút, loại bỏ dịch. Thêm 1mL ethanol tuyệt đối vào cắn, trộn đều và ủ 4 tiếng ở 4oC. Ly tâm 5000 vòng trong 5 phút, dùng 0,5 mL dịch trích trộn với 1 mL dung dịch DPPH, để trong tối khoảng 30 phút và đo quang ở bước sóng 517 nm. - Mẫu đối chứng được chuẩn bị tương tự như trên nhưng dùng ethanol tuyệt đối 23
thay cho mẫu. Khả năng chống oxy hóa (I%) được tính dựa trên khả năng ức chế của các bức xạ tự do của DPPH theo công thức [4], [68]: I% = (Ađối chứng - Amẫu)/Ađối chứng x 100 2.2.5. Xác định hàm lượng phenolic tổng - Lấy 1,0 mL dung dịch tảo ly tâm 5.000 vòng trong 5 phút, loại bỏ dịch. Thêm 1 mL methanol tuyệt đối vào cắn, trộn đều. Ly tâm 5000 vòng trong 5 phút, lấy 0,5 mL dịch trích cho vào eppendorf 2 mL, sau đó thêm vào 0,5 mL thuốc thử Folin- Ciocalteau's phenol, lắc đều. Sau 3 phút, thêm 0,5 mL Na2CO3 10% vào hỗn hợp, để trong tối 1,5 giờ và hỗn hợp được đo quang ở bước sóng 750 nm [37], [23], [38], [62]. Hàm lượng phenolic tương đương với lượng acid gallic/g [29]. - Đường chuẩn phenolic: Sử dụng nồng độ acid gallic chuẩn từ 10 đến 200 mg/L để xây dựng đường chuẩn và xác định nồng độ phenolic tổng trong mẫu bằng phương trình đường chuẩn y = 30,263x – 0,0638; R² = 0,9948. 2.2.6. Xác định trọng lượng khô Lấy 10 mL dịch nuôi cấy tảo, lọc qua màng lọc sợi thủy tinh với đường kính màng là 47 mm, đường kính lỗ 1µm đã sấy khô và biết khối lượng [A(g)]. Sau khi lọc màng lọc được rửa bằng nước cất sau đó sấy khô trong tủ sấy ở 60oC trong 12 tiếng hoặc cho đến khi trọng lượng khô không đổi. Sau khi sấy, chuyển màng lọc vào bình hút ẩm, để nguội và cân lại khối lượng màng lọc [B(g)]. Trọng lượng khô của tảo [C(g)] là phần khác biệt giữa khối lượng màng lọc trước và sau khi lọc tảo [C (g/L)] = [B (g) – A (g)]*100 2.2.7. Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp sulfo-phospho-vanillin Thuốc thử Phosphovanillin được chuẩn bị bằng cách hòa tan 0,06 g vanillin trong 2 mL ethanol tuyệt đối và 8 mL nước cất, lắc kỹ. Sau đó thêm 50 mL acid phosphoric đậm đặc. Hỗn hợp thu được được bảo quản trong tối. Để đảm bảo hoạt tính cao, thuốc thử Phosphovanillin được chuẩn bị ngay trước mỗi lần làm thí nghiệm [43]. Xác định hàm lượng lipid: 1 mL dịch đem đi ly tâm 5000 vòng/5 phút và cắn 24
thu được chiết với 2 mL acid sulfuric đậm đặc (98%) sau đó đun trên bếp cách thủy 100oC trong 10 phút, làm lạnh trong bể nước đá. Bổ sung 5 mL thuốc thử Phosphovanillin được chuẩn bị sẵn, mẫu được ủ ở 37oC và lắc mẫu liên tục. Độ hấp thu được đo ở bước sóng 530 nm [43]. Hàm lượng lipid có trong mẫu được xác định bằng đường chuẩn lipid. Đường chuẩn lipid: dầu cải thương mại (hiệu Tường An) được pha trong chloroform (nồng độ 1 mg/mL), nồng độ lipid chuẩn (10 – 150 µg) và thực hiện trong các ống nghiệm có nắp. Ủ các ống nghiệm ở nhiệt độ 90oC, 10 phút để bay hơi chloroform. Thêm 2 mL acid sulfuric đậm đặc, sau đó đun trên bếp cách thủy 100oC trong 10 phút, làm lạnh trong bể nước đá. Bổ sung 5 mL thuốc thử Phosphovanillin, hỗn hợp được ủ ở 37oC và lắc mẫu liên tục. Đo mẫu ở bước sóng 530 nm. Sau đó thu được phương trình lipid chuẩn y = 0,005x – 0,0531, R2 = 0,9929. 2.2.8. Thu hoạch sinh khối tảo phân tích β-carotene Ly tâm dịch nuôi cấy tảo trong falcon 15 mL với tốc độ 5000 vòng/15 phút để lấy sinh khối tảo. Sau đó sấy bằng tủ sấy ở 60oC đến khi khô hoàn toàn. Mẫu thu được bảo quản trong tối và đem đi phân tích β-carotene. 2.3. Phương pháp thiết kế thí nghiệm 2.3.1. Khảo sá t sự tăng trưởng của vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl Dunaliella bardawil DCCBC 15 đạt phase tăng trưởng sau 8-10 ngày nuôi cấy được sử dụng để bố trí các thí nghiệm. Thí nghiệm được thực hiện trong bình tam giác 500 mL với 370 mL môi trường MD4 1,5M NaCl, pH = 7,5, mật độ tế bào ban đầu là 14×104 tế bào/mL và sục khí liên tục. Điều kiện nuôi cấy: cường độ ánh sáng 50 µmol photon/m2/s, chu kỳ sáng : tối = 12 : 12 giờ, nhiệt độ 25 ± 2oC. Quan sát hình thái tế bào, xác định mật độ và trọng lượng khô tế bào, phân tích hàm lượng diệp lục tố, carotenoid của D.bardawil DCCBC 15 sau mỗi 2 ngày nuôi cấy. Nghiệm thức được lặp lại 3 lần. 25
Sinh khối khô của vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 thu hoạch sau 22 ngày nuôi cấy được sử dụng để phân tích hàm lượng β-carotene bằng phương pháp HPLC tại phòng thí nghiệm Kiểm nghiệm thuốc công ty DHG Pharma. 2.3.2. Khảo sát sự tăng trưởng và tích lũy carotenoid của vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường MD4 1,5M NaCl gồm 2 giai đoạn: Giai đoạn nuôi cấy tăng trưởng: Trong 16 ngày đầu, D. bardawil DCCBC 15 được nuôi trong bình tam giác 500 mL với 450 mL môi trường MD4 1,5M NaCl, mật độ tế bào ban đầu là 10,333×104 tế bào/mL, pH = 7,5, cường độ ánh sáng 50 µmol photon/m2/s (chu kỳ sáng : tối = 12 : 12 giờ), nhiệt độ 25 ± 2oC và sục khí liên tục. Giai đoạn nuôi cấy ức chế: Sau 16 ngày nuôi cấy tăng trưởng D. bardawil DCCBC 15 được chuyển sang các điều kiện ức chế khác nhau (bảng 2.1). Quan sát hình thái tế bào, xác định mật độ tế bào, phân tích hàm lượng diệp lục tố và carotenoid, khả năng chống oxy hóa, hàm lượng phenolic tổng, hàm lượng lipid và trọng lượng khô của D.bardawil DCCBC 15 ở các nghiệm thức được xác định sau mỗi 3 ngày nuôi cấy. Các nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Sinh khối khô của vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 thu hoạch sau 31 ngày nuôi cấy được sử dụng để phân tích hàm lượng β-carotene bằng phương pháp HPLC tại phòng thí nghiệm Kiểm nghiệm thuốc công ty DHG Pharma. 26
Bảng 2.1. Thí nghiệm ảnh hưởng của các điều kiện ức chế khác nhau lên sự tích lũy carotenoid của D.bardawil DCCBC 15 Nghiệm thức Đặc điểm Ký hiệu Sau 16 ngày nuôi cấy D.bardawil DCCBC 15 Cạn kiệt dinh được chuyển qua điều kiện ánh sáng 100 Đối chứng dưỡng µmol photon/m2/s. Sau 16 ngày nuôi cấy D.bardawil DCCBC 15 được chuyển qua điều kiện ánh sáng 100 Ức chế H2O2 H2O2 2 µmol photon/m /s kết hợp bổ sung H2O2 12,5 µM. Sau 16 ngày nuôi cấy D.bardawil DCCBC 15 Ức chế kết hợp được chuyển qua điều kiện ánh sáng 100 H2O2 và muối H2O2 + 4M µmol photon/m2/s kết hợp độ muối 4M NaCl 4M NaCl và bổ sung H2O2 12,5 µM. Sau 16 ngày nuôi cấy D.bardawil DCCBC 15 Ức chế kết hợp được chuyển qua điều kiện ánh sáng 300 H2O2 và ánh sáng H2O2 + AS300 2 µmol photon/m /s kết hợp bổ sung H2O2 12,5 cao µM. 2.4. Phương pháp phân tích số liệu Dữ liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft office Excel 2016 và thực hiện phân tích One-way ANOVA bằng phần mềm SPSS phiên bản 20.0. Mức ý nghĩa thống kê p < 0,05. Tất cả các số liệu trong thí nghiệm được trình bày dưới dạng Trung bình (Mean) ± Sai số chuẩn (SE). 27
CHƯƠNG 3. KẾ T QUẢ VÀ BÀ N LUÂṆ 3. 1. Kết quả 3.1.1. Khảo sá t sự tăng trưởng của vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl 3.1.1.1. Hình thái tế bào D.bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl Quan sát dưới kính hiển vi quang học cho thấy tế bào D.bardawil DCCBC 15 trong 10 ngày nuôi cấy đầu tiên có hình cầu, hình trứng hoặc hình ellip. Sau 10 ngày nuôi cấy, tế bào D. bardawil DCCBC 15 có sự biến đổi hình dạng thành hình trụ hoặc hình cầu có kích thước lớn. Đồng thời, dịch nuôi cấy cũng như tế bào D.bardawil DCCBC 15 chuyển sang màu vàng hoặc cam sau 10 ngày nuôi cấy (hình 3.1). Ngày 0 Ngày 12 Ngày 14 Ngày 2 Ngày 4 Ngày 16 Ngày 6 Ngày 18 Ngày 8 Ngày 20 Ngày 10 Ngày 22 Hình 3.1. Hình thái của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl 28
3.1.1.2. Sự tăng trưởng của D.bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl Trong môi trường MD4 1,5M NaCl, mật độ và trọng lượng khô tế bào D.bardawil DCCBC 15 đạt phase tăng trưởng từ ngày 2 đến ngày 10 với tốc độ tăng trưởng cao (0,219 tế bào/mL/ngày và 0,310 g/L/ngày). Sau 10 ngày nuôi cấy, mật độ tế bào ổn định (p = 0,279), trong khi đó trọng lượng khô giảm dần (p = 0,002) cho thấy tế bào D.bardawil DCCBC 15 đi vào giai đoạn suy vong làm giảm hàm lượng các hợp chất hữu cơ (hình 3.2, bảng 3.1). Hình 3.2. Mật độ tế bào và trọng lượng khô của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl 29
Bảng 3.1. Mật độ tế bào và trọng lượng khô của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl Mật độ tế bào Trọng lượng khô Ngày (tế bào/mL x 104) (g/L) 0 14,000 ± 0,5771 0,063 ± 0,0241 2 18,667 ± 0,3331 0,420 ± 0,087123 2 12 4 39,333 ± 3,180 0,203 ± 0,020 6 63,667 ± 4,8423 0,493 ± 0,09923 8 80,667 ± 3,9304 0,670 ± 0,06634 10 82,333 ± 2,0284 1,400 ± 0,1085 12 81,333 ± 1,8564 0,880 ± 0,1054 14 88,667 ± 1,2024 0,503 ± 0,09723 16 90,000 ± 2,6464 0,383 ± 0,047123 18 86,667 ± 6,4894 0,200 ± 0,01612 20 90,667 ± 4,1804 0,365 ± 0,033123 22 83,667 ± 1,4534 0,175 ± 0,04012 Cá c số trung bình trong côṭ vớ i cá c mẫu tư ̣ số khá c nhau khá c biêṭ có ý nghiã ở mứ c p = 0,05 3.1.1.3. Hàm lương̣ diệp lục tố của D. bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl Kết quả cho thấy hàm lương̣ diệp lục tố a trên thể tích tăng nhanh và đaṭ giá trị cưc̣ đaị (0,172 μg/mL) sau 14 ngày nuôi cấy và duy trì ổn định sau đó. Trong khi đó, hàm lượng diệp lục tố a trên tế bào giảm dần và đạt giá trị ổn định từ ngày 10 đến ngày 22 của quá trình nuôi cấy (p = 0,080) (hình 3.3, bảng 3.2). Tương tự, hàm lương̣ diệp lục tố tổng trên thể tích tăng nhanh từ ngày 0 đến ngày 14 và đaṭ giá trị cưc̣ đaị là 1,575 μg/mL sau 14 ngày nuôi cấy rồi ổn định đến ngày 22 (p = 0,826). Tuy nhiên hàm lương̣ diệp lục tố tổng trên tế bào cao nhất là 2,366 pg/tế bào ở ngày 0 sau đó giảm dần và ổn định từ ngày 10 đến ngày 22 (p = 0,939) (hình 3.4, bảng 3.2). 30
Hình 3.3. Hàm lượng diệp lục tố a trên thể tích (a) và trên tế bào (b) của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl 31
Hình 3.4. Hàm lượng diệp lục tố tổng trên thể tích (a) và trên tế bào (b) của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl 32
Bảng 3.2. Hàm lượng diệp lục tố a, diệp lục tố tổng trên thể tích và trên tế bào của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl Hàm lượng diệp lục tố a Hàm lượng diệp lục tố tổng Ngày µg/mL pg/tb µg/mL pg/tb 0,034 ± 0,241 ± 0,331 ± 2,366 ± 0 0,0131 0,09212 0,0411 0,2952 0,056 ± 0,302 ± 0,441 ± 2,364 ± 2 0,00312 0,0152 0,04412 0,2362 0,083 ± 0,211 ± 0,732 ± 1,861 ± 4 0,00323 0,00712 0,04023 0,10112 0,136 ± 0,214 ± 1,076 ± 1,691 ± 6 0,01945 0,02912 0,13134 0,20512 0,126 ± 0,156 ± 1,236 ± 1,532 ± 8 0,00334 0,00412 0,06945 0,0861 0,131 ± 0,159 ± 1,382 ± 1,678 ± 10 0,004345 0,00512 0,02045 0,02512 0,150 ± 0,184 ± 1,400 ± 1,721 ± 12 0,00745 0,00912 0,05945 0,07312 0,172 ± 0,194 ± 1,575 ± 1,776 ± 14 0,0135 0,01512 0,0665 0,07412 0,152 ± 0,169 ± 1,532 ± 1,702 ± 16 0,00745 0,00812 0,0585 0,06512 0,142 ± 0,164 ± 1,514 ± 1,746 ± 18 0,00945 0,01012 0,0865 0,10012 0,146 ± 0,161 ± 1,486 ± 1,639 ± 20 0,00945 0,01012 0,0825 0,09012 0,122 ± 0,146 ± 1,441 ± 1,723 ± 22 0,01134 0,0131 0,11045 0,13212 Cá c số trung bình trong côṭ vớ i cá c mẫu tư ̣ số khá c nhau khá c biêṭ có ý nghiã ở mứ c p = 0,05 3.1.1.4. Hàm lương̣ carotenoid của D.bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl Hàm lương̣ carotenoid trên thể tích và tế bào của D.bardawil DCCBC 15 thấp trong 2 ngày đầu nuôi cấy. Hàm lượng carotenoid tăng mạnh từ ngày 2 và đạt giá trị cao sau 22 ngày nuôi cấy (11,609 µg/mL và 13,875 pg/tb). Tương tự, tỷ lệ carotenoid/diệp lục tố cũng tăng mạnh sau 2 ngày nuôi cấy (hình 3.5, bảng 3.3). Kết quả phân tích hàm lượng β-carotene của D.bardawil DCCBC 15 cho thấy đạt giá trị cao (205,663 mg/100 g) ở ngày 22. 33
Hình 3.5. Hàm lượng carotenoid trên thể tích (a), trên tế bào (b) và tỷ lệ carotenoid/ diệp lục tố (c) của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl 34
Bảng 3.3. Hàm lượng carotenoid trên thể tích, trên tế bào và tỷ lệ carotenoid/diệp lục tố của D.bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl Hàm lượng carotenoid Ngày µg/mL pg/tb Carotenoid/dlt 0 0,672 ± 0,0551 4,800 ± 0,3931 2,029 ± 0,1661 2 0,991 ± 0,1301 5,310 ± 0,6991 2,246 ± 0,29612 4 1,722 ± 0,03412 4,378 ± 0,0851 2,352 ± 0,04612 6 2,638 ± 0,22123 4,142 ± 0,3471 2,451 ± 0,20512 8 3,578 ± 0,34434 4,436 ± 0,4261 2,899 ± 0,27812 10 4,511 ± 0,5104 5,479 ± 0,6201 3,265 ± 0,3702 12 6,140 ± 0,3375 7,550 ± 0,4152 4,386 ± 0,2413 14 8,140 ± 0,1726 9,180 ± 0,19323 5,169 ± 0,10934 16 9,206 ± 0,24267 10,229 ± 0,26934 6,009 ± 0,15845 18 10,223 ± 0,14078 11,796 ± 0,1614 6,754 ± 0,09256 20 10,718 ± 0,18089 11,822 ± 0,1984 7,211 ± 0,12167 22 11,609 ± 0,3359 13,875 ± 0,4005 8,055 ± 0,2327 Cá c số trung bình trong côṭ vớ i cá c mẫu tư ̣ số khá c nhau khá c biêṭ có ý nghiã ở mứ c p = 0,05 3.1.2. Khảo sát sự tăng trưởng và tích lũy carotenoid của vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau 3.1.2.1. Hình thái tế bào D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau Quan sát dưới kính hiển vi quang học cho thấy D.bardawil DCCBC 15 trong 16 ngày nuôi cấy đầu tiên tế bào có dạng đơn bào, nhỏ, di động nhanh, có hình cầu, hình trứng, hình ellip và có hai roi. Sau ức chế tế bào D.bardawil DCCBC 15 có sự biến đổi hình dạng, tế bào bị kéo dài hoặc là hình cầu có kích thước lớn. Đồng thời dịch nuôi cấy và tế bào D.bardawil DCCBC 15 chuyển sang màu vàng hoặc cam sau ức chế (hình 3.6). 35
Đối chứng H2O2 H2O2 + 4M H2O2 + AS300 Ngày 0 Ngày 4 Ngày 8 Ngày 12 Ngày 16 Ngày 22 Ngày 28 Ngày 31 Hình 3.6. Hình thái của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau 3.1.2.2. Sự tăng trưởng của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau D.bardawil DCCBC 15 được nuôi trong môi trường MD4 1,5M NaCl có giai đoạn tăng trưởng từ ngày 0 đến ngày 16 với tốc độ tăng trưởng cao 0,122 tế bào/mL/ngày (p = 0,038) và đạt mật độ tế bào cao ở ngày 16 (72,667 x 104 tế bào/mL). Sự tăng trưởng của D.bardawil DCCBC 15 ổn định sau ức chế và có sự 36
khác biệt ý nghĩa giữa các điều kiện nuôi cấy ức chế khác nhau (p = 0,000) (hình 3.7, bảng 3.4). Trọng lượng khô của D.bardawil DCCBC 15 tăng sau 3 ngày ứ c chế và duy trì ổn định từ ngày 19 đến ngày 31 (p = 0,837). Trong điều kiện nuôi cấy đối chứng trọng lượng khô tăng từ ngày 16 đến 19 và duy trì ổn định, tuy nhiên không có sự khác biệt ý nghĩa (p = 0,944) (hình 3.8, bảng 3.5). Hình 3.7. Mật độ tế bào của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau Hình 3.8. Trong̣ lương̣ khô của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau 37
Bảng 3.4. Mật độ tế bào của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau Mâṭ đô ̣tế bào (tế bào/mL x 104) Ngày Đố i chứ ng H2O2 H2O2 + 4M H2O2 + AS300 10,333 ± 10,333 ± 10,333 ± 10,333 ± 0 0,3331a 0,3331a 0,3331a 0,3331a 17,333 ± 14,000 ± 14,667 ± 17,333 ± 2 0,33312a 1,5281a 1,66712a 1,85612a 28,333 ± 23,333 ± 15,333 ± 23,333 ± 4 1,33312b 2,18612ab 3,52812a 1,85612ab 33,333 ± 29,667 ± 20,667 ± 30,667 ± 6 0,66723a 7,055123a 5,548123a 0,3332a 50,000 ± 39,000 ± 33,333 ± 48,000 ± 8 6,00034a 3,000234a 7,881234a 3,5123a 58,333 ± 44,667 ± 40,333 ± 53,333 ± 10 3,33345a 8,293345a 9,062345a 0,88234a 52,000 ± 49,667 ± 50,000 ± 54,000 ± 12 3,0004a 0,88245a 2,082456a 3,05534a 64,000 ± 54,333 ± 57,667 ± 59,333 ± 14 2,000456a 2,33345a 3,38356a 4,410345a 72,667 ± 59,000 ± 66,333 ± 64,333 ± 16 2,028567c 0,5775a 0,3336b 0,33345b 67,333 ± 57,333 ± 51,333 ± 61,667 ± 19 0,8824567c 2,33345ab 1,667456a 1,764345bc 77,667 ± 53,667 ± 51,667 ± 61,333 ± 22 5,17567b 4,66745a 0,882456a 4,410345ab 70,333 ± 61,000 ± 54,000 ± 61,000 ± 25 7,219567a 5,5085a 4,163456a 4,041345a 75,667 ± 62,667 ± 51,333 ± 65,333 ± 28 4,702567c 0,8825ab 1,202456a 2,72845bc 83,667 ± 63,333 ± 53,667 ± 73,000 ± 31 2,0287d 0,8825b 1,333456a 1,5285c Cá c số trung bình trong hà ng vớ i cá c mẫu tư ̣ chữ khá c nhau khá c biêṭ có ý nghiã ở mứ c p = 0,05 Cá c số trung bình trong côṭ vớ i cá c mẫu tư ̣ số khá c nhau khá c biêṭ có ý nghiã ở mứ c p = 0,05 38
Bảng 3.5. Trong̣ lương̣ khô của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau Trong̣ lương̣ khô (g/L) Ngày Đố i chứ ng H2O2 H2O2 + 4M H2O2 + AS300 0,447 ± 0,427 ± 0,590 ± 0,623 ± 16 0,0181a 0,0901a 0,0611a 0,0441a 1,493 ± 1,463 ± 1,277 ± 1,370 ± 19 0,3991a 0,4982a 0,1132a 0,1972a 1,027 ± 1,163 ± 1,230 ± 1,280 ± 22 0,3381a 0,03912a 0,0762a 0,16212a 1,257 ± 1,783 ± 1,577 ± 1,580 ± 25 0,1771a 0,4632a 0,1192a 0,2272a 1,057 ± 1,027 ± 1,197 ± 1,100 ± 28 0,0821a 0,03812a 0,0622a 0,07812a 1,143 ± 1,103 ± 1,180 ± 1,167 ± 31 0,0131a 0,04412a 0,0462a 0,04312a Cá c số trung bình trong hà ng vớ i cá c mẫu tư ̣ chữ khá c nhau khá c biêṭ có ý nghiã ở mứ c p = 0,05 Cá c số trung bình trong côṭ vớ i cá c mẫu tư ̣ số khá c nhau khá c biêṭ có ý nghiã ở mứ c p = 0,05 3.1.2.3. Hàm lương̣ diệp lục tố của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau Sau ức chế, hàm lượng diệp lục tố a và diệp lục tố tổng trên thể tích và tế bào ở các điều kiện nuôi cấy ức chế duy trì ổn định và không có sự khác biệt với điều kiện nuôi cấy đối chứng (hình 3.9, hình 3.10, bảng 3.6, bảng 3.7). 39
Hình 3.9. Hàm lượng diệp lục tố a trên thể tích (a) và trên tế bào (b) của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các đi ều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau 40
Hình 3.10. Hàm lượng diệp lục tố tổng trên thể tích (a) và trên tế bào (b) của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau 41
Bảng 3.6. Hàm lượng diệp lục tố a trên thể tích và trên tế bào của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau Hàm lương̣ diêp̣ luc̣ tố a Ngày Đố i chứ ng H2O2 H2O2 + 4M H2O2 + AS300 µg/mL pg/tb µg/mL pg/tb µg/mL pg/tb µg/mL pg/tb 0,453 ± 0,623 ± 0,385 ± 0,653 ± 0,484 ± 0,730 ± 0,421 ± 0,655 ± 16 0,2531a 0,0351a 0,0291a 0,0501a 0,13012a 0,0201a 0,02312a 0,03512a 0,498 ± 0,740 ± 0,436 ± 0,761 ± 0,316 ± 0,616 ± 0,551 ± 0,893 ± 19 0,0031ab 0,0051a 0,0271ab 0,0481a 0,0251a 0,0481a 0,0872b 0,1412a 0,468 ± 0,602 ± 0,402 ± 0,749 ± 0,368 ± 0,713 ± 0,401 ± 0,654 ± 22 0,0481a 0,0611a 0,0381a 0,0701a 0,0181a 0,0351a 0,01212a 0,01912a 0,536 ± 0,762 ± 0,450 ± 0,737 ± 0,476 ± 0,882 ± 0,432 ± 0,709 ± 25 0,0401a 0,0571a 0,0371a 0,0611a 0,04012a 0,07412a 0,01912a 0,03112a 0,601 ± 0,794 ± 0,488 ± 0,778 ± 0,578 ± 1,126 ± 0,465 ± 0,711 ± 28 0,0331a 0,0431ab 0,0371a 0,0591a 0,0622a 0,1202b 0,02912a 0,04412a 0,534 ± 0,639 ± 0,473 ± 0,750 ± 0,462 ± 0,860 ± 0,333 ± 0,456 ± 31 0,0191a 0,0221ab 0,1521a 0,0241ab 0,07012a 0,13012b 0,0501a 0,0691a Cá c số trung bình trong hà ng vớ i cá c mẫu tư ̣ chữ khá c nhau khá c biêṭ có ý nghiã ở mứ c p = 0,05 Cá c số trung bình trong côṭ vớ i cá c mẫu tư ̣ số khá c nhau khá c biêṭ có ý nghiã ở mứ c p = 0,05 Bảng 3.7. Hàm lượng diệp lục tố tổng trên thể tích và trên tế bào của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau Hàm lương̣ diêp̣ luc̣ tố tổng Ngày Đố i chứ ng H2O2 H2O2 + 4M H2O2 + AS300 µg/mL pg/tb µg/mL pg/tb µg/mL pg/tb µg/mL pg/tb 0,490 ± 0,6674 ± 0,422 ± 0,715 ± 0,541 ± 0,815 ± 0,469 ± 0,730 ± 16 0,0321a 0,0441a 0,0351a 0,0591a 0,18712a 0,0281a 0,0271a 0,0421a 0,591 ± 0,879 ± 0,545 ± 0,950 ± 0,394 ± 0,767 ± 0,793 ± 1,285 ± 19 0,00712a 0,01012a 0,03412a 0,0591a 0,0211a 0,0401a 0,2181a 0,3541a 0,536 ± 0,690 ± 0,427 ± 0,795 ± 0,393 ± 0,760 ± 0,432 ± 0,705 ± 22 0,0671a 0,0861a 0,0152a 0,0961a 0,0111a 0,0221a 0,0231a 0,0381a 0,658 ± 0,936 ± 0,541 ± 0,888 ± 0,565 ± 1,047 ± 0,512 ± 0,840 ± 25 0,06212a 0,08912a 0,01212a 0,0891a 0,04112a 0,07612a 0,0341a 0,0561a 0,773 ± 1,021 ± 0,638 ± 1,018 ± 0,722 ± 1,406 ± 0,587 ± 0,898 ± 28 0,0582a 0,0772ab 0,0562a 0,0891ab 0,0662a 0,1292b 0,0401a 0,0611a 0,669 ± 0,780 ± 0,576 ± 0,910 ± 0,519 ± 0,968 ± 0,399 ± 0,546 ± 31 0,00712a 0,00812a 0,01412a 0,0221a 0,10012a 0,18812a 0,0851a 0,1161a Cá c số trung bình trong hà ng vớ i cá c mẫu tư ̣ chữ khá c nhau khá c biêṭ có ý nghiã ở mứ c p = 0,05 Cá c số trung bình trong côṭ vớ i cá c mẫu tư ̣ số khá c nhau khá c biêṭ có ý nghiã ở mứ c p = 0,05 42
3.1.2.4. Hàm lương̣ carotenoid của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau D.bardawil DCCBC 15 sau khi chuyển sang điều kiện nuôi cấy ức chế thì hàm lượng carotenoid trên thể tích và tế bào đều tăng mạnh và đạt giá trị cao sau 12 ngày ức chế. Ở ngày 28 và ngày 31 hàm lượng carotenoid trên thể tích (μg/mL) ở điều kiện ức chế H2O2 thấp hơn so với các điều kiện ức chế còn lại, đặc biệt trong 2 điều kiện ức chế kết hợp H2O2 và ánh sáng cao 300 μmol photon/m /s có hàm lượng carotenoid cao nhất (10,685 μg/mL) (p ≤ 0,05) (hình 3.11, bảng 3.8). Tuy nhiên, hàm lượng carotenoid trên tế bào của D.bardawil DCCBC 15 ở các điều kiện nuôi cấy đối chứng, ức chế H2O2, kết hợp H2O2 và độ muối 4M NaCl thấp và không có sự khác biệt ý nghĩa ở ngày 28 và ngày 31 (p ≥ 0,05). Trong khi 2 đó, điều kiện ức chế kết hợp H2O2 và ánh sáng cao 300 μmol photon/m /s có hàm lượng carotenoid trên tế bào cao nhất (14,637 pg/tb) (p ≤ 0,05) (hình 3.11, bảng 3.9). Tỷ lệ carotenoid/diệp lục tố ở các điều kiện nuôi cấy cũng tăng sau ức chế, đặc 2 biệt trong điều kiện ức chế kết hợp H2O2 và ánh sáng cao 300 μmol photon/m /s đạt giá trị cao hơn các điều kiện ức chế còn lại sau 9 ngày ức chế (p ≤ 0,05) (hình 3.11, bảng 3.10). 43
Hình 3.11. Hàm lượng carotenoid trên thể tích (a), trên tế bào (b) và tỷ lệ carotenenoid/diệp lục tố (c) của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau 44
Bảng 3.8. Hàm lượng carotenoid trên thể tích của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau Hàm lương̣ carotenoid trên thể tích (μg/mL) Ngày Đối chứ ng H2O2 H2O2 + 4M H2O2 + AS300 3,100 ± 3,116 ± 2,696 ± 3,066 ± 16 0,2771a 0,2191a 0,06612a 0,3961a 3,435 ± 3,688 ± 1,756 ± 4,536 ± 19 0,13812b 0,2861b 0,1221a 0,4881b 4,721 ± 4,225 ± 2,495 ± 5,519 ± 22 0,04723b 0,50612ab 0,08712a 0,64412b 5,443 ± 4,805 ± 3,108 ± 8,005 ± 25 0,1293b 0,36112ab 0,1532a 0,71323c 6,821 ± 5,603 ± 4,150 ± 9,290 ± 28 0,4394b 0,4272ab 0,3643a 0,29234c 6,938 ± 5,846 ± 4,217 ± 10,685 ± 31 0,4384b 0,2492ab 0,2693a 0,5474c Cá c số trung bình trong hà ng vớ i cá c mẫu tư ̣ chữ khá c nhau khá c biêṭ có ý nghiã ở mứ c p = 0,05 Cá c số trung bình trong côṭ vớ i cá c mẫu tư ̣ số khá c nhau khá c biêṭ có ý nghiã ở mứ c p = 0,05 Bảng 3.9. Hàm lượng carotenoid trên tế bào của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau Hàm lương̣ carotenoid trên tế bào (pg/tế bào) Ngày Đố i chứ ng H2O2 H2O2 + 4M H2O2 + AS300 4,266 ± 5,282 ± 4,065 ± 4,766 ± 16 0,3811a 0,3711a 0,10112a 0,6151a 5,102 ± 6,432 ± 3,420 ± 7,356 ± 19 0,20512ab 0,49912bc 0,2381a 0,79112c 6,078 ± 7,873 ± 4,829 ± 8,998 ± 22 0,06023ab 0,94312ab 0,16912a 1,0492c 7,739 ± 7,877 ± 5,755 ± 13,123 ± 25 0,18434a 0,59112a 0,2832a 1,1693b 9,014 ± 8,940 ± 8,084 ± 14,220 ± 28 0,5804a 0,6822a 0,7093a 0,4463b 8,293 ± 9,231 ± 7,858 ± 14,637 ± 31 0,5234a 0,3922a 0,5003a 0,7503b Cá c số trung bình trong hà ng vớ i cá c mẫu tư ̣ chữ khá c nhau khá c biêṭ có ý nghiã ở mứ c p = 0,05 Cá c số trung bình trong côṭ vớ i cá c mẫu tư ̣ số khá c nhau khá c biêṭ có ý nghiã ở mứ c p = 0,05 45
Bảng 3.10. Tỷ lệ carotenoid/diệp lục tố của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau Hàm lương̣ carotenoid trên diêp̣ luc̣ tố Ngày Đối chứ ng H2O2 H2O2 + 4M H2O2 + AS300 6,323 ± 7,388 ± 4,987 ± 6,531 ± 16 0,56512a 0,51912a 0,12312a 0,8441a 5,807 ± 6,770 ± 4,457 ± 5,722 ± 19 0,2341ab 0,5251b 0,3101a 0,6151ab 8,812 ± 9,900 ± 6,355 ± 12,769 ± 22 0,08734ab 1,18612ab 0,2222a 1,4892b 8,271 ± 8,871 ± 5,499 ± 15,624 ± 25 0,19723a 0,66612a 0,27012a 1,3922b 8,830 ± 8,785 ± 5,749 ± 15,824 ± 28 0,56834b 0,67012b 0,50412a 0,4962c 10,372 ± 10,149 ± 8,114 ± 26,786 ± 31 0,6544a 0,4322a 0,5173a 1,3733b Cá c số trung bình trong hà ng vớ i cá c mẫu tư ̣ chữ khá c nhau khá c biêṭ có ý nghiã ở mứ c p = 0,05 Cá c số trung bình trong côṭ vớ i cá c mẫu tư ̣ số khá c nhau khá c biêṭ có ý nghiã ở mứ c p = 0,05 3.1.2.5. Hàm lương̣ β-carotene của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau Hàm lượng β-carotene của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 được phân tích bằng phương pháp HPLC, kết quả cho thấy ở điều kiện ức chế kết hợp H2O2 và độ muối cao có hàm lượng thấp (248,887 mg/100 g), ở điều kiện ức chế kết hợp H2O2 và ánh sáng cao 300 μmol photon/m2/s có giá trị 646,374 mg/100 g (tuy hàm lượng carotenoid tổng cao nhất) thấp hơn so với điều kiện nuôi cấy đối chứng (679,155 mg/100 g) (p ≤ 0,05) (hình 3.12, bảng 3.11). 46
p = 0,000 Hình 3.12. Hàm lượng β-carotene của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiện nuôi cấy ức chế khác nhau Bảng 3.11. Hàm lượng β-carotene của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiện kiện nuôi cấy ức chế khác nhau Hàm lương̣ β-carotene (mg/100 g) Đối chứ ng H2O2 H2O2 + 4M H2O2 + AS300 679,155 ± 559,547 ± 248,887 ± 646,374 ± 3,721d 4,440b 6,042a 8,104c Cá c số trung bình trong hàng vớ i cá c mẫu tư ̣ chữ khá c nhau khá c biêṭ có ý nghiã ở mứ c p = 0,05 3.1.2.6. Hàm lương̣ lipid của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau Tương tự như hàm lượng carotenoid, hàm lượng lipid trên thể tích, trên tế bào của D. bardawil DCCBC 15 cũng tăng sau ứ c chế ở tất cả các điều kiện và có sự khác biệt ý nghĩa (p ≤ 0,05). Trong đó, hàm lương̣ lipid trên thể tích, trên tế bào của D.bardawil DCCBC 15 trong điều kiện ứ c chế kết hơp̣ H2O2 và ánh sáng cao 300 μmol photon/m2/s ở ngày 31 (66,153 μg/mL; 90,621 pg/tế bào) cao hơn các điều kiêṇ ứ c chế còn lại (p ≤ 0,05). Ở điều kiêṇ ứ c chế kết hơp̣ H2O2 và độ muối 47
4M NaCl, hàm lượng carotenoid (trên thể tích, tế bào) của D.bardawil DCCBC 15 có giá trị thấp nhưng không có sự khác biệt ý nghĩa so với các điều kiện nuôi cấy còn lại (p ≥ 0,05) (hình 3.13, bảng 3.12). Hình 3.13. Hàm lượng lipid trên thể tích (a) và trên tế bào (b) của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ưc chế khác nhau ́ 48
Bảng 3.12. Hàm lượng lipid tổng trên thể tích và trên tế bào của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau Hàm lương̣ lipid tổng Ngày Đố i chứ ng H2O2 H2O2 + 4M H2O2 + AS300 µg/mL pg/tb µg/mL pg/tb µg/mL pg/tb µg/mL pg/tb 38,620 ± 53,147 ± 39,553 ± 67,040 ± 33,687 ± 50,784 ± 34,087 ± 52,985 ± 16 2,80212a 3,8561a 3,90812a 6,6231a 1,73712a 2,6191a 3,2381a 5,0331a 36,887 ± 54,782 ± 35,753 ± 62,361 ± 26,087 ± 50,818 ± 34,020 ± 55,168 ± 19 1,2351b 1,83412a 3,9751ab 6,9341a 0,7691a 1,5001a 1,2001ab 1,94612a 53,153 ± 68,438 ± 47,753 ± 88,981 ± 34,087 ± 65,974 ± 49,820 ± 81,228 ± 22 1,4893b 1,91734a 4,85212ab 9,0401a 2,33612a 4,52223a 2,60023b 4,24034a 45,087 ± 64,104 ± 40,687 ± 66,700 ± 30,553 ± 56,580 ± 43,820 ± 71,836 ± 25 0,5702b 0,81023a 2,88812ab 4,7341a 2,0831a 3,85712a 3,78612b 6,20623a 53,820 ± 71,128 ± 53,953 ± 86,096 ± 40,287 ± 78,481 ± 56,020 ± 85,745 ± 28 1,5533b 2,05334a 4,27412b 6,8211a 0,74223a 1,44634a 1,66534b 2,54934a 65,487 ± 78,271 ± 55,687 ± 87,926 ± 43,753 ± 81,528 ± 66,153 ± 90,621 ± 31 0,8824c 1,0544a 2,6692b 4,2141a 1,9663a 3,6664a 0,8824c 1,2084a Cá c số trung bình trong hà ng vớ i cá c mẫu tư ̣ chữ khá c nhau khá c biêṭ có ý nghiã ở mứ c p = 0,05 Cá c số trung bình trong côṭ vớ i cá c mẫu tư ̣ số khá c nhau khá c biêṭ có ý nghiã ở mứ c p = 0,05 3.1.2.7. Hàm lương̣ phenolic của vi tả o D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau Sau khi chuyển sang điều kiện ức chế, hàm lương̣ phenolic trên thể tích và tế bào của D.bardawil DCCBC 15 tăng chậm sau 6 ngày ức chế, sau đó tăng nhanh hơn từ ngày 25 tất cả các điều kiện nuôi cấy. Trong đó, D.bardawil DCCBC 15 2 dưới điều kiện ứ c chế kết hơp̣ H2O2 và ánh sáng cao 300 μmol photon/m /s có hàm lượng phenolic cao hơn so với các điều kiện ức chế khác qua các ngày (p ≤ 0,05). Đặc biêt ở điều kiện ứ c chế H2O2 kết hơp̣ với ánh sáng cao, hàm lượng phenolic trên thể tích đạt cực đại vào ngày 31 (6,751 μg/mL) và trên tế bào đạt cực đại vào ngày 25 (10,796 pg/tế bào) (p ≤ 0,05), tuy nhiên không có sự khác biệt ý nghĩa với các điều kiện nuôi cấy ức chế còn lại (p ≥ 0,05) (hình 3.14, bảng 3.13). 49
Hình 3.14. Hàm lượng phenolic trên thể tích (a) và trên tế bào (b) của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau 50
Bảng 3.13. Hàm lượng phenolic trên thể tích và tế bào của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau Hàm lương̣ phenolic tổng Ngày Đố i chứ ng H2O2 H2O2 + 4M H2O2 + AS300 µg/mL pg/tb µg/mL pg/tb µg/mL pg/tb µg/mL pg/tb 4,074 ± 5,607 ± 3,634 ± 6,159 ± 3,568 ± 5,378 ± 3,546 ± 5,511 ± 16 0,4391a 0,6041a 0,1351a 0,2301a 0,08012a 0,1201a 0,0761a 0,1191a 4,096 ± 6,084 ± 3,898 ± 6,799 ± 3,061 ± 5,963 ± 4,129 ± 6,696 ± 19 0,1711b 0,2541a 0,0941b 0,16412a 0,1051a 0,2051a 0,1241b 0,2011a 4,234 ± 5,451 ± 3,992 ± 7,438 ± 3,320 ± 6,426 ± 4,421 ± 7,208 ± 22 0,2261b 0,2911a 0,2431ab 0,45423b 0,02912a 0,05612ab 0,1661b 0,27112b 5,506 ± 7,829 ± 5,099 ± 8,358 ± 4,669 ± 8,647 ± 6,586 ± 10,796 ± 25 0,2762ab 0,3932a 0,1252a 0,2053a 0,2023a 0,3743a 0,3542b 0,5793b 4,818 ± 6,367 ± 4,818 ± 7,688 ± 3,926 ± 7,647 ± 5,908 ± 9,043 ± 28 0,10112ab 0,13312a 0,0952ab 0,15223ab 0,1562a 0,30423ab 0,4682b 0,71623b 5,198 ± 6,213 ± 4,812 ± 7,598 ± 3,942 ± 7,346 ± 6,751 ± 9,248 ± 31 0,19912b 0,23812a 0,1172b 0,18423b 0,1882a 0,3502ab 0,2172c 0,2973b Cá c số trung bình trong hà ng vớ i cá c mẫu tư ̣ chữ khá c nhau khá c biêṭ có ý nghiã ở mứ c p = 0,05 Cá c số trung bình trong côṭ vớ i cá c mẫu tư ̣ số khá c nhau khá c biêṭ có ý nghiã ở mứ c p = 0,05 3.1.2.8. Khả năng chống oxy hóa của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ ứ c chế Hai điều kiện nuôi cấy đối chứng, ức chế kết hợp H2O2 và ánh sáng cao 300 μmol photon/m2/s tăng nhanh sau ức chế, trong đó điều kiện ức chế kết hợp ánh sáng cao có giá trị cao hơn sau 12 ngày ức chế (p ≤ 0,05). Trong điều kiện ức chế H2O2, kết hợp H2O2 và độ muối 4M NaCl khả năng chống oxy hóa trên thể tích và tế bào đạt giá trị thấp và không có sự khác biệt ý nghĩa (p ≥ 0,05) (hinh̀ 3.15, bảng 3.14). 51
Hình 3.15. Khả năng chống oxy hóa trên thể tích (a) và trên tế bào (b) của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các đi ều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau 52
Bảng 3.14. Khả năng chống oxy hóa trên thể tích và trên tế bào của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế khác nhau Khả năng chố ng oxy hóa Đố i chưng H2O2 H2O2 + 4M H2O2 + AS300 Ngay ́ ̀ I%/tb × I%/tb × I%/tb × I%/tb × I%/mL I%/mL I%/mL I%/mL 10-4 10-4 10-4 10-4 9.318 ± 12.823 ± 10.694 ± 18.126 ± 8.943 ± 13.482 ± 8.943 ± 13.901 ± 16 1.6801a 2.3121a 1.6361a 2.7721a 1.7641a 2.6601a 1.2321a 1.9151a 19.425 ± 28.849 ± 16.716 ± 29.156 ± 11.695 ± 22.782 ± 17.212 ± 27.911 ± 19 1.18323b 1.7563a 1.1591b 2.0221a 0.7311a 1.4231a 1.04912b 1.70212a 12.241 ± 15.761 ± 11.008 ± 20.512 ± 9.644 ± 18.664 ± 19.463 ± 31.733 ± 22 2.87112a 3.69612a 3.9431a 7.3461a 3.5601a 6.8911a 4.4202a 7.2062a 15.691 ± 22.310 ± 10.360 ± 16.983 ± 7.846 ± 14.529 ± 19.116 ± 31.337 ± 25 0.810123bc 1.151123ab 1.5821ab 2.5951a 2.1001a 3.8891a 1.89512c 3.1062b 19.177 ± 25.345 ± 16.489 ± 26.312 ± 13.127 ± 25.573 ± 24.792 ± 37.948 ± 28 1.31123b 1.73223a 0.6531ab 1.0421a 0.6361a 1.2401a 1.0632c 1.6272b 20.550 ± 24.561 ± 16.766 ± 26.473 ± 13.938 ± 25.973 ± 24.970 ± 34.205 ± 31 1.0213b 1.22023a 0.3981ab 0.6291a 1.3041a 2.4301a 0.8622c 1.1802b Cá c số trung bình trong hà ng vớ i cá c mẫu tư ̣ chữ khá c nhau khá c biêṭ có ý nghiã ở mứ c p = 0,05 Cá c số trung bình trong côṭ vớ i cá c mẫu tư ̣ số khá c nhau khá c biêṭ có ý nghiã ở mứ c p = 0,05 53
3.2. Bàn luận 3.2.1. Khảo sá t sự tăng trưởng của vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl Vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 được bổ sung nguồn nitrogen và phosphor từ phân bón NPK tế bào có hình elip, bầu dục, màu xanh, 2 roi và di động trong 10 ngày nuôi cấy ban đầu. Giai đoạn này cũng là thời điểm tế bào đạt phase tăng trưởng với tốc độ tăng trưởng cao, mật độ tế bào và trọng lượng khô tế bào cao sau 10 ngày nuôi cấy. Sau 10 ngày nuôi cấy mật độ tế bào ổn định và trọng lượng khô tế bào giảm, đây là giai đoạn Dunaliella bardawil DCCBC 15 đi vào pha ổn định và suy vong do môi trường cạn kiệt dinh dưỡng đặc biệt là các dinh dưỡng đa lượng như nitơ và phosphor gây ra giảm tổng hợp các hợp chất hữu cơ, bắt đầu tổng hợp carotenoid nên dịch nuôi và tế bào chuyển sang màu vàng hoặc cam (hình 3.1, hình 3.2). Nitrogen là dinh dưỡng đa lượng quan trọng cho sự tăng trưởng và biến dưỡng, là thành phần chính của protein, vật liệu di truyền và quá trình biến dưỡng lipid, acid béo ở nhiều loài vi tảo [25]. Ngoài ra nó là thành phần quan trọng tổng hợp diệp lục tố và các protein của hệ thống quang hợp như LHCII apoprotein. Vì vậy, việc cung cấp nitrogen có ảnh hưởng lên thành phần cấu trúc và sinh lý quang hợp của vi tảo [66]. Tương tự, phosphor là một yếu tố cần thiết cho sự tăng trưởng của vi tảo, đặc biệt cho sự hình thành và vận chuyển năng lượng chuyển hóa. Phosphor hiện diện trong ribosome giàu phosphor nơi mà các protein liên quan đến quang hợp được tổng hợp. Vì vậy phosphor bị hạn chế sẽ làm giảm hoạt tính quang hợp dẫn đến tốc độ tăng trưởng giảm [57]. Có thể thấy tương ứng với sự tăng trưởng của D. bardawil DCCBC 15, ở giai đoạn tăng trưởng thì hàm lượng diệp lục tố cao, sau khi môi trường cạn kiệt dinh dưỡng, nitrogen và phosphor bị hạn chế sẽ làm giảm hoạt tính quang hợp dẫn đến tốc độ tăng trưởng giảm và hàm lượng diệp lục tố bắt đầu ổn định (hình 3.3, hình 3.4). Ngoài ra, độ muối và cường độ ánh sáng thích hợp được xem là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự tăng trưởng tối ưu và tổng hợp sắc tố 54
của Dunaliella. Nhiều nghiên cứu cho thấy hầu hết các chủng Dunalella tăng trưởng tốt ở độ muối 1,5M NaCl và cường độ ánh sáng 50 - 100 µmol photon/m2/s [8]. Trong các điều kiện môi trường tối ưu này giúp tế bào D. bardawil DCCBC 15 sử dụng hiệu quả nguồn dinh dưỡng, hấp thụ và cố định CO2 hiệu quả hơn so với các điều kiện nuôi cấy ức chế. Hàm lượng carotenoid ở D.bardawil DCCBC 15 trong 10 ngày đầu tăng chậm và tăng nhanh sau đó (hình 3.5). Sau 22 ngày nuôi cấy, kết quả phân tích cho thấy hàm lượng β-carotene của D.bardawil DCCBC 15 đạt giá trị cao là 205,663 mg/100g. Điều này có thể cho thấy sự sinh tổng hợp lượng lớn carotenoid thứ cấp khi tế bào D.bardawil DCCBC 15 đi vào phase ổn định và suy vong do nguồn dinh dưỡng bị cạn kiệt (hình 3.5). Trong các điều kiện bất lợi của môi trường như độ muối cao, cường độ ánh sáng cao, cạn kiệt dinh dưỡng, carotenoid thứ cấp được tích lũy trong các cấu trúc đặc biệt có thể nằm ở bên trong stroma của lục lạp (như các giọt chứa β-carotene ở D. bardawil) và bên ngoài lục lạp (như các hạt oleosome trong tế bào chất của H. pluvialis). Các cấu trúc chứa carotenoid thứ cấp được tổng hợp cùng với sự tham gia chủ yếu của lipid trung tính (Triacylglycerol, TAG) [61]. Kết quả cho thấy hàm lượng carotenoid tăng dần trong quá trình nuôi cấy và tăng cao khi môi trường nuôi cấy cạn kiệt dinh dưỡng. Sự tăng hàm lượng carotenoid tổng là do sự tăng hàm lượng β-carotene [72]. 3.2.2. Khảo sát sự tăng trưởng và tích lũy carotenoid của vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiêṇ nuôi cấy ứ c chế Tế bào D.bardawil DCCBC 15 được chuyển qua các điều kiện nuôi cấy ức chế khi đạt phase ổn định sau 16 ngày nuôi cấy. Sau ức chế mật độ và trọng lượng khô tế bào D.bardawil DCCBC 15 duy trì ổn định, đồng thời tế bào có sự thay đổi hình dạng và màu sắc thành vàng hoặc cam (hình 3.6, hình 3.7, hình 3.8). Như được biết, vi tảo Dunaliella có khả năng thích nghi tốt với các điều kiện nuôi cấy bất lợi như cạn kiệt dinh dưỡng, độ muối cao, cường độ ánh sáng cao bằng cách tổng hợp các hợp chất như glycerol để duy trì áp suất thẩm thấu nội bào hoặc tổng hợp lượng lớn carotenoid để đáp ứng với các điều kiện bất lợi này. 55
Sau ức chế, hàm lượng diệp lục tố ở các điều kiện nuôi cấy ức chế duy trì ổn định và không có sự khác biệt với điều kiện nuôi cấy đối chứng (hình 3.9, hình 3.10) do khi môi trường cạn kiệt nguồn dinh dưỡng, sự tăng trưởng giảm dẫn đến giảm tổng hợp diệp lục tố mà thay vào đó là tổng hợp các chất khác như carotenoid. Theo Phadwal và Singh (2003) kết luận rằng dưới điều kiện hạn chế sulfat, nitrate và phosphate Dunaliella sẽ giảm tốc độ tăng trưởng và hàm lượng diệp lục tố, nhưng sẽ tăng hàm lượng beta-carotene [75]. Ức chế thẩm thấu làm tổn thương lục lạp và làm tăng tỉ lệ carotenoid/diệp lục tố, sự tăng này như một cách để chống lại sự tổn thương lục lạp [13]. Những điều trên làm giảm tỷ lệ tăng trưởng (hình 3.7, hình 3.8) và làm thay đổi thành phần sinh hóa của tế bào D.bardawil DCCBC 15 như hàm lượng diệp lục tố (hình 3.9, hình 3.10), hàm lượng carotenoid (hình 3.11) và hàm lượng lipid (hình 3.13). D.bardawil DCCBC 15 sau khi chuyển sang điều kiện nuôi cấy ức chế thì hàm lượng carotenoid tăng mạnh. Trong đó, ức chế kết hợp H2O2 với ánh sáng cao gây ra sự tích lũy carotenoid cao hơn so với ức chế bằng H2O2 cũng như ức chế kết hợp H2O2 và độ muối cao (hình 3.11). Điều này là do khi tiếp xúc với cường độ ánh sáng cao, tế bào Dunaliella sử dụng con đường tổng hợp carotenoid như một cơ chế bảo vệ chống lại các tổn thương do ánh sáng và tổn thương oxy hóa của tế bào. Ở D.bardawil DCCBC 15 tăng cường độ ánh sáng và thời gian chiếu ánh sáng lên hoặc ức chế sự tăng trưởng bằng các điều kiện ức chế khác như thiếu chất dinh dưỡng hoặc độ muối cao làm giảm hàm lượng diệp lục tố, tăng hàm lượng β- carotene trên mỗi tế bào và tỷ lệ β-carotene/diệp lục tố [10]. Sự sản xuất carotenoid ở D. bardawil DCCBC 15 liên quan đến cơ chế đáp ứng tổn thương oxy hóa của tế bào. Trong điều kiện ức chế ánh sáng cao và cạn kiệt nitrogen hoặc kết hợp cả hai điều kiện có thể làm tăng tổn thương oxy hóa gây ra tăng tổng hợp carotenoid [74]. Các nghiên cứu cho thấy sự liên quan của ROS đến cảm ứng tổng hợp carotenoid. ROS được tạo ra trong các điều kiện ức chế ánh sáng cao hoặc những điều kiện ức chế khác, đóng vai trò như các chất truyền tín hiệu thứ 2 để hoạt hóa các con đường tổng hợp carotenoid. ROS và các sản phẩm chuyển hóa của chúng có thể hoạt hóa 56
các enzyme tiền tổng hợp carotenoid và cảm ứng sự biểu hiện các gen tương ứng [61]. Như vậy kết quả này có thể cho thấy rằng ánh sáng là yếu tố chính ảnh hưởng đến khả năng tích lũy carotenoid của D.bardawil DCCBC 15 và phù hợp với kết quả của các nhà nghiên cứu trước đây về khả năng kích thích tạo carotene của ánh sáng cũng như sự kết hợp với yếu tố khác như độ muối cao hoặc cạn kiệt dinh dưỡng đối với Dunaliella và một số tảo khác [48], [51]. Hàm lượng β-carotene của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 được phân tích bằng phương pháp HPLC, kết quả cho thấy ở điều kiện ức chế kết hợp H2O2 và độ muối cao có hàm lượng thấp (248,887 mg/100 g), ở điều kiện ức chế kết hợp H2O2 và ánh sáng cao tuy hàm lượng carotenoid tổng cao nhất nhưng hàm lượng β-carotene có giá trị là 646,374 mg/100 g thấp hơn so với điều kiện nuôi cấy đối chứng (679,155 mg/100 g) (hình 3.12). Điều này có thể là do ở điều kiện ức chế kết hợp H2O2 và ánh sáng cao vi tảo D.bardawil DCCBC 15 còn tích lũy nhiều loại carotene khác ngoài β-carotene. Có thể thấy ức chế cạn kiệt dinh dưỡng và cường độ ánh sáng cao ảnh hưởng lên sự tổng hợp sắc tố, đặc biệt β-carotene của D. bardawil DCCBC 15 hơn so với ức chế bằng độ muối cao. Kết quả cho thấy có sự liên quan giữa hàm lượng carotenoid và sự tích lũy lipid của D.bardawil DCCBC 15 sau ức chế. Tương tự như hàm lượng carotenoid, hàm lượng lipid của D. bardawil DCCBC 15 cũng tăng lên sau ứ c chế ở các điều kiện. Trong đó, hàm lương̣ lipid của D.bardawil DCCBC 15 ở điều kiện ứ c chế kết hơp̣ H2O2 và ánh sáng cao có giá trị cao hơn các điều kiêṇ ứ c chế còn lại. Nhiều nghiên cứu cho thấy ở vi tảo như Dunaliella, Haematococcus carotenoid thứ cấp và lipid được tổng hợp đồng thời trong các điều kiện nuôi cấy bất lợi. Vi tảo có tỷ lệ diện tích bề mặt/thể tích cao, tạo điều kiện đáp ứng nhanh với những điều kiện môi trường thay đổi và chúng có thể thay đổi nhanh sự chuyển hóa lipid trong các điều kiện môi trường này [73]. Nitrogen và phosphor là hai dinh dưỡng đa lượng quan trọng cho sự tăng trưởng và biến dưỡng ở các tế bào tảo. Sự hạn chế của các dinh dưỡng quan trọng này làm thay đổi con đường biến dưỡng của tế bào. Đối với sự cạn kiệt nitrogen và phosphor làm thay đổi sự biến dưỡng lipid từ tổng hợp lipid 57
màng thành dự trữ lipid trung tính. Điều này lần lượt làm tăng hàm lượng lipid trong tảo lục [35]. Bên cạnh đó, trong điều kiện nuôi cấy tối ưu gây stress oxy hóa bằng cách sử dụng H2O2 dẫn đến tăng hàm lượng lipid nội bào lên đến 44% so với mẫu đối chứng không có xử lý. Stress oxy hóa và sự tăng sản xuất lipid có mối liên kết với nhau, stress oxy hóa là trung gian gây tích lũy lipid [76]. Ngoài ra, β- carotene được sản xuất lượng lớn ở D. salina khi đáp ứng với cường độ ánh cao, sự sản xuất carotenoid gắn với sự hình thành các giọt lipid và giảm nồng độ acid béo không bão hòa, tăng tích lũy các acid béo đặc hiệu (C16:0 và C18:1) [71]. Vì vậy, tín hiệu lipid của D. bardawil DCCBC 15 tăng sau ức chế là phù hợp với các nghiên cứu trước đó. Các kết quả cho thấy khả năng chống oxy hóa và hàm lượng phenolic của D.bardawil DCCBC 15 tăng lên sau ức chế. Trong đó, ứ c chế kết hơp̣ H2O2 và ánh sáng cao có giá trị cao hơn so với các điều kiện ức chế khác (hình 3.14, hình 3.15). Khả năng chống oxy hóa của D.bardawil DCCBC 15 tăng lên sau ức chế ánh sáng cao phù hợp với các nghiên cứu trước đó [17]. Hàm lượng phenolic tổng của D.bardawil DCCBC 15 cũng tăng lên sau ức chế tương ứng với sự tăng của khả năng chống oxy hóa. Carotenoid là chất chống oxy hóa mạnh và khử các gốc tự do. Carotenoid thứ cấp (astaxanthin và ester với acid béo) ở vi tảo có thể khử hiệu quả ROS được tạo ra trên màng thylakoid vì chúng nằm bên ngoài màng thylakoid. Carotenoid thứ cấp bảo vệ chống lại sự peroxide hóa lipid dự trữ trong oleosome và các ngăn khác của tế bào như nhân. Chính vì vậy người ta thấy các oleosome chứa carotenoid thứ cấp nằm quanh nhân để tạo ra một rào cản lý hóa hấp thụ ROS và bảo vệ ADN tránh các tổn thương oxy hóa. Sự tổng hợp carotenoid chứa oxy ở vi tảo làm giảm nồng độ oxy trong tế bào và trong các ngăn khác của tế bào. Một yếu tố quan trọng kiểm soát hình thành ROS trong các điều kiện nuôi cấy bất lợi cũng có thể là chất nhận electron từ plastoquinone trên chuỗi vận chuyển điện tử ở lục lạp đến oxidase cuối cùng trong lạp thể (PTOX) thông qua desaturase của con đường tổng hợp carotenoid. Đồng thời oxy phân tử trong lục lạp được khử tạo thành H2O, làm giảm khả năng tạo ROS [61]. Qua thí nghiệm trên có thể thấy tương ứng với sự 58
tăng khả năng chống oxy hóa sau ức chế của D.bardawil DCCBC 15 là sự tăng hàm lượng của các chất chống oxy hóa như phenolic và carotenoid để bảo vệ tế bào khỏi các yếu tố bất lợi của môi trường. 59
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Dunaliella bardawil DCCBC 15 là một vi tảo lục đơn bào, tăng trưởng tốt trong môi trường MD4 1,5M NaCl với tốc độ tăng trưởng cao, mật độ tế bào và trọng lượng khô cao sau 10 ngày nuôi cấy. Hàm lượng diệp lục tố trên thể tích tăng cao, trong khi đó hàm lượng diệp lục tố tương đối ổn định trong phase tăng trưởng. Hàm lượng carotenoid tăng mạnh khi D. bardawil DCCBC 15 đạt phase ổn định hoặc suy vong do cạn kiệt dinh dưỡng. Trong các điều kiện ức chế bổ sung H2O2 12,5 µM, độ muối cao 4M và ánh sáng cao 300 µmol photon/m2/s sự tăng trưởng của Dunaliella bardawil DCCBC 15 bị ức chế, hàm lượng diệp lục tố duy trì hàm lượng ổn định, đồng thời tăng sự tổng hợp lipid và các chất chống oxy hóa như carotenoid và phenolic. Hàm lượng β- carotene của D. bardawil DCCBC 15 đạt giá trị cao sau ức chế đặc biệt ở điều kiện ức chế cạn kiệt dinh dưỡng và kết hợp ánh sáng cao 300 µmol photon/m2/s. 4.2. Kiến nghị Sử dụng ánh sáng xanh dương trong quá trình nuôi cấy D. bardawil DCCBC 15 để tăng tốc độ tăng trưởng, đạt mật độ tế bào và sinh khối cao trong giai đoạn nuôi tăng trưởng. Nuôi cấy và phân tích hàm lượng β-carotene của D. bardawil DCCBC 15 trong các điều kiện ức chế, đặc biệt sử dụng ánh sáng tự nhiên trên qui mô nuôi cấy hệ thống bioreactor túi ni lông khoảng 20 lít. 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Huỳnh Hiêp̣ Hùng, Lê Thi ̣ Thanh Loan, Nguyễn Thi ̣ My ̃ Lan, Lê Thi ̣ My ̃ Phước, et al (2013), "Khảo sát khả năng tạo Beta-carotene của chủng vi tảo Dunaliella phân lập ở Việt Nam", Tạp chí Phát triển KH&CN, 16 (T1), tr. 43- 50. 2. Nguyễn Thi ̣Hải Thanh, Ngô Đăng Nghiã (2014), "Phân lâp̣ vi tảo Dunaliella salina NT6 taị Khánh Hòa và nghiên cứ u các điều kiêṇ sinh trưở ng và tổng hơp̣ β-carotene của tảo", Tap̣ chí Khoa hoc̣ Trườ ng Đaị hoc̣ Cần Thơ, Thủ y sản (1), tr. 218-228. 3. Võ Hồng Trung (2017), Choṇ loc̣ và nuôi cấy môṭ số chủng tảo Dunaliella salina doc̣ bờ biển môṭ số tỉnh miền Trung – Nam bô ̣ cho hà m lương̣ carotenoid cao, Luận án tiến sĩ, Chuyên ngành Sinh lý học thực vật, Trường Đaị hoc̣ Khoa hoc̣ Tư ̣ nhiên, Đaị hoc̣ Quốc gia Tp.Hồ Chí Minh. Tài liệu tiếng Anh 4. Albayrak S, Aksoy A, Sagdic O, Hamzaoglu E (2010), "Compositions, antioxidant and antimicrobial activities of Helichrysum (Asteraceae) species collected from Turkey", Food Chemistry, 119 (1), pp. 114-122. 5. Baas-Becking L G M (1931), "Salt effects on swarmers of Dunaliella viridis Teod", The Journal of general physiology, 14 (6), pp. 765-779. 6. Becker W (2004), "Microalgae for aquaculture. The nutritional value of microalgae for aquaculture", Handbook of microalgal culture, pp. 380-391. 7. Ben-Amotz A (1980), "Glycerol production in the alga Dunaliella", Biochemical and Photosynthetic aspects of energy production, pp. 191-208. 8. Ben-Amotz A (2009), "Bioactive compounds: glycerol production, carotenoid production, fatty acids production", The Alga Dunaliella: Biodiversity, Physiology, Genomics and Biotechnology, pp. 189-208.
9. Ben-Amotz A, Avron M (1978), "On the mechanism of osmoregulation in Dunaliella", Developments in halophilic microorganisms, pp. 529-541. 10. Ben-Amotz A, Avron M (1983), "On the factors which determine massive β- carotene accumulation in the halotolerant alga Dunaliella bardawil", Plant Physiology, 72 (3), pp. 593-597. 11. Ben-Amotz A, Avron M (1990), "The biotechnology of cultivating the halotolerant alga Dunaliella", Trends in Biotechnology, 8, pp. 121-126. 12. Ben‐Amotz A, Avron M (1989), "The wavelength dependence of massive carotene synthesis in Dunaliella bardawil (Chlorophyceae)", Journal of phycology, 25 (1), pp. 175-178. 13. Ben‐Amotz A, Katz A, Avron M (1982), "Accumulation of β‐carotene in halotolerant alge: purification and characterization of β‐carotene‐rich globules from Dunaliella bardawil (Chlorophyceae) 1", Journal of Phycology, 18 (4), pp. 529-537. 14. Borowitzka M A (1988), "Dunaliella", Microalgal biotechnology, pp. 27-58. 15. Borowitzka M A, (1995), "Microalgae as sources of pharmaceuticals and other biologically active compounds", Journal of Applied Phycology, 7 (1), pp. 3- 15. 16. Butcher R W (1959), "An undescribed species of Dunaliella from the Cambridge collection of algae", Hydrobiologia, 12 (4), pp. 249-250. 17. Chen H, Jiang J G (2009), "Osmotic responses of Dunaliella to the changes of salinity", Journal of cellular physiology, 219 (2), pp. 251-258. 18. Cordero B F, Couso I, León R, Rodríguez H, et al (2011), "Enhancement of carotenoids biosynthesis in Chlamydomonas reinhardtii by nuclear transformation using a phytoene synthase gene isolated from Chlorella zofingiensis", Applied microbiology and biotechnology, 91 (2), pp. 341-351. 19. Cunningham F X (2002), "Regulation of carotenoid synthesis and accumulation in plants", Pure and Applied Chemistry, 74 (8), pp. 1409-1417.
20. Del Campo J A, García-González M, Guerrero M G (2007), "Outdoor cultivation of microalgae for carotenoid production: current state and perspectives", Applied microbiology and biotechnology, 74 (6), pp. 1163- 1174. 21. Dufossé L, Galaup P, Yaron A, Arad S M, et al (2005), "Microorganisms and microalgae as sources of pigments for food use: a scientific oddity or an industrial reality?", Trends in Food Science & Technology, 16 (9), pp. 389- 406. 22. Gibbs N, Duffus C M (1976), "Natural protoplast Dunaliella as a source of protein", Applied and environmental microbiology, 31 (4), pp. 602-604. 23. Goiris K, Muylaert K, Fraeye I, Foubert I, et al (2012), "Antioxidant potential of microalgae in relation to their phenolic and carotenoid content", Journal of applied phycology, 24 (6), pp. 1477-1486. 24. Gonçalves A L, Pires J C, Simões M (2013), "Lipid production of Chlorella vulgaris and Pseudokirchneriella subcapitata", International Journal of Energy and Environmental Engineering, 4 (1), pp. 1-6. 25. Griffiths M J, Harrison S T L (2009), "Lipid productivity as a key characteristic for choosing algal species for biodiesel production", Journal of Applied Phycology, 21 (5), pp. 493-507. 26. Grünewald K, Hirschberg J, Hagen C (2001), "Ketocarotenoid biosynthesis outside of plastids in the unicellular green alga Haematococcus pluvialis", Journal of Biological Chemistry, 276 (8), pp. 6023-6029. 27. Guillard R R, Sieracki M S (2005), "Counting cells in cultures with the light microscope", Algal culturing techniques, pp. 239-252. 28. Hejazi M, Holwerda E, Wijffels R (2004), "Milking microalga Dunaliella salina for β‐carotene production in two‐phase bioreactors", Biotechnology and bioengineering, 85 (5), pp. 475-481. 29. Hemalatha A, Girija K, Parthiban C, Saranya C, et al (2013), "Antioxidant properties and total phenolic content of a marine diatom, Navicula clavata and