›

Khóa luận Xây dựng quy trình định lượng citral trong tinh dầu sả chanh bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò dãy DIOD

pdf 54 trang thiennha21 18/04/2022 8272
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Xây dựng quy trình định lượng citral trong tinh dầu sả chanh bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò dãy DIOD", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_xay_dung_quy_trinh_dinh_luong_citral_trong_tinh_da.pdf

Nội dung text: Khóa luận Xây dựng quy trình định lượng citral trong tinh dầu sả chanh bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò dãy DIOD

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ===  === NGUYỄN THỊ HUÊ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CITRAL TRONG TINH DẦU SẢ CHANH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO GHÉP ĐẦU DÒ DÃY DIOD KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2019
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ===  === NGUYỄN THỊ HUÊ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CITRAL TRONG TINH DẦU SẢ CHANH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO GHÉP ĐẦU DÒ DÃY DIOD KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHOÁ: QHY.2014 NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. NGUYỄN THỊ THANH BÌNH HÀ NỘI @ -School 2019 of Medicine and Pharmacy, VNU
  3. LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới Tiến sĩ Nguyễn Thị Thanh Bình – Bộ môn Hoá Dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, là người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này. Tôi xin cảm ơn các thầy trong bộ Bộ môn Hoá Dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã tạo điều kiện để tôi có thể thực hiện khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Chủ nhiệm, các Phòng ban Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội cùng toàn thể các thầy cô giáo trong Khoa đã cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt những năm học tập, sinh hoạt và rèn luyện tại Khoa. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh, động viên tôi trong lúc khó khăn cũng như trong quá trình thực hiện khóa luận này. Hà Nội, tháng 05 năm 2019 Sinh viên Nguyễn Thị Huê @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  4. CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril BP Dược điển Anh Quốc (British Pharmacopoeia) DAD Máy đo quang (Diode Array Detector) EP Dược điển châu Âu (European pharmacopoeia) GC Sắc ký khí (Gas Chromatography) Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High - performance liquid HPLC chromatography) ICH Hội nghị quốc tế về hài hoà hoá các thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho con người (International conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human use) LOD Giới hạn phát hiện (Limit of detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitation) MS Phương pháp khối phổ (Phương pháp khối phổ) NIR Quang phổ cận hồng ngoại RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation) USP Dược điển Hoa Kỳ (United States Pharmacopoeia) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  5. MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 2 1.1. Giới thiệu chung về cây sả chanh 2 1.2. Giới thiệu chung về citral 4 1.2.1. Nguồn gốc 4 1.2.2. Cấu trúc và tính chất 5 1.2.3. Công dụng 5 1.2.4. Các phương pháp định lượng citral 6 1.3. Thẩm định quy trình phân tích 9 1.3.1. Tính đặc hiệu 9 1.3.2. Miền giá trị 10 1.3.3. Tính tuyến tính 10 1.3.4. Giới hạn phát hiện 11 1.3.5. Giới hạn định lượng 11 1.3.6. Độ đúng 12 1.3.7. Độ chính xác 13 CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1. Nguyên vật liệu, trang thiết bị 14 2.1.1. Dung môi, hoá chất 14 2.1.2. Trang thiết bị 14 2.2. Phương pháp nghiên cứu 14 2.2.1. Tối ưu hoá điều kiện sắc ký 14 2.2.2. Thẩm định tính đặc hiệu 15 2.2.3. Thẩm định tính tuyến tính và xác @ định School miền giá of trị Medicine and 15 Pharmacy, VNU
  6. 2.2.4. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 15 2.2.5. Thẩm định độ đúng 15 2.2.6. Thẩm định độ chính xác 15 2.2.7. Định lượng citral trong tinh dầu sả chanh 16 CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 17 3.1. Xác định điều kiện phân tích 17 3.1.1. Khảo sát các hệ dung môi 17 3.1.2. Xác định bước sóng hấp thụ 19 3.1.3. Điều kiện sắc ký 20 3.2 . Tính đặc hiệu 21 3.3. Tính tuyến tính và miền giá trị 23 3.3.1. Đối với đồng phân neral 23 3.3.2. Đối với đồng phân geranial 24 3.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 26 3.5. Độ đúng 26 3.5.1. Đối với đồng phân neral 26 7.5.2. Đối với đồng phân geranial 27 3.6. Độ lặp lại 27 3.6.1. Đối với đồng phân neral 28 3.6.2. Đối với đồng phân geranial 29 3.7. Độ chính xác trung gian 29 3.7.1. Đối với đồng phân neral 30 3.7.2. Đối với đồng phân geranial 31 3.8. Định lượng citral trong một số mẫu tinh dầu sả chanh 31 3.8.1. Sản phẩm A 31 3.8.2. Sản phẩm B @ School of Medicine and 32 Pharmacy, VNU
  7. 3.8.3. Sản phẩm C 33 3.8. Bàn luận 35 CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 4.1. Kết luận 38 4.2. Kiến nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  8. DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Neral (A) và Geranial (B) 5 Hình 3.1. Sắc ký đồ của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml tại bước sóng 233 nm, hệ dung môi ACN : H2O = 70 : 30 (v/v/v) 17 Hình 3.2. Sắc ký đồ của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml tại bước sóng phát hiện 233 nm với hệ dung môi ACN : MeOH : H2O = 47 : 10 : 43 (v/v/v) 18 Hình 3.3. Phổ hấp thụ UV-VIS của Neral (A) và Geranial (B) 19 Hình 3.4. Sắc ký đồ của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml trong điều kiện sắc ký được lựa chọn 20 Hình 3.5. Phổ hấp thụ cực đại UV-VIS của geraniol 21 Hình 3.6. Sắc ký đồ của dung dịch chứa 20 µg/ml citral và 5 µg/ml geraniol tại bước sóng phát hiện 200 nm 21 Hình 3.7. Sắc ký đồ của dung dịch chứa 20 µg/ml citral và 5 µg/ml geraniol tại bước sóng phát hiện 242 nm 22 Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn sự tương quang giữa nồng độ dung dịch và diện tích pic của đồng phân neral 24 Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn sự tương quang giữa nồng độ dung dịch và diện tích pic của đồng phân geranial 25 Hình 3.10. Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp đối với đồng phân neral 28 Hình 3.11. Sắc ký đồ dung dịch mẫu A nồng độ 100 µg/ml 32 Hình 3.12. Sắc ký đồ dung dịch mẫu B nồng độ 100 µg/ml 33 Hình 3.13. Sắc ký đồ dung dịch mẫu C nồng độ 50 µg/ml 34 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  9. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Tên gọi cây sả chanh tại một số nước 2 Bảng 1.2. Hàm lượng citral trong một số loại tinh dầu 4 Bảng 3.1. Thông số pic của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml tại bước sóng phát hiện 233 nm với hệ dung môi ACN : H2O = 70 : 30 (v/v) 18 Bảng 3.2. Thông số pic của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml tại bước sóng phát hiện 233 nm với hệ dung môi ACN : MeOH : H2O = 47 : 10 : 43 (v/v/v) 19 Bảng 3.3. Thông số các pic của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml trong điều kiện sắc ký được lựa chọn 20 Bảng 3.4. Thông số các pic của dung dịch citral 20 µg/ml và dung dịch geraniol 5 µg/ml tại bước sóng phát hiện 200 nm 22 Bảng 3.5. Kết quả phân tích hồi quy mối tương quan giữa nồng độ dung dịch và diện tích pic của đồng phân neral 23 Bảng 3.6. Kết quả phân tích hồi quy mối tương quan giữa nồng độ dung dịch và diện tích pic của đồng phân geranial 25 Bảng 3.7. Kết quả xác định tỷ lệ phục hồi của đồng phân neral 26 Bảng 3.8. Kết quả xác định tỷ lệ phục hồi của đồng phân geranial 27 Bảng 3.9. Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp đối với đồng phân geranial 29 Bảng 3.10. Kết quả xác định độ chính xác trung gian của phương pháp đối với đồng phân neral 30 Bảng 3.11. So sánh một số phương pháp định lượng citral 35 Bảng 4.1. Các yêu cầu đảm bảo quy trình định lượng đối với neral 38 Bảng 4.2. Các yêu cầu đảm bảo quy trình định lượng đối với geranial 39 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  10. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  11. MỞ ĐẦU Sả chanh (Cymbopogon citratus) còn được gọi là cỏ sả, lá sả, hương mao, thuộc họ Lúa có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới. Cây cao khoảng 1,5 m sống lâu năm mọc thành bụi, phân nhánh nhiều. Sả không những được sử dụng làm gia vị trong chế biến các món ăn mà còn được sử dụng ở nhiều nước trên thế giới [16]. Tại Việt Nam, cây sả chanh dễ trồng, thích hợp với nhiều loại đất ở các vùng trung du, miền núi và mang lại hiệu quả kinh tế cao. Tinh dầu sả chanh được các nhà khoa học quan tâm bởi khả năng ức chế hoạt động sống của một số nhóm vi sinh vật gây bệnh và hoạt tính dược lý của nó. Priyanka Singh và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của tinh dầu sả chanh đến sự phát triển và khả năng sản sinh độc tố của Aspergillus flavus. Kết quả cho thấy tinh dầu sả chanh ức chế hoàn toàn sự phát triển của nấm mốc A. flavus [38] và ức chế sự hình thành của các biofilm gây nên bởi Candida albicans, Listeria monocytogenes (biofilm là nguyên nhân chính gây nhiễm khuẩn trong công nghiệp sản xuất thực phẩm bởi chúng rất khó bị loại trừ trong quá trình vệ sinh hệ thống trang thiết bị) [21,27]. Một số công trình nghiên cứu về thành phần tinh dầu sả chanh (Cymbopogon citratus) cho thấy thành phần chính của tinh dầu sả chanh là citral, bao gồm hai đồng phân geranial (citral-A) và neral (citral-B) [6]. Tại Việt Nam, tinh dầu sả chanh khá phổ biến trên thị trường nhưng chất lượng chưa được kiểm soát chặt chẽ. Nhằm kiểm soát chất lượng của tinh dầu sả chanh, chúng tôi tiến hành xây dựng quy trình định lượng citral trong tinh dầu sả chanh bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò dãy diod theo hướng dẫn của Hội nghị quốc tế về hài hoà hoá các thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho con người (International conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human use) và ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng citral trong một số sản phẩm thương mại. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 1
  12. CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu chung về cây sả chanh Cây sả chanh tên khoa học là Cymbopogon citratus, thuộc họ Poaceae, là một loại thảo dược ở vùng nhiệt đới và có nguồn gốc từ Ấn Độ và Sri Lanka [32]. Loài cây này được sử dụng ở nhiều nước trên thế giới với nhiều tên gọi khác nhau (bảng 1.1). Bảng 1.1. Tên gọi cây sả chanh tại một số nước [45] Đất nước Tên gọi English Lemon grass, Citronella (Hashisha al-limun ) نو ُِ يش لَلا َةش ِيش (Middle Eastern ( Arabic Chinese 草薑(Chou geung) 風茅(Fung maauh) 草薑(Chou geung) 風茅(Fung maauh) 檸檬草(Nihng mung chou) Malaysia Serai, Serai dapur Dutch Citroengras, Sereh French Verveine des Indes German Zitronengras, Citronella, Lemongras Greek Λεμονόχορτο (Lemonochorto ) Κιτρονέλλα (Kitronella) (Cymbopogon nardus (Essef limon) ןומיל בשע Hebrew @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 2
  13. (Limonit rehanit) סארג ןומיל India (Hindi) Sera, Verveine Italian Cimbopogone Russian Лимонное сорго(Limonnoe sorgo) Лимонная трава(Limmonaya trava) Spanish Zacate de limón, Te de limón, Caña de Limón, Citronella, Hierba de Limón Japanese レモングラス(Remonso) レモンソウ(Remonguraso Turkish Limon out Vietnamese Sả chanh, Sả (Sa chanh, Sa) Cây được trồng rộng rãi ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và thích hợp với khí hậu ẩm ướt trong điều kiện đầy đủ ánh nắng mặt trời. Trong điều kiện được hỗ trợ, cây sẽ chịu đựng được các loại khí hậu khác. Tuy nhiên, ở khu vực ôn đới, cây không sống được vào mùa đông vì rễ bị đóng băng [49]. Loại cây nhiệt đới này phát triển nhanh thành cụm dày đặc, có thể đạt chiều cao 180 cm và chiều rộng khoảng 120 cm. Lá rộng khoảng 3 cm, dài khoảng 90 cm, đầu lá nhọn rủ xuống và có màu xanh hơi sáng [50]. Cây sả chanh có lẽ được biết đến nhiều nhất vì sự xuất hiện trong ẩm thực Thái Lan và Việt Nam. Sả chanh cũng được sử dụng trong các loại trà thảo dược và đồ uống không cồn khác, trong các món nướng và trong bánh kẹo. Sả chanh từ lâu đã được sử dụng trong y học cổ truyền Ấn Độ như một loại thuốc để hạ sốt, làm giảm ợ hơi trong đường tiêu hóa, chống nhiễm trùng và chống côn trùng rất hiệu quả [39]. Tinh dầu chiết xuất từ sả chanh được sử dụng rộng rãi như một hương thơm trong nước hoa và mỹ phẩm vì có đặc tính khử mùi tốt. Trong liệu pháp mùi hương, tinh dầu sả chanh được sử dụng như một chất chống trầm cảm, làm dịu cơn đau nhức và giảm căng thẳng [39]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 3
  14. Tinh dầu sả chanh có thành phần chính là citral. Chất lượng của tinh dầu sả chanh được xác định bởi hàm lượng citral, mùi thơm của tinh dầu sả chanh do thành phần aldehyd quyết định [34]. Trong tinh dầu sả chanh, đồng phân trans geranial (40 đến 62%) chiếm ưu thế so với đồng phân cis neral (25 đến 38%) [37]. 1.2. Giới thiệu chung về citral 1.2.1. Nguồn gốc Citral là thành phần chính của một số loại tinh dầu (bảng 1.2) [15,25,30]. Bảng 1.2. Hàm lượng citral trong một số loại tinh dầu Loại tinh dầu Hàm lượng citral (%) Backhousia citriodora 90-98 Litsea citrata 90 Litsea cubeba 70-85 Cymbopogon citratus 65-85 Leptospermum liversidgei 70-80 Ocimum gratissimum 66,5 Lindera citriodora 65 Calypranthes parriculata 62 Petitgrain 36 Eucalyptus staigeriana 26 Aloysia citriodora 30-35 Melissa officinalis 11 Citral là một aldehyd có công thức C10H16O được phân lập lần đầu tiên bởi Bertram [8] từ tinh dầu Backhousia citriodora. Năm 1890, Dodge phân lập được citral từ tinh dầu sả chanh [12]. Sau đó, Tiemann và các cộng sự [23] phân lập được đồng thời hai đồng phân geranial (citral A) và neral (citral B) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 4
  15. của citral. Citral A dễ dàng tách khỏi citral B bằng phương pháp bisulphate natri được đề xuất bởi Tiemann [44]. 1.2.2. Cấu trúc và tính chất Citral có danh pháp quốc tế là 3,7-dimethyl-2,6-octadienal, khối lượng mol phân tử là 152,237 g/mol. Citral có số CAS là 5392-40-5, mã Pubchem là 638011 [51]. Citral là một chất lỏng màu vàng nhạt, có mùi chanh mạnh. Citral hòa tan trong nước rất kém (độ hòa tan trong nước là 0,059 g/100ml ở 250C); hòa tan được trong rượu (độ hòa tan trong rượu là 1 ml trong 7ml cồn 70%); đồng tan trong benzen benzoat, diethyl phthalate, glycerin, propylene glycol, dầu khoáng, dầu cố định và cồn 95%. Citral có khối lượng riêng 0.9 g/cm³ và nhiệt độ sôi ở 229 °C (502 K; 444 °F) [51]. Citral là hỗn hợp của hai đồng phần hình học monoterpene aldehyd có cùng công thức phân tử là C10H16O. Hai đồng phân này có tên gọi lần lượt là neral (Cis hay Z) và geranial (Trans hay E) cùng thể hiện tính chất vật lí gần giống nhau. Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Neral (A) và Geranial (B) 1.2.3. Công dụng Geranial có mùi chanh mạnh. Mùi chanh của neral ít nồng hơn, nhưng ngọt hơn. Do đó Citral là một hợp chất hương thơm được sử dụng trong nước hoa để tạo mùi hương của họ cam quýt. Citral cũng được sử dụng như một hương liệu và làm tăng thêm mùi hương của tinh dầu sả chanh. Citral cho thấy hoạt động kháng khuẩn đáng kể chống lại vi khuẩn Gram dương và Gram âm cũng như nấm do tinh dầu có tính chất kỵ nước, có thể tấn công và phá vỡ màng tế bào, gây ảnh hưởng đến hệ thống enzym dẫn đến ức chế hô hấp và gây chết tế bào @. Do School đó, citral of được Medicine sử dụng như and một Pharmacy, VNU 5
  16. chất bảo quản trong các ngành công nghiệp thực phẩm, xà phòng và mỹ phẩm [30]. Mặc dù citral trong tinh dầu sả chanh có khả năng xua đuổi côn trùng, tuy nhiên tinh dầu sả chanh lại có tác dụng hấp dẫn và được sử dụng như "mồi nhử" để thu hút ong mật. Vì một trong những chất pheromone từ ong chúa tiết ra giống như mùi của tinh dầu sả chanh. Do đó trong kỹ thuật nuôi ong mật người ta dùng tinh dầu sả chanh như chất gọi đàn khi đàn ong mới được chuyển vùng [24,33]. Citral còn được dùng để tổng hợp vitamin A, ionone và methylionone. Citral đã được thử nghiệm lâm sàng rộng rãi, không gây biến đổi gen hay gây ung thư [40]. 1.2.4. Các phương pháp định lượng citral Phương pháp chuẩn độ (theo dược điển Anh) Tiến hành lấy 25 mẫu tinh dầu sả chanh nguyên chất và trộn mỗi mẫu với ethanol tuyệt đối. Sau đó, thêm vào hỗn hợp trên dung dịch hydroxylamine hydrochloride và dung dịch xanh promophenol. Thêm axit clohydric, hiệu chỉnh lượng axit clohydric theo phản ứng của hydroxylamine với citral. Axit clohydric đã phản ứng được chuẩn độ từ từ với dung dịch kali hydroxit etanolic chuẩn cho đến khi màu 19 chuyển từ màu vàng sang màu xanh ô liu. Hàm lượng citral được tìm thấy trong mẫu tinh dầu sả chanh là 69,89-76,95%. Phương pháp quang phổ cận hồng ngoại Phương pháp quang phổ cận hồng ngoại được Wilson và các cộng sự xây dựng để xác định hàm lượng citral trong tinh dầu sả chanh vào năm 2002 [17]. Phương pháp quang phổ cận hồng ngoại dựa trên sự hấp thụ bức xạ điện tử ở các bước sóng trong phạm vi 750 – 2500 nm: Khi có một chùm ánh sáng tới chiếu qua các mẫu, vùng ánh sáng cận hồng ngoại (bước sóng 750 – 2500 nm) được các liên kết C-H, N-H, O-H có trong các chất hữu cơ hấp phụ. Ghi nhận phổ ánh sáng phản xạ từ các mẫu sẽ thu được các thông tin về thành phần hóa học của mẫu đó. Phổ thu được sẽ được phân tích bằng phần mềm @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 6
  17. máy tính. Áp dụng mô hình thống kê nhiều biến sẽ mô tả được mối quan hệ giữa phổ hấp phụ và thành phần hóa học; mối quan hệ này là cơ sở để xác định thành phần hóa học tại các máy phân tích (máy NIR) [46]. Các tác giả tiến hành lấy 26 mẫu tinh dầu sả chanh và quét phổ trong khoảng 1100-2500 nm trên máy Foss NIR- System 6500 Rapid Content Sample. Mỗi mẫu thu lấy 3 phổ (mỗi phổ là trung bình của 32 lần quét). Quang phổ sau đó được tính trung bình bằng phần mềm NSAS phiên bản 3.52. Kết quả thu được hàm lượng citral trung bình trong mẫu tinh dầu sả chanh là 75,77% (w/w) có độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của độ chính xác trung gian là 1,00% và RSD của độ đúng là 0,23% [46]. Tham chiếu với phương pháp định lượng citral trong tinh dầu sả chanh quy định trong Dược điển Anh, phương pháp NIR có độ chính xác tương đương. Tuy nhiên, phương pháp NIR có ưu điểm hơn so với phương pháp của Dược điển Anh là thực hiện đơn giản hơn, không cần xử lý mẫu và thời gian định lượng nhanh hơn [46]. Phương pháp sắc ký khí Phương pháp được Gaonkar và các cộng sự [49] xây dựng để định lượng đồng thời 2 đồng phân hình học của citral có trong mẫu tinh dầu sả chanh. Phân tích được thực hiện trên máy Agilent technologies 5975 Inert Mass Selective Detector GC–MS. Sử dụng cột sắc ký HP-5MS với chiều dài 30 mm, đường kính trong (ID) = 0,25 mm, lớp phim mỏng 0,25 µm. Heli được sử dụng làm khí mang với tốc độ dòng 1ml/phút. Nhiệt độ buồng bơm mẫu 250oC. Nhiệt độ bộ phận phát hiện 260oC. Chương trình nhiệt độ buồng điều nhiệt: duy trình nhiệt độ 75oC trong 2 phút, tăng 4oC/phút cho đến 250oC, dừng ở nhiệt độ này trong 10 phút. Kết quả thu được hàm lượng citral trong mẫu tinh dầu sả chanh là 72,57%. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tuỳ thuộc vào@ loạiSchool pha tĩnh of sử Medicine dụng. Khi phân and tích Pharmacy, VNU 7
  18. sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và hầu hết sự phân tách đều xảy ra ở nhiệt độ thường. Chính vì thế mà các chất không bền với nhiệt không bị phân hủy khi sắc ký [3,11,22,29]. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha thuận Phương pháp được Rauber và các cộng sự [50] xây dựng để xác định hàm lượng citral có trong tinh dầu sả chanh. Phân tích sử dụng pha động là n- hexane : ethanol (85:15, v/v) với tốc độ dòng 0,3 ml/phút, ghép với đầu dò UV được cài đặt ở bước sóng 233nm để phát hiện citral. Phương pháp sử dụng cột pha thuận CN. Kết quả thực nghiệm cho thấy, thời gian lưu của citral là 13,8 phút. Trong khoảng nồng độ tiến hành có sự tương quan chặt chẽ với độ lệch chuẩn se slopes là 1,78 và hệ số xác định R2 = 0,9991. Phương pháp đảm bảo tính đặc hiệu với citral, có độ đúng và độ chính xác tốt với tỷ lệ phục hồi ≤ 100 ± 2%, RSD của độ lặp lại ≤ 1,37%. Ứng dụng phương pháp trên, xác định được hàm lượng citral trong mẫu tinh dầu sả chanh là 75,20%. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo Phương pháp được Gaonkar và các cộng sự [49] xây dựng để định lượng đồng thời 2 đồng phân hình học của citral có trong một số mẫu tinh dầu. Phân tích sử dụng cột silicagel pha đảo Enable C - 18G (250 × 4,6 mm, 5 µ), pha động là acetonitril : nước (70: 30, v/v) với tốc độ dòng 1 ml/phút; ghép với đầu dò DAD được đặt ở bước sóng 233nm để phát hiện citral. Nhiệt độ cột 22oC, đầu dò có nhiệt độ 40oC và độ rộng khe 1,2 nm. Kết quả thực nghiệm cho thấy, thời gian lưu của neral và geranial tương ứng là 7,246 phút và 7,680 phút. Trong khoảng nồng độ citral từ 3 – 100 µg/ml, có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic y (mAU.min) và nồng độ dung dịch x (µg/ml) theo phương trình đối với đồng phân neral là y = 230540x – 100165 (hệ số xác định R2 = 0,9996), phương trình đối với đồng phân geranial là y = 260014x + 23521 (hệ số xác định R2 = 0,9964). Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) đối với đồng phân neral lần lượt là 0,062 µg/ml và 0,205 µg/ml, đối với đồng phân geranial lần lượt là 0,059 µg/ml và 0,198 µg/ml. Phương pháp @ đảm School bảo tính đặcof hiệuMedicine với citral, and có độ Pharmacy, VNU 8
  19. đúng và độ chính xác tốt với tỷ lệ phục hồi ≤ 100 ± 2%, RSD của độ lặp lại ≤ 1,74%, RSD của độ chính xác trung gian ≤ 1,93%. Ứng dụng phương pháp để định lượng citral có trong tinh dầu của cây sả chanh, tinh dầu lá chanh ta và tinh dầu vỏ quả chanh tây. Kết quả xác định được hàm lượng citral trong mẫu tinh dầu sả chanh là 74,98%, trong mẫu tinh dầu lá chanh ta là 2.09% và trong mẫu tinh dầu từ vỏ quả chanh tây là 0,3%. 1.3. Thẩm định quy trình phân tích Theo tài liệu “Thẩm định quy trình phân tích: nội dung và phương pháp”(Validation of analytical procedures: text and methodology) của ICH (International conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human use) ban hành vào tháng 11 năm 2005 [43], các yếu tố của một quy trình phân tích định lượng cần thẩm định gồm: độ đúng, độ chính xác, tính đặc hiệu, tính tuyến tính và miền giá trị. LOD và LOQ là các thông số không bắt buộc phải có trong quy trình thẩm định. 1.3.1. Tính đặc hiệu Phương pháp HPLC được coi là chọn lọc đối với chất phân tích nếu: - Sắc ký đồ các mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu chuẩn. - Sắc ký đồ các mẫu trắng, mẫu nền không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu chất chuẩn [1,2,14,43]. Phương pháp xác định Trong phương pháp HPLC với đầu dò DAD hoặc khối phổ, việc sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết của pic sẽ giúp tránh nhầm lẫn với các hợp chất có cấu trúc tương tự và chứng minh sắc ký không phải là pic của hai thành phần trở lên. Khi chế phẩm chưa xác định có sản phẩm phân huỷ hay không thì tự tạo ra mẫu có sản phẩm phân huỷ và so sánh với một mẫu không có sản phẩm phân huỷ. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 9
  20. 1.3.2. Miền giá trị Khái niệm Miền giá trị của một quy trình phân tích là khoảng giữa nồng độ cao và nồng độ thấp nhất của chất cần phân tích có trong mẫu thử với bất kì nồng độ nào trong khoảng này đều phải đáp ứng về độ chính xác lẫn độ đúng và tính chất tuyến tính của phương pháp [1,2,14,43]. Phương pháp xác định - Khảo sát và đánh giá tính tuyến tính của một khoảng nồng độ nhất định. - Sau đó thiết lập bằng cách khẳng định là khoảng này có đáp ứng độ tuyến tính có thể chấp nhận, độ đúng, độ lặp lại hay không. Yêu cầu Với quy trình định lượng nguyên liệu và thuốc, yêu cầu tối thiểu của miền giá trị là phải đạt 80% - 120% nồng độ của mẫu thử [1,2,14,43]. 1.3.3. Tính tuyến tính Khái niệm Tính tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả của phương pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của đại lượng đo được như chiều cao hoặc diện tích pic (y) và nồng độ (x). Tính tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax+b với hệ số tương quan tuyến tính R2 [1,2,14,43]. Phương pháp xác định - Khảo sát ở ít nhất 5 [43] hoặc 6 [14] mức nồng độ khác nhau. - Nồng độ cao nhất và thấp nhất phải nằm trong khoảng xác định của phương pháp. - Các mẫu được pha loãng từ mẫu chuẩn ban đầu. - Đánh giá tính tuyến tính bằng các phương pháp thống kê thích hợp: trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa các hệ số a, b; trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương trình. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 10
  21. Yêu cầu Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,99 ≤ R2 ≤ 1 [1, 2]. 1.3.4. Giới hạn phát hiện Khái niệm Giới hạn phát hiện của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được và không cần phải xác định chính xác hàm lượng [1,2,14,43]. Phương pháp xác định - Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu nhỏ nhất: LOD được xác định bằng cách phân tích mẫu có hàm lượng biết trước và thiết lập mức nồng độ nhỏ nhất nào đó còn có thể phát hiện bằng quy trình phân tích đang thực hiện. - Lập tỷ số phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử: Áp dụng cho phương pháp có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền. Giả sử tín hiệu thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là S. LOD là nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị 2 - 3. - Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc: Trong đó: a là độ dốc của đường chuẩn định lượng SD độ lệch chuẩn của độ đáp ứng. SD được tính bằng hai cách: dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc dựa vào đường chuẩn định lượng. 1.3.5. Giới hạn định lượng Khái niệm Giới hạn định lượng (LOQ) của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể định lượng với độ đúng và độ chính xác phù hợp [1,2,14,43]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 11
  22. Phương pháp xác định - Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu vẫn đáp ứng độ đúng và độ chính xác: giới hạn phát hiện được xác định bằng cách phân tích mẫu có hàm lượng biết trước và thiết lập mức nồng độ nhỏ nhất mà khi đó tiến hành bằng quy trình phân tích đang thẩm định vẫn đáp ứng độ đúng và độ chính xác chấp nhận. - Lập tỷ số phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử: áp dụng cho phương pháp có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền. Giả sử tín hiệu thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là S. LOQ là nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị khoảng 10. - Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc: Trong đó: a là độ dốc của đường chuẩn độ SD độ lệch chuẩn của độ đáp ứng. SD được tính bằng hai cách: dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc dựa vào đường cong chuẩn độ. 1.3.6. Độ đúng Khái niệm Độ đúng của một quy trình phân tích là mức độ sát gần của các giá trị tìm thấy so với giá trị thực, khi áp dụng quy trình đề xuất trên cùng với một mẫu thử dã được làm đồng nhất trong cùng một điều kiện xác định [1,2,10,42]. Phương pháp xác định Độ đúng được thực hiện bằng cách tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử ở tối thiểu ba nồng độ của miền giá trị trong quy trình phân tích (3 lần phân tích/nồng độ × 3 nồng độ khác nhau). Đại lượng đặc trưng cho độ đúng là tỷ lệ phục hồi được xác định theo công thức sau: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 12
  23. Tỉ lệ phục hồi = × 100% µ Trong đó: là giá trị mẫu đo được µ là giá trị mẫu theo lý thuyết. Yêu cầu Tỷ lệ phục hồi được chấp thuận dựa vào mẫu phân tích, quy trình xử lý mẫu và nồng độ phân tích. Trong các định lượng thường quy, tỷ lệ phục hồi thường được chấp thuận với giá trị 100 ± 2% [1,2]. Tỷ lệ phục hồi càng gần giá trị 100% quy trình có độ đúng càng cao. 1.3.7. Độ chính xác Khái niệm Độ chính xác của phương pháp là mức độ sát gần giữa các kết quả thử riêng biệt so với giá trị trung bình thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng một điều kiện [1,2,14,43]. Phương pháp xác định Độ lặp lại: tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử trong miền giá trị của quy trình phân tích (3 lần phân tích/ nồng độ × 3 nồng độ) hoặc định lượng tối thiểu 6 lần ở nồng độ 100%. Độ chính xác trung gian: tuỳ thuộc vào từng trường hợp cụ thể. Phân tích nhiều lần, nhiều mẫu với các yếu tố như thời gian, địa điểm, hệ thống máy thay đổi. Yêu cầu Tiêu chuẩn cho giá trị RSD phụ thuộc nhiều vào loại phân tích mẫu phân tích. Đối với các quy trình định lượng thường quy, RSD dễ dàng đạt trên dưới 2%. Đối với phân tích các mẫu sinh học, độ chính xác ở khoảng 20% ở giới hạn định lượng dưới và 15% ở các nồng độ khác cao hơn. Giá trị RSD càng nhỏ, quy trình càng có độ chính xác cao [1,2]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 13
  24. CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu, trang thiết bị 2.1.1. Dung môi, hoá chất Chất chuẩn citral tinh khiết 96% có tỷ lệ neral : geranial là 50:50, chất chuẩn geraniol tinh khiết 98%, methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) đạt tiêu chuẩn HPLC, kali hydroxit (KOH) được mua từ nhà sản xuất Merck KGaA, Đức. Nước được tinh chế bằng thiết bị Thermo Scientific GenPure UV-TOC đạt điện trở suất 18,2 M Ω.m. Các mẫu tinh dầu: Caroline (mẫu A), Julyhouse (mẫu B), Ngọc Tuyết (mẫu C) mua từ trang thương mại điện tử Tiki.vn. 2.1.2. Trang thiết bị Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Model Ultimate 3000 – Dionex, Thermo Scientific Hoa Kỳ ghép thiết bị phát hiện đa sóng DAD - 3000 Dionex. Cột silica gel pha đảo Eclipse XDB – C18 (4,6 x 250mm, 5µm). Xử lý tín hiệu bằng máy vi tính với hệ điều hành Microsoft Windows 7 trang bị phần mềm điều khiển Chromeleon Dionex phiên bản 7.1.2.1478. Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC - 150H, MRC Ltd, Isareal. Cân phân tích Shimadzu AUW220, Nhật Bản. Pipetman Finnpipette F3, Thermo Scientific, Hoa Kỳ, 2.2. Phương pháp nghiên cứu Trong quá trình nghiên cứu, mỗi mẫu được phân tích 3 lần, lấy giá trị trung bình. Xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Exel. 2.2.1. Tối ưu hoá điều kiện sắc ký Tiến hành sắc ký dung dịch citral chuẩn, sử dụng cột silica gel pha đảo C18 (5 µm, 120 Å, 4,6×250 nm), tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl, thời gian sắc ký 25 phút. Quét phổ hấp thụ trong khoảng 190-300 nm để tìm bước sóng hấp thụ cực đại. Khảo sát các pha động khác nhau, xác định @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 14
  25. pha động cho các pic neral và geranial có độ phân tách tốt, đạt độ cân xứng tốt, tỷ lệ diện tích pic trên nồng độ và chiều cao pic trên nồng độ lớn nhất. 2.2.2. Thẩm định tính đặc hiệu Tính đặc hiệu của phương pháp được xác định dựa vào khả năng phân tách của citral với tạp geraniol. Tiến hành sắc ký dung dịch geraniol, quét phổ hấp thụ của dung dịch trong khoảng 190-300 nm để xác định bước sóng hấp thụ cực đại của geraniol. Tiến hành sắc ký dung dịch chứa đồng thời citral và geraniol tại bước sóng hấp thụ cực đại của citral và bước sóng hấp thụ cực đại của geraniol để xác định khả năng phân tách của citral với geraniol. 2.2.3. Thẩm định tính tuyến tính và xác định miền giá trị Chuẩn bị dung dịch citral có nồng độ 10.000 µg/ml trong ACN. Pha loãng dung dịch này trong dung môi ACN : H2O (60:40, v/v) để thu được dãy 5 dung dịch có nồng độ citral lần lượt là 100, 80, 60, 40, 10 µg/ml . Khi đó nồng độ của neral hay geranial lần lượt là 50, 40, 30, 20, 5 µg/ml. Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn, phân tích mối tương quan giữa diện tích pic y (mAu.min) và nồng độ dung dịch (µg/ml). 2.2.4. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng LOD và LOQ được xác định bằng phương pháp pha loãng dung dịch chuẩn. LOD là nồng độ thấp nhất cho pic có chiều cao gấp 2-3 lần đường nền ở tất cả 3 lần sắc ký. LOQ là nồng độ cho pic có chiều cao gấp 10 lần đường nền ở tất cả 3 lần sắc ký. 2.2.5. Thẩm định độ đúng Đánh giá tỷ lệ phục hồi của dãy nồng độ trong khoảng tuyến tính đã phân tích. Tỷ lệ phục hồi được tính bằng tỷ lệ phần trăm giữa nồng độ xác định được từ thực nghiệm so với nồng độ dung dịch chuẩn. 2.2.6. Thẩm định độ chính xác Độ lặp lại: tiến hành phân tích 3 mẫu có nồng độ 100, 60 và 10 µg/ml, mỗi mẫu 3 lần trong cùng một ngày. Xác@ địnhSchool giá trị ofRSD Medicine giữa các lần đoand. Pharmacy, VNU 15
  26. Độ chính xác trung gian: tiến hành phân tích 3 mẫu có nồng độ 100, 60 và 10 µg/ml, mỗi mẫu 3 lần trong 3 ngày khác nhau. Xác định giá trị RSD giữa các lần đo. 2.2.7. Định lượng citral trong tinh dầu sả chanh Chuẩn bị các mẫu tinh dầu để định lượng. Cân chính xác khoảng 0,123 mg tinh dầu cho vào bình định mức 10 ml, thêm ACN đến vạch, siêu âm 1 phút và lọc qua màng PTFE 0,2 μm. Pha loãng dung dịch trên theo tỉ lệ thích hợp trong dung môi ACN : H2O (60:40, v/v) rồi tiêm vào hệ thống sắc ký. Xác định diện tích pic dưới đường cong (AUC) dựa vào đường chuẩn định lượng và hệ số pha loãng để xác định hàm lượng neral, geranial và citral toàn phần trong mẫu tinh dầu. Kết quả định lượng chỉ có giá trị đối với mẫu được phân tích. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 16
  27. CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Xác định điều kiện phân tích 3.1.1. Khảo sát các hệ dung môi Tiến hành sắc ký dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml tại bước sóng 233 nm (tham khảo nghiên cứu của Gaonkar và cộng sự) [49], sử dụng cột silica gel pha đảo C18 (5 µm, 120 Å, 4,6×250 nm), tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl, thời gian sắc ký 25 phút. Khảo sát hai hệ dung môi: hệ dung môi ACN : MeOH : H2O = 47 : 10 : 43 (v/v/v) và hệ dung môi ACN : H2O = 70 : 30 (v/v). Kết quả thu được như sau: Hệ dung môi ACN : H2O = 70 : 30 (v/v) Hình 3.1. Sắc ký đồ của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml tại bước sóng 233 nm, hệ dung môi ACN : H2O = 70 : 30 (v/v/v) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 17
  28. Bảng 3.1. Thông số pic của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml tại bước sóng phát hiện 233 nm với hệ dung môi ACN : H2O = 70 : 30 (v/v) STT Tên pic Thời gian As Hệ số Số đĩa lý lưu (phút) phân giải thuyết 1 Neral 6,243 1,07 6928 0,88 2 Geranial 6,527 1,32 5659 Tại pha động ACN : H2O = 70 : 30 (v/v), hai pic neral và pic geranial không tách nhau hoàn toàn, khả năng phân tách của hai pic kém và không đạt yêu cầu (yêu cầu Rs >1). Hệ dung môi ACN : MeOH : H2O = 47 : 10 : 43 (v/v/v) Hình 3.2. Sắc ký đồ của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml tại bước sóng phát hiện 233 nm với hệ dung môi ACN : MeOH : H2O = 47 : 10 : 43 (v/v/v) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 18
  29. Bảng 3.2. Thông số pic của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml tại bước sóng phát hiện 233 nm với hệ dung môi ACN : MeOH : H2O = 47 : 10 : 43 (v/v/v) STT Tên pic Thời gian As Hệ số Số đĩa lý lưu (phút) phân giải thuyết 1 Neral 11,017 1,02 13985 2,54 2 Geranial 12,090 1,13 13997 Khi sử dụng pha động ACN : MeOH : H2O tỷ lệ 43 : 47 : 10 (v/v/v), hai pic neral và geranial tách hoàn toàn khỏi nhau, hệ số phân tách của 2 pic tốt, hệ số bất đối xứng của các pic đều gần 1 và số đĩa lý thuyết lớn. Từ các kết quả thực nghiệm, lựa chọn được hệ dung môi pha động là ACN : MeOH : H2O tỷ lệ 43 : 47 : 10 (v/v/v). 3.1.2. Xác định bước sóng hấp thụ Tiến hành sắc ký dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml với hệ pha động xác định được ở trên. Quét phổ hấp thụ trong khoảng 190-300 nm để tìm bước sóng hấp thụ cực đại. Kết quả cho thấy bước sóng hấp thụ cực đại của neral là 241,99 nm nhỏ hơn bước sóng hấp thụ cực đại của geranial là 242,90 nm. Để đơn giản hóa phương pháp, chọn bước sóng phát hiện là 242 nm cho cả hai đồng phân. Hình 3.3. Phổ hấp thụ UV-VIS @ của School Neral (A) of và Medicine Geranial (B) and Pharmacy, VNU 19
  30. 3.1.3. Điều kiện sắc ký Như vậy đã chọn được điều kiện sắc ký là pha tĩnh cột silica gel pha đảo C18 (4,6 x 250mm, 5µm), pha động là hỗn hợp H2O : ACN : CH3OH với tỷ lệ 43 : 47 : 10 (v/v/v), tốc độ dòng 1 ml/phút. Mẫu được tiêm với thể tích 10 µl, thời gian sắc ký 25 phút. Hệ thống sử dụng đầu dò DAD với bước sóng phát hiện với cả 2 đồng phân neral và geranial là 242 nm. Hình 3.4. Sắc ký đồ của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml trong điều kiện sắc ký được lựa chọn Bảng 3.3. Thông số các pic của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml trong điều kiện sắc ký được lựa chọn STT Tên pic Thời gian As Hệ số Độ tinh Số đĩa lý lưu (phút) phân giải khiết thuyết 1 Neral 11,013 1,06 999 14217 2,73 2 Geranial 12,073 1,1 990 14059 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 20
  31. 3.2 . Tính đặc hiệu Tiến hành sắc ký dung dịch geraniol 5µg/ml trong điều kiện đã xác định như đối với citral, quét phổ hấp thụ của dung dịch trong khoảng 190-300 nm tìm được bước sóng hấp thụ cực đại của geraniol là 200 nm. Hình 3.5. Phổ hấp thụ cực đại UV-VIS của geraniol Tiến hành sắc ký dung dịch chứa đồng thời 20µg/ml citral và 5µg/ml geraniol với các bước sóng phát hiện 200 và 242 nm. Sắc ký đồ tại các bước sóng trên được thể hiện lần lượt trong hình 3.6 và hình 3.7. Hình 3.6. Sắc ký đồ của dung dịch chứa 20 µg/ml citral và 5 µg/ml geraniol tại bước sóng @phát School hiện 200 nmof Medicine and Pharmacy, VNU 21
  32. Hình 3.7. Sắc ký đồ của dung dịch chứa 20 µg/ml citral và 5 µg/ml geraniol tại bước sóng phát hiện 242 nm Bảng 3.4. Thông số các pic của dung dịch citral 20 µg/ml và dung dịch geraniol 5 µg/ml tại bước sóng phát hiện 200 nm Hệ số Thời gian Độ tinh Số đĩa lý Tên pic As phân lưu (phút) khiết thuyết giải Geraniol 9,360 1,12 4,78 996 13967 Neral 11,017 1,25 2,68 999 13568 Geranial 12,090 1,26 990 12909 Kết quả cho thấy tạp geraniol không hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 242 nm. Ở 200 nm, geraniol cho pic có thời gian lưu 9,360 phút, tách hoàn toàn khỏi các pic neral và geranial. Hệ số phân giải giữa pic geraniol và pic neral là 4,78. Các pic đều tinh khiết với độ tương xứng lớn. Suy ra phương pháp đảm bảo tính đặc hiệu. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 22
  33. 3.3. Tính tuyến tính và miền giá trị Chuẩn bị các dung dịch citral có nồng độ lần lượt là: 100, 60, 10 µg/ml pha trong pha động; khi đó đồng phân neral (hay geranial) có nồng độ lần lượt là: 50, 30, 5 µg/ml. Tiến hành sắc ký các dung dịch trên. 3.3.1. Đối với đồng phân neral Phân tích mối tương quan giữa diện tích pic y (mAu.min) và nồng độ dung dịch (µg/ml) của đồng phân neral. Kết quả thu được như sau: Bảng 3.5. Kết quả phân tích hồi quy mối tương quan giữa nồng độ dung dịch và diện tích pic của đồng phân neral STT Nồng độ lý dung dịch (µg/ml) Diện tích pic (mAU.min) 1 50 17,07 2 40 13,92 3 30 10,29 4 20 6,32 5 5 1,05 Khoảng định lượng 5 – 50 µg/ml Độ lệch chuẩn S (se slope) 0,369823 R2 0,9989 Phương trình hồi quy y = 0,3619x - 0,7782 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 23
  34. Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn sự tương quang giữa nồng độ dung dịch và diện tích pic của đồng phân neral Phương trình hồi quy đối với đồng phân neral là y = 0,3619x - 0,7782, hệ số xác định R2 = 0,9989 và độ lệch chuẩn S = 0,369823. Qua trắc nghiệm Fischer, phương trình được chứng minh là tương thích (Phồi quy = 1,56E-05 < 0,05). Qua trắc nghiệm Student, hệ số a có ý nghĩa về mặt thống kê (P = 1,56E-05 < 0,05), hệ số b có ý nghĩa về mặt thống kê (P = 0,042565 < 0,05). Như vậy, trong khoảng nồng độ từ 5 – 50 µg/ml, có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ dung dịch neral. Độ lệch của các giá trị thực nghiệm với giá trị hồi quy rất gần với 0 chứng tỏ khoảng tin cậy của phương trình hồi quy hẹp. 3.3.2. Đối với đồng phân geranial Phân tích mối tương quan giữa diện tích pic y (mAu.min) và nồng độ dung dịch (µg/ml) của đồng phân geranial. Kết quả thu được như sau: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 24
  35. Bảng 3.6. Kết quả phân tích hồi quy mối tương quan giữa nồng độ dung dịch và diện tích pic của đồng phân geranial STT Nồng độ dung dịch (µg/ml) Diện tích pic (mAU.min) 1 50 24,98 2 40 9,46 3 30 14,86 4 20 19,54 5 5 1,69 Khoảng định lượng 5 – 50 µg/ml Độ lệch chuẩn S (se slope) 0,420443 R2 0,9996 Phương trình hồi quy y = 0,5153x - 0,838 Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn sự tương quang giữa nồng độ dung dịch và diện tích pic của đồng phân geranial @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 25
  36. Phương trình hồi quy đối với đồng phân geranial là y = 0,5153x - 0,838, hệ số xác định R2 = 0.9996 và độ lệch chuẩn S = 0.420443. Qua trắc nghiệm Fischer, phương trình được chứng minh là tương thích (Phồi quy = 2,92E-06 < 0,05). Qua trắc nghiệm Student, hệ số a có ý nghĩa về mặt thống kê (P = 2,92E-06 < 0,05), hệ số b có ý nghĩa về mặt thống kê (P = 0,020517< 0,05). Như vậy, trong khoảng nồng độ từ 5 – 50 µg/ml, có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ dung dịch geranial. Độ lệch của các giá trị thực nghiệm với giá trị hồi quy rất gần với 0 chứng tỏ khoảng tin cậy của phương trình hồi quy hẹp. 3.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Xác định LOD và LOQ bằng phương pháp pha loãng theo mô tả trong mục 2.2.4. Kết quả thu được như sau: LOD và LOQ của neral lần lượt là 0,10 và 0,33 µg/ml; LOD và LOQ của geranial lần lượt là 0,30 và 1,00 µg/ml. 3.5. Độ đúng Tỷ lệ phục hồi được tính bằng tỷ lệ phần trăm giữa nồng độ xác định được từ thực nghiệm so với nồng độ dung dịch chuẩn. Kết quả thu được như sau: 3.5.1. Đối với đồng phân neral Bảng 3.7. Kết quả xác định tỷ lệ phục hồi của đồng phân neral STT Nồng độ dung dịch Nồng độ thực nghiệm Tỷ lệ phục hồi (µg/ml) (µg/ml) 1 50 49,32 98,10 2 40 40,61 101,10 3 30 30,58 101,60 4 20 19,61 98,10 5 5 5,05 101,00 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 26
  37. Phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng đối với neral với các giá trị của độ phục hồi đều nằm trong khoảng 100±2%. 7.5.2. Đối với đồng phân geranial Bảng 3.8. Kết quả xác định tỷ lệ phục hồi của đồng phân geranial STT Nồng độ dung dịch Nồng độ thực nghiệm Tỷ lệ phục hồi (µg/ml) (µg/ml) 1 50 50,10 99,40 2 40 39,55 98,40 3 30 30,46 101,70 4 20 19,98 101,20 5 5 4,91 98,10 Phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng đối với geranial với các giá trị của độ phục hồi đều nằm trong khoảng 100±2%. 3.6. Độ lặp lại Chuẩn bị các dung dịch citral có nồng độ lần lượt là: 100, 60, 10 µg/ml pha trong pha động; khi đó đồng phân neral (hay geranial) có nồng độ lần lượt là: 50, 30, 5 µg/ml. Tiến hành sắc ký mỗi mẫu ba lần. Kết quả thu được như sau: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 27
  38. 3.6.1. Đối với đồng phân neral Hình 3.10. Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp đối với đồng phân neral STT Nồng độ dung Diện tích pic Diện tích SD RSD dịch (µg/ml) (mAU.min) pic trung (%) bình (mAU.min) 15,72 1 50 15,20 15,32 0,35 2,29 15,05 10,23 2 30 10,01 10,24 0,24 2,34 10,49 0,98 3 5 1,02 0,99 0,02 2,08 0,99 Kết quả cho thấy RSD giữa các lần đo đối với neral đều nhỏ hơn 2,34%. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 28
  39. 3.6.2. Đối với đồng phân geranial Bảng 3.9. Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp đối với đồng phân geranial STT Nồng độ dung Diện tích pic Diện tích SD RSD dịch (µg/ml) (mAU.min) pic trung (%) bình (mAU.min) 24,98 1 50 25,17 25,12 0,13 0,50 25,22 11,33 2 30 11,27 11,38 0,14 1,24 11,54 1,98 3 5 1,87 1,91 0,05 2,48 1,96 Kết quả cho thấy RSD giữa các lần đo đối với geranial đều nhỏ hơn 2,48%. 3.7. Độ chính xác trung gian Chuẩn bị các dung dịch citral có nồng độ lần lượt là: 100, 40, 20 µg/ml pha trong dung dịch pha động; khi đó đồng phân neral (hay geranial) có nồng độ lần lượt là 50, 20, 10 µg/ml. Tiến hành sắc ký mỗi mẫu ba lần. Lặp lại thí nghiệm trong ba ngày khác nhau. Kết quả thu được như sau: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 29
  40. 3.7.1. Đối với đồng phân neral Bảng 3.10. Kết quả xác định độ chính xác trung gian của phương pháp đối với đồng phân neral STT Nồng độ Ngày Diện tích pic Diện tích pic SD RSD dung (mAU.min) trung bình (%) dịch (mAU.min) (µg/ml) 1 15,94 1 50 2 15,20 15,75 0,48 3,05 3 16,10 1 6,34 2 20 2 5,98 6,16 0,18 2,92 3 6,17 1 2,09 3 10 2 1,97 2,04 0,06 3,00 3 2,05 Kết quả cho thấy giá trị RSD đối với neral đều nhỏ hơn 3,05% @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 30
  41. 3.7.2. Đối với đồng phân geranial Bảng 1. Kết quả xác định độ chính xác trung gian của phương pháp đối với đồng phân geranial STT Nồng độ Ngày Diện tích pic Diện tích pic SD RSD dung (mAU.min) trung bình (%) dịch (mAU.min) (µg/ml) 1 28,29 1 50 2 28,98 28,76 0,41 1,42 3 29,01 1 8,97 2 20 2 8,47 8,77 0,27 3,06 3 8,89 1 3,04 3 10 2 3,12 3,05 0,07 2,31 3 2,98 Kết quả cho thấy giá trị RSD đối với geranial đều nhỏ hơn 3,05% 3.8. Định lượng citral trong một số mẫu tinh dầu sả chanh 3.8.1. Sản phẩm A Pha loãng dung dịch mẹ 125 lần trong dung môi ACN : H2O (60:40, v/v) thu được dung dịch có nồng độ tinh dầu là 100 µg/ml. Sắc ký dung dịch trên. Kết quả thể hiện trong hình 3.11: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 31
  42. Hình 3.11. Sắc ký đồ dung dịch mẫu A nồng độ 100 µg/ml Trên sắc ký đồ ghi nhận được sự xuất hiện của 2 pic: Pic 1 có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của neral. Diện tích pic là 8,231 mAU.min tương ứng với nồng độ 24,85 µg/ml. Như vậy mẫu A chứa 24,85% neral. Pic 2 có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của geranial. Diện tích pic là 10,138 mAU.min tương ứng với nồng độ 21,54 µg/ml. Như vậy mẫu A chứa 21,54% geranial. Như vậy tổng hàm lượng citral trong mẫu A là 46,39 µg/ml, tương đương với 46,39%. 3.8.2. Sản phẩm B Pha loãng dung dịch mẹ 125 lần trong dung môi ACN : H2O (60:40, v/v) thu được dung dịch có nồng độ tinh dầu là 100 µg/ml. Sắc ký dung dịch trên. Kết quả thể hiện trong hình 3.12: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 32
  43. Hình 3.12. Sắc ký đồ dung dịch mẫu B nồng độ 100 µg/ml Trên sắc ký đồ ghi nhận được sự xuất hiện của 2 pic: Pic 1 có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của neral. Diện tích pic là 12,793 mAU.min tương ứng với nồng độ 37,35 µg/ml. Như vậy mẫu B chứa 37,35% neral. Pic 2 có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của geranial. Diện tích pic là 17,738 mAU.min tương ứng với nồng độ 35,96 µg/ml. Như vậy mẫu B chứa 35,96% geranial. Như vậy tổng hàm lượng citral trong mẫu B là 73,31 µg/ml, tương đương với 73,31%. 3.8.3. Sản phẩm C Pha loãng dung dịch mẹ 150 lần trong dung môi ACN : H2O (60:40, v/v) thu được dung dịch có nồng độ tinh dầu là 50 µg/ml. Sắc ký dung dịch trên trong điều kiện đã chọn. Kết quả thể hiện trong hình 3.13: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 33
  44. Hình 3.13. Sắc ký đồ dung dịch mẫu C nồng độ 50 µg/ml Trên sắc ký đồ ghi nhận được sự xuất hiện của 2 pic: Pic 1 có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của neral. Diện tích pic là 6,017 mAU.min tương ứng với nồng độ 18,78 µg/ml. Như vậy mẫu C chứa 37,56% neral. Pic 2 có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của geranial. Diện tích pic là 8,795 mAU.min tương ứng với nồng độ 18,69 µg/ml. Như vậy mẫu C chứa 37,38% geranial. Như vậy tổng hàm lượng citral trong mẫu C là 36,47 µg/ml, tương đương với 74,94%. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 34
  45. 3.8. Bàn luận So sánh phương pháp xây dựng với một số phương pháp định lượng citral Bảng 3.11. So sánh một số phương pháp định lượng citral R2 Tỷ lệ RSD RSD LOD LOQ Thông số phục của của độ (µg/ml) (µg/ml) hồi độ lặp chính (%) lại xác (%) trung gian Phương pháp (RSD %) NIR [17] _ 100±2 _ ≤ 1,00 _ _ Pha thuận [50] 0,99 100±2 ≤ 1,37 _ _ _ Pha đảo, sử dụng hệ dung môi ACN Neral 0,99 0,062 0,205 : H2O = 70 : 30, tốc độ dòng là 1 100±2 ≤ 1,74 ≤ 1,93 ml/phút, thể tích tiêm mẫu là 15 µl, bước sóng phát Geranial 0,99 0,059 0,198 hiện là 233nm, miền giá trị 3-100 HPLC µg/ml citral [49] Pha đảo, hệ dung môi ACN : H2O : Neral 0,99 _ _ _ _ _ CH3OH=47:43:10 , tốc độ dòng 1,4 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 15 µl , bước sóng phát hiện là 240 nm, Geranial 0,99 _ _ _ _ _ miền giá trị 50-90 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 35
  46. µg/ml citral [51] Phương pháp xây dựng: pha đảo, hệ Neral 0,99 100±2 ≤ 2,34 ≤ 3,05 0,10 0,33 dung môi ACN : H2O:CH3OH = 47 : 43 :10 , tốc độ dòng là 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl , bước sóng Geranial 0,99 100±2 ≤ 2,48 ≤ 3,06 0,30 1,00 phát hiện là 240 nm, miền giá trị là 10 - 100 µg/ml citral Chú thích: ( - ) chưa xác định. Từ bảng kết quả so sánh cho thấy phương pháp xây dựng có độ chính xác, độ lặp lại thấp hơn so với các phương pháp khác. Tuy nhiên phương pháp xây dựng lại có các ưu điểm vượt trội hơn như: - So với phương pháp NIR: phương pháp xây dựng hiện đại hơn, có khả năng định lượng đồng thời 2 đồng phân của citral và tiến hành xác định được thêm các thông số (độ lặp lại, LOD và LOQ). - So với phương pháp HPLC pha thuận: phương pháp xây dựng có khả năng định lượng đồng thời 2 đồng phân của citral và có tính đặc hiệu hơn, tiến hành xác định được thêm các thông số (độ chính xác trung gian, LOD và LOQ). - So với các phương pháp HPLC pha đảo khác: phương pháp xây dựng xác định đầy đủ được các thông số (tỷ lệ phục hồi, độ chính xác trung gian, độ lặp lại, LOD, LOQ) và có miền giá trị rộng. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 36
  47. Như vậy phương pháp xây dựng có những ưu điểm nổi bật: có khả năng tách các chất ra hoàn toàn nên tính đặc hiệu cao, độ chính xác cao và nhạy với các nồng độ nhỏ. Chất lượng của các mẫu tinh dầu sả chanh Qua kết quả định lượng citral trong ba sản phẩm tinh dầu sả chanh trên thị trường. Kết quả xác định được hàm lượng citral trong các sản phẩm tương đương với hàm lượng citral ghi trên nhãn bao bì sản phẩm. Sản phẩm A và B có hàm lượng citral lần lượt là 73,31% và 74,94%, đạt yêu cầu chất lượng về hàm lượng citral trong tinh dầu sả chanh. Sản phẩm C có hàm lượng citral thấp (46,39%), không đạt yêu cầu chất lượng về hàm lượng citral trong tinh dầu sả chanh. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 37
  48. CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Dựa trên các tài liệu về thẩm định quy trình phân tích của ICH, nghiên cứu này đã xây dựng và thẩm định thành công quy trình định lượng đồng thời hai đồng phân hình học của citral bằng hệ thống HPLC - DAD với các thông số: pha tĩnh là silicagel C18 trong cột 5 μm, 4,6×250 mm, pha động nước : acetonitril : nước : methanol tỷ lệ 43 : 47 : 10, thể tích tiêm mẫu là 10 µl, thời gian sắc ký là 25 phút, tốc độ dòng 1 ml/phút, đầu dò DAD tại bước sóng 242 nm. Bằng các quá trình thực nghiệm đã chứng tỏ được quy trình định lượng đồng thời hai đồng phân hình học của citral đạt các yêu cầu về tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ đúng và độ chính xác (bảng 4.1 và bảng 4.2) theo hướng dẫn chung của ICH. - Đối với neral Bảng 4.1. Các yêu cầu đảm bảo quy trình định lượng đối với neral Miền giá trị 5 – 50 µg/ml Tính tuyến tính y = 0,3619x - 0,7782 Hệ số tương quan R2 0,9989 Độ đúng 100±2% Độ lặp lại RSD ≤ 2,34% Độ chính xác trung gian RSD ≤ 3,05% Độ lệch chuẩn S 0,369823 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 38
  49. - Đối với geranial Bảng 4.2. Các yêu cầu đảm bảo quy trình định lượng đối với geranial Miền giá trị 5 – 50 µg/ml Tính tuyến tính y = 0,5153x - 0,838 Hệ số tương quan R2 0,9996 Độ đúng 100±2% Độ lặp lại RSD ≤ 2,48% Độ chính xác trung gian RSD ≤ 3,06% Độ lệch chuẩn S 0,420443 Phương pháp được ứng dụng để định lượng citral trong 3 mẫu tinh dầu sả chanh trên thị trường. 4.2. Kiến nghị Ứng dụng phương pháp để góp phần vào việc kiểm soát chất lượng tinh dầu sả chanh trên thị trường. Phương pháp cũng là cơ sở để lựa chọn nguyên liệu bào chế các sản phẩm chống côn trùng từ tinh dầu sả chanh. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 39
  50. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  51. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Bộ Y tế (2012), Kiểm nghiệm thuốc (dùng cho đào tạo dược sĩ đai học), Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam, pp.135-184. [2] Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hoá học và vi sinh vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật,pp.10-59. [3] Vụ khoa học và đào tạo – Bộ Y tế (2005), Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB Y học, pp.68-84. Tiếng anh [4] Adams, R. Identification of Essential Oils Compounds by Gas Chromatography – Mass Spectroscopy. Allured Publishing Co. : IL, 1997. [5] Barbier; Bouveault. Comp. Rend. 1894, 118, 983, 1050 ; 1895, 121, 1159; 1896, 122, 293. [6] Bassolé, I. H., A. Lamien-Meda, B. Bayala, L.C. Obame, A. J. Ilboudo, C. Franz, J. Novak, R. C. Nebié, M. H. Dicko, 2011. Phytomedicine, 18(12): 1070-1074. [7] Bermejo, P.; Abad, M.; Silvon Sen, A.; Sonchez Contreras, S.; Diaz lanza, A. Life Sci. 1998, 63, 1147- 1156. [8] Bertram. Schimmel’s Report. 1888, 17. [9] Bilal Yilmaz, Emrah Alkan (2015), “Spectrofluorometric and Spectrofluorometric and UV Spectrofluorometric Methods for the [10] Chenghan Mei, Bin Li, et al (2015), "Liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantification of flurbiprofen in human plasma and its application in a study of bioequivalence", Journal of Chromatography B, 993-994, pp.69-74. [11] Determination of Flurbiprofen in Pharmaceutical Preparations”, Journal of Pharmaceutical Analysis, 4(4). [12] Dodge. Amer. Chem J. 1890, 12, 553. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  52. [13] Epstein, W.; McGee, L.; Poulter,C.; Marsh, J. Chem. Eng. Data. 1976, 21, 500. [14] European Medicines Agency (2011), Guideline on bioanalytical method validation, pp.9-10. [15] Fenaroli, G., Furia, T.E., Bellanca, N., Handbook of Flavor Ingredients, ISBN 0-87819-532-7 [16] Gbenou, J. D., J. F. Ahounou, H. B. Akakpo, A. Laleye, E. Yayi, F. Gbaguidi, L. BabaMoussa, R. Darboux, P. Dansou, M. Moudachirou, S. O. Kotchoni, 2013. Molecular Biology Reports, 40 (2): 1127-1134. [17] Hattori, T.; Ito, M.; Suzuki, Y. Nippon Yakurigaku Zasshi. 1991, 97, 13-21. [18] Husek, P.; Mack, K. J. Chromatgr. 1975, 133, 139-230. [19] Jennings, W.; Shibamoto, T. Qualitative Analysis of Flavor and Fragrance Volatile by Capillary Gas Chromatography. Academic Press: New York, 1980. [20] Joulain, D.; Konig, A.; Verlag, E. The Atlas of Spectral Data of Sesquiterpene Hydrocarbons Hamburg, Germany, 1998. [21] Khan, M. S., I. Ahmad, 2012. Journal of Ethnopharmacology, 140 (2): 416-423. [22] Kokane Vikrant , Naik Sonali (2014), “Formulation and evaluation of topical flurbiprofen gel using different gelling agents”, World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3(9),pp. 654-663. [23] Kruger; Stiehl; Tiemann. J. Pr. Chem. 1898, 58, 51; 1899, 59, 497. [24] Kuwahara, Y., Suzuki, H., Matsumoto, K. & Wada, Y. (1983). “Pheromone study on acarid mites. XI. Function of mite body as geometrical isomerization and reduction of citral (the alarm pheromone) Carpoglyphus lactis”. Appl. Entomol. Zool. 18: 30–39. [25] Lawless, J., The Illustrated Encyclopedia of Essential Oils, ISBN 1- 85230-661-0 [26] Libbey, L.; Essent, J. Oil Res. 1991, 3, 192. [27] Maíra Maciel Mattos de Oliveiraa, Danilo Florisvaldo Brugneraa, Maria das Graças Cardosob, Eduardo Alvesc and Roberta Hilsdorf Piccoli, 2010. Food Control, 2010. 21(4): 549-553. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  53. [28] Motoo, Y.; Sawabu, N. Cancer Lett. 1994, 86, 91-95. [29] Murray, Kermit K., et al (2013), "Definitions of terms relating to mass spectrometry (IUPAC Recommendations 2013)", Pure and Applied Chemistry, 85(7),1515-1609. [30] Onawunmi, G.O. (1989). “Evaluation of the antimicrobial activity of citral”. Lett. Appl. Microbial. 9 (3): 105–108 [31] Pala-Paul, J.; Perez-Alonso, M.; Velasco-Negueruela, A.; Sanz, J. “Analysis by Gas Chromatography – Mass Spectroscopy of the Volatile Components of Ageratina Adenophora Spreng., Growing in the Canary Islands.” J. of Chromatography. 2002, 947, 327-331. [32] Parry, E.J. The Chemistry of Essential Oils and Artificial Perfumes. 4th Ed.; Scott, Greenwood and Son: London, UK, 1921; Vol. 1, pp 63, 270, 71-73, 270 [33] Robacker, D.C. & Hendry, L.B. (1977). “Neral and geranial: components of the sex pheromone of the parasitic wasp, Itoplectis conquisitor”. J. Chem. Ecol. 3 (5): 563–577 [34] Schimelpfenig, C.W. J. Chem. Ed. 1978, 55, 306. [35] Semmler, F. W. Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1891, 24, 201. [36] Semmler, F.W. Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1890, 23, 2965-3556. [37] Simonsen, J.L. The Terpenes. 2nd Ed. Cambridge University Press: Cambridge, 1947; Vol. 1, pp 42 - 45, 70 - 85. [38] Singh, P., R. Shukla, A. Kumar, B. Prakash, S. Singh, N. K. Dubey, 2010. Mycopathologia, 170(3): 195-202. [39] Sofowora, A. Medicinal Plants and Traditional Medicine in Africa. John Wiley & Sons Inc. : New York, 1982; pp 71-72. [40] Survey and health assessment of chemical substances in massage oils Archived 28 June 2007 at the Wayback Machine [41] Swinger, A.; Silverstein, R. Aldrich Chemical Co. Milwaukee, WI, 1981. [42] The Europaean Pharmacopieal Commission (2010), Pharmacopoeia Europaea 7th Edition vol 2, pp.2056-2057. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  54. [43] The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1), pp.6-13. [44] Tiemann. Ber. DTSCH. Chem. Ges. 1899, 32, 117. [45] Wilson, C.M. Grass and People. University of Florida Press: Gainesville, 1961; pp 75. [46] Wilson, N.; Ivanova, M.; Watt, R.; Moffat, A. “The quantification of Citral in Lemon Grass and Lemon Oils by Near-Infrared Spectroscopy.” The Journal of Pharmacy And Pharmacology. 2002, 54, 1257-1263. [47] Xiuqin, L.; Jia, Y.; Song, A.; Chen, X. ; Bi, K. “Analysis of the Essential Oil from Radix Bupleuri Using Capillary Gas Chromatography.” The Pharmaceutical Society of Japan. 2005, 125, 815-819. [48] Zeitshel. Ibid. 1906, 39, 1787. [49] Gaonkar, R., Yallappa, S., Dhananjaya, B. L., & Hegde, G. (2016). Development and validation of reverse phase high performance liquid chromatography for citral analysis from essential oils. Journal of Chromatography B, 1036-1037, 50–56. [50] Rauber, C.; Guterres, S.; Schapoval, E. “LC Determination of Citral in Cymbopogon Citratus Volatile Oil.” J. of Pharmaceutical And Biomedical Analysis. 2004, 37, 597-601. [51] Miron, D., Battisti, F., Schwengber Ten Caten, C., Mayorga, P., & Eva Scherman Schapoval, E. (2012). Spectrophotometric Simultaneous Determination of Citral Isomers in Cyclodextrin Complexes with Partial Least Squares Supported Approach. Current Pharmaceutical Analysis, 8(4), 401–408. Trang web [52] 2005 [53] 2005. [54] and-Physical-Properties @ School of Medicine and Pharmacy, VNU