›

Khóa luận Xây dựng quy trình chiết xuất cao chuẩn hoá giàu saponin và tinh chế saponin từ củ tam thất Panax pseudoginseng (Burk) F.H.Chen

pdf 56 trang thiennha21 18/04/2022 5001
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Xây dựng quy trình chiết xuất cao chuẩn hoá giàu saponin và tinh chế saponin từ củ tam thất Panax pseudoginseng (Burk) F.H.Chen", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_xay_dung_quy_trinh_chiet_xuat_cao_chuan_hoa_giau_s.pdf

Nội dung text: Khóa luận Xây dựng quy trình chiết xuất cao chuẩn hoá giàu saponin và tinh chế saponin từ củ tam thất Panax pseudoginseng (Burk) F.H.Chen

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGÔ HẢI HÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO CHUẨN HOÁ GIÀU SAPONIN VÀ TINH CHẾ SAPONIN TỪ CỦ TAM THẤT PANAX PSEUDOGINSENG (BURK.) F.H.CHEN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2021
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC Người thực hiện: NGÔ HẢI HÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO CHUẨN HOÁ GIÀU SAPONIN VÀ TINH CHẾ SAPONIN TỪ CỦ TAM THẤT PANAX PSEUDOGINSENG (BURK.) F.H.CHEN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa: QH.2016.Y Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Văn Khanh TS. Đào Thị Thanh Hiền Hà Nội - 2021
  3. LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các thầy cô giáo thuộc Ban Chủ nhiệm, các phòng ban trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã dìu dắt, giúp đỡ trong suốt năm năm học tập, sinh hoạt và rèn luyện trên ghế nhà trường và tạo điều kiện cho em hoàn thành khoá luận tốt nghiệp. Đồng thời em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới Thạc sĩ Nguyễn Văn Khanh – giảng viên bộ môn Bào chế và công nghệ dược phẩm trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, cùng tiến sĩ Đào Thị Thanh Hiền là người đã trực tiếp tận tình chỉ bảo và hướng dẫn em trong khoảng thời gian thực hiện đề tài. Đồng thời, em xin cảm ơn các thầy cô trong bộ Bào chế và công nghệ dược phẩm thuộc Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã tạo điều kiện để em có thể thực hiện khóa luận này. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn luôn động viên và giúp đỡ em trong lúc khó khăn cũng như trong quá trình thực hiện khóa luận này. Hà Nội, tháng 6 năm 2021 Sinh viên Ngô Hải Hà
  4. MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về cây tam thất ( Panax Pseudoginseng) 3 1.1.1. Tên khoa học của cây tam thất 3 1.1.2. Phân bố của cây tam thất 3 1.1.3. Đặc điểm thực vật của cây tam thất 4 1.1.4. Thành phần hoá học của cây tam thất 5 1.1.5. Tác dụng dược lý của cây tam thất 8 1.1.6. Tam thất trong y học cổ truyền 11 2.2. Các phương pháp chiết xuất và tinh chế saponin từ tam thất 12 2.2.1. Nguyên tắc chung 12 2.2.2. Các phương pháp chiết xuất saponin toàn phần từ tam thất 13 2.2.3. Các phương pháp tinh chế saponin từ tam thất 14 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1. Đối tượng và nguyên vật liệu thí nghiệm 16 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.2. Nguyên liệu, hoá chất 16 2.1.3. Máy móc, dụng cụ 17 2.2. Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Rb1 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 18 2.2.2. Quy trình chiết xuất và tinh chế saponin 20 2.2.3. Xác định cấu trúc và độ tinh khiết của các saponin tinh chế được 22 2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu 22 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ 23 3.1. Thẩm định phương pháp định lượng R1, Rg1 và Rb1 trong tam thất bằng phương pháp HPLC 23
  5. 3.1.1. Độ đặc hiệu của phương pháp 23 3.1.2. Tính thích hợp của hệ thống 25 3.1.3. Độ tuyến tính và khoảng nồng độ 26 3.1.4. Độ lặp lại 27 3.1.5. Độ đúng 28 3.2. Định lượng saponin toàn phần trong mẫu củ tam thất 29 3.3. Chiết xuất saponin toàn phần từ củ tam thất 30 3.4. Tinh chế saponin trong mẫu củ tam thất 32 3.4.1. Tinh chế saponin toàn phần 32 3.4.2. Tinh chế saponin điển hình bằng sắc ký lỏng đầu dò PDA 33 3.5. Xác định cấu trúc và độ tinh khiết của các saponin tinh chế được 34 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 37 4.1. Về phương pháp định lượng notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Rb1 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 37 4.2. Về quy trình chiết xuất và tinh chế saponin 37 4.3. Về quy trình xác định cấu trúc và độ tinh khiết của các saponin tinh chế được 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41 1. Kết luận 41 2. Đề xuất 41
  6. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt, ký hiệu Tên đầy đủ Panax pseudoginseng (Burk.) F. H. Chen 1 PPG hay còn được gọi là panax notoginseng 2 PNS Panax notoginseng saponin 3 ESI Ion hoá tia điện 4 HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao 5 DAD Đầu dò mảng diod 6 TB Trung bình 7 SD Độ lệch chuẩn 8 RSD Độ lệch tương đối 9 AOAC Hiệp hội các nhà phân tích hoá học chính thống 10 PDA Màng quang Điot
  7. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 2.1 Nguyên liệu và hoá chất 16 Bảng 2.2 Máy móc và dụng cụ 17 Bảng 3.1 Kết quả đánh giá tính thích hợp của hệ thống 26 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát độ tuyến tính 27 Bảng 3.3 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp 28 Bảng 3.4 Độ đúng của phương pháp 29 Bảng 3.5 Kết quả định lượng hàm lượng R1, Rg1 và Rb1 trong củ 30 tam thất Bảng 3.6 Kết quả chiết xuất saponin của ba phương pháp chiết 31 Bảng 3.7 Kết quả chiết xuất saponin từ củ tam thất thông qua chiết 32 nóng Bảng 3.8 Kết quả tinh chế saponin toàn phần 32 Bảng 3.9 Kết quả hàm lượng R1, Rg1 và Rb1 trong mẫu cao giàu 33 saponin Bảng 3.10 Khối lượng saponin S1 và S2 thu được 34
  8. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Hình ảnh cây và củ Panax pseudoginseng (Burkill) F. H. 4 Chen Hình 1.2 Cấu trúc phân tử notoginsenosid R1 và ginsenosid Rb1 6 Hình 1.3 Cấu trúc phân tử ginsenosid Rg1 và ginsenosid Rd 6 Hình 1.4 Cấu trúc phân tử ginsenosid Re 6 Hình 2.1 Mẫu củ tam thất Panax pseudoginseng (Burk.) F.H. Chen 16 Hình 3.1 Sắc ký đồ mẫu chuẩn R1 23 Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Rg1 23 Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Rb1 23 Hình 3.4 Sắc ký đồ mẫu chuẩn hỗn hợp gồm R1, Rg1 và Rb1 24 Hình 3.5 Sắc ký đồ mẫu trắng 24 Hình 3.6 Sắc ký đồ mẫu thử từ củ tam thất 25 Hình 3.7 Sắc ký đồ phân đoạn với đầu dò PDA ở bước sóng 203 nm 34 Hình 3.8 Phổ khối của saponin S1 35 Hình 3.9 Phổ khối của saponin S2 35 Hình 3.10 Sắc ký đồ của mẫu saponin S1 35 Hình 3.11 Sắc ký đồ của mẫu saponin S2 36
  9. MỞ ĐẦU Từ xưa, các loại thảo dược tự nhiên đã được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền với tác dụng bồi bổ cơ thể cũng như điều trị bệnh lý của người bị bệnh. Ngày nay, việc ứng dụng các loại cây cỏ tự nhiên trong các lĩnh vực chăm sức khoẻ con người càng được quan tâm và đẩy mạnh phát triển nhằm đáp ứng nhu cầu thị trường ngày càng tăng của các chế phẩm có nguồn gốc thảo dược. Trong các loại thảo dược có tác dụng bồi bổ cơ thể, các cây thuộc chi sâm như nhân sâm (Panax ginseng) hay sâm Mỹ (Panax quinquefolium) đã được biết đến và sử dụng rộng rãi bởi những lợi ích và ứng dụng của các loài cây này đối với sức khoẻ con người, và Panax pseudoginseng (Burk.) F. H. Chen, hay còn gọi là tam thất, là một trong những loài cây thuộc chi sâm có tác dụng hàng đầu có thể kể đến. Tam thất là một loài dược liệu quý, được biết đến từ xa xưa với vai trò là một vị thuốc y học cổ truyền sử dụng phổ biến với những tác dụng như bồi bổ thân thể người bị suy nhược, điều trị chảy máu [1, 4, 43, 48]. Đến thời điểm hiện tại, đã có hơn 200 hợp chất hoá học đã được phân lập và xác định từ các bộ phận khác nhau của cây Tam thất, trong đó thành phần chủ yếu là các saponin, với năm loại saponin chính có thể kể đến là notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, Rb1, Rd và Re [43, 48]. Các saponin này đã được chứng minh có tác dụng tốt đối với sức khoẻ, như các lợi ích đối với hệ tim mạch [43, 48, 51], khả năng chống xơ vữa động mạch[50], khả năng chống viêm [12, 45], chống oxi hoá [49], giảm nồng độ cholesterol trong máu cũng như điều hoà huyết áp [31, 36] và giảm rủi ro mắc phải ung thư [9, 20, 24, 43]. Trong tam thất, ba thành phần saponin chính được đặc biệt lưu ý là notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1 và ginsenosid Rb1 bởi tác dụng điều trị các loại bệnh xu hướng của thế kỷ 21, như các bệnh về tim mạch [48, 51], tiểu đường [31, 36] hay ung thư [9, 20, 24]. Từ những minh chứng trên, có thể thấy tam thất là một dược liệu quý giàu saponin với nhiều tác dụng dụng có lợi đối với sức khoẻ con người. Việc sản xuất cũng như ứng dụng tam thất trong lĩnh vực chăm sóc sức khoẻ là một thị trường đầy tiềm năng tại Việt Nam. Tuy nhiên, hiện nay ở nước ta các nghiên cứu về chiết xuất cao chuẩn hoá giàu saponin cũng như phân lập các saponin riêng biệt còn hạn chế. Việc phân lập các saponin chính từ tam thất có nhiều ý nghĩa trong việc đánh giá tác dụng dược lý của các saponin này, từ đó những nghiên cứu sâu hơn về các saponin điển hình trong tam thất có thể được tiến hành. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài 1
  10. “Xây dựng quy trình chiết xuất cao chuẩn hoá giàu saponin và tinh chế saponin từ củ tam thất Panax pseudoginseng (Burk) F.H.Chen với hai mục tiêu chính như sau: 1. Xây dựng được quy trình thẩm định ba loại saponin R1, Rg1 và Rb1 có trong củ tam thất. 2. Xây dựng được bào chế cao chuẩn hoá giàu saponin từ tam thất và tinh sạch hai loại saponin điển hình từ cao chuẩn hoá giàu saponin. 2
  11. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cây tam thất (Panax Pseudoginseng) 1.1.1. Tên khoa học của cây tam thất Tên khoa học: Panax pseudoginseng (Burkill) F. H. Chen, trong giới thực vật có vị trí phân loại như sau: Giới: Thực vật (Plantae) Ngành: Thực vật hạt kín (Magnoliophyta) Lớp: Thực vật hai lá mầm (Magnoliopsida) Bộ: Hoa tán (Apiales) Họ: Nhân sâm (Araliaceae). Chi: Sâm (Panax) Loài: Tam thất (pseudoginseng) Tên đồng nghĩa: Aralia quinquefolia var. notoginseng Burkill; Panax pseudoginseng var. notoginseng (Burkill) G.Hoo & C.L.Tseng hoặc Panax pseudoginseng Wall. Tên thường gọi: sâm tam thất, kim bất hoán, nhân sâm tam thất, điền thất [1, 4]. 1.1.2. Phân bố của cây tam thất Tam thất có nguồn gốc ở phía nam Trung Quốc, được trồng từ lâu đời và không còn được tìm thấy trong trạng thái mọc trong tự nhiên. Cây được nuôi trồng nhiều nhất ở tỉnh Vân Nam, sau đó là Quảng Tây và ở một số quốc gia khác như Đài Loan, Nhật Bản, Triều Tiên [4]. Sự nhạy cảm với ánh sáng của cây hạn chế sự phân bố của tam thất tại Trung Quốc [43]. Ở Việt Nam, tam thất là một loại cây được nhập trồng từ Trung Quốc [4]. Tam thất được trồng với số lượng ít tại một số tỉnh như: Hà Giang (Đồng Văn), Lào Cai (Mường Khương, Bát Xát, Phà Lùng), Cao Bằng tại các vùng núi cao 1200 – 1500 m [1]. 3
  12. 1.1.3. Đặc điểm thực vật của cây tam thất Tam thất là cây thân thảo, sống nhiều năm. Thân tam thất mọc thẳng, không phân nhánh, cao 30 – 50 cm, màu tím tía. Lá kép chân vịt, màu xanh đậm, 3 – 4 lá mọc vòng, cuống lá dài 3 – 6 cm, mỗi cuống lá gồm 5 – 7 lá chét hình mác, cuống lá chét dài 0,6 – 1,2 cm, gốc thuôn, đầu có mũi nhọn, mép khía răng, hai mặt có lông cứng ở gân, mặt trên sẫm, mặt dưới nhạt [4]. Cụm hoa hoàn chỉnh có đường kính 5 – 25 mm, tổng chiều dài cuống từ 5 – 45mm. Cuống nhỏ ở một đầu và đầu còn lại chứa nhiều nụ hoa, với khoảng 130–230 hoa [48].Cụm hoa mọc thành tán đơn ở ngọn thân, có hoa đơn tính, có hoa lưỡng tính cùng tồn tại. Hoa màu lục vàng nhạt, đài 5 răng ngắn, màu xanh, tràng 5 cánh rộng ở phía dưới, nhị 5, bầu 2 ô. Quả mọng, hình cầu dẹt, khi chín màu đỏ, trong có hai hạt hình cầu, màu trắng [4]. Rễ chính có hình nón hoặc trụ, với chiều dài từ 1 – 6 cm, có màu vàng hoặc nâu với các vết nhăn và nếp rễ. Cây thường được thu hoạch vào mùa thu, trong thời gian trước khi nở hoa và có thể được nghiền thành bột sử dụng cho đường uống hoặc kết hợp với các thảo dược khác [4]. Hình 1.1. Hình ảnh cây và củ Panax pseudoginseng (Burkill) F. H. Chen 4
  13. 1.1.4. Thành phần hoá học của cây tam thất Theo các nghiên cứu, hơn 200 thành phần hoá học đã được phân lập từ tam thất. Trong số đó, saponin (4,42 – 12%) [4] chiếm hàm lượng lớn và được coi là thành phần chính, ngoài ra trong tam thất còn chứa những thành phần khác như flavonoid, các peptit vòng, đường saccarid và các nguyên tố vô cơ. Những thành phần phân bố trong các bộ phận khác nhau của cây như rễ, thân, hoa và lá với tỉ lệ khác nhau. Saponin được coi là thành phần chính trong Panax pseudoginseng. Trong thực tế, đã có hơn 100 loại saponin được phân lập và xác định, xthuộc ba nhóm ginsenosid, notoginsenosid và gypenosid. Hầu hết các saponin trong cây tam thất là các triterpen thuộc nhóm Dammarane với nhóm aglycon là 20(S)-protopanaxadiol (nhóm Rb) hoặc 20(S)-protopanaxatriol (nhóm Rg). PPG có thành phần không chứa bất cứ saponin nào có nhóm axit oleanolic(nhóm Ro), đây là một khác biệt lớn so với cây Panax ginseng C. A. Meyer and Panax quinquefolius L. Mỗi bộ phận khác nhau của tam thất sẽ chứa thành phần và tỉ lệ saponin khác nhau tuỳ theo từng bộ phận cụ thể. Nghiên cứu cho thấy ginsenosid Rb1 có nhiều trong tất cả các bộ phận của cây, trong khi Rg1 giàu trong thân và rễ. Rg3 – một chất được báo cáo về khả năng bảo vệ thần kinh - có hàm lượng lớn trong nụ hoa tam thất. Thông thường, năm loại saponin chính là notoginsenosid R1 (7 – 10%), ginsenosid Rb1 (30 – 36%), Rg1 (20 – 40%), Rd (5 – 8,4%) và Re (3,9 – 6%) chiếm tới khoảng 90% tổng số saponin trong tam thất được nghiên cứu cùng ứng dụng trong thí nghiệm về dược lý. Trong số đó, ba saponin lần lượt là ginsenosid Rb1, ginsenosid Rg1 và notoginsenosid R1 được chọn làm hợp chất tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng tam thất. Để tăng cường sự đa dạng phân tử của ginsenosid, đồng nghĩa với khả năng tìm kiếm được các chất có hoạt tính sinh học mới, các nghiên cứu khoa học đã được thực hiện nhằm xác định các sản phẩm thuỷ phân và các sản phẩm biến đổi sinh học của saponin nhằm tìm kiếm các chất có hoạt tính mới, mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc ứng dụng tam thất trong điều trị [43]. 5
  14. Hình 1.2. Cấu trúc phân tử notoginsenosid R1 và ginsenosid Rb1 Hình 1.3. Cấu trúc phân tử ginsenosid Rg1 và ginsenosid Rd Hình 1.4. Cấu trúc phân tử ginsenosid Re 6
  15. Ngoài các loại saponin, các thành phần khác cũng được báo cáo có mặt trong Panax pseudoginseng. Trong PPG, các peptit vòng được tìm thấy có cấu trúc là các hợp chất mạch vòng hình thành dựa trên các liên kết peptit do 2 – 37 protein hoặc axit amin không phải protein tạo nên. Chúng được tìm thấy trong các thực vật thuộc họ Caryophyllaceae và Rhamnaceae và được phân chia thành hai lớp, năm lớp phụ và tám loại. Đã có 14 loại peptit vòng được phân lạp và xác định về cấu trúc dựa trên phương pháp quang phổ, đó là các peptit vòng sau: cyclo- (Leu-Thr), cyclo- (Leu- Ile), cyclo- (Leu-Val), cyclo- (Ile-Val), cyclo- (Leu-Ser), cyclo- (Leu-Tyr), cyclo- (Val-Pro), cyclo- (Ala-Pro), cyclo- (Phe-Tyr), cyclo- (Phe-Ala), cyclo- (Phe-Val), cyclo- (Leu-Ala), cyclo- (Ile-Ala) và cyclo- (Val-Ala) [35]. Saccarid phân lập từ cây bao gồm monosaccarid, oligosaccarid và polysaccarid. Polysaccarid tồn tại trong nhiều bộ phận, với hàm lượng cao nhất ở rễ chính. Tổng hàm lượng đường của rễ PPG gần gấp đôi so với thân rễ, và hàm lượng polysaccarid của hoa gấp đôi so với thân và lá của tam thất. Các nghiên cứu khoa học đã chứng minh rằng các polysaccarid trong PPG có tác dụng bổ trợ và hoạt động kích thích miễn dịch. Một số loại flavonoid đã được phân lập ra từ PPG, chủ yếu là flavonol và flavonglycosid như liquiritigenin, quercetin hay kaempferol-3-O-α-L-rhamnoside. Có một lượng ít sterol đã được phân lập và xác định từ PPG, bao gồm β- sitosterol, daucosterol, stigmasterol, stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosid và stigmast-7-en-3β-ol-3-O-β-D-glucopyranosid. Hơn 19 loại amino axit đã được phân lập trong PPG, với 7 trong số chúng được coi là thiết yếu [43]. Các thành phần dầu dễ bay hơi trong PPG gồm tecpen, rượu, aldehit, olefin và ankan. Terpen được coi là một thành phần quan trọng vì tỷ lệ tương đối cao trong hợp chất. Hơn 91 chất dễ bay hơi đã được phân lập từ dầu của hoa nụ hoa tam thất, với các thành phần chính là spathulenol (12.19%), α‐gurjunen (6.73%), bicyclogermacren (6.57%), germacren‐D (5.26%) và bicycloelemen (3.55%) [33]. Ngoài các hợp chất hóa học được liệt kê ở trên, còn có các thành phần khác được phân lập từ PPG, bao gồm icarisid B6, guanosin hydrat, axit béo, các nguyên tố vô cơ và muối khoáng [43]. 7
  16. 1.1.5. Tác dụng dược lý của cây tam thất Đúc kết từ các kinh nghiệm xưa cùng với các nghiên cứu hiện đại, tam thất đã được chứng minh là một loài cây với nhiều tác dụng dược lý tốt lên hệ tim mạch, hệ miễn dịch, khả năng chống xơ vữa động mạch, hoạt động cầm máu, khả năng chống ung thư  Tác động lên hệ tim mạch Rất nhiều nghiên cứu đã cho thấy khả năng điều trị các bệnh tim mạch thông qua việc sử dụng PPG thông qua hai tác dụng chính: khả năng ảnh hưởng đến tế bào nội mô và khả năng bảo vệ tế bào cơ tim. Cụ thể, trong cao huyết áp, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc tăng cường hoạt động của các tế bào nội mô cơ tim thông qua tác dụng giảm nồng độ NO và ET-1 trong máu đã làm giảm khả năng tăng huyết áp trong chuột thí nghiệm [43]. Ngoài ra tác dụng bảo vệ tế bào tim mạch của saponin 20 (S) ‐panaxadiol thông qua việc chống lại sự oxi hoá, cùng với tác dụng hình thành mạch máu của ginsenosid Rg1 có tác dụng trong điều trị chữa lành vết thương do thiếu máu cục bộ [48]. Trong suy tim, thông qua thử nghiệm điều trị chuột bị suy tim sử dụng ginsenosid Rb1 (35 và 70 mg/kg) và losartan (4,5 mg/kg) trong 8 tuần, Rb1 đã được chứng minh có tác dụng khôi phục chức năng tim và ty thể, tăng hấp thu glucose và bảo vệ chống lại quá trình tái định dạng tim thông qua các con đường tín hiệu TGF- β1/ Smad, ERK và Akt [51].  Khả năng chống xơ vữa động mạch Thực nghiệm trên 3 nhóm chuột được sử dụng parafin lỏng, zymosan (20mg/kg, 3 ngày 1 lần) và zymosan cùng PNS (100mg/kg hàng ngày) trong 9 tuần, kèm chế độ ăn nhiều chất béo đã đã chứng minh khả năng trong việc điều trị xơ vỡ động mạch của PNS. Kết quả mẫu máu trên chuột đã chứng minh PNS có thể ngăn ngừa và điều trị xơ vữa động mạch dựa trên khả năng chống viêm, giảm mức lipid trong máu cũng như khả năng sửa chữa mạch máu. Cơ chế chính của tác dụng này là do khả năng kháng viêm thông qua sự ức chế chuyển vị của p65 NF-kB [50].  Khả năng gây đông máu và chữa lành vết thương Tam thất được coi là thần dược trong điều trị chảy máu trong và ngoài trong điều trị chấn thương. Các thành phần saponin có tác dụng làm giảm viêm, giảm stress oxy hóa và ức chế endotoxin và myeloperoxidase trong giai đoạn hồi phục của chuột bị sốc xuất huyết [43]. Nghiên cứu riêng về ginsenosid Rg1 được phân lập còn cho 8
  17. thấy tác dụng thúc đẩy tạo mạch máu con đường tín hiệu VEGF-KDR/FIK-1 và I3K- Akt-eNOS [18].  Hoạt động chống oxy hoá Các flavonoid và saponin từ tam thất đã được chứng minh có hoạt tính chống oxy hóa và loại bỏ gốc tự do. Tại nồng độ 0,2 – 1,0 mg/ml, các flavonoid trong tam thất có hoạt tính chống sự oxi hoá của axit 2,2'-azino-bis-3-ethylbenzthiazolin-6- sulphonic, các gốc superoxit anion và các gốc hydroxyl vượt trội hơn so với axit ascorbic. Ngoài ra, các flavonoid còn hể hiện tác dụng ức chế đối với Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila và Pseudomonas aeruginosa[17]. Một số loại saponin từ tam thất cũng được báo cáo về tác dụng chống lại stress oxy hoá trên ty thể [49].  Khả năng chống viêm Hoạt động chống viêm của PPG được chứng minh thông qua các cơ chế khác nhau, đặc biệt thông qua con đường NF-kB. Tam thất có tác dụng ngăn chặn sự tập trung và kích hoạt của bạch cầu trung tính, đại thực bào và tế bào lympho dẫn đến sự hạn chế giải phóng của ROS, lysozym, prostaglandin, leukotrien và các cytokin gây viêm, làm giảm thiệt hại cho các mô xung quanh [45]. Thực nghiệm cho thấy ginsenosid Rb1 có khả năng chống viêm thông qua khả năng hạn chế sự giải phóng của các cytokin gây viêm trong các tế RAW264.7, cũng như giảm lượng COX-2 và iNOS. Trong các thử nghiệm trên động vật, Rb1 có tác dụng giảm chấn thương do viêm thận cấp và chữa trị nhiễm trùng huyết do lipopolysaccarid [12].  Khả năng hạ đường huyết và chống tăng lipid máu Trong tam thất, PNS có tác dụng làm tăng đáng kể độ nhạy với insulin cũng như cải thiện cân bằng nội mô glucose trong các thử nghiệm trên chuột KK-Ay, điều này có ý nghĩa rất lớn trong quá trình kiểm soát tiểu đường. Ngoài ra, PNS còn có khả năng điều chỉnh về cả mức độ cũng như độ nhạy cảm của leptin trên chuột KK- Ay, hóc môn này có tác dụng kiểm soát năng lượng tổng thể cũng như sự cân bằng nội môi trong trao đổi chất, thông qua đó giảm nhu cầu thức ăn và và chất béo [37]. Trong 5 thành phần chính của PNS, Rb1 và Rg1 được báo cáo về tác dụng thúc đẩy tiết insulin của tế bào beta và làm giảm tích tụ chất béo trung tính. Tác dụng nói trên được dựa trên cơ chế cải thiện cân bằng đường nội môi bằng cách tăng cường quá trình tạo chất béo trung tính trong tế bào mỡ và tăng cường chức năng và khả năng sống sót của tế bào beta thông qua con đường phụ thuộc PKA [31]. 9
  18.  Tác dụng bảo vệ thần kinh Đã có những ghi nhận về tác dụng của các PNS như ginsenosid Rg1, Rb1, notoginsenosid R1 và các polysaccarid từ cây về khả năng hạn chế sự chết tế bào thông qua việc điều chỉnh tỉ lệ Bcl-2/Bax và biểu hiện của Trx-1, SOD-1, HSP70, giảm biểu hiện của caspase-1, caspase-3 và các protein có liên quan, nhằm khôi phục con đường tín hiệu Akt-NF-kB có tác dụng chống chết tế bào. Các cơ chế chống viêm cũng có tác dụng trong việc bảo vệ thần kinh. Ngoài ra, các saponin còn có tác dụng thúc đẩy quá trình chuyển hóa và bảo vệ cấu trúc của tế bào thần kinh chống lại tổn thương do thiếu oxy trong ống nghiệm một cách toàn vẹn, thúc đẩy tăng sinh tế bào gốc thần kinh hồi hải mã và biệt hóa thành tế bào thần kinh và tế bào thần kinh đệm mới [43]. Ginsenosid Rb1 có thể điều chỉnh mức protein của yếu tố thần kinh có nguồn gốc từ não. Ngoài các tác dụng trên, PPG có tác dụng chống thoái hóa thần kinh, ginsenosid Rb1 có thể điều chỉnh giảm protein Tau quá trình phosphoryl hóa trong bệnh Alzheimer [30].  Khả năng hỗ trợ và kích thích miễn dịch Các chất trong tam thất như saponin dạng protopanaxadiol, ginsenosid -Rb1, - Rd, notoginsenosid -K, -R4 phân lập từ P.notoginseng có tác dụng tăng cường mạnh một số kháng thể đặc hiệu và các phản ứng tế bào chống lại ovalbumin (OVA) trên chuột, và chúng còn có khả năng tặng hoạt hoá tế bào lympho T và tế bào lympho B ở chuột miễn dịch với OVA [43].  Tác dụng lên thận Nghiên cứu chỉ ra rằng các PNS có khả năng bảo vệ chống lại độc tính trên thận do cisplatin gây ra[27], ngoài ra PNS còn có tác dụng giảm sự chết của mô thận thông qua ức chế con đường ty thể, do tác dụng giảm biểu hiện của caspase 9 và Bax và tăng biểu hiện của Bcl-2 [28].  Tác dụng lên gan Các loại PNS còn thể hiện tác dụng bảo vệ các tổn thương gan do nhiều nguyên nhân như rượu, carbon tetrachlorid, Những tác dụng điều trị của các loại saponin kể trên đối với bệnh xơ gan có thể liên quan đến hoạt động điều hòa miễn dịch của nó đối với các cytokin tiền xơ và chống xơ hóa, cũng như đặc tính chống oxy hóa. Ngoài ra, PNS có thể làm giảm chứng thiếu máu cục bộ đường ruột, rối loạn chức năng vi mạch gan do tái tưới máu và tổn thương tế bào gan bởi cơ chế chống viêm [43]. Cụ thể, tác dụng của ginsenosid Rg1 tại gan đã được chỉ ra như việc giảm nồng 10
  19. độ đường huyết trong máu và chỉ số kháng insulin tại chuột, làm tăng nồng độ aspartate transaminase và alanin transaminase trong mô hình chuột T2 ‐ DM [36]. Tác dụng bảo vệ gan của ginsenosid Rg1 còn được thể hiện thông qua việc điều chỉnh con đường tín hiệu Keap1-Nrf2-ARE [13].  Cơ chế chống ung thư Các chiết xuất và thành phần của PPG đã được kiểm chứng về khả năng chống ung thư đối với bệnh ung thư ruột kết, ung thư gan, ung thư phổi, u lympho, ung thư tuyến tuỵ, ung thư vú. Cơ chế chính có thể do sự ức chế sự tăng sinh tế bào và gây ra quá trình chết rụng tế bào thông qua giảm điều hoà biểu hiện Bcl-2, tăng điều hoà biểu hiện Bax, giảm tiềm năng xuyên màng của ty thể, và sự hoạt hoá của caspase-3 [43]. Trong ung thư vú, ginsenosid Rg1 đã được báo cáo về khả năng gây chết tế bào theo chương trình, và ngăn chặn sự hình thành tế bào khối u ở chuột thực nghiệm thông qua sự ngăn chặn tổn thương do oxi hoá[9]. Ngoài ra, những báo cáo khác về khả năng chống ung thư tại xương hay ung thư bạch cầu cũng đã cho thấy khả năng chống ung thư của Rg1 trong tam thất [20, 24]. 1.1.6. Tam thất trong y học cổ truyền Rễ tam thất được thu hái trước khi ra hoa, rửa sạch, phơi khô hoặc sấy khô, rồi phân loại thành rễ củ, rễ nhánh và thân rễ. Tam thất có vị đắng, ngọt, tính ẩm, vào các kinh can, thận, có công năng hoạt huyết, bổ huyết, cầm huyết, tiêu ứ máu, tiêu sưng, giảm đau. Tam thất được dùng làm vị thuốc trong các bài thuốc y học cổ truyền của Việt Nam như chữa các chứng chảy máu khi bị thương hoặc chữa suy nhược cơ thể ở người cao tuổi hoặc phụ nữ có thai. Trong y học cổ truyền Ấn Độ, tam thất là thuốc bổ và làm tăng khả năng thích nghi của cơ thể [4]. Tại Trung Quốc, từ xa xưa rễ của tam thất đã được sử dụng như một phương thuốc cầm máu nổi tiếng, là thành phần chính trong Vân Nam Bạch Dược – một phương thuốc nổi tiếng của Trung Quốc. Các ghi chép về cây có thể được tìm thấy từ rất sớm trong cuốn Bản Thảo Cương Mục của Lý Thời Trân, với các tác dụng được đề cập đến như cầm máu, loại bỏ máu ứ, giảm đau và điều trị chảy máu do vật sắc, ho ra máu, nôn trớ, chảy máu cam và lỵ ra máu [43]. 11
  20. 2.2. Các phương pháp chiết xuất và tinh chế saponin từ tam thất 2.2.1. Nguyên tắc chung Chiết tách là bước đầu tiên và có vai trò lớn trong việc thu hồi và làm sạch các chất có hoạt tính sinh học từ nguyên liệu thô. Trong PPG, sản phẩm chính thu được sau quá trình tách chiết là các loại saponin, tuy vậy do bản chất của saponin là một chất có độ phân cực cao, không bền về mặt hoá học và nhiệt học, không dễ bay hơi dẫn đến những thách thức trong việc tìm ra các biện pháp hiệu quả trong quá trình tách chiết [29]. Chính vì vậy, rất nhiều các biện pháp chiết tam thất đã được thử nghiệm, cụ thể như các phương pháp chiết xuất phổ thông như ngâm, sử dụng soxhlet, chiết nóng hồi lưu cùng với các biện pháp chiết xuất hiện đại như chiết xuất sóng siêu âm, hỗ trợ vi sóng hay chiết dung môi nhanh, với các kỹ thuật có những ưu điểm và nhược điểm riêng biệt. Trong quá trình tách chiết tam thất, các bước được tiến hành lần lượt là: Quá trình tiền xử lý, chiết xuất và sau đó là tinh chế sản phẩm. Tiền xử lý là bước đầu tiên trong quá trình tách chiết, được tiến hành với mục đích tăng hiệu quả của quá trình chiết xuất. Các bước tiền xử lý bao gồm làm khô, giảm kích thước hạt và khử chất béo. Các nguyên liệu thô từ thực vật (rễ, vỏ cây, lá, thân, củ) thường được làm khô và sau đó nghiền thành bột trước khi nhằm giảm kích thước hạt với mục đích tăng hiệu quả truyền khối của quá trình chiết. Các nguyên liệu thô thường được làm khô. Quá trình khử chất béo được tiến hành thông qua việc sử dụng dung môi ưa béo, chẳng hạn như ethyl axetat hoặc n–hexan nhằm loại bỏ chất béo khỏi hỗn hợp. Hiệu quả của quá trình phân tách được cải thiện bằng cách sử dụng một phần của cây có nồng độ saponin cao nhất [29]. Các phương pháp chiết thường được phân loại theo 2 nhóm chính: các phương pháp chiết xuất truyền thống và các phương pháp chiết xuất hiện đại. Các phương pháp chiết xuất truyền thống có thể kể đến như ngâm, chiết bằng soxhlet, chiết nóng hồi lưu (HRE), với hiệu suất chiết xuất trong các phương pháp này phụ thuộc phần lớn vào khả năng tan của nguyên liệu trong dung môi. Điều này dẫn đến sự bắt buộc của việc sử dụng lượng lớn dung môi, kèm theo sự hỗ trợ về nhiệt độ (đun nóng) hoặc cơ học (khuấy và lắc). Các nhược điểm chung có thể thấy của phương pháp truyền thống là về thời gian, lượng dung môi sử dụng lớn, hiệu suất thấp và khả năng phân huỷ của các chất trong thời gian chiết [8]. So sánh với các phương pháp cũ, các phương pháp chiết xuất hiện đại được cho là tối ưu hơn, do các ưu thế như việc sử dụng ít dung môi, tốn ít thời gian hơn, có khả năng tự động hoá cũng như hiệu quả 12
  21. hơn. Càng ngày càng có nhiều các thí nghiệm nhằm tối ưu hoá hiệu suất chiết xuất saponin trong tam thất thông qua các phương pháp chiết xuất hiện đại [29]. Việc phân lập các thành phần trong hỗn hợp chiết của tam thất có thể tốn nhiều thời gian và do sự đa dạng và phức tạp trong cấu trúc của các thành phần. Chính vì vậy, rất nhiều kỹ thuật phân lập đã được tiến hành thử nghiệm nhằm tìm ra biện pháp phân lập và tinh chế hiệu quả nhất [32, 42]. Các biện pháp thường được sử dụng có thể kể tới là sắc ký cột, sắc ký lỏng hiệu năng cao và sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao [11, 21, 22, 41]. 2.2.2. Các phương pháp chiết xuất saponin toàn phần từ tam thất Tam thất thường được chiết xuất với dung môi cồn nồng độ cao, thông qua nhiều phương pháp khác nhau nhu đun hồi lưu, chiết siêu âm, chiết nóng. Những phương pháp này đều đạt được hiệu suất cao về khả năng chiết xuất saponin từ tam thất [38]. Ngoài ra, các nghiên cứu cũng chỉ ra như các yếu tố như thời gian, nồng độ ethanol sử dụng, tỉ lệ dược liệu – dung môi và số lần chiết cũng sẽ ảnh hưởng tới hiệu suất chiết của saponin [19]. Một số phương pháp cụ thể có thể tham khảo như: Theo patent CN101513438A: PPG đầu tiên được làm sạch, khô, sau đó nghiền nhỏ và trộn với dung môi ethanol 85% với tỷ lệ dược liệu/dung môi là 6 – 10. Hỗn hợp được chiết thông qua phương pháp đun hồi lưu với nhiệt độ 60oC. Sau khi đun, dịch chiết được đem đi lọc, sau đó tiếp tục chiết và lọc, tổng cộng ba lần chiết. Dịch lọc được gộp lại và cô đặc thu hồi dưới điều kiện áp suất thấp ở nhiệt độ 60oC. Dịch cô đặc được loại tạp bằng việc sử dụng vật liệu hấp phụ là nhựa macroporous D101 theo lần lượt các bước: Rửa giải trước bằng nước cất để loại tạp, sau đó rửa với ethanol 70%, thu được dịch rửa giải ethanol, cô đặc dịch, rửa giải thông qua cột alumina bằng 70% ethanol, dịch rửa giải được cô đặc đến khô để thu được saponin toàn phần. Theo thống kê, hàm lượng saponin toàn phần của phương pháp có thể đạt lên tới hơn 14% [10]. Theo patent CN104800258A về quá trình chiết xuất PPG toàn phần, tam thất được nghiền nhỏ thành bột thô sau đó cho vào bể chiết kết hợp với nước tinh khiết với tỷ lệ từ 6-8 lần, thêm chất nhũ hóa, trộn đều tới khi hỗn hợp hoà lẫn với nhau. Hỗn hợp được chiết xuất bằng biện pháp đun hồi lưu hai lần, mỗi lần trong một giờ. Dịch chiết được được tổng hợp lại từ hai lần, điều chỉnh pH của dung dịch từ 7 – 8 sau đó lọc và lấy dịch. Dịch lọc được tiến hành hấp phụ và sắc ký thông qua nhựa 13
  22. macroporous, rửa giải bằng ethanol nồng độ 50 – 70% trong một hoặc hai lần. Dịch rửa giải thu được sẽ được loại bỏ ethanol bằng biện pháp ngưng tụ dưới môi trường áp suất giảm và tiến hành sấy phun để thu được dạng bột. Các ưu điểm của phương pháp được kể ra như: hiệu suất chiết tăng hơn 30% so với các phương pháp thông thường, thời gian và số lần chiết tam thất được giảm thiểu, cùng với sự tiết kiệm về giá thành cũng như tổng thời gian chiết xuất [47]. Theo patent CN101049331A, PPG được nghiền thành hạt có đường kính 3 – 8 mm, sau đó thêm dung môi ethanol nồng độ 65 – 75% với tỷ lệ dược liệu/dung môi từ 10 đến 12 lần. Hỗn hợp dịch được mang đi chiết bằng phương pháp hồi lưu hai lần, mỗi lần 2 giờ. Dịch thu sẽ được hấp phụ bằng nhựa macropative D101 và rửa giải bằng nước tinh khiết với tổng thể tích khoảng từ 4 đến 6 lần thể tích cột, và sau đó được rửa với dung dịch amoniac 0,05 – 1% với thể tích khoảng 4 – 6 lần thể tích cột. Rửa cột bằng nước đến pH = 7, sau đó rửa bằng ethanol 20 – 30% với thể tích bằng 3 – 5 thể tích cột, và cuối cùng rửa giải bằng ethanol 60 – 80% với thể tích bằng 3 – 5 thể tích cột, thu được saponin toàn phần [16]. 2.2.3. Các phương pháp tinh chế saponin từ tam thất Đối với tuỳ loại saponin cần phân lập và tinh chế, có các phương pháp khác nhau được tiến hành như sau: Phương pháp tinh chế notoginsenosid R1 và ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd từ củ tam thất: Đầu tiên, tam thất được chiết bằng dung môi ethanol 40 – 95%, sau đó dịch chiết được tách phân đoạn để thu được notoginsenosid R1 và ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd. Quá trình rửa giải áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu suất cao pha đảo với tỉ lệ hệ dung môi nước/ethanol biến đổi từ 30% đến 80% được sử dụng trong quá trình. Phương pháp này có một số ưu điểm như quy trình đơn giản, không gây ô nhiễm, chi phí thấp và độ tinh khiết cao (hơn 97%) [44]. Phương pháp tinh chế Ginsenosid Rg1, Re và Rb1: Chiết xuất saponin PPG toàn phần được hòa tan với ethanol, thêm dodecylbenzen natri sulfonat, sau khi hòa tan xong nạp vào nhựa hấp phụ macroporous không phân cực, với dung môi rửa giải là ethanol, cô đặc dịch rửa giải thu được. Sản phẩm khô được hòa tan với ethanol, sau đó được nạp vào sắc ký cột với quá trình rửa giải gradient dung môi là ethanol 80% - 50%, ở nhiệt độ không đổi, phát hiện ginsenosid Rg1, Re và Rb1 bằng detector UV. Ginsenosid Rg1, Re và Rb1 có độ tinh khiết hơn 90% [22]. 14
  23. Phương pháp tinh chế Ginsenosid Rg1: Chiết xuất saponin toàn phần hòa tan trong nước, tinh chế bằng cột nhựa hấp phụ macroporous không phân cực hoặc phân cực yếu, rửa sạch bằng nước, rửa giải bằng ethanol 10 % ~ 70%, thu được dịch rửa giải, cô đặc và sấy khô thu được sản phẩm thô của ginsenosid Rg1. Ginsenosid Rg1 thô, hòa tan trong ethanol, khuấy với silica gel, sau khi dung môi được làm bay hơi đến khô trên cột silica gel, rửa giải bằng dung môi hữu cơ, sấy khô dịch rửa giải. Chất khô được hòa tan trong nước, thêm 0,1 – 5,0% than hoạt tính, khuấy, lọc để loại bỏ than hoạt tính, dịch lọc được sấy khô để thu được ginsenosid Rg1 [15]. Phương pháp tinh chế R1 và Rb1: Chiết xuất saponin tam thất toàn phần được thêm ethanol 60-90% để hòa tan, propylen glycol có nồng độ phần trăm theo thể tích 1 – 5% được thêm vào. Dung dịch thu được cho đi qua cột sắc ký (silica gel polymer đơn phân tử), rửa giải gradient bằng ethanol 80% - 50%, ở nhiệt độ không đổi, detector UV được dùng để đánh giá hàm lượng propylene glycol. Kết quả cho thấy chất rửa giải không có propylene glycol dư, sau đó cô đặc dịch rửa giải, thu được notoginsenosid R1 và ginsenosid Rb1 với độ tinh khiết hơn 90% [21]. 15
  24. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng và nguyên vật liệu thí nghiệm 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Củ tam thất (Panax pseudoginseng (Burk.) F.H. Chen) được thu hái ở Simacai, Lào Cai vào tháng 9/2019. Hình 2.1. Mẫu củ tam thất (Panax pseudoginseng (Burk.) F.H. Chen 2.1.2. Nguyên liệu, hoá chất Các nguyên liệu và hoá chất sử dụng được liệt kê trong bảng 2.1. Nguyên liệu, hoá chất Nguồn gốc Chất chuẩn R1, Rg1, Rb1 Chungde Must Biological Technology Co., Ltd., Trung Quốc Nhựa hấp phụ Marcoporous D101 Donghong Chemical Co., Ltd., Trung Quốc Ethanol 96% Việt Nam Nước tinh khiết Việt Nam 16
  25. Methanol đạt tiêu chuẩn HPLC Merk, Đức Acetnitril đạt tiêu chuẩn HPLC Merk, Đức Ammonium clorid Merk, Đức Ethanol Pháp Bảng 2.1. Nguyên liệu và hoá chất 2.1.3. Máy móc, dụng cụ Các máy móc và dụng cụ được liệt kê trong bảng 2.2. Máy móc, dụng cụ Nguồn gốc Hệ thống máy HPLC Agilent 1260 Technologies với Agilent Technologies đầu dò DAD, bơm mẫu tự động Hệ thống sắc ký lỏng điều chế đầu dò PDA Agilent Technologies Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối đầu dò Agilent Technologies khối phổ LC-MS/MS 6420 Triple Quad Cân kĩ thuật Sartorius PRACTUM612 – 1S Đức Cân phân tích Sartorius QUINTIX224 – 1S Đức Hệ thống cất quay Rovapor R-210, Buchi Đức Hệ thống ly tâm CVE-3310 kết nối với hệ thống làm Nhật Bản lạnh UT-2000, Eyela Rây các cỡ Nhiều nguồn Máy đông khô EYELA Nhật Bản Máy đo hàm ẩm MB 45 Ohaus- Mỹ Máy siêu âm Elmasonic S100H Đức Cột thủy tinh (đường kính trong 5cm, chiều dài 60 cm) Đức Phễu lọc Buchner Đức Màng lọc cellulose acetat 0,2 µm Đức Các dụng cụ thủy tinh khác: bình định mức, pipet, cốc Nhiều nguồn có mỏ, ống đong 17
  26. Bảng 2.2. Máy móc và dụng cụ 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Rb1 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao  Lựa chọn điều kiện sắc ký Dựa trên các tài liệu [25, 39], điều kiện sắc ký được sử dụng được lựa chọn như sau: - Cột sắc ký: Cột Agilent C18 (4,6×250 mm; 3,5 µm). - Pha động: Tiến hành trên hệ dung môi pha động gồm acetonitril (A) và nước tinh khiết (B) với các tỷ lệ khác nhau, chế độ gradient: 0 – 20 phút (20 – 25% A), 20 – 25 phút (25 – 31% A), 25 – 34 phút (31 – 34% A), 34 – 54 phút (34 – 35% A), 54 – 55 phút (35 – 20% A), 55 – 60 phút (20% A). - Detector: UV 203 nm. - Nhiệt độ cột: 35 ± 0,1oC. - Tốc độ dòng: 1 ml/phút. - Thể tích tiêm: 20 l.  Chuẩn bị các dung dịch chuẩn và thử - Tiến hành pha các dung dịch chuẩn gốc R1, Rg1 và Rb1 đều có nồng độ 320 µg/ml. - Tiến hành pha các dãy dung dịch chuẩn R1, Rg1 và Rb1 đều có nồng độ từ 10 – 160 µg/ml. - Tiến hành pha dãy hỗn hợp chuẩn gồm R1, Rg1 và Rb1 có nồng độ 80 µg/ml. - Mẫu thử: Cân chính xác một lượng bột tam thất mịn đã rây qua rây 180, cho vào bình định mức 25 ml, bổ sung 15 ml methanol, lắc siêu âm trong 15 phút cho saponin tan hoàn toàn, bổ sung methanol tới vạch, lọc qua màng lọc 0,2 µm.  Thẩm định phương pháp Dựa trên quy định của Dược điển Việt Nam V, AOAC và các tài liệu khác [2, 5, 6], phương pháp thẩm định và định lượng đồng thời R1, Rb1 và Rg1 được xây dựng như sau: 18
  27. - Độ đặc hiệu của phương pháp: Chuẩn bị mẫu chuẩn đơn, mẫu chuẩn hỗn hợp, mẫu trắng, mẫu dung dịch thử củ tam thất trong methanol vừa đủ. Xử lý mẫu rồi tiến hành sắc ký với các điều kiện như mẫu thử. Yêu cầu: Trên sắc ký đồ của mẫu trắng thu được không xuất hiện pic của chất phân tích, thời gian lưu của R1, Rg1 và Rb1 trong hỗn hợp dung dịch chuẩn và dung dịch thử phải tương đương nhau, tại thời điểm tương ứng pic của R1, Rg1 và Rb1 không được xuất hiện pic lạ và phải tách hoàn toàn với các pic khác trong nền mẫu. - Tính thích hợp của hệ thống: Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn R1, Rg1 và Rb1 có nồng độ 160 µg/ml. Ghi lại thời gian lưu, diện tích pic. Yêu cầu: Chênh lệch về thời gian lưu và diện tích pic biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD% của 6 lần không được lớn hơn 2%. - Tính tuyến tính và khoảng xác định: Tiến hành xác lập mối tương quan giữa diện tích pic với nồng độ R1, Rg1 và Rb1. Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn R1, Rg1 và Rb1 có nồng độ từ 10 – 160 µg/ml. Tiến hành sắc ký, xây dựng phương trình hồi quy và xác định hệ số tương quan r. Yêu cầu: Đường hồi quy thu được phải có dạng đường thẳng và giá trị r ≥ 0,995. - Độ lặp lại: Tiến hành định lượng 6 lần dung dịch thử củ tam thất pha trong methanol, tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Xác định độ lặp lại bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối giữa các giá trị của các lần định lượng. Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tương đối phải trong khoảng từ 0,5 – 2%. - Độ đúng của phương pháp: Độ đúng của phương pháp được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu thử sao cho nồng độ R1, Rg1 và Rb1 vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát. Thêm vào mẫu dung dịch thử củ tam thất trong methanol đã được xác định hàm lượng R1, Rg1 và Rb1 một lượng chính xác chất chuẩn ở 3 mức 80%, 100%, 120% so với hàm lượng R1, Rg1 và Rb1 trong mẫu khảo sát. Từ kết quả sắc ký sẽ tính được phần trăm tìm lại của lượng mẫu chuẩn thêm vào tính theo thực tế so với lý thuyết. Yêu cầu: Độ thu hồi chấp nhận cho trường hợp chất phân tích có hàm lượng ≥ 1% là từ 97 – 103%. Độ thu hồi chấp nhận cho trường hợp chất phân tích có hàm lượng ≥ 0,1% là từ 95 – 105%.  Định lượng Áp dụng phương pháp định lượng đã được thẩm định để định lượng R1, Rg1 và Rb1 trong các mẫu bột, mẫu cao tam thất, mẫu cao tinh chế giàu saponin và xác định độ tinh khiết của các saponin điển hình là Rg1 và Rb1. Các mẫu định lượng được 19
  28. hòa tan một lượng thích hợp trong methanol, lọc qua màng lọc 0,2 µm, sau đó được tiến hành chạy sắc ký theo điều kiện sắc ký đã được thẩm định. 2.2.2. Quy trình chiết xuất và tinh chế saponin  Quy trình chiết xuất Trong quá trình chiết xuất, tiến hành đồng thời ba phương pháp chiết là đun hồi lưu, ngâm lạnh và chiết nóng đối với mẫu dược chất PPG nhằm khảo sát phương pháp đạt được hiệu suất chiết tối ưu. Đầu tiên, mẫu dược liệu thô tam thất được xay mịn, sau đó rây qua rây 350. - Phương pháp ngâm lạnh: 100 gam bột dược liệu được ngâm trong ethanol 70o với tỷ lệ dược liệu/ dung môi là 1/7 và được khuấy từ trong 24 giờ. Dịch chiết sẽ được lọc và bã dược liệu sẽ tiếp tục được ngâm và khuấy trong cồn 70o với tỷ lệ dược liệu/dung môi là 1/5. Dịch chiết được lọc, gộp sau hai lần, lọc qua giấy lọc sau đó cô quay dưới áp suất giảm thu được cao lỏng 1:1. - Phương pháp đun hồi lưu: Lấy 100 gam bột PPG và thêm vào ethanol 70o với tỷ lệ dược liệu/dung môi là 1/7. Tiến hành đung hồi lưu hỗn hợp với nhiệt độ 70oC trong 3 tiếng. Tiến hành rút dịch chiết lần 1, lọc thu dịch và tiếp tục chiết bã dược liệu với cồn 70o với tỷ lệ 1/5. Dịch chiết được lọc, gộp sau hai lần, lọc qua giấy lọc sau đó được cô quay dưới áp suất giảm thu được cao lỏng 1:1. - Phương pháp pháp chiết nóng: Nước tinh khiết được thêm vào 100 gam bột tam thất với tỷ lệ dược liệu/dung môi là 1/7. Hỗn hợp nước và dược liệu thu được sẽ được chiết xuất trong bình cô quay trên nồi cách thủy ở nhiệt độ 50oC trong 2 giờ. Sau đó, ta rút dịch chiết lần 1, lọc thu dịch và tiếp tục chiết bã dược liệu với nước tinh khiết với tỷ lệ dược liệu/dung môi là 1/5 trong 1,5 giờ tương tự như trên. Sau đó, dịch chiết được rút lần 2, lọc thu dịch. Gộp dịch chiết thu được trong 2 lần, lọc qua giấy lọc sau đó cô quay dịch chiết dưới áp suất giảm thu được cao lỏng 1:1. Các mẫu thu được sẽ được pha loãng tới nồng độ phù hợp, định lượng và so sánh kết quả về hiệu suất chiết xuất so với mẫu đã được định lượng bằng methanol.  Quy trình tinh chế saponin Quy trình tinh chế saponin toàn phần từ cao lỏng chiết xuất được bằng nhựa macroporous D101 thông qua phương pháp sắc ký cột 20
  29. - Chuẩn bị cột: Ngâm nhựa microporous D101 trong ethanol 96o trong 12 giờ, rửa sạch lại bằng nước, rút kiệt nước đến khô. Sau đó 300 gam nhựa được nạp lên cột với thể tích khối nhựa là 500 ml. - Quá trình hấp phụ: Hoà tan 50 gam cao lỏng 1:1 trong nước với tỷ lệ khối lượng là 1/10, sau đó dung dịch cao – nước được hấp phụ lên cột chứa nhựa macroporous D101 với tốc độ 10 ml/phút. Đồng thời mở khóa rửa giải cột với cùng tốc độ 10 ml/phút. - Quá trình giải hấp phụ: Sau khi toàn bộ saponin trong dịch chiết đã được hấp phụ, tiến hành rửa cột bằng 2500 ml nước tinh khiết với tốc độ 30 ml/phút. Sau đó rửa giải cột bằng 2500 ml ethanol 70% với tốc độ 20 ml/phút. Loại bỏ dịch nước. Dịch rửa giải ethanol 70% được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm để loại dung môi, sau đó dung môi được loại bỏ hoàn toàn bằng phương pháp đông khô ở nhiệt độ -85oC và áp suất khoảng 10 Pa, thu được cao tinh chế giàu saponin. Tinh chế saponin điển hình Cân chính xác khoảng 250 mg cao tinh chế giàu saponin, sau đó hòa tan trong ethanol 70% thu được dung dịch có nồng độ chính xác khoảng 50 mg/ml. Lọc dung dịch qua màng lọc 0,2 µm. Sử dụng dịch lọc thu được, tiến hành tinh chế saponin điển hình bằng phương pháp sắc ký lỏng điều chế đầu dò PDA, với điều kiện sắc ký như sau: - Cột sắc ký: Cột Agilent 10 Prep-C18 250 x 21,2 mm; 10 µm. - Pha động: gồm acetonitril (A) và nước tinh khiết (B) với các tỷ lệ khác nhau, chế độ gradient: 0 – 20 phút (20 – 25% A), 20 – 25 phút (25 – 32% A), 25 – 34 phút (32 – 34% A), 34 – 45 phút (34 – 35% A), 45 – 50 phút (35 – 20% A). - Detector phát hiện: UV 203 nm. - Nhiệt độ cột: 35 ± 0,1 oC. - Tốc độ dòng: 20 ml/phút. - Thể tích tiêm: 500 l. 21
  30. Dưới sự phát hiện của detector UV 203 nm, từng các phân đoạn dịch chứa các saponin điển hình được thu hồi. Ly tâm dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 40oC để loại dung môi hữu cơ, sau đó dịch được đông khô ở -85oC và áp suất khoảng 10 Pa, để thu được các saponin điển hình tinh chế. 2.2.3. Xác định cấu trúc và độ tinh khiết của các saponin tinh chế được  Xác định cấu trúc của saponin tinh chế được Cân chính xác khoảng 10 mg saponin tinh chế đã được sấy khô đến kiệt cho vào bình định mức 100 ml, thêm 70 ml methanol. Hỗn hợp thu được mang đi siêu âm trong 10 phút, sau đó bổ sung methanol tới đúng vạch. Các saponin điển hình được xác định bằng phổ khối và so sánh thời gian lưu với mẫu chuẩn ở cùng điều kiện sắc ký bằng pháp pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối đầu dò DAD. Phổ khối được xác định bằng hệ thống sắc ký lỏng ghép nối với đầu dò khối phổ LC-MS/MS 6420 Triple Quad (Agilent Technologies) - Nguồn ion ESI: ion hóa tia điện. - Capillary Voltage: 4000 V. - Áp suất Nebulizer: 30 psi. - Tốc độ dòng khí N2: 11 L/phút. - Nhiệt độ: 300oC. - Chế độ Scan: từ 100 – 1500 m/z, CE là 4 V.  Xác định độ tinh khiết của các saponin điển hình tinh chế được Các mẫu saponin điển hình tinh chế được hòa tan trong methanol, lọc qua màng lọc 0,2 µm, sau đó được định tính, định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối đầu dò DAD đã được xây dựng ở trên. 2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu được xử lý thông qua phần mềm Microsoft Office Excel 2013. 22
  31. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ 3.1. Thẩm định phương pháp định lượng R1, Rg1 và Rb1 trong tam thất bằng phương pháp HPLC 3.1.1. Độ đặc hiệu của phương pháp Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn đơn, dung dịch chuẩn hỗn hợp, dung dịch mẫu thử, mẫu trắng với điều kiện sắc ký được quy định trong mục 2.2.1. Kết quả sắc ký đồ của các mẫu chất chuẩn R1, chất chuẩn Rg1, chất chuẩn Rb1, hỗn hợp chất chuẩn R1 - Rg1 - Rb1, mẫu trắng, mẫu củ tam thất được thể hiện theo hình 3.1 đến hình 3.6. Hình 3.1. Sắc ký đồ mẫu chuẩn R1 Hình 3.2. Sắc ký đồ mẫu chuẩn Rg1 23
  32. Hình 3.3. Sắc ký đồ mẫu chuẩn Rb1 Hình 3.4. Sắc ký đồ mẫu chuẩn hỗn hợp gồm R1, Rg1 và Rb1 Hình 3.5. Sắc ký đồ mẫu trắng 24
  33. Hình 3.6. Sắc ký đồ mẫu thử từ củ tam thất Nhận xét: Các sắc ký đồ cho thấy R1, Rg1 và Rb1 được tách hoàn toàn trên sắc ký đồ của chuẩn hỗn hợp 3 chất chuẩn và trong dung dịch mẫu thử. Thời gian lưu của mẫu pic chuẩn R1 từ phút 14 đến phút 15, Rg1 từ phút 17 đến phút 18 và Rb1 từ phút 35 tới 36. So sánh với sắc ký đồ mẫu thử, ta thấy thời gian lưu của ba chất R1, Rb1 và Rg1 là giống với như thời gian lưu của các pic chuẩn ở các pic chuẩn riêng lẻ và trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn hỗn hợp. Trong khi đó sắc ký đồ của mẫu trắng không có pic nào có thời gian lưu trùng với của các pic R1, Rg1 và Rb1. Kết luận: Phương pháp sắc ký có độ đặc hiệu cao để định lượng đồng thời R1, Rg1 và Rb1. 3.1.2. Tính thích hợp của hệ thống Tính thích hợp của hệ thống được xác định bằng phương pháp đo sắc ký 6 lần dung dịch chuẩn R1, Rg1 và Rb1 có nồng độ 160 µg/ml với điều kiện sắc ký như mục 2.2.1. Kết quả thời gian lưu và diện tích các mẫu thu được như trong bảng 3.1. 25
  34. Bảng 3.1. Kết quả đánh giá tính thích hợp của hệ thống R1 Rg1 Rb1 Diện tích Diện tích Diện tích STT Thời gian Thời gian Thời gian pic pic pic lưu (phút) lưu (phút) lưu (phút) (mAU*s) (mAU*s) (mAU*s) 1 14,298 273,2 17,869 391,7 35,187 251,4 2 14,245 270,6 17,85 393,5 35,186 249,7 3 14,221 269,8 17,913 392,8 35,182 252,6 4 14,232 275,2 17,873 392,5 35,199 251,3 5 14,228 273,8 17,877 391,0 35,218 255,0 6 14,294 271,9 17,872 390,6 35,245 250,4 TB 14,253 272,4 17,876 392,0 35,203 251,7 RSD 0,24 0,75 0,12 0,28 0,07 0,75 (%) Nhận xét: Kết quả cho thấy độ lệch chuẩn tương đối RSD của diện tích pic và thời gian lưu của cả 3 mẫu chuẩn R1, Rg1 và Rb1 đều dưới 1%. Kết luận: Hệ thống HPLC và các điều kiện sắc ký đã được lựa chọn sử dụng thích hợp trong quá trình định lượng R1, Rg1 và Rb1. 3.1.3. Độ tuyến tính và khoảng nồng độ Tiến hành sắc ký lần lượt các dãy dung dịch chuẩn R1, Rg1 và Rb1 có nồng độ từ 10 - 160 µg/ml. Kết quả thu được như bảng 3.2. 26
  35. Bảng 3.2. Kết quả khảo sát độ tuyến tính Nồng độ (µg/ml) 10 20 40 80 120 160 R1 Diện tích pic 13,7 28,4 63,3 131,8 204,8 272 (mAU*s) Nồng độ (µg/ml) 10 20 40 80 120 160 Rg1 Diện tích pic 25,0 50,2 96,8 193,7 299,4 398,7 (mAU*s) Nồng độ (µg/ml) 10 20 40 80 120 160 Rb1 Diện tích pic 14,7 31,7 64,3 125,8 190,8 252,2 (mAU*s) Kết quả thống kê Phương trình hồi quy Hệ số tương quan R2 Hệ số r R1 y = 1,7365x - 5,4487 0,9998 0,9999 Rg1 y = 2,494x - 1,4398 0,9997 0,9999 Rb1 y = 1,5816x - 0,0961 0,9999 0,9999 Nhận xét: Phương trình hồi quy được xây dựng dựa trên kết quả với hệ số y (mAU.min) là diện tích pic, x (µg/ml) là nồng độ mẫu phân tích. Kết quả các phương trình cho thấy trong khoảng nồng độ đã khảo sát từ 10 – 160 µg/ml của R1, Rg1 và Rb1 có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic với nồng độ đối với cả ba chất, với hệ số hồi quy tuyến tính r và hệ số tương quan R2 đều lớn hơn 0,995. Kết luận: Phương pháp có thể định lượng được R1, Rg1 và Rb1 trong khoảng nồng độ từ 10 – 160 µg/ml. 3.1.4. Độ lặp lại Tiến hành định lượng độc lập 6 mẫu dung dịch thử của củ tam thất với điều kiện sắc ký như mục 2.2.1. Kết quả như trong bảng 3.3. 27
  36. Bảng 3.3. Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp Độ ẩm Khối lượng mẫu Hàm lượng trong củ tam thất (%) STT (%) tam thất (mg) R1 Rg1 Rb1 1 103,6 0,68 3,49 3,64 2 102,3 0,71 3,51 3,61 3 100,9 0,69 3,47 3,56 11,27 4 105,5 0,69 3,53 3,72 5 103,5 0,70 3,52 3,65 6 104,1 0,69 3,46 3,67 TB 0,69 3,50 3,64 SD 0,01 0,03 0,05 RSD (%) 1,48 0,80 1,49 Nhận xét: Hàm lượng R1, Rg1 và Rb1 trung bình trong tam thất lần lượt là 0,69%; 3,50% và 3,64% với độ lệch chuẩn RSD tương ứng là 1,48%; 0,80%; 1,49%. Kết quả cho thấy giá trị RSD đều nhỏ hơn 2%. Kết luận: Phương pháp có độ lặp lại cao. 3.1.5. Độ đúng Độ đúng được đánh giá bằng cách xác định tỷ lệ thu hồi của chuẩn R1, Rg1 và Rb1 khi thêm vào mẫu củ tam thất. - Mẫu củ tam thất: cân chính xác 50 mg bột củ tam thất, xử lý như trong mục 2.2.1. - Mẫu củ tam thất được thêm chuẩn: cân chính xác 50 mg bột củ tam thất. Tiến hành thêm chuẩn ở 3 mức khoảng 80%, 100 % và 120% so với hàm lượng của R1, Rg1 và Rb1 trong mẫu củ tam thất. Xử lý mẫu tương tự như mô tả trong mục 2.2.1. 28
  37. Tiến hành định lượng mẫu củ tam thất và mẫu củ tam thất thêm chuẩn. Kết quả thu được như trong bảng 3.4. Bảng 3.4. Độ đúng của phương pháp Nồng độ Nồng độ chuẩn Nồng độ thử thêm Độ thu hồi (%) mẫu thêm (µg/ml) chuẩn (µg/ml) STT thử R Rg Rb R Rg Rb R Rg Rb (µg/ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 22,2 112,0 114,2 99,0 99,8 99,2 2 10 50 50 22,0 111,4 113,7 97,0 98,6 98,2 3 22,3 111,7 115,7 100,0 99,2 102,2 4 R1 :12,3 24,1 122,5 124,8 98,3 100,7 100,3 5 Rg1:62,1 12 60 60 24,4 121,3 124,2 100,8 98,7 99,3 6 Rb1:64,6 24,0 121,6 123,5 97,5 99,1 98,2 7 26,1 123,2 125,4 98,6 101,8 101,3 8 14 70 70 25,9 122,8 124,5 97,1 101,1 99,8 9 26,7 121,4 124,3 102,8 98,8 99,5 Nhận xét: Độ đúng của phương pháp định lượng R1, Rg1 và Rb1 đều nằm trong khoảng 97-103% đạt theo yêu cầu về độ thu hồi cho phép theo AOAC. Kết luận: Phương pháp có độ đúng đạt yêu cầu. 3.2. Định lượng saponin toàn phần trong mẫu củ tam thất Tiến hành xác định hàm lượng R1, Rg1 và Rb1 trong củ tam thất bằng phương pháp đã xây dựng. Kết quả như trong bảng 3.5. 29
  38. Bảng 3.5. Kết quả định lượng hàm lượng R1, Rg1 và Rb1 trong củ tam thất Độ ẩm Hàm lượng trong củ tam thất (%) STT nguyên liệu R Rg Rb (%) 1 1 1 1 0,69 3,48 3,64 2 0,68 3,52 3,62 3 0,71 3,47 3,57 11,21 4 0,69 3,54 3,71 5 0,70 3,55 3,65 6 0,68 3,46 3,68 TB 0,69 3,50 3,65 SD 0,01 0,04 0,05 RSD (%) 1,69 1,09 1,33 Nhận xét: Hàm lượng saponin toàn phần (R1, Rg1, Rb1) trong củ tam thất chiếm 7,84% tính theo tổng hàm lượng của R1, Rg1 và Rb1. Mẫu dược liệu được cho là phù hợp với tiêu chuẩn theo Dược điển Việt Nam V, với hàm lượng R1 lớn hơn 0,4% và tổng hàm lượng R1, Rg1 và Rb1 lớn hơn 5%[2]. Kết luận: Mẫu tam thất đạt yêu cầu. 3.3. Chiết xuất saponin toàn phần từ củ tam thất Tiến hành chiết xuất tam thất theo các phương pháp chiết xuất khác nhau như mô tả trong mục 2.2.2. Định lượng các mẫu thu được kết quả như bảng 3.6. 30
  39. Bảng 3.6. Kết quả chiết xuất saponin của ba phương pháp chiết STT Phương pháp Tỷ lệ saponin chiết Tỷ lệ tổng 3 Hiệu suất chiết xuất so với dược liệu saponin chiết xuất (%) (%) xuất được so với dược liệu (%) R1 Rg1 Rb1 1 Đun hồi lưu 0,74 3,24 3,19 7,17 91,90 2 Ngâm lạnh 0,72 3,20 3,14 7,06 90,43 3 Chiết nóng 0,70 3,52 3,13 7,35 92,48 Dựa trên kết quả bảng 3.6, phương pháp chiết nóng đạt hiệu suất chiết xuất cao nhất (92,48%), cao hơn so với hai phương pháp còn lại. Ngoài ra, phương pháp chiết nóng sử dụng dung môi là nước tinh khiết, đây là một dung môi dễ kiếm, an toàn với môi trường và không gây ra cháy nổ khi so sánh với dung môi chứa ethanol. Chính vì vậy, phương pháp chiết nóng được chọn làm phương pháp tiến hành chiết xuất PPG. Tiến hành chiết xuất 3 mẻ, mỗi mẻ 100 gam dược liệu tam thất bằng phương pháp chiết nóng như quy trình mô tả trong mục 2.2.2. Định lượng các mẫu thu được kết quả thu được như trong bảng 3.7. 31
  40. Bảng 3.7. Kết quả chiết xuất saponin từ củ tam thất thông qua chiết nóng Khối Hàm lượng saponin tính Hàm lượng Hiệu suất lượng Hàm theo dược liệu (%) tổng 3 saponin chiết tính theo STT dược ẩm trong cao 3 saponin R1, liệu (%) R1 Rg1 Rb1 chiết tính theo Rg1 và Rb1 (g) dược liệu (%) (%) 1 100,6 0,64 3,35 3,23 7,22 92,09 2 100,3 11,35 0,63 3,36 3,24 7,23 92,20 3 99,5 0,64 3,38 3,29 7,31 93,24 TB 0,64 3,36 3,25 7,25 92,52 Kết quả cho thấy hiệu suất chiết xuất cao đạt 92,52 %. 3.4. Tinh chế saponin trong mẫu củ tam thất 3.4.1. Tinh chế saponin toàn phần Tiến hành tinh chế saponin toàn phần theo như mô tả trong mục 2.2.2 để thu được cao chuẩn hoá giàu saponin. Kết quả thu được như trong bảng 3.8. Bảng 3.8. Kết quả tinh chế saponin toàn phần Khối Hàm lượng saponin Hàm lượng tổng 3 Hiệu Hiệu lượng tính theo dược liệu (%) saponin trong cao suất suất toàn STT cao lỏng chiết tính theo tinh chế quy trình R Rg Rb 1:1 (g) 1 1 1 dược liệu (%) (%) (%) 1 30,1 0,63 3,32 3,18 7,13 98,34 90,99 2 30,1 0,63 3,29 3,22 7,14 98,48 91,12 3 29,9 0,59 3,26 3,22 7,07 97,52 90,22 TB 30,0 0,62 3,29 3,21 7,11 98,11 90,78 32
  41. Kết quả cho thấy hiệu suất tinh chế cao chuẩn hoá giàu saponin bằng nhựa hấp phụ macroporous D101 đạt hiệu suất rất cao (98,11%). Hiệu suất toàn quy trình đạt 90,78 %. Mẫu cao khô tam thất giàu saponin sau khi đông khô được đánh giá hàm lượng R1, Rg1 và Rb1 trong mẫu cao. Kết quả thu được như trong bảng 3.9. Bảng 3.9. Kết quả hàm lượng R1, Rg1 và Rb1 trong mẫu cao giàu saponin Khối Khối lượng saponin (mg) Hàm lượng Tổng hàm lượng STT lượng saponin trong R1, Rg1 và Rb1 R1 Rg1 Rb1 cao (mg) cao (mg) trong cao khô (%) 1 100,2 6,4 34,2 33,9 74,5 74,35 2 99,7 6,6 33,9 32,7 73,2 73,42 3 100,5 6,6 33,1 33,9 73,6 73,23 TB 100,1 6,5 33,7 33,5 73,8 73,67 Kết quả bảng 3.9 cho thấy cao khô tam thất chứa tổng hàm lượng saponin R1, Rg1 và Rb1 cao (73,67 %). 3.4.2. Tinh chế saponin điển hình bằng sắc ký lỏng đầu dò PDA Tiến hành tinh chế các saponin điển hình trong mẫu cao giàu saponin bằng phương pháp như mô tả trong mục 2.2.2. Kết quả sắc ký đồ như được nêu trong hình 3.7. 33
  42. Hình 3.7. Sắc ký đồ phân đoạn với đầu dò PDA ở bước sóng 203 nm Phân đoạn S1 và S2 được thu lấy dịch riêng, sau đó loại dung môi như mô tả trong mục 2.2.2 thu được saponin tinh chế điển hình S1 và S2. Khối lượng cao khô saponin S1 và S2 thu được như bảng 3.10. Bảng 3.10. Khối lượng saponin S1 và S2 thu được Khối lượng cao tinh chế giàu Khối lượng S1 Khối lượng S2 saponin(mg) 250,3 73,3 71,8 Như vậy từ 250,3 cao tinh chế thu được 2 saponin là 73,3 mg S1 và 71,8 mg S2. 3.5. Xác định cấu trúc và độ tinh khiết của các saponin tinh chế được Saponin S1, S2 được xác định cấu trúc bằng phổ khối và so sánh thời gian lưu với chuẩn Rg1 và Rb1. Kết quả thu được như trong hình 3.8 – 3.11. 34
  43. Hình 3.8. Phổ khối của saponin S1 Hình 3.9. Phổ khối của saponin S2 Hình 3.10. Sắc ký đồ của mẫu saponin S1 35
  44. Hình 3.11. Sắc ký đồ của mẫu saponin S2 Kết quả sắc ký đồ cho thấy thời gian lưu của saponin S1, S2 giống thời gian lưu của saponin Rg1, Rb1 tương ứng trong cùng điều kiện sắc ký. - Phổ khối của S1 có m/z là 835,3 tương ứng với [Rg1 + Cl] . Phổ khối của S2 - có m/z là 1143,5 tương ứng với [Rb1 + Cl] . Những kết quả trên chỉ ra rằng saponin S1 tinh chế được là Rg1, saponin S2 tinh chế được là Rb1. Tiến hành đánh giá độ tinh khiết của hai saponin điển hình Rg1 và Rb1 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Kết quả thu được saponin Rg1 và Rb1 có độ tinh khiết cao trên 95% lần lượt tương ứng là 98,3 % và 97,4%. Kết luận: Từ 250,3 mg cao chuẩn hoá giàu saponin tương ứng thu được 73,3 mg Rg1 và 71,8 mg Rb1 có độ tinh khiết lần lượt là 98,3% và 97,4%. 36
  45. CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 4.1. Về phương pháp định lượng notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Rb1 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Thẩm định phương pháp là sự khẳng định bằng việc kiểm tra và cung cấp bằng chứng khách quan chứng minh rằng phương pháp đó đáp ứng được các yêu cầu đặt ra (fitness for the purpose). Thẩm định phương pháp phân tích là một phần không thể thiếu nếu muốn có một kết quả phân tích đáng tin cậy [5]. Việc thẩm định phương pháp định lượng tam thất có vai trò quan trọng trong việc định tính, định lượng các chất có trong củ tam thất, cũng như xây dựng lên những tiêu chuẩn cho các nghiên cứu về sau. Trong quá trình thẩm định tam thất, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp đầu dò DAD đã được lựa chọn do các ưu điểm như độ chính xác, nhạy cảm, khả năng định lượng tốt và sự thích hợp trong việc tách các chất dễ bị phân huỷ nhiệt trong tam thất. Thực tế chứng minh, đã có rất nhiều nghiên cứu về quy trình thẩm định các saponin trong tam thất thông qua HPLC kết hợp đầu dò DAD với kết quả thu được khả quan [23, 26]. Dựa trên kết quả đã ghi nhận được, quy trình thẩm định đã có độ đặc hiệu, tính thích hợp hệ thống, độ tuyến tính và khoảng nồng độ từ 10 – 160 µg/ml, độ lặp lại, độ đúng đáp ứng yêu cầu theo AOAC. Theo đó, quy trình thẩm định được cho là hợp lệ và có thể ứng dụng trong định lượng saponin R1, Rg1, Rb1. Dựa trên quy trình thẩm định đã xây dựng, tiến hành định lượng dược liệu nhằm xác định nồng độ ba loại saponin R1, Rg1 và Rb1 có trong mẫu củ tam thất được nghiên cứu. Kết quả cho thấy tổng hàm lượng của ba loại saponin chính có trong mẫu củ tam thất chiếm 7,84% khối lượng dược liệu, với tỷ lệ trong notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1 và Rb1 lần lượt là 0,69%; 3,50% và 3,65%. Đối chiếu với tiêu chuẩn của Dược Điển Việt Nam V, quy định hàm lượng notoginsenosid R1 không ít hơn 0,4% và tổng hàm lượng ba saponin R1, Rb1 và Rg1 không ít hơn 5% trong mẫu dược liệu rễ củ khô kiệt, mẫu có kết quả đạt chuẩn so các yêu cầu đề ra [2]. Thông qua quá trình thẩm định, mẫu củ tam thất được cho là đạt điều kiện dược liệu, phù hợp cho các thử nghiệm chiết xuất và tinh chế của đề tài. 4.2. Về quy trình chiết xuất và tinh chế saponin Hiện nay, đã có rất nhiều phương pháp tiên tiến được ứng dụng trong việc chiết xuất saponin từ tam thất như sử dụng sóng siêu âm, sóng vi ba hay chiết dưới 37
  46. áp suất lớn [38, 39], tuy vậy các phương pháp này mới chỉ dừng lại ở phòng thí nghiệm do sự hạn chế về kinh phí trong chiết xuất ở quy mô lớn. Trong quá trình chiết xuất quy mô công nghiệp, việc sử dụng một phương pháp chiết xuất tối giản về điều kiện cơ sở vật chất được coi là một yếu tố quan trọng. Chính vì các nguyên nhân trên, nghiên cứu này thử nghiệm hiệu suất của ba phương pháp ngâm lạnh, chiết nóng và đun hồi lưu trong chiết xuất tam thất, đây là ba phương pháp với kỹ thuật không phức tạp, dung môi dễ kiếm và phù hợp với quá trình chiết xuất quy mô lớn dễ ứng dụng trong công nghiệp. Thông qua kết quả khảo sát, phương pháp chiết nóng (92,48%) không chỉ đạt hiệu suất cao hơn so với chiết xuất ngâm lạnh (90,43%) và đun hồi lưu (91,90%) mà còn sử dụng dung môi là nước tinh khiết, một dung môi dễ kiếm và an toàn trong phòng thí nghiệm và với môi trường hơn so với ethanol. Dựa trên các kết quả trên, phương pháp chiết nóng được sử dụng trong đề tài trong quá trình chiết xuất saponin toàn phần từ dược liệu thô. Thông qua việc ứng dụng phương pháp, kết quả định lượng cho thấy hàm lượng trung bình của ba saponin trong tam thất đã chiết xuất chiếm 7,25% khối lượng dược liệu thô ban đầu với hiệu suất chiết xuất cao 92,52%. Đây được coi là một phương pháp chiết xuất đơn giản, hiệu quả cao về mặt kinh tế, tạo tiền để cho việc nâng cấp quy mô công nghiệp. Quá trình tinh chế saponin toàn phần từ cao tam thất chiết xuất được được tiến hành thông qua phương pháp sắc ký cột sử dụng nhựa macroporous D101. Nguyên lý của quá trình phân tách dựa trên sự khác biệt giữa khối lượng phân tử, độ phân cực hình dạng của các phân tử sẽ dẫn đến sự khác biệt về ái lực đối với chất hấp phụ. Dựa trên nguyên lý trên, khi pha loãng và cho cao hấp phụ vào cột chứa nhựa macroporous D101, các phân tử saponin sẽ được giữ lại trên cột bởi ái lực lớn của các saponin với pha tĩnh và các tạp chất với ái lực thấp hơn sẽ được loại bỏ. Sau đó, quá trình rửa giải với nước tinh khiết sẽ loại bỏ các tạp chất phân cực như polysaccarid hay các amino axit khỏi cột [40]. Dựa trên các nghiên cứu trước, saponin được thông qua việc rửa giải cột với ethanol nồng độ 70o nhằm rửa giải hai nhóm saponin Rb và Rg với hiệu suất cao nhất [3]. Phương pháp tiến hành có hiệu suất tinh chế rất cao lên tới 98% và đạt hiệu suất toàn bộ quá trình là 90,78%, cao hơn so với các quy trình tinh chế trước đó [3, 21, 22, 44]. Tổng hàm lượng 3 saponin trong cao khô tinh chế (73,67%) cũng tương đương so với phương pháp sử dụng nhựa macroporous D101 trong tinh chế trước đây [3]. Nồng độ thu được của ba loại saponin R1 (6,5%), Rg1 (33,7%) và Rb1 (33,5%) trong cao khô tinh chế được coi là phù hợp với hàm lượng của ba loại saponin điển hình R1, Rb1 và Rg1 trong thử nghiệm tại Thẩm Dương, Trung Quốc, với tỉ lệ ginsenosid Rb1 từ 26,17 – 29,60%, Rg1 từ 20,50 – 25,43% và notoginsenosid R1 trong 38
  47. khoảng 5,29% – 6,89% [46]. Dựa trên các kết quả trên, phương pháp tinh chế saponin toàn phần từ cao tam thất của đề tài được đánh giá là tốt, với nhiều ưu điểm như hiệu suất chiết xuất cao, sử dụng các dung môi dễ kiếm, rẻ, phù hợp trong các nghiên cứu sâu hơn về lĩnh vực ứng dụng sản xuất cao chuẩn hóa giàu saponin từ tam thất. Trong quá trình tinh chế các saponin điển hình, dựa trên kết quả về điều kiện pha động và thời gian lưu đã được khảo sát trong quá trình thẩm định phương pháp. Thực nghiệm đã thu được kết quả với 73,3 mg S1 và và 71,8 mg S2 đã được phân lập từ 250,3 mg cao tinh chế giàu saponin. 4.3. Về quy trình xác định cấu trúc và độ tinh khiết của các saponin tinh chế được Phổ khối là một phương pháp được sử dụng thường xuyên trong việc xác định cấu trúc phân tử và đã có nhiều ứng dụng với PPG, như việc xác định các saponin riêng biệt trong nghiên cứu chiết xuất tinh chế [38] hay trong những thử nghiệm in vivo về tác dụng dược lý [7], với kết quả chính xác. Trong nghiên cứu này, phổ khối được xác định bằng hệ thống sắc ký lỏng ghép nối với đầu dò khối phổ LC-MS/MS với nguồn ion ESI. Nguồn ion ESI thường được sử dụng đối với các chất phân cực và có trọng lượng phân tử lớn, được coi là phù hợp với nhóm chất saponin. Trong thử nghiệm, hai saponin ginsenosid Rg1 (S1) và ginsenosid Rb1 (S2) đã được phân lập và xác định cấu trúc thông qua LC-MS/MS kết hợp ESI, kết quả thu được là phổ khối 835,3 m/z của [Rg1 + Cl]- và 1143,5 m/z tương ứng với [Rb1 + Cl]-. Có nhiều thay đổi có thể được tiến hành nhằm tăng độ nhạy và cụ thể hoá hơn trong việc xác định cấu trúc của các saponin. Một thí nghiệm nhằm xác định cấu trúc ba saponin R1, Rg1 và Rb1 trong mẫu huyết thanh chó đã so sánh các điều kiện thực hiện phổ khối, với kết quả được ghi nhận về khả năng ghi nhận ion tốt hơn của nguồn ion ESI so với nguồn ion hoá học áp suất khí quyển(APCI) cũng như và độ nhạy của [M + Na]- được cho là tốt hơn so với [M + Cl]-, [M + HCOO]- hay [M – H]- trong việc lựa chọn dung môi từ các nghiên cứu trước đó [34]. Sự kết hợp giữa LC-MS/MS cùng với phổ cộng hưởng từ hạt nhân (H-NRM) cũng được cho là một phương pháp hữu ích trong việc tăng cường khả năng xác định cấu trúc cụ thể của các saponin, với khả năng phát hiện các hạt nhân 1H, 8O và 12C tốt hơn so với phổ LC-MS/MS, kèm theo những ưu điểm khác như sự bảo tồn mẫu phân tích hay khả năng tái tạo kết quả dựa trên các kết quả đã thu được từ những thí nghiệm trước [14]. 39
  48. Độ tinh khiết của Rg1 và Rb1 thu được tương ứng là 98,3 % và 97,4% thông qua phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Kết quả này hứa hẹn 2 saponin Rg1 và Rb1 có thể phát triển để dùng làm chất chuẩn trong phòng thí nghiệm. 40
  49. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 1. Kết luận Qua thời gian thực hiện đề tài, quá trình nghiên cứu đã thu được các kết quả theo các mục tiêu nghiên cứu đề ra: - Đã xây dựng được quy trình thẩm định ba loại saponin R1, Rg1 và Rb1 trong củ tam thất Panax pseudoginseng (Burk) F.H.Chen. - Xây dựng sơ bộ được quy trình bào chế cao chuẩn hoá giàu saponin từ củ tam thất với tổng hàm lượng tính theo 3 saponin chính (R1, Rg1, Rb1) đạt hơn 70% và tinh sạch hai saponin Rg1 và Rb1 từ cao chuẩn hoá giàu saponin đạt độ tinh khiết cao trên 95%. 2. Đề xuất - Nâng cấp quy mô công nghiệp đối với quy trình chiết xuất cao chuẩn hoá giàu saponin. - Tiến hành các nghiên cứu nhằm đánh giá về tác dụng dược lý của ginsenosid Rg1 và Rb1 trong mô hình thí nghiệm trên động vật. 41
  50. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Đỗ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, 289-291. 2. Hội đồng dược điển Việt Nam (2017), Dược điển Việt Nam V, Bộ Y tế. 3. Trần Trọng Biên và các cộng sự (2016), "Chiết xuất và tinh chế saponin từ củ Tam thất (Panax notoginseng Burk.)", Tạp chí Nghiên cứu Dược & Thông tin thuốc. 4+5, tr. 47-51. 4. Viện Dược Liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập. 2 NXB Khoa học và Kỹ thuật, 775-780. 5. Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm (2010), "Thẩm định phương pháp trong phân tích hoá học và vi sinh vật", NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr. 10-59. Tài liệu tiếng Anh 6. Association of Official Analytical Chemists (2002), AOAC Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals, 1 - 38. 7. Chen M. Y. et al. (2018), "Metabolic analysis of Panax notoginseng saponins with gut microbiota-mediated biotransformation by HPLC-DAD-Q-TOF- MS/MS", J Pharm Biomed Anal. 150, pp. 199-207. 8. Cheok Choon Yoong, Salman Hanaa Abdel Karim and Sulaiman Rabiha (2014), "Extraction and quantification of saponins: A review", Food Research International. 59, pp. 16-40. 9. Chu Y. et al. (2020), "Ginsenoside Rg1 Induces Apoptotic Cell Death in Triple-Negative Breast Cancer Cell Lines and Prevents Carcinogen-Induced Breast Tumorigenesis in Sprague Dawley Rats", Evid Based Complement Alternat Med. 2020, pp. 8886955. 10. Cui Xiuming and Sun Yuqin (2008),"Method for extracting panax notoginseng saponins from fresh panax notoginseng", Google Patent, China, CN101513438A 11. Du Qizhen et al. (2003), "Isolation of dammarane saponins from Panax notoginseng by high-speed counter-current chromatography", Journal of Chromatography A. 1008(2), pp. 173-180. 12. Gao Hongwei et al. (2020), "Ginsenoside Rb1 exerts anti-inflammatory effects in vitro and in vivo by modulating toll-like receptor 4 dimerization and NF- kB/MAPKs signaling pathways", Phytomedicine. 69, pp. 153197. 13. Gao Y. et al. (2017), "Hepatoprotective effects of ginsenoside Rg1 - A review", J Ethnopharmacol. 206, pp. 178-183. 14. Gathungu Rose M. et al. (2020), "The integration of LC-MS and NMR for the analysis of low molecular weight trace analytes in complex matrices", Mass spectrometry reviews. 39(1-2), pp. 35-54.
  51. 15. Gu Qun et al. (2010),"Method for extraction and seperation of ginsenoside Rg1", Google Patent, China, CN102532234A 16. He Qing et al. (2007),"Preparation method for extracting purified general saponin from notoginseng of Chinese traditional medicine", Google Patent, China, CN101049331A 17. Hong J. et al. (2014), "In vitro antioxidant and antimicrobial activities of flavonoids from Panax notoginseng flowers", Nat Prod Res. 28(16), pp. 1260- 6. 18. Hong S. J. et al. (2009), "Angiogenic effect of saponin extract from Panax notoginseng on HUVECs in vitro and zebrafish in vivo", Phytother Res. 23(5), pp. 677-86. 19. Hu Yupiao et al. (2018), "Optimisation of Ethanol-Reflux Extraction of Saponins from Steamed Panax notoginseng by Response Surface Methodology and Evaluation of Hematopoiesis Effect", Molecules. 23(5). 20. Huang Y. et al. (2017), "Ginsenoside Rg1 Activates Dendritic Cells and Acts as a Vaccine Adjuvant Inducing Protective Cellular Responses Against Lymphomas", DNA Cell Biol. 36(12), pp. 1168-1177. 21. Huang Yusheng et al. (2014),"Method for purifying R1 and Rb1 from Panax notoginsenosides", Google Patent, China, CN105796577A 22. Lan Xing et al. (2014),"The method that Rg1, Re and Rb1 are purified from arasaponin", Google Patent, China, CN105801656A 23. Lau Aik-Jiang, Woo Soo-On and Koh Hwee-Ling (2003), "Analysis of saponins in raw and steamed Panax notoginseng using high-performance liquid chromatography with diode array detection", Journal of Chromatography A. 1011(1), pp. 77-87. 24. Lee S. Y. (2020), "Ginsenoside Rg1 Drives Stimulations of Timosaponin AIII- Induced Anticancer Effects in Human Osteosarcoma Cells", Evid Based Complement Alternat Med. 2020, pp. 8980124. 25. Li Lie et al. (2005), "Determination of Four Active Saponins of Panax Notoginseng in Rat Feces by High-Performance Liquid Chromatography", Journal of Chromatographic Science. 43(8), pp. 421-425. 26. Li Lie et al. (2005), "Simultaneous quantification of six major active saponins of Panax notoginseng by high-performance liquid chromatography-UV method", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 38(1), pp. 45- 51. 27. Liu S. J. and Zhou S. W. (2000), "Panax notoginseng saponins attenuated cisplatin-induced nephrotoxicity", Acta Pharmacol Sin. 21(3), pp. 257-60. 28. Liu X. et al. (2014), "Panax notoginseng saponins attenuates cisplatin-induced nephrotoxicity via inhibiting the mitochondrial pathway of apoptosis", Int J Clin Exp Pathol. 7(12), pp. 8391-400. 29. Majinda Runner (2012), "Extraction and Isolation of Saponins", Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 864, pp. 415-26. 30. Ning Ning et al. (2012), "Panax notoginsenoside produces neuroprotective effects in rat model of acute spinal cord ischemia–reperfusion injury", Journal of Ethnopharmacology. 139(2), pp. 504-512.
  52. 31. Park S. et al. (2008), "Ginsenosides Rb1 and Rg1 suppress triglyceride accumulation in 3T3-L1 adipocytes and enhance beta-cell insulin secretion and viability in Min6 cells via PKA-dependent pathways", Biosci Biotechnol Biochem. 72(11), pp. 2815-23. 32. Qi L. W., Wang C. Z. and Yuan C. S. (2011), "Isolation and analysis of ginseng: advances and challenges", Nat Prod Rep. 28(3), pp. 467-95. 33. Shu-lin Chen (2005), "Simultaneous Distillation and Solvent Extraction and GC/MS Analysis of Volatile Oil from Flowers of Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen", Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis. 34. Song M. et al. (2010), "Simultaneous determination of three Panax notoginseng saponins at sub-nanograms by LC-MS/MS in dog plasma for pharmacokinetics of compound Danshen tablets", J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 878(32), pp. 3331-7. 35. Tan Ning-Hua and Zhou Jun (2006), "Plant Cyclopeptides", Chemical Reviews. 106(3), pp. 840-895. 36. Tian W. et al. (2017), "Effects of ginsenoside Rg1 on glucose metabolism and liver injury in streptozotocin-induced type 2 diabetic rats", Genet Mol Res. 16(1). 37. Uzayisenga R., Ayeka P. A. and Wang Y. (2014), "Anti-diabetic potential of Panax notoginseng saponins (PNS): a review", Phytother Res. 28(4), pp. 510- 6. 38. Vongsangnak Wanwipa et al. (2004), "Towards efficient extraction of notoginseng saponins from cultured cells of Panax notoginseng", Biochemical Engineering Journal. 18(2), pp. 115-120. 39. Wan J. B. et al. (2006), "Simultaneous determination of nine saponins from Panax notoginseng using HPLC and pressurized liquid extraction", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 41(1), pp. 274-279. 40. Wan J. B. et al. (2008), "Quantification and separation of protopanaxatriol and protopanaxadiol type saponins from Panax notoginseng with macroporous resins", Separation and Purification Technology. 60(2), pp. 198-205. 41. Wan Jian-Bo et al. (2013), "Separation and purification of 5 saponin from Panax Notoginseng by preparative high-performance liquid chromatography", Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 36(3), pp. 406- 417. 42. Wang J. et al. (2011), "Isolation of four high-purity dammarane saponins from extract of Panax notoginseng by centrifugal partition chromatography coupled with evaporative light scattering detection in one operation", Phytochem Anal. 22(3), pp. 263-7. 43. Wang Ting et al. (2016), "Traditional uses, botany, phytochemistry, pharmacology and toxicology of Panax notoginseng (Burk.) F.H. Chen: A review", Journal of Ethnopharmacology. 188, pp. 234-258. 44. Wang Yitao, Wan Jianbo and Zhang Qingwen (2008),"Method for preparing notoginsenoside R1 and ginsenoside Rg1, Re, Rb1 and Rd", Google Patent, China, CN101575357A
  53. 45. Xu Y. et al. (2018), "Panax notoginseng for Inflammation-Related Chronic Diseases: A Review on the Modulations of Multiple Pathways", Am J Chin Med. 46(5), pp. 971-996. 46. Yao Hong et al. (2011), "Chemical fingerprinting and quantitative analysis of a Panax notoginseng preparation using HPLC-UV and HPLC-MS", Chinese medicine. 6, pp. 9. 47. Zhang Pengfei (2015),"Method for preparing panax notoginseng saponins", Google Patent, China, CN104800258A 48. Zhang Siqi et al. (2018), "Phytochemistry, pharmacology, and clinical use of Panax notoginseng flowers buds: Active Components and Uses of Panax notoginseng Flowers", Phytotherapy Research. 32. 49. Zhang Y. et al. (2013), "Bioactive protopanaxatriol type saponins isolated from the roots of Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen", Molecules. 18(9), pp. 10352-66. 50. Zhang Y. G. et al. (2008), "Panax notoginseng saponins attenuate atherosclerosis in rats by regulating the blood lipid profile and an anti- inflammatory action", Clin Exp Pharmacol Physiol. 35(10), pp. 1238-44. 51. Zheng Xian et al. (2017), "Ginsenoside Rb1 improves cardiac function and remodeling in heart failure", Experimental Animals. 66(3), pp. 217-228.
  54. PHỤ LỤC Sắc ký đồ mẫu chuẩn R1 Sắc ký đồ mẫu Rb1 chuẩn Sắc ký đồ mẫu Rg1 chuẩn
  55. Sắc ký đồ mẫu thử củ tam thất Sắc ký đồ mẫu tam thất đã tinh chế Phổ khối Rb1
  56. Phổ khối Rg1