›

Khóa luận Sàng lọc in silico các hợp chất trong tự nhiên theo tác dụng ức chế enzym HER2 định hướng điều trị ung thư vú

pdf 56 trang thiennha21 18/04/2022 3230
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Sàng lọc in silico các hợp chất trong tự nhiên theo tác dụng ức chế enzym HER2 định hướng điều trị ung thư vú", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_sang_loc_in_silico_cac_hop_chat_trong_tu_nhien_the.pdf

Nội dung text: Khóa luận Sàng lọc in silico các hợp chất trong tự nhiên theo tác dụng ức chế enzym HER2 định hướng điều trị ung thư vú

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC SINH VIÊN : NGÔ THỊ HẰNG ĐỀ TÀI SÀNG LỌC IN SILICO CÁC HỢP CHẤT TỰ NHIÊN CÓ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM HER2 HƯỚNG ĐIỀU TRỊ BỆNH UNG THƯ VÚ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2021
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC SINH VIÊN : NGÔ THỊ HẰNG ĐỀ TÀI SÀNG LỌC IN SILICO CÁC HỢP CHẤT TỰ NHIÊN CÓ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM HER2 HƯỚNG ĐIỀU TRỊ BỆNH UNG THƯ VÚ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khoá : QH. 2016.Y Người hướng dẫn: ThS. NGUYỄN THỊ THUÝ PGS.TS. VŨ MẠNH HÙNG HÀ NỘI – 2021
  3. Lời cảm ơn Đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất tới giáo viên hướng dẫn của tôi – ThS. Nguyễn Thị Thuý công tác tại Trường Đại học Y Dược – Đaị học Quốc gia Hà Nội, cô đã ân cần quan tâm, động viên, tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi trong suốt quãng thời gian tôi thực hiện khóa luận. Tôi cũng xin được cảm ơn PGS.TS Bùi Thanh Tùng công tác tại Trường Đại học Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội đã dẫn dắt tôi trong những bước đi đầu tiên thực hiện khóa luận của mình. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Vũ Mạnh Hùng công tác tại Học viện Quân Y, người đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình nhận và thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn người bạn đã đồng hành cùng nghiên cứu của tôi, em Nguyễn Hồng Nhung lớp K6 Dược đã hỗ trợ tôi trong suốt thời gian qua. Tôi cũng vô cùng biết ơn và xin được chân thành cảm ơn, các thầy cô ở bộ môn Bào chế, các thầy cô Trường Đại học Y Dược, cũng như các thầy cô trong Hội đồng chấm Khóa luận tốt nghiệp đã hết sức nhiệt tình, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận. Cuối cùng, tôi xin dành sự biết ơn sâu sắc nhất tới bố mẹ tôi và tất cả những người thân trong gia đình, những người bạn đã luôn ở bên yêu thương, ủng hộ để tôi có được ngày hôm nay! Hà Nội, ngày 26, tháng 5, năm 2021 Ngô Thị Hằng
  4. DANH MỤC KÍ HIỆU VIẾT TẮT ADMET Sự hấp thụ, phân bố, chuyển hoá, thải trừ ATP Phân tử mang năng lượng BRCA1 Gen ức chế khối u BRCA2 CLVT Chụp cắt lớp vi tính CSC Tế bào gốc ung thư CYP2D6 Enzym ở người được mã hóa bởi gen CYP2D6 CYP3A4 Enzym trong gan và ruột CYP1A2 Enzyme xúc tác chuyển hoá thuốc CYP2C19 Enzyme xúc tác chuyển hoá thuốc thụ thể trên màng tế bào thuộc nhóm thụ thể của HER2 yếu tố tăng trưởng thượng bì HBD Số nhóm cho liên kết hydro HBA Số nhóm nhận liên kết hydro MARK/ERK Chuỗi các protein trong tế bào truyền tín hiệu MRI Chụp cộng hưởng từ PDB Protein Data Bank (Ngân hang dữ liệu protein) PET/CT Chụp chẩn đoán hình ảnh dạng phân tử
  5. PET/MRI Chụp cắt lớp bằng bức xạ PI3K Là một họ của các enzym liên quan đến ung thư Root mean square deviation (Độ lệch căn quân RMSD phương) ROS Các gốc tự do oxygen Simplified Molecular Input Line Entry SMILE Specification UTV Ung Thư Vú Volumetric Modulated Arc Therapy hay Rapid VMAT Arc ( xạ trị cung điều biến thể tích)
  6. MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 1 1.1. Tổng quan về bệnh ung thư vú 1 1.1.1. Đại cương 1 1.1.2. Nguyên nhân – Các yếu tố nguy cơ 2 1.1.3. Các liệu pháp hiện tại cho ung thư vú 3 1.1.4. Tổng quan về đích HER2 5 1.2. Tổng quan về nghiên cứu In silico 6 1.2.1. Mô hình in silico trong nghiên cứu phát triển thuốc mới 6 1.2.2. Kỹ thuật Protein docking. 7 1.2.3. Quy tắc Lipinski về các hợp chất giống thuốc 9 1.2.4. Dự đoán ADMET các thông số dược động học và độc tính 9 1.3. Một số hợp chất có tác dụng ức chế enzym HER2 10 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1. Nguyên liệu 13 2.2. Thiết bị, phần mềm 14 2.3. Nội dung nghiên cứu 15 2.4. Phương pháp nghiên cứu 15 2.4.1. Chuẩn bị ligand 15 2.4.2. Chuẩn bị protein 15 2.4.3. Xác nhận giao thức docking 16 2.4.4. Nghiên cứu các đặc điểm giống thuốc 18 2.4.5. Nghiên cứu các đặc tình dược động học và độc tính 18
  7. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 20 3.1. Sàng lọc chất ức chế enzym HER2 trong tự nhiên 20 3.2. Kết quả phân tích các thông số Lipinski 31 3.3. Đánh giá các đặc tính ADMET 32 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 36 4.1. Về kết quả 36 4.1.1. Diplacone (ID:14539948) 36 4.1.2. [2-(naphthalen-2-ylamino)-2-oxoethyl] 3- (difluoromethoxy)benzoate (ID:4853197) 36 4.1.3. Mono-O-acetylbisdemethoxycurcumin (ID:52944954) 37 4.1.4. Berberin (ID:2353) 37 4.2. Về phương pháp 37 4.3. Những hạn chế và thách thức trong mô hình nghiên cứu In silico 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO
  8. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Kết quả docking các phân tử vào mục tiêu tác động với mức năng lượng liên kết tương ứng. Bảng 2. Bảng tương tác của các chất với các amin axit trong vùng trung tâm hoạt động Bảng 3. Các thông số Lipinski Bảng 4. Các đặc tính ADMET (hấp thụ, phân phối, chuyển hóa, bài tiết và độc tính) của năm lượt truy cập hàng đầu.
  9. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1. Cấu trúc 3D enzym HER2 được lấy từ ngân hàng dữ liệu protein Hình 2. Cấu trúc 3D enzym HER2 sau khi sàng lọc Hình 3. Kết quả re-dock ligand TAK-285 Hình 4. Sự tương tác giữa TAK-285 và HER2 Hình 5. Tương tác của Diplancone với enzyme HER2 Hình 6. Tương tác của [2-(naphthalen-2-ylamino)-2-oxoethyl] 3- (difluoromethoxy)benzoate với enzyme HER2 Hình 7. Tương tác của Mono-O-acetylbisdemethoxycurcumin với enzyme HER2 Hình 8. Tương tác của Berberin với enzyme HER2
  10. ĐẶT VẤN ĐỀ Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) báo cáo rằng ung thư vú là một trong những bệnh ác tính phổ biến nhất ở phụ nữ trên toàn thế giới. Ung thư vú có tỷ lệ mắc bệnh cao hơn đáng kể (43,3 trên 100.000) so với bất kỳ loại ung thư nào khác, tiếp theo là đại trực tràng , cổ tử cung , phổi và tử cung trong số các khối u phụ khoa [1]. Mặc dù tỷ lệ tử vong tương đối thấp, ung thư vú có tỷ lệ tử vong cao nhất (12,9 trên 100.000) so với bất kỳ loại ung thư nào khác. Mặc dù các liệu pháp phân tử điều trị ung thư vú đã phát triển nhanh chóng trong vài thập kỷ qua , các chiến lược điều trị trong tương lai với hiệu quả cao hơn và độc tính thấp hơn vẫn đang cần được nghiên cứu khẩn cấp [2]. Thụ thể 2 yếu tố tăng trưởng biểu bì ở người (HER2) là một mục tiêu đã được xác nhận trong liệu pháp điều trị ung thư vú. HER2, một thụ thể xuyên màng có hoạt tính tyrosine kinase, thuộc họ thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì và được biết đến như một chất trung gian mạnh mẽ cho sự phát triển và tăng sinh tế bào [3]. Nó đóng một vai trò quan trọng trong nhiều quá trình liên quan đến việc điều chỉnh sự tồn tại, tăng trưởng và biệt hóa của tế bào thông qua quá trình truyền tín hiệu liên kết với nhau liên quan đến việc kích hoạt PI3K / Akt và MAPK / ERK1 / 2 (protein hoạt hóa mitogen (MAP) kinase / điều chỉnh tín hiệu ngoại bào các con đường kinase (ERK) 1/2) [4,5]. Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng HER2 luôn ở trạng thái hoạt động và sẵn sàng tương tác với các thụ thể HER được kích hoạt bởi phối tử [6]. Sự biểu hiện quá mức của HER2 là một trong những bất thường phân tử liên quan đến sự phát triển của ung thư vú và tồn tại ở khoảng 30% bệnh nhân ung thư vú giai đoạn đầu. Việc phát hiện ra chất ức chế tyrosine kinase nhắm vào HER2 đã cung cấp một phương pháp điều trị thành công trong bệnh ung thư vú biểu hiện quá mức HER2 [7]. Nhiều chất ức chế phân tử nhỏ nhắm mục tiêu HER2 hiện đang được phát triển lâm sàng. Với mục đích phát triển các chất ức chế HER2 tiềm năng mới, việc sàng lọc ảo thông lượng cao dựa trên cấu trúc đã được thực hiện. Các đặc tính ADMET (hấp thụ, phân phối, chuyển hóa, bài tiết và độc tính) của các ứng viên phân tử nhỏ cũng được đánh giá.
  11. Việt Nam là quốc gia có nguồn tài nguyên dược liệu vô cùng dồi dào và phong phú, đây là một nguồn quan trọng và đầy hứa hẹn để xác định các hợp chất ức chế enzyme HER2. Hàng ngàn hoạt chất đã được xác định và phân lập từ các cây dược liệu là nguyên liệu vô cùng quý giá cho các nghiên cứu sàng lọc tìm kiếm các hợp chất dẫn đường có tác dụng tốt trong kiểm soát tế bào ung thư ở bệnh nhân ung thư vú. Từ những phân tích nêu trên, nhằm góp phần tìm kiếm các chất có hoạt tính tốt phù hợp phát triển thành thuốc điều trị ung thư vú, tôi tiến hành đề tài “Sàng lọc in silico các hợp chất trong tự nhiên theo tác dụng ức chế enzym HER2 định hướng điều trị ung thư vú” với mục tiêu chính như sau: 1. Xây dựng tổ hợp các hợp chất tự nhiên và sang lọc các hợp chất có tác dụng ức chế enzym HER2 bằng kĩ thuật docking phân tử 2. Phân tích đặc tính giống thuốc và đánh giá các thông số ADMET
  12. CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về bệnh ung thư vú 1.1.1. Đại cương Ung thư vú là nguyên nhân thứ hai gây tử vong do ung thư ở phụ nữ. Sự phát triển của ung thư vú là một quá trình gồm nhiều bước liên quan đến nhiều loại tế bào, và việc ngăn ngừa nó vẫn còn nhiều thách thức trên thế giới. Chẩn đoán sớm ung thư vú là một trong những cách tiếp cận tốt nhất để ngăn ngừa căn bệnh này. Ở một số nước phát triển, tỷ lệ sống tương đối sau 5 năm của bệnh nhân ung thư vú là trên 80% do được phòng ngừa sớm. Trong thập kỷ gần đây, đã có nhiều tiến bộ trong sự hiểu biết về bệnh ung thư vú cũng như trong việc phát triển các phương pháp phòng ngừa. Cơ chế sinh bệnh và cơ chế kháng thuốc của khối u được tiết lộ khi phát hiện ra tế bào gốc ung thư vú, người ta tìm thấy nhiều gen liên quan đến ung thư vú [21]. Ung thư vú là một trong những bệnh ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ trên toàn thế giới, chiếm khoảng 570.000 ca tử vong vào năm 2015. Hơn 1,5 triệu phụ nữ (25% tổng số phụ nữ mắc bệnh ung thư) được chẩn đoán mắc bệnh ung thư vú mỗi năm trên toàn thế giới 1 , 2 . Ở Mỹ, người ta ước tính rằng 30% tổng số ca ung thư mới (252.710 ca) ở phụ nữ là ung thư vú vào năm 2017 [3]. Ung thư vú là một bệnh ung thư di căn và thường có thể di chuyển đến các cơ quan ở xa như xương, gan, phổi và não. Chẩn đoán sớm bệnh có thể tiên lượng tốt và tỷ lệ sống sót cao [21]. Theo Bộ Y tế Việt Nam năm 2020, Ung thư vú (UTV) là loại ung thư thường gặp và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu do ung thư ở phụ nữ trên toàn thế giới. Mỗi năm nước ta có khoảng hơn 15.230 phụ nữ mới mắc và hơn 6.100 người tử vong do UTV. Ung thư vú nam chiếm khoảng 1% các trường hợp UTV. Đa số UTV xuất phát từ các tế bào biểu mô của vú. Bệnh Paget của vú có thể kèm theo UTV. Do vậy, khi có thành phần ung thư trên Paget vú cần được điều trị như UTV thông thường với giai đoạn tương ứng [8]. Các yếu tố tiên lượng quan trọng bao gồm: kích thước u nguyên phát, số lượng hạch di căn, thể mô bệnh học, độ mô học, tình trạng thụ thể nội tiết, 1
  13. tình trạng thụ thể yếu tố phát triển biểu bì người số 2 (human epidermal growth factor receptor-HER2) [8]. Tỷ lệ sống 5 năm của bệnh nhân UTV ngày càng được cải thiện. Thống kê tại Hoa kỳ năm 2001-2002: giai đoạn 0: 100%; giai đoạn I: 88%; giai đoạn II: 74-81%; giai đoạn III: 41-67%; giai đoạn IV: 15%. Đến năm 2012, tỷ lệ này là: giai đoạn 0 và I: 100%; giai đoạn II: 93%; giai đoạn III: 72%; giai đoạn IV: 22% [8]. Theo báo cáo ghi nhận ung thư toàn cầu Globocan 2020, tại Việt Nam, trong số ung thư ở nữ, số người mới mắc ung thư vú đứng hàng thứ nhất, với 21.555 người, chiếm 25.8%, tính theo cả hai giới đứng hàng thứ ba (sau ung thư gan và ung thư phổi) [19]. Tỷ lệ mới mắc chuẩn theo tuổi của ung thư vú ở nữ là 34.2 trên 100.000 dân. Ở cả hai giới, số tử vong do ung thư vú đứng hàng thứ tư (với 9.345 trường hợp) sau ung thư gan, ung thư phổi và ung thư dạ dày. Tỷ lệ tử vong chuẩn theo tuổi do ung thư vú là 13.8 trên 100.000 dân [19]. Tại Việt Nam, cách đây 5 đến 10 năm thì tỷ lệ người bệnh ung thư tới khám, điều trị ở giai đoạn muộn là hơn 70%. Thời gian qua, công tác truyền thông được đẩy mạnh, đặc biệt là trong Chương trình quốc gia về phòng, chống bệnh không lây nhiễm, nhờ đó, tỷ lệ người mắc bệnh ung thư đến khám và điều trị bệnh ở giai đoạn sớm tăng dần [19]. 1.1.2. Nguyên nhân – Các yếu tố nguy cơ Các khối u vú thường bắt đầu từ sự tăng sinh của ống dẫn sữa, sau đó phát triển thành các khối u lành tính hoặc thậm chí là ung thư di căn sau khi liên tục bị kích thích bởi các yếu tố gây ung thư khác nhau. Môi trường vi mô khối u như ảnh hưởng mô đệm hoặc đại thực bào đóng vai trò quan trọng trong việc khởi phát và tiến triển ung thư vú. Tuyến vú của chuột có thể bị tạo ra u khi chỉ chất đệm tiếp xúc với chất gây ung thư, không phải chất nền ngoại bào hoặc biểu mô . Các đại thực bào có thể tạo ra một vi môi trường gây viêm đột biến, có thể thúc đẩy sự hình thành mạch và cho phép các tế bào ung thư thoát khỏi sự từ chối miễn dịch. Các kiểu methyl hóa DNA khác nhau đã được quan sát thấy giữa môi trường bình thường và môi trường liên quan 2
  14. đến khối u, cho thấy rằng những thay đổi biểu sinh trong vi môi trường khối u có thể thúc đẩy quá trình sinh ung thư . Gần đây, một phân lớp mới của các tế bào ác tính trong các khối u được gọi là tế bào gốc ung thư (CSC) được quan sát thấy và có liên quan đến sự khởi phát, thoát ra và tái phát của khối u. Đây dân nhỏ của các tế bào, trong đó có thể phát triển từ tế bào gốc hoặc tế bào nguyên bản trong các mô bình thường, có khả năng tự tái tạo và có khả năng kháng các liệu pháp truyền thống như hóa trị và xạ trị [21]. Trong các yếu tố nguy cơ mắc bệnh, nổi bật là tiền sử gia đình có người mắc UTV, đặc biệt có từ 2 người mắc trở lên ở lứa tuổi trẻ. Người ta cũng tìm thấy sự liên quan giữa đột biến gen BRCA1 và BRCA2 với UTV, ung thư buồng trứng và một số ung thư khác. Một số yếu tố khác bao gồm: có kinh lần đầu sớm, mãn kinh muộn, phụ nữ độc thân, không sinh con, không cho con bú, sinh con đầu lòng muộn. Béo phì, chế độ ăn giàu chất béo, sử dụng rượu cũng góp phần tăng nguy cơ bị bệnh. Viêm vú trong khi sinh đẻ và một số bệnh vú lành tính cũng là các yếu tố tăng nguy cơ mắc UTV. Tuổi càng cao, nguy cơ mắc bệnh càng tăng. Tuy nhiên, bệnh cũng có thể xuất hiện ở những người rất trẻ [8]. 1.1.3. Các liệu pháp hiện tại cho ung thư vú 1.1.3.1. Phẫu thuật - Đối với khối u nguyên phát: có các hình thái phẫu thuật như cắt tuyến vú vét hạch nách, cắt tuyến vú tiết kiệm da, cắt tuyến vú bảo tồn quầng núm, phẫu thuật bảo tồn kết hợp với các kỹ thuật tái tạo [8]. - Đối với hạch vùng: có các hình thái phẫu thuật như nạo vét hạch nách hoặc sinh thiết hạch cửa [8]. - Tạo hình và tái tạo tuyến vú cho bệnh nhân UTV: đây là nhu cầu cấp thiết và chính đáng của người bệnh trong những năm gần đây. Có nhiều biện pháp tạo hình, tái tạo tuyến vú như sử dụng chất liệu độn (implant), sử dụng các vạt da cơ có cuống hay vạt da cơ tự do với kỹ thuật vi phẫu. Việc chỉ định loại phẫu thuật này cần được đưa ra bởi bác sỹ chuyên ngành ung bướu sau khi đã có đánh giá tổng thể toàn diện các vấn đề liên quan đến tiên lượng bệnh ung thư và chất lượng sống của người bệnh [8]. 3
  15. - Phẫu thuật sạch sẽ, phẫu thuật triệu chứng: đối với giai đoạn muộn [8]. 1.1.3.2. Xạ trị a. Xạ trị chiếu ngoài - Xạ trị tại diện u: áp dụng với các trường hợp có khối u lớn (>5cm) hoặc u ở vị trí ngoại biên, khả năng cắt rộng bị giới hạn [8]. - Xạ trị tại hạch vùng: áp dụng cho các trường hợp có 4 hạch di căn hoặc có hạch di căn kết hợp với yếu tố nguy cơ cao [8]. - Xạ trị trong điều trị bảo tồn: đây là lựa chọn bắt buộc trong điều trị bảo tồn ung thư vú. [8] Xạ trị trong UTV có nhiều hình thức đa dạng: xạ trị bằng máy Cobalt thông thường đến xạ trị bằng máy gia tốc với các kỹ thuật hiện đại như lập kế hoạch và xạ trị 3D, 14 xạ trị điều biến liều, xạ trị với suất liều thấp, xạ trị điều biến thể tích VMAT, xạ trị proton Mô phỏng xạ trị: Chụp mô phỏng bằng CLVT, MRI hoặc PET/CT, PET/MRI [8]. b. Xạ trị áp sát Cấy hạt phóng xạ vào khối u hoặc diện u trong các trường hợp không phẫu thuật triệt căn được hoặc bệnh lý kèm theo không thể phẫu thuật hay bệnh nhân nhất định từ chối phẫu thuật [8]. c. Xạ trị trong mổ (Intraoperative Radiation Therapy: IORT) - IORT là một kỹ thuật đặc biệt có thể cung cấp một liều xạ trị duy nhất, tập trung cao liều bức xạ tại nền khối u sau phẫu thuật hoặc phần còn lại của khối u không thể phẫu thuật được, các khối u tái phát, di căn [8]. - Các chỉ định cho xạ trị trong mổ với ung thư vú thường là các khối u vú mổ tiếp cận, mổ bảo tồn (kích thước u là dưới 3cm và không có hạch trên lâm sàng), hoặc các trường hợp tái phát [8]. - Có thể sử dụng IORT với liều duy nhất hoặc tăng cường xạ trị toàn bộ vú, đặc biệt những trường hợp ung thư vú tái phát [8]. 1.1.3.3. Điều trị hệ thống 4
  16. - Hóa trị: được áp dụng cho phần lớn các bệnh nhân UTV vào một thời gian nào đó. Đây là phương pháp hiệu quả cao, mang lại rất nhiều lợi ích về sống thêm cho người bệnh [8] - Điều trị nội tiết: được áp dụng cho các trường hợp UTV có thụ thể nội tiết dương tính [8]. - Điều trị đích: là phương pháp điều trị sử dụng các thuốc là kháng thể đơn dòng nhắm vào các đích đặc hiệu của tế bào ung thư vú. [8]. - Điều trị miễn dịch: là phương pháp dùng các thuốc tác động vào các đích là các cơ chế miễn dịch xác định, giúp cơ thể loại trừ tế bào ung thư [8]. 1.1.4. Tổng quan về đích HER2 Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì ở người 2, còn được gọi là c-erbB-2 , là một gen gây ung thư quan trọng trong ung thư vú và nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc thể 17 ở người (17q12). Homologene ở chuột là Neu , lần đầu tiên được xác định trong tế bào u nguyên bào thần kinh chuột gây ra 3- methylcholanthrene [22]. Sự biểu hiện của gen HER2 được kích hoạt chủ yếu thông qua quá trình khuếch đại và tái sắp xếp gen. Protein HER2 là một thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) thuộc họ tyrosine kinase và tạo thành dị thể với các thành viên họ EGFR liên kết với phối tử khác như Her3 và Her4, do đó để kích hoạt các con đường tín hiệu xuôi dòng [23]. Các thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì ở người (HER / erbB) tạo thành một họ gồm bốn thụ thể bề mặt tế bào liên quan đến việc truyền tín hiệu điều khiển sự phát triển và biệt hóa tế bào bình thường. Một loạt các yếu tố tăng trưởng đóng vai trò như phối tử, nhưng không có yếu tố nào đặc hiệu cho thụ thể HER2 [20]. Các thụ thể HER tồn tại dưới dạng dimer, đồng nhất hoặc dị phân. Liên kết phối tử với HER1, HER3 hoặc HER4 gây ra sự đồng phân hóa thụ thể nhanh chóng, với sự ưu tiên rõ rệt đối với HER2 như một đối tác mờ. Hơn nữa, các dị thể chứa HER2 tạo ra các tín hiệu nội bào mạnh hơn đáng kể so với các tín hiệu phát ra từ các tổ hợp HER khác. Trong các tế bào bình thường, rất ít phân tử HER2 tồn tại trên bề mặt tế bào, do đó rất ít dị vật được hình thành và tín hiệu tăng trưởng tương đối yếu và có thể kiểm soát được. Khi 5
  17. HER2 được biểu hiện quá mức, nhiều dị phân tử HER2 được hình thành và tín hiệu tế bào mạnh hơn, dẫn đến tăng cường khả năng đáp ứng với các yếu tố tăng trưởng và tăng trưởng ác tính. Điều này giải thích tại sao sự biểu hiện quá mức của HER2 là một dấu hiệu cho thấy tiên lượng xấu trong các khối u vú và có thể dự đoán về đáp ứng với điều trị. HER2 là một mục tiêu cụ thể và đầy hứa hẹn cho các phương pháp điều trị ung thư vú mới [20]. 1.2. Tổng quan về nghiên cứu In silico 1.2.1. Mô hình in silico trong nghiên cứu phát triển thuốc mới Phát triển thuốc mới là một quá trình rất phức tạp, tốn nhiều thời gian và tiền bạc (hàng tỷ đô la cho một loại thuốc mới) mà tỷ lệ thành công trong việc có được 9 từ một hợp chất dẫn đường ban đầu để thương mại hóa là rất thấp (< 2% của hợp chất mới đc nghiên cứu có thể có đặc tính sinh học phù hợp để làm thuốc). Theo nghiên cứu năm 2016 của DiMasi và cộng sự - Trung tâm nghiên cứu và phát triển thuốc, Đại học Tufts Hoa Kỳ, trung bình cần hơn 2,5 tỷ đô với thời gian từ 10-15 năm cho mỗi dự án (nếu thành công) đưa một thuốc ra ngoài thị trường. Quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc bao gồm nhiều khâu : xác định bệnh, xác định đích tác dụng của thuốc, thiết lập quy trình thử nghiệm, tìm kiếm hợp chất dẫn đường, xây dựng mối qua hệ giữa hợp chất và tác dụng, xác định pharmacophore, tối ưu hóa dược lực học và dược động học, sàng lọc (cơ quan phân lập, tế bào), nghiên cứu (nghiên cứu dược lý của hợp chất, mô hình hiệu quả điều trị bệnh, nghiên cứu sớm về độ an toàn và độc tính), các nghiên cứu tiền lâm sàng (độc tính), tiến hành bào chế, phát triển sản xuất, đăng kí giấy tờ pháp lí và thử nghiệm lâm sàng. Trong các nghiên cứu hiện nay, vấn đề thiết kế thuốc hiệu quả nhất đã được giải quyết bằng cách sử dụng kỹ thuật thiết kế thuốc dựa trên sự hỗ trợ của máy tính [9]. Trong quá trình đó máy tính được ứng dụng vào nhiều khâu, từ việc tìm kiếm các hợp chất hóa học có tác dụng sinh học, đến tối ưu hóa cấu trúc các hợp chất này nhằm tăng hoạt tính sinh học, giảm độc tính, tăng các tính chất dược động học của thuốc, đến các khâu nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng. Chúng được gọi chung là các phương pháp “in silico” nhằm 6
  18. phân biệt với các phương pháp còn lại . So với các phương pháp thực nghiệm truyền thống các phương pháp in silico có ưu thế giúp thiết kế những phân tử thuốc mới với những ưu thế vượt trội như giải thích bản chất phân tử của các tương tác thuốc, rút ngắn thời gian thực hiện. Ngoài ra chúng cho phép dự đoán hoạt tính sinh học sử dụng các mô hình toán học, nghiên cứu dự đoán cơ chế tác dụng, cơ chế gây độc của các hợp chất. Các phương pháp này giúp tiết kiệm đáng kể cả thời gian và tiền bạc trong việc phát triển một thuốc mới. Các phương pháp in silico đã giúp ích nhiều cho việc phát hiện các hợp chất mới có hoạt tính sinh học ngay cả trước khi chúng được tổng hợp hay phân lập thông qua quá trình sàng lọc ảo (virtual screening) [9]. 1.2.2. Kỹ thuật Protein docking. Docking phân tử là một phương pháp mới để sàng lọc các chất ức chế enzym và chất chủ vận thụ thể trong nghiên cứu bệnh ung thư vú. Phần mềm chuyên dụng sử dụng các mô hình phân tử ba chiều, độ phân giải cao của protein mục tiêu (ví dụ như thụ thể hoặc enzym) làm khuôn mẫu để dự đoán các phối tử mới có thể liên kết và có khả năng điều chỉnh hoạt động của nó [10]. Cấu trúc khuôn mẫu có được thông qua mô hình tương đồng hoặc tinh thể học. Trong docking phân tử, mục tiêu phân tử hoạt động theo các hướng khác nhau và mức độ tự do hình thành liên tiếp nhanh chóng cho phép phần mềm sàng lọc cơ sở dữ liệu hỗn hợp theo cách thông lượng cao. Các chức năng chấm điểm tích hợp dự đoán hoạt động sinh học dựa trên sự tương tác giữa phối tử và protein mục tiêu có tính đến các yếu tố như hình dạng phối tử, khả năng tương thích tĩnh điện với mục tiêu, hiệu ứng hòa tan, năng lượng liên kết và hiệu ứng entanpy và entropy; tất cả đều là những yếu tố quyết định quan trọng của sự tương tác phối tử - thụ thể thành công [21]. Docking thực chất là một bài toán tối ưu, dùng để tìm vị trí và cấu hình phù hợp nhất của một cơ chất gắn kết lên protein. Về mặt nhiệt động lực học, mục tiêu chính của docking là tìm ra cấu hình mà năng lượng tự do của toàn hệ là thấp nhất, tương đương với cấu hình bền nhất sau khi tạo thành liên kết giữa phối tử và protein. Để tìm cấu hình phù hợp nhất, cần liên hệ cấu hình 7
  19. không gian với các trị số đánh giá được khả năng gắn kết của cơ chất lên protein và sau đó áp dụng thuật toán tìm kiếm. Quá trình docking bao gồm ba bước chính: 1) Chuẩn bị cấu tử ; 2) Chuẩn bị protein ; 3) Mô phỏng docking. Chuẩn bị cấu tử: Cấu trúc các cấu tử có thể lấy từ các thư viện sẵn có như Pubchem, Zinc, cũng có thể được vẽ trên phần mềm ChemDraw, Chemsketch, Sau khi xây dựng được cấu trúc 3D, sử dụng phần mềm Chimera và Avogadro để xử lí cấu tử theo các bước: chỉnh sửa điện tích cho phù hợp, tối giản hóa năng lượng, gắn trường lực cho phân tử, xây dựng file dbpqt. Chuẩn bị protein: Thường sử dụng các cấu trúc 3D của protein đã có sẵn trên ngân hàng dữ liệu protein (protein data bank). Trường hợp chưa có sẵn, chúng ta có thể xây dựng cấu trúc 3D theo phương pháp mô phỏng tính tương đồng (Homology modeling). Về cơ bản của phương pháp mô phỏng tương đồng là sắp xếp chuỗi amino acid của protein thu được bởi quá trình giải mã gen lên khung cấu trúc bậc 3 của protein có độ phân giải cao nhưng thiếu thông tin của toàn bộ amino acid. Sau khi có cấu trúc 3D, sử dùng các phần mềm để chuẩn bị protein cho chương trình mô phỏng docking. Các bước chuẩn bị thường gồm: loại nước và các cấu tử (nếu có), thêm hydro, gắn trường lực, phân tích vùng có khả năng tương tác, xây dựng file dbqpt. Mô phỏng docking: Trước khi tiến hành mô phỏng, cần sử dụng phần mềm để tìm kiếm túi tương tác trên protein để đánh giá khả năng liên kết của phối tử tại vị trí đó. Vị trí của vùng tìm kiếm thông thường sẽ được đặt ở trung tâm hoạt động của protein. Khi quá trình docking được tiến hành, phần mềm sẽ tự động tìm kiếm cấu dạng phù hợp nhất của phối tử, tương ứng với năng lượng của toàn hệ thấp nhất. Cấu dạng này cùng với các tương tác sẽ được phân tích bởi các phần mềm chuyên dụng như: Chimera 1.14, Discovery Studio Visualizer 4.0, Autodock vina 1.1.2. 8
  20. 1.2.3. Quy tắc Lipinski về các hợp chất giống thuốc Hầu hết các ứng cử viên làm thuốc thất bại trong các thử nghiệm lâm sàng bởi không đạt các chỉ tiêu về hiệu quả và độc tính. Năm 1997, Christopher Lipinski và các cộng sự đã đưa ra bộ quy tắc số 5 về các hợp chất giống thuốc, theo đó các loại thuốc dùng đường uống thường có đặc tính hóa lý và cấu trúc trong một phạm vi giá trị nhất định. Một dược chất đường uống không vi phạm quá 2 trong 5 tiêu chí sau: - Trọng lượng phân tử: MW < 500 Dalton. - Số lượng nhóm cho liên kết hydro (Số lượng các nhóm –NH và – OH): HBD ≤ 5. - Số lượng nhóm nhận liên kết hydro (Bao gồm nguyên tử O và N): HBA ≤ 10. - Hệ số phân bố octanol/nước: LogP < 5. - Hệ số khúc xạ mol trong khoảng 40-130 [24]. Các thông số hóa lý này liên quan đến khả năng hòa tan trong nước, tính thấm ở ruột và bao gồm các bước đầu tiên trong sinh khả dụng đường uống. Nếu một hợp chất không vượt qua quy tắc RO5, nó sẽ có nguy cơ gặp vấn đề khi sử dụng đường uống. Tuy vậy một chất đáp ứng RO5 không đảm bảo nó sẽ trở thành thuốc, vì RO5 không đề cập đến các đặc điểm cấu trúc hóa học cụ thể được tìm thấy trong thuốc và hợp chất không phải thuốc [25]. 1.2.4. Dự đoán ADMET các thông số dược động học và độc tính Trong các nghiên cứu in silico, việc dự đoán các thông số dược động học như hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ và độc tính đã trở thành một phần quan trọng của quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới. Theo thống kê ở những năm 2000, trong số các thuốc không vượt qua các thử nghiệm lâm sàng, một nửa số trường hợp là do không đáp ứng yêu cầu về dược động học (39%) và độc tính trên động vật (11%)[26]. Ngày nay, cùng với các kho dữ liệu khổng lồ các hợp chất hóa học đang được phát triển và những tiến bộ 9
  21. công nghệ thông tin, việc sàng lọc các ứng cử viên thuốc dựa trên các thông số ADMET đã được thực hiện sớm hơn, trước khi đưa vào đánh giá trên lâm sàng. Kể từ khi xuất hiện các công cụ đánh giá thông số ADMET, chỉ còn 8% các thuốc thất bại do không đáp ứng được các thuộc tính ADMET, giúp tiết kiệm thời gian và tiền bạc, đồng thời đảm bảo tính an toàn và ổn định của thuốc được thiết kế [27]. Trong rất nhiều công cụ dự đoán ADMET, ngoài một số phần mềm thương mại như CASE ULTRA, DEREK, META-PC, METEOR, PASS, GUSAR , còn có các công cụ trực tuyến như ADMETlab, admetSAR, pkCSM, SwissADME khá phổ biến trong các nghiên cứu khoa học vì dự đoán ADMET chính xác và thuận tiện [28]. Công cụ trực tuyến pkCSM là một công cụ dự đoán ADMET mạnh mẽ, cho hiệu suất bằng hoặc cao hơn các công cụ tương tự hiện có. pkCSM dự đoán các thuộc tính ADMET bằng cách sử dụng đồ thị của các đặc tính để phát triển các mô hình dự đoán. Nền tảng này có thể nhanh chóng đánh giá các đặc tính dược động học và độc tính chính cần thiết cho giống thuốc và sinh khả dụng chỉ bằng cách cung cấp phân tử đầu vào dưới dạng SMILES. Với bộ dữ liệu lớn gồm hơn 10000 cấu trúc phân tử đối với độc tính trên chuột, 18000 hợp chất đối với các đặc tính chuyển hóa, 14 mô hình hồi quy định lượng các thuộc tính ADMET và 16 mô hình phân loại nhị phân, pkCSM có khả năng xử lý các tập dữ liệu lớn, có thể áp dụng vào các nghiên cứu sàng lọc[28,29]. 1.3. Một số hợp chất có tác dụng ức chế enzym HER2 Lapatinib là một chất ức chế tyrosine kinase kép đường uống nhắm mục tiêu vào thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) và thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì-2 ở người (HER2), cả hai đều thường biểu hiện quá mức trong bệnh ung thư ở người. Dữ liệu tiền lâm sàng đã chỉ ra rằng lapatinib là chất ức chế mạnh và có chọn lọc vùng tyrosine kinase của EGFR và HER2, và các tế bào khối u biểu hiện quá mức các thụ thể này sẽ bị lapatinib ức chế tăng trưởng cả in vitro và in vivo [30]. Các nghiên cứu chỉ ra rằng Emodin ức chế đáng kể sự phát triển của khối u và kéo dài thời gian sống sót ở những con chuột mang tế bào ung thư vú của 10
  22. người mang HER-2 . Hơn nữa, sự kết hợp của emodin và paclitaxel đồng thời ức chế sự phát triển phụ thuộc vào neu và phụ thuộc vào chỉ định của tế bào ung thư vú biểu hiện HER-2 / neu- loverexpress và đồng thời ức chế sự phát triển của khối u và kéo dài thời gian sống sót ở những con chuột khỏe mạnh mang bản đồ các tế bào khối u của người biểu hiện mức độ cao của p185 neu. Cả phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch và phân tích Western blot đều cho thấy rằng emodin làm giảm quá trình phosphoryl hóa tyrosine của HER-2 / neu trong mô khối u. Kết hợp với nhau, kết quả của chúng tôi cho thấy rằng hoạt động tyrosine kinase của HER-2 / neu là cần thiết cho sự phát triển của khối u và tính kháng hóa học và các chất ức chế tyrosine kinase như emodin có thể ức chế sự phát triển của HER-2 / neu-làm tăng biểu hiện khối u ở chuột và cũng gây nhạy cảm các khối u này đến paclitaxel [31]. Lapatinib, một chất ức chế tyrosine kinase mới của HER2 / EGFR, được sử dụng để điều trị ung thư vú dương tính với HER2. Tuy nhiên, tình trạng kháng thuốc mắc phải đã hạn chế hiệu quả điều trị lâm sàng của lapatinib. Nghiên cứu trước đây cho thấy rằng việc ức chế autophagy có thể làm giảm khả năng tăng sinh, tổng hợp DNA và khả năng hình thành thuộc địa của các tế bào kháng lapatinib. Berberine đã thu hút sự chú ý rộng rãi do có nhiều tác dụng sinh hóa và dược lý trong điều trị ung thư vú. Các báo cáo cho thấy rằng berberine có thể gây ra stress oxy hóa và con đường tự chết liên quan đến ty thể trong các tế bào ung thư vú ở người. Một liệu pháp kết hợp mới giữa berberine với lapatinib đã khắc phục được tình trạng kháng lapatinib. Hơn nữa, berberine gây ra quá trình apoptosis của các tế bào kháng lapatinib thông qua việc điều chỉnh mức độ ROS. Đặc biệt, lapatinib kích hoạt cả con đường c-Myc / pro-Nrf2 và tín hiệu GSK-3β để ổn định Nrf2 và duy trì mức ROS thấp trong các tế bào kháng thuốc. Tuy nhiên, berberine có thể làm đảo lộn sự cân bằng ROS bằng cách điều chỉnh giảm c-Myc để đảo ngược sự đề kháng của lapatinib. Chiến lược mới trong việc sử dụng berberine để khắc phục tình trạng kháng thuốc lapatinib [32]. Curcumin làm giảm sự phát triển tế bào của các dòng tế bào ung thư vú khác nhau. Khi được điều trị bằng curcumin, oncoprotein HER-2, phosphoryl hóa Akt, MAPK và biểu hiện của NF- κB đều giảm ở cả ô BT-474 và SK-BR- 11
  23. 3hrs. Trong mô hình xenograft BT-474, mặc dù không nhiều như herceptin, nhưng curcumin đã làm giảm kích thước khối u một cách hiệu quả. Kết quả nhiều nghiên cứu cho thấy curcumin có tiềm năng như một phương pháp điều trị ung thư vú biểu hiện quá mức HER-2 [33]. Tác dụng chống ung thư của các hợp chất đang được sử dụng hiện nay là không thể phủ nhận, tuy nhiên tình trạng kháng thuốc đã làm hạn chế hiệu quả điều trị trên lâm sàng . Cần tìm hướng đi mới để tìm kiếm them nhiều các hợp chất có khả năng chống lại tế bào ung thư. Các hợp chất thiên nhiên và các hợp chất dẫn xuất có cấu trúc liên quan vẫn chiếm 50% số lượng thuốc đang được sử dụng trong hoá trị ung thư. Điều này cho thấy hợp chất thiên nhiên vẫn là nguồn nguyên liệu chính để tìm kiếm các hợp chất có độc tính trên tế bào ung thư. Bên cạnh các hợp chất thiên nhiên được sử dụng trong hóa trị ung thư, hợp chất thiên nhiên được sử dụng trong ngăn ngừa ung thư cũng là một hướng được quan tâm. 12
  24. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu Cấu trúc tinh thể của protein dùng trong nghiên cứu Docking Cấu trúc 3D của protein được tải về từ ngân hàng dữ liệu protein (protein data bank) đồng thời được xử lý trước khi ứng dụng trong sàng lọc (Hình 2.1 và Hình 2.2) Hình 1. Cấu trúc 3D enzym HER2 được lấy từ ngân hàng dữ liệu protein 13
  25. Hình 2. Cấu trúc 3D enzym HER2 sau khi sàng lọc 2.2. Thiết bị, phần mềm Thiết bị: Sử dụng các phần mềm trên máy tính Sony Vaio – Hệ điều hành Windows 10. Phần mềm: Danh sách các phần mềm sử dụng bao gồm: - Phần mềm lưu trữ, hiệu chỉnh số liệu: Microsoft Excel 2010 - Phần mềm xây dựng cấu trúc hóa học: ChemDraw Professional bản 16.0. - Phần mềm tối ưu hóa các hợp chất : Avogadro 1.0.3. - Phần mềm mô phỏng Docking: phần mềm Autodock vina 1.1.2. - Phần mềm phân tích, đánh giá cấu dạng và biểu diễn tương tác: Chimera 1.14 và Discovery Studio Visualizer 4.0 -Phần mềm sàng lọc vùng hoạt động của enzym : MGL Autodock tools 1.5.6 14
  26. - Phần mềm nghiên cứu đặc điểm hóa lý và dược động học và độc tính (Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion and Toxicity, ADMET): Volsurf bản 1.0.4, Toxtree bản 3.1.0 các công cụ trực tuyến như AdmetSAR phiên bản 2.0 và SwissADME. 2.3. Nội dung nghiên cứu Nội dung nghiên cứu gồm : 1. Xây dựng tổ hợp các hợp chất tự nhiên có tác dụng ức chế enzym HER2 dựa trên các công bố trước đây : tối ưu hóa cấu trúc và xây dựng file pdbqt 2. Chuẩn bị cấu trúc protein. 3. Thực hiện docking phân tử. 4. Sàng lọc các hợp chất có tác dụng ức chế enzym HER2 tối ưu nhất 5. Phân tích các thông số và đánh giá đặc tính giống thuốc của hợp chất 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Chuẩn bị ligand Dựa trên các công bố trước đây, tập hợp các hợp chất có khả năng ức chế enzym HER2 từ các hợp chất tự nhiên [12-17]. Cấu trúc 3D của những hợp chất này được lấy từ cơ sở dữ liệu PubChem sau đó được tối ưu hóa bằng phần mềm Avogadro. 2.4.2. Chuẩn bị protein Sử dụng enzym HER2 với ID: 3RCD được lấy từ ngân hàng dữ liệu protein RCSB (www.rcsb.org). HER2 phức hợp với TAK-285 (ID PDB: 3RCD; độ phân giải: 3,21 Å; không có giá trị R: 0,294) được truy xuất từ PDB. Các tiêu chí để lựa chọn PDB là (a) độ phân giải tối thiểu và (b) cấu trúc của phối tử được gắn vào giống như trong cấu trúc kết tinh sau quy trình thả lại [17].Trong phức hợp 3RCD đã chứa sẵn ligand đồng kết tinh là TAK -285 một chất ức chế enzym HER2. Sau khi được tải về từ ngân hàng RCSB, phân tử ligand đồng kết tinh TAK-285 sẽ được tách ra khỏi phức hợp nhờ phần mềm Discovery Studio 15
  27. Visualizer 4.0. Khi đó, ta sẽ được phân tử đồng kết tinh và enzym HER2 riêng. Phân tử đồng kết tinh sau khi re-dock sẽ được dùng để so sánh với các phối tử đã được dock, xem sự tương đồng về cấu dạng và khả năng tương tác như thế nào để từ đó đánh giá kết quả. Đánh giá cấu dạng và khả năng tương tác sử dụng phần mềm Chimera 1.14 và Discovery Studio Visualizer 4.0. Sau khi phân tử đồng kết tinh được tách ra, protein sẽ được loại bỏ phân tử nước và các nguyên tử hydro sẽ được thêm vào trước khi tái lập vùng hoạt động của enzym bằng phần mềm MGL Autodock tools 1.5.6, sau đó xây dựng file pdbqt. Vùng hoạt động của enzyme được thiết lập dựa vào các amino acid quan trọng: Ala751, Leu800, Met801, Leu852 và Asp863 đã được công bố trước đây [17]. Thông số Grid box : dựa vào các acid amin quan trọng , thông số Grid box được xác định như sau : - center_x = 13.842 - center_y = 0.075 - center_z = 27.267 - size_x = 50 - size_y = 50 - size_z = 50 2.4.3. Xác nhận giao thức docking Trước khi sàng lọc các hợp chất, phối tử đồng tinh thể cần được re-dock lại vào vị trí hoạt động của mục tiêu để xác định độ lệch bình phương trung bình gốc (RMSD) từ đó đánh giá tính phù hợp của các thông số docking. Đánh giá sự tương đồng về cấu dạng, xác định giá trị RMSD bằng phần mềm Chimera 1.14 thu được sự chồng khít về cấu trúc của phối tử đồng tinh thể trước và sau khi dock và giá trị RMSD là 1.400 Å. Giá trị này thỏa mãn điều kiện RMSD nhỏ hơn 1.5 Å chứng tỏ kết quả docking phân tử vào mục tiêu là đáng tin cậy [18]. 16
  28. Hình 3. Kết quả re-dock ligand TAK-285 Sử dụng phần mềm Discovery Studio Visualizer 4.0 để biểu diễn sự tương tác giữa TAK-285 và enzym HER2, được thể hiện như trong hình 2.4 Hình 4. Sự tương tác giữa TAK-285 và HER2 Năng lượng liên kết sau khi re-dock cho kết quả -10.1 (kcal/mol) 17
  29. 2.4.4. Nghiên cứu các đặc điểm giống thuốc Quy tắc Lipinski 5 tiêu chí được sử dụng để so sánh giữa các hợp chất có đặc tính giống thuốc và không giống thuốc sau khi quá trình docking cho thấy khả năng liên kết của phối tử tốt hơn lisinopril đồng kết tinh. Một hợp chất có thể phát triển thành thuốc dùng đường uống nếu không vi phạm quá 2 trong 5 tiêu chí sau: - Trọng lượng phân tử: MW < 500 Dalton. - Số lượng nhóm cho liên kết hydro (Số lượng các nhóm –NH và – OH): HBD ≤ 5. - Số lượng nhóm nhận liên kết hydro (Bao gồm nguyên tử O và N): HBA ≤ 10. - Hệ số phân bố octanol/nước: LogP < 5. - Độ khúc xạ mol trong khoảng 40-130 [34]. Công cụ trực tuyến pkCSM ( được sử dụng để đánh giá quy tắc Lipinski 5. Công thức SMILES của các phối tử được tải về từ cơ sở dữ liệu Pubchem (www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov) và dùng làm dữ liệu đầu vào cho công cụ pkCSM. Sau khi lựa chọn được các hợp chất giống thuốc, tiếp tục tiến hành phân tích các thông số dược động học và độc tính để cho ra kết quả cuối cùng. 2.4.5. Nghiên cứu các đặc tình dược động học và độc tính Sử dụng công cụ trực tuyến pkCSM để dự đoán các đặc tính dược động học và độc tính với dữ liệu đầu vào là công thức SMILES của các hợp chất. Kết quả thu được là các thông số về hấp thu (tính tan trong nước, tính thấm màng Caco2, hấp thu ở ruột), phân bố (tính thấm qua hàng rào máu não và hệ thần kinh trung ương ), chuyển hóa (ức chế các enzym chuyển hóa ở gan), thải trừ ở thận và độc tính (độc tính AMES, độc tính gan ). Một khía cạnh quan trọng trong sự hấp thu chính là tính hấp thu thuốc ở ruột người (HIA) và tính thấm 18
  30. qua màng Caco2. Các hợp chất được cho là hấp thụ kém hoặc hấp thụ vừa hoặc hấp thụ tốt nếu HIA của chúng lần lượt ở trong khoảng 0 đến 20%, 20% đến 70%, và 70% đến 100%. Tính thấm qua màng Caco2 được đánh giá là cao nếu lớn hơn 0,9 (log Papp trong 10 cm/s). Hợp chất có thể thấm qua hàng rào máu não nếu logBB> 0,3 và tương ứng ở hệ thần kinh trung ương (CNS) là trên -2 [34, 35]. Các hợp chất cũng được lựa chọn dựa trên tính không có độc tính của chúng. 19
  31. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Sàng lọc chất ức chế enzym HER2 trong tự nhiên Sau khi chuẩn bị các phối tử, tiến hành docking toàn bộ 46 hợp chất tự nhiên được tổng hợp từ các nghiên cứu trước đây và enzym HER2 để sàng lọc các phân tử có khả năng ức chế HER2. Kết quả thu được ở bảng sau: Bảng 1: Kết quả docking các phân tử vào mục tiêu tác động với mức năng lượng liên kết tương ứng. Tên Năng Công thức cấu Pubchem lượng liên tạo ID STT kết (kcal/mol) 4-hydroxy-3 - [(2 E ) -4-hydroxy- -9.2 4989777 3,7-dimetylocta-2,6-dienyl] -5 - [( 1 E ) -4-hydroxy-3-metylbut-2-enyl] axit benzoic Diplacone -10.5 14539948 (2-(3,4-dihydroxyphenyl)-6-[(2E)- 3,7-dimethylocta-2,6-dienyl]-5,7- 2 dihydroxy-2,3-dihydrochromen-4- on) Bonanniol A -9.6 21721861 ((2R,3R)-6-[(2E)-3,7- 3 dimethylocta-2,6-dienyl]-3,5,7- trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)- 2,3-dihydrochromen-4-on) 20
  32. Salviaflaside -9.5 6438919 ((2R) -3- (3,4-dihydroxyphenyl) -2 – [E -3- [4-hydroxy-3 – [(2S, 3R, 4 4S, 5S, 6R) -3,4,5-trihydroxy -6- (hydroxymetyl) oxan-2-yl] oxyphenyl] prop-2-enoyl] axit oxypropanoic) Axit erionic A -8.7 51136392 (4-hydroxy-3-[€-7-hydroxy-3,7- 5 dimethyl-4-oxooct-5-enyl]-5-[E-4- hydroxy-3-methylbut-2- enyl]benzoic acid) 2-[3-[2-(1,3-benzodioxol-5-yl)-7- -7.6 23760123 methoxy-1-benzofuran-5-yl]-3- 6 hydroxypropoxy]-6- (hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol 3-(1,3-benzodioxol-5-yl)-7- -8.1 23643351 [(2S,3R,4S,5S,6R)-6- [[(2S,3R,4R)-3,4-dihydroxy-4- 7 (hydroxymethyl)oxolan-2- yl]oxymethyl]-3,4,5- trihydroxyoxan-2-yl]oxy-6- methoxychromen-4-ol 3-[3-[(2S,3R,4S,5R)-3,4- -9.3 13596891 dihydroxy-5-(6-oxo-1H-purin-9- 3 8 yl)oxolan-2-yl]propanoyl]benzoic acid 21
  33. 2- [3- [2- (1,3-benzodioxol-5-yl) - -9.6 70696455 7-metoxy-1-benzofuran-5-yl] -3- 9 hydroxypropoxy] -6- (hydroxymetyl) oxan-3,4,5 -triol [(2R,3S,4S,5R,6S)-6-[2-[[(1S,6R)- -9.7 95789966 1,6-dihydroxycyclohex-2-ene-1- 10 carbonyl]oxymethyl]phenoxy]- 3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]methyl benzoate [(2R,3S,4S,5R,6S)-6-[2,3- -8.8 10460858 dihydroxy-4-E-3-(4- hydroxyphenyl)prop-2- 11 enoyl]phenoxy]-3,4,5- trihydroxyoxan-2-yl]methyl E-3- (4-hydroxyphenyl)prop-2-enoate Caffeoyl feruloyl tartaric acid -9.6 50915790 12 2-O-feruloyl tartaric axit -9.5 14104340 13 Axit salvianolic C -8.9 13991590 14 22
  34. [3-hydroxy-5-[E-2-(4- -7.9 25113755 hydroxyphenyl)ethenyl]phenyl] 15 hydrogen sulfate Dihydropiceatannol -9.1 152444 (3,3’,4,5’-Tetrahydroxybibenzyl 16 4-[2-(3,5- Dihydroxyphenyl)ethyl]benzene- 1,2-diol) 5-[(Z)-2-(4- -7.6 1548910 hydroxyphenyl)ethenyl]benzene- 17 1,3-diol 5-[2-(4- -9.2 185914 hydroxyphenyl)ethyl]benzene-1,3- 18 diol (1R)-5-[2-(4- -9.6 5326961 hydroxyphenyl)ethyl]cyclohexa- 19 3,5-diene-1,3-diol 2,6-dimethyl-4-[E-2- -9.8 6365297 phenylethenyl]phenol 20 23
  35. 4-[E-2-(3,5- -9.1 667639 dihydroxyphenyl)ethenyl]benzene 21 -1,2-diol 5-[(Z)-2-fluoro-2-(4- -9.8 67144664 hydroxyphenyl)ethenyl]benzene- 22 1,3-diol 5-[2-(4- -8.7 71816176 bromophenyl)ethyl]benzene-1,3- 23 diol 5-[E-2-(3-fluoro-4- -8.9 73659198 hydroxyphenyl)ethenyl]benzene- 24 1,3-diol 5-[E-2-(4- -9.0 73659198 hydroxyphenyl)ethenyl]benzene- 25 1,3-diol Curcumin -9.1 969516 26 24
  36. Mono-O-demethylcurcumin -8.9 5469426 27 Di-O-demethylcurcumin -8.6 5469425 28 O-demethyldemethoxycurcumin -7.9 25055438 29 Mono-O-n-propylcurcumin -9.7 46946664 30 Di-O-n-propylcurcumin -9.6 45276263 31 Mono-O-(2- -8.7 45276266 hydroxyethyl)curcumin 32 25
  37. Di-O-(2-hydroxyethyl)curcumin -7.9 45276267 33 Mono-O-allylcurcumin -9.1 46881235 34 Di-O-allylcurcumin -9.9 16727530 35 Mono-O-n-pentylcurcumin -8.4 46946665 36 Mono-O-acetylcurcumin -7.9 10070122 37 Mono-O”- -9.8 52942889 acetyldemethoxycurcumin 38 26
  38. Mono-O- -10.4 52944954 acetylbisdemethoxycurcumin 39 Dihydrocurcumin -9.5 10429233 40 Tetrahydrocurcumin -9.2 124072 41 Hexahydrocurcumin -9.7 5318039 42 Octahydrocurcumin -9.1 11068834 43 [2-(naphthalen-2-ylamino)-2- -10.4 4853197 oxoethyl] 3- 44 (difluoromethoxy)benzoate 27
  39. 2-benzhydrylsulfanyl-5-(2- -9.1 16365624 methoxyphenyl)-1,3,4-oxadiazole 45 Berberin -10.3 2353 46 Phân tử đồng kết tinh TAK-285 -10.1 11620908 TAK-285 đã chứng minh hoạt tính ức chế chống lại các kinase HER2 và EGFR với giá trị IC 50 đối với HER2 và EGFR lần lượt là 17 nmol / L (95% CI 12-24) và 23 nmol / L (95% CI 18-30). Trong một nhóm các kinase ở người, TAK-285 cho thấy sự ức chế yếu (0‒50%) đối với 88 trong số 96 kinase được thử nghiệm, ức chế vừa phải (50-80%) đối với EGFR (L858R) và phosphatase kiềm, và ức chế mạnh (80‒100 %) chống lại các kinase họ HER bao gồm EGFR (L861Q) cũng như chống lại CDK3 / cyclin E và Flt3. [34] Từ kết quả ở bảng 1, ta thấy được có 4 phân tử cho kết quả tối ưu so với TAK-285 đó là Diplacone (2-(3,4-dihydroxyphenyl)-6-[(2E)-3,7- dimethylocta-2,6-dienyl]-5,7-dihydroxy-2,3-dihydrochromen-4-on) (14539948) , [2-(naphthalen-2-ylamino)-2-oxoethyl] 3- (difluoromethoxy)benzoate (4853197) , Mono-O- acetylbisdemethoxycurcumin (52944954 ) , Berberin (2353) với năng lương liên kết lần lượt là -10.5 kcal/mol, -10.4 kcal/mol, -10.4 kcal/mol và -10.3 kcal/mol. Đây đều có khả năng ức chế enzym HER2 mạnh, đặc biệt là Diplacone với năng lượng liên kết nhỏ nhất: -10.5 kcal/mol. 28
  40. Bảng 2. Bảng tương tác của các chất với các amin axit trong vùng trung tâm hoạt động Tên hợp chất Acid Amin tạo liên kết Diplacone Cys805, Ala751, Phe864, Ser728 [2-(naphthalen-2-ylamino)-2- Ala751, Met801, Thr862, Ser783 oxoethyl] 3- (difluoromethoxy)benzoate Mono-O- Thr862 , Cys805 , Asp863, Met801 acetylbisdemethoxycurcumin Berberin Ala751, Thr862, Asp863, Cys805, Lys753 TAK-285 Leu726, Val734, Ala751, Glu770, Met774, Leu796, Met801, Leu852, Thr862, Asp863 Hình 5. Tương tác của Diplancone với enzyme HER2 29
  41. Hình 6. Tương tác của [2-(naphthalen-2-ylamino)-2-oxoethyl] 3- (difluoromethoxy)benzoate với enzyme HER2 Hình 7. Tương tác của Mono-O-acetylbisdemethoxycurcumin với enzyme HER2 30
  42. Hình 8. Tương tác của Berberin với enzyme HER2 3.2. Kết quả phân tích các thông số Lipinski Kết quả nghiên cứu cho thấy cả 4 hợp chất đều có khả năng ức chế cao hơn TAK-285. Trong đó Diplacone là tối ưu nhất với mức năng lượng thấp nhất. Qua các phân tích và đánh giá cho thấy các thông số Lipinski và các đặc tính ADMET của 4 hợp chất được thể hiện qua bảng 2 và bảng 3 dưới đây Bảng 3. Các thông số Lipinski Tên hợp chất Khối Số liên kết Liên kết LOGP Độ khúc xạ lượng hydro hydro mol phân tử được chấp nhận Diplacone 424.0000 4 6 5.4507 117.985649 00 02 [2-(naphthalen-2- 371.0000 1 5 4.2366 95.934181 ylamino)-2-oxoethyl] 00 99 31
  43. 3- (difluoromethoxy)ben zoate Mono -O-acetyl bis 350.0000 1 5 3.5723 98.556778 demethoxy curcumin 00 98 Berberin 336.0000 0 4 3.8913 94.711983 00 98 Trong đó : - Mass là khối lượng phân tử - Hydrogen bond donor là số liên kết hydro - Hydrogen bond acceptors là số liên kết hydro được chấp nhận - LOGP là tính ưa mỡ, được biểu thị bằng logP - Molar Refractivity là độ khúc xạ mol Đối chiếu với Quy tắc Lipinski: - Khối lượng phân tử nhỏ hơn 500 Dalton - Tính ưa mỡ cao (được biểu thị bằng LogP nhỏ hơn 5) - Ít hơn 5 liên kết hydro - Ít hơn 10 chất nhận liên kết hydro - Độ khúc xạ mol phải nằm trong khoảng 40-130 Ta thấy, Diplacone đáp ứng 4/5 tiêu chí của quy tắc Lipinski , trong khi 3 hợp chất còn lại đáp ứng đủ cả 5/5 tiêu chí. 3.3. Đánh giá các đặc tính ADMET Các đặc tính ADMET của bốn hợp chất được thể hiện rõ ở bảng 4 Bảng 4. Các đặc tính ADMET (hấp thu, phân bố, chuyển hóa, bài tiết và độc tính). Thuộc tính Diplacone [2-(naphthalen- Mono -O- Berberin ADMET 2-ylamino)-2- acetyl bis 32
  44. oxoethyl] 3- demethoxy (difluorometho curcumin xy)benzoate Khả năng -3.403 -4.744 -4.364 -3.973 hòa tan trong nước Sự hấp Tính thấm 0.046 0.7 1.075 1.734 thu Caco2 Hấp thụ 82.56 89.534 92.768 97.147 đường ruột (con người) Khả năng -2.735 -2.741 -2.734 -2.576 thẩm thấu qua da Chất nền p- Có Không Không Có glycoprotei n Chất ức chế Có Có Có Không P- glycoprotei n I Chất ức chế Có Có Có Có P- glycoprotei n II VDss 0.801 -0.165 -0.411 0.58 Phân bố Phân số 0,117 0 0 0.262 không bị ràng buộc (con người) 33
  45. Thấm BBB -1.287 0.424 -0,38 0.198 Tính thấm 2.828 -2.1 -2.377 -1.543 của thần kinh trung ương Chuyển Chất nền Không Không Không Không hoá CYP2D6 Chất nền Có Có Có Có CYP3A4 Chất ức chế Không Có Có Có CYP1A2 Chất ức chế Không Có Có Không CYP2C19 Chất ức chế Có Có Có Không CYP2C9 Chất ức chế Không Không Không Có CYP2D6 Chất ức chế Không Có Có Có CYP3A4 Bài tiết Tổng bài 0.223 0.111 0.226 1.27 tiết Chất nền Không Không Không Không OCT2 trong thận Độc tính AMES độc Không Không Không Có tính Tối đa liều 0.23 0.97 lượng dung 0.165 0.144 nạp 34
  46. Chất ức chế Không Không Không Không hERG I Chất ức chế Có Có Có Không hERG II Độc tính 2.328 2.06 1.841 2.571 cấp tính cho chuột bằng miệng (LD50) Độc tính 2.434 1.166 1.563 1.89 mãn tính ở chuột bằng miệng (LOAEL) Nhiễm độc Không Có Không Có gan Da nhạy Không Không Không Không cảm Độc tính 0.34 0.501 0.48 0.354 của T.Pyriformi s Độc tính 1.356 0.047 -1.025 -0.277 nhỏ Một trong những trở ngại khó khăn nhất mà ứng viên thuốc phải vượt qua là sở hữu các đặc tính ADMET phù hợp [12]. Việc xác định các đặc tính này trong quá trình phát hiện thuốc sớm là rất quan trọng để giảm các vấn đề ADMET sau này trong quá trình phát triển thuốc. Trong nghiên cứu này, các đặc tính ADMET đã được phân tích. Kết quả cho thấy hợp chất tự nhiên trong nghiên cứu sở hữu các đặc tính ADMET thuận lợi. 35
  47. CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 4.1. Về kết quả Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành sàng lọc ảo 46 hợp chất tự nhiên được tải về từ thư viện hóa học Pubchem. Nhiều hợp chất cho thấy khả năng gắn kết tốt hơn chất đối chứng TAK-285 do có các vòng thơm tạo tương tác π-π ổn định và nhiều nhóm hydroxy cần thiết cho hoạt động ức chế HER2. Có 4 hợp chất có năng lượng liên kết tối ưu hơn TAK-285 là Diplacone (2-(3,4- dihydroxyphenyl)-6-[(2E)-3,7-dimethylocta-2,6-dienyl]-5,7-dihydroxy-2,3- dihydrochromen-4-on) , [2-(naphthalen-2-ylamino)-2-oxoethyl] 3- (difluoromethoxy)benzoate , Mono-O-acetylbisdemethoxycurcumin , Berberin. 4.1.1. Diplacone (ID:14539948) Diplacone cho thấy khả năng liên kết tốt với HER2 với điểm số docking là -10,5 kcal/mol, khả năng hấp thu tốt (82,56% qua ruột), tính thấm màng Caco2 là 0,046 log Papp trong 10 cm/s, tuy nhiên khả năng thấm qua hàng rào máu não và hệ thần kinh trung ương thấp bởi tính ưa lipid của nó kém (LOGP>5). Bên cạnh đó, diplacone không gây hại trên hệ thần kinh và thận. Hiện nay, chưa có nghiên cứu thực nghiệm đối với tác dụng ức chế HER2 của diplacone. Vì vậy, mặc dù có khả năng tương tác tốt với enzym đích và có những đặc tính giống thuốc, cần có những nghiên cứu sâu hơn về tác dụng của diplacone đối với cơ thể người. 4.1.2. [2-(naphthalen-2-ylamino)-2-oxoethyl] 3- (difluoromethoxy)benzoate (ID:4853197) [2-(naphthalen-2-ylamino)-2-oxoethyl] 3-(difluoromethoxy)benzoate có khả năng liên kết tốt với điểm số docking là -10,4kcal/mol. Hợp chất đáp ứng cả 5 tiêu chí của quy tắc Lipinski. Khả năng hấp thu trong đường ruột tốt (89,534%),khả năng thấm tốt qua hệ thần kinh trung ương và hàng rào máu não. Tuy nhiên, hợp chất gây độc trên gan và ức chế đa số các men chuyển hóa. Vì vậy, cần có những nghiên cứu sâu hơn chứng minh các yếu tố nguy cơ của 36
  48. [2-(naphthalen-2-ylamino)-2-oxoethyl] 3-(difluoromethoxy)benzoate đối với cơ thể. 4.1.3. Mono-O-acetylbisdemethoxycurcumin (ID:52944954) Hợp chất Mono-O-acetylbisdemethoxycurcumin được tìm thấy ở chiết xuất củ nghệ vàng. Có khả năng liên kết tốt với enzym HER2 , khả năng hấp thu tốt (92,768 qua ruột, tính thấm màng Caco2 : 1,075). Hợp chất đáp ứng đủ cả 5 tiêu chí Lipinski. Tuy nhiên, hợp chất gây độc trên gan và ức chế các chất chuyển hóa. 4.1.4. Berberin (ID:2353) Hợp chất Berberin có màu vàng, thường được dùng để chữa nhiễm trùng đường tiêu hóa. Khả năng hấp thu tốt ( 97.147 qua ruột, tính thấm qua màng Caco2 : 1.734). Đáp ứng đầy đủ cả 5 tiêu chí của quy tắc Lipinski. Tuy nhiên hợp chất có độc tính trên gan và các độc tính gây hại khác với cơ thể. 4.2. Về phương pháp Việc ứng dụng kĩ thuật sàng lọc ảo in silico trong quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc đang trở thành xu thế chung của ngành công nghiệp dược phẩm trên toàn thế giới bởi nhiều ưu điểm so với các phương pháp tổng hợp hóa học truyền thống. Ngày nay, với nhiều CSDL lớn về các hợp chất tự nhiên, tổng hợp được cập nhật liên tục bởi các nhà khoa học trên khắp thế giới, việc dự đoán các tính chất dược lý, dược động học trở nên dễ dàng hơn. Công việc này được khi thực hiện trên máy tính có thể sàng lọc một số lượng lớn các hợp chất trong CSDL, giúp tiết kiệm công sức, thời gian và chi phí nghiên cứu. Về mặt nhược điểm, sàng lọc ảo sử dụng nhiều phễu lọc với nhiều phần mềm khác nhau có thể làm tăng sai số cho quá trình, bên cạnh việc sử dụng các thuật toán học máy phức tạp. Ngoài ra, việc xác định chính xác cấu trúc 3D của protein đích, sự khác biệt giữa mô hình và thực tế diễn ra trong cơ thể người cũng là lý do khiến sàng lọc ảo gặp nhiều khó khăn hơn. Vì vậy, việc phối hợp các kỹ thuật in silico rất cần thiết trong quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc. Về kỹ thuật docking 37
  49. Docking là một kỹ thuật sàng lọc ảo phổ biến hiện nay để mô phỏng các tương tác giữa protein và phối tử, ứng dụng vào sàng lọc một thư viện lớn các chất để tìm ra hợp chất tiềm năng, thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc, tối ưu hóa hợp chất dẫn đường hay nghiên cứu cơ chế tác dụng của các thuốc ở mức độ phân tử. Phân tích hàm tính điểm (năng lượng liên kết) và các tương tác từ kết quả đầu ra của docking cho phép chúng ta có thể kết luận một cách sơ bộ là chất đó có hay không hoạt tính ức chế protein. Điều này giúp thu hẹp CSDL, loại bỏ các hợp chất không có hoạt tính, cũng như lựa chọn các hợp chất thiết kế có hoạt tính trước khi tiến hành các thử nghiệm về sau. Mặc dù vậy, kết quả docking phụ thuộc vào độ chính xác của phần mềm sử dụng. Nghiên cứu này sử dụng Autodock Vina, một phần mềm học thuật được đánh giá cao về tính chính xác của công suất lấy mẫu và công suất cho điểm, với độ chính xác cao hơn các phần mềm thương mại [37] Bên cạnh đó, mỗi chất được tiến hành dock ba lần và lấy kết quả trung bình để tăng độ tin cậy của quá trình. Về dự đoán đặc tính hóa lý và các thông số ADMET Việc kết hợp dự đoán tính giống thuốc và các thông số dược động học và độc tính cùng với kĩ thuật docking giúp dự đoán khả năng trở thành thuốc của các hợp chất, thu gọn tập dữ liệu và giảm bớt gánh nặng cho các nghiên cứu thực nghiệm về sau. Các đặc điểm ADMET được dự đoán bằng công cụ trực tuyến pkCSM cho kết quả dựa trên cấu trúc hóa học của hợp chất. Tính thấm qua tế bào Caco2 ở ruột là tiêu chuẩn quan trọng khi đánh giá dược chất đường uống, được FDA khuyến cáo sử dụng trong qua trình phát triển thuốc. Theo mô hình dự đoán PkCSM, một hợp chất được coi là có tính thấm Caco2 cao nếu giá trị dự đoán của nó > 0,9. Mô hình hấp thu ở ruột được sử dụng để dự đoán tỷ lệ phần trăm hấp thu của một loại thuốc uống qua ruột non của con người, mô hình dự đoán PkCSM cho biết rằng một phân tử có độ hấp thu dưới 30% sẽ được coi là một loại thuốc kém hấp thu. Các hợp chất trong bài đều cho thấy khả năng hấp thu tốt qua ruột non của người khi hấp thu trên 50%, một vài chất cho giá trị trên 90%. Khối lượng phân phối càng cao, lượng thuốc đến các mô càng nhiều, giá trị log VDss 0,45 cho thấy khối lượng phân phối cao. Tính thấm qua hàng rào máu 38
  50. não (BBB) cũng là một thông số quan trọng về tính thẩm thấu của hợp chất, cùng với khả năng đi vào hệ thần kinh trung ương (CNS) có thể liên quan đến tính an toàn của dược chất đối với hệ thần kinh. Một dược chất được coi là không thấm qua hàng rào máu não nếu giá trị BBB 0.3. Nếu log PS > -2, hợp chất có thể đi vào hệ thần kinh trung ương và ngược lại nếu có giá trị 2 mol/kg được coi là an toàn. Các hợp chất được chọn đều đáp ứng các tiêu chí an toàn này. 4.3. Những hạn chế và thách thức trong mô hình nghiên cứu In silico Nghiên cứu bằng mô hình in silico giúp tiết kiệm thời gian trong quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới. Tuy nhiên, bên cạnh đó những hạn chế của nghiên cứu bằng mô hình in silico vẫn luôn tồn tại song song. Việc sử dụng quá nhiều phần mềm, đòi hỏi hệ điều hành máy tính phải đáp ứng các điều kiện của phần mềm. Một sai sót nhỏ trong quá trình nhập liệu cũng có thể làm sai kết quả cả nghiên cứu. Mô hình in silico đòi hỏi cơ sở dữ liệu lớn. 39
  51. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau thời gian nghiên cứu, đề tài đã đạt được mục tiêu đề ra và có một số kết luận chính như sau: 1. Xây dựng tổ hợp các hợp chất tự nhiên và sang lọc được 4 hợp chất có tác dụng ức chế enzym HER2 bằng kĩ thuật docking phân tử 2. Phân tích đặc tính giống thuốc và đánh giá các thông số ADMET Đã sàng lọc được 4 hợp chất tiềm năng : Diplacone (2-(3,4- dihydroxyphenyl)-6-[(2E)-3,7-dimethylocta-2,6-dienyl]-5,7-dihydroxy-2,3- dihydrochromen-4-on) (14539948) , [2-(naphthalen-2-ylamino)-2-oxoethyl] 3- (difluoromethoxy)benzoate (4853197) , Mono-O- acetylbisdemethoxycurcumin (52944954 ) , Berberin (2353) từ 46 hợp chất thiên nhiên gợi ý cho quá trình nghiên cứu thực nghiệm và phát triển thuốc trong tương lai. KIẾN NGHỊ Bên cạnh những kết quả đạt được, để tiếp tục phát triển các kết quả nghiên cứu của khóa luận đồng thời tăng tính ứng dụng của nghiên cứu, tôi xin đưa ra các đề xuất sau: 1. Cần tiến hành các nghiên cứu sâu hơn để phát triển các hợp chất này thành thuốc điều trị bệnh ung thư vú. 2. Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm hoạt tính trên đích của các hợp chất đã sang lọc được trên mô hình in vivo thực tế 40
  52. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Stewart B., Wild C.P. World Cancer Report 2014. WHO Press; Geneva, Switzerland: 2014. 2. Carey L.A., Perou C.M., Livasy C.A., Dressler L.G., Cowan D., Conway K., Karaca G., Troester M.A., Tse C.K., Edmiston S. Race, Breast cancer subtypes, and survival in the carolina breast cancer study. JAMA. 2006;295:2492–2502. 3. Yarden Y., Sliwkowski M.X. Untangling the ErbB signalling network. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2001;2:127–137. 4. Bartholomeusz C., Gonzalez-Angulo A.M. Targeting the PI3K signaling pathway in cancer therapy. Expert Opin. Ther. Targets. 2012;16:121– 130. 5. Xia W., Mullin R.J., Keith B.R., Liu L.-H., Ma H., Rusnak D.W., Owens G., Alligood K.J., Spector N.L. Anti-tumor activity of GW572016: A dual tyrosine kinase inhibitor blocks EGF activation of EGFR/ErbB2 and downstream ERK1/2 and Akt pathways. Oncogene. 2002;21:6255–6263. 6. Graus-Porta D., Beerli R.R., Daly J.M., Hynes N.E. ErbB-2, the preferred heterodimerization partner of all ErBb receptors, is a mediator of lateral signaling. EMBO J. 1997;16:1647–1655. 7. Hynes N.E., Lane H.A. ErbB receptors and cancer: The complexity of targeted inhibitors. Nat. Rev. Cancer. 2005;5:341–354. 8. Bộ Y tế , Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị ung thư vú 2020. 9. Bibi Shabana, Saima Kalsoom and Hamid Rashid (2013), "In Silico Approach for Lead Identification and Optimization Of Antidiabetic Compounds", IOSR Journal of Pharmacy and Biological Sciences (IOSR- JPBS), 3, 36-46. 10. Shoichet Brian K, Susan L McGovern, Binqing Wei and John J Irwin (2002), "Lead discovery using molecular docking", Current opinion in chemical biology, 6(4), 439-446.
  53. 11. Kitchen Douglas B, Hélène Decornez, John R Furr and Jürgen Bajorath (2004), "Docking and scoring in virtual screening for drug discovery: methods and applications", Nature reviews Drug discovery, 3(11), 935-949. 12. Jianzong Li, Haiyang Wang, Junjie Li, Jinku Bao,1 and Chuanfang Wu1. “Discovery of a Potential HER2 Inhibitor from Natural Products for the Treatment of HER2-Positive Breast Cancer”.Accepted 2016 Jun 28. 13. Todd W Miller 1, James T Forbes, Chirayu Shah, Shelby K Wyatt, H Charles Manning, Maria G Olivares, Violeta Sanchez, Teresa C Dugger, Nara de Matos Granja, Archana Narasanna, Rebecca S Cook, J Phillip Kennedy, Craig W Lindsley, Carlos L Arteaga. “Inhibition of mammalian target of rapamycin is required for optimal antitumor effect of HER2 inhibitors against HER2-overexpressing cancer cells”. 2009 Nov 24. 14. K. S. N. M. Megana and Y. Suneetha. “In-silico molecular screening of natural plant products for the identification of novel potential chemotherapeutic agents against breast cancer”. 15. Wannarat Yim-im, Orathai Sawatdichaikul,corresponding author Suwanna Semsri, Natharinee Horata, Wanwimon Mokmak, Sissades Tongsima, Apichart Suksamrarn, and Kiattawee Choowongkomoncorresponding author. “Computational analyses of curcuminoid analogs against kinase domain of HER2”. 2014 Aug 3 16. Mohammad Rizki Fadhil Pratama , Guntur Satrio Pratomo. “Pharmacophore Optimization Of Berberine As HER2 Inhibitor. Jurnal Farmasi Indonesia”, November 2017, hal 109 – 117. ISSN: 1693-8615 EISSN : 2302-4291. 17. Zeeshan Yousuf , Kanzal Iman , Nauman Iftikhar , Muhammad Usman Mirza . “Structure-based virtual screening and molecular docking for the identification of potential multi-targeted inhibitors against breast cancer”. 2017 Jun 14 18. Nataraj S. Pagadala, Khajamohiddin Syed & Jack Tuszynski . “Software for molecular docking: a review” .16 January 2017.
  54. 19. Bộ Y tế. Báo sức khoẻ và đời sống . Ngày 20/01/2021. 20. 29. I.RubinY.Yarden. The basic biology of HER2. Annals of Oncology Volume 12, Supplement 1, 2001, Pages S3-S8. 21. Yi-Sheng Sun, Zhao Zhao, [ ], and Han-Ping Zhu. Risk Factors and Preventions of Breast Cancer. Int J Biol Sci 2017;13(11) : 1387-1397 22. Shih C, Padhy LC, Murray M. et al. Transforming genes of carcinomas and neuroblastomas introduced into mouse fibroblasts. Nature. 1981;290:261–264. 23. Harbeck N, Gnant M. Breast cancer. The Lancet. 2017;389:1134– 1150. 24. Lipinski, C.A., et al., Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings. Advanced drug delivery reviews, 1997. 23(1-3): p. 3-25. 25. Lipinski, C.A., Lead-and drug-like compounds: the rule-of-five revolution. Drug Discovery Today: Technologies, 2004. 1(4): p. 337-341. 26. 26.Van De Waterbeemd, H. and E. Gifford, ADMET in silico modelling: towards prediction paradise? Nature reviews Drug discovery, 2003. 2(3): p. 192-204. 27. 27.Ferreira, L.L. and A.D. Andricopulo, ADMET modeling approaches in drug discovery. Drug discovery today, 2019. 24(5): p. 1157- 1165. 28. 28.Kar, S. and J. Leszczynski, Open access in silico tools to predict the ADMET profiling of drug candidates. Expert Opinion on Drug Discovery, 2020. 15(12): p. 1473-1487. 29. 29.Pires, D.E., T.L. Blundell, and D.B. Ascher, pkCSM: predicting small-molecule pharmacokinetic and toxicity properties using graph-based signatures. Journal of medicinal chemistry, 2015. 58(9): p. 4066- 4072.
  55. 30. Johnston, S.R.D., Leary, A.Lapatinib: A novel EGFR/HER2 tyrosine kinase inhibitor for cancer. Drugs Today 2006, 42(7): 441 ISSN 1699- 3993 31. 31.Lisha Zhang, Yiu-Keung Lau, Weiya Xia, Gabriel N. Hortobagyi and Mien-Chie Hung. Tyrosine Kinase Inhibitor Emodin Suppresses Growth of HER-2/neu-overexpressing Breast Cancer Cells in Athymic Mice and Sensitizes These Cells to the Inhibitory Effect of Paclitaxel 32. Ruohan Zhang,Hongyu Qiao,Suning Chen,Xu Chen,Kefeng Dou,Li Wei &Jian Zhang . Berberine reverses lapatinib resistance of HER2- positive breast cancer cells by increasing the level of ROS. Accepted 03 Jul 2016 33. Hung-Wen Lai, Su-Yu Chien, Shou-Jen Kuo, Ling-Ming Tseng, Hui-Yi Lin, Chin-Wen Chi, and Dar-Ren Chen. The Potential Utility of Curcumin in the Treatment of HER-2-Overexpressed Breast Cancer: An In Vitro and In Vivo Comparison Study with Herceptin. Article ID 486568. 34. 34.Tung, B.T., P.H. Minh, and N.N. Son, Screening Virtual ACE2 Enzyme Inhibitory Activity of Compounds for COVID-19 Treatment Based on Molecular Docking. VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, 2020. 36(4). 35. 35.Tien, N.T. and B.T. Thanh, Predicting binding modes and affinities for non-nucleoside inhibitors to HIV-1 reverse transcriptase using molecular docking. Science and Technology Development Journal-Natural Sciences, 2018. 2(1): p. 53-58. 36. Akiko Nakayama, Shinji Takagi, and Yoshikazu Ohta. Antitumor Activity of TAK-285, an Investigational, Non-Pgp Substrate HER2/EGFR Kinase Inhibitor, in Cultured Tumor Cells, Mouse and Rat Xenograft Tumors, and in an HER2-Positive Brain Metastasis Model. J Cancer 2013;4(7) 557-565. 37. Wang, Z., et al., Comprehensive evaluation of ten docking programs on a diverse set of protein–ligand complexes: the prediction
  56. 38. accuracy of sampling power and scoring power. Physical Chemistry Chemical Physics, 2016. 18(18): p. 12964-12975. 39. Belal, A., Drug likeness, targets, molecular docking and ADMET studies for some indolizine derivatives. Die Pharmazie-An International Journal of Pharmaceutical Sciences, 2018. 73(11): p. 635-642.