›

Khóa luận Xác định hàm lượng ethanol, methanol, aldehyde trong một số mẫu rượu nếp chưng cất tại Kim Sơn, Ninh Bình

pdf 53 trang thiennha21 18/04/2022 7500
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Xác định hàm lượng ethanol, methanol, aldehyde trong một số mẫu rượu nếp chưng cất tại Kim Sơn, Ninh Bình", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_xac_dinh_ham_luong_ethanol_methanol_aldehyde_trong.pdf

Nội dung text: Khóa luận Xác định hàm lượng ethanol, methanol, aldehyde trong một số mẫu rượu nếp chưng cất tại Kim Sơn, Ninh Bình

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y- DƯỢC PHAN THỊ HƯƠNG XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ETHANOL, METHANOL, ALDEHYDE TRONG MỘT SỐ MẪU RƯỢU NẾP CHƯNG CẤT TẠI KIM SƠN, NINH BÌNH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC Hà Nội – 2017
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC Phan Thị Hương XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ETHANOL, METHANOL, ALDEHYDE HÀ N ỘI - 2017 TRONG MỘT SỐ MẪU RƯỢU NẾP LỜI CẢM ƠN CHƯNG CẤT TẠI KIM SƠN, NINH BÌNH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC Khóa: QH.2012.YLỜI CẢM ƠN Người hướng dẫn: ThS. Dương Hải Thuận Hà Nội – 2017 LỜI CẢM ƠN
  3. LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS. Dương Hải Thuận, người đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ và truyền đạt những kiến thức quan trọng cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại Khoa Y-Dược Đại học Quốc gia Hà Nội. Xin trân trọng cảm ơn các giảng viên Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc, Bộ môn Bào chế và Công nghệ dược phẩm Khoa Y- Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo cùng các thầy cô Khoa Y-Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập tại Khoa. Cuối cùng, tôi xin được cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã luôn bên cạnh, quan tâm chăm sóc và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa học. Trong quá trình thực hiện đề tài, tuy đã nỗ lực và cố gắng hết sức nhưng vẫn không thể tránh khỏi những thiếu sót, tôi kính mong nhận được những ý kiến chỉ bảo và phê bình của quý thầy cô. Tôi xin chân thành cảm ơn! Thành phố Hà Nội, tháng 5 năm 2017. Sinh viên Phan Thị Hương
  4. DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT %V/V Phần trăm thể tích AOAC Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thống GNS Rượu tinh cất từ ngũ cốc GABA Acid gamma-Aminobutyric Liều gây chết 50% LD50 MEOS Hệ thống oxy hóa ethanol thuộc hạt lưới nội bào TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam STT Số thứ tự MR Mẫu rượu RSD Độ lệch chuẩn tương đối tR Thời gian lưu
  5. DANH MỤC HÌNH Hình 1: Quy trình sản xuất bánh men rượu 5 Hình 2: Quy trình sản xuất rượu Kim Sơn 6 Hình 3: Quá trình chuyển hóa methanol trong cơ thể. 12 Hình 4: Sơ đồ hoạt động máy sắc ký khí 13 Hình 5: Phản ứng màu giữa aldehyde và thuốc thử fuchine-sulfite 18 Hình 6: Quy trình xác định hàm lượng ethanol 20 Hình 7: Quy trình so màu xác định hàm lượng methanol trong rượu 22 Hình 8: Kết quả so màu methanol của 12 mẫu rượu chưng cất Kim Sơn 23 Hình 9: Quy trình so màu xác định hàm lượng aldehyde trong rượu 25 Hình 10: Sắc ký đồ của chuẩn acetaldehyde 10 mg/l 29 Hình 11: Sắc ký đồ của chuẩn acetaldehyde 50 mg/l 29 Hình 12: Sắc ký đồ của chuẩn acetaldehyde 100 mg/l 29 Hình 13: Sắc ký đồ của chuẩn acetaldehyde 150 mg/l 30 Hình 14: Sắc ký đồ của chuẩn acetaldehyde 200 mg/l 30 Hình 15: Đồ thị biểu thị sự phụ thuộc giữa chiều cao pic hàm lượng acetaldehyde 31 Hình 16: Sắc ký đồ thu được của 12 mẫu rượu 34
  6. DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Các mẫu rượu được khảo sát 16 Bảng 2: Hàm lượng ethanol trong 12 mẫu rượu chưng cất Kim Sơn 21 Bảng 3: Kết quả phương pháp so màu xác định hàm lượng methanol trong 12 mẫu rượu Kim Sơn. 24 Bảng 4 : Pha dãy dung dịch chuẩn acetaldehyde 25 Bảng 5: Kết quả hàm lượng aldehyde trong 12 mẫu rượu Kim Sơn bằng phương pháp so màu 26 Bảng 6: Kết quả sắc ký khí với acetaldehyde chuẩn 100 mg/l thực hiện 6 lần 28 Bảng 7: Sự phụ thuộc chiều cao pic theo nồng độ acetaldehyde 30 Bảng 8: Kết quả hàm lượng acetaldehyde trong 12 mẫu rượu Kim Sơn bằng 35 phương pháp sắc ký khí 35
  7. MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan về quá trình chưng cất và rượu chưng cất 2 1.1.1. Quá trình chưng cất rượu 2 1.1.2. Phân loại rượu chưng cất (rượu trắng chưng cất) 2 1.2. Giới thiệu bánh men thuốc bắc và quy trình sản xuất rượu Kim Sơn 4 1.2.1. Giới thiệu bánh men thuốc bắc 4 1.2.2. Quy trình sản xuất rượu Kim Sơn 5 1.3. Ethanol và những tạp chất có liên quan trong quá trình chưng cất 8 1.3.1. Ethanol 8 1.3.2. Hợp chất cacbonyl 9 1.3.3. Alcohol 11 1.3.4. Furfural 12 1.4. Sơ lược về sắc ký khí 13 1.4.1. Khái niệm 13 1.4.2. Ứng dụng của sắc ký khí 15 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1. Đối tượng nghiên cứu 16 2.2. Thiết bị - Dụng cụ - Hóa chất 16 2.2.1. Thiết bị, dụng cụ 16 2.2.2. Hóa chất 17 2.3. Một số phương pháp xác định hàm lượng ethanol, methanol và aldehyde trong rượu chưng cất 17 2.3.1. Xác định hàm lượng ethanol 17 2.3.2. Xác định hàm lượng methanol 17 2.3.3. Xác định hàm lượng aldehyde 18 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1. Xác định hàm lượng ethanol 20 3.2. Xác định hàm lượng methanol 21 3.2.1. Phương pháp sắc ký khí 21
  8. 3.2.2. Phương pháp so màu 21 3.3. Hàm lượng aldehyde 24 3.3.1. Phương pháp so màu 24 3.3.2. Phương pháp sắc ký khí 27 3.4. Bàn luận 36 Kết luận 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 Phụ lục A: Quy định kỹ thuật về rượu trắng trong TCVN 7043:2013 41 Phụ lục B: Bảng quy đổi độ rượu ở các nhiệt độ khác nhau về 20 oC 42 Phụ lục C: Sắc ký đồ của mẫu chuẩn acetaldehyde 100 mg/l qua 6 lần thử 45 Tài liệu tham khảo
  9. MỞ ĐẦU Rượu từ lâu đã là một thức uống quen thuộc, gắn liền với đời sống văn hoá người Việt Nam nhưng có một điều không thể phủ nhận rằng tác hại của rượu vô cùng ghê gớm. Đặc biệt trong thời gian qua, tình trạng lạm dụng rượu và ngộ độc rượu có xu hướng tăng nhanh và phức tạp. Mỗi năm vẫn còn nhiều ca phải nhập viện, thậm chí tử vong vì ngộ độc rượu. Nhiều trường hợp là do uống rượu liên tục trong một thời gian ngắn nhưng nhiều trường hợp đáng tiếc lại do sử dụng rượu không rõ nguồn gốc, chất lượng kém, các nạn nhân phần lớn lại là người nghèo, sinh viên, người trẻ tuổi chưa đủ nhận thức. Đặc biệt từ đầu năm 2017 đến nay số vụ ngộ độc rượu đã tăng đột biến. Có thể thấy các vụ tai nạn giao thông hiện nay phần lớn là do tác động của rượu bia, khi nồng độ cồn trong máu cao thì ta không thể kiểm soát được bản thân. Ngoài ra rượu còn gây ức chế thần kinh cũng như hoạt động của các cơ quan tim mạch trong cơ thể. Trong rượu không chỉ có ethanol mà còn có thể chứa một lượng lớn methanol, aldehyde, và các chất độc hại khác, gây độc mạnh hơn ethanol, làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến bộ máy tuần hoàn, hô hấp và thần kinh của con người [18, 28]. Việt Nam là một trong số ít những quốc gia đang có xu hướng tăng nhanh về mức tiêu thụ đồ uống có cồn, đặc biệt là rượu. Theo thống kê của Bộ Y tế, từ đầu năm 2007 đến hết tháng 3-2017, toàn quốc đã ghi nhận 58 vụ ngộ độc rượu do sử dụng rượu không an toàn làm 382 người mắc và 98 người chết. Hầu hết các loại rượu đã sử dụng trong các vụ ngộ độc đều không rõ nguồn gốc, không được cấp Giấy chứng nhận công bố tiêu chuẩn sản phẩm, được kinh doanh nhỏ lẻ hoặc sản phẩm do người tiêu dùng tự pha chế và nấu sẵn. Rượu chưng cất ở Việt Nam (chủ yếu là rượu trắng) đa số được sản xuất tự do tại các địa phương và hầu hết đều nấu bằng phương pháp thủ công. Nhiều người nấu, nhiều cách nấu và nguyên liệu mỗi nơi môi khác nên chất lượng rượu không đồng đều. Trong đó, rượu nếp chưng cất Kim Sơn là một loại rượu có thương hiệu, được đề cử kỷ lục “Top 10 đặc sản rượu nổi tiếng nhất Việt Nam”. Rượu được sản xuất từ các làng nghề truyền thống thuộc huyện miền biển Kim Sơn, Ninh Bình [8]. Nhưng cho đến nay vẫn chưa có báo cáo chính thức nào về chất lượng rượu ở đây. Vì vậy, đề tài được thực hiện nhằm xác định hàm lượng ethanol, methanol, aldehyde trong sản phẩm rượu chưng cất Kim Sơn, Ninh Bình. 1
  10. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN Rượu là loại thức uống có cồn được sản xuất từ quá trình lên men, là sản phẩm của sự chưng cất hoặc không chưng cất ngũ cốc khoai, củ, hoa quả, chứa glucid, lêm men rượu. Về cơ bản, rượu được chia thành các loại như sau: rượu lên men qua chưng cất (rượu trắng, rượu lúa mới, ), rượu lên men không qua chưng cất (rượu vang, rượu táo, rượu bia, ) [11, 16]. 1.1. Tổng quan về quá trình chưng cất và rượu chưng cất 1.1.1. Quá trình chưng cất rượu Quá trình chưng cất dựa trên sự khác nhau về nhiệt độ sôi của các cấu tử trong hỗn hợp ở một áp suất nhất định. Người ta dùng nhiệt để chuyển hỗn hợp lỏng sang pha hơi và thu chất lỏng ở khoảng nhiệt độ thích hợp bằng cách cho hơi ngưng tụ [13]. Trong chưng cất rượu, quá trình chưng cất được tiến hành bằng cách đun sôi hỗn hợp lên men, hỗn hợp hơi bay lên được qua hệ thống làm lạnh và ngưng tụ thành rượu. Rượu được chưng cất nhằm loại bỏ một số tạp chất độc hại được sinh ra trong quá trình lên men và làm tăng độ cồn [26]. 1.1.2. Phân loại rượu chưng cất (rượu trắng chưng cất) Rượu trắng chưng cất là loại đồ uống có cồn được chưng cất từ dịch lên men có nguồn gốc tinh bột hoặc các loại đường [2]. Đa số rượu chưng cất đều có độ cồn từ 20% V/V trở lên (vodka (40-45% V/V) brandy (40-60% V/V)), số ít rượu chưng cất được sản xuất ở Đức có độ cồn thấp hơn 15% V/V [33]. 1.1.2.1. Rượu tinh cất Rượu tinh cất là rượu được chưng cất liên tục đến độ cồn bằng hoặc trên 95% V/V và được tinh chế lại nhằm loại bỏ mùi vị và màu sắc của rượu sau khi chưng cất. Rượu tinh cất được dùng để pha chế các loại rượu khác thấp độ cồn hơn như vodka, GNS . Volka (40-45% V) là rượu tinh cất được chưng cất từ sản phẩm lên men của khoai tây, ngũ cốc rỉ mật, và được xử lý sau chưng cất bằng than hoạt tính [31, 33]. 1.1.2.2. Whisky 2
  11. Whisky được chưng cất từ dịch ngâm lên men của nhiều loại ngũ cốc khác nhau như ngô, lúa mạch, lúa mạch đen, lúa mì, đến độ cồn thấp hơn 95% V/V và độ cồn đóng chai bằng hoặc trên 40% V/V [33]. Có nhiều loại Whisky được sản xuất trên thế giới khác nhau chủ yếu ở nguyên liệu lên men và quá trình sản xuất. Bốn loại nguyên liệu lên men chính là mạch nha, lúa mạch, lúa mạch đen và ngô. Các loại ngũ cốc có thể sử dụng đơn lẻ hoặc phối hợp với nhau để lên men. 1.1.2.3. Gin Gin được chưng cất từ các loại ngũ cốc lên men (chủ yếu là lúa mạch đen) và có mùi thơm đặc trưng của quả bách xù (juniper) hay một số loại thảo mộc khác, độ cồn đóng chai bằng hoặc trên 40% V/V [33]. 1.1.2.4. Brandy Brandy được chưng cất từ các loại trái cây lên men (thường là nho) đến độ cồn thấp hơn 95% V/V, có mùi vị và tính chất đặc trưng, độ cồn đóng chai bằng hoặc trên 40% V/V. Brandy gồm 3 loại chính là brandy nho (làm từ nước ép quả nho như Cognac, Armagnac, pisco, metaxa, ), brandy táo (làm từ các phần còn lại của quả nho như pomace/marc, grapa, Calvados, ) và brandy trái cây (làm từ các loại quả khác nho như kirschwasser, slivovitz, raisin, lees, ) [26, 33]. 1.1.2.5. Rum Rum được chưng cất từ dịch lên men của nước mía, syro mía, mật mía hay các phụ phẩm của mía đến độ cồn thấp hơn 95% V/V, có mùi vị và tính chất đặc trưng, độ cồn đóng chai bằng hoặc trên 40% V/V [33]. 1.1.2.6. Tequila Tequila là loại rượu có nguồn gốc từ Mexico, được chưng cất từ dịch ngâm lên men cây thùa xanh (Agave tequilana) trồng ở vùng Tequila và được chia thành hai nhóm chính là 100% de agave (100% đường sử dụng lên men từ agave) và mixto (51% đường sử lên men từ agave và 49% đường từ nguồn khác). Tequila có mùi vị và tính chất đặc trưng, độ cồn đóng chai bằng hoặc trên 40% V/V [26, 33]. 3
  12. 1.1.2.7. Mescal Mescal là loại rượu có nguồn gốc từ Mexico, được chưng cất từ dịch ngâm lên men cây maguey (Agave americana L.), có mùi vị và tính chất đặc trưng, độ cồn đóng chai bằng hoặc trên 40% V/V [33]. 1.1.2.8. Rượu mùi Rượu mùi là đồ uống được pha chế từ rượu chưng cất với nước, có thể bổ sung đường, dịch chiết trái cây và phụ gia thực phẩm. Độ cồn đóng chai khoảng 20-45% V/V. Có nhiều loại rượu mùi được sản xuất trên thế giới khác nhau chủ yếu bởi nguyên liệu sản xuất. Nguyên liệu sản xuất từ berry, từ chocolate, cà phê, kem, crème liquor, hoa, trái cây, thảo dược, mật ong, hạt, whisky và một số nguyên liệu khác như rum, brandy, lòng đỏ trứng, trà đen, [10]. 1.2. Giới thiệu bánh men thuốc bắc và quy trình sản xuất rượu Kim Sơn 1.2.1. Giới thiệu bánh men thuốc bắc Bánh men thuốc bắc là một loại men rượu được sản xuất thủ công tại Việt nam. Mỗi địa phương và mỗi dân tộc có phương pháp sản xuất riêng. Men rượu nếp chưng cất Kim Sơn là loại men 36 vị thuốc bắc, điều này đã làm nên sự khác biệt của sản phẩm này. Trong chế phẩm bánh men thuốc bắc chứa nhiều giống vi sinh vật thuộc vi khuẩn, nấm men và nấm mốc. Thực chất, men thuốc bắc là canh trường không thuần khiết của hệ vi sinh vật có khả năng sinh trưởng hệ enzym, đường hóa men rượu. Ngoài ra, đa số các vị thuốc bắc đều có mùi thơm. Các hợp chất này có thể phản ứng với nhau và với những hợp chất khác, tạo ra những hợp chất mới. Kết quả tạo ra mùi vị rất đặc trưng cho rượu cổ truyền [7]. Thực tế, trong sản xuất người ta thường dùng kết hợp nhiều vị thuốc khác nhau nhưng thông thường, chỉ sử dụng 8- 10 vị. Đặc biệt men rượu nếp Kim Sơn có sự kết hợp của 36 vị thuốc bắc tạo nên mùi vị đặc trưng của rượu. Qua khảo sát, các vị thuốc chính được thấy bao gồm: Nhục đậu khấu, Bạch truật, Nhục quế, Thảo quả, Cam thảo, Bạc hà, Tế tân, Uất kim, Tiểu hồi, Khung cùng, Phòng phong, Thạch cao, Tân lang, Mộc hương, Đinh hương, Thiên niên kiện, Trần bì, Bạch chỉ, Hoàng bá, Hoàng liên, Các vị thuốc được kết hợp với nhau theo một tỷ lệ nhất 4
  13. định theo kinh nghiệm để lại của người dân. Nguyên liệu chính để sản xuât bánh men thuốc bắc là: bột gạo, men giống và các vị thuốc bắc. Quy trình sản xuất như sau: Gạo Làm sạch Nước Ngâm nước Để ráo Bánh men Thuốc Giống bắc Xay thành bột Nghiền mịn Trộn men Nghiền mịn Nước Làm ẩm Tạo hình Bánh Ủ Hong khô men rượu Hình 1: Quy trình sản xuất bánh men rượu Bánh men sử dụng trong sản xuất rượu truyền thống là bột gạo ẩm trộn với bánh men giống giã nhỏ. Để tránh sự nhiễm các vi sinh vật là không mong muốn, người ta bổ sung các vị thuốc bắc thu được men thuốc bắc. Mỗi vị thuốc bắc chứa nhiều chất khác nhau, có tác dụng khác nhau như: nhóm chất có giá trị dinh dưỡng với vi sinh vật (protein, glucid, lipid, vitamin, chất khoáng, ); nhóm chất có tác dụng dược lý sát trùng (các tinh chất nhựa, alcaloid và các glucozid). Chính nhóm chất này giúp hạn chế các vi sinh vật không mong muốn từ môi trường ngoài trong quá trình lên men; và nhóm chất xơ, chất màu, [7, 9]. Do đó thuốc bắc vừa có tính kháng khuẩn vừa giảm sự tạp nhiễm các loài vi sinh vật có hại, đồng thời có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của hệ vi sinh vật chính trong bánh men. 1.2.2. Quy trình sản xuất rượu Kim Sơn 5
  14. Quy trình sản xuất rượu nếp trắng Kim Sơn được trình bày trong sơ đồ sau: Gạo nếp Nấu Bánh Nghiền mịn Trộn men men Lên men ẩm Nước Lên men lỏng Chưng cất Rượu trắng Hình 2: Quy trình sản xuất rượu Kim Sơn Chọn gạo nếp chiêm Cùng một quy trình nấu rượu nhưng khi nấu rượu với các loại gạo khác nhau sẽ cho ra chất lượng rượu khác nhau. Điển hình như khi nấu gạo tẻ, rượu sẽ không thơm và ngọt bằng rượu nếp nhưng đổi lại giá thành rẻ hơn. Người dân Kim Sơn thường chỉ nấu bằng gạo nếp, ở đây có hai loại nếp là nếp mùa và nếp chiêm nhưng theo kinh nghiệm từ xưa để lại thì gạo nếp chiêm sẽ cho ra rượu thơm ngon hơn. Gạo nếp đem nấu thành cơm Mục đích của quá trình nấu nguyên liệu là nhằm phá vỡ màng tế bào của bột, chuyển tinh bột thành trạng thái hòa tan trong dung dịch – hồ hóa tinh bột. Khi đun nguyên liệu với nước, sẽ xảy ra hiện tượng trương nở, hòa tan các kết dính giữa các tế bào (pectin, tinh bột, pentozan ), dẫn đến làm giảm độ bền cơ học của nguyên liệu. Ở 6
  15. nhiệt độ khoảng 140 - 150 ºC thành tế bào sẽ bị phá vỡ, các hạt tinh bột sẽ tách ra và hòa tan trong dung dịch. Để cơm nguội và rắc men thuốc bắc Để cơm nhanh nguội, người ta thường trải cơm ra một cái nong thật to, đan từ tre. Sau đó chờ đến khi nhiệt độ cơm còn khoảng 25 - 30 độ thì tiến hành rắc men thuốc bắc 36 vị và trộn đều. Tỷ lệ trộn men thường chiếm khoảng 3% so với tổng khối lượng cơm nấu. Quá trình lên men được chia làm 2 giai đoạn là lên men ẩm và lên men lỏng: Lên men ẩm Quá trình lên men ẩm là quy trình để emzym amylase và vi khuẩn xúc tác thủy phân tinh bột. Cơm đã trộn men được đem ủ trong khoảng 5 - 10 giờ để mốc mọc cả khối cơm, sau đó vun thành đống, phủ kín bằng vải và giữ ở nơi thoáng mát, nhiệt độ 25 - 30 ºC trong 3- 4 ngày tùy thuộc thời tiết và nhiệt độ. Mục đích của quá trình này là để tạo điều kiện cho nấm mốc và vi khuẩn phát triển, tiết ra emzym đường hóa tinh bột. Cũng trong giai đoạn này, nấm men cũng bắt đầu phát triển và chuyển hóa một ít đường thành rượu. Lên men lỏng Lên men lỏng là quá trình nấm men sử dụng đường tạo ra để lên men rượu. Khi cơm rượu có mùi thơm nhẹ của rượu, ăn thấy ngọt, có hơi cay vị của rượu thì chuyển sang ủ trong chum vại kín với nước sạch theo tỷ lệ: 1 phần gạo/ 2 - 3 phần nước. Thời gian ủ lỏng kéo dài khoảng 2 - 3 ngày. Cơm rượu ủ trong điều kiện kín, nấm mốc ngừng phát triển nhưng enzym tạo thành vẫn tiếp tục thủy phân tinh bột. Trong giai đoạn này, nấm men phát triển mạnh nhờ lượng oxy hòa tan trong nước và lượng đường tạo thành, sau đó chuyển sang lên men rượu. Chưng cất Khi quá trình lên men kết thúc, tiến hành trưng cất để thu rượu thành phẩm. Quá trình chưng cất rượu nhằm tách hỗn hợp rượu và nước có nhiệt độ sôi khác nhau. Ở áp suất thông thường, rượu sôi và bốc hơi ở nhiệt độ 78,5 ºC, nước sôi ở 100ºC nên rượu được tách ra khỏi nước nhờ nhiệt độ sôi thấp hơn. Dụng cụ để nấu rượu gồm một nồi 7
  16. lớn, không cần vung. Bên trên nồi này là một thùng tròn đóng bằng gỗ như cái trống, có đặt máng và ống dẫn rượu ra ngoài, trên cùng thường là một chậu lớn đặt nghiêng. Trong chậu này đựng nước thường xuyên được thay để giữ lạnh. Hơi rượu bốc lên từ nồi dưới, gặp lạnh ở đáy chậu đựng nước lạnh phía trên, sẽ hóa lỏng mà theo máng chảy ra ngoài rồi được hứng vào chai. Lúc bỏ cơm rượu vào để nấu, người ta pha thêm nước theo liều lượng, dùng đất sét trám thật kỹ giữa hai nồi, cùng chung quanh ống dẫn rượu để hơi rượu không bị bay thoát. Rượu thu được có màu trong, có mùi thơm đặc trưng và nồng độ rượu sẽ giảm dần theo thời gian chưng cất. Kết thúc quá trình lên men lỏng, cơm rượu được đêm chưng cất, thu được rượu trắng truyền thống Kim Sơn, Ninh Bình. Thông thường với 10 kg gạo nếp thường cất được 3 - 5 lít rượu. Tùy theo nồng độ rượu mong muốn mà người ta tiến hành pha trộn các loại rượu ở các khoảng thời gian chưng cất khác nhau. 1.3. Ethanol và những tạp chất có liên quan trong quá trình chưng cất 1.3.1. Ethanol Ethanol là thành phần chính có trong hầu hết thức uống có cồn có nguồn gốc từ quá trình lên men carbohydrate với nấm men [25]. Ethanol là chất lỏng không màu trong suốt, dễ bay hơi, có mùi đặc trưng và vị cay [14]: - Công thức cấu tạo: C2H5OH - Nhiệt độ sôi: 78,5 º C - Nhiệt độ nóng chảy: -114,1 º C - Tỷ trọng: d=0,789 g/mL Khi uống vào cơ thể, khoảng 20% ethanol được hấp thu ở dạ dày và 80% hấp thu ở ruột non. Rượu được hấp thu từ ruột sẽ theo tĩnh mạch cửa đến gan. Tại đây, 90% ethanol được chuyển hóa, một phần nhỏ được bài tiết nguyên dạng qua mồ hôi, hơi thở và nước tiểu. Ethanol được chuyển hóa chủ yếu bởi ADH ở bào tương của tế bào gan tạo thành acetaldehyde. Khi nồng độ ethanol trong máu đạt 100 mg/mL, ethanol được chuyển hóa qua hệ MEOS (ở những người nghiện rượu). Acetaldehyde được hình thành 8
  17. nhanh chóng bị oxy hóa thành acetate. Acetate được chuyển hóa thành acetyl-CoA vào chu trình Crebs giải phóng CO2 và H2O [18, 22, 28]. Ethanol gây độc trên hầu hết các hệ cơ quan, một số triệu chứng nhiễm độc có liên quan đến tác dụng của chất chuyển hóa acetaldehyde. Ethanol tác động lên một số protein màng tham gia vào con đường truyền tín hiệu bao gồm các receptor dẫn truyền thần kinh. Tác động chính của ethanol liên quan đến sự gia tăng ức chế GABA tại receptor GABA và ức chế receptor NMDA (N–methyl–D-aspartate), receptor của glutamate [18, 22]. Uống rượu vừa phải (khoảng 10 - 20g ethanol nguyên chất mỗi ngày) có tác dụng tốt trên hệ tim mạch. Ngược lại, việc lạm dụng rượu có khả năng gây tổn thương các cơ quan trong cơ thể, đặc biệt là gan, dạ dày, thực quản, ruột, tuyến tụy và não bộ, làm tăng khả năng ung thư trên các bộ phận [18]. 1.3.2. Hợp chất cacbonyl 1.3.2.1. Acid cacboxylic Acid cacboxylic là những hợp chất hữu cơ trong phân tử chứa ít nhất một nhóm carboxyl liên kết trực tiếp với nguyên tử cacbon hay hydrogen bằng liên kết cộng hóa trị [14]. Carboxylic acid trong rượu chưng cất có nguồn gốc từ quá trình lên men chủ yếu là các acid đơn chức mạch hở từ C1 đến C18 (đa số là mạch nhánh) và một phần nhỏ là các acid thơm. Acid acetic chiếm phần lớn trong tổng số acid, theo sau là acid decanoic, acid octanoic và acid dodecanoic [25]. Các acid được hình thành trong quá trình sinh tổng hợp hoặc quá trình phân hủy các acid béo và sự phân hủy các amino acid ở Saccharomyces trong điều kiện kỵ khí, số lượng tùy thuộc vào mỗi dòng nấm men. Điều kiện lên men không tối ưu cũng là nguyên nhân hình thành các acid, đặc biệt là acid acetic (do vi khuẩn acetic acid). Các acid thơm lẫn trong rượu có nguồn gốc từ những thùng sồi dùng để bảo quản, chủ yếu là benzoic acid, o-/p-hydrobenzoic acid, gallic acid, cinamic acid, ferulic acid, coumaric acid, syringic acid, vanillic acid, góp phần vào hương vị của rượu [25, 32]. Trong rượu chưng cất, các acid có nhiệt độ sôi cao hơn ethanol nên ra sau, quá trình chưng cất diễn ra càng dài tương ứng với hàm lượng acid càng cao. Hàm lượng 9
  18. acid cao trong rượu không đảm bảo chất lượng sản phẩm, acid acetic nhiều làm cho rượu có vị chua, sự hiện diện của các acid béo mạch ngắn tạo mùi vị khó chịu cho rượu, TCVN 7043:2013 không quy định hàm lượng acid trong rượu chưng cất [2]. 1.3.2.2. Este Este là sản phẩm của phản ứng giữa các acid (hữu cơ hoặc vô cơ) với alcohol. Este hữu cơ là dẫn xuất của carboxylic acid khi thay thế nhóm hydroxyl ở nhóm carboxyl bằng nhóm OR [14]. Este trong rượu là sản phẩm của sự tổ hợp các acid cacboxylic và alcohol, chủ yếu là các ethyl este [26]. RCOOH + R’OH ↔ RCOOR’ + H2O Các este trong rượu chưng cất bao gồm este của carboxylic acid mạch hở từ C2 đến C18 và este của các acid thơm. Ethyl acetate chiếm hơn 50% trong tổng số este. Ethyl formate tạo nên mùi thơm đặc trưng cho rum với hàm lượng dao động 5-35 mg/L. Este của acid thơm hiện diện ít nhất trong rượu chưng cất, chủ yếu là benzoate và ethyl phenylacetate [25]. Sự hình thành este giảm bớt một số độc tính trong rượu gây nên bởi acid và alcohol độc hại. Este cũng được xem là nguồn dự trữ các acid và alcohol trong rượu. Sự có mặt của este tạo nên mùi hương đặc trưng cho sản phẩm [26]. TCVN 7043:2013 không quy định hàm lượng este trong rượu chưng cất [2]. 1.3.2.3. Aldehyde Aldehyde là những hợp chất hữu cơ mang nhóm chức –CHO liên kết trực tiếp với nguyên tử cacbon hoặc hydrogen bằng liên kết cộng hóa trị [14]. Trong rượu chưng cất, aldehyde tổng số được tính bằng tổng của aldehyde dạng tự do và aldehyde dạng bảo vệ (hemiacetal và acetal)-sản phẩm của phản ứng thuận nghịch giữa aldehyde liên kết với alcohol trong rượu với hệ số bằng khoảng 0,9. Do đó, tương ứng với rượu mạnh có độ cồn từ 40% đến 50% V/V sẽ có 15-20% lượng aldehyde liên kết với ethanol [25]. Ở hầu hết các loại rượu chưng cất acetaldehyde chiếm hơn 90% tổng số aldehyde, ngoài ra, còn các aldehyde mạch hở khác từ C1 đến C12 (bão hòa hoặc không bão hòa) và các aldehyde thơm [25]. 10
  19. Các aldehyde được sinh ra trong quá trình lên men, bay hơi trước ethanol và nằm trong dịch cất đầu của quá trình chưng cất. Sự có mặt của aldehyde trong rượu sẽ làm tăng độc tính cho sản phẩm. Khi vào cơ thể, aldehyde có khả năng gắn kết với các protein và DNA của tế bào gan gây tổn thương. Acetaldehyde cùng các cytokine và các gốc tự do kích thích quá trình hoạt hóa các tế bào ở trạng thái không hoạt động. Các tế bào này sẽ biệt hóa thành các nguyên bào sợi cơ có khả năng sản xuất một lượng lớn collagen, proteoglycan và các glycoprotein như fibronectin và laminin lắng đọng bên ngoài tế bào làm tăng quá trình tạo xơ và dẫn tới xơ gan [18, 26]. Aldehyde là tạp chất luôn có mặt trong các sản phẩm rượu và có thể điều chỉnh được trong quá trình chế biến [26]. TCVN 7043:2013 cho phép tự công bố hàm lượng aldehyde trong rượu trắng chưng cất [2]. 1.3.2.4. Keton Keton hay alkanone là những hợp chất hữu cơ có cấu trúc RC(=O)R’, với R và R’ là những nhóm thế chứa cacbon có thể giống hoặc khác nhau [14]. Keton trong rượu chưng cất gồm các monoketon và diketon mạch hở từ C3 đến C14, đa số là acetone. Ngoài ra, còn có các keton khác như butaone, 2-pentanone, 3-penten-2-one, (E)-6- nonen-2-one, diacetyl, 2,3-pentanedione [25]. Các keton được hình thành chủ yếu do sự oxy hóa các alcohol bậc hai được sinh ra trong quá trình lên men [26]. Sự tạo thành keton làm giảm một số độc tính cho rượu gây nên bởi các alcohol tương ứng [26]. TCVN 7043:2013 không quy định hàm lượng keton trong rượu chưng cất [2]. 1.3.3. Alcohol 1.3.3.1. Methanol Methanol là alcohol đơn giản nhất có công thức CH3OH [14]. Trong rượu chưng cất, methanol có nguồn gốc từ sự phân giải các đại phân tử trong quá trình lên men như hemicelllulose, pectin, lignin và xylan. Chủ yếu là sự phân giải pectin bởi pectin methylestease [21]. Methanol là một chất được sinh ra trong quá trình lên men, bản thân methanol ít độc nhưng các chất chuyển hóa của nó lại rất độc. Khi vào cơ thể, methanol được chuyển 11
  20. hóa bởi ADH tạo ra formaldehyde (độc gấp 33 lần methanol) gây ra các triệu chứng lâm sàng. Formaldehyde sau đó nhanh chóng chuyển hóa thành formic acid (độc gấp 6 lần methanol) bởi formaldehyde dehydrogenase, ức chế cytochrome oxidase trong thần kinh thị giác làm xáo trộn dẫn truyền sợi trục. Ngoài ra, formic acid còn liên quan đến mức độ toan máu và mức độ gia tăng khoảng trống anion. Cuối cùng, formic acid được chuyển hóa thành CO2 và nước. Methanol ảnh hưởng chủ yếu lên hệ thần kinh trung ương với các triệu chứng say rượu, ngủ gà, sững sờ, co giật hay hôn mê [18, 21]. Hình 3: Quá trình chuyển hóa methanol trong cơ thể. Hàm lượng methanol vượt quá chỉ tiêu cho phép có thể dẫn đến ngộ độc cho người sử dụng [18]. TCVN 7043:2013 quy định hàm lượng methanol có trong 1 L ethanol 100º không lớn hơn 2000 mg [2]. 1.3.3.2. Alcohol bậc cao Alcohol bậc cao là những alcohol từ C3 trở lên lẫn trong thức uống có cồn [26]. Rượu bậc cao trong rượu chưng cất thường là 1-propanol, 2-methylpropanol, 2- methylbutanol, 3-methylbutanol và phenethyl alcohol được sinh ra trong quá trình lên men bởi các phản ứng sinh hóa biến đổi cacbohydrate và các amino acid [25]. Khi vào cơ thể, rượu bậc cao được chuyển hóa bởi ADH tạo thành các aldehyde và keton tương ứng, độc tính (dựa trên giá trị LD50) tùy thuộc vào chất chuyển hóa. Chất chuyển hóa của isobutanol là 2-methyl propanal có giá trị LD50 nhỏ hơn (độ độc cao hơn) nên hàm lượng rượu bậc cao được tính theo isobutanol [27]. TCVN 7043:2013 không quy định hàm lượng rượu bậc cao, tính theo metyl-2 propanol-1, mg/l ethanol 100o trong rượu trắng chưng cất [2]. 1.3.4. Furfural Furfural là hợp chất hữu cơ có nguồn gốc từ phụ phẩm nông nghiệp như bã mía, lõi ngô, vỏ trấu, thân lau sậy, mùn cưa, Furfural là một aldehyde dị vòng thơm, ở trạng 12
  21. thái lỏng dạng dầu, không màu, có mùi hạnh nhân. Furfural trong rượu được tạo ra từ quá trình dehydrate các pentose, chủ yếu là xylose khi lên men (xylose là sản phẩm phân hủy của hemicellulose, xylan, và là sản phẩm chuyển hóa của glucose qua nhiều bước) [15]. Nhiệt độ sôi của furfural là 161,7ºC, cao gấp đôi ethanol nên furfural ít gặp trong rượu chưng cất. Sự hiện diện của furfural trong rượu chưng cất có thể do dịch lên men có hàm lượng furfural cao, quá trình chưng cất diễn ra dài, nhiệt độ chưng cất cao, [34]. 1.4. Sơ lược về sắc ký khí 1.4.1. Khái niệm Sắc ký khí là kỹ thuật tách các chất dựa vào sự phân bố các chát giữa hai pha, pha động là chất khí và thường là khí trơ, pha tĩnh có thể là chất rắn (sắc ký khí rắn) hoặc chất lỏng (sắc ký khí lỏng). Thực chất trong sắc ký khí, pha động chỉ đóng vai trò làm chức năng vận chuyển chứ không tương tác với pha tĩnh [17, 24]. Hình 4: Sơ đồ hoạt động máy sắc ký khí Mẫu được bơm vào buồng pha động theo dòng khí mang đưa đến cột sắc ký (pha tĩnh). Mẫu khi đi qua cột này sẽ được hấp phụ lên pha tĩnh. Sau đó, các chất lần lượt tách khỏi cột theo dòng khí ra ngoài và được ghi nhận bởi đầu dò. Từ các tín hiệu nhận được, máy tính sẽ xử lý và biểu hiện kết quả bằng sắc ký đồ. Các chất được xác định nhờ giá 13
  22. trị thời gian lưu trên sắc ký đồ. Hệ thống sắc ký khí bao gồm các thành phần cơ bản như sau [17, 23]: - Nguồn cung cấp khí mang: bình chứa khí hoặc các thiết bị sinh khí. Khí mang thường là khí có phân tử lượng nhỏ, phải đảm bảo yêu cầu trơ về mặt hóa học, đảm bảo tinh khiết và phù hợp với từng loại detector. Một số loại khí mang thường dùng là heli, nitơ, hydro, argon, Đi kèm với bình cấp khí mang còn có van giảm áp, đồng hồ kiểm tra lưu lượng khí. - Buồng tiêm mẫu: mẫu phân tích được tiêm nhanh vào dòng pha động với một hàm lượng vừa đủ bằng kỹ thuật bơm tay hoặc bơm tự động. Mẫu được tiêm qua đệm silicon chịu nhiệt vào buồng hóa hơi, buồng này được đốt nóng tới nhiệt độ thích hợp và nối với cột tách. Có nhiều kỹ thuật tiêm mẫu khác nhau. Trong sắc ký mao quản, lượng mẫu rất ít (cỡ nanogram) và lưu lượng dòng khí cũng rất nhỏ (0,5-5 ml/phút) nên mẫu có thể được đưa vào cột theo các hình thức: - Kỹ thuật tiêm chia dòng (split) - Kỹ thuật tiêm không chia dòng (splitness) - Kỹ thuật tiêm thẳng vào cột (on-column) - Cột và lò cột: chương trình nhiệt độ cột của sắc ký khí là thông số rất quan trọng cần kiểm soát chính xác và lò cột đảm nhiệm nhiệm cụ này. Trong sắc ký khí có hai loại cột là cột nhồi và cột mao quản. Ngày nay do nhiều ưu điểm nên cột mao quản thường được sử dụng phổ biến. - Đầu dò: dùng phát hiện tín hiệu để định tính và định lượng các chất cần phân tích. Có nhiều loại đầu dò khác nhau tùy theo mục đích phân tích như đầu dò ion hóa ngọn lửa (FID), đầu dò dẫn nhiệt (TCD), đầu dò cộng kết điện tử (ECD), đầu dò quang hóa ngọn lửa (FPD), đầu dò Nitro- photpho (NPD), đầu dò khối phổ. - Bộ phận ghi nhận tín hiệu: ghi nhận tín hiệu do đầu dò phát hiện. * Các loại pha tĩnh trong sắc ký khí: trong sắc ký khí, pha tĩnh đóng vai trò chủ yếu trong việc tách các chất khỏi nhau. Tùy thuộc vào bản chất của chất phân tích mà chọn pha tĩnh thích hợp. Các loại pha tĩnh có thể được xếp vào 4 nhóm chính dựa vào tính 14
  23. phân cực của nó, bao gồm: nhóm không phân cực, nhóm phân cực yếu, nhóm phân cực trung bình và nhóm phân cực cao [17, 30]. 1.4.2. Ứng dụng của sắc ký khí 1.4.2.1. Phân tích định tính Phương pháp định tính các chất được tách ra bằng sắc ký khí có thể thực hiện theo 3 cách sau [1]: - So sánh tR của chất phân tích với tR của chất chuẩn trong cùng điều kiện sắc ký. - So sánh sắc ký đồ của mẫu phân tích với sắc ký đồ của mẫu phân tích đã thêm chuẩn đối chiếu. - Kết nối máy sắc ký khí với máy quang phổ IR hoặc khối phổ. 1.4.2.2. Phân tích định lượng Phân tích định lượng các hợp chất dựa trên nguyên tắc: nồng độ của chất tỷ lệ thuận với chiều cao hoặc diện tích pic của nó [6]. 15
  24. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của đề tài là một số mẫu rượu nếp chưng cất tại huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình. Bảng 1: Các mẫu rượu được khảo sát Ký hiệu mẫu Địa chỉ rượu MR 1 Nguyễn Thị C, xã Chất Bình, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình. MR 2 Tạ Lan T, trị trấn Phát Diệm, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình. MR 3 Đoàn Văn Q, chợ Kim Sơn, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình. MR 4 Lê Thị V, xã Cách Tâm, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình. MR 5 Lê Văn S, thị trấn Phát Diệm, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình. MR 6 Trần Quân L, xã Kim Định, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình. MR 7 Trần Lê B, xã Ân Hòa, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình. MR 8 Vũ Văn T, xã Hùng Tiến, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình. MR 9 Phạm Văn L, xã Cồn Thoi, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình. MR 10 Lê Anh V, xã Kim Trung, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình. MR 11 Trần Văn H, xã Chất Bình, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình. MR 12 Vũ Thị T, xã Kim Đông, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình. 2.2. Thiết bị - Dụng cụ - Hóa chất 2.2.1. Thiết bị, dụng cụ - Máy sắc ký khí Agilent được trang bị detector ion hóa ngọn lửa (nguồn gốc: Mỹ) - Cột sắc ký Supelcowax TM 10 - Khí heli tinh khiết 99,999% - Cân phân thích AW 220 (SHIMAZU) - Cồn kế - Nhiệt kế 16
  25. - Một số dụng cụ thủy tinh thông thường: buret, pipet, bình định mức, 2.2.2. Hóa chất - Kali pemanganat - Acid sulfuric - Acid oxalic - Ethanol - Methanol - Acetaldehyde - Fucsin bazơ - Natri hydrosulfit Tất cả các hóa chất đều thuộc hóa chất tinh khiết phân tích. 2.3. Một số phương pháp xác định hàm lượng ethanol, methanol và aldehyde trong rượu chưng cất 2.3.1. Xác định hàm lượng ethanol 2.3.1.1. Phương pháp đo tỷ trọng Dựa trên nguyên lý tỷ trọng của dung dịch ethanol trong nước càng thấp khi hàm lượng ethanol trong nước càng cao, do đó đo tỉ trọng dung dịch sẽ suy ra được hàm lượng ethanol [3]. 2.3.1.2. Phương pháp sử dụng cồn kế Về bản chất đây là phương pháp đo tỉ trọng, độ chìm của cồn kế trong dung dịch sẽ cho biết hàm lượng ethanol [3]. 2.3.2. Xác định hàm lượng methanol 2.3.2.1. Phương pháp sắc ký khí Hàm lượng methanol trong rượu xác định theo phương pháp sắc ký khí sử dụng chuẩn nội n-butanol: thêm vào cả mẫu chuẩn lẫn mẫu thử những lượng bằng nhau của n-butanol tinh khiết, rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Từ dữ kiện về chiều cao (hoặc diện tích) pic và nồng độ của chuẩn, chuẩn nội và mẫu thử, có thể xác định được hàm lượng methanol trong mẫu rượu [5, 6]. 2.3.2.2. Phương pháp so màu Nguyên tắc 17
  26. Oxy hóa methanol trong rượu thử bằng KMnO4 trong môi trường acid H2SO4 tạo ra formaldehyde [19]: 5CH3OH + 2KMnO4 + 3H2SO4 → 5HCHO + 2MnSO4 + K2SO4 + 8H2O Cho phần mẫu thử tác dụng với thuốc thử fucsin sulfit sau khi đã oxi hóa methanol thành aldehyd focmic. So màu của dung dịch thu được với màu của dung dịch chuẩn [5]. 2.3.3. Xác định hàm lượng aldehyde 2.3.3.1. Phương pháp chuẩn độ Nguyên tắc Aldehyde trong rượu tác dụng với bisulfite tạo thành α-oxisunfonic bền với chất oxi hóa. Lượng dư bisulfite được cho tác dụng với dung dịch chuẩn I2 sau đó chuẩn độ lượng dư I2 bằng dung dịch chuẩn Na2S2O3 với chỉ thị hồ tinh bột. Tuy nhiên đây là phương pháp dùng để xác định aldehyde có hàm lượng cao trong rượu [12]. 2.3.3.2. Phương pháp so màu Nguyên tắc Lượng nhỏ aldehyde được định lượng theo phương pháp so màu dựa trên phản ứng của aldehyde với fucshin và NaHSO3 tạo ra hợp chất màu hồng [12]. Cho thuốc thử fuchsine–bazơ tác dụng với rượu thử và rượu có hàm lượng aldehyde đúng tiêu chuẩn, màu của dung dịch rượu thử không được đậm hơn màu của dung dịch aldehyde tiêu chuẩn [4]. Hình 5: Phản ứng màu giữa aldehyde và thuốc thử fuchine-sulfite Tiến hành khảo sát khoảng nồng độ của các mẫu rượu cần phân tích và pha dãy các dung dịch acetaldehyde chuẩn có dải nồng độ bao trùm nồng độ của các mẫu. 18
  27. 2.3.3.3. Phương pháp sắc ký khí Nguyên tắc: Định lượng theo phương pháp chuẩn ngoại: so sánh chiều cao pic của aldehyde trong mẫu rượu thử với chiều cao pic của aldehyde chuẩn từ đó tính được nồng độ của aldehyde trong mẫu thử [6, 29]. Phương pháp sắc ký khí dùng để xác định hàm lượng acetaldehyde. Do ở hầu hết các loại rượu chưng cất, acetaldehyde chiếm đến hơn 90% tổng số các loại aldehyde nên việc xác định hàm lượng acetaldehyde có thể đánh giá được hàm lượng aldehyde nói chung có mặt trong rượu. 19
  28. CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định hàm lượng ethanol Quy trình xác định hàm lượng ethanol trong rượu bằng cồn kế được tóm tắt trong sơ đồ sau: Rượu mẫu Ống đong 100 mL Cồn kế + Nhi ệt kế + R + R Gía trị đọc được trên cồn kế + Gía trị đọc được trên nhiệt kế Tra phụ lục B + KẾT QUẢ Hình 6: Quy trình xác định hàm lượng ethanol Kết quả độ cồn của 12 MR chưng cất Kim Sơn được xác định bằng phương pháp sử dụng cồn kế và được quy đổi về độ cồn ở 20 C̊ như bảng sau: 20
  29. Bảng 2: Hàm lượng ethanol trong 12 mẫu rượu chưng cất Kim Sơn Hàm lượng Hàm lượng Mẫu Nhiệt độ đo ( ̊ C ) ethanol biểu kiến ethanol ở 20 C̊ (% V/V) (% V/V) MR 1 22 44,5 43,7 MR 2 22 40,0 39,2 MR 3 22 49,0 48,2 MR 4 20 42,5 42,5 MR 5 22 44,5 43,7 MR 6 22 43,5 42,7 MR 7 22 45,5 44,7 MR 8 22 50,5 49,7 MR 9 21 41,0 40,6 MR 10 21 41,5 41,4 MR 11 22 42,5 41,7 MR 12 23 40,5 39,2 3.2. Xác định hàm lượng methanol 3.2.1. Phương pháp sắc ký khí Tiến hành theo quy trình như trong TCVN 8010:2009 đồng thời khảo sát các điều kiện chạy sắc ký khí phù hợp để có thể tách được pic methanol khỏi các pic còn lại trên sắc ký đồ. Thay đổi các điều kiện nhiệt độ cột (từ 30 C̊ -150 C̊ , cách 10 C̊ ), tốc độ dòng qua cột (từ 1 ml/phút – 3 ml/ phút). Tuy nhiên do điều kiện tại Phòng thí nghiệm của Khoa không có loại cột sắc ký 23% Carbowax mà sử dụng cột Rxi-5Sil và cột Supelcowax TM 10-24080, kết quả hai cột này không thể tách được pic methanol ra khỏi pic ethanol, nhưng lại có thể tách tốt acetaldehyde. Do đó hệ này được dùng để xác định hàm lượng acetaldehyde có trong rượu. 3.2.2. Phương pháp so màu Hàm lượng methanol trong rượu chưng cất được xác định theo TCVN 8009:2009 bằng phương pháp so màu. 21
  30. Tiến hành: Pha dãy các dung dịch methanol chuẩn 50 mg/l, 100 mg/l, 250 mg/l, 1000mg/l trong cồn 45 .̊ Lấy 17 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 17 tương ứng với 12 mẫu rượu, 1 ống mẫu trắng chứa 0,2 ml cồn 45 ,̊ 4 ống đựng các dung dịch methanol chuẩn 50 mg/l, 100 mg/l, 250 mg/l, 1000 mg/l trong cồn 45 .̊ Quy trình xác định hàm lượng methanol trong rượu được tóm tắt trong sơ đồ sau: 0,2 ml mẫu thử 0,2 ml methanol chuẩn Thêm vào mỗi ống 5 ml dd KMnO4 + 0,4 ml H2SO4 loãng + 0,4 ml H=2SO4 Đậy nút, lắc đều 3 phút 1 ml acid oxalic bão hòa 1 ml H2SO4 đậm đặc Vàng nhạt 5 ml fucsin sulfit Mất màu hoàn toàn 35 phút SO SÁNH MÀU Hình 7: Quy trình so màu xác định hàm lượng methanol trong rượu Hàm lượng methanol (H) được tính bằng số mg methanol có trong 1L ethanol ∗100 100 ̊ theo công thức: = 22
  31. Trong đó: X: Hàm lượng methanol trong rượu (mg/l) c: Độ cồn của rượu. Kết quả theo thứ tự màu đậm dần như sau: Ống 13 < Ống 14 < Ống 1,2,5,8,11,12 < Ống 15 < Ống 3,4,6,7 < Ống 16 < Ống 17. . Hình 8: Kết quả so màu methanol của 12 mẫu rượu chưng cất Kim Sơn Kết quả cho thấy không có ống nào màu đậm hơn ống nghiệm methanol chuẩn 250 mg/l, có 5 mẫu (MR 3, 4, 6, 7, 8) màu đậm hơn ống nghiệm methanol chuẩn 100 mg/l và 7 mẫu (MR 1, 2, 5, 9, 10, 11, 12) có màu đậm hơn màu ống nghiệm methanol chuẩn 50 mg/l, riêng ống chứa mẫu trắng không có màu. Kết quả này được chuyển về hàm lượng methanol trong MR quy về độ cồn 100 thể hiện trong bảng 3. 23
  32. Bảng 3: Kết quả phương pháp so màu xác định hàm lượng methanol trong 12 mẫu rượu Kim Sơn. Tên Khoảng hàm lượng Hàm lượng methanol STT mẫu Độ cồn methanol trong MR trong MR quy về độ cồn rượu (mg/l) 100 (mg/l) 1 MR 1 43,7 50 < C1 < 100 114,4 < C1 < 228,8 2 MR 2 39,2 50 < C2 < 100 127,6 < C2 < 255,1 48,2 3 MR 3 100 < C3 < 250 207,5 < C3 < 518,7 42,5 4 MR 4 100 < C4 < 250 235,3 < C4 < 588,2 43,7 5 MR 5 50 < C5 < 100 114,4 < C5 < 228,8 6 MR 6 42,7 100 < C6 < 250 234,2 < C6 < 585,5 7 MR 7 44,7 100 < C7 < 250 224,7 < C7 < 559,3 8 MR 8 49,7 100 < C8 < 250 202,0 < C8 < 503,0 9 MR 9 40,6 50 < C9 < 100 123,2 < C9 < 246,3 10 MR 10 41,4 50 < C10< 100 120,8< C10 < 241,5 11 MR 11 41,7 50 < C11 < 100 117,9 < C11 < 239,8 12 MR 12 39,2 50 < C12 < 100 127,9 < C12 < 255,1 C1, C2, C12 lần lượt là hàm lượng methanol trong MR 1, MR 2, MR 12. Vậy không mẫu rượu nào có hàm lượng methanol vượt quá 2000 mg/l, các mẫu rượu có hàm lượng methanol nằm trong khoảng 114,1 đến 588,2 mg/l (tính theo số mg methanol trong 1 lít ethanol 100 ).̊ Điều này nghĩa là 12 mẫu rượu được khảo sát đều nằm trong giới hạn cho phép về hàm lượng methanol trong rượu trắng chưng cất theo TCVN 7043:2013 [2]. 3.3. Hàm lượng aldehyde 3.3.1. Phương pháp so màu Chuẩn bị 1 mẫu trắng chứa 10 ml ethanol 45̊ (không chứa aldehyde) cho vào ống nghiệm số 13 và pha dãy các dung dịch acetaldehyde chuẩn 20 mg/l, 40 mg/l, 80 mg/l, 24
  33. 160 mg/l từ dung dịch chuẩn acetaldehyde 160 mg/l vào 4 ống nghiệm đánh số từ 14 đến 17 như mô tả trong bảng sau: Bảng 4 : Pha dãy dung dịch chuẩn acetaldehyde Ống nghiệm Ống 14 Ống 15 Ống 16 Ống 17 Dung dịch Acetaldehyde 160 1,25 2,5 5,0 10,0 mg/l (ml) Cồn 45̊ (ml) 8,75 7,5 5,0 0,0 Nồng độ (mg/l) 20 40 80 160 Hàm lượng aldehyde được xác định theo TCVN 8009:2009 bằng phương pháp so màu, quy trình tóm tắt như sau: 10 ml mẫu thử 10 ml acetaldehyde chuẩn Thêm vào mỗi ống 2 ml dd fucsin sulfit Đặt trong chậu nước 20±2 C Lắc đều 20 phút SO SÁNH MÀU Hình 9: Quy trình so màu xác định hàm lượng aldehyde trong rượu Kết quả cho thấy ống mẫu trắng không màu, trong 12 ống nghiệm chứa các MR cần phân tích: không 1 ống nghiệm màu đậm hơn màu ống acetaldehyde chuẩn 160 mg/l (MR 12); 3 ống nghiệm (MR 2, 7, 12) có màu đậm hơn màu ống acetaldehyde chuẩn 80 25
  34. mg/l; 5 ống nghiệm (MR 1, 3, 5, 6, 8) có màu đậm hơn màu ống acetaldehyde chuẩn 40 mg/l và 4 ống nghiệm (MR 4, 9, 10, 11) có màu đậm hơn màu ống acetaldehyde chuẩn 20 mg/l. Bảng 5: Kết quả hàm lượng aldehyde trong 12 mẫu rượu Kim Sơn bằng phương pháp so màu Tên Khoảng hàm lượng Hàm lượng aldehyde trong STT mẫu Độ cồn aldehyde trong MR MR quy về độ cồn 100 rượu (mg/l) (mg/l) 1 MR 1 43,7 40 < C1 < 80 91.5< C1 < 183,1 2 MR 2 39,2 80 < C2 < 160 204,1 < C2 < 408,2 48,2 3 MR 3 40 < C3 < 80 83,0 < C3 < 166,0 42,5 4 MR 4 20 < C4 < 40 47,1 < C4 < 94,1 43,7 5 MR 5 40 < C5 < 80 91,5 < C5 < 183,1 6 MR 6 42,7 40 < C6 < 80 93,7 < C6 < 187,4 7 MR 7 44,7 80 < C7 < 160 179,0 < C7 < 358,0 8 MR 8 49,7 40 < C8 < 80 80,5 < C8 < 161,0 9 MR 9 40,6 20 < C9 < 40 49,3 < C9 < 98,5 10 MR 10 41,4 20 < C10< 40 48,3< C10 < 96,6 11 MR 11 41,7 20 < C11 < 40 48,0 < C11 < 95,9 12 MR 12 39,2 80 < C12 < 160 204,1 < C12 <408,2 26
  35. 3.3.2. Phương pháp sắc ký khí Khảo sát các điều kiện chạy của máy sắc ký khí kết nối detector FID để tìm được điều kiện tối ưu cho quá trình phân tích acetaldehyde trong rượu: - Cột sắc ký Supelcowax TM 10-24080 (30 m × 0,32 mm × 0,25 μm) - Nhiệt độ cột: 60 C/̊ 6 phút, tăng lên 220 ̊C (50 C/̊ 1 phút), giữ trong 2 phút - Tỷ lệ chia dòng: 5:1 - Thể tích tiêm mẫu: 1 µl - Tốc độ dòng khí heli: 0,75 mg/ml - Nhiệt độ detector FID và ống nối: 250 ̊C Đánh giá phương pháp phân tích • Tính phù hợp của hệ thống sắc ký khí Tiến hành chạy sắc ký khí với các điều kiện đã chọn trên. Sắc ký đồ của acetaldehyde chuẩn 100 mg/l thực hiện 6 lần được minh họa trong Phụ lục 2. Kết quả 6 lần sắc ký khí với acetaldehyde chuẩn 100 mg/l được thể hiện trong bảng sau: 27
  36. Bảng 6: Kết quả sắc ký khí với acetaldehyde chuẩn 100 mg/l thực hiện 6 lần Chuẩn aldehyde 100 mg/l Thời gian lưu (s) Chiều cao pic (mAU) Lần 1 2,062 15492,4 Lần 2 2,066 16747,7 Lần 3 2,054 17376,9 Lần 4 2,052 17785,1 Lần 5 2,073 18049,1 Lần 6 2,073 17451,4 Tổng 10,307 102902,6 Trung bình 풙̅ 2,0614 17150,4 SD 0,008648 615,3 RSD (%) 0,4196 3,588 푛 ∑1 푖 Giá trị trung bình: ̅ = 푛 2 ∑푛( 푖− ̅) Độ lệch chuẩn: SD =√ 1 푛−1 SD Độ lệch chuẩn tương đối RSD (%)= *100 ̅ Như vậy, độ lệch chuẩn RSD của thời gian lưu là 0,4196 % < 1 %, của chiều cao pic là 3,588% < 4% nên hệ thống sắc ký ổn định, đảm bảo kết quả tin cậy [20]. • Độ tuyến tính Tiến hành: dựng đường chuẩn của dãy acetaldehyde chuẩn nồng độ 10 mg/l, 50 mg/l, 100 mg/l, 150 mg/l, 200 mg/l. Sắc ký đồ thu được như sau: 28
  37. uV(x10,000) Chromatogram 1.25 1.00 /1146963940/51219417 0.75 0.50 0.25 /5913/1229 0.00 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 min Hình 10: Sắc ký đồ của chuẩn acetaldehyde 10 mg/l uV(x10,000) Chromatogram 2.50 2.25 2.00 1.75 1.50 1.25 1.00 0.75 /48710/6902 0.50 0.25 0.00 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 min Hình 11: Sắc ký đồ của chuẩn acetaldehyde 50 mg/l uV(x10,000) 3.00 Chromatogram 2.75 2.50 2.25 2.00 1.75 /64878/16671 1.50 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 3.75 4.00 4.25 4.50 4.75 5.00 5.25 5.50 5.75 min Hình 12: Sắc ký đồ của chuẩn acetaldehyde 100 mg/l 29
  38. uV(x10,000) 3.5 Chromatogram 3.0 /101561/25614 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 3.75 4.00 4.25 4.50 4.75 5.00 5.25 5.50 5.75 min Hình 13: Sắc ký đồ của chuẩn acetaldehyde 150 mg/l uV(x10,000) Chromatogram 3.5 3.0 /176512/36036 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 3.75 4.00 4.25 4.50 4.75 5.00 5.25 5.50 5.75 6.00 min Hình 14: Sắc ký đồ của chuẩn acetaldehyde 200 mg/l Kết quả sự tương quan giữa nồng độ acetaldehyde chuẩn và chiều cao pic thể hiện qua bảng sau: Bảng 7: Sự phụ thuộc chiều cao pic theo nồng độ acetaldehyde Nồng độ acetaldehyde chuẩn 10 50 100 150 200 (mg/l) Chiều cao pic (mAU) 1229 6902 16671 25614 36036 30
  39. 40000 y = 184,39x - 1517,2 35000 R² = 0,9971 30000 25000 20000 Chiều Chiều pic cao (mAU) 15000 10000 5000 0 0 50 100 150 200 250 Nồng độ (mg/l) Hình 15: Đồ thị biểu thị sự phụ thuộc giữa chiều cao pic hàm lượng acetaldehyde Từ đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa chiều cao pic với hàm lượng acetaldehyde, phương trình hồi quy tuyến tính y = 184,93x – 1519,2 có hệ số tương quan R² = 0,9971 > 0,995 cho thấy trong khoảng hàm lượng 10 mg/l - 200 mg/l, có sự tương quan tuyến tính giữa chiều cao pic với hàm lượng acetaldehyde. Tiến hành chạy sắc ký khí với 12 mẫu rượu và ghi lại kết quả từ sắc ký đồ. Sắc ký đồ của các mẫu rượu thu được như sau: 31
  40. uV(x10,000) Chromatogram 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 /29249/6635 0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 min uV(x10,000) Chromatogram 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 /79443/17093 1.5 1.0 0.5 0.0 /984/211 uV(x10,000) 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 min Chromatogram 2.25 MR 3 2.00 1.75 1.50 1.25 1.00 0.75 /30210/7192 0.50 0.25 0.00 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 min uV(x1,000) 11.0 Chromatogram 10.0 MR 4 9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 /17476/3747 3.0 2.0 1.0 0.0 -1.0 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 3.75 4.00 4.25 4.50 4.75 5.00 5.25 5.50 5.75 6.00 6.25 min 32
  41. uV(x10,000) Chromatogram 4.5 MR 5 4.0 3.5 /901008574/46341946 3.0 2.5 2.0 1.5 /54351/11116 1.0 0.5 0.0 uV(x10,000) Chromatogram0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 min 4.5 4.0 MR 6 /666430/150293 3.5 /816574246/44326817 3.0 2.5 2.0 1.5 /56911/12351 1.0 0.5 /6074/2150 0.0 /795/191 uV(x10,000) Chromatogram0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 min 4.5 4.0 MR 7 /874783/201627 /1056678/243810 3.5 /87121/23122 /932064363/47480962 3.0 2.5 2.0 /80164/19245 /53026/16225 1.5 1.0 0.5 /7899/1447 /1525/556 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 min uV(x10,000) Chromatogram 4.5 4.0 MR 8 /98552/30607 /477594/106432 /774107/173937 3.5 /951284031/46069058 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 /40119/8016 0.5 /9400/3282 0.0 /804/167 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 min 33
  42. uV(x10,000) 1.2 Chromatogram 1.1 MR 9 1.0 /30651/8699 /108232/25195 0.9 /676401/130696 0.8 /697736358/42640105 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 /14711/3180 0.2 /4806/1566 0.1 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 min uV(x1,000) Chromatogram 5.0 4.5 MR 10 /31435/8631 /266180/63259 4.0 /562809/91222 3.5 /723373881/41999919 3.0 2.5 /13382/2663 2.0 /5916/1664 1.5 1.0 0.5 0.0 -0.5 uV(x1,000)0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 min 6.0 Chromatogram 5.5 5.0 MR 11 /52138/16896 /139982/31808 4.5 /22858/4555 4.0 /812413874/44118381 3.5 3.0 /8381/2641 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 -0.5 uV(x10,000)0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 min 5.0 Chromatogram 4.5 MR 12 4.0 /444390/85366 /491257/122867 /835547/144966 3.5 /672163398/41296213 3.0 /127118/27384 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 /9874/2776 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 min Hình 16: Sắc ký đồ thu được của 12 mẫu rượu 34
  43. Dựa vào chiều cao pic acetaldehyde thu được của 12 mẫu rượu nếp Kim Sơn, thay vào phương trình đường chuẩn phụ thuộc giữa nồng độ acetaldehyde và chiều cao pic y = 184,93x – 1517,2 nồng độ acetaldehyde trong các mẫu rượu được tính: 풚+ , x= ퟒ, Hàm lượng acetaldehyde (Hi) được tham chiếu trên đường chuẩn quy đổi về số mg 푿∗ acetaldehyde có trong 1lít ethanol 100 ̊ được tính theo công thức: Hi= Trong đó: X là hàm lượng acetaldehyde trong mẫu rượu. c là độ cồn của rượu mẫu. Kết quả phân tích hàm lượng acetaldehyde trong 12 mẫu rượu Kim Sơn được trình bày trong bảng sau. Bảng 8: Kết quả hàm lượng acetaldehyde trong 12 mẫu rượu Kim Sơn bằng phương pháp sắc ký khí Hàm lượng Chiều Hàm lượng Mẫu acetaldehyde trong cao pic acetaldehyde/mẫu rượu Độ cồn rượu ethanol 100 ̊ (mAU) (mg/l) (mg/l) MR 1 6635 44,2 43,7 101,2 MR 2 17093 100,9 39,2 257,5 MR 3 7192 47,2 48,2 97,9 MR 4 3747 28,6 42,5 67,2 MR 5 11116 68,5 43,7 156,8 MR 6 12351 75,2 42,7 176,1 MR 7 19245 112,6 44,7 251,9 MR 8 8016 51,7 49,7 104,0 MR 9 3180 25,5 40,6 62,7 MR 10 2663 22,7 41,4 54,8 MR 11 4555 32,9 41,7 79,0 MR 12 27384 156,7 39,2 399,8 35
  44. Kết quả hai phương pháp xác định hàm lượng aldehyde trong rượu cho thấy hàm lượng acetaldehyde trong các mẫu rượu theo phương pháp sắc ký khí cũng thuộc khoảng nồng độ đánh giá của phương pháp so màu. Phương pháp sắc ký khí có ưu điểm là cho phép định lượng acetaldehyde trong rượu, tuy nhiên quy trình thực hiện phức tạp và tốn kém hơn so với phương pháp so màu. 3.4. Bàn luận Về độ cồn Theo TCVN 8008:2009, độ cồn có thể được xác định theo phương pháp sử dụng máy đo tỷ trọng hoặc sử dụng cồn kế. Tuy nhiên do điều kiện cơ sở vật chất chưa có máy đo tỷ trọng nên nghiên cứu chỉ tiến hành theo một phương pháp là sử dụng cồn kế. Độ cồn xác định theo phương pháp sử dụng cồn kế có thể có sai số trong quá trình đo do: khắc vạch trên cồn kế và nhiệt kế là 0,5; nhiệt độ trong bảng tra độ cồn là số nguyên phải làm tròn số; nhiệt độ không đảm bảo trong quá trình đo; sai số chủ quan khi đọc kết quả trên cồn kế và nhiệt kế, nhưng có ưu điểm là thực hiện nhanh và đơn giản. Về hàm lượng methanol Phương pháp so màu xác định hàm lượng methanol trong rượu chưng cất mới chỉ dừng lại ở mức bán định lượng. Hàm lượng methanol trong rượu chưng cất có thể được định lượng bằng phương pháp khác như sắc ký khí. Nghiên cứu cũng đã tiến hành trên máy sắc ký khí Agilent, cột sắc ký Supelcowax TM 10, 24080 (30 m × 0,32 mm × 0,25 µ) và cột Rxi 5Sil (15 m × 0,25 mm × 0,25 µ), khảo sát các điều kiện chạy khác nhau. Tuy nhiên cả hai loại cột này đều không tách rõ pic methanol và pic ethanol. Một trong số các nguyên nhân ở đây là do tỷ số bêta (β – liên quan giữa bán kính và độ dày cột) của hai cột sắc ký trên là quá lớn: βSupelcowax =320, βRxi 5Sil = 250. Mà theo [30], các hợp chất có phân tử lượng thấp, dễ bay hơi được tách bởi những cột có tỷ số β nhỏ hơn 100. Theo kết quả xác định hàm lượng methanol trong rượu bằng phương pháp so màu như trong TCVN 8010:2009 thì tất cả các mẫu rượu được khảo sát đều nằm trong giới hạn cho phép. Tuy nhiên, nếu so với mức cho phép của hàm lượng methanol trong rượu trắng pha chế (yêu cầu hàm lượng methanol ≤ 100 mg/l ethanol 100̊) thì 12 mẫu rượu trên đều cao hơn và có tới 5 mẫu vượt hơn 2 lần. 36
  45. Về hàm lượng aldehyde Hàm lượng aldehyde trong rượu trắng được xác định dựa theo phương pháp so màu và phương pháp sắc ký khí. Phương pháp so màu có ưu điểm là quy trình thực hiện đơn giản hơn, tuy nhiên kết quả chỉ dừng lại ở mức bán định lượng. Phương pháp sắc ký khí cho thấy ưu điểm hơn do định lượng chính xác hàm lượng acetaldehyde – một loại aldehyde chính có mặt trong rượu. Phương pháp phân tích sắc ký khí trong nghiên cứu đã được thẩm định các chỉ tiêu về độ chọn lọc và khoảng tuyến tính. Qua kết quả khảo sát, độ lệch chuẩn của thời gian là 0,4196%, của chiều cao pic là 3,588%, chứng tỏ hệ thống có tính phù hợp cao, có thể áp dụng trong phân tích mẫu thực tế. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính cho thấy trong khoảng hàm lượng 10 – 200 mg/l, có sự tương quan chặt chẽ giữa hàm lượng acetaldehyde và chiều cao pic với hệ số tương quan bằng 0,9971. Qua kết quả phân tích, hàm lượng acetaldehyde trong các mẫu rượu đều cao, ở mức từ 54,8 mg/l đến 399,8mg/l ethanol 100̊. Nhưng trong quy định chỉ tiêu hàm lượng aldehyde (TCVN 7043:2013) nêu “nhà sản xuất tự công bố”, nên không có cơ sở để dánh giá. Tuy nhiên, nếu áp theo chỉ tiêu về hàm lượng aldehyde tính theo của rượu trắng pha chế (< 5 mg/l) thì riêng hàm lượng acetaldehyde đã vượt quá tiêu chuẩn quy định đối với rượu trắng pha chế từ gần 11 đến 80 lần. 37
  46. Kết luận Từ kết quả thực nghiệm nói chung khóa luận đã đạt được mục tiêu đề ra, tuy rằng còn hạn chế là số lượng mẫu còn thấp, chỉ bán định lượng hàm hượng methanol, và aldehyde. Qua quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi đã rút ra một số kết luận sau: - Về hàm lượng ethanol có sự chênh lệch lớn giữa các mẫu rượu (từ 39,2% V/V đến 49,7% V/V) - Về hàm lượng methanol không có mẫu rượu nào vượt chỉ tiêu hàm lượng methanol quy đinh cho rượu trắng chưng cất. Nhưng tất cả các mẫu đều vượt chỉ tiêu hàm lượng quy định cho rượu trắng pha chế và có tới 5 mẫu vượt hơn 2 lần chỉ tiêu. - Về hàm lượng aldehyde tuy không có quy định cụ thể cho rượu trắng chưng cất, nhưng hàm lượng được xác định là khá cao, tính riêng acetaldehyde đã gấp từ 11 đến 80 lần hàm lượng aldehyde cho phép trong rượu trắng pha chế. Kiến nghị: - Do còn hạn chế về mặt thời gian và điều kiện nên để tài chỉ nghiên cứu được ít chỉ tiêu và lượng ít mẫu. Để đánh giá toàn diện về rượu chưng cất Kim Sơn cần tiến hành với số lượng mẫu đủ đại diện và khảo sát toàn bộ các chỉ tiêu quy định. - Cần bổ sung quy trình định lượng acetaldehyde trong rượu chưng cất vào TCVN 8009 để các cơ sở kiểm nghiệm có căn cứ áp dụng và có được kết quả tin cậy hơn các phương pháp đã nêu. 38
  47. TÀI LIỆU THAM KHẢO I. TIẾNG VIỆT [1]. Trần Tử An (2007), Hóa phân tích, Tập II- Phân tích dụng cụ, Nxb Y học. [2]. Bộ Khoa học và Công nghệ, TCVN 7043:2013. Rượu trắng. [3]. Bộ Khoa học và Công nghệ, TCVN 8008:2009. Rượu chưng cất – Xác định độ cồn. [4]. Bộ Khoa học và Công nghệ, TCVN 8009:2009. Rượu chưng cất – Xác định hàm lượng aldehyde. [5]. Bộ Khoa học và Công nghệ, TCVN 8010:2009. Rượu chưng cất – Xác định hàm lượng methanol. [6]. Bộ Y tế (2005), Kiểm nghiệm Dược phẩm, Nxb Y học. [7]. Nguyễn Phi Hùng (2013), Luận văn Nghiên cứu sản xuất rượu gạo từ bánh men thuốc bắc. [8]. Liên hiệp Hội Khoa học và Kỹ thuật Ninh Bình (2011), [9]. Đỗ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. [10]. Lê Văn Việt Mẫn (2010), Công nghệ sản xuất các sản phẩm từ sữa và thức uống pha chế, Tập 2, Nxb Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh. [11]. NĐCP (2012), Về sản xuất, kinh doanh rượu. [12]. Tạ Văn Ri, Nguyễn Thị Thảo (2006), Thực tập phân tích hóa học phần 1, phân tích định lượng hoá học, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội. [13]. Đặng Như Tại, Trần Quốc Sơn (1999), Hóa học hữu cơ, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội. [14]. Nguyễn Đình Thành (2010), Cơ sở Hóa học hữu cơ, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội. [15]. Nguyễn Minh Thảo (2004), Hóa học hợp chất dị vòng, Nhà xuất bản giáo dục, Hà Nội. [16]. Nguyễn Đình Thưởng Nguyễn Thanh Hằng (2012), Công nghệ sản xuất và kiểm tra cồn etylic, Đại học Bách Khoa Hà Nội, Nxb Khoa học và Kỹ thuật. [17]. Phạm Hùng Việt (2005), Sắc ký khí cơ sở lý thuyết và khả năng ứng dụng, Đại học Quốc gia Hà Nội. [18]. Phan Thị Xuân (2010). Ngộ độc ethanol và ngộ độc methanol, Bộ môn Hồi sức cấp cứu chống độc, Bệnh viện Chợ Rẫy. II. TIẾNG ANH [19]. AOAC 958.04, Methanol in distilled liquors. Colorimetric Method. [20]. AOAC International (2012), AOAC offical methods of analysis, Appendix K: Guidelines for Dietary Supplements and Botanicals, Part 1: AOAC Guidelines for 39
  48. Single Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals [21]. Becker C.E. (1983), Methanol poisoning, The journal of Emergence Medicine. [22]. Christiane B. and Christian B. J (1997), Alcohol’s role in gastrointestinal tract disorders, Alcohol Health and Research World. [23]. David O. S., Zelda P., Fulton K., (2011), Gas Chromatography and Mass Spectrometry: A Practical Guide, Academic Press. [24]. Frederic D. Cristina C. H. (2007), "Fast analysis by gas-liquid chromatography Perspective on the resolution of complex fatty acid composition", Journal of Chromatography A, 175- 178. [25]. IARC Monograph (1988), Chemical composition of alcoholic beverages, additives and contaminants, Medline, 46:419. [26]. Jacques K.A, Lyons T.P, Kelsal D. R. (2003), The Alcohol Textbook-A Reference for the Beverage, Fuel and Industrial Alcohol Industrie. Nottingham University Press. Nottingham, UK. [27]. Lachenmeier D. W., Haupt S., Schulz K. (2008), Defining maximum levels of higher alcohols in alcoholic beverages and surrogate alcohol products. [28]. Lieber C.S. (2000), "Alcohol and the liver: Metabolism of alcohol and its role in hepatic and extrahepatic diseases", The Mount Sinai Journal of Medicine 84-94. [29]. Matia N. Lau, John D. Ebeler, Susan E. Ebeler (1999), "Gas Chromatographic Analysis of Aldehydes in Alcoholic Beverages Using a Cysteamine Derivatization Procedure", AJEV, US. [30]. Sigma-Aldrich (2017), GC Column Selection Guide. Product Information, US. [31]. Stone (2001), "Making gin and vodka - A professional guide for ". [32]. Torija M.J. Beltran G., Novo M. (2003), "Effect of organic acids and nitrogen source on alcoholic fermentation: Study of their buffering capacity.", Journal of Agricultural and Food Chemistry. [33]. U.S. Department of Treasury (2007), The beverage alcohol manual (BAM) – A practice guide. , T. The Alcohol and Tobacco Tax and Trade Bureau. [34]. Zeitsch K. J. (2000), The Chemistry and Technology of Furfural and its Many By- Products, Elsevier Science B.V. 40
  49. Phụ lục A: Quy định kỹ thuật về rượu trắng trong TCVN 7043:2013 Các chỉ tiêu hóa học của rượu trắng Tên chỉ tiêu Mức Rượu trắng Rượu trắng pha chưng cất chế 1. Hàm lượng ethanol, % thể tích ở 20 oC Tự công cố Tự công bố 2. Hàm lượng methanol, mg/l ethanol 100o Không lớn hơn Không lớn hơn 2 000 100 3. Hàm lượng rượu bậc cao, tính theo – Không lớn hơn 5 metyl-2 propanol-1, mg/l ethanol 100o 4. Hàm lượng aldehyde, tính theo Tự công bố Không lớn hơn 5 axetaldehyd, mg/l ethanol 100o 5. Hàm lượng este, tính theo ethyl acetate, – Không lớn hơn 13 mg/l ethanol 100o 41
  50. Phụ lục B: Bảng quy đổi độ rượu ở các nhiệt độ khác nhau về 20 oC Thông số đo được trên cồn kế Nhiệt 55,0 54,5 54,0 53,5 53,0 52,5 52,0 51,5 51,0 50,5 độ oC Độ rượu tính theo thể tích ở nhiệt độ 20 oC + 30 51,3 50,8 50,3 49,8 49,3 48,8 48,2 47,7 47,2 46,7 + 29 51,7 51,2 50,7 50,2 49,6 49,1 48,6 48,1 47,6 47,1 + 28 52,1 51,5 51,0 50,5 50,0 49,5 49,0 48,5 48,0 47,5 + 27 52,4 51,9 51,4 50,9 50,4 49,9 49,4 48,8 48,3 47,8 + 26 52,8 52,3 51,8 51,3 50,8 50,2 49,7 49,2 48,7 48,2 + 25 53,2 52,6 52,2 51,6 51,4 50,9 50,4 49,6 49,1 48,6 + 24 53,5 53,0 52,5 52,0 51,5 51,0 50,5 50,0 49,5 49,0 + 23 53,9 53,4 52,9 52,4 51,9 51,4 50,9 50,4 49,9 49,4 + 22 54,3 53,8 53,3 52,8 52,2 51,8 51,2 50,7 50,2 49,7 + 21 54,6 54,1 53,6 53,4 52,6 52,1 51,6 51,1 50,6 50,1 + 20 55,0 54,5 54,0 53,5 53,0 52,5 52,0 51,5 51,0 50,5 + 19 54,4 54,9 54,4 53,9 53,4 52,9 52,4 51,9 51,4 50,9 + 18 55,8 55,2 54,7 54,2 53,7 53,2 52,7 52,2 51,7 51,2 + 17 56,1 55,6 55,1 54,6 54,1 53,6 53,4 52,6 52,1 51,6 + 16 56,4 56,0 55,5 55,0 54,5 54,0 53,5 53,0 52,5 52,0 + 15 56,8 56,3 55,8 55,3 54,8 54,4 53,9 53,4 52,9 52,4 + 14 57,2 56,7 56,2 55,7 55,2 54,7 54,2 53,7 53,2 52,7 + 13 57,5 57,0 56,5 56,0 55,6 55,1 54,6 54,4 53,6 53,4 + 12 57,9 57,4 56,9 56,4 55,9 55,4 55,0 54,5 54,0 53,5 + 11 58,2 57,7 57,2 56,8 56,3 55,8 55,3 54,8 54,3 53,8 + 10 58,6 58,1 57,6 57,1 56,6 56,2 55,7 55,2 54,7 54,2 + 9 58,9 58,4 58,0 57,5 57,0 56,5 56,0 55,6 55,1 54,6 + 8 59,3 58,8 58,3 57,8 57,4 56,9 56,4 55,9 55,4 54,9 + 7 59,6 59,2 58,7 58,2 57,7 57,2 56,8 56,3 55,8 55,3 + 6 60,0 59,5 59,0 58,5 58,1 57,6 57,1 56,6 56,1 55,6 + 5 60,3 59,8 59,4 58,9 58,4 57,9 57,4 57,0 56,5 56,0 + 4 60,7 60,2 59,7 59,2 58,8 58,3 57,8 57,3 56,8 56,4 + 3 61,0 60,5 60,1 59,6 59,1 58,6 58,2 57,7 57,2 56,7 + 2 61,4 60,9 60,4 59,9 59,4 59,0 58,5 58,0 57,5 57,1 + 1 61,7 61,2 60,7 60,3 59,8 59,3 58,8 58,4 57,9 57,4 + 0 62,0 61,6 61,1 60,6 60,4 59,7 59,2 58,7 58,2 57,8 42
  51. Thông số đo được trên cồn kế Nhiệt 50,0 49,5 49,0 48,5 48,0 47,5 47,0 46,5 46,0 45,5 độ oC Độ rượu tính theo thể tích ở nhiệt độ 20 oC + 30 46,2 45,7 45,2 44,7 44,2 43,6 43,4 42,6 42,1 41,6 + 29 46,6 46,1 45,6 45,0 44,5 44,0 43,5 43,0 42,5 42,0 + 28 47,0 46,4 46,0 45,4 44,9 44,4 43,9 43,4 42,9 42,4 + 27 47,3 46,8 46,4 45,8 45,3 44,8 44,3 43,8 43,3 42,8 + 26 47,7 47,2 46,7 46,2 45,7 45,2 44,7 44,2 43,7 43,2 + 25 48,1 47,6 47,1 46,6 46,1 45,6 45,1 44,6 44,1 43,6 + 24 48,5 48,0 47,5 47,0 46,4 46,0 45,4 44,9 44,4 43,9 + 23 48,9 48,4 47,8 47,3 46,8 46,3 45,8 45,3 44,8 44,3 + 22 49,2 48,7 48,2 47,7 47,2 46,7 46,2 45,7 45,2 44,7 + 21 49,6 49,1 48,6 48,1 47,6 47,1 46,6 46,1 45,6 45,1 + 20 50,0 49,5 49,0 48,5 48,0 47,5 47,0 46,5 46,0 45,5 + 19 50,4 49,9 49,4 48,9 48,4 47,9 47,4 46,9 46,4 45,9 + 18 50,7 50,2 49,8 49,3 48,8 48,3 47,8 47,3 46,8 46,3 + 17 51,1 50,6 50,1 49,6 49,2 48,7 48,2 47,7 47,2 46,7 + 16 51,5 51,0 50,5 50,0 49,5 49,0 48,6 48,0 47,6 46,1 + 15 51,9 51,4 50,9 50,4 49,9 49,4 48,9 48,4 47,9 47,4 + 14 52,2 51,8 51,3 50,8 50,3 49,8 49,3 48,8 48,3 47,8 + 13 52,6 52,1 51,6 51,2 50,7 50,2 49,7 49,2 48,7 48,2 + 12 53,0 52,5 52,0 51,5 51,0 50,6 50,1 49,6 49,1 48,6 + 11 53,4 52,9 52,4 51,9 51,4 50,9 50,4 50,0 49,5 49,0 + 10 53,7 53,2 52,8 52,3 51,8 51,3 50,8 50,3 49,8 49,4 + 9 54,1 53,6 53,1 52,6 52,2 51,7 51,2 50,7 50,2 49,7 + 8 54,5 54,0 53,5 53,0 52,5 52,0 51,6 51,1 50,6 50,4 + 7 54,8 54,3 53,9 53,4 52,9 52,4 51,9 51,4 51,0 50,5 + 6 55,2 54,7 54,2 53,7 53,2 52,8 52,3 51,8 51,3 50,8 + 5 55,5 55,0 54,6 54,1 53,6 53,4 52,7 52,2 51,7 51,2 + 4 55,9 55,4 54,9 54,5 54,0 53,5 53,0 52,6 52,1 51,6 + 3 56,2 55,8 55,3 54,8 54,3 53,9 53,4 52,9 52,4 52,0 + 2 56,6 56,1 55,6 55,2 54,4 54,2 53,8 53,3 52,8 52,3 + 1 57,0 56,4 56,0 55,5 55,0 54,6 54,1 53,6 53,2 52,7 + 0 57,3 56,8 56,4 55,9 55,4 54,9 54,5 54,0 53,5 53,0 43
  52. Thông số đo được trên cồn kế Nhiệt 45,0 44,5 44,0 43,5 43,0 42,5 42,0 41,5 41,0 40,5 độ oC Độ rượu tính theo thể tích ở nhiệt độ 20 oC + 30 41,4 40,6 40,1 39,5 39,0 38,5 38,0 37,5 37,0 36,5 + 29 41,5 41,0 40,4 39,9 39,4 38,9 38,4 37,9 37,4 36,9 + 28 41,9 41,4 40,8 40,3 39,8 39,3 38,8 38,3 37,8 37,3 + 27 42,3 41,8 41,2 40,7 40,2 39,7 39,2 38,7 38,2 37,7 + 26 42,7 42,2 41,6 41,4 40,6 40,1 39,6 39,1 38,6 38,1 + 25 43,0 42,5 42,0 41,5 41,0 40,5 40,0 39,5 39,0 38,5 + 24 43,4 42,9 42,4 41,9 41,4 40,9 40,4 39,9 39,4 38,9 + 23 43,8 43,3 42,8 42,3 41,8 41,3 40,8 40,3 39,8 39,2 + 22 44,2 43,7 43,2 42,7 42,2 41,7 41,2 40,7 40,2 39,7 + 21 44,6 44,4 43,6 43,1 42,6 42,4 41,6 41,4 40,6 40,1 + 20 45,0 44,5 44,0 43,5 43,0 42,5 42,0 41,5 41,0 40,5 + 19 45,4 44,9 44,4 43,9 43,4 42,9 42,4 41,9 41,4 40,9 + 18 45,8 45,3 44,8 44,3 43,8 43,3 42,8 42,3 41,8 41,3 + 17 46,2 45,7 45,2 44,7 44,2 43,7 43,2 42,7 42,2 41,7 + 16 46,6 46,1 45,6 45,1 44,6 44,4 43,6 43,1 42,6 42,1 + 15 47,0 46,4 46,0 45,5 45,0 44,5 44,0 43,5 43,0 42,5 + 14 47,3 46,8 46,4 45,8 45,4 44,9 44,4 43,9 43,4 42,9 + 13 47,7 47,2 46,7 46,2 45,8 45,3 44,8 44,3 43,8 43,3 + 12 48,1 47,6 47,1 46,6 46,1 45,6 45,2 44,7 44,2 43,7 + 11 48,5 48,0 47,5 47,0 46,5 46,0 45,6 45,1 44,6 44,1 + 10 48,9 48,4 47,9 47,4 46,9 46,4 46,0 45,5 45,0 44,5 + 9 49,2 48,8 48,3 47,8 47,3 46,8 46,3 45,8 45,4 44,9 + 8 49,6 49,1 48,6 48,2 47,7 47,2 46,7 46,2 45,8 45,3 + 7 50,0 49,5 49,0 48,5 48,1 47,6 47,1 46,6 46,2 45,7 + 6 50,4 49,9 49,4 48,9 48,4 48,0 47,5 47,0 46,5 46,0 + 5 50,8 50,3 49,8 49,3 48,8 48,3 47,9 47,4 46,9 46,4 + 4 51,1 50,6 50,2 49,7 49,2 48,7 48,2 47,8 47,3 46,8 + 3 51,5 50,7 50,5 50,0 49,6 49,1 48,6 48,1 47,6 47,2 + 2 51,8 51,4 50,9 50,4 49,9 49,5 49,0 48,5 48,0 47,6 + 1 52,2 51,7 51,3 50,8 50,3 49,8 49,4 48,9 48,4 47,9 + 0 52,6 52,1 51,6 51,4 50,7 50,2 49,7 49,3 48,8 48,3 44
  53. Phụ lục C: Sắc ký đồ của mẫu chuẩn acetaldehyde 100 mg/l qua 6 lần thử uV(x10,000) uV(x10,000) 3.5 Lần 1 3.0 Lần 2 3.0 2.5 2.5 2.0 2.0 1.5 1.5 1.0 1.0 0.5 0.5 0.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 min 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 min uV(x10,000) uV(x10,000) 3.5 3.5 3.0 Lần 3 3.0 Lần 4 2.5 2.5 2.0 2.0 1.5 1.5 1.0 1.0 0.5 0.5 0.0 0.0 -0.5 -0.5 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 min uV(x10,000) 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 min 3.5 Lần 6 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 min 45