Khóa luận Thành phần hóa học phân đoạn phân cực của cao acetone thô từ loài địa y parmotrema tsavoense

Nội dung text: Khóa luận Thành phần hóa học phân đoạn phân cực của cao acetone thô từ loài địa y parmotrema tsavoense

1. ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN PHÂN CỰC CỦA CAO ACETONE THÔ TỪ LOÀI ĐỊA Y PARMOTREMA TSAVOENSE GVHD: TS. DƯƠNG THÚC HUY SVTH: NGUYỄN NGỌC MẪN MSSV: K39.106.061 Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 3 tháng 5 năm 2017
2. Xác nhận của Hội đồng phản biện: KÍ TÊN VÀ DUYỆT (Kí và ghi rõ họ tên)
3. LỜI CẢM ƠN Trên thực tế để đạt được thành công, ngoài sự nổ lực, phấn đấu của bản thân, luôn luôn cần có sự giúp đỡ, hỗ trợ dù nhiều hay ít, dù trực tiếp hay gián tiếp của những người xung quanh. Để hoàn thành bài báo cáo khóa luận tốt nghiệp này, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè. Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Thầy Cô ở Khoa Hóa Học – Trường Đại học Sư Phạm TP.HCM đã cũng với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em trong suốt thời gian học tập tại trường. Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn Thầy TS. Dương Thúc Huy, người đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện đề tài, hơn nữa thầy còn là người giúp em có thêm niềm say mê nghiên cứu khoa học. Nếu không có sự hướng dẫn, giúp đỡ của Thầy thì bài báo cáo khó có thể hoàn thiện được. Một lần nữa xin chân thành cảm ơn Thầy. Ngoài ra, không thể không nhắc đến các anh chị khóa trên, các bạn sinh viên bộ môn hóa Hữu Cơ ở khoa Hóa học, những người đã động viên, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài. Và cuối cùng là lời cảm ơn gửi tới gia đình, những người thân, đã là chổ dựa vững chắc về tinh thần trong suốt quá trình học tập tại trường, cũng như trong quá trình thực hiện đề tài. Do bài báo cáo được thực hiện trong khoảng thời gian khá ngắn nên không thể tránh khỏi sự sai sót, em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của quý Thầy Cô để em có thêm kinh nghiệm ở các bài báo cáo sau được hoàn thiện hơn. Sau cùng, xin chúc quý Thầy Cô và các bạn thật dồi dào sức khỏe! i
4. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU Ac Acetone br Mũi dãn rộng (Broad) AcOH Acetic acid C Chloroform DMSO Dimethyl sulfoxide d Mũi đôi (Doublet) EA Ethyl acetate HMBC Tương quan 1H-13C qua 2, 3 nối (Heteronuclear Multiple Bond Coherence) HSQC Tương quan 1H-13C qua 1 nối (Heteronuclear Single Quantum Correlation) IC50 Nồng độ ức chế sự phát triển của 50% số tế bào thử nghiệm (Half Maximal Inhibitory Concentration) J Coupling constant (Hằng số tương tác spin-spin) m Mũi đa (Multiplet) MIC Nồng độ tối thiểu ức chế sự phát triển của tế bào (Minimum Inhibitory Concentration) NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) N.D Không xác định (Not determined) pTLC Sắc ký lớp mỏng điều chế (Preparative thin layer chromatography) s Mũi đơn (Singlet) SKC Sắc ký cột δ Chemical shift (Độ chuyển dịch hóa học) ii
5. DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Ba dạng chính của địa y Hình 1.2. Sinh tổng hợp của các hợp chất từ địa y Hình 1.3. Các hợp chất cô lập từ địa y thuộc chi Parmotrema Hình 2.1. Sơ đồ sắc ký cột trên cao acetone Hình 3.1. Cấu trúc hóa học và một số tương quan HMBC của T3 Hình 3.2. Cấu trúc hóa học và một số tương quan HMBC của N3 Hình 4.1. Cấu trúc của hai hợp chất đã cô lập DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao Bảng 1.2. Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme của virus của các hợp chất địa y Bảng 1.3. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y Bảng 1.4. Hoạt tính gây độc tế bào và kháng đột biến của các hợp chất địa y Bảng 1.5. Các loại enzyme bị ức chế bởi các hợp chất của địa y Bảng 3.1. So sánh số liệu phổ NMR của hợp chất parmosidone F, T3, parmosidone G và N3 DANH MỤC PHỤ LỤC Phụ lục 1. Phổ 1H và 13H-NMR của hợp chất T3 Phụ lục 2. Phổ HSQC và HMBC của hợp chất T3 Phụ lục 3. Phổ 1H và 13C -NMR của hợp chất N3 Phụ lục 4. Phổ HSQC và HMBC của hợp chất N3 iii
6. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU ii DANH MỤC HÌNH ẢNH iii DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC PHỤ LỤC iii MỤC LỤC iv LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Định nghĩa và phân loại địa y 2 1.2. Vai trò sinh thái của các hợp chất tự nhiên trong địa y 2 1.3. Nghiên cứu hoá học về các hợp chất trong địa y 3 1.4. Nghiên cứu hoá học của một số loài địa y thuộc chi Parmotrema 3 1.5. Nghiên cứu hóa trên loài địa y Parmotrema tsavoense 6 1.6. Hoạt tính của địa y và các hợp chất của địa y 9 1.6.1. Hoạt tính đối với động vật 10 1.6.2. Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao 10 1.6.3. Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme virus của các hợp chất địa y 11 1.6.4. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y 11 1.6.5. Hoạt tính gây độc tế bào và kháng đột biến của các hợp chất địa y 12 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 15 2.1. Máy móc, thiết bị, hóa chất 15 2.2. Thu hái và xử lý mẫu nguyên liệu, ly trích và cô lập các hợp chất 15 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 iv
7. 3.1. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất T3 17 3.2. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất N3 18 CHƯƠNG 4. KÊT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 21 4.1. KẾT LUẬN 21 4.2. ĐỀ XUẤT 21 TÀI LIỆU THAM KHẢO 22 PHỤ LỤC 25 v
8. LỜI MỞ ĐẦU Trong khoảng 20 năm trở lại đây, những nghiên cứu hóa học và sinh học về địa y trên thế giới trở nên phổ biến. Địa y là thực vật bậc thấp, là kết quả của sự cộng sinh của tảo và nấm. Địa y có thể sống được ở nhiều nơi trên đất, đá, thân cây, trong những điều kiện khắc nghiệt và khô hạn của vùng nhiệt đới. Ở Việt Nam, người ta dễ dàng tìm thấy sự có mặt của địa y ở những nơi quen thuộc với sự phân bố phong phú và đa dạng. Ngay từ thời trung đại, nhiều người làm nghề y đã sử dụng các loài địa y làm thuốc chữa bệnh. Y học cổ truyền Trung Quốc từng sử dụng 71 loài địa y của 17 chi (9 họ) với mục đích làm thuốc chữa bệnh. Địa y thuộc họ Parmeliaceae, Usneaceae, Cladionaceae được sử dụng nhiều hơn hết. Một vài loại cao điều chế từ địa y được sử dụng để trị các bệnh khác nhau như Lobaria pulmonaria chữa các bệnh về phổi, Xanthoria parientina chữa bệnh vàng da, chi Usnea để dưỡng tóc, Cetraria islandica (được gọi Ireland moss) chữa nhiễm khuẩn và tiêu chảy. Ngoài công dụng chữa bệnh, địa y còn được sử dụng làm thực phẩm, mỹ phẩm, xà phòng, nước hoa. Theo các tác giả Boustie et al. (2005)[1], Muller et al. (2001)[22], Huneck et al. (1999)[17], từ xưa cho đến nay có khoảng gần 1.000 hợp chất địa y đã được cô lập và thử nghiệm các hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa, kháng ung thư, kháng viêm, kháng enzyme Xuất phát từ những ứng dụng y học quý giá và kế thừa những nghiên cứu đã có về chi Parmotrema trong nước cũng như nghiên cứu hóa học trên loài địa y Parmotrema tsavoense (Huynh BLC, Duong et al)[4], chúng tôi tiếp tục nghiên cứu trên loài địa y Parmotrema tsavoense (Krog & Swincow) Krog & Swincow nhằm cô lập các hợp các hợp chất phenolic có nhiều hoạt tính sinh học. 1
9. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Định nghĩa và phân loại địa y Địa y là một dạng thực vật bậc thấp, đặc biệt, là kết quả cộng sinh của nấm (mycobiont) và một thành phần quang hợp (photobiont) thường là tảo (green alga) hay vi khuẩn lam (cyanobacterium). Hiện nay có khoảng 17.000 loài địa y đã được tìm thấy. Thông thường địa y chia làm 3 dạng (Choi et al., 2008)[30]: Xanthoria sp., Xanthoparmelia cf. lavicola, Hypogymnia cf. tubulosa, (Crustose lichen) (Foliose lichen) (Fructicose lichens) Hình 1.1. Ba dạng chính của địa y Thành phần tảo của địa y sản sinh các carbohydrate bằng quá trình quang hợp, còn thành phần nấm sản sinh các hợp chất tự nhiên (để chống tia UV, ngăn chặn sâu bọ và các loài động vật ăn cỏ, ), cung cấp nước và khoáng chất. Kết quả từ sự cộng sinh này giúp địa y có thể sinh trưởng và sống sót trong những điều kiện khắc nghiệt, chủ yếu ở vùng vĩ độ cao, vùng nhiệt đới, và có thể hiện diện ở khắp mọi nơi như trên đá, đất, lá cây, thân cây, kim loại, thủy tinh (Choi et al., 2008)[30]. Ðể hiểu được bản chất của địa y và giải thích nguồn gốc của chúng, các nhà thực vật học đã thử tổng hợp địa y từ tế bào tảo và nấm. Mặc dù cả hai thành phần được nuôi cấy riêng rẽ nhưng việc tổ hợp lại thành địa y thật sự khó khăn. 1.2. Vai trò sinh thái của các hợp chất tự nhiên trong địa y Bảo vệ đối với cây trồng bậc thấp và bậc cao. Các hợp chất thơm hấp thụ tia UV, bảo vệ địa y chống lại bức xạ có hại. Các carboxylic acid từ địa y là tác chất tạo phức mạnh và giúp cho địa y lấy được các khoáng chất từ vật chủ nơi địa y bám vào (substrate) (Choi et al., 2008)[30]. 2
10. Giúp xua đuổi thú ăn thịt và côn trùng. 1.3. Nghiên cứu hoá học về các hợp chất trong địa y Có nhiều hệ thống phân loại các hợp chất hóa học từ địa y, trong đó được sử dụng nhiều nhất là hệ thống phân loại do Shibata et al. đề nghị (Huneck 1997)[12]: Các hợp chất hóa học trong địa y được chia làm ba nhóm chính dựa theo nguồn gốc sinh tổng hợp của chúng (Hình 1.2). Nguồn gốc acid shikimic: terphenylquinone và dẫn xuất của acid tetronic. Nguồn gốc acid mevalonic: triterpenoid. Nguồn gốc acetate-malonate: các acid dây dài và các acid phenol Tảo Nấm Hình 1.2. Sinh tổng hợp của các hợp chất từ địa y 1.4. Nghiên cứu hoá học của một số loài địa y thuộc chi Parmotrema  Parmotrema praesorediosum (+)-Praesorediosic acid (1), (+)-protopraesorediosic acid (2), atranorin (11) và chloroatranorin (12) được cô lập bởi David F. et al. (1990)[6]. Lecanoric acid (14) và [29] stictic acid (18) được cô lập bởi Ramesh P. et al. (1994) . Huynh B. L. Chi et al. đã cô lập được prasoether A (42), zeorin (46), và 1β,3β- diacetoxyhopan-29-oic acid (57) (2011)[7]. 3
11.  Parmotrema sancti-angelii Atranorin (11), lecanoric acid (14) và α-collatolic acid (25) được cô lập bởi Neeraj V. et al. (2011)[29]. Hà Xuân Phong (2012)[10] đã cô lập được 10 hợp chất từ loài địa y Parmotrema sancti-angelii: 8-(2,4-dihydroxy-6-(2-oxoheptyl)phenoxy)-6-hydroxy-3-pentyl-1H- isochromen-1-one (41), gyrophoric acid (13), lecanoric acid (14), orsellinic acid (4), methyl orsellinate (5), methyl β-orsellinate (8), methyl haematomate (9) và ba hợp chất bicyclo mới Sancti A-C (43-45).  Parmotrema conformatum Protocetraric acid (21), malonprotocetraric acid (23) và (+)-(12R)-usnic acid (40) được cô lập bởi Keogh M. F. (1977)[17].  Parmotrema dilatum Depside atranorin (11), các depsidone salazinic acid (16), norstictic acid (19), hypostictic acid (20) và protocetraric acid (21) được cô lập từ Parmotrema dilatum bởi Honda N. K. et al. (2010)[11].  Pamotrema lichexanthonicum Depside atranorin (11), depsidone salazinic acid (16) và xanthone lichexanthone (40) được cô lập từ cao chloroform của loài địa y Pamotrema lichexanthonicum bởi Micheletti A. C. et al. (2009)[21].  Parmotrema mellissii Methyl orsellinate (5), ethyl orsellinate (6), n-butyl orsellinate (7), methyl β- orsellinate (8), methyl haematommate (9), ethyl chlorohaematommate (10), atranorin (11), chloroatranorin (12), α-alectoronic acid (24), α-collatolic acid (25), 2′′′-O-methyl-α- alectoronic acid (26), 2′′′-O-ethyl-α-alectoronic acid (27), dehydroalectoronic acid (28), dehydrocollatolic acid (29), parmosidone A (30), parmosidone B (31), parmosidone C (32), isocoumarin A (33), isocoumarin B (34), β-alectoronic acid (36), 2′′′-O-methyl-β- alectoronic acid (37), 2′′′-O-ethyl-β-alectoronic acid (38), (+)-(12R)-usnic acid (39) và skyrin (41) được cô lập từ loài địa y Parmotrema mellissii thu hái ở thành phố Đà Lạt bởi Lê Hoàng Duy (2012)[20].  Parmotrema nilgherrense 4
12. α-Alectoronic acid (24), α-collatolic acid (25) và dehydrocollatolic acid (29) được cô lập bởi Kharel M. K. et al. (2000)[18]. Depside atranorin (11) được cô lập bởi Neeraj V. et al. (2011)[24].  Parmotrema planatilobatum Năm 2011, Dương T. Huy et al. đã cô lập được 7 hợp chất gồm có methyl β- orsellinate (8), methyl orsellinate (5), orsellinic acid (4), methyl haematommate (9), atranorin (11), lecanoric acid (14), (+)-(12R)-usnic acid (39)[7]. Năm 2012, orcinol (3), gyrophoric acid (13), protocetraric acid (21), 9’-O- methylprotocetraric acid (22), 2-[3-(2,6-dihydroxy-4-methylbenzyl)-2,4-dihydroxy-6- methylphenoxy]-3-formyl-4-hydroxy-6-methylbenzoate (35), được cô lập bởi Dương T. Huy et al.[8]  Parmotrema reticulatum Atranorin (11), chloroatranorin (12), salazinic acid (16) và consalazinic acid (17) được cô lập từ cao acetone bởi Fazio A. T. et al. (2009)[9].  Parmotrema saccatilobum Atranorin (11) và chloroatranorin (12) được cô lập từ cao n-hexane của loài địa y Parmotrema saccatilobum bởi Bugni T. S. et al. (2009)[5].  Parmotrema stuppeum Orsellinic acid (4), methyl orsellinate (5), atranorin (11) và lecanoric acid (14) được cô lập bởi Jayaprakasha G. K. et al. (2000)[16].  Parmotrema subisidiosum Depside atranorin (11) và hai depsidone salazinic acid (16) và consalazinic acid (17) được cô lập từ cao acetone bởi O’Donovan D. G. et al. (1980)[25].  Parmotrema tinctorum Isolecanoric acid (15) được cô lập bởi Sakurai A. et al. (1987)[26]. Ethyl orsellinate (6) được cô lập bởi Santos L. C. et al. (2004)[28]. Atranorin (11) và lecanoric acid (14) được cô lập bởi Honda N. K. et al. (2013)[3]. 5
13. 1.5. Nghiên cứu hóa trên loài địa y Parmotrema tsavoense Các acid béo Hợp chất phenolic đơn vòng Hình 2.3. Các hợp chất cô lập từ địa y thuộc chi Parmotrema 6
14. Depside Depsidone Hình 2.3. Các hợp chất cô lập từ địa y thuộc chi Parmotrema (tiếp) 7
15. Diphenylethers Hình 2.3. Các hợp chất cô lập từ địa y thuộc chi Parmotrema (tiếp) 8
16. Hình 2.3. Các hợp chất cô lập từ địa y thuộc chi Parmotrema (tiếp) 1.6. Hoạt tính của địa y và các hợp chất của địa y Địa y sản sinh ra một lượng lớn các hợp chất hữu cơ, đa số có hoạt tính sinh học và nhiều loại trong chúng là đặc hiệu của địa y trong hoá học các hợp chất tự nhiên. Tuy vậy, các khảo sát hoá học trên địa y bị hạn chế do nguồn cung có hạn, vì các địa y phát triển rất chậm. Những nghiên cứu gần đây cho thấy việc nuôi cấy địa y trong phòng thí nghiệm cũng không dễ dàng, chỉ khoảng 10% địa y được nuôi cấy thành công, tuy nhiên chúng lại chứa các hợp chất hữu cơ khác hẳn với các hợp chất có trong cùng loại địa y tự nhiên. Lê Hoàng Duy (2012)[19] đã nghiên cứu nuôi cấy thành công 10% trên khoảng 50 loài địa y lấy từ Việt Nam. Tuy đạt thành công về mặt cô lập hợp chất mới nhưng hầu như các hợp chất cô lập từ địa y nuôi cấy đều khác so với các hợp chất địa y tự nhiên. Khoảng gần 1.000 hợp chất địa y đã được cô lập cho đến nay. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học và khả năng dược học của các hợp chất tự nhiên từ địa y được thống kê đầy 9
17. đủ của Boustie (2010)[2], Huneck (1999)[13], Muller (2001)[22] về kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa, kháng ung thư, kháng viêm, kháng enzyme 1.6.1. Hoạt tính đối với động vật Caperatic acid và các cao chiết xuất từ địa y Flavoparmelia baltimorensis và Xanthoparmelia cumberlvàia kìm hãm sự tăng trưởng của loài ốc Pallifera varia. Các hợp chất phenol đơn vòng gây độc ấu trùng của loài giun Toxocara canis. Atranorin, pulvinic acid dilactone, calycin, parietin, evernic acid, psoromic acid, physodic acid, 3-hydroxyphysodic acid, fumarprotocetraric acid, stictic acid, norstictic acid, salazinic acid, vulpinic acid, rhizocarpic acid và usnic acid làm giảm sự tăng trưởng của ấu trùng ăn tạp Spodoptera littoralis nhưng không ảnh hưởng đến sự sống còn của chúng. 1.6.2. Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao Một số hợp chất từ địa y thể hiện hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao như sau Bảng 1.1. Bảng 1.1. Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao Địa y hoặc các hợp chất của địa y Hoạt tính Acid barbatic, acid 4-O- Ức chế sự tăng trưởng của cây rau diếp demethylbarbatic, acid diffractaic, acid evernic, acid lecanoric, acid β- orcinolcarboxylic, acid orsellinic Ergochrome AA (acid secalonic A) Gây độc cho thực vật Acid evernic Giảm các nồng độ chất diệp lục trong lá rau bina Acid lecanoric Nguyên nhân gây bất thường cho gốc của cây Allium cepa Các hợp chất phenol đơn vòng Hoạt tính ức chế của độc chất thực vật Các quinone từ Pyxine spp Ức chế sự nguyên phân của rễ cây Allium cepa Acid usnic Ức chế sự nảy mầm và phát triển của Lepidium sativum 10
18. 1.6.3. Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme virus của các hợp chất địa y Anthraquinone như emodin và các chất tương tự có hoạt tính kháng virus. Hypericin có hoạt tính đáng kể chống lại sự sao chép ngược của virus HIV (antiretroviral). Các hợp chất 7,7’-dichlorohypericin cũng như 5,7-dichloroemodin có hoạt tính mạnh đối với virus HSV-1 (virus bệnh sinh dục herpes đơn dạng loại 1) trong khi các anthraquinone thế monochloro có hoạt tính giảm hơn. Hoạt tính dường như tăng theo số lượng nguyên tử Cl trong cấu trúc (Muller 2001)[22]. Depside và depsidone có hoạt tính ức chế sự sao chép của virus HIV (do enzyme gọi là intergrase) (Boustie 2005) [1]. Neamati et al. đề nghị hoạt tính này xuất phát từ đặc điểm cấu trúc vòng 11H-dibenzo[b,e][1,4]dioxepin-11-one của depsidone. Depside có hoạt tính khá yếu trong khi những β-depsidone như virensic acid, granulatine, stictic acid và chloroparellic acid cùng cho những khả năng tương đương, cụ thể với giá trị IC50 khoảng 3 µM. Các β-depsidone khác như physodic acid, norlobaric acid, salarinic acid và parellic acid cũng có hoạt tính với giá trị IC50 khoảng vài µM. Acid béo loại γ-butyrolactone cũng có hoạt tính kháng virus như protolichesterinic ức chế sự [22] nhân bản DNA của virus HIV với giá trị IC50 khoảng 24 µM (Bảng 1.2) (Muller 2001) . 1.6.4. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y Các hợp chất từ địa y cũng là những hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả. Protolichesterinic acid được thử nghiệm in vitro kháng khuẩn Helicobacter pylori (acid này là thành phần trong thuốc cổ truyền giảm đau dạ dày với tên Iceland moss) (Muller 2001)[22]. Một số lượng lớn các hợp chât địa y kiềm hãm sự phát triển của vi khuẩn hay nấm như alectosarmentin, pannarin và chloropannarin, emodin và physcion, evernic acid, leprapinic acid và dẫn xuất, các hợp chất phenol đơn vòng, puvinic acid và dẫn xuất, usnic acid và dẫn xuất (Bảng 1.3) (Muller 2001)[22]. Khả năng kháng nấm của các hợp chất địa y cũng được đánh giá dựa trên giá trị MIC, thí dụ như các hợp chất parietin, fallacinal, emodin (Boustie 2010) [2]. Trong các hợp chất địa y, usnic acid và dẫn xuất của nó cho thấy hoạt tính kháng khuẩn cực kì mạnh trên khá nhiều dòng vi khuẩn. 11
19. Bảng 1.2. Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme của virus của các hợp chất địa y Hợp chất Virus và enzyme của virus Depsidone: virensic acid và dẫn xuất Hệ enzyme đặc hiệu đính thể nguyên thực tương tự khuẩn vào nhiễm sắc thể virus HIV. Butyrolactone acid: protolichesterinic Nhân bản của HIV acid (+)-Usnic acid và 4 depside khác Virus Epstein-Barr (EBV) Emodin, 7-cloroemodin, 7-chloro-1-O- methylemodin, 5,7-dichloroemodin, HIV, cytomegalovirus và các virus khác hypericin 1.6.5. Hoạt tính gây độc tế bào và kháng đột biến của các hợp chất địa y Hợp chất từ địa y có khả năng gây độc tế bào mạnh là usnic acid. Thử nghiệm kháng u (antitumour) của usnic acid được khám phá cách đây 3 thập niên, được thử nghiệm lần đầu đối với hệ thống thử nghiệm ung thư phổi Lewis bởi Kupchan và Kopperman (1975)[27]. Những nghiên cứu về mối liên hệ hoạt tính cấu trúc cũng được khảo sát và kết quả đã chỉ ra rằng tính thân dầu (lipophilicity) có ảnh hưởng quan trọng đối với khả năng gây độc tế bào. Hai liên kết hydrogen nội phân tử trong cấu trúc của usnic acid đã làm tăng tính thân dầu tự nhiên của nó. Depside và depsidone cũng thể hiện độc tính tế bào tương đối. Depsidone lobaric acid và depside baeomyceic acid cùng có khả năng ức chế sự phát triển của 14 dòng tế [2] bào ung thư với giá trị IC50 trong khoảng 12-65 µg/mL (Boustie 2010) . Depsidone pannarin và depside sphaerophin cũng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư tuyến tiền liệt DU-145 và tế bào ung thư da M14 với IC50 trong khoảng 25-30 µg/mL (Bảng 1.4) (Boustie 2010) [2]. Ngoài ra, một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme trình bày trong bảng 1.5. 12
20. Bảng 1.3. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y Hợp chất Vi khuẩn Vi khuẩn gram (+), Bacteroides spp., Clostridium perfringens, Bacillus subtilis, Staphylococcus Usnic acid và các dẫn xuất aureus, Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Mycobacterium aurum Protolichesterinic acid Helicobacter pylori Epidermophyton floccosum, Microsporum canis, Methyl orsellinate, M. gypseum, Trichophyton rubrum, T. ethyl orsellinate, mentagrophytes, Verticillium achliae, Bacillus methyl β-orsellinate, subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas methyl haematommate aeruginosa, Escherichia coli, Cvàida albicans Staphylococcus aureus, Mycobacterium Alectosarmentin smegmatitis 1´-Chloropannarin, pannarin Leishmania spp Emodin, physcion Bacillus brevis Drechslera rostrata, Alternaria alternata Pulvinic acid và dẫn xuất Vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn kỵ khí Leprapinic acid và dẫn xuất Vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) Bảng 1.4. Hoạt tính gây độc tế bào và kháng đột biến của các hợp chất địa y Hợp chất Hoạt tính trên loại tế bào (-)-Usnic acid Kháng ung thư phổi Lewis, ung thư bạch cầu P388, ức chế phân bào, có hoạt tính chống lại tế bào sừng hóa HaCat Protolichesterinic acid Có hoạt tính chống lại tế bào ung thư bạch cầu K- 562 và khối u rắn Ehrlich Pannarin, 1-chloropannarin, Gây độc cho quá trình tái tạo các lympho bào sphaerophorin Naphthazarin Có hoạt tính chống lại dòng tế bào sừng hóa 13
21. Scabrosin ester và dẫn xuất, Gây độc chống lại tế bào murine P815 euplectin mastocytoma và các dòng tế bào khác Hydrocarpone, salazinic acid, stitic Có hoạt tính với sự nhân bản của tế bào gan chuột acid Psoromic acid, chrysophanol, Có hoạt tính chống lại tế bào ung thư bạch cầu emodin và dẫn xuất Bảng 1.5. Các loại enzyme bị ức chế bởi các hợp chất của địa y Hợp chất của địa y Enzyme bị ức chế Atranorin Trypsin, Pankreaselastase, Phosphorylase Baeomycesis acid 5-Lipoxygenase Bis-(2,4-dihydroxy-6-n- propylphenyl)methane, divarinol, cao chiết từ Cetraria juniperina, Tyrosinase Hypogymnia physodes và Letharia vulpina Chrysophanol Glutathione reductase Confluentic acid, 2β-O- Monoaminoxidase B Methylperlatolic acid 4-O-Methylcryptochlorophaeic acid Prostataglvàinsynthetase (+)-Protolichesterinic acid 5-Lipoxygenase (Sao chép ngược HIV) Vulpinic acid Phosphorylase Norsolorinic acid Monoamino oxidase Physodic acid Arginine decarboxylase Usnic acid Ornithine decarboxylase 14
22. CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Máy móc, thiết bị, hóa chất Phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC được ghi bằng máy Bruker Avance 500 tại Phòng Phân tích trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM (phổ 1H-NMR được đo ở tần số 500MHz và phổ 13C-NMR được đo ở tần số 125 MHz). Dung môi sử dụng được cung cấp bởi hãng Chemsol (Việt Nam). Sắc kí cột pha thuận sử dụng silica gel kích thước hạt (0.040–0.063 mm, Merck). Sắc kí lớp mỏng sử dụng bản mỏng 20 cm x20 cm phủ silica gel 60 F254 (Merck). 2.2. Thu hái và xử lý mẫu nguyên liệu, ly trích và cô lập các hợp chất Loài địa y Parmotrema tsavoense (Krog & Swinscow) Krog & Swinscow thu hái trên đá trên núi Tà Cú, tỉnh Bình Thuận (tháng 8/2012-12/2012). Tên khoa học được xác định bởi tiến sĩ Wetchasart Polyiam, Tổ nghiên cứu địa y, Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa học, Đại học Ramkhamhaeng, Bangkok, Thái Lan. Mẫu ký hiệu số US-B027 và được lưu trong quyển tiêu bản thực vật tại bộ môn Hoá hữu cơ, Khoa Hoá, Đại học Khoa học Tự nhiên. Bột khô địa y nghiền nhỏ (1,350 g) được ngâm dầm trong methanol và dịch chiết được cô quay dưới áp suất thấp. Trong quá trình methanol bay hơi, tủa trắng P (30.3g) xuất hiện dần và được lọc riêng. Phần dung dịch lọc còn lại được tiếp tục cô quay thu được cao methanol thô (249.8 g). Phần cao methanol thô đã được tiến hành nghiên cứu bởi Duong TH (2015)[14]. Phần bột địa y khô còn lại tiếp tục được ngâm dầm trong acetone thu được cao acetone thô AC (8.54 g). Tiến hành sắc kí cột silica gel pha thường trên cao acetone, giải ly với hệ dung môi n-hexane: ethyl acetate: acetone: acetic acid (20:10:10:0.1) để thu được 10 phân đoạn AC0 (341.6 mg), AC1 (1.2 g), AC2 (1.3 g), AC3 (209.0 mg), AC4 (264.9 mg), AC5 (1.31 g), AC6 (476.3 mg), AC7 (971.1 mg), AC8 (1.2 g) và AC9 (1.1 g). Phân đoạn AC1 (341.6 mg) thực hiện sắc kí lớp mỏng điều chế, giải ly với hệ dung môi n-hexane: chloroform: ethyl acetate: acetone: acetic acid (5:1:2:2:0.1) thu được hợp chất N3 (3.2 mg). 15
23. Phân đoạn AC5 (1.31 g) được thực hiện sắc ký cột, giải ly với hệ dung môi n- hexane: ethyl acetate: acetone: acid acetic (30:5:1:1) để thu được 8 phân đoạn AC5.1- AC5.8. Từ Phân đoạn AC5.5 (78.4 mg) thực hiện sắc kí lớp mỏng điều chế, giải ly với hệ dung môi chloroform: ethyl acetate: acetone: acetic acid (10:4:2.4:0.8) thu được hợp chất T3 (3.0 mg). Bột khô của cây địa y Parmotrema tsavoense (1350.0g) Ngâm dầm với methanol Tủa P (30.3g) Cao methanol thô (249.8g) Bột khô còn lại (249.8g) Ngâm dầm với acetone Cao aceton (8.54 g) SKC H:EA:Ac:AcOH 20:10:10:0.1 AC1 AC1 AC2 AC3 AC4 AC5 AC6 AC7 AC8 AC9 AC10 (341.6 mg) (1.2 mg) (1.3 g) (209 mg) (204.9 mg) (1.31 g) (476.3 mg) (971.1 mg) (1.2 g) (1.31 g) (1.1 g) SKC H:EA:Ac:AcOH 30:5:1:1 AC5.1 AC5.2 AC5.3 AC5.4 AC5.5 AC5.6 AC5.7 AC5.8 (78.4mg) pTLC pTLC H:C:EA:Ac:AcOH 5:1:2:2:0.1 C:EA:Ac:AcOH 12:5:1:1 N3 (3.2 mg) T3 (3.0 mg) Sơ đồ quy trình ly trích và cô lập các hợp chất trên cao acetone thô 16
24. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất T3 Hợp chất T3 thu được từ phân đoạn cao acetone của loài địa y Parmotrema tsavoense là chất bột, màu trắng đục. Phổ 1H và 13C-NMR (phụ lục 1). Phổ HSQC và HMBC (phụ lục 2).  Biện luận cấu trúc phổ Phổ 1H-NMR ở vùng từ trường yếu cho thấy sự hiện diện hai tín hiệu proton của nhóm olefin mũi đôi tại δH 8.14 (1H, d, J=16) và δH 7.38 (1H, d, J=16) ghép đôi với nhau với hằng số ghép J=16.0 Hz giúp xác định cấu hình trans của chúng. Ngoài ra phổ còn cho thấy tín hiệu của một proton vòng thơm mũi đơn tại δH 6.83 (1H, s), một nhóm methylene –CH2-O- mũi đơn ở δH 4.48 (2H, s), một tín hiệu của nhóm methyl gắn với nhóm carbonyl δH 2.64 (3H, s) và hai tín hiệu của nhóm methyl gắn với vòng thơm tại δH 2.29 (3H, s) và δH 2.25 (3H, s). Phổ 13C-NMR cho thấy hợp chất T3 cho thấy sự hiện diện của một nhóm carbonyl (δC 195.0), một nhóm carboxyl (δC 171.0), hai carbon olefin (δC 132.0 và 132.4), một nhóm methylene (δC 53.2), ba nhóm methyl (δC 15.3, 21.1, 28.8) và các carbon tứ cấp khác. Bên cạnh đó, phân tích độ dịch chuyển hóa học của hai proton nhóm olefin mũi đôi tại δH 8.14 và δH 7.38, chứng tỏ chúng phải có sự cộng hưởng với nhóm C=O lân cận (–CH=CH-C(O)-). So sánh dữ liệu phổ của hợp chất T3 với parmosidone F đã cô lập trước đó[23], nhận thấy hợp chất T3 có sự tương đồng trên nhân thơm A nhưng có sự khác biệt tại các nhóm thế trên nhân thơm B. Điều này được thể hiện trên bảng so sánh số liệu phổ NMR (Bảng 3.1). Tương tự, so sánh dữ liệu phổ của hợp chất T3 với parmosidone A đã cô lập trước đó[14], nhận thấy dữ liệu phổ của hợp chất T3 có sự tương đồng trên nhân thơm B nhưng có sự khác biệt tại nhóm thế trên C-3 của nhân thơm A. Điều này được thể hiện trên bảng so sánh số liệu phổ NMR (Bảng 3.1). 17
25. Trên phổ HMBC, nhận thấy trên nhân thơm B, nhóm methyl CH3-9’ tương quan với các carbon tại δC 115.8 (C-1’), 132.1 (C-5’), 140.0 (C-6’). Proton H-8’ tương quan với các carbon tại δC 162.3 (C-2’), 117.5 (C-3’), 143.5 (C-4’). Từ đó giúp xác định giúp xác định cấu trúc nhân thơm B của hợp chất T3. Trên nhân thơm A, proton H-8 tương quan với các carbon tại δC 163.5 (C-4) và 195.0 (C-11), proton H-12 tương quan với carbon tại δ 195.0 (C-11) trên phổ HMBC giúp xác định sự liên kết của dây hydrocarbon tại C-3. Từ tất cả dữ liệu trên, cấu trúc của hợp chất T3 được xác định như hình 3.1. Đây là một hợp chất mới, được đặt tên là parmosidone G. Hình 3.1. Cấu trúc hóa học và một số tương quan HMBC của T3 3.2. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất N3 Hợp chất N3 thu được từ phân đoạn cao acetone của loài địa y Parmotrema tsavoense là chất bột vô định hình, màu trắng. Phổ 1H và 13C-NMR (phụ lục 3). Phổ HSQC và HMBC (phụ lục 4). 18
26. Bảng 3.1. So sánh số liệu phổ NMR của hợp chất parmosidone F, T3, parmosidone G và N3 Parmosidone F T3 Parmosidone A N3 N δH, J (Hz) δC δH, J (Hz) δC δH, J (Hz) δC δH, J (Hz) δC 1 115.5 117.8 112.5 103.3 2 161.3 N.D 161.9 165.0 3 111.3 111.4 111.6 107.5 4 161.6 163.5 164.1 161.0 5 6.76 (s) 115.9 6.38 (s) 116.3 6.54 (s) 116.7 6.45 (s) 111.6 6 145.4 143.5 151.9 142.1 7 161.8 N.D 166.2 172.2 8 8.01 (d) 132.9 8.14 (d, 16) 132.4 10.61 (s) 192.2 7.94 (d, 16.5) 133.5 9 2.35 (s) 20.7 2.29 (s) 21.1 2.41 (s) 21.4 2.48 (s) 23.6 10 7.13 (d) 131.1 7.38 (d, 16) 132.0 - 7.22 (d, 16.5) 129.3 11 198.4 195.0 - 197.9 12 2.33 (s) 27.7 2.25 (s) 28.8 - 2.27 (s) 28.3 1 112.0 115.8 115.6 2 155.2 162.3 162.2 3 116.0 117.5 117.5 4 145.9 143.5 143.8 5 142.5 132.1 131.6 6 130.7 140.0 139.6 7 170.5 171.0 170.6 8 4.49 (s) 62.2 4.48 (s) 53.2 4.49 (s) 52.5 9 2.44 (s) 15.5 2.64 (s) 15.3 2.62 (s) 14.2 Ba hợp chất parmosidone F, T3 và parmosidone A được đo trong cùng dung môi DMSO-d6, hợp chất N3 được đo trong dung môi acetone-d6. 19
27.  Biện luận cấu trúc phổ 1 13 Phổ H và C NMR cho thấy sự hiện diện của một carbon methine thơm (δH 6.45, δC 111.6), hai carbon olefine (δH 7.94, δC 133.5 C-8; δH 7.22, δC 129.3 C-10), hai nhóm methyl (δH 2.48, δC 23.6, C-9; δH 2.40, δC 28.3, C-12), một nhóm methoxy (δH 3.96, δC 51.8), hai nhóm carbonyl (δC 172.2, 197.9), và năm carbon tứ cấp khác. Hai tín hiệu proton olefine H-8 và H-10 ghép nhau với hằng số ghép J=16, chứng tỏ chúng ghép trans với nhau, đồng thời phân tích độ chuyển dịch hóa học của chúng, nhận thấy chúng có cộng hưởng với nhóm carbonyl kế cận. So sánh dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất N3 và T3, nhận thấy hợp chất N3 có sự tương đồng trên nhân thơm A, đồng thời các tín hiệu trên nhân thơm B bị mất đi, giúp xác định N3 là hợp chất đơn vòng có cấu trúc tương tự với nhân thơm A của hợp chất T3 (Bảng 3.1). Ngoài ra, trên phổ HMBC, nhận thấy có các tương quan của proton H-8 với C-2 (δC 165.0) và C-4 (δC 161.0), proton H-10 cho tương quan với C-3 (δC 107.5) trong khi, proton H-5 cho tương quan tới C-3 và C-4 giúp xác định sự liên kết của dây hydrocarbon tại C-3. Độ dịch chuyển hóa của của nhóm hydroxyl kiềm nối được xác định tại C-2 dựa trên tương quan HMBC của 2-OH tới C-1 và C-2. Proton 7-OCH3 cho tương quan với C-7 (δC 172.2), giúp xác định cấu trúc nhóm ester. Các tương quan HMBC khác giúp xác định cấu trúc đầy đủ của N3. Từ những dữ kiện trên, hợp chất N3 được xác định là methyl (E)-2,4-dihydroxy-6- methyl-3-(3-oxobut-1-en-1-yl)benzoate. Hình 3.2. Cấu trúc hóa học và một số tương quan HMBC của N3 20
28. CHƯƠNG 4. KÊT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1. KẾT LUẬN Từ mẫu địa y Parmotrema tsavoense (Krog & Swinscow) Krog & Swinscow thu hái trên đá trên núi Tà Cú, tỉnh Bình Thuận đã cô lập được hai hợp chất T3 và N3. Bằng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo xác định được cấu trúc của hai hợp chất hữu cơ gồm parmosidone G (T3) và methyl (E)-2,4- dihydroxy-6-methyl-3-(3-oxobut-1-en-1-yl)benzoate (N3) (Hình 4.1). Đây là hai hợp chất lần đầu được tìm thấy. Parmosidone G Methyl (E)-2,4-dihydroxy-6-methyl-3-(3-oxobut-1-en-1-yl)benzoate Hình 4.1. Cấu trúc hai hợp chất đã cô lập 4.2. ĐỀ XUẤT Vì điều kiện về thời gian và vật chất không cho phép, nên trong phạm vi của đề tài này, chúng tôi chỉ khảo sát trên phân đoạn trên cao acetone. Trong thời gian sắp tới, nếu có điều kiện chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát trên các phân đoạn cao còn lại. Đồng thời chúng tôi sẽ tiến hành thử nghiệm một số hoạt tính sinh học ở các loại cao và hợp chất đã cô lập được. 21
29. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Boustie J., Grube M. (2005), “Lichens - a promising source of bioactive secondary metabolites”, Plant Genetic Resources, 3, 273–287. [2] Boustie J., Tomashi S., Grube M. (2010), “Bioactive lichen metabolites: alpine habitats as an untapped source”, Phytochemistry Review, 10(3), 287-307. [3] Brandão L. F. G., Alcantara G. B., Matos M. de F. C., Bogo D., Freitas D. dos S., Oyama N. M., Honda N. K. (2013), “Cytotoxic evaluation of phenolic compounds from lichens against melanoma cells”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 61(2), 176–183. [4] Bui Thi Lan Anh, Duong Thuc Huy (2015), Chemical constituents of the lichen Parmotrema tsavoense (Krog & Swincow) Krog & Swincow, Tạp chí Khoa học-Trường Đại học Sư phạm Tp. Hồ Chí Minh, 78, 119 125. [5] Bugni T. S., Cynthia D. A., Ann R. P., Prem Rai, Chris M. I., Louis R. B. (2009), “Biologically active components of a Papua New Guinea analgesic and anti-inflammatory lichen preparation”, Fitoterapia, 80 (5), 270-273. [6] David F., Elix J. A., Binsamsudin M. W. (1990), “Two new aliphatic acids from the lichen Parmotrema praesorediosum (Nyl.) Hale”, Australian Journal of Chemistry, 43, 1297–1300. [7] Duong Thuc Huy, Huynh Bui Linh Chi, Ha Xuan Phong, Ton That Quang, Nguyen Kim Phi Phung (2011), “Some phenolic compounds of the lichen Parmotrema planatilobatum (Hale) Hale (Parmeliaceae)”, Journal of Science and Technology Development, 14(6), 5–10. [8] Duong Thuc Huy, Huynh Bui Linh Chi, Ha Xuan Phong, Tuong Lam Truong, Ton That Quang, Joel Boustie, Nguyen Kim Phi Phung (2012), “New diphenyl ether from lichen Parmotrema planatilobatum (Hale) Hale (Parmeliaceae)”, Vietnamese Journal of Chemistry, 50(4A), 199-202. [9] Fazio A. T., María D. B., Mónica T. A., Laura B. R., María L. R., Lucia M., Armin H., Elfie Stocker W., Marta S. M. (2009), “Culture studies on the mycobiont isolated from Parmotrema reticulatum (Taylor) Choisy: metabolite production under different conditions”, Mycol Progress, 8, 359-365. 22
30. [10] Ha Xuan Phong (2012), Chemical constituents of lichen Parmotrema sancti- angelii collected in Vienam, A thesis for Master of Science, University of Science, National University-Ho Chi Minh City. [11] Honda N. K., Pavan F. R., Coelho R. G., Andrade Leite S. R., Micheletti A. C., Lopes T. I. B., Misutsu M. Y., Beatriz A., Bruma R. L., Leite C. Q. F. (2010), “Antimycobacterial activity of lichen substances”, Phytomedicine, 1−5. [12] Huneck S., Yoshimura I. (1997), Identification of lichen substances, Springer, Berlin, 155−311. [13] Huneck S. (1999), “The significance of lichens and their metabolites”, Naturwissenschaften, 86, 559–570. [14] Huynh B. L. C., Duong T. H., Do T. M. L., Pinnock G. T., Pratt L. M., Yamamoto S., Watarai H., Tanahashi T., Nguyen K. P. P. (2015), “New γ-lactone carboxylic acids from the Lichen Parmotrema prasorediosum (Nyl.) Hale, Parmeliacea”, Records of Natural Products, 10(3), 332-340. [15] Huynh Bui Linh Chi (2014), Chemical constituents of lichen Parmotrema prasorediosum collected in Vienam, A thesis for Doctor of Philosophy, University of Science, National University -Ho Chi Minh City. [16] Jayaprakasha G. K., Rao L. J. (2000), “Phenolic constituents from the lichen Parmotrema stuppeum (Nyl.) Hale and their antioxidant activity”, Zeitschrift für Naturforschung [C], 55, 1018−1022. [17] Keogh M. F. (1977), “Malonprotocetraric acid from Parmotrema conformatum”, Phytochemistry, 16(7), 1102. [18] Kharel M. K., Rai N. P., Manandhar M. D., Elix J. A., Wardlan J. H. (2000), “Dehydrocollatolic acid, a new depsidone from the lichen Parmotrema nilgherrense”, Australian Journal of Chemistry, 53, 891−892. [19] Le Hoang Duy (2012), Chemical study of common lichens in the south of Vienam, A thesis for Doctor of Philosophy, Kobe Pharmaceutical University, 2-8. [20] Lopes T. I. B., Coelho R. G., Yoshida N. C. and Honda N. K. (2008), “Radical- scavenging activity of orsellinates”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 56, 1551−1554. 23
31. [21] Micheletti A. C., Beatriz A., Lima D. P. de, Honda N. K. (2009), “Chemical constituents of Parmotrema lichexanthonicum Eliasaro & Adler – Isolation, structure modification and evaluation of antibiotic and cytotoxic activities”, Química Nova, 32, 12−20. [22] Muller K. (2001), “Pharmaceutically relevant metabolites from lichens”, Applied Microbiology and Biotechnology, 56, 9−16. [23] Ng. T. Q. Như, Ng. T. T. Hương (2017), “Cô lập một số hợp chất phenolic từ cao acetone thô của loài địa y Parmotrema tsavoense”, Đề tài sinh viên nghiên cứu khoa học, Đại học Sư Phạm TP.HCM. [24] Neeraj V., Behera B. C., Parizadeh H., Bo S. (2011), “Bactericidal activity of some lichen secondary compounds of Cladonia ochrochlora, Parmotrema nilgherrensis and Parmotrema sancti-angelii”, International Journal of Drug Development and Research, 3(3), 222−232. [25] O’Donovan D. G., Robert G., Keogh M. F. (1980), “Structure of the β-orcinol depsidones, connorstictic acid and consalazinic acid”, Phytochemistry, 19, 2497−2499. [26] Sakurai A., Goto Y. (1987), “Chemical studies on the lichen. I. The structure of isolecanoric acid, a new ortho-depside isolated from Parmelia tinctorum Despr.”, Bulletin of the Chemical Society of Japan, 60, 1917−1918. [27] S. Morris Kupchan, Herbert L. Kopperman (1975), “l-Usnic acid: Tumor inhibitor isolated from lichens”, Experientia, 31, 625-625. [28] Santos L. C., Honda N. K., Carlos I. Z., Vilegas W. (2004), “Intermediate reactive oxygen and nitrogen from macrophages induced by Brazilian lichens”, Fitoterapia, 75, 473−439. [29] Ramesh P., Shere E., Baig A. (1994), “Chemical investigation of South Indian lichen: Parmelia praesorediosa (Nyl.) and Parmelia reticulate (Tayl.)”, Indian Journal of Heterocyclic Chemistry, 3(3), 211−212. [30] Yit Heng Choi (2008), Generic potential of lichen-forming fungi in polyketide biosynthesis, A thesis for Doctor of Philosophy, RMIT University, 10-15. 24
32. PHỤ LỤC 25
33. T3-DMSO-1H 9’ 9 12 8’ 8 10 5 T3-DMSO-13C Phụ lục 1. Phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất T3 26
34. 9’ 9 12 T3-DMSO-HSQC 8’ 8 10 5 9’ 9 12 8’ 5 10 8 7 11 9’ 9 T3-DMSO-HMBC 12 8’ 8 10 5 9’ 9 12 8’ 5 10 8 7 11 Phụ lục 2. Phổ HSQC và HMBC của hợp chất T3 27
35. 9 7-OCH3 12 2-OH 8 10 5 9 8 10 7-OCH3 12 5 Phụ lục 3. Phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất N3 28
36. 9 7-OCH3 12 8 10 5 9 12 7-OCH3 5 10 8 9 7-OCH3 12 2-OH 8 10 5 Phụ lục 4. Phổ HSQC và HMBC của hợp chất N3 29