›

Khóa luận Sàng lọc in silico các hợp chất coumarin có tác dụng ức chế enzyme carbonic anhydrase ii hướng điều trị tăng huyết áp

pdf 62 trang thiennha21 18/04/2022 4760
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Sàng lọc in silico các hợp chất coumarin có tác dụng ức chế enzyme carbonic anhydrase ii hướng điều trị tăng huyết áp", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_sang_loc_in_silico_cac_hop_chat_coumarin_co_tac_du.pdf

Nội dung text: Khóa luận Sàng lọc in silico các hợp chất coumarin có tác dụng ức chế enzyme carbonic anhydrase ii hướng điều trị tăng huyết áp

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN KHÁNH HỒNG SÀNG LỌC IN SILICO CÁC HỢP CHẤT COUMARIN CÓ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYME CARBONIC ANHYDRASE II HƯỚNG ĐIỀU TRỊ TĂNG HUYẾT ÁP KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC SĨ Hà Nội - 2021
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN KHÁNH HỒNG SÀNG LỌC IN SILICO CÁC HỢP CHẤT COUMARIN CÓ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYME CARBONIC ANHYDRASE II HƯỚNG ĐIỀU TRỊ TĂNG HUYẾT ÁP KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC SĨ Khóa: QH2016.Y Người hướng dẫn: 1. PGS.TS Bùi Thanh Tùng 2. PGS.TS Vũ Mạnh Hùng Hà Nội - 2021
  3. LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành cảm ơn tới PGS. TS Bùi Thanh Tùng, công tác tại bộ môn Dược lý – Dược Lâm sàng – Trường Đại học Y dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, là người thầy vô cùng tâm huyết đã động viên và chỉ dẫn tận tâm cho em từ những ngày đầu tiên thực hiện đề tài. Em cũng bày tỏ sự biết ơn tới PGS. TS Vũ Mạnh Hùng công tác tại Học viện Quân y đã hỗ trợ cho em trong suốt quá trình hoàn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp này. Bên cạnh đó, em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới lãnh đạo, các thầy cô công tác tại Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện để em được học tập, nghiên cứu, rèn luyện tại Trường suốt 5 năm học vừa qua. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, anh chị em và bạn bè luôn sát cánh, ủng hộ động viên em trong quá trình nghiên cứu hoàn thành luận văn nói riêng và quá trình học tập 5 năm nói chung. Dù đã rất cố gắng nhưng vì kiến thức và kinh nghiệm thực tiễn còn giới hạn, em khó tránh khỏi những thiếu sót. Em kính mong nhận được sự chỉ dẫn và đóng góp của các thầy, cô để khóa luận của em được hoàn thiện hơn. Em xin kính chúc thầy cô nhiều sức khỏe, thành công và hạnh phúc. Em xin chân thành cảm ơn. Hà Nội, ngày 28 tháng 05 năm 2021 Sinh viên Nguyễn Khánh Hồng
  4. DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT THA Tăng huyết áp CAII Enzyme carbonic anhydrase II AT1 Thụ thể angiotensin II tuýp 1 WHO Tổ chức Y tế Thế giới ISH Hiệp hội tăng huyết áp quốc tế ESC/ ESH Hội Tim mạch và Huyết áp châu Âu HATT Huyết áp tâm thu HATTr Huyết áp tâm trương BMI Chỉ số khối cơ thể (kg/ m2) FKE 4-(4-phenylpiperidin-1-yl) carbonylbenzenesulfonamide hCAII Enzyme carbonic anhydrase II ở người R&D Quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới FDA Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ Ro5 Quy tắc Lipinski 5 ADMET Hấp thu, phân phối, chuyển hóa, thanh thải và độc tính SMILES Simplified Molecular Input Line Entry Specification RMSD Giá trị độ lệch bình phương trung bình gốc PDB Ngân hàng dữ liệu Protein CSDL Cơ sở dữ liệu pkCSM Predicting Small-Molecule Pharmacokinetic and Toxicity Properties Using Graph-Based Signatures CYP Các isozyme cytochromes P450 BBB Hàng rào máu não
  5. Caco2 Khả năng kết bám với tế bào ung thư ruột kết OCT2 Chất vận chuyển cation hữu cơ ở thận CNS Hệ thần kinh trung ương AMES Xét nghiệm đột biến ngược Salmonella typhimurium IMP Imperatorin MPO Myeloperoxidase
  6. MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về bệnh Tăng huyết áp: 3 1.1.1. Khái niệm và phân loại: 3 1.1.2. Nguyên nhân gây bệnh: 4 1.1.3. Triệu chứng của THA: 5 1.1.4. Hậu quả: 5 1.1.5. Điều trị: 6 1.2. Tổng quan về enzym CAII: 8 1.2.1. Giới thiệu chung về enzyme CA: 8 1.2.2. Sơ lược enzyme carbonic anhydrase II: 8 1.2.3. Trung tâm hoạt động của enzyme CAII: 9 1.3. Nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên nhóm coumarin: 10 1.3.1. Tiềm năng của hợp chất thiên nhiên Việt Nam: 10 1.3.2. Đôi nét về nhóm hợp chất coumarin: 10 1.4. Mô hình in silico trong quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới: 12 1.4.1. Tổng quan về quá trình nghiên cứu phát triển thuốc: 12 1.4.2. In silico trong quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc: 13 1.4.3. Giới thiệu về Docking: 13 1.4.4. Giới thiệu về Quy tắc Lipinski 5 (RO5): 14 1.4.5. Dự đoán ADMET: 15 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1. Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu: 17 2.2. Nội dung nghiên cứu: 18
  7. 2.3. Phương pháp nghiên cứu: 18 2.3.1. Sàng lọc bằng Docking phân tử: 18 2.3.2. Chọn ra hợp chất “giống thuốc” từ Quy tắc Lipinski 5: 19 2.3.3. Dự đoán ADMET bằng công cụ trực tuyến: 20 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 22 3.1. Sàng lọc docking: 22 3.2. Đặc điểm hóa lý của các hợp chất được chọn: 32 3.3. Dự đoán về hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thanh thải và độc tính (ADMET): 34 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 39 4.1. Về phương pháp sàng lọc ảo: 39 4.2. Về kết quả sàng lọc ảo: 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO
  8. DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Phân độ tăng huyết áp theo Hội tim mạch và huyết áp Châu Âu (ESC/ESH) năm 2018 3 Bảng 1.2: Các thể THA dựa theo trị số HA phòng khám và HA tại nhà hoặc HA liên tục 4 Bảng 3.1: Kết quả docking của 50 hợp chất coumarin tự nhiên 23 Bảng 3.2: Kết quả lipinski của 8 hợp chất được lựa chọn từ kết quả Docking 31 Bảng 3.3: Tương tác giữa 5 hợp chất với đích CAII 32 Bảng 3.4: Kết quả ADMET của 5 hợp chất được chọn từ RO5 33
  9. DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 : Các biến chứng nguy hiểm của tăng huyết áp . 6 Hình 1.2: Hình ảnh 2D của FKE tương tác với các axit amin quan trọng trong túi liên kết của protein hCAII (PDB ID: 6H2Z) 9 Hình 1.3: Hình ảnh 2D về coumarin 11 Hình 1.4: Các giai đoạn chính của quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới 12 Hình 2.1: Hình ảnh 3D của protein 6H2Z 17 Hình 2.2 Thực hiện dự đoán tính giống thuốc và các thông số ADMET bằng pkCSM bao gồm 2 bước: nhập công thức SMILES của hợp chất, sau đó chọn ADMET để hiển thị đầy đủ các thông số 20 Hình 3.1: Tóm tắt kết quả in silico 21 Hình 3.2: Kết quả re-dock của phân tử đồng kết tinh . 22 Hình 3.3: Minh họa hai chiều tương tác của 4-(4-phenylpiperidine-1- carbonyl) benzenesulfonamide với trung tâm hoạt động CAII 23 Hình 4.1: Minh họa 2 chiều tương tác của Calophyllolide với trung tâm hoạt động của CAII 38 Hình 4.2: Minh họa 2 chiều tương tác của Imperatorin với trung tâm hoạt động của CAII 39 Hình 4.3: Minh họa 2 chiều tương tác của Khellactone với trung tâm hoạt động của CAII 40 Hình 4.4: Minh họa 2 chiều tương tác của Scandenin với trung tâm hoạt động của CAII 41 Hình 4.5: Minh họa 2 chiều tương tác của Frutinon A với trung tâm hoạt động của CAII 42
  10. MỞ ĐẦU Tăng huyết áp (THA) được coi là một trong 8 nguyên nhân hàng đầu gây tàn tật và tử vong toàn cầu. Theo ước tính của Tổ chức y tế Thế giới (WHO), hàng năm có 9.4 triệu người tử vong do THA [58]. Tại Việt Nam, THA là một vấn đề y tế công cộng, tỷ lệ mắc là 25.1%, là yếu tố nguy cơ quan trọng hàng đầu dẫn đến bệnh lý về tim mạch [46]. THA với khoảng 10 triệu người tử vong vào năm 2015; trong đó có 4,9 triệu người tử vong do bệnh mạch vành và 3,5 triệu người do đột quỵ [8]. Người ta ước tính rằng số người bị tăng huyết áp sẽ tăng 15-20% vào năm 2025, đạt khoảng 1,5 tỷ người [44, 47]. Trong suốt những thập kỷ qua, nhiều nghiên cứu lâm sàng đã cho thấy điều trị THA hiệu quả đã làm giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch và tử vong, nhưng đến nay gánh nặng kinh tế của THA và các hậu quả về tim mạch do THA vẫn ngày càng tăng trên toàn thế giới [40]. THA là bệnh mãn tính, quá trình điều trị lâu dài, thậm chí là cả đời, ước tính trên thế giới, THA sẽ tiêu tốn gần 1 nghìn tỷ đô la Mỹ và nếu THA không được điều trị, chi phí có thể lên tới 3,6 nghìn tỷ đô la Mỹ hàng năm [62]. Mặc dù hiện nay đã có nhiều loại thuốc hạ huyết áp nhắm vào các con đường khác nhau liên quan đến sinh lý bệnh của nó, nhưng bệnh tăng huyết áp vẫn được kiểm soát kém trên toàn thế giới và tỷ lệ mắc bệnh vẫn tăng [2]. Do đó, việc phát triển các loại thuốc hạ huyết áp mới tác động lên các mục tiêu mới, với các phương thức tác dụng khác nhau, vẫn là điều cần thiết, để cải thiện việc kiểm soát huyết áp và giảm gánh nặng cho các nguy cơ tim mạch. Tuy nhiên, những khó khăn gặp phải trong quá trình hình thành, phát triển, chi phí và việc đưa ra thị trường các loại thuốc hạ huyết áp, vẫn còn là trở ngại rất lớn [38]. Hiện nay, đã có nhiều loại thuốc chữa THA ví dụ như thuốc ức chế men chuyển, chẹn beta giao cảm, lợi tiểu, chẹn kênh canxi, ức chế thụ thể AT1 của angiotensin II, thuốc lợi tiểu [63]. Trong các thuốc mới phát triển, nhiều hoạt chất được tìm thấy thông qua quá trình thiết kế và sàng lọc ảo với sự hỗ trợ của các mô hình máy tính (in silico), cụ thể là Docking. Các mô hình in silico có lợi thế so với các mô hình thực nghiệm truyền thống cả về thời gian và chi phí vận hành. Hiện nay, in silico đã trở thành một phần không thể tách rời trong các dự án nghiên cứu và phát triển thuốc mới, chúng được sử 1
  11. dụng trong giai đoạn sàng lọc các thư viện hoá học lớn nhằm tìm kiếm hợp chất tiềm năng cho các nghiên cứu thực nghiệm. Từ những phân tích nêu trên, nhằm góp phần tìm kiếm các chất có hoạt tính tốt phù hợp phát triển thành thuốc điều trị THA, em tiến hành đề tài “Sàng lọc in silico các hợp chất coumarin có tác dụng ức chế enzyme carbonic anhydrase II hướng điều trị tăng huyết áp” với mục tiêu chính như sau: - Sàng lọc một số hợp chất coumarin có tác dụng ức chế enzyme carbonic anhydrase II (CAII) bằng phương pháp Docking phân tử. - Nghiên cứu đặc tính giống thuốc và tính toán dược động học - độc tính của chúng; từ đó tìm ra các hợp chất tiềm năng. 2
  12. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về bệnh Tăng huyết áp: 1.1.1. Khái niệm và phân loại: • Huyết áp là gì [5, 19]: Huyết áp là lực tác động bởi tuần hoàn máu chống lại thành mạch khi được tim bơm máu. Huyết áp bình thường tăng và giảm trong suốt cả ngày. Huyết áp được đo bằng hai con số. Cả hai đều được đo bằng milimét thủy ngân (mmHg): - Con số đầu tiên, được gọi là huyết áp tâm thu, còn gọi là huyết áp tối đa, là trị số huyết áp cao nhất trong chu kỳ tim, đo được ở thời kỳ tâm thu, phụ thuộc vào lực tâm thu và thể tích tâm thu của tim. - Con số thứ hai, được gọi là huyết áp tâm trương, là trị số huyết áp thấp nhất trong chu kỳ tim, ứng với thời kỳ tâm trương, phụ thuộc vào trương lực của mạch máu. • Định nghĩa tăng huyết áp, theo [9]: Tăng huyết áp là tình trạng tăng huyết áp tâm thu và/hoặc huyết áp tâm trương có hoặc không có nguyên nhân. Theo WHO-ISH 1999 thì tăng huyết áp (THA) được xác định khi huyết áp tâm thu ≥ 140mmHg và hoặc huyết áp tâm trương ≥ 90mmHg, hoặc đang sử dụng thuốc chống THA. • Phân loại tăng huyết áp: Bảng 1.1: Phân độ tăng huyết áp theo Hội tim mạch và huyết áp Châu âu (ESC/ESH) năm 2018 [9, 17]: HATT HATTr Tối ưu <120 Và <80 Bình thường 120-129 Và/hoặc 80-84 3
  13. Bình thường cao 130-139 Và/hoặc 85-89 THA độ 1 140-159 Và/hoặc 90-99 THA độ 2 160-179 Và/hoặc 100-109 THA độ 3 ≥ 180 Và/hoặc ≥110 THA Tâm thu đơn độc ≥ 140 Và 120-139mmHg và HATTr > 80-89 mmHg. Các thể THA và Huyết áp bình thường [8]: Bảng 1.2: Các thể THA dựa theo trị số huyết áp phòng khám và huyết áp tại nhà hoặc huyết áp liên tục Huyết áp phòng khám (mmHg) HATT 14 gam/ngày) có nhiều nguy cơ THA; nòi giống: người da đen có tỷ lệ THA cao hơn người da trắng (trong cùng hoàn cảnh, điều kiện làm việc như nhau); thừa cân và béo phì; di truyền; nghiện rượu; hút thuốc lá [6]. Các nguyên nhân THA thứ phát có thể là: hẹp động mạch thận, hẹp eo động mạch chủ, hẹp động mạch chủ (trên chỗ xuất phát động mạch thận), viêm thận các loại, teo thận bẩm sinh, u thượng thận, ăn mặn, sinh hoạt bị nhiều stress, di truyền [9]. 4
  14. 1.1.3. Triệu chứng của THA: Khi các triệu chứng xảy ra, chúng có thể bao gồm nhức đầu vào sáng sớm, chảy máu cam, nhịp tim không đều, thay đổi thị lực và ù tai. Tăng huyết áp nghiêm trọng có thể gây ra mệt mỏi, buồn nôn, nôn mửa, lú lẫn, lo lắng, đau ngực và run cơ. Tăng huyết áp được mệnh danh là “kẻ giết người thầm lặng”. Hầu hết những người bị tăng huyết áp không biết mình bị tăng huyết áp vì nó hầu như không có dấu hiệu hoặc triệu chứng cảnh báo. Vì lý do này, việc đo huyết áp thường xuyên là điều cần thiết [57]. 1.1.4. Hậu quả: Tăng huyết áp là một bệnh lý tiến triển âm thầm và gây ra nhiều biến chứng ảnh hưởng tới tuổi thọ và chất lượng cuộc sống của con người. Tăng huyết áp có thể ảnh hưởng đến cơ thể bằng nhiều cách khác nhau. Thông thường, tăng huyết áp làm tăng gánh nặng cho tim và động mạch. Tim phải làm việc nặng hơn trong thời gian dài nên tim có xu hướng to ra, giãn ra và dày thành tim lên, dần dần sẽ gây ra hậu quả suy tim. Tăng huyết áp thúc đẩy và gây ra xơ vữa động mạch. Đây là bệnh lý nguy hiểm gây ra nhiều biến chứng tim mạch (tai biến mạch não, nhồi máu cơ tim ). Tăng huyết áp làm tăng nguy cơ đột quỵ, ngoài ra tăng huyết áp còn có thể làm tổn thương thận, mắt [8]. Hầu hết các trường hợp tăng huyết áp có thể kiểm soát hiệu quả bằng thuốc và từ đó làm giảm nguy cơ mắc bệnh và biến cố tim mạch do tăng huyết áp. *Các biến chứng thường gặp của THA [8]: ✓ Biến chứng tim: - Cấp tính: phù phổi cấp, nhồi máu cơ tim cấp - Mạn tính: dày thành tim trái, suy vành mạn, suy tim ✓ Biến chứng mạch não: - Cấp tính: xuất huyết não, tắc mạch não, tai biến mạch máu não thoáng qua, bệnh não do THA - Mạn tính: tai biến mạch não, tai biến mạch não thoáng qua ✓ Thận: đái máu, đái ra protein, suy thận 5
  15. ✓ Mắt: phù võng mạc, xuất huyết, xuất tiết võng mạc, động mạch võng mạc co nhỏ ✓ Biến chứng động mạch: tách thành động mạch chủ, bệnh động mạch ngoại biên Hình 1.1: Các biến chứng nguy hiểm của tăng huyết áp 1.1.5. Điều trị: Tăng huyết áp là bệnh mạn tính nên cần theo dõi đều, điều trị đúng và đủ hàng ngày, điều trị lâu dài. Mục tiêu điều trị là đạt “huyết áp mục tiêu” là <140/90 mmHg và giảm tối đa “nguy cơ tim mạch”. Nếu nguy cơ tim mạch từ cao đến rất cao thì huyết áp mục tiêu cần đạt là <130/80 mmHg. Khi điều trị đã đạt huyết áp mục tiêu, cần tiếp tục duy trì phác đồ điều trị lâu dài kèm theo việc theo dõi định kỳ [1, 11]. Cho đến nay, quá trình phát triển bệnh được phát hiện là có liên quan nhiều đến lối sống như hút thuốc, béo phì và các yếu tố môi trường chẳng hạn như hấp thụ quá nhiều muối và rượu [16, 42, 64]. Nên người bệnh cần có chế độ ăn hợp lý, đảm bảo đủ kali và các yếu tố vi lượng như giảm ăn mặn (< 6 gam muối hay 1 thìa cà phê muối mỗi ngày); tăng cường rau xanh, hoa quả tươi; hạn chế thức ăn có nhiều cholesterol và axít béo no; duy trì vòng bụng dưới 90 cm ở nam và dưới 80 cm ở nữ; hạn chế uống rượu, bia, hút thuốc; hoạt động thể lực ở mức thích hợp; tránh lo âu, căng thẳng thần kinh [1]. 6
  16. Bên cạnh đó, việc sử dụng thuốc cũng vô cùng quan trọng với bệnh nhân THA: - Đối với THA độ I với nguy cơ thấp: lựa chọn một thuốc trong số các nhóm: lợi tiểu thiazide liều thấp; ức chế men chuyển; chẹn kênh canxi loại tác dụng kéo dài; chẹn β giao cảm (nếu không có chống chỉ định). - THA từ độ 1 với nguy cơ trung bình, cao, rất cao hoặc độ II, III: nên phối hợp 2 loại thuốc (lợi tiểu, chẹn kênh canxi, ức chế men chuyển, chẹn thụ thể angiotensin, chẹn β giao cảm). - Nếu chưa đạt huyết áp mục tiêu, cần điều chỉnh liều tối ưu hay từng bước phối hợp các thuốc hạ huyết áp: + Phối hợp 2 thuốc: ức chế men chuyển/chẹn thụ thể angiotensin phối hợp với chẹn kênh canxi hoặc lợi tiểu. + Phối hợp 3 thuốc: ức chế men chuyển/chẹn thụ thể angiotensin phối hợp với chẹn kênh canxi và lợi tiểu. + Phối hợp 4 thuốc (THA kháng trị): Thêm kháng aldosteron hoặc lợi tiểu khác, chẹn α hoặc chẹn β. - Đối với tăng huyết áp có chỉ định điều trị bắt buộc: + Bệnh mạch vành: Chẹn β + ức chế men chuyển/chẹn thụ thể angiotensin, chẹn kênh canxi. + Suy tim: ức chế men chuyển/chẹn thụ thể angiotensin + chẹn β + kháng aldosteron, lợi tiểu quai khi ứ dịch. + Đột quỵ: ức chế men chuyển + lợi tiểu. + Bệnh thận mạn, đái tháo đường: ức chế men chuyển/chẹn thụ thể angiotensin + lợi tiểu/chẹn kênh canxi [8, 16]. 7
  17. 1.2. Tổng quan về enzym CAII: 1.2.1. Giới thiệu chung về enzyme CA: Anhydrase carbonic (CAs) là các metalloenzyme có mặt ở khắp nơi trong tự nhiên và được tìm thấy trong nhiều loại sinh vật. Các enzym này có nguồn gốc cổ xưa vì chúng được tìm thấy ở phần sâu nhất của các nhánh của cây tiến hóa. Về mặt di truyền, chúng thuộc bảy phân nhóm α, β, γ, δ, ζ, η, θ không liên quan về mặt tiến hóa [35]. Enzyme này có cấu trúc ba chiều khác nhau, nhưng cơ chế enzym là tương tác tập trung mà kim loại tạo liên kết ion làm giảm pKa của phân tử nước để trở thành ion hydroxyl có thể tấn công phân tử carbon dioxide liên kết trong một túi kỵ nước ở vị trí hoạt động [15]. CAs xúc tác quá trình hydrat hóa thuận nghịch của carbon dioxide thành bicarbonate với sự giải phóng proton. Mức độ hoạt động bất thường của các enzyme này có liên quan đến nhiều rối loại như tăng nhãn áp, động kinh, loét dạ dày, ung thư, mất cân bằng axit- bazo. Do đó, CAs đã nổi lên như một mục tiêu có giá trị để điều trị hoặc phòng ngừa các rối loạn này [29]. Trong số năm lớp khác nhau của anhydrase cacbonic, lớp alpha có lẽ được chú ý nhiều nhất vì vai trò của nó trong bệnh lý ở người [29]. Hiện nay, người ta đã phát hiện có 15 đồng dạng a-carbonic anhydrase khác nhau ở người [35]. Chúng xúc tác sự chuyển - đổi lẫn nhau giữa CO2, bicacbonat và proton, do đó tạo ra hai trong số các ion (HCO3 và H+): - + CO2 + H2O ⇔ HCO3 + H Các đồng dạng CA (h) của con người có hoạt tính xúc tác khác nhau, nằm cục bộ dưới tế bào và phân bố ở một số mô [53]. 1.2.2. Sơ lược enzyme carbonic anhydrase II: Anhydrase carbonic II cụ thể là trên người là một metalloenzyme xúc tác quá trình - hydrat hóa thuận nghịch của CO2 sang HCO3 . Protein miền đơn này bao gồm 260 axit amin với một tấm sợi trung tâm. Kẽm được điều khiển bởi các gốc imidazole của ba histidine nằm sâu trong một túi liên kết kỵ nước hình nón. Ở trạng thái không có phối tử, các mol phân tử nước lấp đầy vị trí hoạt động. Một trong số chúng, được cho là OH- chiếm vị trí phối trí thứ tư của kẽm. Nó cũng được liên kết hydro với Thr199, được giả định là tạo thành liên kết hydro với cơ chất CO2. Một loại nước bổ sung, W338 (gọi là 8
  18. “deep water”), được tìm thấy ở trạng thái không có phối tử và được thay thế trong phản ứng enzyme bằng CO2 [55]. 1.2.3. Trung tâm hoạt động của enzyme CAII: Một cái nhìn sâu hơn về các đặc điểm cấu trúc giữa 6H2Z và phối tử 4-(4- phenylpiperidin-1-yl) carbonylbenzenesulfonamide (FKE) cho thấy rằng FKE liên kết với ion Zn (II) bằng cách gốc sulfonamit bị khử có liên quan đến liên kết H (khoảng cách 2,16 Å) với -OH của Thr199 dư. Một trong số oxy sulfonamide tạo thành liên kết H (khoảng cách 1,85 Å) với nitơ amin của Thr199, và nhóm cacboxyl cũng tạo liên kết H (khoảng cách 2,10 Å) với Gln92. Hơn nữa, FKE hiển thị thêm một tương tác bổ sung, như liên kết giữa vòng benzen và nhóm imidazole của His94 [14]. Hình 1.2: Hình ảnh 2D của FKE tương tác với các axit amin quan trọng trong túi liên kết của protein hCAII (PDB ID: 6H2Z). Vai trò của enzyme CAII: Nhìn chung, các đồng dạng CA của người có trong thận gồm CAII, IV, VB, IX, XII và XIV và chúng đóng một chức năng quan trọng trong ba quá trình sinh lý: - Cân bằng axit - bazơ (bằng cách tiết và bài tiết proton, do sự mất nước của CO2 phản ứng xúc tác bởi các enzym này). - Quá trình tái hấp thu bicacbonat. 9
  19. + - Sản xuất NH4 ở thận. Các chức năng quan trọng này được thực hiện trong các phân đoạn khác nhau của nephron: tái hấp thu bicarbonat xảy ra ở ống lượn gần, trong khi quá trình ion hóa axit + tiết niệu và đầu ra NH4 xảy ra ở ống lượn xa và ống góp. Sự định vị của anhydrase carbonic trong thận đã được nghiên cứu tích cực bằng mô học và miễn dịch. Trong số các isozyme CA có hoạt tính xúc tác, ít nhất bốn (CAII, IV, XII và XIV) được chứng minh là có mặt trong các tế bào biểu mô của ống thận. Trong các tế bào của ống lượn gần, ống lượn xa và ống góp, nồng độ CAII cao đã được báo cáo. Thật vậy, vai trò của CAII trong sinh lý thận đã được ghi nhận ở những bệnh nhân mắc hội chứng thiếu CAII [23]. 1.3. Nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên nhóm coumarin: 1.3.1. Tiềm năng của hợp chất thiên nhiên Việt Nam: Việt Nam hiện có 4.000 loài cây thuốc, hơn 50 loài tảo biển, 75 loài khoáng vật và gần 410 loài động vật làm thuốc, trong đó có nhiều loại dược liệu quý được thế giới công nhận như cây hồi, quế, atisô, sâm Ngọc Linh Tổng sản lượng dược liệu trồng ở Việt Nam ước tính đạt khoảng 100.000 tấn/năm. Nguyên liệu làm thuốc có nguồn gốc thảo mộc được sử dụng hàng năm tại cộng đồng, các cơ sở y tế, phòng khám đông y, sản xuất và kinh doanh với khoảng 50.000 tấn/năm thì 1/3 nguyên liệu do thu hái và khai thác tự nhiên, 1/3 do trồng trọt và còn lại do nhập khẩu chủ yếu từ Trung Quốc, Đài Loan, Hồng Công [3]. Theo Quyết định 1976 về Quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu đến năm 2020 và định hướng đến năm 2030 của Thủ tướng Chính phủ, Việt Nam sẽ có 8 vùng trồng nguyên liệu trên cả nước để trồng 54 loài dược liệu, lựa chọn và khai thác hợp lý 24 loài dược liệu tự nhiên. Đây sẽ là tiền đề để quy hoạch và phát triển nguồn dược liệu nước ta trong thời gian tới để đáp ứng nhu cầu sản xuất trong nước [3]. 1.3.2. Đôi nét về nhóm hợp chất coumarin: Coumarins là nhóm dẫn xuất 1-benzopyran lớn nhất được tìm thấy trong thực vật. Hợp chất ban đầu của nhóm hợp chất này, coumarin (2H-1-benzopyran-2-one), một hợp chất không màu có mùi thơm, lần đầu tiên được phân lập từ đậu Tonka (Dipteryx odorata, họ Fabaceae) vào năm 1820. Tên coumarin bắt nguồn từ một Thuật ngữ tiếng Pháp cho 10
  20. đậu tonka, coumarou. Hơn 1300 coumarin đã được xác định là chất chuyển hóa thứ cấp từ thực vật, vi khuẩn và nấm. Coumarins đã được tìm thấy ở khoảng 150 loài khác nhau phân bố trên gần 30 họ khác nhau, trong đó một số họ quan trọng là Rutaceae, Umbelliferae, Clusiaceae, Guttiferae, Caprifoliaceae, Oleaceae, Nyctaginaceae và Apiaceae. Họ Apiaceae, Asteraceae và Rutaceae là ba nguồn thực vật chính cung cấp coumarin [31, 51]. Hình 1.3: Hình ảnh 2D về coumarin Coumarin là một trong hợp chất được sự quan tâm nhiều của các nhà thực vật học, vì tính đa dạng về cấu trúc và đặc tính y học của chúng, cùng với hoạt tính sinh học trên phạm vi rộng như giảm đau, chống đông máu, chống HIV, chống viêm, kháng khuẩn, chống ung thư, tác dụng chống oxy hóa và điều hòa miễn dịch [51]. Ngày nay, nhiều hợp chất coumarin chiết xuất từ thiên nhiên đã được chứng minh là có hoạt tính trên bệnh tăng huyết áp (antihypertensive). Dihydromammea C/OB là một coumarin mới được phân lập từ hạt của cây Tây Phi Mammea africana Sabine (Guttiferae). Hợp chất này được tìm thấy ở chiết xuất methanol và dichloromethane của vỏ thân cây Mammea africana trong Nω-nitro-L-arginine methyl ester và đã xác định được là gây hạ huyết áp ở những con chuột bạch tạng Wistar nặng 250-300g 12-16 tuần tuổi [43]. Scopoletin được phân lập từ quả của cây Tetrapleura tetraptera TAUB (Mimosaceae) và nó gây hạ huyết áp ở động vật thí nghiệm in vitro và in vivo thông qua hoạt động giãn cơ trơn [28]. Visnadine, một hoạt chất chiết xuất từ quả Ammi visnaga, có tác dụng giãn mạch vành, ngoại vi [27]. Dẫn xuất khellactone được phân lập từ Phlojodicarpus sibiricus cho thấy tác dụng giãn mạch rõ rệt [18]. 11
  21. 1.4. Mô hình in silico trong quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới: 1.4.1. Tổng quan về quá trình nghiên cứu phát triển thuốc: R&D – Quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới là một quá trình gồm nhiều giai đoạn, từ lựa chọn mục tiêu phân tử của thuốc mới cho đến khi thuốc được phê duyệt và đưa ra thị trường. Hình 1.4: Các giai đoạn chính của quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới Các phân tích trên tất cả các lĩnh vực điều trị đã chỉ ra rằng, phát triển một loại thuốc mới, từ việc xác định mục tiêu thông qua phê duyệt tiếp thị, mất hơn 12 năm và trung bình 13.5 năm. Chi phí để phát triển một phân tử nhỏ hoặc thực thể sinh học mới (kháng thể, protein, liệu pháp gen ) là hơn 1 tỷ đô la và trung bình ước tính vào khoảng 2.6 tỷ đô la [48]. Các thử nghiệm lâm sàng chiếm 63% tổng chi phí, trong khi chi phí phát hiện và phát triển thuốc tiền lâm sàng ước tính chỉ chiếm 32% tổng chi phí. Tỷ lệ thành công (xác suất thành công của các thuốc đi vào quy trình lâm sàng / Giai đoạn I) được ước tính là 7% đối với các phân tử nhỏ và 11% đối với thụ thể sinh học (tỷ lệ tiêu hao tương ứng là 93% và 89%) [32]. 12
  22. Hiện nay, R&D thường được tiến hành bởi các công ty, tập đoàn dược phẩm đa quốc gia lớn. Khi xảy ra các bệnh hiếm gặp tại các nước nghèo (châu Phi) hay các nước đang phát triển, thuốc đặc trị lại không có. Để giải quyết tình hình đó, WHO và một số chính phủ phải đầu tư kinh phí và đặt hàng nghiên cứu với các trường đại học hoặc công ty dược phẩm để phát triển thuốc cho các bệnh đặc thù này [4]. 1.4.2. In silico trong quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc: Sự ra đời của sàng lọc ảo dựa trên cấu trúc đã thay đổi, cải thiện rất nhiều trong quá trình nghiên cứu và phát hiện thuốc. Phương pháp này được ứng dụng hầu như vào mọi khâu của R&D, từ khâu tìm kiếm các hợp chất hóa học có tác dụng sinh học, đến tối ưu hóa cấu trúc các hợp chất này nhằm tăng hoạt tính sinh học, giảm độc tính, tăng các tính chất dược động học của thuốc, đến các khâu nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng. Chúng được gọi chung là phương pháp “in silico” để phân biệt với các phương pháp in vivo, in situ và in vitro [22]. So với các phương pháp thực nghiệm trước đó, các phương pháp in silico có ưu thế giúp thiết kế những phân tử thuốc mới với những ưu thế vượt trội bằng việc giải thích bản chất phân tử của các tương tác thuốc, điều mà không một thí nghiệm nào có khả năng làm được. Ngoài ra chúng cho phép dự đoán hoạt tính sinh học nhờ sử dụng các mô hình toán học, dự đoán cơ chế tác dụng, cơ chế gây độc của các hợp chất và đặc biệt giúp tiết kiệm đáng kể cả thời gian và tiền bạc trong việc phát triển một thuốc mới [22]. 1.4.3. Giới thiệu về Docking: Việc giải trình tự bộ gen người đã dẫn đến sự gia tăng số lượng các mục tiêu điều trị mới cho nghiên cứu dược phẩm. Ngoài ra, các phương pháp tinh thể học thông lượng cao và cộng hưởng từ hạt nhân đã góp phần thu được cấu trúc nguyên tử của protein và phức hợp protein-phối tử với mức độ chi tiết ngày càng cao. Và từ đó một kỹ thuật mới ra đời đó là thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc. Phương pháp phổ biến nhất là Docking [30]. Được thành lập vào đầu những năm 1980, docking là công cụ tìm kiếm mạnh mẽ và hiện là một trong những phương pháp hữu ích nhất trong các công cụ thiết kế thuốc in silico và là một thành phần không thể thiếu trong nhiều chương trình tìm kiếm thuốc [34, 56]. Docking được mô tả là một phương pháp thiết kế thuốc dựa vào cấu trúc ba chiều (3D), nghiên cứu khả năng gắn kết một hay nhiều hợp chất (ligand) vào mô hình 13
  23. của protein hay enzyme, DNA v v [12, 24]. Trong lĩnh vực mô hình phân tử, docking dự đoán hướng ưu tiên của một phân tử thứ nhất vào phân tử thứ hai khi chúng liên kết với nhau để tạo thành một phức hợp ổn định. Docking dự đoán tiềm năng liên kết giữa hai phân tử dựa trên điểm số docking cũng như vị trí gắn kết, từ đó dự đoán khả năng hoạt hóa hoặc ức chế một protein của hợp chất [24]. Về mặt nhiệt động lực học, mục tiêu của docking là tìm ra cấu hình mà năng lượng tự do (∆G) của toàn hệ thống thấp nhất. Khi cơ chất gắn kết lên một phân tử protein mục tiêu, hai điểm cần chú ý là sự phù hợp về hình dạng, kích thước và năng lượng tương tác giữa cơ chất với protein. Ngoài yêu cầu phù hợp về hình dạng, kích thước, giữa cơ chất và enzyme còn những tương tác khác như tương tác Van der Waals, tương tác tĩnh điện Tuy nhiên, protein thường có kích thước lớn và mềm dẻo nên rất khó để khảo sát hết tất cả các khả năng tương tác giữa protein và cơ chất. Trong docking, phân tử protein thường được đưa vào dưới dạng cấu trúc cứng, cơ chất có thể chuyển động tương đối so với protein và thay đổi cấu hình [24]. Ngày nay, hơn 30 ứng dụng để Docking hoàn toàn dễ tìm kiếm trên Internet. Được sử dụng rộng rãi nhiều nhất là AutoDock Vina rồi đến Genetic Optimization for Ligand Docking (GOLD), FlexX/FlexE, DOCK và Internal Tọa độ Cơ học (ICM)/Thuật toán kết nối ICM-linh hoạt (IFREDA) [56]. 1.4.4. Giới thiệu về Quy tắc Lipinski 5 (RO5): Vào những năm 1990, do sự thay đổi mô hình tìm kiếm thuốc từ sàng lọc kiểu hình sang hóa học tổ hợp, sàng lọc thông lượng cao, RO5 đã được tạo ra để trở thành một công cụ dự đoán trong thời đại mà hóa học dược liệu và tổ hợp tạo ra quá nhiều hợp chất có đặc tính hóa lý rất kém. Lipinski và các đồng nghiệp đã báo cáo một phân tích về các hợp chất liên quan mà đến 90% đã tham gia vào các nghiên cứu lâm sàng giai đoạn II, về tương quan các đặc tính hóa lý tính toán của các phân tử này với khả năng hòa tan trong nước, tính thẩm thấu và sinh khả dụng đường uống của chúng [18, 37]. "Quy tắc năm" ra đời, như một công cụ ghi nhớ cho các nhà hóa dược sử dụng để đánh giá nhanh các hợp chất trong quá trình phát hiện và tối ưu hóa thuốc liên quan đến khả năng hiển thị độ hòa tan và độ thẩm thấu tốt của các hợp chất [37]. Nếu một hợp chất không đạt RO5 thì khả năng cao khi trở thành thuốc sẽ gặp phải các vấn đề trong cơ thể 14
  24. con người. Tuy nhiên, việc vượt qua RO5 không có gì đảm bảo chắc chắn rằng một hợp chất là giống thuốc (drug-like) [18]. Theo trang web scfbio-iitd.res.in của Supercomputing Facillity for Bioinformatics & Computational Biology, IIT Delhi, thì Quy tắc Lipinski 5 giúp phân biệt giữa các phân tử giống thuốc và không giống thuốc [13]. Nó dự đoán xác suất thành công với tỷ lệ chính xác cao, nếu các phân tử tuân thủ 2 hoặc nhiều quy tắc sau: - Khối lượng phân tử nhỏ hơn 500 Dalton. - Tính ưa mỡ cao (được biểu thị bằng Log P nhỏ hơn 5). - Ít hơn 5 liên kết hydro (cho) (tổng của O-Hs và N-Hs). - Ít hơn 10 liên kết hydro (nhận) (tổng của N và Os). - Độ khúc xạ mol phải nằm trong khoảng 40-130. 1.4.5. Dự đoán ADMET: Thực nghiệm đánh giá các đặc tính dược động học và độc tính của phân tử nhỏ vừa tốn thời gian vừa tốn chi phí và không phải lúc nào kết quả đáng tin cậy giữa các mô hình động vật và con người. Để giải quyết vấn đề này, nhiều phương pháp tính toán đã được phát triển để tìm kiếm và lựa chọn hợp chất trong suốt quá trình phát triển thuốc [21]. Mô hình tính toán dựa trên các đặc tính dược động học như hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thanh thải và độc tính (ADMET) trên máy tính là cần thiết cho R&D [19]. Ở một số công ty dược phẩm, phương pháp này đã được các nhà thiết kế thuốc của họ áp dụng thường xuyên với nhiều thành công đáng kể [39]. Các đặc tính hấp thu, phân phối, chuyển hóa, thanh thải và độc tính (ADMET) là những hiện tượng liên quan chặt chẽ đến đặc tính của một chất hóa học trong cơ thể con người. Mục tiêu chính để tính toán các thuộc tính ADMET là thu được dự đoán sơ bộ về khả năng dược lý tiềm năng của một hợp chất để trở thành thuốc [19]. Mỗi đặc tính của ADMET sẽ phản ánh kết quả của một hợp chất hóa học khi tương tác với các cơ quan khác nhau trong cơ thể. Việc dự đoán các đặc tính ADMET quan trọng, đặc biệt là đối với các hợp chất hóa học lạ được tiêu thụ trong thời gian dài hoặc ở nồng độ lớn [39]. 15
  25. Trong rất nhiều công cụ dự đoán ADMET, ngoài một số phần mềm như CASE ULTRA, DEREK, META-PC, METEOR, PASS, GUSAR , còn có các công cụ trực tuyến như pkCSM, SwissADME khá phổ biến trong các nghiên cứu khoa học [52]. Ở đây khóa luận này sử dụng một cách tiếp cận để dự đoán các đặc tính dược động học, được gọi là pkCSM. pkCSM sử dụng khái niệm về dấu hiệu cấu trúc dựa trên đồ thị để nghiên cứu và dự đoán một loạt các đặc tính ADMET bổ sung cho các phân tử hóa học mới. Nhiều kết quả cho thấy rằng pkCSM hoạt động tốt và có thể nói là tốt hơn về các đặc tính dược động học so với các phương pháp có sẵn khác [20, 21]. 16
  26. CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu: Cấu trúc protein: Cấu trúc của protein CAII được lấy từ ngân hàng dữ liệu Protein châu Âu RCSB, có mã là 6H2Z (Độ phân giải 1.94Å), lần đầu được công bố bởi Buemi và cộng sự [36]. Hình 2.1: Hình ảnh 3D của protein 6H2Z. Cấu trúc phối tử: Bao gồm phân tử đồng kết tinh 4-(4-phenylpiperidine-1- carbonyl) benzenesulfonamide và 50 hợp chất coumarin được lấy từ PubChem. Đây là một cơ sở dữ liệu về các phân tử hóa học và các hoạt động của hợp chất, trực thuộc Viện Y tế Quốc gia Hoa Kỳ. Cơ sở dữ liệu để sàng lọc: 17
  27. Thiết bị sử dụng: Máy tính DELL Vostro 3590 - Hệ điều hành Windows 10. Phần mềm: Danh sách các phần mềm hay các trang web được sử dụng bao gồm: - Avogadro 1.2.ON.32: https: //qpdownload.com/avogadro/ - Chimera 1.14: - MGL tools 1.5.6: - Autodock Vina 1.5.6: - Discovery Studio 2020 Client: - pkCSM tool trực tuyến: - Quy tắc Lipinski 5 (RO5) trực tuyến: - Microsoft Office 2019. 2.2. Nội dung nghiên cứu: Bước 1: Sàng lọc ra các hợp chất tự nhiên trong cơ sở dữ liệu PDB có tác dụng ức chế CAII bằng phương pháp docking phân tử. Bước 2. Nghiên cứu đặc điểm giống thuốc của các hợp chất tốt chất, thu được sau khi đã thông qua sàng lọc, bằng cách phân tích các thông số hóa lý của cấu trúc đó. Bước 3: Dự đoán sự hấp thu, phân phối, chuyển hóa, thanh thải và độc tính (ADMET) của các hợp chất trong cơ thể con người thông qua thuật toán pkCSM. 2.3. Phương pháp nghiên cứu: 2.3.1. Sàng lọc bằng Docking phân tử: Chuẩn bị protein: Sử dụng CAII với ID: 6H2Z được lấy từ ngân hàng dữ liệu protein RCSB (www.rcsb.org). Trong phức hợp 6H2Z đã chứa sẵn ligand đồng kết tinh là 4-(4-phenylpiperidine-1-carbonyl) benzenesulfonamide. Quá trình chuẩn bị thực hiện các bước: loại bỏ phân tử nước, tách cấu trúc đồng tinh thể ra khỏi protein. Sau khi phân tử đồng kết tinh được tách ra, protein sẽ được loại bỏ phân tử nước và các nguyên tử hydro sẽ được thêm vào trước khi tái lập vùng hoạt 18
  28. động của enzym bằng phần mềm MGL Autodock tools 1.5.6. Vùng hoạt động của enzym được thiết lập dựa vào kích thước hộp tìm kiếm (grid box) là 70x70x70 Å, khoảng cách giữa các ô lưới là 0,375 Å, tọa độ trục là x = -6.185, y = 1.015, z = 13.997 được đặt dựa theo vị trí của ion Zn2+ và một số axit amin quan trọng ở vị trí hoạt động. Xác nhận giao thức docking: Để xác thực giao thức docking, các phối tử từ đồng tinh thể đã được re-dock lại vào vị trí hoạt động của mục tiêu. Quá trình được thực hiện thành công nếu giá trị độ lệch bình phương trung bình gốc (RMSD) nhỏ hơn hoặc bằng 1.5Å. Phân tử đồng kết tinh sau khi re-dock sẽ được dùng để so sánh với các phối tử đã được dock, xem sự tương đồng về cấu dạng và khả năng tương tác như thế nào để từ đó đánh giá kết quả. Đánh giá cấu dạng và khả năng tương tác thì sử dụng phần mềm Chimera 1.14 và Discovery Studio Visualizer 4.0. Chuẩn bị phối tử: Các cấu trúc phối tử được thu thập từ các tài liệu về protease và các mục tiêu protein liên quan đến 50 hợp chất tự nhiên. Cấu trúc 3D được tải xuống từ PubChem ( ở định dạng SDF và sau đó được chuyển đổi thành định dạng PDB bằng phần mềm Chimera. Sau đó, các phối tử được phần mềm Avogadro tối ưu hóa bằng Conjugate Gradients và chuyển sang định dạng .pdbqt bằng phần mềm Autodock Tools. Thực hiện docking phân tử: Enzym và phối tử đã được dock, sử dụng phần mềm Autodock Vina của The Scripps Research Institute. Đối với các chất cần docking, khả năng gắn kết của chúng được đánh giá thông qua tương tác với các acid amin trong hốc phản ứng và năng lượng tương tác, tính bởi hàm tính điểm (scoring function) của Autodock Vina. Biểu diễn liên kết: Phân tích kết quả bằng phần mềm Discovery Studio tìm tương tác của các phối tử với cấu trúc tinh thể của ACE. Đây là công cụ cho hình ảnh trực quan 2D và 3D về các tương tác giữa phối tử và các axit amin ở trung tâm hoạt động của protein. 2.3.2. Chọn ra hợp chất “giống thuốc” từ Quy tắc Lipinski 5: Quy tắc Lipinski 5 giúp so sánh các phân tử giống thuốc và không giống thuốc. Khóa luận ở đây sử dụng công cụ trực tuyến ( để đánh giá quy tắc 19
  29. năm của Lipinski. Các cấu trúc hóa học được tải xuống từ cơ sở dữ liệu Pubchem và đặt ở pH 7,0. Tiêu chí: Nếu các hợp chất tuân thủ ít nhất 2 trong 5 quy tắc sau: - Khối lượng phân tử nhỏ hơn 500 Dalton. - Tính ưa mỡ cao (được biểu thị bằng Log P nhỏ hơn 5). - Ít hơn 5 liên kết hydro (cho) (tổng của O-Hs và N-Hs). - Ít hơn 10 liên kết hydro (nhận) (tổng của N và Os). - Độ khúc xạ mol phải nằm trong khoảng 40-130. 2.3.3. Dự đoán ADMET bằng công cụ trực tuyến: Nghiên cứu dược lý trong silico đã được dự đoán bởi ADMET. ADMET bao gồm hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thanh thải và độc tính được dự đoán bằng cách sử dụng công cụ pkCSM ( Các cấu trúc phân tử SMILE chính tắc của các hợp chất được thu thập được truy xuất từ cơ sở dữ liệu PubChem. Tính toán các thông số: - Hấp thu: tính thấm màng caco2, khả năng hấp thu ở ruột người, - Phân bố: thể tích phân bố VDss, tỷ lệ hợp chất ở dạng tự do, - Chuyển hóa: cơ chất CYP2D6, cơ chất CYP3A4, - Thải trừ: độ thanh thải toàn phần, cơ chất OCT2 thận, - Độc tính: độc tính AMES, độc tính gan, kích ứng da, 20
  30. Hình 2.2. Thực hiện dự đoán tính giống thuốc và các thông số ADMET bằng pkCSM bao gồm 2 bước: nhập công thức SMILES của hợp chất, sau đó chọn ADMET để hiển thị đầy đủ các thông số. 21
  31. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ Hình 3.1: Tóm tắt kết quả in silico. 3.1. Sàng lọc docking: Trước khi sàng lọc các hợp chất, phối tử đồng tinh thể cần được re-dock lại vào vị trí hoạt động của mục tiêu để xác định độ lệch bình phương trung bình gốc (RMSD) từ đó đánh giá tính phù hợp của các thông số docking. Tiến hành dock phân tử đồng kết tinh có định dạng file .pdbqt với file protein 6H2Z định dạng .pdbqt bằng Autodock Vina cho ra năng lượng liên kết ∆G= -8.4 kCal/mol. Đánh giá sự tương đồng về cấu dạng, xác định giá trị RMSD bằng phần mềm Chimera 1.14 thu được sự chồng khít về cấu trúc của phối tử đồng tinh thể trước và sau khi dock và giá trị RMSD là 1.378Å. Giá trị này thỏa mãn điều kiện RMSD nhỏ hơn 1.5Å chứng tỏ kết quả docking phân tử vào mục tiêu là đáng tin cậy. 22
  32. Hình 3.2: Kết quả re-dock của phân tử đồng kết tinh. Nghiên cứu sử dụng phần mềm Discovery Studio Visualizer 4.0 để biểu diễn sự tương tác giữa 4-(4-phenylpiperidine-1-carbonyl) benzenesulfonamide và CAII, được thể hiện như trong hình dưới. Từ hình ta có thể thấy được phân tử đồng kết tinh hình thành liên kết với 4 acid amin quan trọng: - và -sulfur với His94; -σ với Leu198, Val135; liên kết -alkyl với Val121. Ngoài ra, hợp chất còn thể hiện tương tác với các gốc Thr199, Gln92, Zn301. 23
  33. Hình 3.3: Minh họa hai chiều tương tác của 4-(4-phenylpiperidine-1-carbonyl) benzenesulfonamide với trung tâm hoạt động CAII. Sàng lọc chất ức chế enzyme CAII: Sau khi chuẩn bị các phối tử, tiến hành docking toàn bộ 50 hợp chất tự nhiên coumarine và enzym CAII để sàng lọc các phân tử có khả năng ức chế CAII. Kết quả thu được ở bảng sau: Bảng 3.1: Kết quả docking của 50 hợp chất coumarin tự nhiên: Nhóm 1: Coumarin đơn giản: 1.a. Nhóm oxy coumarine: STT Tên Cấu trúc Năng lượng liên kết (kcal/mol) 01 Umbelliferone -6.6 24
  34. 02 Aesculin -7.2 03 Coumarin -6.7 04 Skimmin -7.6 05 Cichoriin -7.5 06 Daphnin -8.1 07 Scopoletin -6.5 08 Collinin -8.3 09 Fraxin -6.2 10 Calycanthoside -6.9 25
  35. 1.b. Nhóm alkyl-coumarin: 11 Osthol -7.6 12 Suberosin -7.1 Nhóm 2. Furanocoumarin (= furocoumarin) : 2a. Nhóm 6, 7 furanocoumarin (hay còn gọi là nhóm psoralen) : 13 Psoralen -7.5 14 Bergaptol -7.2 15 Xanthotoxin -6.2 16 Imperatorin -8.5 17 Isoimperatorin -8.0 26
  36. 18 Phellopterin -7.7 19 Peucedanin -6.8 2b. Nhóm dihydro 6, 7 furanocoumarin: 20 Nodakenetin -7.5 21 Nodakenin -7.8 22 Ammijin (Marmesinin) -7.2 2c. Nhóm 7, 8 furanocoumarin ( hay còn gọi là nhóm angelicin): 23 Angelicin -7.3 24 Isobergapten -7.1 27
  37. 25 Sphondin -7.2 26 Oroselone -8.1 (cây bạch chỉ) 2d. Nhóm dihydro 7, 8 furanocoumarin: 27 Athamantin -8.3 28 Edultin -8.1 29 Peucenidin -8.2 Nhóm 3. Pyranocoumarin: 3a. Nhóm 6, 7 pyranocoumarin (nhóm xanthyletin): 30 Xanthyletin -7.6 31 Luvangetin -8.1 28
  38. 32 Xanthoxyletin -7.8 3b. Nhóm dihydro 6, 7 pyranocoumarin: 33 Decursin -8.3 34 Xanthalin -8.3 3c. Nhóm 7, 8 pyranocoumarin: 35 Seselin -7.2 3d. Nhóm dihydro 7, 8 pyranocoumarin: 36 Xanthogalin -8.3 (Jatamansin) 37 (+) cis Khellactone -8.6 38 Samidin -8.4 29
  39. 39 Visnadin -7.8 3e. Nhóm 5, 6 pyranocoumarin: 40 Avicennin -7.2 41 Alloxanthoxyletin -7.5 4. Một số nhóm khác: 42 Scandenin -8.5 (3-phenycoumarin) 43 Wedelolactone -8.1 (coumestan) 44 Calophyllolid -9.3 (4 phenyl coumarin) 30
  40. 45 Frutinone A -8.7 (chromonocoumarin) 46 Phyllocoumarin -8.4 (catechin coumarin) 47 Hydrangenol -8.0 (isocoumarin) 48 Novobiocin -8.5 49 Chartreusin -8.9 31
  41. 50 3''- -9.1 Demethylchartreusin So sánh năng lượng liên kết của phối tử đồng kết tinh với 50 hợp chất, kết quả thu được 8 hợp chất tối ưu so với phối tử đồng kết tinh (-8,4 kcal/mol). Đó là Calophyllolid với năng lượng là -9,3 kcal/mol; Imperatorin là -8.5 kcal/mol; (+) cis Khellactone là -8.6 kcal/mol; Scandenin là -8.5 kcal/mol; Frutinone A là -8.7 kcal/mol; Novobiocin là -8.5 kcal/mol; Chartreusin là -8.9 kcal/mol; 3''- Demethylchartreusin là -9.1 kcal/mol. 3.2. Đặc điểm hóa lý của các hợp chất được chọn: Từ kết quả ở bảng trên, ta thấy được có 8 phân tử cho kết quả tối ưu so với 4- (4-phenylpiperidine-1-carbonyl) benzenesulfonamide. Bảng 3.2: Kết quả lipinski của 8 hợp chất được lựa chọn từ kết quả Docking: STT Hợp chất Trọng Nhóm Nhóm Log Độ Hợp lượng cho liên nhận liên P khúc xạ chất phân kết kết mol giống tử hydrogen hydrogen (MR) thuốc (HBD) (HBA) 1 Calophyllolid 416 0 5 5.379 119.652 Có 2 Imperatorin 270 0 4 3.710 75.809 Có 3 (+) cis Khellactone 386 0 7 3.272 99.636 Có 4 Scandenin 434 2 6 5.439 123.055 Có 5 Frutinone A 264 0 4 2.592 70.397 Có 32
  42. 6 Novobiocin 612 6 13 3.138 159.911 Không 7 Chartreusin 640 5 14 0.948 154.030 Không 8 3''- 626 6 14 0.294 149.239 Không Demethylchartreusin Trong số tám hợp chất tự nhiên tiềm năng, năm hợp chất trong số chúng đáp ứng 2 hay nhiều hơn 2 tiêu chí RO5, do đó chúng là những ứng cử viên tiềm năng để phát triển thuốc. Đó là Calophyllolid, Imperatorin, Khellactone, Scandenin, Frutinone A. Để thấy tương tác axid amin của 5 hợp chất với đích enzyme CAII, khóa luận này sử dụng phần mềm Discovery Studio Visualizer 4.0 và cho được kết quả như bảng dưới đây: Bảng 3.3: Tương tác giữa 5 hợp chất với đích CAII: Hợp chất Năng Các tương tác với axit amin lượng liên kết (kcal/mol) Calophyllolid -9.3 Tương tác Van der Waals: Ala65, Asn62, Asn67, Gln92, Zn301, Thr200, His96, Val143, Thr199, Phe131. Liên kết Carbon-Hydro: His 64. Liên kết π − σ: Leu198, His94. Liên kết alkyl: Pro202, Pro201, Trp5, Phe20. Liên kết π − alkyl: Val121. Imperatorin -8.5 Tương tác Van der Waals: Zn301, Trp5, His64, Tyr7, His96, Ala65, Asn67, Asn62, Gln92, Phe131, Val121. Liên kết Hydro: Thr199, Thr200. 33
  43. Liên kết π − σ: Leu198, His94. Liên kết π − π: His94. Liên kết π − alky: Leu198. (+) Cis -8.6 Tương tác Van der Waals: His119, His96, Ala65, Asn62, Khellactone Gln92, Phe131, Leu141, Trp209. Liên kết Hydro: Asn67, Thr199. Liên kết cơ kim: Zn301. Liên kết hydro tạo từ liên kết π: Thr200, His94. Liên kết π-alkyl: Leu198, Val121, Val143. Scandenin -8.5 Tương tác Van der Waals: Gly132, Phe131, Leu204, Gln92, Zn301, Thr199, Ser197, His96, Tyr7, Thr200, Ala65, Trp5, His64, Asn62, Asn67. Liên kết alkyl : Val143, Val207, Trp209, Val121. Liên kết π − alkyl: Val135, Pro202, His94, His119, Val143, Leu198. Frutinone A -8.7 Tương tác Van der Waals: Phe231, Gly6, Trp5, Gly63, His64, Lys170, Gly8. Liên kết Hydro: Tyr7. Liên kết π-anion: Glu239. Liên kết hydro tạo từ liên kết π: Asn11. 3.3. Dự đoán về hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thanh thải và độc tính (ADMET): Để phân tích hiệu quả hóa lý của năm hợp chất ức chế protein mục tiêu nêu trên, phương pháp in silico ADMET đã được sử dụng. ADMET liên quan đến năm thông số: hấp thu, phân phối, chuyển hóa, thanh thải và độc tính, tất cả đều đóng vai trò quan trọng 34
  44. để chứng minh khả năng thành công của một loại thuốc. Dự đoán về sự hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thanh thải và độc tính của năm hợp chất được trình bày trong bảng dưới đây: Bảng 3.4. Kết quả ADMET của 5 hợp chất được chọn từ RO5: Thông số Calophyllolid Imperatorin (+) cis Scandenin Frutinone Khellactone A Hấp thu Độ tan trong -5.699 -3.831 -2.992 -4.179 -3.837 nước (log mol/L) Tính thấm 1.121 1.383 1.2 1.136 1.356 màng Caco2 (log Papp in 10 cm/s) (cao :>0.9) Hấp thu ở 98.504 97.755 96.737 93.028 100 ruột (%) . ( 2.81) 35
  45. Tỷ lệ hợp chất 0.147 0.187 0.401 0 0.254 ở dạng tự do (người) Tính thấm -0.823 0.176 -0.071 -0.48 0.387 BBB (Không thấm: 0.3) Thấm qua hệ -1.678 -1.905 -2.915 -1.817 -1.691 thần kinh trung ương CNS (Không thấm: -2) Chuyển hóa Cơ chất Không Không Không Không Không CYP2D6 Cơ chất Có Có Không Có Có CYP3A4 Ức chế Không Không Không Không Không CYP2D6 Ức chế Có Không Không Có Không CYP3A4 Thanh thải 36
  46. Độ thanh thải 0.757 0.994 0.583 0.52 0.828 toàn phần (log ml/min/kg) Cơ chất Không Không Không Không Không OCT2 thận Độc tính Độc tính Không Có Không Không Có AMES Độc tính gan Không Không Không Không Không Kích ứng da Không Không Không Không Không Về hấp thu, tính thấm của dòng tế bào ung thư biểu mô ruột kết (Caco2) và khả năng hấp thu ở ruột của người là các thông số chính để quyết định sinh khả dụng của một loại thuốc [45]. Kết quả bảng trên cho thấy tất cả hợp chất đều có tính thấm Caco2 cao, lớn hơn 0,9. Tỷ lệ hấp thu ở ruột (ở người) của tất cả các hợp chất được phân tích là khá cao: Calophyllolid (98.504%), Imperatorin (97.755%), Khellactone (96.737%), Scandenin (93.028%), Frutinone A (100%). Do đó, năm hợp chất có thể được hấp thu qua đường ruột của con người. Sự phân bố của một loại thuốc phụ thuộc bởi nhiều thông số như khả năng hòa tan trong lipid, nồng độ trong huyết tương và khả năng liên kết với protein huyết tương, protein vận chuyển, v.v. %). Giá trị log BB cho thấy khả năng qua hàng rào máu não tốt khi có giá trị lớn hơn 0,3. Trong năm chất, chỉ có Frutinone A là thỏa mãn (log BB = 0.387) cho thấy khả năng qua hàng rào máu não tốt; và Khellactone không thấm qua thần kinh trung ương (do -2.915 < -2). Các isozyme cytochromes P450 (CYP) đóng vai trò quan trọng trong chuyển hóa thuốc. Người ta đã quan sát thấy rằng tất cả hợp chất đều là cơ chất của CYP3A4 và do 37
  47. đó, có thể được chuyển hóa hiệu quả bởi CYP3A4 ngoại trừ Khellactone. Mặt khác, Khellactone là chất ức chế CYP2D6, chất ức chế CYP3A4. Tất cả bốn hợp chất được dự đoán không phải là chất nền của chất vận chuyển cation hữu cơ ở thận (OCT2) Dự đoán độc tính từ thử nghiệm AMES (xét nghiệm đột biến ngược Salmonella typhimurium) chỉ ra rằng có Calophyllolid, Khellactone, Scandenin có thể được coi là tác nhân không gây đột biến. Tất cả các hợp chất không có độc tính cấp tính, độc tính với gan và kích ứng da. 38
  48. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1. Về phương pháp sàng lọc ảo: Ưu điểm: Quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc hiện nay gồm 4 giai đoạn và mất khoảng hơn 10 năm. Để tiết kiệm thời gian, công sức cũng như chi phí, việc áp dụng sàng lọc ảo in silico trong R&D ngày càng trở nên phổ biến. Với CSDL lớn về các hợp chất tự nhiên, tổng hợp được cập nhật hàng năm thì nhờ in silico việc dự đoán tính chất sinh học của thuốc trở nên nhanh chóng hơn. Từ đó, CSDL được thu hẹp, tăng khả năng thành công của hợp chất trong những thử nghiệm sâu hơn. Nhược điểm: Quá trình sàng lọc docking sử dụng nhiều phần mềm khác nhau, mỗi phần mềm có hàm thuật toán khác nhau, điều này có thể xảy ra tình trạng kết quả không thống nhất. Chính vì vậy, sau khi có kết quả từ nghiên cứu này, việc tiếp tục thử nghiệm trên các mô hình tế bào hay động vật là vô cùng quan trọng, để có thể xác định được ứng viên tiềm năng trở thành thuốc. 4.2. Về kết quả sàng lọc ảo: Từ kết quả ở bảng trên, ta thấy được có 5 phân tử cho kết quả tối ưu so với 4-(4- phenylpiperidine-1-carbonyl) benzenesulfonamide. • Hợp chất Calophyllolide: 39
  49. Hình 4.1: Minh họa 2 chiều tương tác của Calophyllolide với trung tâm hoạt động của CAII Hợp chất Calophyllolide có liên kết hydro với His 64 đồng thời liên kết kỵ nước với Phe20, Trp5, Pro201, Pro202, Val121. Năng lượng liên kết với đích tác dụng ∆G = -9.3 kCal/mol. Calophyllolide, một dẫn xuất coumarin được xác định là thành phần hóa học quan trọng được chiết xuất từ cây mù u. Mù u, tên khoa học Calophyllum inophyllum L., thuộc họ Bướu (Clusiaceae). Nó có nguồn gốc từ Châu Á nhiệt đới và hiện nay được trồng khắp vùng nhiệt đới trên thế giới bao gồm nhiều đảo trên Thái Bình Dương. Ở Việt Nam, phân bố chủ yếu ở các vùng núi thấp thuộc tỉnh miền Bắc, miền Trung, miền Đông và Tây Nam Bộ. Năm 2014, Hà Minh Hiển đã phân lập và xác định được trong Hạt và Lá mù u có thành phần calophyllolid [7]. Trong một số bài báo, calophyllolide đã cho thấy tác dụng chống đông máu cho các đợt huyết khối mạch vành và ngoại vi [41]. Điển hình, calophyllolide đã được nghiên cứu trên 78 con thỏ ở mức liều duy nhất 50 mg/kg sử dụng để xác định trị số đông máu (phần trăm prothrombin trong huyết tương) và cho thấy kết quả khả quan [47]. Nên callophyllolide có thể được sử dụng làm thuốc chống đông trong điều trị tăng huyết áp động mạch phổi [33]. 40
  50. • Hợp chất Imperatorin: Hình 4.2: Minh họa 2 chiều tương tác của Imperatorin với trung tâm hoạt động của CAII Hợp chất Imperatorin có liên kết hydro với Thr 199, Thr200 đồng thời liên kết kỵ nước với His94, Leu198. Năng lượng liên kết với đích tác dụng ∆G = -8.5 kCal/mol. Imperatorin (IMP) là một furanocoumarin được phân lập từ rễ cây Bạch chỉ (Angelica dahurica) ở thành phố Hồ Chí Minh. Cấu trúc của chúng đã được xác nhận bởi MS, phổ NMR [10]. Hiện nay, IMP được biết đến với vai trò trên hoạt động trên hệ thần kinh trung ương, chống ung thư và ảnh hưởng đến hệ thống tim mạch. Imperatorin đã được thử nghiệm chống lại nhiều vi khuẩn và còn được phát hiện là một chất ức chế sao chép HIV-1 [49, 60]. Đặc biêt, IMP ngăn chặn việc sản xuất nitric oxide tổng hợp (liên quan đến giãn mạch) và myeloperoxidase (MPO) và từ đây cho thấy một hoạt động điều hòa mạch máu tốt khi sử dụng IMP. Dựa trên kết quả từ nghiên cứu của Yan Jun Cao (2014), Imperatorin có thể được sử dụng để điều trị trong phòng ngừa tăng huyết áp và tổn thương thận liên quan đến tăng huyết áp ở chuột [59]. 41
  51. • Hợp chất Khellactone: Hình 4.3: Minh họa 2 chiều tương tác của Khellactone với trung tâm hoạt động của CAII Hợp chất Khellactone có liên kết hydro với Thr 199, Asn67 đồng thời liên kết kỵ nước với His94, Thr200, Leu198, Val121, Val143. Năng lượng liên kết với đích tác dụng ∆G= -8.6 kCal/mol. Khellactone là một pyranocoumarin tự nhiên được sử dụng như một chất chuyển hóa thứ cấp. Cis-khellactone như một chất chống ung thư mới bằng cách gây ra quá trình chết rụng tế bào, được phân lập từ phần hòa tan chloroform của thân rễ cây Angelica amurensis [26, 50]. • Hợp chất Scandenin: 42
  52. Hình 4.4: Minh họa 2 chiều tương tác của Scandenin với trung tâm hoạt động của CAII Hợp chất Scandenin không có liên kết hydro nhưng có liên kết kỵ nước với Trp209, Val207, His119, Val143, His94, Pro202, Val135, Leu198, Val121. Năng lượng liên kết với đích tác dụng ∆G = -8.5 kCal/mol. Scandenin, một dẫn xuất coumarin được xác định là thành phần hóa học quan trọng được chiết xuất từ cây Cóc kèn leo. Cóc kèn, tên khoa học Derris scandens Benth, (họ Đậu Fabaceae). Scandenin đã được chiết xuất và xác định trong rễ và thân của cây. Hiện nay, Scandenin mới chỉ được phát hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh [25]. • Hợp chất Frutinone A: 43
  53. Hình 4.5: Minh họa 2 chiều tương tác của Frutinone A với trung tâm hoạt động của CAII Hợp chất Frutinone A có liên kết hydro với Tyr7 và có liên kết kỵ nước với Glu239, Asn11. Năng lượng liên kết với đích tác dụng ∆G = -8.7 kCal/mol. Frutinone A được phân lập từ chiết xuất ưa mỡ của cây bụi thuộc chi Polygala (chi Viễn chí), Polygala fruticosa và từ rễ và các bộ phận tiếp xúc với không khí của hai loài châu Phi khác là P. gazensis Bak và P. teretifolia L. Frutinone A cho thấy hoạt tính kháng nấm và thể hiện hoạt tính ức chế mạnh đối với enzym CYP1A2 [54, 61]. Từ các thông tin trên cho thấy, các nghiên cứu về khả năng điều trị Tăng huyết áp của 5 hợp chất còn rất ít (chỉ có Imperatorin đã có một số nghiên cứu). Bên cạnh đó, các nhóm chất hay các dược liệu chứa các hợp chất khác khá phổ biến. Đây sẽ là một hướng đi mới mà từ khóa luận này có thể phát triển tiếp. 44
  54. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Sau thời gian nghiên cứu, đề tài đã đạt được mục tiêu đề ra và đã có được những kết quả nhất định. Từ kết quả này, em rút ra kết luận sau: - Đã sàng lọc ra 8 hợp chất tự nhiên coumarin trong tổng số 50 hợp chất có tác dụng ức chế CAII bằng phương pháp docking. Những hợp chất đó bao gồm Callophyllolid; Imperatorin; Khellactone; Scandenin; Frutinone A; Novobiocin; Chartreusin; 3''- Demethylchartreusin. - Đã tìm ra 5 hợp chất có tiềm năng nhất sau khi sử dụng Quy tắc Lipinski 5 và ADMET, đó là Callophyllolid; Khellactone; Scandenin; Frutinone A và Imperatorin — một chất đã được chứng minh có tác dụng điều trị bệnh tăng huyết áp. Kiến nghị: Kết quả của khóa luận này dựa trên việc sàng lọc ảo bằng việc sử dụng phần mềm trên máy tính nên khó tránh khỏi ít nhiều khác biệt với kết quả thực tế. Để tiếp tục phát triển kết quả của khóa luận, đồng thời tăng tính ứng dụng và tính chính xác cho nghiên cứu cần: - Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm chuyên sâu trên đích của các hợp chất đã sàng lọc được trên mô hình tế bào in vivo, in vitro. - Tiến hành thêm nghiên cứu về các nhóm hợp chất khác hay dược liệu điều trị tăng huyết áp. 45
  55. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Bộ Y tế (2010), "Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị tăng huyết áp". 2. tế, Bộ Y (2012), Báo cáo kết quả đề tài nghiên cứu các yếu tố nguy cơ của một số bệnh không lây nhiễm tại 8 tỉnh/thành phố của Việt Nam, Đề tài nghiên cứu khoa học cấp bộHà Nội 3. Bộ môn Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội (2016), Thực trạng nghiên cứu phát triển dược liệu của Việt Nam và trên thế giới. 4. Nguyễn Văn Đạt (2017), Tổng quan về vai trò của hợp chất tự nhiên trong nghiên cứu và phát triển thuốc mới, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội. 5. GS. TS. Phạm Thị Minh Đức (2017), Sinh lý học (Sách đào tạo Bác sĩ đa khoa), Bộ Y tế, Nhà xuất bản Y học, TP. Hà Nội. 6. PGS.TS Nguyễn Thị Dung (2019), Quản lý và điều trị bệnh nhân tăng huyết áp tại y tế cơ sở, chủ biên. 7. Hà Minh Hiển (2014), Nghiên cứu xác định hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả mù u để ứng dụng trong kiểm nghiệm, Luận án tiến sĩ dược học, Trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh, TP. Hồ Chí Minh. 8. Hội Tim mạch Quốc gia Việt Nam (2018), Khuyến cáo về chẩn đoán và điều trị Tăng huyết áp. 9. PGS. TS Lê Thị Luyến (2010), Bệnh học (Sách đào tạo DSĐH), Bộ Y tế, NXB Y học. 10. Trần Thị Ngần, Phan Văn Chung, Huỳnh Ngọc Thụy (2011), "Phân lập và xây dựng quy trình định lượng đồng thời imperatorin và isoimperatorin trong rễ bạch chỉ Radix Angelicae dahuricae bằng HPLC/PDA", Tạp chí Dược liệu số 6- Tập 16, tr. 395- 402. 11. Nguyễn Quang Tuấn (2004), Chẩn đoán và điều trị tăng huyết áp, Nhà xuất bản Y học.
  56. Tiếng Anh 12. Aldo Jongejan, Chris de Graaf, Nico P. E. Vermeulen, Rob Leurs, Iwan J. P. de Esch (2005), "The role and application of in silico docking in chemical genomics research", Chemical Genomics, Springer, tr. 63-91. 13. B Jayaram, Tanya Singh, Goutam Mukherjee, Abhinav Mathur, Shashank Shekhar, & Vandana Shekhar (2012), Sanjeevini: a freely accessible web-server for target directed lead molecule discovery, BMC bioinformatics, Springer, tr. 1- 13. 14. Belgin Sever, Cüneyt Türkeş, Mehlika Dilek Altıntop, Yeliz Demir, ŞükrüBeydemir (2020), "Thiazolyl-pyrazoline derivatives: In vitro and in silico evaluation as potential acetylcholinesterase and carbonic anhydrase inhibitors", International Journal of Biological Macromolecules. 163, tr. 1970-1988. 15. Bengt-Harald Jonsson, and Anders Liljas (2020), "Perspectives on the classical enzyme carbonic anhydrase and the search for inhibitors", Biophysical Journal. 119(7), tr. 1275-1280. 16. Bryan Williams, Giuseppe Mancia, Wilko Spiering, Enrico Agabiti Rosei, Michel Azizi, Michel Burnier (2018), "2018 ESC/ESH Guidelines for the management of arterial hypertension: The Task Force for the management of arterial hypertension of the European Society of Cardiology (ESC) and the European Society of Hypertension (ESH)", European heart journal. 39(33), tr. 3021-3104. 17. Bryan Williams, Giuseppe Mancia, Wilko Spiering, Enrico Agabiti Rosei, Michel Azizi, Michel Burnier (2018), "2018 Practice Guidelines for the management of arterial hypertension of the European Society of Cardiology and the European Society of Hypertension", Blood pressure. 27(6), tr. 314-340. 18. Christopher A. Lipinski (2004), "Lead-and drug-like compounds: the rule-of- five revolution", Drug Discovery Today: Technologies. 1(4), tr. 337-341. 19. Desmond MacLeod-Carey, Eduardo Solis-Céspedes, Emilio Lamazares, Karel Mena-Ulecia (2020), "Evaluation of new antihypertensive drugs designed in
  57. silico using Thermolysin as a target", Saudi Pharmaceutical Journal. 28(5), tr. 582-592. 20. Douglas E. V. Pires, Tom L. Blundell, and David B. Ascher (2015), "pkCSM: predicting small-molecule pharmacokinetic and toxicity properties using graph- based signatures", Journal of medicinal chemistry. 58(9), tr. 4066-4072. 21. Douglas E. V. Pires, Lisa M. Kaminskas, David B. Ascher (2018), "Prediction and optimization of pharmacokinetic and toxicity properties of the ligand", Computational Drug Discovery and Design, Springer, tr. 271-284. 22. Evanthia Lionta, George Spyrou, Demetrios K. Vassilatis and Zoe Cournia (2014), "Structure-based virtual screening for drug discovery: principles, applications and recent advances", Current topics in medicinal chemistry. 14(16), tr. 1923-1938. 23. Fabrizio Carta, Claudiu T Supuran (2013), "Diuretics with carbonic anhydrase inhibitory action: a patent and literature review (2005–2013)", Expert opinion on therapeutic patents. 23(6), tr. 681-691. 24. Hans-Dieter Höltje , Gerd Folkers (2008), Molecular Modeling: Basic Principles and Applications, Vol. 5, John Wiley & Sons. 25. Hidayat Hussain, Ahmed Al-Harrasi, Karsten Krohn, Simeon F.Kouam, Ghulam Abbas, Afzal Shah, Muhammad Adil Raees, Riaz Ullah, Shahid Aziz, Barbara Schulz (2015), "Phytochemical investigation and antimicrobial activity of Derris scandens", Journal of King Saud University-Science. 27(4), tr. 375-378. 26. Hyeong-Kyu Lee, Sei-Ryang Oh, Ok-Kyoung Kwon, Kyoung-Seop Ahn, Joongku Lee, Jin-Cheol Kim, Byung-Sun Min, Hyouk Joung (2007), "Isolation of coumarins and ferulate from the roots of Angelica purpuraefolia and the antitumor activity of khellactone", Phytotherapy Research: An International Journal Devoted to Pharmacological and Toxicological Evaluation of Natural Product Derivatives. 21(5), tr. 406-409. 27. Iranshahi Mehrdad, Askari M., Sahebkar A., Hadjipavlou Litina D (2009), "Evaluation of antioxidant, anti-inflammatory and lipoxygenase inhibitory activities of the prenylated coumarin umbelliprenin".
  58. 28. J. A. R. Mead, J. N. Smith, R. T. Williams (1958), "Studies in detoxication. 72. The metabolism of coumarin and of o-coumaric acid", Biochemical Journal. 68(1), tr. 67-74. 29. Jamshed Iqbal, Mariya Al-Rashida, Serdar Durdagi, Vincenzo Alterio, Anna Di Fiore, (2015), Recent developments of carbonic anhydrase inhibitors as potential drugs, chủ biên, NXB Hindawi. 30. Jerome de Ruyck, Guillaume Brysbaert, Ralf Blossey, Marc F Lensink (2016), "Molecular docking as a popular tool in drug design, an in silico travel", Advances and applications in bioinformatics and chemistry: AABC. 9, tr. 1. 31. K. N. Venugopala , V. Rashmi, and B. Odhav (2013), "Review on natural coumarin lead compounds for their pharmacological activity", BioMed research international. 2013. 32. K.C. Nicolaou (2014), "Advancing the drug discovery and development process", Angewandte Chemie. 126(35), tr. 9280-9292. 33. Laurent Bertoletti, Valentine Mismetti, George Giannakoulas (2020), "Use of anticoagulants in patients with pulmonary hypertension", Hämostaseologie. 40(03), tr. 348-355. 34. Lopez-Vallejo, Fabian; Caulfield, Thomas; Martinez-Mayorga, Karina; A. Giulianotti, Marc; Nefzi, Adel; A. Houghten, Richard; L. Medina-Franco, Jose (2011), "Integrating virtual screening and combinatorial chemistry for accelerated drug discovery", Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 14(6), tr. 475-487. 35. Maciej Jakubowski, Ewa Szahidewicz-Krupska, Adrian Doroszko (2018), "The human carbonic anhydrase II in platelets: An underestimated field of its activity", BioMed research international. 2018. 36. Maria RosaBuemi, AnnaDi Fiore, LauraDe Luca, Andrea Angeli, Francesca Mancuso, Stefania Ferro, Simona Maria Monti, MartinaBuonanno, EmilioRusso, Giovanbattista De Sarro, Giuseppina De Simone, Claudiu T.Supuran, Rosaria Gitto (2019), "Exploring structural properties of potent human carbonic anhydrase inhibitors bearing a 4-(cycloalkylamino-1-carbonyl)
  59. benzenesulfonamide moiety", European journal of medicinal chemistry. 163, tr. 443-452. 37. Michael P. Pollastri (2010), "Overview on the Rule of Five", Current protocols in pharmacology. 49(1), tr. 9-12. 38. Michel Azizi, Patrick Rossignol, Jean-Sébastien Hulot, (2019), "Emerging drug classes and their potential use in hypertension", Hypertension. 74(5), tr. 1075- 1083. 39. Mohammad Rizki Fadhil Pratama, Hadi Poerwono, Siswandono Siswodiharjo (2019), "ADMET properties of novel 5-O-benzoylpinostrobin derivatives", J Basic Clin Physiol Pharmacol. 30(6). 40. Morgado Manuel, Sandra Rolo and Miguel Castelo Braco (2011), "Pharmacist intervention program to enhance hypertension control: a ramdomised controlled trial", Int J Clin Pharm. 33, tr. 13-140. 41. Muhammad Ilyas (1985), "Cardiovascular Medicine Islamic heritage: concepts and contributions", circulation. 1, tr. 8. 42. Neil R Poulter, Dorairaj Prabhakaran, Mark Caulfi eld (2015), "Hypertension", Lancet. 386(9995), tr. 801-12. 43. P.E.Nguelefack-Mbuyo, T.B.Nguelefack, A.B.Dongmo, S.Afkir, A.G.B.Azebaze, T.Dimo, A.Legssyer, A.Kamanyi, A.Ziyyat (2008), "Anti- hypertensive effects of the methanol/methylene chloride stem bark extract of Mammea africana in L-NAME-induced hypertensive rats", Journal of Ethnopharmacology. 117(3), tr. 446-450. 44. Patricia M Kearney, Megan Whelton, BSa, and et al (2005), "Global burden of hypertension: analysis of worldwide data", Lancet. 365, tr. 217-223. 45. Pham-The, Hai; Cabrera-Pérez, Miguel Á.; Nam, Nguyen-Hai; Castillo-Garit, Juan A.; Rasulev, Bakhtiyor; Le-Thi-Thu, Huong; Casañola-Martin, Gerardo M. (2018), "In Silico assessment of ADME properties: advances in Caco-2 cell monolayer permeability modeling", Current topics in medicinal chemistry. 18(26), tr. 2209-2229.
  60. 46. PT Son, Quang NN, Viet NL, Khai PG, Wall S, Weinehall L, Bonita R and Byass P (2012), "Prevalence, awareness, treatment and control of hypertension in Vietnam-results from a national survey", J Hum Hypertens. 26(4), tr. 268- 280. 47. R B Arora, C N Mathur, S D S Seth (1962), "Calophyllolide, a complex coumarin anticoagulant from Calophyllum inophyllum Linn", The Journal of pharmacy and pharmacology. 14, tr. 534-535. 48. Richard C.Mohs và Nigel H.Greig (2017), "Drug discovery and development: Role of basic biological research", Alzheimer's & Dementia: Translational Research & Clinical Interventions. 3(4), tr. 651-657. 49. Rocío Sancho, Nieves Márquez, Marta Gómez-Gonzalo, Marco A.Calzado, Giorgio Bettoni, Maria Teresa Coira, José Alcamí, Manuel López-Cabrera, Giovanni Appendino, Eduardo Muñoz (2004), "Imperatorin inhibits HIV-1 replication through an Sp1-dependent pathway", Journal of Biological Chemistry. 279(36), tr. 37349-37359. 50. Samil Jung, Hyung-In Moon, Beom Suk Lee, Subeen Kim, Nguyen Thi Ngoc Quynh, Jimin Yu, Dan-Diem Thi Le, Zolzaya Sandag, Hyegyeong Lee, Hyojeong Lee, Nguyen Hai Anh, Young Yang, Jong-Seok Lim, Keun-Il Kim, Myeong-Sok Lee (2018), "Anti-cancerous effect of cis-khellactone from Angelica amurensis through the induction of three programmed cell deaths", Oncotarget. 9(24), tr. 16744. 51. Satyajit D. Sarker, Lutfun Nahar (2017), "Progress in the chemistry of naturally occurring coumarins", Progress in the Chemistry of Organic Natural Products 106, tr. 241-304. 52. Supratik Kar & Jerzy Leszczynski (2020), "Open access in silico tools to predict the ADMET profiling of drug candidates", Expert Opinion on Drug Discovery. 15(12), tr. 1473-1487. 53. Susan C.Frost (2014), "Physiological functions of the alpha class of carbonic anhydrases", Carbonic anhydrase: mechanism, regulation, links to disease, and industrial applications, tr. 9-30.
  61. 54. Susana Johann, Beatriz G. Mendes, Fabiana C. Missau, Maria A. de Resende, Moacir G. Pizzolatti (2011), "Antifungal activity of five species of Polygala", Braz J Microbiol. 42(3), tr. 1065-75. 55. Sven Grüneberg, Milton T. Stubbs, and Gerhard Klebe (2002), "Successful virtual screening for novel inhibitors of human carbonic anhydrase: strategy and experimental confirmation", J Med Chem. 45(17), tr. 3588-602. 56. Vincent Zoete, Aurélien Grosdidier, Olivier Michielin (2009), "Docking, virtual high throughput screening and in silico fragment-based drug design", J Cell Mol Med. 13(2), tr. 238-48. 57. WHO (World Health Organization) (2021), Hypertension, 58. World Health Organization (2013), "World Health Day: A global brief on hypertension. Silent killer, global public health crisis", World Health Organization, tr. 1-36. 59. Yanjun Cao, Yanmin Zhang, Nan Wang, Langchong He (2014), "Antioxidant effect of imperatorin from Angelica dahurica in hypertension via inhibiting NADPH oxidase activation and MAPK pathway", J Am Soc Hypertens. 8(8), tr. 527-36. 60. Yong Soo Kwon, Won Gyu Choi, Won Jun Kim, Woo Kyung cKim, Myong Jo Kim, Won Hee Kang, Chang Min Kim (2002), "Antimicrobial constituents of Foeniculum vulgare", Arch Pharm Res. 25(2), tr. 154-7. 61. Yongje Shin, Changho Yoo, Youngtaek Moon, Prof. Yunho Lee, Prof. Sungwoo Hong (2015), "Efficient synthesis of frutinone A and its derivatives through palladium-catalyzed C - H activation/carbonylation", Chem Asian J. 10(4), tr. 878-81. 62. Gaziano TA., Bitton A., Anand S. and Weinstein MC (2009), "The global cost of non-optimal blood pressure", J Hypertension. 27, tr. 1472-1477. 63. Genevieve M Gabb, et al (2016), "Guideline for the diagnosis and management of hypertension in adults—2016", Medical Journal of Australia. 205(2), tr. 85- 89.
  62. 64. Cemal Ozemek, Stephanie Tiwari, Ahmad Sabbahi, Salvatore Carbone, Carl J.Lavie (2020), "Impact of therapeutic lifestyle changes in resistant hypertension", Progress in cardiovascular diseases. 63(1), tr. 4-9.