Khóa luận Phân tích định tính thành phần hoá học và tác dụng bảo vệ tế bào của cao chiết cây Xấu hổ (Mimosa pudica Linn.) do methyl glyoxal gây ra

Nội dung text: Khóa luận Phân tích định tính thành phần hoá học và tác dụng bảo vệ tế bào của cao chiết cây Xấu hổ (Mimosa pudica Linn.) do methyl glyoxal gây ra

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN THỊ NGỌC HUYỀN PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO CỦA CAO CHIẾT CÂY XẤU HỔ (Mimosa pudica Linn.) DO METHYL GLYOXAL GÂY RA KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2021
2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN THỊ NGỌC HUYỀN PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO CỦA CAO CHIẾT CÂY XẤU HỔ (Mimosa pudica Linn.) DO METHYL GLYOXAL GÂY RA KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHOÁ: QH.2016.Y Người hướng dẫn 1: ThS. PHẠM THỊ LAN Người hướng dẫn 2: PGS.TS. BÙI THANH TÙNG Hà Nội – 2021
3. LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu và toàn thể các giảng viên tại Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội lời cảm ơn chân thành vì sự tâm huyết, trách nhiệm và lòng nhiệt thành đã thiết kế và xây dựng chương trình đào tạo thực sự hiệu quả, trong đó bao gồm Khoá luận hoàn thành tốt nghiệp. Là một sinh viên ngành Dược học của Trường Đại học Y Dược khoá QH.2016.Y, tôi vô cùng biết ơn và tự hào khi được tham gia nghiên cứu và hoàn thành Khoá luận với đề tài “ Phân tích định tính thành phần hoá học và tác dụng bảo vệ tế bào của cao chiết cây Xấu hổ (Mimosa pudica Linn.) do methyl glyoxal gây ra”. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Th.S. Phạm Thị Lan và PGS.TS. Bùi Thanh Tùng với những định hướng rõ ràng cùng sự chỉ dẫn cụ thể trong vai trò là giảng viên hướng dẫn trực tiếp của tôi. Cùng với đó là sự giúp đỡ nhiệt tình của các giảng viên, cán bộ nhân viên tại Viện Dược liệu, Khoa Hoá-Đại học Khoa Học Tự Nhiên và Trường Đại học Gachon, Hàn Quốc để tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài Khoá luận tốt nghiệp này. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè, những người luôn đồng hành, động viên và khích lệ tôi trong suốt quá trình hoàn thành đề tài Khoá luận. Với sự tập trung và cố gắng hết mình, tôi thực sự tự tin với Khoá luận đã hoàn thành, mặc dù vậy vẫn khó tránh khỏi những hạn chế và thiếu sót cần bổ sung. Do đó, tôi rất mong sẽ nhận được những nhận xét, đánh giá và góp ý của quý thầy cô để Khoá luận được hoàn thiện hơn nữa. Hà Nội tháng 5 năm 2021 Tác giả khoá luận Nguyễn Thị Ngọc Huyền
4. DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT AG Aminoguanidine AGEs Advanced glycation end products AMPK 5' adenosine monophosphate-activated protein kinase BSA Bovine serum albumin ĐTĐ Đái tháo đường EtOH Ethanol GLO1 Glyoxalase 1 Tế bào nội mô tĩnh mạch rốn người HUVECs (Human umbilical vein endothelial cells) Nồng độ ức chế 50% IC50 (Inhibitory concentration 50%) Sắc ký lỏng khối phổ LC/MS (Liquid chromatography-mass spectrometry) MGO Methyl glyoxal MGO-Hs Methyl glyoxal-derived hydroimidazolone 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium MTT bromide PTP1B Protein tyrosine phosphatase 1B RAGE Thụ thể của AGEs (Receptor for AGEs) α-glucosidase Alpha-glucosidase
5. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình Tên Trang 1.1. Sự hình thành MGO và AGEs trong đái tháo đường type 2. 12 2.1. Cây Xấu hổ. 17 2.2. Sơ đồ cấu tạo đơn giản của hệ thống sắc ký lỏng khối phổ. 19 2.3. Nguyên lý của phương pháp MTT. 21 3.1 Cấu trúc hoá học của các hợp chất trong cây Xấu hổ. 26 Khả năng sống sót của tế bào khi được xử lý với cao chiết 3.2. cây Xấu hổ ở các nồng độ khác nhau trước khi tiếp xúc với 27 MGO. Khả năng ức chế sự hình thành AGEs do MGO ở các nồng 3.3. 28 độ khác nhau của cao chiết cây Xấu hổ.
6. DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng Tên Trang 1.1. Nguyên nhân ĐTĐ nguyên phát. 4 2.1. Thông số chạy mẫu trong quá trình sắc ký lỏng. 21 2.2. Các điều kiện tại nguồn ion hoá trong thiết bị khối phổ. 21 3.1. Các hợp chất được xác định trong cao chiết cây Xấu hổ. 26
7. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về bệnh đái tháo đường 3 1.1.1. Khái niệm 3 1.1.2. Phân loại đái tháo đường 3 1.1.3. Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh của đái tháo đường típ 2 4 1.1.4. Các biến chứng của bệnh 5 1.2. Một số đích phân tử trong điều trị đái tháo đường típ 2 6 1.2.1. 5' adenosine monophosphate-activated protein kinase 6 1.2.2. Alpha-glucosidase 6 1.2.3. Protein tyrosine phosphatase 1B 7 1.2.4. Advanced glycation end products 8 1.3. Methyl glyoxal và sự gây độc cho tế bào biểu hiện trong bệnh đái tháo đường 9 1.3.1 Methyl glyoxal và sự hình thành các AGEs 9 1.3.2. Những hậu quả do MGO biểu hiện trong đái tháo đường 10 1.3.3. Một số phương pháp ức chế sự hình thành AGEs liên quan tới MGO 12 1.4. Tổng quan về cây Xấu hổ 13 1.4.1. Vị trí phân loại 13 1.4.2. Đặc điểm thực vật và phân bố 14 1.4.3. Tác dụng dược lý 14
8. 1.4.4. Một số nghiên cứu về các tác dụng điều trị đái tháo đường của cây Xấu hổ. 15 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 17 2.1.1. Mẫu nghiên cứu 17 2.1.2. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 17 2.1.3. Hoá chất, dung môi và các cơ chất tham gia phản ứng 18 2.1.4. Thiết bị, dụng cụ 18 2.2. Nội dung nghiên cứu 19 2.3. Phương pháp nghiên cứu 19 2.3.1. Phương pháp định tính các thành phần hoá học trong cao chiết cây Xấu hổ bằng phương pháp LC/MS 19 2.3.2. Phương pháp đánh giá khả năng sống sót của tế bào với độc tính do MGO sau khi xử lý với cao chiết cây Xấu hổ 22 2.3.3. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế sự hình thành AGEs do MGO gây ra của cao chiết cây Xấu hổ 23 2.4. Phương pháp xử lý số liệu 24 Chương 3. KẾT QUẢ 25 3.1. Kết quả định tính các thành phần hoá học trong cao chiết ethanol của cây Xấu hổ 25 3.2. Kết quả đánh giá khả năng sống sót của tế bào với độc tính của MGO sau khi được xử lý với cao chiết cây Xấu hổ 28 3.3. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế MGO hình thành AGEs của cao chiết cây Xấu hổ 29 Chương 4. BÀN LUẬN 30 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 32
9. MỞ ĐẦU Đái tháo đường là một trong những bệnh không lây nhiễm phổ biến trên toàn cầu. Trên toàn thế giới có 415 triệu người lớn (độ tuổi 20-79) tương đương 1 trong 11 người lớn đang sống với bệnh đái tháo đường trong năm 2015. Dự đoán vào năm 2040, con số này sẽ tăng tới khoảng 642 triệu người, hay nói cách khác 1 người trong 10 người lớn sẽ có bệnh đái tháo đường. Nhiều người đang sống với bệnh ĐTĐ típ 2 trong một thời gian dài mà không nhận biết được tình trạng bệnh của họ. Đến khi được chẩn đoán, thường đã kèm theo biến chứng của bệnh. Tại Việt Nam, vào năm 2015 đã có 3,5 triệu người mắc bệnh theo báo cáo của Hiệp hội Đái tháo đường thế giới IDF Diabetes Atlas và con số này được dự báo sẽ tăng lên 6,1 triệu vào năm 2040. Trước mức độ phổ biến và sức ảnh hưởng của đái tháo đường, rất nhiều nghiên cứu đã và đang được tiến hành với mục tiêu phát triển các loại thuốc cho tác dụng điều trị hiệu quả và hạn chế tối đa các tác dụng phụ lên người bệnh. Tuy nhiên, hiện nay các loại thuốc điều trị đái tháo đường vẫn gây ra những tác dụng phụ đáng kể trên bệnh nhân khi sử dụng trong thời gian dài. Do đó, việc nghiên cứu và tìm ra những hoạt chất tiềm năng trong phát triển thuốc mới hiệu quả hơn, ít tác dụng phụ hơn vẫn vô cùng quan trọng và cần thiết. Song song với quá trình tìm ra thuốc mới từ các phản ứng hoá học tổng hợp, xu hướng nghiên cứu và phát triển thuốc từ chính các nguồn dược liệu trong tự nhiên cũng phát triển mạnh mẽ và có những kết quả vượt trội được minh chứng qua các dược chất đã được phát minh và ứng dụng rộng rãi trên lâm sàng. Cây Xấu hổ (Mimosa pudica Linn.) là một loại cây cỏ đã rất quen thuộc tại Việt Nam và một số nước ở khu vực và cũng được biết đến với các tác dụng chữa bệnh khác nhau. Một số nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy cây Xấu hổ có tác dụng chống viêm, kháng khuẩn, đặc biệt là khả năng làm giảm đường huyết và các biểu hiện khác của bệnh đái tháo đường. Tại Việt Nam, các kết quả nghiên cứu về cây Xấu hổ cho mục đích điều trị đái tháo đường vẫn chưa có nhiều dù loại cây này rất phổ biến, dễ bắt gặp ở bất cứ đâu. Vì vậy, đề tài nghiên 1
10. cứu khoa học: “ Phân tích định tính thành phần hoá học và tác dụng bảo vệ tế bào của cao chiết cây Xấu hổ (Mimosa pudica Linn.) do methyl glyoxal gây ra” được thực hiện với các mục tiêu sau: 1. Định tính các hợp chất có trong cao chiết cây Xấu hổ (Mimosa pudica Linn.) bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS. 2. Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào của cao chiết cây Xấu hổ (Mimosa pudica Linn.) thông qua: - Khả năng sống sót của tế bào với độc tính của MGO sau khi được xử lý với cao chiết cây Xấu hổ - Tác dụng ức chế MGO hình thành AGEs của cao chiết cây Xấu hổ 2
11. Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về bệnh đái tháo đường 1.1.1. Khái niệm Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) là bệnh rối loạn chuyển hoá không đồng nhất, có đặc điểm tăng đường huyết do khiếm khuyết về tiết insulin, về tác động của insulin, hoặc cả hai. Tăng glucose mạn tính trong thời gian dài gây nên những rối loạn chuyển hoá carbohydrat, protid, lipid, gây tổn thương ở nhiều cơ quan khác nhau, đặc biệt ở tim và mạch máu, thận, mắt, thần kinh [1]. 1.1.2. Phân loại đái tháo đường Đái tháo đường típ 1 ĐTĐ típ 1 do tế bào beta bị phá hủy nên bệnh nhân không còn hoặc còn rất ít insulin, 95% do cơ chế tự miễn (típ 1A), 5% vô căn (típ1 B). Bệnh nhân bị thiếu hụt insulin, tăng glucagon trong máu, không điều trị sẽ bị nhiễm toan ceton. Bệnh có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi nhưng chủ yếu ở trẻ em và thanh thiếu niên. Bệnh nhân cần insulin để ổn định glucose huyết. Đái tháo đường típ 2 ĐTĐ típ 2 trước kia được gọi là ĐTĐ của người lớn tuổi hay ĐTĐ không phụ thuộc insulin, chiếm 90-95% các trường hợp ĐTĐ. Thể bệnh này bao gồm những người có thiếu insulin tương đối cùng với đề kháng insulin. Bệnh nhân không có sự phá hủy tế bào beta do tự miễn, không có kháng thể tự miễn trong máu. Đa số bệnh nhân có béo phì hoặc thừa cân và/hoặc béo phì vùng bụng với vòng eo to. Béo phì nhất là béo phì vùng bụng có liên quan với tăng acid béo trong máu, mô mỡ cũng tiết ra một số hormon làm giảm tác dụng của insulin ở các cơ quan đích như gan, tế bào mỡ, tế bào cơ (đề kháng insulin tại các cơ quan đích). Do tình trạng đề kháng insulin, ở giai đoạn đầu tế bào beta bù trừ và tăng tiết insulin trong máu, nếu tình trạng đề kháng insulin kéo dài hoặc nặng dần, tế bào beta sẽ không tiết đủ insulin và ĐTĐ típ 2 lâm sàng sẽ xuất hiện. 3
12. Bảng 1.1. Nguyên nhân ĐTĐ nguyên phát. Các ngyên nhân ĐTĐ típ 1 ĐTĐ típ 2 Tiền sử gia đình Kháng nguyên HLA- Đặc tính dân tộc Yếu tố nguy cơ DR3, HLA-DR4 Ăn nhiều, ít tập luyện thể dục Nhiễm độc Nhiễm virus Béo phì Yếu tố khởi phát Stress chuyển hoá Stress chuyển hoá Các tế bào tại đảo tuỵ thoái Phá huỷ đảo tuỵ theo cơ Yếu tố bệnh sinh hoá/suy yếu dần chế tự miễn Giảm receptor insulin Đái tháo đường thai kỳ ĐTĐ được chẩn đoán trong 3 tháng giữa thai kỳ hoặc 3 tháng cuối của thai kỳ và không có bằng chứng về ĐTĐ típ 1, típ 2 trước đó. Thể bệnh chuyên biệt của ĐTĐ Thể chuyên biệt của ĐTĐ hay ĐTĐ thứ phát do các nguyên nhân khác, như ĐTĐ sơ sinh hoặc ĐTĐ do sử dụng thuốc và hoá chất như sử dụng glucocorticoid, điều trị HIV/AIDS hoặc sau cấy ghép mô [1,2,3]. 1.1.3. Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh của đái tháo đường típ 2 Nguyên nhân Đặc điểm lớn nhất trong sinh lý bệnh của đái tháo đường típ 2 là có sự tương tác giữa yếu tố gen và môi trường. - Yếu tố di truyền. - Yếu tố môi trường: đây là nhóm các yếu tố có thể can thiệp để làm giảm tỷ lệ mắc bệnh. Các yếu tố đó là: + Sự thay đổi lối sống: như giảm các hoạt động thể lực; thay đổi chế độ ăn uống theo hướng tăng tinh bột, giảm chất xơ gây dư thừa năng lượng. 4
13. + Chất lượng thực phẩm + Các stress - Tuổi thọ ngày càng tăng, nguy cơ mắc bệnh càng cao: Đây là yếu tố không thể can thiệp được. Cơ chế bệnh sinh - Suy giảm chức năng tế bào beta và kháng insulin -Tình trạng thừa cân, béo phì, ít hoạt động thể lực, là những đặc điểm thường thấy ở người đái tháo đường típ 2 có kháng insulin. Tăng insulin máu, kháng insulin còn gặp ở người tiền đái tháo đường, tăng huyết áp vô căn, người mắc hội chứng chuyển hoá. Người đái tháo đường típ 2 bên cạnh kháng insulin còn có thiếu insulin – đặc biệt khi lượng glucose huyết tương khi đói trên 10,0 mmol/L [4]. 1.1.4. Các biến chứng của bệnh Các biến chứng của bệnh đái tháo đường típ 2 có những đặc điểm liên quan mật thiết đến quá trình phát sinh và tiến triển của bệnh. Về phân loại biến chứng, có thể phân ra các biến chứng cấp tính và mạn tính. Các biến chứng cấp tính: + Hôn mê nhiễm toan ceton: là một biến chứng đặc trưng bởi những rối loạn nặng nề trong chuyển hoá carbonhydrat, protein và lipid do thiếu insulin, gây nên sự nguy hiểm tức thời đến tính mạng người bệnh nên cần phải được theo dõi tại các khoa điều trị tích cực. + Hạ glucose máu: nguyên nhân có thể do tăng bài tiết insulin (chất có tác dụng ức chế sản xuất glucose tại gan, kích thích tiêu thụ glucose ở cơ vân và mô mỡ), tình trạng giảm tiếp nhận thức ăn hoặc tăng mức độ luyện tập (làm tăng sử dụng glucose ở cơ vân) + Hôn mê tăng glucose máu không nhiễm toan ceton: có nhiều điểm giống với hôn mê nhiễm toan ceton, khác biệt chủ yếu là tăng glucose máu, mất nước và rối loạn điện giải, có thể phân biệt là không có thể ceton hoặc có rất ít trong nước tiểu 5
14. + Hôn mê nhiễm toan Lactic + Các bệnh nhiễm trùng cấp Các biến chứng mạn tính: được chia ra bệnh mạch máu lớn và nhỏ hoặc theo cơ quan bị tổn thương ( VD: bệnh thận do đái tháo đường, bệnh võng mạc do đái tháo đường, bệnh thần kinh do đái tháo đường ) [1,4]. 1.2. Một số đích phân tử trong điều trị đái tháo đường típ 2 Cơ chế bệnh sinh của bệnh ĐTĐ típ 2 gắn liền với sự đề kháng insulin và suy giảm chức năng của tế bào beta tại tuyến tuỵ. Nhiều nguyên nhân ở cấp độ phân tử dẫn đến tình trạng trên đã được nghiên cứu như các đích tác dụng để phát triển các thuốc sử dụng rộng rãi trong điều trị đái tháo đường, có thể kể đến như: 1.2.1. 5' adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) AMPK là một phân tử cảm thụ năng lượng tế bào (cellular energy sensor), tương tác với các tín hiệu liên quan tới hoạt động sinh lý, hóc- môn và dinh dưỡng của tế bào để cân bằng sự sản sinh adenosine triphosphate. AMPK điều hoà hoạt động đồng hoá năng lượng thông qua sự phosphoryl hoá của nhiều cơ chất khác nhau và tham gia vào hầu hết các con đường chuyển hoá của tế bào, được biết đến như một đích phân tử cho các thuốc điều trị đái tháo đường [13]. Metformin là loại thuốc được sử dụng phổ biến với những hiệu quả rõ ràng liên quan tới chuyển hoá glucose và các biến chứng đái tháo đường. Cơ chế tác dụng của metformin qua cả hai con đường phụ thuộc AMPK và không phụ thuộc AMPK dựa trên sự ức chế quá trình hô hấp tại ti thể, cũng có thể bao gồm ức chế glycerophosphate dehydrogenase và quá trình liên quan tới lysosome [14]. 1.2.2. Alpha-glucosidase (α-glucosidase) Các enzyme chuyển hoá carbohydrate tại ruột non có khả năng phân cắt các chuỗi polysaccharide thành các monosaccharide đơn giản để có thể hấp thu được. Trong số đó, các enzyme α-glucosidase đóng vai trò quan trọng trong việc phá vỡ liên kết glucopyranoside ở các oligosaccharide và disaccharide để giải phóng các monosaccharide là dạng được hấp thu vào cơ thể, do đó các enzyme 6
15. này tham gia điều hoà lượng glucose và sự tăng đường huyết sau ăn. Sự ức chế hoạt động của α-glucosidase là một mục tiêu căn bản trong việc nghiên cứu và phát triển nhiều loại thuốc mới hiệu quả và ít độc tính hơn. Các chất ức chế α-glucosidase tham gia điều chỉnh tình trạng tăng đường huyết mà không tác động trực tiếp lên sự bài tiết insulin được biết đến là các thuốc đường uống làm giảm đường huyết thế hệ đầu tiên, có thể sử dụng theo phương pháp đơn trị liệu hoặc liệu pháp kết hợp với insulin và các thuốc khác. Hiện tại sử dụng trong lâm sàng là các carbohydrate tương tự acarbose, voglibose và miglitol có khả năng liên kết thuận nghịch với α-glucosidase và ngăn chặn quá trình phân giải saccharide [15]. 1.2.3. Protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) Quá trình phosphoryl hoá tyrosine của các protein trong cơ thể là một trong những cơ chế quan trọng nhất liên quan tới kiểm soát sự sinh trưởng và biệt hoá tế bào cũng như điều chỉnh các chức năng của tế bào. Đây là một quá trình thuận nghịch được chi phối bởi các hoạt động tương phản giữa protein tyrosine phosphatases (PTPs) chịu trách nhiệm cho quá trình đề phosphoryl hoá và protein tyrosine kinases (PTKs) có vai trò trong quá trình phosphoryl hoá. Sự sai lệch và thiếu sót trong hoạt động của PTPs và PTKs gây ra sự bất thường của quá trình phosphoryl hoá là nguyên nhân dẫn tới một số bệnh như đái tháo đường, các hội chứng viêm và ung thư. PTP1B thuộc nhóm các PTPs nội bào tham gia vào quá trình điều hoà ngược insulin (negative insulin regulation) và tập hợp các tín hiệu liên quan tới leptin (leptin signal system). Cụ thể là PTP1B xúc tác sự phosphoryl hoá các gốc tyrosine (tyrosine residues) của phức hệ hoạt hoá thụ thể insulin b (activated insulin receptor b subunit) và cơ chất hình thành thụ thể insulin 1 (insulin receptor substrate-1), do đó ảnh hưởng đáng kể đến thời gian và biên độ của sự đáp ứng giữa tế bào và insulin. Béo phì được biết đến như hội chứng mất kiểm soát cân nặng cơ thể, là một trong những nguyên nhân dẫn tới nhiều căn bệnh chuyển hoá trong đó có đái tháo đường típ 2. Leptin là một hóc-môn dạng peptide ngắn hoạt động tại vùng 7
16. dưới đồi phát đi các tín hiệu liên quan tới việc giảm cảm giác muốn ăn nên giữ vai trò quan trọng trong việc duy trì cân nặng cơ thể. PTP1B tại vùng dưới đồi chịu trách nhiệm cho quá trình đề phosphoryl hoá của các kinase liên kết với thụ thể của leptin, do đó có thể kiểm soát các tín hiệu từ leptin và được xem xét như một đích tác dụng hiệu quả với sự ức chế các tín hiệu từ leptin ở những bệnh nhân béo phì. Những đánh giá tích cực về PTP1B như một đích tác dụng hiệu quả là tiền đề cho sự nghiên cứu phát triển và sản xuất các thuốc ức chế chọn lọc phân tử này sử dụng trong điều trị đái tháo đường và các bệnh chuyển hoá liên quan [16]. 1.2.4. Advanced glycation end products (AGEs) AGEs là tên gọi chung của nhiều sản phẩm hình thành từ các hợp chất Amadori thông qua các phản ứng tách nước, chuyển vị, ngưng tụ và oxi-hoá. Các hợp chất Amadori trước đó là sản phẩm của quá trình ngưng tụ không có sự xúc tác của enzyme (a non-enzymatic condensation reaction) được biết đến là phản ứng Maillard giữa nhóm carbonyl của đường khử (ceton hoặc aldehyd) và nhóm amino của các phân tử protein, lipid và acid nucleic [17-19]. Dưới điều kiện là tăng đường huyết và/hoặc stress oxi-hoá, phản ứng Maillard bắt đầu với sự chuyển đổi của các phức gốc Schiff linh động (reversible Schiff base adducts) thành các sản phẩm tái cấu trúc Amadori dạng liên kết cộng hoá trị ổn định hơn. Sau vài ngày tới vài tuần, các sản phẩm Amadori tiếp tục trải qua các phản ứng tái cấu trúc để hình thành các nhóm chức liên kết chặt chẽ và trở thành các AGEs. Sự hình thành và tích luỹ các AGEs vẫn xảy ra trong quá trình lão hoá theo sinh lý bình thường, tuy nhiên sự kiện này diễn ra với tốc độ nhanh và mạnh hơn ở các bệnh nhân mắc đái tháo đường. AGEs cũng gây ra tổn thương tại các mô liên quan trực tiếp tới các biến chứng mạn tính của đái tháo đường. Một số nghiên cứu khác cho thấy các AGEs có thể làm giảm đáp ứng với insulin ở ngoại vi, tham gia việc phá huỷ các tế bào beta, kích thích sản sinh quá mức các tế bào miễn dịch và gây độc cho tế bào [20]. 8
17. Những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng sự tương tác giữa AGEs và các thụ thể của AGEs (receptor for AGEs-RAGE) làm phát sinh chuỗi phản ứng stress oxy hoá ở nhiều loại tế bào gây ra tình trạng viêm ở hệ thống mạch máu, thúc đẩy sự hoạt động của các đại thực bào và tiểu cầu và hình thành huyết khối. AGEs làm tăng sự bám dính của các tế bào miễn dịch với các tế bào nội mô (endothelial cells) của các vi mạch thông qua sự hoạt động của các phân tử bám dính nội bào và sự hình thành các gốc tự do. Sự tích luỹ của AGEs ở các tế bào ngoại mạch tại võng mạc (retinal pericytes) trong bệnh đái tháo đường ảnh hưởng đáng kể tới chức năng và thời gian tồn tại của loại tế bào này. Tương tác giữa AGE và RAGE thúc đẩy sự sản sinh các gốc tự do dẫn tới sự chết theo chu trình của các tế bào. AGEs cũng gây ra sự kích thích các yếu tố nhân kappa B (nuclear factor-κB,) và hoạt động của Caspase-3 là một enzyme liên quan tới sự chết tế bào. Hơn nữa, sự điều hoà tăng RAGE từ AGEs ở cấp độ phân tử mRNA cũng diễn ra ở các tế bào ngoại mạch thông qua sự sản sinh các gốc tự do nội bào. Vòng lặp điều hoà này lại làm biến đổi các tín hiệu của AGEs gây gia tăng thêm những độc tính lên tế bào [18]. Những độc tính này do AGEs gây ra cũng được tìm thấy trên các loại tế bào khác như tế bào beta tuyến tuỵ, tế bào nội mô và tế bào gian mao mạch tại cầu thận (mesangial cells), [18,19]. 1.3. Methyl glyoxal và sự gây độc cho tế bào biểu hiện trong bệnh đái tháo đường 1.3.1 Methyl glyoxal và sự hình thành các AGEs Methyl glyoxal (MGO), một chất chuyển hoá hoạt động mạnh (highly reactive metabolite), là một tác nhân chính trong việc hình thành các AGEs. Như đã đề cập ở phần trên, sự duy trì nồng độ cao của glucose là nguyên nhân quan trọng nhất trong phản ứng phi enzyme gắn kết cộng hóa trị của đường với protein hoặc lipid (glycation) tạo ra các sản phẩm chứa nhóm chức dị thể (heterogenous group) đã được biết đến là AGEs. Tuy nhiên, glucose chỉ là những phân tử đường hoạt động rất yếu, thực tế thì sự hình thành các AGEs chủ yếu 9
18. đến từ nhiều sản phẩm chuyển hoá của glucose và MGO là một tiền chất chủ yếu (precursor) để tạo thành các AGEs [21]. MGO được chuyển hoá chủ yếu từ quá trình thoái hoá phi enzyme của triose phosphates, glyceraldehyd-3-phosphate và dihydroxyacetone-phosphate. Ngoài ra, MGO cũng được hình thành từ sự oxy hoá của acetone, quá trình dị hoá của threonine và sự thoái hoá của protein. Các phân tử này hoạt động rất mạnh và phần lớn phản ứng với arginine trên phân tử protein tạo thành argpyrimidine, hydroimidazolone (MGO-derived hydroimidazolone, MG-H1, MG-H2, MG-H3) và tetrahydropyrimidine. Trong đó MGO-H1 được coi là các AGE chính tạo thành từ MGO. Vì arginine xuất hiện nhiều trong các chuỗi chức năng của protein nên các AGE này gây ra những hậu quả nghiêm trọng lên sự hoạt động của tế bào. MGO cũng có thể tương tác với Lysine để tạo ra N(epsilon)carboxymethyl-lysine (CML) hoặc N(epsilon) carboxy -ethyl-lysine (CEL) là các loại AGEs khác. Các protein bị thay đổi cấu trúc bởi MGO-Hs và MGO-H1 hoạt động như các phối tử của RAGE dẫn tới sự thiết lập các tín hiệu và làm tăng sự biểu hiện của một số cytokine. Glyoxalase 1 (GLO1) và glyoxalase 2 (GLO2) là những enzyme quan trọng đóng vai trò ngăn chặn glycation thông qua việc xúc tác cho phản ứng chuyển đổi MGO thành D-lactate với sản phẩm trung gian là S-D-lactoyglutathione. Sự giảm biểu hiện của GLO1 hoặc suy giảm hoạt động của enzyme này đều ảnh hưởng đến nồng độ MGO, do đó có thể thông qua GLO1 để kiểm soát sự hình thành quá mức MGO [21-23]. 1.3.2. Những hậu quả do MGO biểu hiện trong đái tháo đường Sự hình thành MGO là kết quả của sự duy trì nồng độ glucose cao trong máu và các nghiên cứu đã chỉ ra rằng ở cả đái tháo đường típ 1 và típ 2 đều biểu hiện nồng độ cao của MGO và AGEs hình thành từ MGO. Nhiều nghiên cứu tiếp theo nhấn mạnh tầm quan trọng của MGO trong đái tháo đường và các biến chứng liên quan [21]. Một nghiên cứu trên các bệnh nhân mắc đái tháo dường có biến chứng thận chỉ ra mối tương quan theo chiều thuận của nồng độ MGO trong huyết tương và tỉ lệ albumine/creatinine trong khi những biến đổi về mức lọc cầu thận 10
19. lại tương quan nghịch đảo với nồng độ MGO trong suốt quá trình theo dõi. Nồng độ MGO cũng ảnh hưởng tới độ dày của màng trong mạch máu và sự tăng lên của áp lực máu trong mạch cho thấy mối liên hệ giữa MGO và các bệnh mạch máu lớn ở đái tháo đường. Mối liên hệ giữa các AGEs và các bệnh về tim mạch cũng được chỉ ra dựa trên những bằng chứng nghiên cứu về sự mất chức năng của thận, tình trạng viêm mức độ nhẹ, thay đổi cấu trúc và chức năng màng trong mạch và tính mềm dẻo của mạch máu [24]. Lớp nội mô mạch máu (endothelium) là lớp màng đơn mỏng tạo thành từ các tế bào nội mô bao phủ bề mặt trong của các mạch máu trong cơ thể. Ở điều kiện sinh lý bình thường, lớp màng có vai trò làm giảm trương lực mạch máu, điều hoà tính thấm thành mạch, ngăn cản sự tập trung và bám dính của tiểu cầu, hạn chế hoạt động của hệ thống đông máu và thúc đẩy sự ly giải fibrin. Sự rối loạn chức năng của lớp nội mô mạch máu trong bệnh đái tháo đường biểu hiện ở những thay đổi trong điều hoà vận mạch, sự tăng lên của các chất oxi-hoá, tình trạng viêm và chức năng rào chắn của màng. MGO là một tiền chất của AGEs quan trọng trong các tế bào nội mô. Sự tăng hoạt động của enzyme GLO1 ngăn cản sự hình thành của các AGEs dạng CML và CEL dưới tình trạng tăng đường huyết. Một số nghiên cứu cho thấy việc sử dụng MGO ở chuột gây ra những thay đổi tại các vi mạch tương tự khi mắc đái tháo đường như suy giảm sự co giãn của mạch, suy thoái hệ mạch tại da do mất dần các tế bào nội mô và giảm độ dày màng, sự tăng lên quá mức của các chất oxy hoá. Nồng độ cao của MGO không chỉ thúc đẩy quá trình sản xuất các superoxide hình thành các stress oxy hoá mà còn gây ra những độc tính trên vật liệu di truyền (genotoxicity) của các tế bào nội mô và hoạt hoá sự chết của tế bào [21]. 11
20. Đái tháo Glucose đường típ 2 Glyceraldehyde GLO1 D-lactate -3- phosphate MGO AGE Đại thực bào, Mất chức năng Stress oxy tế bào nội mô tế bào miễn hoá dịch Tình trạng Sự chết viêm theo chu trình của tế bào Hình 1.1. Sự hình thành MGO và AGEs trong đái tháo đường type 2. 1.3.3. Một số phương pháp ức chế sự hình thành AGEs liên quan tới MGO Các chất khử dicarbonyl (Dicarbonyl Scavengers) Các chất khử là thế hệ thuốc đầu tiên được phát triển và thử nghiệm trên lâm sàng với mục tiêu làm giảm nồng độ MGO và các dicarbonyl khác. + Aminoguanidine (AG): một chất ức chế hình thành AGEs nhờ vào sự phản ứng nhanh của nhóm guanidine và MGO để làm giảm nồng độ MGO. 12
21. + B6 vitamer pyridoxamine: một chất ức chế khác dựa trên sự hoạt động như các phức chelat tác động lên quá trình chuyển vị ở các phân tử glucose, từ đó ngăn cản hình thành AGEs. + Metformin: các nghiên cứu đã chỉ ra hiệu quả làm giảm nồng độ MGO của metformin. Giả thiết đưa ra là metformin có khả năng bắt giữ các MGO bằng liên kết với nhóm guanidine. Một số nghiên cứu khác cho thấy sự tăng lên của GLO1 trong các tế bào máu khi sử dụng metformin cũng có vai trò làm giảm nồng độ các MGO. + Alagebrium: một chất có khả năng phản ứng và phá vỡ các AGEs đã được hình thành được nghiên cứu trên invitro. Các phương pháp khác + Sự hình thành và thúc đẩy hoạt động của enzyme GLO: enzyme này được điều hoà thông qua sự liên kết của nhân tố phiên mã Nrf2 với yếu tố đáp ứng với chất chống oxi-hoá như là một chất hoạt hoá Nrf2. + Liệu pháp Chelation (transition metal chelation): Liệu pháp có khả năng giảm nồng độ AGEs, ổn định sự chuyển hoá collagen và ngăn chặn sự phát triển biến chứng đục thuỷ tinh thể trong đái tháo đường [24]. 1.4. Tổng quan về cây Xấu hổ 1.4.1. Vị trí phân loại - Tên khoa học: Mimosa pudica Linn. - Tên gọi khác: Cây trinh nữ, cây e thẹn, cây mắc cỡ, Hàm tu thảo [5]. - Vị trí phân loại trong giới thực vật [6]. Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp: Hoa hồng (Rosidae) Bộ: Đậu (Fabales) Họ: Đậu (Fabaceae) Phân họ: Trinh nữ (Mimosoideae) Chi: Trinh nữ (Mimosa) Loài: Mimosa pudica L. 13
22. 1.4.2. Đặc điểm thực vật và phân bố Đặc điểm thực vật Cây nhỏ, thân có gai hình móc. Lá hai lần kép lông chim, cuống phụ xếp như hình chân vịt, khi khẽ động vào lá sẽ cụp xuống. Cuống chung gầy, mang nhiều lông, dài 4 cm, cuống phụ 2 đôi, có lông trắng cứng. Lá chét 15-20 đôi nhỏ, gần như không có cuống. Hoa màu tím đỏ, tụ thành hình đầu trái xoan. Quả giáp dài 2cm, rộng 3mm, tụ thành hình ngôi sao, ở phần giữa các hạt quả hẹp lại, có lông cứng ở mép. Hạt gần như hình trái xoan, dài 2mm, rộng 1.5mm [5]. Phân bố, thu hái và chế biến Cây mọc hoang ở nhiều nơi, thường trên phần đất khô cằn do có khả năng cố định đạm, xa khu dân cư đông đúc. Cây được tìm thấy ở các ven đường cái, bờ đê, bãi hoang ở nhiều nơi ở nước ta và một số nước ở khu vực nhiệt đới của Châu Mỹ, Châu Phi và Châu Á. Bộ phận dùng là toàn cây hoặc lá, rễ, có thể thu hái quanh năm, rửa sạch đất cát, thái mỏng, phơi hay sấy khô. 1.4.3. Tác dụng dược lý Tác dụng ức chế thần kinh trung ương Những kết quả nghiên cứu chứng minh kinh nghiệm trong dân gian dùng cây xấu hổ để chống mất ngủ. Xấu hổ có tác dụng hiệp đồng với hexobarbital, meprobamat đồng thời tăng tác dụng của bibactal cho thấy tác dụng ức chế thần kinh trung ương của Xấu hổ [5]. Một nghiên cứu khác chỉ ra tác dụng an thần của rễ cây Xấu hổ thông qua khả năng làm dịu, giảm các kích thích thần kinh và mang lại hiệu quả thư giãn, giảm áp lực [25]. Dịch chiết phân đoạn ethyl acetate của cây xấu hổ cải thiện các hành vi liên quan đến khả năng học tập và ghi nhớ ở chuột dựa trên cơ chế làm tăng các chất truyền tín hiệu ở hệ thần kinh như dopamin, norepinephrine và các thay đổi trong hoạt động của acetylcholinesterase và caspase-3 [26]. 14
23. Tác dụng kháng khuẩn: Nghiên cứu bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch nuôi cấy Aspergillus fumigatus, Klebsiella pneumonia và Citrobacter divergens với cao chiết methanol từ thân và lá cây Xấu hổ ở các nồng độ 50,100 và 200 µg/đĩa cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của cây [27]. Tác dụng làm lành vết thương Kanan và các cộng sự đã tiến hành đánh giá tác dụng làm lành vết thương qua cơ chế kháng nấm của các cao chiết từ thân và rễ cây Xấu hổ khi so với chất đối chứng là gentamycin, trong đó phân đoạn cao chiết methanol cho hiệu quả cao nhất [28]. Cây Xấu hổ có khả năng rút ngắn giai đoạn co vết thương và quá trình biểu mô hoá giúp các vết thương lành nhanh hơn [29]. Các tác dụng khác Cây Xấu hổ còn được biết đến với khả năng làm giảm đau, giải độc acid asenơ do làm tăng hàm lượng –SH và hô hấp tế bào ở chuột được cho uống acid asenơ, khả năng ức chế hoạt động hyaluronidase và protease trong nọc độc của rắn Echis carinatus, Vipera russelii và Naja naja [5,30]. 1.4.4. Một số nghiên cứu về các tác dụng điều trị đái tháo đường của cây Xấu hổ Một dạng thuốc kết hợp tám loại thảo dược khác nhau bao gồm cả cây Xấu hổ được thử nghiệm trên mô hình chuột bị đái tháo đường do streptozotocin với liều 50mg/kg và 100mg/kg cho kết quả là sự giảm đáng kể nồng độ glucose trong máu đồng thời cũng làm tăng lượng insulin huyết tương, glycogen trong gan và hemoglobin toàn phần [31]. Nghiên cứu khác của Sutar và các cộng sự trên mô hình chuột bị đái tháo đường do alloxan đã chỉ ra hiệu quả làm giảm đáng kể nồng độ glucose trong máu sau khi sử dụng cao chiết cây Xấu hổ khi so với chất chuẩn là metformin [32]. Cao chiết nước của cây Xấu hổ cũng được chứng minh là hỗ trợ điều trị đái tháo đường, ở mức liều 150mg/kg thể trọng có hiệu quả giảm đường huyết và 15
24. trọng lượng trên chuột béo phì bị đái tháo đường. Hơn nữa, nghiên cứu cũng chỉ ra tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase trong khoảng 3.09µg/ml và tác dụng chống oxy hoá qua phương pháp 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazy với nồng độ ức chế 50% (IC50) là 6.32mg/ml của cao chiết [7]. Những hợp chất có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase đã được phân lập từ dịch chiết cây Xấu hổ bao gồm stigmasterol, quercetin và avicularin với IC50 lần lượt là 91.08 ± 1.54, 75.16 ± 0.92 và 481.7 ± 0.703 μg mL−1 so với thuốc đối chứng là acarbose (351.02 ± 1.46 μg mL−1) [33]. Một hợp chất khác là myoinositol đã được phân lập từ dịch chiết methanol của cây Xấu hổ và được thử nghiệm trên mô hình chuột được tiêm streptozotocin mang lại những hiệu quả liên quan tới hoạt động đáp ứng của insulin. Myoinositol cải thiện sự điều hoà các yếu tố PPARγ, glucose transporter type 4 trong mô mỡ bằng cách tương tác với các yếu tố này tại vị trí hoạt động. Hợp chất cũng biểu hiện tiềm năng điều trị thông qua tác dụng ngăn cản sự tăng nồng độ lipid cấp và mạn tính, khả năng bảo vệ tế bào ở các cơ quan như gan, thận, tuỵ, tim và mô mỡ ở chuột mắc đái tháo đường [34]. 16
25. Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 2.1.1. Mẫu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là phần trên mặt đất của cây Xấu hổ. Mẫu nghiên cứu được giám định thực vật học và mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Bộ môn Dược liệu và Dược cổ truyền, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội với tên khoa học là Mimosa pudica Linn., họ Trinh nữ (Mimosaceae). Hình 2.1. Cây Xấu hổ. 2.1.2. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu Dược liệu được xay thô và chiết bằng phương pháp ngâm lạnh với dung môi ethanol (EtOH) 80%. 20 kg dược liệu phần trên mặt đất cây Xấu hổ được ngâm với dung môi EtOH 80% ở nhiệt độ phòng, 3 lần x 3 ngày/lần với tỷ lệ dược liệu/dung môi là 1:10 (kg/l). Sau mỗi lần ngâm, tiến hành lọc bã dược liệu, gộp các dịch chiết và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 1.785 kg cao EtOH 80%. Hiệu suất chiết đạt khoảng 8.925%. 17
26. 2.1.3. Hoá chất, dung môi và các cơ chất tham gia phản ứng - Dung môi EtOH 96% - Acetonitril (Sigma) - Acid formic 0.05% (Sigma) - Methyl glyoxal, MGO (Sigma, Mỹ) - Aminoguanidine, AG (Sigma, Mỹ) - EMG-2 medium (Lonza, Mỹ) - Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs (Sigma, Mỹ) - Bovine serum albumin, BSA (Sigma, Mỹ) - Fetal bovine serum, FBS (Rockville, Mỹ) -3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide, MTT (Sigma, Mỹ) - Dimethyl sulfoxide, DMSO (Sigma, Mỹ) - Phosphate buffer saline, PBS (Sigma, Mỹ) 2.1.4. Thiết bị, dụng cụ - Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C (Thuỵ Sỹ) - Máy chiết công nghiệp 20 l Rotary evaporator WEV-1020 (Hàn Quốc) - Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi, Thụy Sỹ) - Máy siêu âm Power sonic 405 (Powersonic, Hàn Quốc) - Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ bao gồm cột sắc ký Agilent LC 1200 kết nối hệ khổi phổ LTQ Orbitrap XL™ (Thermo Scientific Company) - Thiết bị Microplate Reader (Molecular Devices, CA, Mỹ) - Thiết bị Multilabel plate Reader (Perkin Elmer, MA, Mỹ) - Micro pipet một đầu kênh 2-20µL, 10-100 µL, 100-1000 µL - Lọ đựng mẫu dùng cho hệ tiêm mẫu LC tự động - Cuvet (1ml, 3ml), Eppendorf 1.5 ml - Bông y tế, phễu lọc, đầu côn các loại - Các dụng cụ thuỷ tinh dùng trong thực nghiệm: Pipet, bình định mức, cốc có mỏ, ống đong và các dụng cụ cần thiết khác 18
27. 2.2. Nội dung nghiên cứu Các nội dung nghiên cứu được thiết kế phù hợp với mục tiêu đã đề ra bao gồm: - Nội dung 1: Định tính các hợp chất có trong cao chiết cây Xấu hổ bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS. - Nội dung 2: Đánh giá khả năng sống sót của tế bào với độc tính do MGO gây ra sau khi xử lý với cao chiết cây Xấu hổ theo phương pháp MTT - Nội dung 3: Đánh giá tác dụng ức chế sự hình thành AGEs do MGO gây ra của cao chiết cây Xấu hổ. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp định tính các thành phần hoá học trong cao chiết cây Xấu hổ bằng phương pháp LC/MS Thí nghiệm định tính các hợp chất hoá học trong cao chiết cây Xấu hổ được tiến hành tại Khoa Hoá- Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội. Nguyên lý Chất phân tích sẽ được chuyển sang thể khí và ion hoá, tạo thành các ion dương hoặc âm. Phương pháp phổ khối dựa trên việc đo trực tiếp tỷ số m/z, là tỷ số giữa khối lượng m và điện tích z của ion chất phân tích. Trong máy phổ khối, các ion được tạo thành trong nguồn ion, được gia tốc rồi được tách trong bộ phân tích trước khi đến detector. Tất cả quá trình trên được thực hiện trong một buồng được hút chân không. Phổ thu được biểu diễn cường độ tương đối của các ion khác nhau phụ thuộc vào tỷ số m/z của các ion đó. Tín hiệu tương ứng với một ion là một nhóm các pic tương ứng với phân bố thống kê của các đồng vị khác nhau của ion đó. Đó là hình ảnh đồng vị của ion và trong đó pic của đồng vị có cường độ lớn nhất của một nguyên tử được gọi là pic đơn đồng vị. Từ phổ khối có thể thu được những thông tin định tính (xác định khối lượng phân tử và thông tin về cấu trúc có được nhờ các mảnh thu được) hay định lượng (dùng chuẩn nội hay chuẩn 19
28. ngoại) với giới hạn phát hiện trong khoảng từ picomol (10-12 mol) đến femtomol (10-15 mol) [8]. Xử lý mẫu Phương pháp phân mảnh ion Xử lý dữ liệu Sắc ký lỏng Đưa mẫu Nguồn ion Bộ phận phân tách Detector khối Detector Hình 2.2. Sơ đồ cấu tạo đơn giản của hệ thống sắc ký lỏng khối phổ. Chuẩn bị hoá chất cần thiết + Dung môi Acetonitril, độ tinh khiết 99.8% + Acid formic 0.05%, độ tinh khiết 99.8% + Nước cất Cách tiến hành + Cao chiết được phân tán vào dung môi acetonitril sau đó được lọc qua màng lọc polyvinylidene difluoride ( kích thước lỗ lọc 0.45µm) để thu được dịch lọc chuẩn bị cho quá trình sắc ký 20
29. + Tiến hành chạy mẫu với các thông số: Bảng 2.1. Thông số chạy mẫu trong quá trình sắc ký lỏng. Thông số Chi tiết 30 °C Nhiệt độ cột 0.9 mL/min Tốc độ dòng Kênh A: Hỗn hợp nước cất và acid formic 0.05% Pha động Kênh B: Acetone nitril Pha tĩnh Agilent Poroshell Extend-C18 (1.8 μm, 2.1 × 50 mm) + Các điều kiện tại nguồn ion hoá đã được hệ thống LC/MS tự động tối ưu hoá theo tốc độ dòng của pha động để đảm bảo độ nhạy của thiết bị. Bảng 2.2. Các điều kiện tại nguồn ion hoá trong thiết bị khối phổ. Thông số Chi tiết Chế độ ion hoá/Ionization Chế độ ion dương Điện áp mao quản 3000V Thế phân mảnh 125V Năng lượng va chạm 3-4 V/100 DA Nhiệt độ dòng khí Nitrogen 300°C Tốc độ dòng khí Nitrogen 5L/min 21
30. Cách xác định kết quả Kết quả dựa trên kiểu thu tín hiệu toàn phổ, là khi toàn bộ tín hiệu thu được trên một dải khối được ghi lại. Phổ trình bày sự phụ thuộc của cường độ tương đối của các ion khác nhau vào tỷ số m/z của các ion đó. Kết quả thu được chủ yếu có ý nghĩa định tính. Các hợp chất điển hình trong thí nghiệm được phát hiện dựa trên dữ liệu thu thập từ các phân mảnh theo kiểu tín hiệu toàn phổ kết hợp với các dữ liệu đã công bố ở các tài liệu trước đó. 2.3.2. Phương pháp đánh giá khả năng sống sót của tế bào với độc tính do MGO sau khi được xử lý với cao chiết cây Xấu hổ Thí nghiệm đánh giá khả năng sống sót của tế bào với độc tính do MGO sau khi xử lý với cao chiết cây Xấu hổ được thực hiện theo mô hình tại Khoa Dược, Đại học Gachon, Hàn Quốc. Nguyên lý Phương pháp MTT được dựa trên nguyên tắc là MTT [3- (4,5- dimethylthiazol - 2- yl) - 2,5 - diphenyl tetrazolium bromid] tham gia phản ứng oxy hoá khử với ty thể của tế bào và tạo thành các formazan dạng tinh thể. Sau đó dùng một số dung dịch khác nhau để phá huỷ màng tế bào đồng thời hoà tan các tinh thể formazan và đo độ hấp thụ quang học của các dung dịch này [9]. Hình 2.3. Nguyên lý của phương pháp MTT. 22
31. Cách tiến hành Thí nghiệm được thực hiện dựa trên những thông số về nồng độ của AG và MGO mô tả trong công bố của Figarola và các cộng sự với một số thay đổi nhỏ [35]. Cụ thể như sau: + Các dòng tế bào nội mô tĩnh mạch rốn người (human umbilical vein endothelial cells, HUVECs) được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng có mật độ 1,0x104 tế bào/ giếng, với môi trường nuôi cấy là EGM-2, 4% FBS, ủ ở nhiệt độ 37 °C, 5% CO2. + Sau 24 giờ nuôi cấy, các tế bào sẽ được xử lý trước với AG (1mM) và dịch chiết cây Xấu hổ ở các nồng độ 1, 10, 100 µg/mL trong 1 giờ. + Các tế bào tiếp tục được xử lý với MGO (400µM) trong 24 giờ. + Dung dịch MTT được bổ sung vào các giếng với nồng độ 0,1mg/mL và tiếp tục ủ trong 2 giờ. + DMSO được thêm vào các giếng với nồng độ 100µL/ giếng và đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 570nm trên thiết bị Microplate Reader. Cách đánh giá kết quả Tác dụng bảo vệ tế bào được đánh giá thông qua thành phần phần trăm của tế bào sống sót được xác định bằng cách so độ hấp thụ ở giếng thử nghiệm với độ hấp thụ của giếng đối chứng. Mỗi thử nghiệm có độ lặp lại 3 lần. % tế bào sống sót = (At/Ac) x100 Trong đó At: Độ hấp thụ của mẫu thử Ac: Độ hấp thụ của mẫu trắng (chỉ có tế bào trong môi trường nuôi cấy) Tác dụng bảo vệ tế bào của dịch chiết được so sánh với chất chuẩn dương AG (1mM). 2.3.3. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế sự hình thành AGEs do MGO gây ra của cao chiết cây Xấu hổ 23
32. Thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế sự hình thành AGEs của cao chiết cây Xấu hổ được thực hiện theo mô hình tại Khoa Dược, Đại học Gachon, Hàn Quốc. Cách tiến hành Hoạt tính ức chế sự hình thành AGEs được đánh giá theo phương pháp của Kiho và các cộng sự [36] bao gồm các bước: + MGO (2mM) được thêm vào các ống chứa BSA (5mg/ml) trong dung dịch đệm PBS, pH 7.4 chứa 0.02% sodium azide. + Thêm vào mỗi ống dịch chiết cao Xấu hổ với các nồng độ là 1,5,10 mg/mL và ủ trong 7 ngày ở 37°C và tránh ánh sáng. + Sự hình thành AGEs được xác định bằng phân tích huỳnh quang ở bước sóng kích thích/phát ra là 370 nm/440nm trên máy multilabel plate reader. Cách đánh giá kết quả Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Kết quả biểu thị thông qua phần trăm ức chế được tính bằng công thức: % ức chế = ( Ac – At)/Ac x 100 Trong đó: At: Kết quả đo của mẫu thử Ac: Kết quả đo của mẫu đối chứng âm (chỉ chứa MGO) Khả năng ức chế của dịch chiết được đối chứng với AG ở nồng độ 1mM. 2.4. Phương pháp xử lý số liệu - Các số liệu từ thí nghiệm định tính thành phần hoá học được thống kê và tính toán trên phần mềm Microsoft Excel 2016. - Số liệu của các thí nghiệm đánh giá invitro được lưu trữ và phân tích thống kê bằng test one-way ANOVA và test Bonferroni. Kết quả được biểu diễn trên phần mềm GraphPad Prism 5 với giá trị trung bình cộng/trừ đi độ lệch chuẩn SD. Sự khác biệt giữa các nhóm được coi là có ý nghĩa khi p < 0.05. 24
33. Chương 3. KẾT QUẢ 3.1. Kết quả định tính các thành phần hoá học trong cao chiết ethanol của cây Xấu hổ Cao chiết cây Xấu hổ được phân tích để xác định thành phần các hợp chất bằng phương pháp LC/MS và đối chiếu với các dữ liệu đã công bố trước đó. Những hợp chất cụ thể được dự đoán và liệt kê ở bảng 3.1 và cấu trúc được biểu diễn trong hình 3.1. Các hợp chất được dự đoán bao gồm 2-hydroxy-benzeneethanol, 3-Fluoro- p-anisidine myoinositol, quercetin, apigenin, luteolin, fisetin, naringenin and acid gallic, acid p-hydroxy benzoic, acid caffeic, acid monoamidomalonic, acid ferulic. Trong đó, 4-phenylbutan-2-ol được phát hiện với cường độ tín hiệu ion con cao nhất là 104.0 m/z ứng với ion mẹ là 141.09 m/z [M+H+NH4]. Ion mẹ của ferulic acid với 194.14 m.z có thể hình thành mảnh ion con với tín hiệu ở 233.1 m/z [M+K] tương ứng với sự cộng hợp một nguyên tử kali. Ion con 347.2 m/z được dự đoán xuất phát từ hợp chất apigenin với m/z là 270.28 [M+2K+H]. Kết quả phân mảnh của ion mẹ với m/z là 320.2 thành ion con ở tín hiệu 302.17 m/z [M+NH4] bằng sự thêm vào nhóm amoni có thể là quercetin. Một hợp chất khác là acid gallic m/z là 170.38 được tìm ra dựa trên sự xuất hiện của ion con [M+2K+H] ở 247.3 m/z. Các hợp chất còn lại được tính toán và dự đoán tương tự dựa trên sự xuất hiện của các ion con trên phổ khối. 25
34. Bảng 3.1. Các hợp chất được xác định trong cao chiết cây Xấu hổ. Trọng Ion Ion Cường Hợp chất dự Công thức lượng STT con Kiểu ion mẹ độ (cps) đoán phân tử phân tử (m/z) (m/z) (g/mol) 4-(2- M+H+N 1 104.0 198.48 1.8e7 phenylethyl)- C H O 198.26 H4 14 14 phenol 194.14 9.0e6 M+K 2 233.1 Acid ferulic C H O 194.18 10 10 4 180.24 M+K 6.9e6 Myoinositol C H O 180.16 219.2 6 12 6 3 M+K 180.24 6.9e6 Acid caffeic C H O 180.16 9 8 4 2-hydroxy- 4 156.1 M+NH4 138.07 6.9e6 benzeneethanol C8H10O2 138.16 Acid p-hydroxy 5 156.1 M+NH4 108.07 6.4e6 C H O 138.12 benzoic 7 6 3 M+IsoPr Luteolin 286.13 6.0e6 C H O 286.24 -op+H 15 10 6 6 347.2 M+IsoPr 286.13 6.0e6 Fisetin C H O 286.24 -op+H 15 10 6 7 347.2 M+2K+H 270.28 6.0e6 Apigenin C15H10O5 270.24 247.3 170.38 8 M+2K+H 6.0e6 Acid gallic C H O 170.12 7 6 5 320.2 9 M+NH4 302.17 3.9e6 Quercetin C H O 302.23 15 10 7 Acid C H NO 10 320.2 M+H 319.19 3.9e6 monoamidomalo 12 29 3 319.62 Si -nic 3 3-Fluoro-p- 11 142.1 M +H 141.09 1.6e6 C H FNO 141.14 anisidine 7 8 12 142.1 M+H+Na 272.2 1.6e6 Naringenin C15H12O5 272.25 26
35. Hình 3.1. Cấu trúc hoá học của các hợp chất trong cây Xấu hổ. 27
36. 3.2. Kết quả đánh giá khả năng sống sót của tế bào với độc tính của MGO sau khi được xử lý với cao chiết cây Xấu hổ Tác dụng bảo vệ tế bào của cao chiết cây Xấu hổ theo phương pháp MTT ở các nồng độ 1; 10 và 100 µg/mL được thể hiện ở hình 3.2. Hình 3.2. Khả năng sống sót của tế bào khi được xử lý với cao chiết cây Xấu hổ ở các nồng độ khác nhau trước khi tiếp xúc với MGO. (### p < .001, p < .001) Các tế bào HUVECs giảm khả năng sống sót một cách đáng kể khi xử lý với MGO khi so sánh giữa nhóm mẫu trắng (C) chỉ chứa các tế bào và nhóm mẫu chỉ cho thêm MGO (N). Phần trăm các tế bào sống sót ở các nhóm được xử lý với cao chiết cây Xấu hổ ở các nồng độ khác nhau trước khi ủ với MGO tăng lên rõ rệt. Tuy nhiên, tác dụng bảo vệ tế bào ở nhóm chứng dương AG (P) vẫn cho giá trị cao hơn so với các nhóm tế bào xử lý với cao chiết. Song song với các nhóm tế bào bị gây độc tính bởi MGO, thí nghiệm được tiến hành tương tự với nhóm tế bào không xử lý với MGO cho thấy cao chiết ethanol của cây Xấu hổ chỉ làm giảm khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ cao nhất là 100 µg/mL. 28
37. 3.3. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế MGO hình thành AGEs của cao chiết cây Xấu hổ Thí nghiệm đánh giá sự hình thành AGEs được thể hiện ở hình 3.3 dựa trên kết quả của phương pháp phân tích huỳnh quang. Các nồng độ của cao chiết Xấu hổ được thêm vào lần lượt là 1; 5 và 10mg/mL. Hình 3.3. Khả năng ức chế sự hình thành AGEs do MGO ở các nồng độ khác nhau của cao chiết cây Xấu hổ. (### p < .001, p < .001) Sự xuất hiện của AGEs ở nhóm trắng chỉ chứa BSA trong dung dịch đệm (C) là thấp nhất khi so với nhóm đối chứng âm chỉ được xử lý với MGO (N). Các nhóm được xử lý sau đó với các nồng độ khác nhau của cao chiết cây Xấu hổ thể hiện sự giảm dần hình thành AGEs đáng kể và tương ứng với sự tăng dần nồng độ cao chiết. Hơn nữa, khả năng ngăn cản AGEs tạo ra do MGO ở nhóm được thêm vào 10mg/mL cao chiết mạnh hơn rõ rệt so với nhóm sử dụng chứng dương AG (P). 29
38. Chương 4. BÀN LUẬN Cây Xấu hổ từ lâu đã được biết đến trong Y học cổ truyền với các tác dụng điều trị như giảm đau, tiêu viêm, hạ huyết áp, lợi tiểu, chống ho, long đờm, , có vị ngọt, tính hơi hàn, quy kinh phế [10,11]. Rễ cây có vị chát, hơi đắng được dùng trong phòng ngừa và điều trị các bệnh về phong thấp, viêm dạ dày, hen suyễn [6,11,12]. Cành và lá có vị ngọt, tính bình, có tác dụng an thần dùng trong điều trị mất ngủ, hoặc giảm sưng tấy, mưng mủ [12]. Dựa trên một số tác dụng dược lý hiệu quả của cây Xấu hổ, nhiều nghiên cứu được tiến hành để xác định thành phần các hợp chất trong cây. Các nhóm hợp chất chính có trong cây Xấu hổ bao gồm alkaloids, flavonoids, terpenoids, crocetin dimethyl ester, tannins, phytosterol, glycosides và các hợp chất phenolic [37]. Một số hợp chất cũng đã được phân lập từ dịch chiết của cây như acid chlorogenic, acid p-coumaric, acid jasmonic, acid p-hydroxy benzoic, L- mimosine, acid caffeic, catechin, acid gallic, acid ferulic, hyperoside, luteolin, fisetin, apigenin-7-o-glucoside, naringenin, benzene-triol, apigenin [38-41]. Các chất trong cao chiết ethanol của cây Xấu được dự đoán từ kết quả của phương pháp sắc ký lỏng khối phổ cũng trùng khớp với các nghiên cứu trước đó. Tình trạng tăng đường huyết mạn tính trong đái tháo đường gây ra những độc tính nghiêm trọng trên tế bào, kích hoạt sự chết theo chu trình của tế bào và là nguyên nhân dẫn đến những biến chứng nguy hiểm của căn bệnh này. Thông qua phương pháp MTT, việc sử dụng cao chiết cây Xấu hổ ở các nồng độ khác nhau cho thấy những hiệu quả đáng kể trong cải thiện tình trạng gây độc cho tế bào của MGO, tác nhân chính xuất hiện ở các quá trình sản sinh AGEs khi đường huyết tăng trong một thời gian dài. Tương tác giữa AGEs và các thụ thể dẫn tới các stress oxy hoá ở nhiều loại tế bào trong cơ thể, cùng với đó là sự kích hoạt các phản ứng viêm, quá trình tạo cục máu đông và hoạt hoá tiểu cầu, là những nguyên nhân làm xuất hiện các biến chưng trên tim mạch, thận, mắt, khi mắc đái tháo đường [18]. 30
39. Kết quả nghiên cứu khả năng ức chế sự hình thành AGEs do MGO gây ra chỉ ra tác dụng rõ rệt của cao chiết cây Xấu hổ trên mô hình này. Hơn nữa, lượng sản phẩm AGEs cũng giảm đáng kể khi tăng nồng độ cao chiết, và ở nồng độ 10mg/mL cho tác dụng ức chế cao hơn cả chứng dương là AG. Các thí nghiệm trên mô hình dùng MGO để gây độc là giảm khả năng sống sót của tế bào HUVECs và sản sinh AGEs với kết quả tích cực đã đóng góp những minh chứng dựa trên cơ chế phân tử cho hiệu quả làm giảm đường huyết và các biến chứng liên quan của cây Xấu hổ ở các nghiên cứu in vivo. Những hiệu quả đáng chú ý của dịch chiết cây Xấu hổ để bảo vệ tế bào thông qua sự ngăn chặn độc tính của MGO có thể do sự xuất hiện của các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây như apigenin, catechin, quercetin, naringenin, acid ferulic và acid caffeic. Acid ferulic, một dẫn xuất từ acid cinamic, được biết đến với tác dụng chống viêm cũng như là một chất ức chế AGEs. Khả năng ức chế của acid ferulic có liên quan đến nồng độ CML, lượng protein liên kết với cacbonyl và fructosamine với vai trò là một yếu tố tiềm năng chống lại các stress oxy hoá và quá trình đường hoá (glycation) các protein [42,43]. Catechin, apigenin và quercetin xuất hiện trong cao chiết cây Xấu hổ đều được chứng minh là có khả năng bắt giữ các MGO để tạo thành phức hợp với MGO. Các kết quả từ nghiên cứu của Zhu,D và các cộng sự thu được khi điều trị bằng catechin trên chuột bị đái tháo đường cho thấy sự cải thiện đáng kể sự suy giảm chức năng thận do tác dụng ức chế hình thành AGEs và các cytokines [44]. Zhou,Q và các cộng sự đã chỉ ra khả năng bắt giữ trực tiếp MGO của apigenin để tạo thành phức hệ apigenin-MGO. Apigenin cũng làm giảm sự sản sinh các chất oxy hoá, các phân tử bám dính và các cytokines, do đó có tác dụng ngăn chặn tình trạng viêm và stress oxy hoá ở các tế bào HUVECs [45].Sự hình thành AGEs cũng bị ức chế khi sử dụng hỗn hợp các chất trong đó có acid caffeic và naringenin [46,47]. Quercetin cũng cho thấy tác dụng ngăn cản sự sản sinh AGEs nhờ khả năng bắt giữ MGO cũng như phá huỷ các phân tử AGEs đã hình thành. Tác dụng này của quercetin có thể do sự có mặt của nhóm polyphenol ở vị trí số 6 và số 8 trên vòng A của phân tử [46-48]. 31
40. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Nghiên cứu đã dự đoán sơ bộ được sự có mặt của các hợp chất trong cao chiết của cây Xấu hổ bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ. Nghiên cứu cũng đánh giá được tác dụng bảo vệ tế bào của cao chiết từ cây Xấu hổ thông qua khả năng sống sót của tế bào và sự ức chế hình thành AGEs do MGO gây ra. ĐỀ XUẤT Kết quả thu được ở nghiên cứu có ý nghĩa định hướng tiềm năng của việc sử dụng các thảo dược từ thiên nhiên cụ thể là cây Xấu hổ (Mimosa pudica Linn.) trong phòng ngừa và hỗ trợ điều trị đái tháo đường. Thí nghiệm mới dừng lại ở mức định tính, do vậy cần kết hợp thêm các thí nghiệm có độ chính xác cao hơn để phân tách, tách chiết và tinh sạch cũng như xác định cụ thể cấu trúc của từng hợp chất như phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR. Khi tách chiết và phân lập được các hợp chất có hoạt tính sinh học, các thí nghiệm đánh giá tác dụng và xác định rõ cơ chế tác dụng của từng chất cũng cần được tiếp tục thực hiện. 32
41. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo Tiếng Việt 1. Bộ Y Tế (2017), “Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị đái tháo đường típ 2”. 2. Bệnh viện Bạch Mai (2017), “Đái tháo đường”, Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị bệnh nội khoa, NXB Y học, tr.411-416. 3. Bộ Y Tế (2009), “Bệnh học”, Đái tháo đường, NXB Giáo Dục, tr. 179-191. 4. Bộ Y Tế (2011), “Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị đái tháo đường típ 2”. 5. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, tr:794-796. 6. Viện Dược Liệu (2006), Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập II, tr:1099- 1101. 7. Đồng, T. N. (2019). Nghiên cứu tác dụng điều trị đái tháo đường của cao chiết nước lá cây xấu hổ (mimosa pudica linn.). Khóa luận, Đại học Quốc gia Hà Nội, Việt Nam. 8. Bộ Y Tế (2009), “Dược điển Việt Nam IV”. 9. Trần Vân Hiền, Chu Quốc Trường, Trần Thanh Loan, Nguyễn Đặng Dũng (2005), “ Áp dụng kỹ thuật MTT để đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào lách chuột chịu stress oxy hoá của các dịch chiết hà thủ ô, cúc hoa vàng”, Tạp chí dược liệu, 5(1), tr.23-25. 10. Võ Văn Chi (1991), Cây thuốc An Giang, tr:38. 11. Phạm Hoàng Hộ (2006), Cây cỏ vị thuốc ở Việt Nam, tập 1, tr 119-218. 12. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, tập 1, tr 819 Tài liệu tham khảo Tiếng Anh 13. Mottillo, Emilio P., et al. "FGF21 does not require adipocyte AMP-activated protein kinase (AMPK) or the phosphorylation of acetyl-CoA carboxylase (ACC) to mediate improvements in whole-body glucose homeostasis." Molecular metabolism 6.6 (2017): 471-481. 14. Rena, Graham, D. Grahame Hardie, and Ewan R. Pearson. "The mechanisms of action of metformin." Diabetologia 60.9 (2017): 1577-1585. 15. Dhameja, Manoj, and Preeti Gupta. "Synthetic heterocyclic candidates as promising α- glucosidase inhibitors: An overview." European journal of medicinal chemistry 176 (2019): 343-377. 16. Hussain, Hidayat, et al. "Protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) inhibitors as potential anti-diabetes agents: patent review (2015-2018)." Expert opinion on therapeutic patents 29.9 (2019): 689-702.
42. 17. Yamamoto, Masahiro, and Toshitsugu Sugimoto. "Advanced glycation end products, diabetes, and bone strength." Current osteoporosis reports 14.6 (2016): 320-326. 18. Yamagishi, Sho-ichi. "Role of advanced glycation end products (AGEs) and receptor for AGEs (RAGE) in vascular damage in diabetes." Experimental gerontology 46.4 (2011): 217-224. 19. Nowotny, Kerstin, et al. "Advanced glycation end products and oxidative stress in type 2 diabetes mellitus." Biomolecules 5.1 (2015): 194-222. 20. Vlassara, Helen, and Jaime Uribarri. "Advanced glycation end products (AGE) and diabetes: cause, effect, or both?." Current diabetes reports 14.1 (2014): 1-10. 21. Schalkwijk, C. G., and C. D. A. Stehouwer. "Methylglyoxal, a highly reactive dicarbonyl compound, in diabetes, its vascular complications, and other age-related diseases." Physiological reviews 100.1 (2020): 407-461. 22. Groener, Jan Benedikt, et al. "Methylglyoxal and advanced glycation end products in patients with diabetes–what we know so far and the missing links." Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes 127.08 (2019): 497-504. 23. Bellier, Justine, et al. "Methylglyoxal, a potent inducer of AGEs, connects between diabetes and cancer." Diabetes research and clinical practice 148 (2019): 200-211. 24. Brings, Sebastian, et al. "Dicarbonyls and advanced glycation end-products in the development of diabetic complications and targets for intervention." International journal of molecular sciences 18.5 (2017): 984. 25. Yupparach, Piyapong, and Ampa Konsue. "Hypoglycemic and hypolipidemic activities of ethanolic extract from Mimosa pudica L. in normal and streptozotocin-induced diabetic rats." Pharmacognosy Journal 9.6 (2017). 26. Patro, Ganesh, Subrat Kumar Bhattamisra, and Bijay Kumar Mohanty. "Effects of Mimosa pudica L. leaves extract on anxiety, depression and memory." Avicenna journal of phytomedicine 6.6 (2016): 696. 27. Gandhiraja, N., et al. "Phytochemical screening and antimicrobial activity of the plant extracts of Mimosa pudica L. against selected microbes." Ethnobotanical leaflets 2009.5 (2009): 8. 28. Kannan, S., et al. "Wound healing activity of Mimosa pudica Linn formulation." Int J Chem Tech Res 11.4 (2009): 1554-8. 29. Paul, Jejo, Syed Mohammed Saifulla Khan, and Basheeruddin Asdaq. "Wound healing evaluation of chloroform and methanolic extracts of Mimosa pudica roots in rats." Int J Biol Med Res 1.4 (2010): 223-227. 30. Mitra, Robin, et al. "Medicinal plants of Thailand." Asia-Pacific Biotech News 11.08 (2007): 508-518.
43. 31. Umamaheswari, Selvaraj, and Ponnaian Stanely Mainzen Prince. "Antihyperglycaemic effect of ëilogen-excelí, an ayurvedic herbal formulation in streptozotocin-induced diabetes mellitus." (2007). 32. Sutar, N. G., U. N. Sutar, and B. C. Behera. "Antidiabetic activity of the leaves of Mimosa pudica Linn. in albino rats." Journal of herbal medicine and toxicology 3.1 (2009): 123-126. 33. Tasnuva, S. T., et al. "α-glucosidase inhibitors isolated from Mimosa pudica L." Natural product research 33.10 (2019): 1495-1499. 34. Antony, Poovathumkal James, et al. "Myoinositol ameliorates high-fat diet and streptozotocin-induced diabetes in rats through promoting insulin receptor signaling." Biomedicine & Pharmacotherapy 88 (2017): 1098-1113. 35. Figarola, James L., et al. "LR-90 prevents methylglyoxal-induced oxidative stress and apoptosis in human endothelial cells." Apoptosis 19.5 (2014): 776-788. 36. Kiho, Tadashi, et al. "Effect of buformin and metformin on formation of advanced glycation end products by methylglyoxal." Clinica Chimica Acta 358.1-2 (2005): 139- 145. 37. Tunna, Tasnuva Sarwar, et al. "Weeds as alternative useful medicinal source: Mimosa pudica Linn. on diabetes mellitus and its complications." Advanced Materials Research. Vol. 995. Trans Tech Publications Ltd, 2014. 38. Ahmad, Bashir. "Antioxidant activity and phenolic compounds from Colchicum luteum Baker (Liliaceae)." African Journal of Biotechnology 9.35 (2010). 39. Nokihara, Kiyoshi, et al. "Preparative scale isolation, purification and derivatization of mimosine, a non-proteinogenic amino acid." Amino acids 43.1 (2012): 475-482. 40. Patel, Neeraj K., and Kamlesh K. Bhutani. "Suppressive effects of Mimosa pudica (L.) constituents on the production of LPS-induced pro-inflammatory mediators." EXCLI journal 13 (2014): 1011. 41. Ijaz, Shakeel, et al. "HPLC profiling of Mimosa pudica polyphenols and their non- invasive biophysical investigations for anti-dermatoheliotic and skin reinstating potential." Biomedicine & Pharmacotherapy 109 (2019): 865-875. 42. Dariya, Begum, and Ganji Purnachandra Nagaraju. "Advanced glycation end products in diabetes, cancer and phytochemical therapy." Drug Discovery Today (2020). 43. Sompong, W., et al., A comparative study of ferulic acid on different monosaccharide- mediated protein glycation and oxidative damage in bovine serum albumin. Molecules, 2013. 18(11): p. 13886-13903.
44. 44. Zhu, D., et al., (+)‐Catechin ameliorates diabetic nephropathy by trapping methylglyoxal in type 2 diabetic mice. Molecular nutrition & food research, 2014.58(12): p. 2249-2260. 45. Zhou, Q., et al., Apigenin and its methylglyoxal-adduct inhibit advanced glycation end products-induced oxidative stress and inflammation in endothelial cells. Biochemical pharmacology, 2019. 166: p. 231-241. 46. Do, M.H., et al., Lespedeza bicolor ameliorates endothelial dysfunction induced by methylglyoxal glucotoxicity. Phytomedicine, 2017. 36: p. 26-36. 47. Gugliucci, A., et al., Caffeic and chlorogenic acids in Ilex paraguariensis extracts are the main inhibitors of AGE generation by methylglyoxal in model proteins. Fitoterapia, 2009. 80(6): p. 339-344. 48. Li, X., et al., Quercetin inhibits advanced glycation end product formation by trapping methylglyoxal and glyoxal. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014. 62(50): p. 12152-12158.