›

Khóa luận Nghiên cứu thành phần triterpene glycoside từ loài thìa canh lá to (Gymnema Latifolium)

pdf 73 trang thiennha21 15/04/2022 3950
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu thành phần triterpene glycoside từ loài thìa canh lá to (Gymnema Latifolium)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_nghien_cuu_thanh_phan_triterpene_glycoside_tu_loai.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu thành phần triterpene glycoside từ loài thìa canh lá to (Gymnema Latifolium)

  1. TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 222 KHOA HOÁ HỌC ==== NGUYỄN THỊ HOÀI NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN TRITERPENE GLYCOSIDE TỪ LOÀI THÌA CANH LÁ TO (GYMNEMA LATIFOLIUM) KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa Hữu Cơ HÀ NỘI, 2018
  2. TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 222 KHOA HOÁ HỌC ==== NGUYỄN THỊ HOÀI NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN TRITERPENE GLYCOSIDE TỪ LOÀI THÌA CANH LÁ TO (GYMNEMA LATIFOLIUM) KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa Hữu Cơ Ngƣời hƣớng dẫn khoa học PGS. TS. Phan Văn Kiệm HÀ NỘI, 2018
  3. LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này, em đã nhận đƣợc sự giúp đỡ tận tình của các quý thầy cô, anh chị và bạn bè. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn đến thầy giáo PGS.TS Phan Văn Kiệm, ngƣời thấy đã tận tình hƣớng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Cảm ơn các anh, chị trong phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cho em trong suốt thời gian em thực tập. Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để em thực tập tại Viện. Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy giáo PGS.TS. Nguyễn Văn Bằng và các thầy cô giáo trong Khoa Hóa học – Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện giúp đỡ, dạy bảo em trong suốt 4 năm học tập tại trƣờng. Cảm ơn anh chị, bạn bè đã luôn bên cạnh, giúp đỡ em trong suốt thời gian qua. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến gia đình em, những ngƣời thân luôn bên em, hết lòng ủng hộ em cả về vật chất cũng nhƣ tinh thần trong suốt quá trình học tập. Cuối cùng em xin kính chúc thầy cô trong Khoa Hóa học – Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, các thầy cô và các anh chị Phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh biển- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ VIệt Nam dồi dào sức khỏe, thành công trong công việc. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 5 năm 2018 Sinh viên Nguyễn Thị Hoài
  4. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dƣới sự hƣớng dẫn của PGS.TS. Phan Văn Kiệm. Các số liệu, kết quả trong khóa luận là trung thực và là của bản thân tôi. Các kết quả nghiên cứu ra không hề sao chép của ai. Nếu có vấn đề gì không đúng tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Sinh viên Nguyễn Thị Hoài
  5. MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Đại cƣơng về cây thìa canh lá to 3 1.1.1. Khái quát thực vật học [47] 3 1.1.2. Mô tả đặc điểm 3 1.1.3. Phân bố và sinh thái 4 1.1.4. Bộ phận dùng, tính vị, công năng và công dụng 5 1.1.5. Thành phần hóa học 6 1.1.6. Hoạt tính sinh học 15 1.2. Giới thiệu về lớp chất saponin. 17 1.2.1. Giới thiệu chung 17 1.2.2. Các nhóm saponin 17 1.2.2.1. Saponin triterpenoid 18 1.2.2.2. Saponin steroid 21 1.2.3. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của saponin 23 1.3. Các phƣơng pháp chiết mẫu thực vật 25 1.3.1. Đặc điểm chung của chiết 25 1.3.2. Cơ sở của quá trình chiết 25 1.3.3. Quá trình chiết 25 1.3.3.1. Chọn dung môi chiết 25 1.3.3.2. Quá trình chiết 27 1.4. Các phƣơng pháp sắc ký trong phân lớp các hợp chất hữu cơ 28 1.4.1. Đặc điểm chung của phƣơng pháp sắc ký [1] 29 1.4.2. Cơ sở của phƣơng pháp sắc ký 29 1.4.3. Phân loại các phƣơng pháp sắc ký 29
  6. 1.4.3.1. Sắc ký cột (CC) 30 1.4.3.2. Sắc ký lớp mỏng 31 1.5. Một số phƣơng pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ [1] 32 1.5.1. Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR) 32 1.5.2. Phổ khối lƣợng( Mass spectroscopy, MS). 32 1.5.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR) 33 1.5.3.1. Phổ 1H- NMR: 33 1.5.3.2. Phổ 13C-NMR: 34 1.5.3.3. Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Tranfer): 34 1.5.3.4. Phổ 2D-NMR: 34 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1. Mẫu thực vật 36 2.2. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất 36 2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) 36 2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế 36 2.2.3. Sắc ký cột (CC) 36 2.3. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất 37 2.3.1. Điểm nóng chảy (Mp) 37 2.3.2. Phổ khối lƣợng (ESI-MS) 37 2.3.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều ( 1D-NMR) 37 2.3.4. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hai chiều ( 2D-NMR) 37 2.4. Dụng cụ và thiết bị 37 2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết 37 2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc 38 2.5. Hóa chất 38 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM 39
  7. 3.1. Phân lập các hợp chất 39 3.2. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập đƣợc 41 3.2.1. Hợp chất GL5A1 41 3.2.2. Hợp chất GL8B1 41 CHƢƠNG 4: THẢO LUẬN KẾT QUẢ 42 4.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất GL5A1 42 4.2. Xác định cấu trúc của hợp chất GL8B1 49 KẾT LUẬN 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58
  8. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT [α]D Độ quay cực Specific Optical Rotation 13C-NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân Cacbon 13 Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 1H-NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton Proton Magnetic Resonance Spectroscopy 2D-NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hai chiều Two-Dimensional NMR Spectroscoppy CC Sắc ký cột Column Chromatography DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer ESI-MS Phổ khối lƣợng va chạm electron Electron Impact Mass Spectroscopy HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence Mp Điểm nóng chảy Melting point TLC Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography Me Nhóm metyl
  9. DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH VẼ Hình 1.1. Hình ảnh dây thìa canh lá to [48] 3 Hình 1.2. Cấu trúc của saponin 17 Hình 1.3. Khung cấu trúc nhóm olean và β-amyrin 18 Hình 1.4. Khung cấu trúc nhóm Ursan và α-amyrin 18 Hình 1.5. Khung cấu trúc nhóm lupna 19 Hình 1.6. Khung cấu trúc nhóm Hopan 19 Hình 1.7. Hai genin Protopanaxadiol, Protopanaxatriol khung Dammaran. 20 Hình 1.8. Holothurin A khung Lanostan 20 Hình 1.9. Momorcharaside B khung Cucurbitan 21 Hình 1.10. Ba chất sapogenin 22 Hình 1.11. Thủy phân Sarsaparillosid 22 Hình 1.12. Thủy phân Avenacosid A 23 Hình 1.13. Solanin 23 Hình 3.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn MeOH của loài G. latifolium 40 1 Hình 4.1.1. Phổ H-NMR của hợp chất GL5A1 42 13 Hình 4.1.2. Phổ C-NMR của hợp chất GL5A1 43 Hình 4.1.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL5A1 44 Hình 4.1.4. Phổ HSQC của hợp chất GL5A1 45 Hình 4.1.5. Phổ HMBC của hợp chất GL5A1 45 Hình 4.1.6. Phổ HMBC dãn rộng của hợp chất GL5A1 46 Hình 4.1.7. Phổ HMBC dãn rộng của hợp chất GL5A1 46 Hình 4.1.8. Các tƣơng tác HMBC chính của hợp chất GL5A1 47 1 Hình 4.2.1. Phổ H-NMR của hợp chất GL8B1 49 13 Hình 4.2.2. Phổ C-NMR của hợp chất GL8B1 50
  10. Hình 4.2.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL8B1 51 Hình 4.2.4. Phổ HSQC của hợp chất GL8B1 51 Hình 4.2.5. Phổ HMBC của hợp chất GL8B1 52 Hình 4.2.6. Phổ HMBC dãn rộng của hợp chất GL8B1 52 Hình 4.2.7. Phổ HMBC dãn rộng của hợp chất GL8B1 53 Hình 4.2.8. Tƣơng tác HMBC chính của hợp chất GL8B1 53 Bảng 4.1. Bảng số liệu phổ của hợp chất GL5A1 và hợp chất tham khảo 47 Bảng 4.2. Bảng số liệu phổ của hợp chất GL8B1 và hợp chất tham khảo 54
  11. MỞ ĐẦU Ngày nay, các dƣợc phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi và phổ biến trong đời sống với nhiều ƣu điểm nhƣ dễ hấp thu, ít gây độc, ít tác dụng phụ, có sẵn trong tự nhiên, có giá trị kinh tế cao Các hợp chất thiên thể hiện hoạt tính sinh học rát phong phú và là một trong những định hƣớng để con ngƣời có thể tống hợp ra nhiều loại thuốc mới với những ƣu điểm vƣợt trội đƣợc dùng để chữa bệnh mà ít gây các tác dụng phụ cũng nhƣ không ảnh hƣởng đến môi sinh. Vì vậy, việc nghiên cứu nguồn dƣợc liệu trong thiên nhiên để ứng dụng vào sản xuất thuốc phòng và chữa bệnh đang là xu hƣớng hiện nay của y học Việt Nam và y học thế giới. Việt Nam là quốc gia thuộc khu vực Đông Nam Á, nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm nên có nguồn tài nguyên sinh vật vô cùng phong phú. Đặc biệt là nguồn tài nguyên rừng ở nƣớc ta, không chỉ đa dạng về số lƣợng loài mà còn chứa đựng giá trị đa dạng sinh học cao chƣa đƣợc khám phá. Rừng Việt Nam có thảm thực vật phong phú với khoảng 12.000 loài trong đó có 4000 loài đƣợc nhân dân sử dụng làm thảo dƣợc cùng các mục đích khác phục vụ đời sống con ngƣời. Đây chính là nguồn dƣợc liệu quý phục vụ cho việc sản xuất thuốc chữa bệnh phục vụ cho đời sống. Cùng với sự đa dạng do thiên nhiên mang lại, Việt Nam là một trong những quốc gia có nhiều kinh nghiệm trong việc sử dụng các thực vật và sinh vật trong các bài thuốc y học cổ truyền. Từ ngày xa xƣa, ngƣời ta đã biết sử dụng các loại cây phối hợp với nhau để tạo đƣợc thành các bài thuốc dân gian có nhiều tác dụng tốt nhƣ chữa đƣợc nhiều bệnh mà không để lại tác dụng phụ hoặc ít để lại tác dụng phụ. Tuy nhiên, phần lớn các cây thuốc và các bài thuốc mới chỉ đƣợc sử dụng theo kinh nghiệm dân gian mà chƣa đƣợc nghiên cứu, đánh giá một cách 1
  12. khoa học, cũng nhƣ các thành phần hóa học, các chất có hoạt tính sinh học cao trong cây có thể sử dụng để làm thuốc chữa đƣợc nhiều bệnh khác mà chƣa đƣợc phân tích và tách chiết ra. Xuất phát từ các cơ sở trên, việc nghiên cứu và khai thác các chất có hoạt tính sinh học cao từ các nguồn dƣợc liệu ở Việt Nam là rất cần thiết và đặc biệt có ý nghĩa to lớn về mặt khoa học cũng nhƣ thực tiễn. Hiện nay bệnh đái tháo đƣờng là một trong các căn bệnh mãn tính, gây tử vong cao, đứng hàng thứ ba trên thế giới sau bệnh tim mạch và ung thƣ. Ở Việt Nam, tỉ lệ mắc bệnh ngày một gia tăng, đòi hỏi cấp thiết phải tìm ra các loại thuốc hiệu quả đặc trị. Trong y học cổ truyền, loài thìa canh lá to và loài thìa canh có tác dụng tính kích thích dạ dày, đồng thời làm se da, lợi tiểu, lại rất bổ dƣỡng và nhất là làm giảm thiều đƣợc lƣợng đƣờng trong máu. Cây còn có tác dụng chống béo phì, giảm mỡ máu, đặc biệt cây thìa canh lá to còn hỗ trợ điều trị bệnh tiêu đƣờng hiệu quả tự nhiên mà không tốn kém mà lại an toàn, ngoài ra nó còn hỗ trợ điều trị cao huyết áp các nghiên cứu về dƣợc học từ loài thìa canh lá to trên thế giới cho thấy nhiều tác dụng tuyệt vời đặc biệt là đối với bệnh đái tháo đƣờng đang ngày một gia tăng và phổ biến nhƣ hiện nay. Vì vậy em lựa chọn đề tài: với mục đích khảo sát thành phần hóa học nhằm tạo cơ sở cho các nghiên cứu tiếp trong việc nghiên cứu phát triển thuốc mới và giải thích tác dụng chữa bệnh của cây thuốc quý này. Nhiệm vụ của đề tài: 1. Xử lí mẫu và tạo dịch chiết 2. Nghiên cứu phân phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một số hợp chất từ phân đoạn 2
  13. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Đại cƣơng về cây thìa canh lá to 1.1.1. Khái quát thực vật học [47] Tên khoa học: Gymnema latifolium Tên thƣờng gọi: Dây thìa canh lá to Tên khác: Lõa ti lá rộng Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp: Bạc hà Bộ: Long đởm (Gentianales) Họ: Trúc đào (Aposynaceae) Phân họ: Thiên lý (Asclepiadoideae) Chi: Gymnema R.Br Loài: Gymnema latifolium Wall. ex Wight 1.1.2. Mô tả đặc điểm Hình 1.1: Hình ảnh dây thìa canh lá to [48] 3
  14. Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium), còn gọi là Lõa ti lá rộng, là dạng cây thân gỗ, dây leo, thân leo tới 6m. Thân có lỗ vỏ, các nhánh có nhiều lông tơ. Cuống lá 1,5 - 4 cm, có lông tơ dày đặc, phiến lá 8-13 × 5-8 cm, lông dày đặc, càng xa trục càng dày đặc, gốc tròn, ngọn nhọn, gân bên 6-7 cặp. Cụm hoa xim dạng đầu thành từng đôi ở mấu, có lông dày. Một cụm mang rất nhiều hoa, mùi thơm. Cuống cụm hoa 1-1,5 cm, cuống hoa 3-8 mm. Đài hình trứng, phủ lông măng.Tràng hoa vàng, hình chuông, nhẵn ở mặt ngoài. Ống hoa có 5 cặp gờ mang lông ở họng tràng, các thùy hình trứng, khoảng 1,2 × 1,2 mm, phủ lông dày đặc hƣớng trục, ngắn hơn so với ống tràng. Khối nhị nhụy dạng hình trụ, phần phụ nhị dạng màng ngắn hơn so với đầu núm nhụy. Khối phấn hình thuôn. Đầu núm nhụy hình nón, đỉnh phân đôi [8]. Quả đại hình mác nhọn, 4,5-5,5 × 1,5-2 cm. Hạt hình trứng thuôn, dài khoảng 1,1 cm × 5 mm, mép dạng màng, mào lông dài 3 cm [8]. 1.1.3. Phân bố và sinh thái Phân bố: Đảo Andaman và Nicobar, Bangladesh, Trung Quốc (Quảng Đông, Quảng Tây, Vân Nam), Ấn Độ (Arunachal Pradesh, Assam, Kerala, Maharashtra, Tamil Nadu), Myanmar, Thailand, Indonesia [45]. Ở Việt Nam đƣợc trồng ở nhiều nơi nhƣ Cúc Phƣơng( Ninh Bình), Hòa Bình, Thái Nguyên, Thanh Hóa, Nam Định.[8] Sinh thái: Dây thìa canh lá to nói riêng là loài không ƣa trũng, ngập úng nên khi trồng đây thìa canh phải chọn vùng đất cao nhƣng phải thoát nƣớc tốt, đất càng mùn và tơi xốp càng tốt cho cây. Nếu muốn trồng cây ở nhà thì cũng có thể trồng trên sân thƣợng nhƣng nguồn đất phải giàu dinh dƣỡng, đắp ụ đất cao. Đối với dây thìa canh, từ khi trồng đến khi thu hoạch mất khoảng 6-8 tháng, trồng 1 lần có thể thu hoạch 10 năm. Một năm có thể thu hoạch từ 4-5 lần, từ tháng 4-12, cứ 2 tháng thì thu 1 lần. 4
  15. 1.1.4. Bộ phận dùng, tính vị, công năng và công dụng Bộ phận dùng: Thân leo. Thƣờng thu hái dây lá và ngọn non, sơ chế, rửa sạch sau đó đem phơi hay sấy khô. Tính vị, công năng: Dây thìa canh có vị đắng, cay. Lá của cây khi nhai có tác dụng làm tê trong vài giờ, vị giác đối với các chất ngọt và đắng. Có tác dụng mát, bổ, làm dễ tiêu và lợi tiểu. Công dụng: Dây thìa canh đƣợc dùng làm trị đái tháo đƣờng với liều uống hàng ngày là 4g lá khô (Võ Văn Chi, 1997; 396 - 397). Dây thìa canh đƣợc dùng điều trị đái tháo đƣờng ở nhiều nƣớc khác nhau trên thế giới. Ở các nƣớc Đông Nam Á, ngoài công dụng trị đái tháo đƣờng, rễ và lá đƣợc dùng trị viêm khớp dạng thấp, bệnh gút, viêm mạch máu, phù, sốt, ho, trĩ, nhọt, mụn, lở, rắn cắn, thuốc làm dễ tiêu và lợi tiểu. Lá có khi đƣợc dùng làm rau ăn. Ở Trung Quốc, tất cả các bộ phận của cây, đặc biệt là rễ, đƣợc dùng trị viêm khớp dạng thấp, bệnh gút, viêm mạch máu, phù, sốt, trĩ và rắn cắn (Lemnens R.M.H.J. et al., 2003: 228 - 236). Ở Ấn Độ, lá của dây thìa canh đƣợc dùng trị đái tháo đƣờng và một số chứng bệnh khác nhƣ khó tiêu, trĩ, táo bón, sốt rét, ho, viêm phế quản, hen. Dây thìa canh đƣợc dùng làm thuốc trợ tim, lợi tiểu, làm dễ tiêu, nhuận trành, gây tăng trƣơng lực cơ tử cung, trị các bệnh đa tiết mật, giác mạc và thể kính ở bệnh nhân đái tháo đƣờng. Lá đắp trị vết thƣơng và trộn với dầu thầu dầu đắp trị sƣng hạch, gan to và lách to. Rễ tán bột chữa rắn cắn. Quả đắng và có tác dụng làm giảm trƣớng bụng, và đƣợc dùng trị bệnh phong, đái tháo đƣờng, viêm phế quản, chữa loét, trị ngộ độc và diệt giun. Toàn cây dùng trị lỵ. Trong thú y, dây thìa canh đƣợc dùng cho gia súc ăn để lợi sữa. 5
  16. Ở Đông Phi, rễ tán bột và sắc lấy nƣớc uống để điều trị động kinh, rắn cắn và dùng ngoài trị nhọt (Kirtikar K.R. et al., 1998: 1625 - 1627; Williamson E.M. et al., 2003: 228 - 236) 1.1.5. Thành phần hóa học Dây thìa canh lá nhỏ (Gymnema sylvestre) từ lâu đã đƣợc biết đến rộng rãi với tác dụng hạ đƣờng huyết và kiểm soát béo phì. Giai đoạn gần đây, một loài dây thìa canh khác là dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) đã đƣợc khẳng định có kết quả tốt hơn hẳn so với dây thìa canh lá nhỏ. Cho đến nay, loài Gymnema latifolium chỉ mới đƣợc nghiên cứu rất sơ lƣợc về thành phần hóa học. Các nhóm chất chứa trong cây này chỉ mới đƣợc đề cập đến trong rất ít các tài liệu, bao gồm: HCN-glucosid [36], saponin, flavonoid, tanin, sterol, chất béo acid amin, đƣờng khử và coumarin trong loài Gymnema latifolium Wall. Ex Wight thu hái tại Hòa Bình [2]. Các nghiên cứu về thành phần hóa học vẫn đang tập trung vào loài Gymnema sylvestre. Theo đó các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Gymnema đƣợc bắt đầu vào những năm 1950, chủ yếu bởi các nhà khoa học Ấn Độ. Nghiên cứu về thành phần hóa học thực sự bắt đầu khi có các thiết bị xác định cấu trúc Hoạt tính sinh học đặc trƣng của loài G. sylvestre là khả năng hạ đƣờng huyết [9]. Tuy nhiên nhƣ phổ cộng hƣởng từ nhân NMR, phổ khối lƣợng MS. Các nghiên cứu cho thấy G. sylvestre có thành phần hóa học rất đa dạng, trong đó thành phần chính là các conduritol, gymnemasin. Vào khoảng những năm 1980-1990, các nhà khoa học Nhật Bản tập trung mạnh vào nghiên cứu thành phần hóa học loài này. Cụ thể từ lá loài G. sylvestre đƣợc các nhà khoa học Nhật Bản đã phân lập và xác định cấu trúc của một hợp chất mới conduritol A (1) [10]. Hợp chất này đã đƣợc phát hiện có khả năng ức chế enzyme aldose mạnh trên chuột và không gây độc [11]. Tiếp đó, 6
  17. Yoshikawa và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc thành công của 7 hợp chất mới gymnemic acid I-VII (2-8) [12, 13]. Trong quá trình tìm kiếm các hợp chất có tác dụng diệt cỏ, Yoshikawa và cộng sự đã phân lập và xác định đƣợc 5 hợp chất mới từ lá loài G. sylvestre là gymnemic acid VIII-XII (9-13) [14]. Từ lá loài G. sylvestre, Sahu và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của 4 hợp chất mới, đƣợc đặt tên là gymnemasin A-D (14-17) [15]. Tiếp đó vào năm 1996, Murakami và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của 2 hợp chất mới, đặt tên là gymnemoside a và b (18-19) cùng với 10 hợp chất đã biết. Cũng tiếp tục nghiên cứu này, Yosikawa và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học và đã xác định đƣợc 4 hợp chất mới và đƣợc đặt tên là gymnemoside c-f (20-23) [16]. Các nhà khoa học Trung Quốc, đã phân lập và xác định cấu trúc của 6 hợp chất mới (24-29) và 2 hợp chất đã biết [17]. 7
  18. Otigloyl OH OAc HOOC OH O HO HO O O O HO HO OH 13 OH OH OR OR OH OH OH OH HOOC O HO HO O O O GlcUAO HO HO OH 14 R = Tigloyl 16 R = Tigloyl OH 15 R = H 17 R = H OH OH Otigloyl O R2 OH O OH OR2 OAc GlcUAO HOOC OH O R1 R2 HO 18 OAc H HO O 19 OH Ac OH OH OH 20 OH OH OS2 OH OH HO HO OS1 OS1 21 22 O O O O O OH S1 OH OH HO HO HO HO HOHO OS2 O HO O O OH OH OH S2 HO HO HOHO HO OS1 23 Vào năm 2001, Ye và cộng sự cũng đã tiến hành nghiên cứu và phát hiện ra 4 hợp chất mới có tác dụng diệt cỏ từ loài G. sylvestre, 4 hợp chất này đƣợc đặt tên là: 21α-O-benzoylsitakisogenin 3-O-α-D-glucopyranosyl(1→3)-α-D- 8
  19. glucuronopyranoside (30), longispinogenin 3-O-α-D-glucopyranosyl(1→3)-α- D-glucuronopyranoside potassium (31), 29-hydroxylongispinogenin 3-O-α-D- glucopyranosyl(1→3)-α-D-glucuronopyranoside potassium (32), alternoside II sodium (33) [18]. Liu và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của 1 hợp chất mới (34) và 4 hợp chất đã biết từ loài G. sylvestre [19]. Tiếp nối các nghiên cứu, Zhu và cộng sự đã phân lập đƣợc 2 hợp chất mới, 16β-hydroxyl olean-12-en-3-O-[β-D- glucopyranosyl (1→6)-β-D-glucopyranosyl]-28-O-β-D-glucopyranoside (35) và 16β,21β,28-trihydroxy-olean-12-ene-3-O-glucoronopyranoside (36) [20]. 9
  20. Zhang và cộng sự đã thông báo phân lập đƣợc 1 hợp chất mới, 3β,16 β,22α- trihydroxy-olean-12-ene3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl- (1→6)-β-D-glucopyranoside (37) và 4 hợp chất đã biết từ loài G. sylvestre [21]. Zarrelli và cộng sự thông báo đƣợc 7 hợp chất mới, bao gồm 6 oleanane (38-43): 3β,16β,21β,23-tetrahydroxyolean-12-ene, 3β,16β,21α,23,28-pentahydroxyolean- 12-ene, 3β,16β,23,28-tetrahydroxyolean-13(18)-ene, 16β,23,28-trihydroxyolean- 12-en-3-one, 16β,21β,23,28-tetrahydroxyolean-12-en-3-one, 16β,21β,22α,23,28- pentahydroxyolean-12-en-3-one và 1 lupane 3β,16β,23,28-tetrahydroxylup- 20(29)-ene (44) cùng với 6 hợp chất đã biết từ phần trên mặt đất loài G. sylvestre [22]. 10
  21. Cũng các nghiên cứu thuộc nhóm tác giả này tiếp tục công bố 6 hợp chất mới khác, đó là (3β,16β)-olean-12-ene-3,16,23,28-tetrayl tetraacetate, (3β,16β,21β,22α)-3,16,22,23,28-pentahydroxyolean-12-en-21-yl(2S)-2- methylbutanoate, (3β,16β,21β,22α)-28-(acetyloxy)-3,16,22,23-tetrahydroxyolean- 12-en-21-yl (2S)-2-methylbutanoate, (3β,16β,21β,22α)-3,16,22,23,28-pentakis (acetyloxy)olean-12-en-21-yl (2S)-2-methylbutanoate, (3β,16β,21β,22α)- 3,16,22,23,28-pentahydroxyolean-12-en-21-yl (2E)-2-methylbut-2-enoate, và (3β,16β)-lupane-3,16,20,23,28-pentol (45-50) [23]. 11
  22. Từ loài G. inodorum, Wang và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của 2 hợp chấtmới: 2α,3β-dihydroxy-olean-12-ene-23,28-dioicacid-3-O-β-D- glucopyranoside và 2α,3β,15β-trihydroxy-olean-12-ene-23,28-dioic acid-3-O- β-D-glucopyranoside [24]. Cũng từ loài này, Atsuchi và cộng sự đã phân lập đƣợc 1 hợp chất mới (3β,16β)-16,28-dihydroxyolean-12-en-3-yl-2-O-β-D- glucopyranosyl-β-D-glucopyranosiduronic acid [25]. 12
  23. Từ loài G. alternifolium, Yoshikawa và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của 6 hợp chất mới và đƣợc đặt tên là gymnepregoside A-F [26]. Cũng từ loài này, nhóm tác giả tiếp tục công bố phân lập và xác định cấu trúc của 11 hợp chất mới khác và đặt tên là gymnepregoside G-Q [27]. 6 hợp chất mới đặt tên là gymnetinoside A-F cùng với 6 hợp chất cũ, sequinoside K, khaephuoside B, and albibrissinoside A (60-69) đƣợc Tian và cộng sự phân lập từ loài G. tingens. Các hợp chất này đƣợc phát hiện có khả năng bảo vệ tế bào gan mạnh [28]. 13
  24. 8 hợp chất mới thuộc khung pregnane steroidal glycoside đã đƣợc phân lập từ vỏ quả loài G. griffithii và đƣợc đặt tên là gymnemogriffithoside A-H. Các hợp chất này đã đƣợc đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên 5 dòng tế bào ung thƣ (BT 474, Chago, Hep-G2, KATO-III và SW620) và hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase và thể hiện hoạt tính ở mức độ trung bình [29]. 14
  25. 1.1.6. Hoạt tính sinh học Bên cạnh việc sử dụng phổ biến để điều trị bênh tiểu đƣờng, các loài thuộc chi Gymnema còn đƣợc sử dụng để điều trị một số bệnh nhƣ béo phì, viêm khớp, bệnh Parkinson và bệnh sơ vữa động mạch. Các hoạt chất từ các loài thuộc chi Gymnema đã đƣợc nghiên cứu về tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn, và kháng ung thƣ, và kháng cỏ dại. Dƣợc tính của các loài này đã đƣợc nghiên cứu rộng dãi. Hơn 70 hợp chất mới đã đƣợc phân lập. Dịch chiết đã đƣợc nghiên cứu lâm sàng và trên động vật. Các hoạt tính đƣợc thử nghiệm bao gồm: Hoạt tính trị bệnh tiểu đường Tác dụng hạ đƣờng huyết của dịch chiết saponin cùng với 5 triterpene saponin gymnemic acid I-IV và gymnemasaponin V từ loài G. sylvestre đã đƣợc thông báo. Hợp chất gymnemic acid IV (3.4/13.4 mg/kg) đƣợc phát hiện có tác dụng hạ đƣờng huyết từ 14,0-60% trong vòng 6h khi so sánh với glibenclamide. Thêm vào đó, hợp chất này cũng làm tăng lƣợng insulin khi cho chuột bị tiểu đƣờng uống ở nồng độ 13.4 mg/kg [30]. Nghiên cứu khác về tác dụng hạ đƣờng huyết của lá loài G. sylvestre thông qua kiểm soát hàm lƣợng glyucose trong máu và lipid trên chuột Wistar ở nồng độ 200mg/kgP. Kết quả cho thấy dịch chiết loài này làm giảm đáng kể đƣờng trong huyết tƣơng và mỡ máu (thông qua các thông số cholesterol VLDL, LDL) [31]. Với liều triacetate dihydroxy gymnemic (20 mg/kgP) bằng đƣờng uống trong 45 ngày trên chuột bị tiểu đƣờng. Các thông số đánh giá bao gồm đƣờng huyết, insulin, hemoglobin glycated (HbA1c), mô glycogen, các thông số lipid nhƣ triglycerid, cholesterol tổng, LDL-cholesterol, HDL-cholesterol và họat tính của các enzym gan đánh dấu, nhƣ aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase (ALP) và phosphatase acid (ACP). Kết quả cho thấy hợp chất dihydroxy triacetate gymnemic tại liều 20 15
  26. mg đã tác động đáng kể trên tất cả các thông số sinh hóa học so với nhóm chuột mang bệnh tiểu đƣờng [32]. Gymnemic acid từ lá loài G. sylvestre đã làm tăng đáng kể sự tiết ra insulin từ tế bào β- tuyến tụy của chuột mang bệnh tiểu đƣờng [33]. Một nghiên cứu ở cấp độ lâm sàng về tác dụng tiết insulin của dịch chiết ethanol loài G. sylvestre thông qua đƣờng uống (500 mg/ngày) trong 60 ngày cho thấy nồng độ glucose trong máu lúc đói giảm từ 162 mg/L xuống còn 119 mg/L, nồng độ glucose trong máu sau ăn giảm từ 291 mg/L xuống 236 mb/L; tăng nồng độ insulin huyết thanh từ 24 đến 32 μU/mL, tăng nồng độ C-peptide huyết thanh từ 298 đến 447 pmol/L, nhƣng không ảnh hƣởng đến cân nặng [34]. Một số nghiên cứu về tác dụng hạ đƣờng huyết loài G. inodorum đã chỉ dịch chiết cũng nhƣ các hợp chất từ loài này đã thể hiện tác dụng hạ đƣờng huyết mạnh [35, 36]. Hoạt tính chống béo phì Saponin từ dịch chiết nƣớc của lá loài G. sylvestre đã đƣợc phát hiện có tác dụng chống béo phì tƣơng đƣơng với orlistat, một loại thuốc tổng hợp dùng để điều trị bệnh béo phì [37]. Dịch chiết nƣớc loài G. sylvestre đã phát hiện có khả năng chống béo phì trên chuột thông qua giảm nồng độ serum lipid, leptin, insulin, glucose, apolipoprotein B và LDH trong khi tăng nồng độ HDL-cholesterol, apolipoprotein A1 [38]. Hoạt tính kháng viêm khớp Dịch chiết nƣớc và ether dầu hỏa từ lá loài G. sylvestre đã đƣợc phát hiện có tác dụng rõ rệt trong việc kiểm soát hiệu quả bệnh nhân viêm khớp [34]. Thêm vào đó, các dịch chiết khác nhau từ loài này cũng đã đƣợc phân bố đều trong 1% Tween 8 và diclofenac sodium cho chuột viêm đa khớp uống 1 lần/ngày trong 21 ngày. Kết quả cho thấy dịch chiết ether dầu hỏa làm giảm rõ các yếu tố viêm nhƣ IL-1b, TNF-α, GM-CSF, PGDF [39]. 16
  27. Ngoài ra, còn có một số nghiên cứu về hoạt tính diệt tế bào ung thƣ [40], kháng viêm [41], kháng khuẩn [42] từ các hợp chất cũng nhƣ cặn chiết của loài thuộc chi Gymnema. 1.2. Giới thiệu về lớp chất saponin. 1.2.1. Giới thiệu chung Saponin hay saponoid là một nhóm glycosid lớn, Sapo trong tiếng la tinh có nghĩa là xà phòng. Saponin có mặt trong các lòa thực vật nhƣ một số cây họ đậu: đậu tƣơng, đậu Hà Lan và một số loài động vật nhƣ: hải sâm, cá sao Cấu trúc saponin gồm 2 phần: Aglycone và Glycone. SAPONIN Glycone Aglycone Sugar Sapogen 1. Glucose 2.Arabinos e Neutral Acid 3. Xylose 4. Glucuronic Steroids Triterpenoi Hình 1.2. Cấu trúc của saponin d Dựa theo cấu trúc hóa học có thể chia ra: saponin triterpenoid và saponin steroid. 1.2.2. Các nhóm saponin Các hợp chất saponin đƣợc phân loại thành 2 nhóm khác nhau dựa vào khung cấu trúc hóa học của các hợp chất: 17
  28. 1.2.2.1. Saponin triterpenoid Saponin triterpenoid có bản chất là các hợp chất triterpenoid gốm 6 nhóm hemitrerpen, tạo nên 2 loại: - Saponin triterrpenoid pentacyclic: Bao gồm các nhóm nhỏ: Olean, Ursan, Lupan, Hopan. + Nhóm Olean: Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm này. 29 30 R 20 4 R5 19 21 12 18 11 22 25 17 1 28 R3 2 16 8 15 27 4 3 5 7 (A) 6 OH 23 24 R R2 1 olean β-amyrin R1=R2=R3=R4=R5= CH3 Hình 1.3. Khung cấu trúc nhóm olean và β-amyrin Cấu trúc hóa học: Phần aglycon thƣờng có 5 vòng và thƣờng là dẫn chất của 3-hydroxy olean 12-ene, tức là -amyrin. + Nhóm Ursan: Nhóm ursan có cấu trúc tƣơng tự olean chỉ khác nhau ở nhóm methyl ở C-30 không đỉnh vào vị trí C-20 mà đỉnh vào C-19. CH3 H Ursan α-amyrin Hình 1.4. Khung cấu trúc nhóm Ursan và α-amyrin 18
  29. Các sapogenin nhóm ursan thƣờng là những dẫn chất của 3-hydroxy ursan 12-ene, tức là -amyrin. + Nhóm Lupan: E C D A B Lupan Hình 1.5. Khung cấu trúc nhóm lupna Cấu trúc của nhóm lupan có các vòng A,B,C,D giống các nhóm trên chỉ khác vòng E là vòng 5 cạnh, C-20 ở ngoài vòng và thƣờng có nối đôi ở vị trí C20-C29. + Nhóm Hopan: cấu trúc của nhóm hopan có các vòng A, B, C, D giống nhƣ các nhóm trên, vòng E là vòng 5 cạnh giống nhóm lupan. Tuy nhiên, nhóm C-22 ở ngoài vòng và nhóm methyl gốc đỉnh C-18 thay vì ở C-17. Hopan Hình 1.6. Khung cấu trúc nhóm Hopan 19
  30. - Saponin triterpenoid: Nhóm này đƣợc chia làm 3 nhóm nhỏ: Dammaran, Lanostan, Cucurbitan. + NHóm Dammaran: Phần Aglycon gồm 4 vòng và một mạch nhánh, Khi tác dụng bởi acid thì mạch nhánh đóng vòng tạo thành vòng tetrahydropyran. Bằng các phƣơng pháp đặc biệt để cắt phần đƣờng, ngƣời ta đã thu đƣợc các genin thật. Hai genin chính là protopanaxadiol và protopanaxatripol. Phần đƣờng nối vào OH ở C-3 hoặc có khi thêm một mạch nữa nối vào OH ở mạch nhánh. OH OH OH OH OH OH OH Protopanaxadiol Protopanaxatriol Hình 1.7. Hai genin Protopanaxadiol, Protopanaxatriol khung Dammaran. + Nhóm Lanostan: Holothurin A, một trong những saponin có trong các loài hải sâm - Holothuria spp là một ví dụ của nhóm này. H O O O O OH Na O O S OH H O O H OH OH OH OH O H HO OH HO O O O H H H O O O O OH OH Hình 1.8. Holothurin A khung Lanostan 20
  31. + Nhóm Cucurbitan: Phần lớn các saponin nhóm cucurbitan gặp trong họ cucurbitaceae. Ở đây nhóm CH3 gốc thay vì ở vị trí C-10 lại đính ở C-9. OH OH OH OH OH O OH O OH OH Hình 1.9. Momorcharaside B khung Cucurbitan 1.2.2.2. Saponin steroid - Nhóm spirostan: Ta xét 3 chất sapogenin làm ví dụ: sarsasapogenin, smilagenin, tigogenin. Những chất này có 27 carbon nhƣ cholesterol, nhƣng mạch nhánh từ C20-27 tạo thành 2 vòng có oxy (16,22 và 22,26 diepoxy), một vòng là hydrofuran (vòng E) và một vòng là hydropyran (vòng F). Hai vòng này nối với nhau bởi một carbon chung ở C-22. Mạch nhánh này đƣợc gọi là mạch nhánh spiroacetal. 21 26 O O 20 22 25 18 F 27 E 12 17 O 23 24 O 11 19 13 D 16 C 1 9 15 2 10 8 14 H H 3 A 5 B 7 OH OH 6 4 H H Sarsasapogenin Smilagenin 21
  32. O O H OH H Tigogenin Hình 1.10. Ba chất sapogenin Các sapogenin nhóm này có nối vòng C Và D trans. Còn vòng A và B có thể là cis nhƣ ở chất sarsasapogeninvà smilagenin hoặc có thể là trans nhƣ ở chất tigogenin. - Nhóm furostan: Nhóm này có cấu trúc tƣơng tự nhƣ nhóm spirostan chỉ khác là vòng F bị biến đổi. Trƣờng hợp thứ nhất: vòng F mở và nhóm ancol bậc 1 ở C-26 đƣợc nối với đƣờng glucose. Nếu glucose ở C-26 bị cắt (bởi enzim hoặc acid) thì xảy ra sự đóng vòng F thành vòng hydropyran và chuyển thành dẫn chất nhóm spirostan. Ví dụ sarsaparillosid dƣới tác dụng của enzym thủy phân cắt mạch glucose ở C-26 sẽ chuyển thành parillin. CH2-O-gle CH3 OH CH3 O H H O enzym O H H duong O duong H O Sarsaparillosid Parillin Hình 1.11. Thủy phân Sarsaparillosid Trƣờng hợp thứ hai: vòng F là vòng 5 cạnh do sự đóng vòng 22-25 epoxy, ví dụ avenacosid có trong yến mạch (Avena L. Họ lúa - Poaceae). 22
  33. Avenacosid A cũng có 2 mạch đƣờng. Khi thủy phân cắt đƣờng glucose ở C- 26 thì cũng chuyển thành dẫn chất nhóm spirostan. OH CH3 CH3 O CH2 -O-gle O O O H+ duong O HO Avenacosid Ionuatigenin Hình 1.12. Thủy phân Avenacosid A - Nhóm aminifurostan: Ở đây vòng F mở nhƣ trƣờng hợp sarsaparillosid nói ở trên nhƣng ở vị trí C-3 đính nhóm NH2. - Nhóm Spirosolan: Nhóm này chỉ khác nhóm spirostan ở nguyên tử oxy của vòng F đƣợc thay bằng NH. Một điểm cần chú ý là ở đây có isomer ở C- 22 (khác với nhóm spirostan) - Nhóm Solanidan: Solanin có trong mầm khoai tây thuộc nhóm này. Ở đây 2 vòng E và F cùng chung 1C và 1N N O duong Solanin Hình 1.13. Solanin 1.2.3. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của saponin Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho. Saponin là hoạt chất chính trong các dƣợc liệu chữa ho nhƣ viễn chí, cát cánh, cam thảo, thiên môn, sạch môn, Một số dƣợc liệu chứa saponin có tác dụng thông tiểu nhƣ rau má, tỳ 23
  34. giải, thiên môn, mạch môn Saponin có mặt trong một số vị thuốc bổ tăng cƣờng sinh lực nhƣ nhân sâm, tam thất, ngũ gia bì, đinh lăng và một số cây thuốc họ nhân sâm khác. Saponin làm tăng sự thấm của tế bào, sự có mặt của saponin sẽ làm cho các hoạt chất khác dễ hòa tan và hấp thu. Một số có tác dụng chống viêm nhƣ saponin cam thảo, ngƣu tất, cỏ xƣớc. Một số có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế hoạt động của virut nhƣ saponin cam thảo, lá cà chua, mầm khoai tây. Một số có tác dụng chống ung thƣ trên thực nghiệm. Nhiều saponin có tác dụng diệt các loài thân mền (nhuyễn thể). Sapogenin steroid dùng làm nguyên liệu để bán tống hợp các thuốc steroid. Digitonin dùng để định lƣợng cholesterol. Saponin trong đậu nành cũng giống nhƣ phytate, hành xử nhƣ chất anti-oxidants để bảo vệ tế bào cơ thể chúng ta khỏi bị hƣ hại do tác dụng các gốc tự do. Nó cũng còn có khả năng trực tiếp ngăn cản sự phát triển ung thƣ kết tràng và đồng thời làm giảm lƣợng cholesterol trong máu. Saponin trong nhân sâm làm tăng chuyển hóa lipid, theo các thí nghiệm, nhân sâm có thể ngăn ngừa sự phát sinh cholesterol cao ở thỏ, vì vậy mà ngăn ngừa đƣợc sự hình thành xơ vữa động mạch. Ngƣời ta đã khám phá ra những tác dụng của nhân sâm và các thành phần hóa học đơn lẻ của nó, dặc biệt là saponin (còn gọi là ginsenoside). Trong đó có một hoạt chất mang tên gọi là Ginsenoside Rh2- đây là một trong hơn 30 loại saponin có trong thành phần của Nhân sâm. Saponin tam thất Việt Nam chứa chủ yếu saponin dammaran. Các nhà khoa học đã phân lập đƣợc hai saponin chủ yếu của Tam thất Việt Nam và xác định chúng là ginsenosid- Rb1 và ginsenosid- Rg1. Saponin Rg có tác dụng hƣng phấn trung khu thần kinh, có tác dụng chống mệt mỏi, tăng khả năng lao động trí óc và chân tay, nhƣng loại Saponin nhƣ Rb thì có tác dụng ức chế trung khu thần kinh biểu hiện an thần gây ngủ [3,4]. 24
  35. 1.3. Các phƣơng pháp chiết mẫu thực vật 1.3.1. Đặc điểm chung của chiết Khái niệm: Chiết là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào quá trình chuyển một chất hòa tan trong một pha lỏng vào một pha lỏng khác không hòa tan với nó Mục đích của chiết: + Chuyển một lƣợng nhỏ chất nghiên cứu trong một thể tích lớn dung môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác nhằm nâng cao nồng độ của chất cần nghiên cứu và đƣợc gọi là chiết làm giàu. + Ngoài ra còn dùng phƣơng pháp chiết pha rắn để tách hay phân ly các chất trong một hỗn hợp phức tạp với điều kiện thích hợp. Thƣờng dùng trong phân tách các hợp chất tự nhiên. 1.3.2. Cơ sở của quá trình chiết Dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất trong hai chất lỏng không hòa tan lẫn với nhau. Sự phân bố khác nhau là do tính tan khác nhau của các chất trong các pha lỏng. Quá trình chiết dựa trên định luật Nerst: KA = CA / CB KA: hằng số phân bố CA, CB : nồng độ các chất hòa tan trong chất lỏng A, B không hòa tan lẫn vào nhau. 1.3.3. Quá trình chiết 1.3.3.1. Chọn dung môi chiết Trông thƣờng các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau. Tuy nhiên những thành phần tan trong nƣớc ít khi đƣợc quan tâm. Dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải đƣợc lựa chọn rất cẩn thận. 25
  36. Điều kiện của dung môi là phải hòa tan đƣợc những chất chuyển hóa thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng đƣợc loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy. Những dung môi này nên đƣợc chƣng cất để thu đƣợc dạng sạch trƣớc khi sử dụng nếu chúng có lẫn các chất khác có thể ảnh hƣởng tới hiệu quả và chất lƣợng của quá trình chiết. Thƣờng có một số chất dẻo lẫn trong dung môi nhƣ các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetyniat và tributylphotphat. Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất dung môi hoặc khâu bảo quản nhƣ các thùng nhựa hoặc các nút nhựa. Methanol và chloroform thƣờng chứa đioctylphtalat [đi-(2-etylhexyl) phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hóa thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Chlorofrom, metylen clorit và methanol là những dung môi thƣờng đƣợc lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây nhƣ: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa Những tạp chất của cloroform nhƣ CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ững với một vài hợp chất nhƣ các ankaloit tạo muối bậc bốn và những sản phẩm khác. Tƣơng tự nhƣ vậy sự có mặt của lƣợng nhỏ axits clohidric (HCl) cũng có thể gây ra sự phân hủy, sự khử nƣớc hay sự đồng phân hóa với các hợp chất khác. Vì chloroform có thể gây tổn thƣơng cho gan và thận nên nó cần đƣợc thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng và phải đeo mặt lạ phòng độc. Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn chloroform. Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hidrocacbon thế clo. Ngƣời ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rƣợu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu đƣợc lƣợng lớn các thành phần trong tế bào. Trái lại khả năng phân cực của Chlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol 26
  37. hòa tan phân lớp các chất chuyển hóa phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình thấp. Vì vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị hòa tan đồng thời. Thông thƣờng dung môi cồn trong nƣớc có những đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ. Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới đƣợc tạo thành khi dùng methanol trong suốt quá trình chiết. thí dụ trechlonolide A thu đƣợc từ Trechonaetes aciniata đƣợc chuyển thành trechonolide B bằng quá trình phân hủy 1-hydroxytropcocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense đƣợc chiết trong methanol nóng. Ngƣời ta thƣờng ít sử dụng nƣớc để thu đƣợc dịch chiết thô từ cây mà thay vào đó là dùng dung dịch nƣớc của methanol. Đietyl ete hiếm khi đƣợc dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời có xu hƣớng tạo thành peroxit dễ nổ, peroxit của đietyl êt dễ gây phản ứng oxi hóa với những hợp chất không có khả năng tạo Cholesterol nhƣ các carotenoid. Tiếp đến là axeton cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2 - cis - diol có mặt trong môi trƣờng axit. Quá trình chiết dƣới điều kiện axit hoặc bazo thƣờng đƣợc dùng với quá trình phân tách đặc trƣng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit – bazo có thể tạo thành những sản phẩm mong muốn. Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hóa thứ cấp trong cây đƣợc chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết tránh đƣợc sự phân hủy chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất mong muốn. Sau khi chiết dung môi đƣợc cất ra bằng máy cắt quay ở nhiệt độ không quá 30- 40oC, với một hóa chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn. 1.3.3.2. Quá trình chiết Hầu hết quá trình chiết đơn giản đƣợc phân loại nhƣ sau: 27
  38. - Chiết ngâm - Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet. - Chiết sắc với dung môi nƣớc - Chiết lôi cuốn theo hơi nƣớc Chiết ngâm là một trong những phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian. Thiết bị sử dụng là một bình thủy tinh với một cái khóa ở dƣới đáy để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách nửa dung môi. Dung môi có thể nóng hoặc lạnh nhƣng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Trƣớc đây, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhƣng hiện nay có thể dùng bằng thủy tinh. Thông thƣờng quá trình chiết ngâm không đƣợc sử dụng nhƣ phƣơng pháp chiết liên tục bởi mẫu đƣợc ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ rồi chất chiết đƣợc lấy ra. Thế tahông thƣờng quá trình chiết một mẫu chỉ thực hiện qua ba lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa. Sự kết thúc quá trình chiết đƣợc xác định bằng một vài cách khác nhau. Nhƣ vậy tùy thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý nhằm đạt hiệu quả cao. Ngoài ra, có thể dựa vào mỗi quan hệ của dung môi và chất tan của các hợp chất mà ta có ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết. 1.4. Các phƣơng pháp sắc ký trong phân lớp các hợp chất hữu cơ Phƣơng pháp sắc ký (chromatography) là một phƣơng pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay, đƣợc sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng. 28
  39. 1.4.1. Đặc điểm chung của phƣơng pháp sắc ký [1] Sắc ký là phƣơng pháp tách các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chũng giữa hai pha động và tĩnh. Sắc ký gồm có pha tĩnh và pha động. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và23 pha tĩnh tƣơng ứng với tính chất của chúng ( tính bị hấp phụ, tính tan ). Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình pha động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tƣơng tác yếu hơn với pha này. Nhờ đặc điểm này mà ngƣời ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký. 1.4.2. Cơ sở của phƣơng pháp sắc ký Phƣơng pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha động và pha tĩnh. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc của lƣợng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc cới chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir: N = n- lƣợng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng - lƣợng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó b- hằng số C- nồng độ của chất bị hấp phụ 1.4.3. Phân loại các phƣơng pháp sắc ký Trong các phƣơng pháp sắc ký pha động là các lƣu thể ( các chất ở trạng thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn. Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, ngƣời ta chia sắc ký thành hai nhóm 29
  40. lớn: sắc ký khí và sắc ký lớp mỏng. Dựa vào cách tiến hành sắc ký, ngƣời ta chia ra thành các phƣơng pháp sắc ký chủ yếu sau: 1.4.3.1. Sắc ký cột (CC) Đây là phƣơng pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các loại Silica gel (có kích thƣớc hạt khác nhau) pha thƣờng và pha đảo YMC, ODS, Dianion Chất hấp phụ đƣợc nhồi vào cột (cột có thể bằng thủy tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thủy tinh). Độ mịn của chất hấp phụ hết sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hoặc khả năng tách của chất hấp phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao và ngƣợc lại. Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có kích thƣớc hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm. Trong một số trƣờng hợp nếu lực trọng trƣờng không đủ lớn thì gây ra hiện tƣợng tắc cột (dung môi không chảy đƣợc ), khi đó ngƣời ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC), áp suất cao (HPLC). Trong sắc ký cột, tỷ lệ đƣờng kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc ký, tỷ lệ giữa quang đƣờng đi của chất cần tách so với quãng đƣờng đi của dung môi gọi là quãng đƣờng đi của chất cần tách so với quãng đƣờng đi của dung môi gọi là Rf , với mỗi một chất sẽ có Rf khác nhau. Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp. Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng và tùy thuộc vào yêu cầu tách. Nếu tách thô thì tỉ lệ này thấp (từ 1/5 1/10), còn nếu tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tùy thuộc vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau của Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20 1/30. Trong sắc ký cột, việc đƣa chất lên cột hết sức quan trọng. Tùy thuộc vào lƣợng chất và dạng chất mà ngƣời ta có thể đƣa chất lên cột bằng các phƣơng pháp khác nhau. Nếu lƣợng chất nhiều và chạy 30
  41. thô, thì phổ biến là tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đƣa lên cột. Nếu tách tinh, thì đƣa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan chất bằng dung môi chạy cột với dung lƣợng tối thiểu Có hai cách đƣa chất hấp phụ lên cột: - Cách 1: Nhồi cột khô. Theo cách này, chất hấp phụ đƣợc đƣa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột. Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt. - Cách 2: Nhồi cột ƣớt, tức là chất hấp phụ đƣợc hòa tan trong dung môi chạy cột trƣớc với lƣợng dung môi tối thiểu. Sau đó đƣa dần vào cột đến khi đủ lƣợng cần thiết. Khi chuẩn bị cột phải lƣu ý không đƣợc để bọt khí bên trong (nếu có bọt khí gây nên hiện tƣợng chạy rối loạn trong cột và giảm hiệu quả tách), và cột không đƣợc nứt, gãy, dò. Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hƣởng đến hiệu quả tách. Nếu tốc độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Còn nếu tốc độ dòng chảy quá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hƣởng đến tiến độ công việc. 1.4.3.2. Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng (SKLM) thƣờng đƣợc sử dụng để kiểm tra và định hƣớng cho sắc kí cột. SKLM đƣợc tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn Silicagel trên đế nhôm hay đế thủy tinh. Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu chất trực tiếp. Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản đƣợc tráng Silica gel dày hơn ), có thể đƣa lƣợng chất nhiều hơn lên bản, và sau khi chạy sắc ký, ngƣời ta có thế cạo riêng phần silica gel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu đƣợc từng chất riêng biệt. Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trƣng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%. 31
  42. 1.5. Một số phƣơng pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ [1] Cấu trúc hóa học các hợp chất hữu cơ đƣợc xác định nhờ vào các phƣơng pháp phổ kết hợp. Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng chất mà ngƣời ta sử dụng phƣơng pháp phổ cụ thể nào. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phổi hợp các phƣơng pháp phổ càng cao. Trong một số trƣờng hợp, để xác định chính xác cấu trúc hóa học của các hợp chất, ngƣời ta phải dựa vào các phƣơng pháp phổ bổ sung khác nhƣ chuyển hóa hóa học, kết hợp với các phƣơng pháp sắc ký so sánh 1.5.1. Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR) Phổ hồng ngoại đƣợc xác định dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dƣới sự kích thích của tia hồng ngoại. Mỗi kiểu liên kết đƣợc đặc trƣng bởi một vùng bƣớc sóng khác nhau. Do đó dựa vào phổ hồng ngoại, có thể xác định đƣợc các nhóm chức đặc trƣng trong hợp chất, ví dụ nhƣ dao động hóa trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hydroxyl là 3300 3450 cm-1, của nhóm cacbonyl C=O trong khoảng 1700 1750 cm-1 1.5.2. Phổ khối lƣợng (Mass spectroscopy, MS). Nguyên tắc của phƣơng pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion trong phân tử chất dƣới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó ngƣời ta có thể xác định đƣợc cơ chế phân mảnh và dựng lại đƣợc cấu trúc hóa học các hợp chất. Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lƣợng, những phƣơng pháp chủ yếu đƣợc nêu ra dƣới đây: - Phổ EI-MS (Electron Impact Ionizatoin mass spectroscopy) dựa vào sự phân mảnh ion dƣới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lƣợng khác nhau, phổ biến là 70eV. - Phổ ESI-MS (Electron spray Ionizatoin mass spectroscopy) gọi là phổ phun mù điện tử. Phổ này đƣợc thực hiện với năng lƣợng bắn phá thấp hơn 32
  43. nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu đƣợc chủ yếu là pic ion phân tử và các pic đặc trƣng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lƣợng thấp, dễ bị phá vỡ. - Phổ FAB (Fast Atom Bombing mass spectroscopy) là phổ bắn phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lƣợng thấp, do đó phổ thu đƣợc cũng dễ thu đƣợc pic ion phân tử. - Phổ khối lƣợng phân giải cao (High resolution mass spectroscopy) cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao. - Ngoài ra, hiện nay ngƣời ta còn sử dụng kết hợp các phƣơng pháp sắc ký kết hợp với khối phổ khác nhƣ: GC-MS (sắc kí khí- khối phổ), LC-MS (sắc ký lỏng- khổi phổ). Các phƣơng pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong ngành dƣợc). 1.5.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR) Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân là một phƣơng pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử. Nguyên lý chung của các phƣơng pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon) là sự cộng hƣởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dƣới tác dụng của từ trƣờng ngoài. Sự cộng hƣởng khác nhau này đƣợc biểu diễn bằng độ chuyển dịch hóa học (chemical shift). Ngoài ra, đặc trƣng của phân tử còn đƣợc xác định dựa vào tƣơng tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling). 1.5.3.1. Phổ 1H- NMR: Trong phổ 1H-NMR, độ chuyển dịch hóa học ( ) của các proton đƣợc xác định trong thang ppm từ 0 14 ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hóa của 33
  44. nguyên tử cũng nhƣ đặc trƣng riêng của từng phần. Dựa vào những đặc trƣng của độ chuyển dịch hóa học và tƣơng tác spin mà ngƣời ta có thể xác định đƣợc cấu trúc hóa học của hợp chất. 1.5.3.2. Phổ 13C-NMR: Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hƣởng ở một trƣờng khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo của phổ 13C-NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0 230 ppm. 1.5.3.3. Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Tranfer): Phổ này cho ta tín hiệu phân loại cacbon khac nhau. Trên phổ DEPT, tín hiệu của các cacbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu của CH và CH3 nằm về một o o phía của CH2 về một phía trên phổ DEPT 135 C. Trên phổ DEPT 90 C chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của các CH. 1.5.3.4. Phổ 2D-NMR: Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phéo xác định các tƣơng tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kỹ thuật chủ yếu thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ sau: - Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence): Các tƣơng tác trực tiếp H-C đƣợc xác định nhờ vào các tƣơng tác trên phổ này. Trên phổ một trục là phổ 1H-NMR còn trục kia là 13C-NMR. Các tƣơng tác HQMC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ. - Phổ 1H-1H COSY (HOMOCOSY) (1H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy): phổ này biểu diễn các tƣơng tác xa của H-H, chủ yếu là các proton đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử đƣợc ghép nối lại với nhau. - Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ biểu diễn tƣơng tác xa trong không gian phân tử. Nhờ vào các tƣơng tác trên 34
  45. phổ này mà từng phần của phân tử cũng nhƣ toàn bộ phân tử đƣợc xác định về cấu trúc. - Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): phổ này biểu diễn các tƣơng tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên keetss mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử. Ngƣời ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kĩ thuật nổ NOE Differences để xác định cấu trúc không gian của phân tử. Bằng việc đƣa vào một xung đúng bằng từ trƣờng cộng hƣởng của một proton xác định thì các proton có cùng phía về không gian cũng nhƣ gần nhau về không gian sẽ cộng hƣởng mạnh hơn và cho tín hiệu với cƣờng độ mạnh hơn. Ngoài ra, còn sử dụng phổ X-RAY (Nhiễu xạ Rowngen) để xác định cấu trúc không gian của toàn bộ phân tử của hợp chất kết tinhowr dạng đơn tinh thể. Nhƣng phạm vi sử dụng của nó hạn chế vì yêu cầu cần tiên quyết của phƣơng pháp này là cần phải có đơn tinh thể. Đây là một điều kiện không phổ biến đối với các hợp chất hữu cơ. Nhƣ trên đã đề cập ngoài việc sử dụng các loại phổ ngƣời ta còn sử dụng kết hợp với các chuyển hóa hóa học cũng nhƣ các phƣơng pháp phân tích so sánh kết hợp khác nhau. 35
  46. CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mẫu thực vật Thân lá loài Gymnema latifolium đƣợc thu hái tại trung tâm nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội, Ngọc Hồi, Ngũ Hiệp, Thanh Trì, Hà Nội vào tháng 3 năm 2017. Ngƣời giám định loài là TS. Đỗ Văn Hải. Tiêu bản đƣợc lƣu tại Phòng nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa Sinh Biển, Viện Hàn lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam. Mẫu thực vật đƣợc phơi khô, nghiền nhỏ trƣớc khi đem chiết. 2.2. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất 2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) Sắc ký lớp mỏng đƣợc thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bƣớc sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% đƣợc phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu. 2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60G F254 (Merck, ký hiệu 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai bƣớc sóng 254 nm và 368 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng nhƣ cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp Silica gel có chất, giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp. 2.2.3. Sắc ký cột (CC) Sắc ký cột đƣợc tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thƣờng và pha đảo. Silica gel pha thƣờng có cỡ hạt là 0,040- 0,063 mm (240-430 mesh). Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 m, Fujisilisa Chemical Ltd.). 36
  47. 2.3. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất 2.3.1. Điểm nóng chảy (Mp) Điểm nóng chảy đƣợc đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện Hóa học các hợp chất Thiên nhiên. 2.3.2. Phổ khối lƣợng (ESI-MS) Phổ khối lƣợng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectra) đƣợc đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.3.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều ( 1D-NMR) Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều bao gồm phổ 1H NMR (500 MHz) 13C NMR (125 MHz) và DEPT ( Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer) đƣợc đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrorneter, Viện Hóa học, VIện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.3.4. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hai chiều ( 2D-NMR) Đây là kĩ thuật phổ hai chiều, bao gồm HMQC ( Heteronuclear Multiple- Quantum Correlation), HSQC (Heteronuclear Single-Quantum Correlation), HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation ) cho phép xác định các tƣơng tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. 2.4. Dụng cụ và thiết bị 2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết Các dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch đƣợc sử dụng bao gồm: + Bình chiết 30 lít + Phễu chiết 2 lít + Máy cô quay chân không + Đèn tử ngoại hai bƣớc sóng 254nm và 368 nm + Máy sấy 37
  48. + Micropipet + Bình sắc ký loại phân tích và điều chế + Cột sắc ký pha thƣờng và pha đảo với các kích cỡ khác nhau + Dung dịch thuốc thử H2SO4 10% + Capilla 2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc + Phổ 1H-NMR (400 MHz) và 13C-NMR (101 MHz) đƣợc đo trên máy Varian 400 MHz của Khoa Dƣợc, Trƣờng Đại học Yonsei, Hàn Quốc. Chất nội chuẩn là TMS (Tetrametyl Silan). + Máy đánh siêu âm POWERSON IC 603 củaHãng Hwashin Technology, Korea. + Độ quay cực đƣợc đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY Polarimeter của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. + Cân phân tích 4 số Ohaus P124 của Hãng Ohaus Corporation, USA. + Máy cất quay chân không. + Tủ hút chân không. + Đèn tử ngoại ở hai bƣớc sóng 254 nm và 365 nm + Máy phổ cộng hƣởng từ hạt nhân NMR AM500 FT-NMR spectrometer + Máy đo phổ khối lƣợng AGILENT 1100 LC-MSD Trap 2.5. Hóa chất + Silica gel pha thƣờng (0.04-0.63 mm) Merck + Silica gel pha đảo ODS (30-50 Fujisilisa Chemical Ltd.). + Bản mỏng tráng sẵn pha thƣờng DC –Alufolien 60 F254 (Merck 1.05715). + Bản mỏng tráng sẵn pha đảo RP18F254s (Merck). + Các loại dung môi hữu cơ nhƣ MeOH, EtOAc, CH2Cl2, n-hexan, acxetone, n-butanol, clorofom, diclorofom, ethyl acetat, ethannol, vanilin, 38
  49. CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM 3.1. Phân lập các hợp chất Thân lá G. latifolium đƣợc phơi khô, nghiền nhỏ thu đƣợc 4 kg. Ngâm 4 kg bột G.latifolium với 20 lít MeOH và siêu âm ở nhiệt độ phòng (3 lần, mỗi lần 2 giờ) thu đƣợc dịch chiết methanol. Sau khi loại dung môi dƣới áp suất giảm, cặn chiết MeOH (GL, 750 g) đƣợc phân bố đều trong nƣớc cất và chiết phân lớp lần lƣợt với dung môi n-Hexane và EtOAc thu đƣợc các cặn n- Hexan (GL1A, 130g), cặn EtOAc (GL1B, 400g) và lớp nƣớc (GL1C, 580g). Phân lớp nƣớc (GL1C, 580g) đƣợc phân tách qua cột Diaion HP-20 rửa giải bằng hệ dung môi MeOH:H2O (25%Me, 50%Me, 75%Me, 100%Me, v:v) thu đƣợc bốn phân đoạn tƣơng ứng GL2A, GL2B, GL2C và GL2D. Phân đoạn GL2C đƣợc phân tách trên cột Gradient rửa giải bằng hệ dung môi CHCl3: MeOH (20:1, 10:1, 5:1, v:v:v) thu đƣợc ba phân đoạn tƣơng ứng GL3A, GL3B và GL3C. Phân đoạn GL3A tiếp tục đƣợc phân tách qua cột silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi CHCl3: MeOH: H2O (5:1:0.1, v:v:v) thu đƣợc sáu phân đoạn GL4A, GL4B, GL4C, GL4D, GL4E và GL4F. Tiếp tục phân tách phân đoạn GL4F qua cột silica gel pha đảo, rửa giải bằng hệ dung môi MeOH: H2O (3:1, v:v) thu đƣợc ba phân đoạn GL5A, GL5B và GL5C. Hợp chất 1 (11.6 mg) thu đƣợc sau khi phân tách phân đoạn GL5A bằng cột silica gel pha đảo, rửa giải bằng hệ dung môi (CH3)2 CO: H2O (1:2.5, v:v). Phân đoạn GL3C tiếp tục đƣợc phân tách qua cột silica gel pha đảo, rửa giải bằng hệ dung môi MeOH:H2O (3:1, v:v) thu đƣợc hai phân đoạn GL6A và GL6B. Tiếp tục phân tách phân đoạn GL6B qua cột silica gel pha đảo, rửa giải bằng hệ dung môi môi MeOH:H2O (1.5:1, v:v) thu đƣợc sáu phân đoạn GL7A, GL7B, GL7C, GL7D, GL7E, GL7F. Phân đoạn GL7D tiếp tục đƣợc phân tách qua cột silica gel pha đảo, rửa giải bằng hệ dung môi MeOH:H2O (3:1, v:v) thu đƣợc ba phân đoạn GL8A, GL8B và GL8C. Hợp chất 2 (12.5 mg) thu 39
  50. đƣợc bằng cách tinh chế phân đoạn GL8B trên cột silica gel pha đảo, rửa giải bằng hệ dung môi (CH3)2CO : H2O (1:2, v:v). Bột GL khô (4Kg) Chiết siêu âm với methanol (3lần x20L) GL (MeOH) (750g) n- Hexane EtOAc GL1A GL1B GL1C 130g 400g 580g Diaion HP-20 25%M 50%M 75%M 100%M GL2B GL2A GL2C GL2D 20 g 31.6 g 42 g 50 g Gradient (CM 20/1 10/1 5/1) Gradient (CM 20/1 10/1 5/1) GL6A GL6B GL6C GL3A GL3B GL3C 8.0 g C.C, CMW 5/1/0.1 MW 1.5/1 GL4A GL4B GL4F GL7A GL7B GL7C GL7D GL7E GL7F GL4C GL4D GL4E 650 mg 500 mg RP-18, MW 3/1 RP-18, MW 3/1 GL5A GL8A GL8B GL8C GL5B GL5C 120 mg 100 mg RP-18, AW 1/ 2.5 RP-18, AW 1/2 GL8B1 GL5A1 16.4 mg 12.5 mg Hình 3.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn MeOH của loài G. latifolium 40
  51. 3.2. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập đƣợc 3.2.1. Hợp chất GL5A1 Các thông số vật lí của hợp chất GL5A1 - Mô tả: Bột vô định hình màu trắng. - Công thức phân tử: C42H68O13 (M=780) - Độ quay cực : -6.3° (c 0.17, MeOH) 1 13 - Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân H-NMR (CD3OD, 400MHz) và C- NMR(CD3OD,100MHz): xem bảng 4.1 3.2.2. Hợp chất GL8B1 Các thông số vật lí của hợp chất GL8B1 - Mô tả: Bột vô định hình màu trắng. - Công thức phân tử: C48H80O18 (M=944) - Độ quay cực : -6.6° (c 0.004, MeOH) 1 13 - Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân H-NMR (Methanol-d4, 400MHz) và C- NMR (Methanol-d4, 101MHz): xem bảng 4.2 41
  52. CHƢƠNG 4: THẢO LUẬN KẾT QUẢ 4.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất GL5A1 Hợp chất GL5A1 đƣợc phân lập đƣợc dƣới dạng bột vô định hình màu trắng. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất GL5A1 cho thấy tín hiệu: 7 proton của nhóm methyl dƣới dạng singlet tại δH 0.78, 0.83, 0.89, 0.91, 0.94, 1.03 và 1.14; một proton olefin tại δH 5.23 (1H, br s), 2 proton anome tại δH 4.30 (1H, d, J = 7.6 Hz) và 5.36 (1H, d, J = 8.0 Hz) và sự xuất hiện một số lƣợng lớn các tín hiệu proton ở vùng trƣờng cao (δH 0.78 – 2.83) cho phép dự đoán đây là một hợp chất triterpene có gắn 2 đơn vị đƣờng. Hình 4.1.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất GL5A1 Phổ 13C-NMR của hợp chất GL5A1 cho thấy tín hiệu cộng hƣởng của 42 nguyên tử carbon. Các số liệu phổ proton và carbon tƣơng ứng đƣợc xác định thông qua phổ HSQC (Bảng 4.1). Phân tích số liệu phổ 1H-, 13C-NMR và HSQC cho phép xác định sự tồn tại cấu trúc bộ khung olean-12-ene với các 42
  53. tín hiệu đặc trƣng: 7 nhóm methyl tại δC 33.5 (δH 0.89, H-29), 28.6 (δH 1.03, H-23), 26.4 (δH 1.14, H-27), 24.0 (δH 0.91, H-30), 17.7 (δH 0.78, H-26),17.0 (δH 0.83, H-24) và 16.1 (δH 0.94, H-25); 1 cacbon olefin tại δC 123.6 (δH 5.23, 1H, br s, H-12) và δC 144.8 cho thấy sự có mặt của một liên kết đôi C C đã bị thế ba proton. Kết hợp so sánh số liệu phổ của hợp chất 1 với tài liệu tham khảo cho thấy hợp chất này giống hợp chất oleanolic acid 3-O-β-D- glucopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranoside [43]. Hình 4.1.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất GL5A1 Các tƣơng tác trên phổ HMBC cho phép gắn chính xác các nhóm thế vào aglycone. Tƣơng tác HMBC từ H-23 (δH 1.03), H-24 (δH 0.83) tới C-3 (δC 90.8)/ C-4 (δC 40.2)/ C-5 (δC 57.0) và từ H-3 (δH 3.15) tới C-4 (δC 40.2)/ C-23 (δC 28.6)/ C-24 (δC 17.0) cho thấy liên kết C-O tại C-3 và có 2 nhóm metyl tại C-4. Tƣơng tác HMBC từ H-25 (δH 0.94) tới C-1 (δC 39.8)/ C-5 (δC 57.0)/ C-9 (δC 49.0)/ C-10 (δC 37.8), từ H-26 (δH 0.78) tới C-7 (δC 33.9)/ C-8 (δC 40.2)/ 43
  54. C-9 (δC 49.0)/ C-14 (δC 42.9) và từ H-27 (δH 1.14) tới C-8 (δC 40.2)/ C-13 (δC 144.8)/ C-14(δC 42.9)/ C-15 (δC 28.9) cho thấy 3 nhóm metyl lần lƣợt tại C-10 , C-8 và C-14. Các tƣơng tác HMBC từ H-29 (δH 0.89) và H-30 (δH 0.91) tới C-19 (δC 47.2), C-20 (δC 31.5), C-21 (δC 34.9) cho thấy 2 nhóm metyl tại C- 20. Tƣơng tác HMBC từ H-12 (δH 5.23) tới C-10 (δC 37.8)/ C-11 (δC 24.0)/ C- 14 (δC 42.9) và từ H-18 (δH 2.83) tới C-12 (δC 123.8)/ C-13 (δC 144.8) cho thấy có nối đôi tại C-12 và C-13. Các tƣơng tác HMBC từ H-18 (δH 2.83) và H-22 (δH 1.60) tới C-28 (δC 178.0) cho thấy có nhóm cacboxyl tại C-28. Tƣơng tác H-1′ (δH 4.30) tới C-3 cho thấy đơn vị đƣờng (H-1′ (δH 4.30)) nằm ở C-3. Tƣơng tác H-1′′ (δH 5.36) tới C-28 cho thấy đơn vị đƣờng (H-1′′ (δH 5.36)) nằm ở C-28. Kết hợp các phân tích phổ 1 chiều, 2 chiều và so sánh với tài liệu tham khảo, hợp chất GL5A1 đƣợc xác định là oleanolic acid 3-O-β-D- glucopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranoside. Hình 4.1.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL5A1 44
  55. Hình 4.1.4. Phổ HSQC của hợp chất GL5A1 Hình 4.1.5. Phổ HMBC của hợp chất GL5A1 45
  56. Hình 4.1.6. Phổ HMBC dãn rộng của hợp chất GL5A1 Hình 4.1.7. Phổ HMBC dãn rộng của hợp chất GL5A1 46
  57. Hình 4.1.8. Các tƣơng tác HMBC chính của hợp chất GL5A1 Bảng 4.1. Bảng số liệu phổ của hợp chất GL5A1 và hợp chất tham khảo # a,b a,c C δC δC δH (mult., J in Hz) Aglycone 1 39.6 39.8 0.96 (m)/1.60 (m) 2 26.7 27.0 1.66 (m)/1.91 (m) 3 90.7 90.8 3.15 (m) 4 40.6 40.2 - 5 56.7 57.0 0.75 (*) 6 19.3 19.3 1.39 (m)/1.52 (m) 7 33.1 33.9 1.30 (m)/1.46 (m) 8 40.1 40.2 - 9 48.0 49.0 1.55 (m) 10 37.7 37.8 - 11 24.4 24.0 1.71 (m)/2.00 (m) 12 123.6 123.8 5.23 (br s) 13 144.8 144.8 - 14 42.6 42.9 - 47
  58. 15 28.2 28.9 1.08 (m)/1.77 (m) 16 26.2 24.6 1.88 (m) 17 47.8 48.0 - 18 42.3 42.6 2.83 (dd, 4.0, 10.2) 19 47.2 47.2 1.13 (m)/1.70 (m) 20 31.5 31.5 - 21 34.7 34.9 1.18 (m)/1.38 (m) 22 33.2 33.1 1.60 (m)/1.70 (m) 23 28.2 28.6 1.03 (s) 24 16.4 17.0 0.83 (s) 25 16.7 16.1 0.94 (s) 26 17.7 17.7 0.78 (s) 27 26.1 26.4 1.14 (s) 28 178.3 178.0 - 29 33.5 33.5 0.89 (s) 30 23.8 24.0 0.91 (s) 3-O-β-D-glucopyranosyl 1′ 105.8 106.7 4.30 (d, 7.6) 2′ 73.8 75.6 3.18 (m) 3′ 78.5 78.2 3.38 (m) 4′ 71.6 71.1 3.32 (m) 5′ 78.1 78.3 3.28 (m) 6′ 62.4 62.4 3.65 (m)/3.80 (m) 28-O-β-D-glucopyranosyl 1′′ 95.6 95.7 5.36 (d, 8.0) 2′′ 74.9 73.8 3.30 (m) 48
  59. 3′′ 78.8 78.7 3.32 (m) 4′′ 71.4 71.6 3.25 (m) 5′′ 78.3 77.6 3.22 (m) 6′′ 62.6 62.7 3.65/3.80 # a) b) δC: dữ liệu của hợp chất GL5A1[43], đo bằng CD3OD, 100 MHz, c)400 MHz 4.2. Xác định cấu trúc của hợp chất GL8B1 Hợp chất GL8B1 phân lập đƣợc dƣới dạng bột vô định hình màu trắng. Phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất GL8B1 cho tín hiệu khá tƣơng đồng với hợp chất GL5A1 với sự xuất hiện của 7 nhóm methyl tại δH 0.77, 0.82, 0.89, 0.93, 0.91, 1.03 và 1.14; một proton olefin tại δH 5.23 (1H, br s), 2 proton anome tại δH 4.32 (1H, d, J = 8.0 Hz) và 5.37 (1H, d, J = 8.0 Hz). Sự khác biệt là xuất hiện thêm 2 proton anome tại δH 4.37 (1H, d, J = 7.6 Hz) và δH 4.29 (1H, d, J = 7.6 Hz) gợi ý sự xuất hiện thêm hai đơn vị đƣờng β trong phân tử. Hình 4.2.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất GL8B1 13 Tƣơng ứng trên phổ C-NMR là 2 cacbon anome δC 104.4 và δC 105.7. Sự biến mất 1 nhóm CH2 (δC 62.4), thay vào đó là xuất hiện thêm hai nhóm 49
  60. CH2 tại δC 70.1 và δC 69.8 dự đoán hai đơn vị đƣờng mới này đƣợcnối với các đƣờng cũ ở vị trí C-6 của đƣờng glucose. Đặc biệt, tín hiệu δC 66.8 (CH2 – HSQC) gợi ý sự tồn tại của một gốc đƣờng xylopyranosyl. So sánh số liệu phổ của hợp chất GL8B1 với tài liệu tham khảo cho thấy hợp chất này giống hợp chất 3-O-β-D-xylopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl(1→6)-β-D- glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester [44]. Hình 4.2.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất GL8B1 Cấu trúc của hợp chất GL8B1 đƣợc khẳng định lại bằng phổ hai chiều HMBC tƣơng tự nhƣ ở hợp chất GL5A1. Vị trí của hai đơn vị đƣờng gắn thêm ở hợp chất GL8B1 đƣợc xác định dựa vào tƣơng tác HMBC giữa H-1′′ (δH 4.37) với C-6′ (δC 70.1) và H-1′′′ (δH 4.29) với C-6′ (δC 69.8). Kết hợp phân tích phổ 1D, 2D của hợp chất GL8B1 và so sánh dữ kiện phổ với chất 5 trong tài liệu tham khảo [34],Cấu trúc của hợp chất GL8B1 đƣợc xác định là 3-O-β-D-xylopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl(1→6)-β- D-glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester. 50
  61. Hình 4.2.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL8B1 Hình 4.2.4. Phổ HSQC của hợp chất GL8B1 51
  62. Hình 4.2.5. Phổ HMBC của hợp chất GL8B1 Hình 4.2.6. Phổ HMBC dãn rộng của hợp chất GL8B1 52
  63. Hình 4.2.7. Phổ HMBC dãn rộng của hợp chất GL8B1 Hình 4.2.8. Tƣơng tác HMBC chính của hợp chất GL8B1 53
  64. Bảng 4.2. Bảng số liệu phổ của hợp chất GL8B1 và hợp chất tham khảo # a,b a,c C δC δC δH (mult., J in Hz) Aglycone 1 38.7 39.8 0.95 (m)/1.95 (m) 2 26.7 27.0 1.63 (m)/1.90 (m) 3 89.0 90.8 3.16 (m) 4 39.5 40.1 - 5 55.8 56.7 0.77 (m) 6 18.3 19.3 1.37 (m)/1.51 (m) 7 33.1 33.9 1.29 (m)/1.45 (m) 8 39.9 40.6 - 9 48.0 47.9 1.55 (m) 10 37.0 37.8 - 11 23.8 24.5 1.88 (m) 12 123.0 123.8 5.23 (br s) 13 144.0 144.7 - 14 42.1 42.8 - 15 28.2 28.8 1.08 (m)/1.76 (m) 16 23.4 24.5 1.69 (m)/2.01 (m) 17 47.0 47.2 - 18 41.7 42.5 2.82 (d, 12.0) 19 46.2 47.2 1.13 (m)/1.68 (m) 20 30.8 31.5 - 21 34.0 34.8 1.19 (m)/1.37 (m) 22 32.5 33.0 1.59 (m)/1.69 (m) 23 17.6 28.6 1.03 (s) 54
  65. 24 28.2 17.1 0.82 (s) 25 15.1 16.1 0.93 (s) 26 17.5 17.7 0.77 (s) 27 26.4 26.4 1.14 (s) 28 176.5 177.9 - 29 33.2 33.5 0.89 (s) 30 23.7 24.0 0.91 (s) 3-O-β-D-glucopyranosyl 1′ 107.0 106.6 4.32 (d, 8.0) 2′ 75.0 74.9 3.21 (m) 3′ 78.3 77.7 3.23 (m) 4′ 71.5 71.3 3.34 (m) 5′ 77.0 78.5 3.34 (m) 6′ 70.4 70.1 3.80 (m)/4.08 (m) 6′-O- β-D-glucopyranosyl 1′′ 105.4 104.7 4.37 (d, 7.6) 2′′ 75.6 75.4 3.21 (m) 3′′ 78.5 77.9 3.34 (m) 4′′ 71.6 71.3 3.34 (m) 5′′ 76.9 76.7 3.42 (m) 3.71 (dd, 4.4, 6′′ 69.8 69.8 10.8)/4.08 (m) 6′′-O-β-D-xylopyranosyl 1′′′ 106.0 105.4 4.29 (d, 7.6) 2′′′ 74.7 74.7 3.21 (m) 3′′′ 77.5 77.5 3.23 (m) 55
  66. 4′′′ 71.1 71.0 3.49 (m) 3.19 (d, 11.2)/3.86 5′′′ 67.1 66.8 (dd, 4.8, 11.2) 28-O-β-D-glucopyranosyl 1′′′′ 95.8 95.6 5.37 (d, 8.0) 2′′′′ 74.1 73.8 3.31 (m) 3′′′′ 78.9 78.1 3.34 (m) 4′′′′ 71.1 71.1 3.49 (m) 5′′′′ 79.3 76.7 3.42 (m) 6′′′′ 62.2 62.3 3.67 (m)/3.80 (m) # a) b) δC: dữ liệu của hợp chất GL8B1[44].Đo trong Methanol-d4, 101 MHz, c)400 MHz 56
  67. KẾT LUẬN Bằng các phƣơng pháp sắc kí kết hợp, 2 hợp chất tritecpen glycoside đã đƣợc phân lập từ lá của dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium ). Sử dụng các phƣơng pháp phân tích phổ hiện đại nhƣ phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều (1H, 13C NMR) và phổ hai chiều(HSQC, HMBC) kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo, cấu trúc của các hợp chất đƣợc xác định là oleanolic acid 3- O-β-D-glucopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranoside (1), 3-O-β-D- xylopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester (2). oleanolic acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranoside (1) 3-O-β-D-xylopyranosyl (1→6)-β-D-glucopyranosyl (1→6)-β-D- glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester (2) 57
  68. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] PGS.TS. Nguyễn Hữu Đĩnh (chủ biên), PGS.TS. Đỗ Đình Rãng (2003), Hóa học hữu cơ 1, Nxb Giáo dục [2] Phạm Văn Hải (2010), “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Dây thìa canh lá to ở Hòa Bình”, Khóa luận tốt nghiệp dƣợc sĩ, Thƣ viện Đại học Dƣợc Hà Nội. [3] Phạm Thanh Kỳ (1998), Bài giảng dược liệu, tập II. Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội. [4] Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Y Học [5] Đ. T. Ái. Nghĩa. "Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng hạ đƣờng huyết của Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. Ex Wight)" Đại Học Dƣợc Hà Nội, luận văn thạc sỹ 2014. [6] H. T. B. Ngọc. "Điều tra, nghiên cứu một số thực vật Việt Nam có tác dụng hỗ trợ điều hòa lƣợng đƣờng trong máu để ứng dụng cho bệnh nhân đái tháo đƣờng type 2". Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, luận án tiến sỹ, 2012. [7] N. Q. Tiến, P. T. H. Minh, N. Q. An, T. T. T. Nga, N. N. Tuấn, V. Đ. Doanh, P. H. Điển. Một số kết quả nghiên cứu mới về thành phần hóa học của cây dây thìa canh Gymnema sylvestre. Tạp chí Dƣợc liệu, 16, 230-234 (2011) [8]Phạm Hà Thanh Tùng (2012), “Nghiên cứu tính đa dạng thực vật và thành phần hoá học của các loài trong chi Gymnema R.Br. ở Việt nam”, Luận văn thạc sĩ dƣợc học, Thƣ viện trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội. 58
  69. Tài liệu tiếng Anh [9] S. S. Gupta. Inhibitory effect of Gymnema sylvestris on adrenalineinduced hyperglycemia in rats. Indian Journal of Mecinal Sciene, 15, 883-887 (1961). [10] K. Miyatake, S. Takenaka, T. Fujimoto, G. Kensho, S. Priya Upadhaya, M. Kirihata, I. Ichimoto, Y. Nakano. Isolation of conduritol A from Gymnema sylvestre and its effects against intestinal glucose absorption in rats. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 57, 2184-2185 (1993). [11] K. Miyatake, G. Kensho, T. Fujimoto, E. Noguchi, M. Shinohara, S. Takenaka, T. Taira, S. Priya Upadhaya, I. Ichimoto, Y. Nakano. Effect of Conduritol A, a Polyol from Gymnema sylvestre, on the development of diabetic cataracts in streptozotocin-treated rats and on aldose reductase. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 58, 756-757 (1994). [12] K. Yoshikawa, K. Amimoto, S. Arihara, K. Matsuura. Structure studies of new antisweet constituents from Gymnema sylvestre. Tetrahedron Letters, 30, 1103-1106 (1989). [13] K. Yoshikawa, K. Amimoto, S. Arihara, K. Matsuura. Gymneic acid V, VI and VII from gurma, the leaves of Gymnema sylvestre R. Br. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 37, 852-854 (1989). [14] K. Yoshikawa, M. Nakagawa, R. Yamamoto, S. Arihara, K. Matsuura. Antisweet natural products. V. Structures of gymnemic acids VIII-XII from Gymnema sylvestre R. BR. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 40, 1779-1782 (1992). [15] N. P. Sahu, S. B. Mahato, S. K. Sarkar, G. Poddar. Triterpenoid saponins from Gymnema sylvestre. Phytochemistry, 41, 1181-1185 (1996). 59
  70. [16] M. Yoshikawa, T. Murakami, H. Matsuda. Medicinal Foodstuffs. X. Structures of new triterpene glycosides, Gymnemosides-c, -d, -e, and -f, from the leaves of Gymnema sylvestre R. BR. : influence of gymnema glycosides on glucose uptake in rat small intestinal fragments. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 45, 2034-2038 (1997). [17] W.-C. Ye, Q.-W. Zhang, X. Liu, C.-T. Che, S.-X. Zhao. Oleanane saponins from Gymnema sylvestre. Phytochemistry, 53, 893-899 (2000). [18] W. Ye, X. Liu, Q. Zhang, C.-T. Che, S. Zhao. Antisweet Saponins from Gymnema sylvestre. Journal of Natural Products, 64, 232-235 (2001). [19] X. Liu, W. Ye, B. Yu, S. Zhao, H. Wu, C. Che. Two new flavonol glycosides from Gymnema sylvestre and Euphorbia ebracteolata. Carbohydrate Research, 339, 891-895 (2004). [20] X.-M. Zhu, P. Xie, Y.-T. Di, S.-L. Peng, L.-S. Ding, M.-K. Wang. Two new triterpenoid saponins from Gymnema sylvestre. Journal of Integrative Plant Biology, 50, 589-592 (2008). [21] M.-Q. Zhang, Y. Liu, S.-X. Xie, T.-H. Xu, T.-H. Liu, Y.-J. Xu, D.-M. Xu. A new triterpenoid saponin from Gymnema sylvestre. Journal of Asian Natural Products Research, 14, 1186-1190 (2012). [22] A. Zarrelli, M. DellaGreca, A. Ladhari, R. Haouala, L. Previtera. New triterpenes from Gymnema sylvestre. Helvetica Chimica Acta, 96, 1036- 1045 (2013). [23] A. Zarrelli, A. Ladhari, R. Haouala, G. Di Fabio, L. Previtera, M. DellaGreca. New acylated oleanane and lupane triterpenes from Gymnema sylvestre. Helvetica Chimica Acta, 96, 2200-2206 (2013). [24] D. Wang, G. Li, Y. Feng, S. Xu. Two new oleanane triterpene glycosides from Gymnema inodorum. Journal of Chemical Research, 655-657 (2008). 60
  71. [25] M. Atsuchi, C. Yamashita, Y. Iwasaki. EP636633A1; 1995, 15 pp. [26] K. Yoshikawa, K. Matsuchika, S. Arihara, H.-C. Chang, J.-D. Wang. Pregnane glycosides, gymnepregosides A-F from the roots of Gymnema alternifolium. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 46, 1239-1243 (1998). [27] K. Yoshikawa, K. Matsuchika, K. Takahashi, M. Tanaka, S. Arihara, H.- C. Chang, J.-D. Wang. Pregnane glycosides, gymnepregosides G-Q from the roots of Gymnema alternifolium. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 47, 798-804 (1999). [28] J. Tian, Q.-G. Ma, J.-B. Yang, A.-G. Wang, T.-F. Ji, Y.-G. Wang, Y.-L. Su. Hepatoprotective Phenolic Glycosides from Gymnema tingens. Planta Medica, 79, 761-767 (2013). [29] S. Srisurichan, S. Puthong, S. Pornpakakul. Pregnane-type steroidal glycosides from Gymnema griffithii Craib. Phytochemistry, 106, 197- 206 (2014). [30] Y. Sugihara, H. Nojima, H. Matsuda, T. Murakami, M. Yoshikawa, I. Kimura. Antihyperglycemic effects of gymnemic acid IV, a compound derived from Gymnema sylvestre leaves in streptozotocin-diabetic mice. Journal of Asian Natural Products Research, 2, 321-327 (2000). [31] A. B. A. Ahmed, A. S. Rao, M. V. Rao. Role of in vivo leaf and in vitro callus of Gymnema sylvestre in maintaining the normal levels of blood glucose and lipid profile in diabetic Wistar rats. Biomedicine, 28, 134- 138 (2008). [32] P. Daisy, J. Eliza, K. A. M. Mohamed Farook. A novel dihydroxy gymnemic triacetate isolated from Gymnema sylvestre possessing normoglycemic and hypolipidemic activity on STZ-induced diabetic rats. Journal of Ethnopharmacology, 126, 339-344 (2009). 61
  72. [33] A. B. A. Ahmed, A. S. Rao, M. V. Rao. In vitro callus and in vivo leaf extract of Gymnema sylvestre stimulate β-cells regeneration and anti- diabetic activity in Wistar rats. Phytomedicine, 17, 1033-1039 (2010). [34] A. Al-Romaiyan, B. Liu, H. Asare-Anane, C. R. Maity, S. K. Chatterjee, N. Koley, T. Biswas, A. K. Chatterji, G. C. Huang, S. A. Amiel, S. J. Persaud, P. M. Jones. A novel Gymnema sylvestre extract stimulates insulin secretion from human islets in vivo and in vitro. Phytotherapy Research, 24, 1370-1376 (2010). [35] K. Shimizu, M. Ozeki, A. Iino, S. Nakajyo, N. Urakawa, M. Atsuchi. Structure-activity relationships of triterpenoid derivatives extracted from Gymnema inodorum leaves on glucose absorption. The Japanese Journal of Pharmacology, 86, 223-229 (2001). [36] M. Atsuji, K. Hikimoto, C. Yamashita, Y. Iwasaki. JP06128161A; 1994, 7 pp. [37] R. M. Reddy, P. B. Latha, T. Vijaya, D. S. Rao. The saponin-rich fraction of a Gymnema sylvestre R. Br. aqueous leaf extract reduces cafeteria and high-fat diet-induced obesity. Zeitschrift fur Naturforschung C: Journal of Biosciences, 67, 39-46 (2012). [38] V. Kumar, U. Bhandari, C. D. Tripathi, G. Khanna. Anti-obesity effect of Gymnema sylvestre extract on high fat diet-induced obesity in Wistar rats. Drug Res 63, 625-632 (2013). [39] J. K. Malik, F. V. Manvi, B. R. Nanjware, D. K. Dwivedi, P. Purohit, S. Chouhan. Anti-arthritic activity of leaves of Gymnema sylvestre R.Br. leaves in rats Der Pharmacia Lettre, 336-341 (2010). [40] J. R. Nakkala, R. Mata, E. Bhagat, S. R. Sadras. Green synthesis of silver and gold nanoparticles from Gymnema sylvestre leaf extract: study of 62
  73. antioxidant and anticancer activities. Journal of Nanoparticle Research, 17, 1-15 (2015). [41] K. Yasukawa, S. Okuda, Y. Nobushi. Inhibitory effects of Gymnema (Gymnema sylvestre) leaves on tumour promotion in two-stage mouse skin carcinogenesis. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2014, 5 (2014). [42] V. Gopiesh khanna, K. Kannabiran. Antimicrobial activity of saponin fractions of the leaves of Gymnema sylvestre and Eclipta prostrata. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 24, 2737 (2008). [43] J. Agric. Food. Chem., 46, 1998, 1797-1804, [44] Phytochemistry, 53, 2000, 893-899 [45] Ulrich Meve Jonathan Alejandro Grecebio (2013), "Taxonomy of the Asian Gymnema latifolium (Apocynaceae, Asclepiadoideae, Marsdenieae), including lectotypification of the synonymous G. khandalense", Willdenowia, 43, pp. 81-86. [46] 33. Nadkarni Dr. K. M. (1996), Indian Materia medica, pp. 59 TÀI LIỆU INTERNET [47] [48] BF_enVN747VN747&tbm=isch&tbo=u&source=univ&sa=X&ved=0ah UKEwihtqWR_eXaAhWLyLwKHc0VBHIQsAQIKw&biw=1366&bih= 662#imgrc=PU7gIWXjLiOXrM: 63