Khóa luận Nghiên cứu tách chiết polyphenol từ bã ổi đào sau khi sản xuất nước ép và hướng tới ứng dụng kiểm soát quá trình oxy hóa thức ăn chăn nuôi giàu chất béo

69 trang thiennha21 13/04/2022 5400

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu tách chiết polyphenol từ bã ổi đào sau khi sản xuất nước ép và hướng tới ứng dụng kiểm soát quá trình oxy hóa thức ăn chăn nuôi giàu chất béo", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

khoa_luan_nghien_cuu_tach_chiet_polyphenol_tu_ba_oi_dao_sau.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu tách chiết polyphenol từ bã ổi đào sau khi sản xuất nước ép và hướng tới ứng dụng kiểm soát quá trình oxy hóa thức ăn chăn nuôi giàu chất béo

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ MAI LIÊN Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT POLYPHENOL TỪ BÃ ỔI ĐÀO SAU KHI SẢN XUẤT NƯỚC ÉP VÀ HƯỚNG TỚI ỨNG DỤNG KIỂM SOÁT QUÁ TRÌNH OXY HÓA THỨC ĂN CHĂN NUÔI GIÀU CHẤT BÉO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Chuyên nghành: Công nghệ Thực phẩm Khoa: CNSH - CNTP Khóa học: 2016 - 2020 Thái Nguyên - 2020
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ MAI LIÊN Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT POLYPHENOL TỪ BÃ ỔI ĐÀO SAU KHI SẢN XUẤT NƯỚC ÉP VÀ HƯỚNG TỚI ỨNG DỤNG KIỂM SOÁT QUÁ TRÌNH OXY HÓA THỨC ĂN CHĂN NUÔI GIÀU CHẤT BÉO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Chuyên nghành: Công nghệ Thực phẩm Lớp: K48 - CNTP Khoa: CNSH - CNTP Khóa học: 2016 - 2020 Người hướng dẫn: TS. Lương Hùng Tiến Thái Nguyên - 2020
i LỜI CẢM ƠN Đề tài “Nghiên cứu tách chiết polyphenol từ bã ổi đào sau khi sản xuất nước ép và hướng tới ứng dụng kiểm soát quá trình oxy hóa thức ăn chăn nuôi giàu chất béo” là nội dung em lựa chọn để nghiên cứu và làm khóa luận tốt nghiệp sau bốn năm theo học chuyên ngành Công nghệ thực phẩm tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Để hoàn thành quá trình nghiên cứu và hoàn thiện khóa luận này, trước tiên em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, các phòng ban liên quan, Ban chủ nhiệm khoa CNSH - CNTP đã giảng dạy, hướng dẫn để em có những kiến thức như ngày hôm nay. Em xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo hướng dẫn: TS. Lương Hùng Tiến thuộc khoa Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp đại học. Tiếp theo em xin cảm ơn Th.S Lưu Hồng Sơn và các cán bộ thuộc khoa Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm đã hướng dẫn các kỹ năng trong phòng thí nghiệm, động viên tinh thần và tạo mọi điều kiện tốt nhất để em có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Cuối cùng em xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã luôn động viên, khích lệ em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu để hoàn thành tốt đề tài. Trong quá trình thực hiện nghiên cứu không thể tránh khỏi những thiếu sót nên em rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô và các bạn để khóa luận được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020 Sinh viên Nguyễn Thị Mai Liên
ii DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT TPC Polyphenol tổng số (Total polyphenol Content) EtOH Ethanol MeOH Methanol DW Trọng lượng khô (Dry weight) DPPH 2, 2-Diphenyl-1picrylhydrazyl GAE Gallic acid equivalent (axit gallic tương đường)
iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm 18 Bảng 3.2. Dụng cụ, thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 19 Bảng 3.3. Bảng mã hóa các điều kiện tối ưu 27 Bảng 3.4. Ma trận thực nghiệm Box- Behnken ba yếu tố và hàm lượng polyphenol của dịch chiết bã ổi đào 27 Bảng 4.1. Bảng so sánh hàm lượng polyphenol thu được ở các loại dung môi khác nhau 37 Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu đến hàm lượng polyphenol 38 Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol 38 Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol 39 Bảng 4.5. Kết quả ma trận thực nghiệm Box- Behnken ba yếu tố chiết Polyphenol từ bã ổi đào 40 Bảng 4.6. Kết quả ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố chiết polyphenol từ bã ổi đào 41 Bảng 4.7. Kết quả đáng giá chỉ tiêu vi sinh vật theo 10TCN 863:2006 44 Bảng 4.8. Chỉ số axit và chỉ số peroxyt ban đầu của thức ăn chăn nuôi 44 Bảng 4.9. Sự biến đổi chỉ số axit và chỉ số peroxyt của thức ăn chăn nuôi có bổ sung dịch chiết polyphenol trong 30 ngày bảo quản 45
iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1. Quả ổi 3 Hình 2.2. Lá, Hoa, Quả và hạt, thân và vỏ cây ổi 4 Hình 2.3. a) Quả ổi ruột đỏ b) Quả ổi ruột trắng 4 Hình 2.4. Epicatechin 9 Hình 2.5. Epigalocatechin 9 Hình 2.6. Quercetin 9 Hình 2.7. Kampherol 9 Hình 2.8. Antocyanidin 10 Hình 2.9. Polyphenol 10 Hình 4.1. Bề mặt đáp ứng hàm lượng polyphenol 42 Hình 4.2. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu ở hàm lượng polyphenol 42 Hình 4.3. Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết bã ổi đào 43 Hình 4.4. Sơ đồ hoàn thiện quy trình tách chiết polyphenol 46
v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT ii DANH MỤC CÁC BẢNG iii DANH MỤC CÁC HÌNH iv MỤC LỤC v Phần 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích nghiên cứu 2 1.3. Yêu cầu 2 1.4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2 1.4.1. Ý nghĩa khoa học 2 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn 2 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Giới thiệu về cây ổi 3 2.1.1. Đặc điểm thực vật 3 2.1.2. Đặc điểm phân bố và sinh thái 4 2.1.3. Thành phần hóa học của quả ổi 4 2.1.4. Hoạt tính sinh học và công dụng 5 2.2. Giới thiệu chung về polyphenol và cơ chế chống oxy hóa của hợp chất polyphenol 7 2.2.1. Polyphenol 7 2.2.2. Cơ chế chống oxy hóa của các hợp chất polyphenol 11 2.3. Gốc tự do, quá trình oxy hóa chất béo 13 2.3.1. Gốc tự do 13 2.3.2. Quá trình oxy hóa 14 2.3.3. Biện pháp hạn chế quá trình oxy hóa 14 2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết polyphenol [5] 14
vi 2.4.1. Loại dung môi 14 2.4.2. Tỷ lệ dung môi trên nước 15 2.4.3. Thời gian chiết 15 2.4.4. Nhiệt độ chiết 15 2.5. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới 15 2.5.1. Trên thế giới 15 2.5.2. Trong nước 17 Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1. Đối tượng, địa điểm, vật liệu và thời gian nghiên cứu 18 3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 18 3.1.2. Hoá chất sử dụng 18 3.1.3. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 19 3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 19 3.2.1. Phạm vi nghiên cứu 19 3.2.2. Địa điểm nghiên cứu 20 3.2.3. Thời gian nghiên cứu 20 3.3. Nội dung nghiên cứu 20 3.4. Phương pháp phân tích 20 3.4.1. Xác định trọng lượng khô của nguyên liệu 20 3.4.2. Xác định hàm lượng polyphenol tổng số 22 3.5. Phương pháp nghiên cứu 22 3.5.1. Phương pháp xử lý nguyên liệu 22 3.5.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm 23 3.5.3. Phương pháp nghiên cứu nội dung 4: Đánh giá khả năng chống oxy hóa của dịch chiết polyphenol bằng thử nghiệm DPPH và ứng dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo 28 3.5.4. Phương pháp nghiên cứu nội dung 5: Hoàn thiện quy trình thu dịch chiết từ bã quả ổi đào 35 3.6. Phương pháp xử lý số liệu 35
vii Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 4.1. Kết quả đánh giá thành phần nguyên liệu ban đầu 36 4.1.1. Kết quả xác định trọng lượng khô của nguyên liệu 36 4.1.2. Kết quả xác định hàm lượng polyphenol tổng số 36 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện tách chiết thu dịch chiết tổng từ bã ổi đào 37 4.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi và nồng độ của dung môi chiết đến hàm lượng polyphenol 37 4.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu đến hàm lượng polyphenol 37 4.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol 38 4.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol 39 4.3. Thử nghiệm tách chiết trên điều kiện tối ưu 40 4.3.1. Kết quả thử nghiệm tối ưu hóa quá trình tách chiết polyphenol từ bã ổi đào . 40 4.4. Kết quả xác định khả năng chống oxy hóa của dịch chiết bã ổi đào thông qua khả năng khử gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) và ứng dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo 42 4.4.1. Kết quả xác định khả năng chống oxy hóa của dịch chiết bã ổi đào thông qua khả năng khử gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 42 4.4.2. Kết quả ứng dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo 44 4.4.3. Khảo sát hàm lượng chất béo có trong thức ăn chăn nuôi giàu chất béo 44 4.5. Hoàn thiện quy trình tách chiết polyphenol từ bã ổi đào 46 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 5.1. Kết luận 47 5.2. Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC
1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Trong những năm gần đây việc tiêu thụ nhiều loại nước trái cây nhiệt đới có giá trị dinh dưỡng đã tăng lên đáng kể. Quả ổi là một nguồn thực phẩm có nhiều chất chống oxy hóa như polyphenol và β-carotenes [9, 10 và 11]. Trong ổi cũng có một lượng lớn vitamin như axit ascorbic [11] và là một nguồn chứa rất nhiều các khoáng chất quan trọng như photpho, canxi, và sắt [10, 12]. Hơn nữa, quả ổi có thể được làm thành nhiều dạng sản phẩm thực phẩm nhờ có mùi hương rất đặc biệt. Quả ổi còn được sử dụng để sản xuất sản phẩm nước ép công nghiệp hay phối trộn với các loại nước ép khác. Sau khi sản xuất nước ép ổi đào, lượng bã còn lại cũng có thể được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi. Các nghiên cứu đã được tiến hành trên lượng bã còn sót lại từ quá trình sản xuất nước ổi ép cho thấy vẫn còn các hợp chất polyphenol như axit polyphenol và flavonoid, là các hợp chất chống oxy hóa.Việc tái sử dụng một cách hiệu quả lượng bã quả ổi thừa có thể là nguồn cung cấp polyphenol quan trọng, thể hiện qua nghiên cứu gần đây của Jimenez-Escrig và cộng sự [13]. Vì vậy tách chiết triệt để các hợp chất có giá trị từ bã quả ổi sau khi ép giúp tránh lãng phí một cách có hiệu quả. Việt Nam là một quốc gia nhiệt đới sản xuất nhiều loại nước trái cây như: ổi, măng cụt, sầu riêng, Quả ổi là một trong những loại trái cây hàng đầu được phân phối trên toàn quốc. Tuy nhiên việc bảo quản còn nhiều hạn chế, do thực tế quả ổi rất dễ thâm sạm, hư hỏng và không thể cất giữ trong một thời gian dài nếu như không có nguồn ra là các nhà máy sản xuất hoặc siêu thị sẽ dẫn đến giá bán giảm và dẫn đến thua lỗ cho nông dân. Do đó, nghiên cứu này nhằm mục đích tận dụng triệt để các hoạt chất còn sót lại trong bã ổi đào sau khi sản xuất nước ép của các nhà máy để sử dụng làm sản phẩm phụ phẩm có giá trị. Các polyphenol không chỉ là các hoạt chất đóng vai trò quan trọng đối với sức khỏe của con người mà chúng còn đóng vai trò rất quan trọng đối với sức khỏe của vật nuôi. Bên cạnh đó thức ăn thành phẩm rất dễ bị oxy hóa đặc biệt đối với thức ăn thành phẩm có hàm lượng chất béo cao hoặc thức ăn được bảo quản trong thời gian dài ở điều kiện không thuận lợi gây ra mùi khó chịu và làm hao hụt dinh dưỡng trong thức ăn của vật nuôi.
2 Từ lý do trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tách chiết polyphenol từ bã ổi đào sau khi sản xuất nước ép và hướng tới ứng dụng kiểm soát quá trình oxy hóa thức ăn chăn nuôi giàu chất béo”. 1.2. Mục đích nghiên cứu - Tách chiết polyphenol từ bã quả ổi đào sau khi sản xuất nước ép ổi đào. - Đánh giá hoạt tính sinh học của dịch chiết và hướng tới ứng dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo. 1.3. Yêu cầu - Đánh giá được thành phần nguyên liệu ban đầu. - Nghiên cứu lựa chọn được một số thông số tách chiết polyphenol thích hợp - Tối ưu hóa được điều kiện chiết polyphenol trên dung môi đã chọn. - Đánh giá được hoạt tính sinh học của dịch chiết polyphenol và thử nghiệm kiểm soát khả năng chống oxy hóa của dịch chiết polyphenol trong việc bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo. - Hoàn thiện được quy trình tách chiết dựa trên các thông số công nghệ đã phân tích. 1.4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 1.4.1. Ý nghĩa khoa học Tạo ra quy trình tách chiết polyphenol từ bã quả ổi đào và đánh giá được hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết. Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và bổ sung vào kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn. Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy được kinh nghiệm thực tế cũng như tác phong làm việc, nghiên cứu khoa học phục vụ cho cho công tác sau này. 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn Góp phần gia tăng hiệu quả kinh tế cho người dân trồng ổi với khả năng tận dụng phụ phẩm từ quả ổi. Hướng tới ứng dụng thử nghiệm polyphenol từ bã quả ổi vào bảo quản thức ăn chăn nuôi ngăn ngừa sự oxy hóa chất béo.
3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về cây ổi Ổi (danh pháp khoa học: Psidium guajava) là loài cây ăn quả thường xanh lâu năm, thuộc họ Đào kim nương, có nguồn gốc từ Brasil được Carl Linnaeus mô tả khoa học đầu tiên vào năm 1753. Cây Ổi thuộc: Giới Plante Bộ Myrtalet Họ Myrtaceae Chi Psidium Loài Psidium guajava Hình 2.1. Quả ổi 2.1.1. Đặc điểm thực vật Chi Psidium có 3 loài chính là: - Psidium littorale Raddi (ổi xẻ): cây gỗ nhỏ, cao khoảng 6m, nhánh tròn. Lá không có lông. Hoa đơn độc mọc ở nách lá, màu trắng [2]. - Psidium cujavillus Burm (ổi cảnh): cây gỗ nhỏ, cao 2 - 3m, nhánh non vuông. Lá có phiến nhỏ, dài 3 - 5cm, rộng 1 - 1,8cm; gân phụ 11 - 15 cặp, cuống lá dài 1 - 2mm. Hoa trắng, đơn độc mọc ở kẽ lá, cọng ngắn, lá đài dày, nhiều nhị. Quả tròn, to khoảng 2 - 3,5cm, hột nhiều, nhỏ [2]. - Psidium guajava L. là cây gỗ cao 3 - 5m, cành non vuông, có lông mềm, cành già hình trụ nhẵn. Thân có vỏ mỏng, trơn nhẵn, khi già bong ra từng mảng. Lá đơn, mọc đối, hình bầu dục, mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới nhạt có gân nổi rõ. Hoa trắng mọc đơn độc hoặc tập trung 2 - 3 cái ở kẽ lá, có 4 - 5 cánh hoa, rất nhiều nhị, chỉ nhị rời, bao phấn có trung đới rộng, bầu dưới 5 ô dính vào ống đài. Quả hình
4 cầu, khi xanh có vị chua chát, khi chín màu vàng, ruột màu đỏ, trắng hoặc vàng, có vị ngọt. Quả mọng, ở đầu quả có sẹo của đài tồn tại, có rất nhiều hạt hình thận [3]. Hình 2.2. Lá, hoa, quả và hạt, thân và vỏ cây ổi 2.1.2. Đặc điểm phân bố và sinh thái Ở Việt Nam, ổi là cây ăn quả quan trọng được trồng hầu như ở khắp các địa phương cả vùng đồng bằng và vùng miền núi, tuy nhiên chúng không có ở những vùng cao trên 1500m. Ổi trồng có khoảng 7 - 10 giống khác nhau, là cây ưa sáng, sinh trưởng phát triển tốt trong một giới hạn rộng của vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, ra hoa và quả hàng năm [4]. Hình 2.3 a) Quả ổi ruột đỏ b) Quả ổi ruột trắng 2.1.3. Thành phần hóa học của quả ổi Thành phần hóa học của quả ổi bao gồm: Flavonoid, tanin, tinh dầu, vitamin C, đường, carotene , - Flavonoid: Trong cả quả xanh và chín đều có quercetin, leucocyanidin, mecocyanidin, guajavarin [19]. - Tanin: Với hàm lượng cao khi quả còn xanh và thấp hơn khi quả chín, cũng thuộc loại pyrogalol với cả arabio ester của acid ellagic, acid gallic, [4].
5 - Tinh dầu: β-carophylen (24,1%), nerolidol (17,3%), 3-phenyl acetat (5,3%), carophyllen oxid (5,1%) [20]. - Các thành phần khác: + Quả ổi rất giàu giá trị dinh dưỡng. Phân tích thành phần hóa học của quả ổi ở Ấn Độ cho thấy: nước (81,7%), protein (0,9%), chất béo (0,3%), sợi (5,2%), các hydrat carbon chủ yếu ở dạng đường khử (11,2%), các hợp chất vô cơ (0,7%), Ca, Mg, acid oxalic, P, Fe, Na, Cu, sulfua, thiamin, riboflavin, acid nicotinic, vitamin C [4]. + Hàm lượng vitamin C trong quả ổi gấp 4 - 10 lần quả chanh, chúng thay đổi khá nhiều, trung bình từ 100 - 1000mg/100g, nhiều nhất ở phần vỏ quả rồi đến phần cùi [4]. + Hạt ổi chiếm 6 - 12% trọng lượng quả và có khoảng 14% một chất dầu béo có mùi thơm [4]. 2.1.4. Hoạt tính sinh học và công dụng Ổi không chỉ là một nguồn thực phẩm dinh dưỡng mà còn giống như một loại thuốc dân gian được sử dụng rộng rãi ở các khu vực cận nhiệt đới trên toàn thế giới [21]. Người ta biết rằng ổi thường được sử dụng ở nhiều nơi trên thế giới để chữa nhiều bệnh như tiêu chảy, hạ sốt, kiết lỵ, viêm dạ dày ruột, tăng huyết áp, tiểu đường, sâu răng, giảm đau Hoạt động kháng khuẩn Quả ổi có hoạt tính kháng khuẩn cao, chúng chứa các hoạt chất chống ung thư và chống oxy hóa. Có rất nhiều hợp chất như axit Gallic, galangin, kaempferol, homogentisic acid và cyanidin 3-glucoside được tìm thấy trong vỏ, hạt và bã của quả ổi theo nghiên cứu của Chen Y và cộng sự [22]. Hoạt động chống tiêu chảy Tiêu chảy là một trong những vấn đề sức khỏe phổ biến và được công nhận và là vấn đề toàn cầu. Nó rất phổ biến ngay cả ở các nước phát triển. Ước tính có khoảng 2,2 triệu người chết hàng năm do tiêu chảy; hầu hết trong số họ, là trẻ em hoặc trẻ sơ sinh [23].
6 Quả ổi được sử dụng để điều trị tiêu chảy do độc tố E. coli hoặc S. aureus theo nghiên cứu của Vieira RHSF và cộng sự [24]. Chiết xuất từ quả ổi có hoạt tính chống tiêu chảy và nó được sử dụng để điều trị và phòng ngừa tiêu chảy theo nghiên cứu của Ojewole J và cộng sự [25]. Hoạt động chống viêm Chiết xuất từ quả ổi cho thấy Phenol là một hợp chất quan trọng có trong quả ổi và rất quan trọng trong hoạt động chống dị ứng và chống viêm thể hiện trong nghiên cứu của Denny C và cộng sự [26]. Một nghiên cứu khác của Roy CK cho thấy chiết xuất từ quả ổi có hiệu quả trong điều trị viêm gan và sản xuất huyết thanh [27]. Hoạt động chống oxy hóa Chất chống oxy hóa là các phân tử làm chậm quá trình oxy hóa. Các phản ứng oxy hóa có thể tạo ra các gốc tự do gây tổn hại cho các tế bào bằng cách bắt đầu các phản ứng khác nhau. Các gốc tự do gây tổn hại cho các tế bào gây ung thư và nhiều bệnh khác. Chất chống oxy hóa bao gồm beta-carotene, lycopene, vitamin C, E và A, polyphenol và một số chất khác. Phản ứng oxy hóa là một trong những phản ứng phá hủy quan trọng nhất. Các gốc tự do gây ra rất nhiều rối loạn ở người như rối loạn thần kinh, ung thư, nhiễm virus Các gốc tự do này tác động gây ra các phản ứng oxy hóa qua nghiên cứu của Masuda T và cộng sự [28]. Quả ổi rất giàu chất chống oxy hóa rất hữu ích trong việc làm giảm tỷ lệ mắc các bệnh như rối loạn chức năng não, viêm, bệnh tim, ung thư, xơ cứng động mạch và viêm khớp [29]. Trong trái cây, chất oxy hóa dồi dào nhất là polyphenol và axit ascorbic. Các polyphenol chủ yếu là flavonoid và chủ yếu hiện diện ở dạng glycoside và ester [30]. Quả ổi có hàm lượng cao axit protocatechuic, quercetin, axit ferulic, axit ascorbic, quercetin, axit gallic và axit caffeic là những chất chống oxy hóa quan trọng [31, 32].
7 2.2. Giới thiệu chung về polyphenol và cơ chế chống oxy hóa của hợp chất polyphenol [5] 2.2.1. Polyphenol Polyphenol là các hợp chất mà phân tử của chúng chứa nhiều vòng Benzen, trong đó có một, hai hoặc nhiều hơn hai nhóm Hydroxyl (OH-). Dựa vào đặc trưng của cấu tạo hóa học người ta chia ra các hợp chất polyphenol thành ba nhóm chính: + Nhóm hợp chất phenol C6-C1 Có đặc điểm trong cấu tạo phân tử gồm vòng benzen liên kết với nhóm COOH. Đại diện thường gặp: - Galic acid: có nhiều ở thực vật ở cả dạng tự do và liên kết: - Vallinin: Có mùi thơm đặc biệt, ở dạng glycoside, có nhiều trong quả và được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp xà phòng, công nghiệp thực phẩm với tư cách là chất thơm. - Protocatechin acid: Có nhiều trong hành, tỏi. - Gentizic acid: Có nhiều trong cacao.
8 + Nhóm hợp chất phenol C6-C3 Gồm các hợp chất có vòng benzene kết hợp với mạch bên có 3 nguyên tử cacbon, đó là dẫn xuất phenyl propan. Chúng rất phổ biến trong nhiều loại thực vật, có mùi thơm. Đại diện thường gặp: - Cynnamic acid - Cafeic acid - Ferulic acid - Cumaric acid + Nhóm hợp chất phenol C6-C3-C6 (flavonoids) Flavonoids là một nhóm sắc tố thực vật rất thường gặp có vai trò rất lớn trong việc tạo ra màu sắc của nhiều loại hoa quả. Flavonoid cũng là một nhóm hoạt chất quan trọng trong dược liệu, được phân lập và phân loại dựa vào cấu trúc hóa học bao gồm:
9 - Flavanol: còn được biết đến như là flavan-3-ol hay catechin và galocatechin, là cấu tử của hợp chất tanin có trong nhiều loại hoa quả, trà xanh, rượu đỏ và socola (Yang et al., 2001), còn gallocatechin epigallocatechin và epigallocatechin gallate được tìm thấy ở các loại hạt họ đậu và chè (Arts et al, 2000a, Arts et al., 2000b) [12]. Hình 2.4. Epicatechin Hình 2.5. epigalocatechin - Flavon: Rất phổ biến trong thực vật, có nhiều trong tỏi, hành, chè, dâu tây , có màu vàng và ở dạng glycoside, thường gặp là flavonol. Flavonol thường ở dạng glycoside có muôn hình muôn vẻ khác nhau, thường gặp là Kampherol và Quercetin [6]. Sự tạo thành flavonols glycosides được quyết định bởi hoạt động của ánh sáng, vì thế chúng chủ yếu được tìm thấy ở lá và vỏ quả (Hermann, 1976) [12]. Hình 2.6. Quercetin Hình 2.7. Kampherol - Anthocyanin: Các hợp chất thuộc nhóm này đều là các sắc tố quan trọng của hoa quả. Chúng là chất màu tan trong nước, cho màu đỏ, tím, xanh dương, vàng của hoa quả và nhiều loại thực vật khác. Các anthocyan đều là các glycoside trong đó phần aglucon là anthocyanidin. Các anthocyanin hòa tan trong nước còn antocyanindin thì không hòa tan trong nước. Điều lưu ý là trong cấu tạo của anthocyanidin, nguyên tử oxi trong vòng pyran có hoá trị tự do. Tuy nhiên đã không xác định được một cách chắc chắn rằng nguyên tư nào hoặc oxi hoặc cacbon mang
10 điện tích dương tự do, vì thế thường biểu diễn cấu tạo của anthocyan bằng công thức trung hoà. Nhờ có điện tích dương tự do mà Anthocyanidin mang tính chất của cation trong môi trường acid và mang tính chất anion trong môi trường kiềm, nghĩa là có khả năng tạo muối với acid và base [13]. Tuỳ theo pH môi trường mà trạng thái tích điện của Antocyan thay đổi, theo đó màu sắc cũng thay đổi. Các muối cation của Antocyan đều có màu đỏ với những sắc thái màu khác nhau: vàng nhạt, tím, xanh nhạt. Các muối anion của Antocyan có màu xanh. Nhiều hoa của thực vật màu hồng khi luộc chin chuyển thành màu xanh, điều này chứng tỏ sự thay đổi pH dịch tế bào về phía kiềm [6]. Hình 2.8. Antocyanidin Antocyanidin được chia thành 3 nhóm nhỏ, đó là: Pelargonidin, cyanidin, delphinidin, ngoài ra còn gặp apigenidin. Hình 2.9. Polyphenol Tính chất: Các polyphenol có chứa gốc Pyrocatechic hoặc Pyrogalic nên chúng có thể tham gia phản ứng oxy hóa- khử, phản ứng cộng và ngưng tụ. - Phản ứng oxy hóa-khử: Dưới tác dụng của enzyme polyphenol oxydase, các polyphenol bị oxy hóa tạo thành Quinon. - Phản ứng cộng: Khi có mặt các acid amin thì các Quinon này sẽ tiến hành phản ứng cộng với acid amin để tạo thành các octoquinon tướng ứng.
11 - Phản ứng ngưng tụ: Các octoquinon này sẽ ngưng tụ với nhau để tạo thành các sản phẩm có màu gọi chung là Flobafen. 2.2.2. Cơ chế chống oxy hóa của các hợp chất polyphenol Theo Jovanovic (2000); Nicole (2001); Marfak (2003); Van Camp, (2005) trích dẫn bởi Chirinos Gallardo [12], cơ chế kháng oxi hoá của các chất phenol: Cơ chế 1: Vô hoạt các gốc tự do Polyphenol có cấu trúc dạng vòng, các điện tử chuyển động liên tục trong các liên kết đôi cách bởi liên kết đơn có tác dụng như những chiếc bẫy đối với gốc tự do. Gốc tự do là các nguyên tử hay phân tử có electron lớp ngoài không cặp đôi và vì vậy có hoạt tính rất cao. Chúng rất dễ phản ứng với các phân tử các chất xung quanh như DNA, lipid màng v.v gây nên hiện tượng lão hóa hoặc ung thư. Nếu các gốc tự do gặp polyphenol thì chúng sẽ nhường electron không cặp đôi cho polyphenol và trở về trạng thái bền vững. Electron không cặp đôi trong polyphenol bị "nhốt" lại. Electron này chạy hết vòng benzene này sang vòng benzene khác mà không ảnh hưởng gì nhiều lắm đến cấu trúc của các vòng benzene [6]. Cơ chế 2: Tạo phức dạng chelat với các ion Fe2+ và Cu+ Polyphenol còn có khả năng ngăn chặn sự hình thành các gốc tự do bằng cách “bắt giữ” các ion kim loại. Các kim loại có chức năng sinh lí quan trọng trong cơ thể con người như vận chuyển oxi (Fe trong hemoglobin), cofactor của nhiều enzyme (Fe đối với catalase, Cu đối với superoxyde dismutase). Tuy nhiên, chúng cũng là những tác nhân của việc hình thành các gốc tự do hoặc bằng cách cắt bỏ hydrogen của lipid tạo gốc tự do peroxide hoặc tham gia phản ứng Fenton và Haber-Weiss. Thứ nhất, các ion kim loại có thể gây ra kích thích cắt bỏ hydrogen của lipid chưa bão hòa thành gốc lipid: RH + M+n→ R● + H+ + M+(n-1)+ Các ion kim loại cũng có thể phân tách hydro thành dạng alkoxyl và gốc peroxyl, gây ra kích thích sự oxi hóa lipid: 2+ 2+ + ● + Fe3+(Cu )+ ROOH → Fe (Cu ) + ROO + H + 3+ 2+ ● ─ Fe2+(Cu ) + ROOH → Fe (Cu ) + RO + OH
12 Các kim loại này có thể tham gia phản ứng Fenton và Haber-Weiss: 3+ 2+ Fe + O2-° → Fe + O2 2+ + - 3+ 2+ H2O2 + Fe (Cu ) →°OH + OH + Fe (Cu ) (Phản ứng Fenton) - O2-°+ H2O2 →°OH + OH + O2 (Phản ứng Haber-Weiss) Cấu trúc flavonoid cho phép chúng tạo phức bền dạng chelat với các ion kim loại và do đó ngăn chặn sự tạo gốc tự do gây nên bởi kim loại như Fe và Cu [12]. Cơ chế 3: Kìm hãm enzyme xanthine oxydase Hoạt động của xanthine oxidase cũng là một nguồn tạo các gốc tự do. Khi có mặt của oxi, enzyme này xúc tác sự oxi hóa xanthine thành acid uric, phân tử oxi nhận điện tử và trở thành ion superoxide. - + Xanthine + 2O2 + H2O xanthine oxydase Acid uric + 2O2° + 2H Các flavonoid có cấu tạo vòng A giống như vòng purin của xanthine được coi như chất kìm hãm cạnh tranh của xanthine oxidase do đó ngăn ngừa sự tạo ion superoxide (Nicole, 2001) [12]. Nhiều hợp chất phenol đã thể hiện những tác dụng tốt của chúng đối với cơ thể con người trên cơ sở khả năng chống oxi hóa. Các flavonoid có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạnh, tai biến mạnh, lão hóa, thoái hóa gan, tổn thương do bức xạ. Flavonoid làm bền thành mạch, được dùng trong các trường hợp rối loạn chức năng tĩnh mạnh, trĩ, rối loạn tuần hoàn võng mạc, Flavonoid còn có tác dụng chống độc, làm giảm thương tổn gan. Nhiều flavonoid thuộc nhóm flavon, flavanon, flavanol có tác dụng lợi tiểu rõ rệt có trong lá diếp cá, cây râu mèo Nhiều flavonoid như quercetin, rutin, myciretin, hỗn hợp các catechin của trà có tác dụng làm tăng biên độ co bóp tim. Ngày nay, những dược liệu và hoa quả có hàm lượng flavonoid cao đã được khai thác và chiết xuất, nghiên cứu, sản xuất thành sản phẩm: Thuốc viên, thuốc nước, rất tiện ích khi sử dụng.
13 2.3. Gốc tự do, quá trình oxy hóa chất béo [5] 2.3.1. Gốc tự do Gốc tự do là các nguyên tử không trọng vẹn, số điện tử vòng ngoài của nó là số lẻ nên không bền vững, nó phải kết hợp với một nguyên tử khác để có số điện tử chẵn để bền vững. Sự bền vững này chỉ trong chốc lát, chính nó lại tạo ra một nguyên tử không trọng vẹn khác và tiếp tục kết hợp một nguyên tử khác rồi trở thành nguyên tử không trọn vẹn và tiếp tục chu kì bất tận như thế. Phản ứng hóa học của nó rất mãnh liệt và nó sẽ kéo theo một điện tử của phân tử khác về nó, cho ra những phân tử khác bị hư hại hay bị oxy hóa. Một khi phân tử bị oxy hóa rồi thì phân tử đó sẽ tự mất đi tất cả các chức năng vốn có của nó, tiếp đó chính nó lại là tác nhân oxy hóa các phân tử xung quanh nó, làm hư hại các tế bào của các phân tử xung quanh. Và quá trình này cứ tiếp tục như thế sẽ tạo thành các tế bào không bình thường dẫn tới các loại bệnh như: Xơ vữa động mạch, ung thư Thông thường, các gốc tự do trong tế bào sinh ra trong quá trình sinh dưỡng được kiểm soát chặt chẽ thông qua quá trình kháng oxy hóa nội tại bằng các hợp chất như glutathione, vitamin E, vitamin C và các enzyme superoxide dismutase. Ngoài ra cơ thể còn có các tế bào như neutrophill, monocyte, B- cell Có khả năng chống lại các yếu tố oxy hóa ngoại lai xâm nhập. Tuy nhiên trong các tế bào có thể xuất hiện các hiện tượng các gốc tự do được tạo ra quá nhiều do mất cân bằng trong hoạt động hoặc do các yếu tố bên ngoài như các chất độc, do nhiễm vi sinh vật, do ozone, bức xạ, tia UV, nhiễm phóng xạ, do thuốc lá, môi trường ôi nhiễm Các gốc tự do dư thừa trong khi cơ thể thiếu các yếu tố bảo vệ để ngăn chặn, có khả năng tương tác, phá hủy màng lipit không bão hòa của tế bào, làm giảm khả năng bảo vệ các tế bào dẫn đến sự xâm nhập các tác nhân gây bệnh từ bên ngoài oxy hóa các nucleotid căn bản làm thay đổi cấu trúc ADN, dẫn đến các quá trình đột biến, phát sinh các khối u, ung thư, làm hỏng cấu trúc protein hoặc hoạt hóa enzyme trong các quá trình trao đổi chất gây bệnh.
14 2.3.2. Quá trình oxy hóa Quá trình oxy hóa là quá trình phản ứng hóa học xảy ra, trong đó electron được chuyển sang chất oxy hóa có khă năng tạo gốc tự do sinh ra phản ứng dây chuyền phá hủy tế bào sinh vật. 2.3.3. Biện pháp hạn chế quá trình oxy hóa Để hạn chế sự oxi hóa, một số biện pháp sau thường được sử dụng: - Loại bỏ oxi trong thực phẩm bằng cách đóng gói chân không hoặc sử dụng glucose-oxidase. - Bảo quản trong nhiệt độ thấp và tránh ánh sáng. Trong trường hợp này, tốc độ oxi hóa giảm rõ rệt. Tuy nhiên, phương pháp này không áp dụng được đối với các loại trái cây, rau củ quả có chứa lipoxygenase. Sự ngăn ngừa hư hỏng thực phẩm chỉ có thể đạt được sau khi xử lí nhiệt. - Thêm các chất chống oxi hóa: Các chất chống oxi hóa ngoài khả năng loại bỏ các gốc tự do còn hạn chế đáng kể sự phân hủy hydroperoxide thành các sản phẩm thứ cấp khác. Các chất chống oxi hóa thường sử dụng trong bảo quản dầu mỡ là vitamin E, BHA, BHT. Các chất chống oxi hóa tự nhiên như plyphenol, carotenoid cũng được nghiên cứu bổ sung vào dầu mỡ để ngăn ngừa quá trình oxi hóa. 2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết polyphenol [5] 2.4.1. Loại dung môi Dung môi có vai trò rất quan trọng trong quá trình tách chiết polyphenol từ thực vật. Độ phân cực của dung môi sẽ ảnh hưởng đến độ hòa tan của các hợp chất phenol vào dung môi do đó ảnh hưởng đến hiệu suất chiết tách của quá trình. Thêm vào đó, việc lựa chọn dung môi sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến công đoạn tinh sạch dịch chiết. Nhìn chung, việc lựa chọn dung môi tách chiết bao giờ cũng dựa trên hai tiêu chí: Loại chất chủ đạo muốn tách và sự thuận tiện cho công đọan tinh sạch về sau. Mỗi loại chất khác nhau trong nhóm phenolic lại thích hợp với những dung môi chiết khác nhau. Phenolic có glicosid hóa thường tan nhiều trong nước nên dung môi thường sử dụng là nước và hỗn hợp nước với methanol hoặc ethanol hoặc aceton (Rice-Evans ea at, 1997). Ngược lại, phenolic ít phân cực như isoflavones, flavanones thường tan nhiều hơn trong dung môi kị nước. Ngoài ra, aceton và
15 methanol là dung môi thích hợp để chiết flavanol, methanol thì là tốt nhất cho chiết catechin 2.4.2. Tỷ lệ dung môi trên nước Polyphenol là một nhóm các hợp chất vô cùng đa dạng, có thể tồn tại ở dạng tự do hoặc ở dạng liên kết với các đường (Dạng glycosid). Để tách được polyphenol ở dạng glycoside, nước thường được thêm vào dung môi tách. Trong các loại nguyên liệu khác nhau, tỷ lệ hợp chất phenol glycoside hóa khác nhau do đó tùy thuộc vào loại nguyên liệu mà tỷ lệ dung môi/ nước cần được xác định cho phù hợp để tăng hiệu quả chiết cũng như quyết định chi phí thực hiện cả quá trình. 2.4.3. Thời gian chiết Thời gian chiết là một nhân tố ảnh hưởng tới sự thu hồi polyphenol cũng như chất lượng của dịch chiết. Thời gian chiết ngắn cho hiệu suất thu hồi thấp, tuy nhiên thời gian chiết quá dài khiến polyphenol dễ bị oxi hoa và làm giảm hiệu suất sử dụng thiết bị. Thời gian chiết thay đổi từ 1phút đến 24 giờ (Shahidi & Nack, 2004). 2.4.4. Nhiệt độ chiết Nhiệt độ là yếu tố quan trọng không những ảnh hưởng tới hiệu suất chiết mà còn ảnh hưởng tới chi phí và chất lượng của dịch chiết polyphenol. Nhiệt độ làm giảm độ nhớt của dung dịch, tăng tốc độ thẩm thấu của dung môi vào tế bào và tăng hiệu suất trích li. Tuy nhiên, tiến hành chiết ở nhiệt độ quá cao thì vừa tốn cho phí ổn nhiệt vừa tăng nguy cơ giảm chất lượng của dịch chiết do phản ứng nâu hóa. 2.5. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới 2.5.1. Trên thế giới - Theo nghiên cứu của Lilis Sukeksi và Maya Sarah, “Đặc tính và tách chiết polyphenol từ bã ổi đào”, sử dụng những phương pháp: + Xác định trọng lượng khô: bằng cách thông qua sự bốc hơi của nước trong bã ổi. + Phân tích quercetin: bằng máy đo quang phổ. + Xác định hàm lượng Axit Galic bằng: phương pháp đo màu Folin quy Ciocalteau. + Xác định lượng tanin bằng: phương pháp chuẩn độ. + Phân tích Apigenin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography).
16 Kết quả thu được từ nghiên cứu trên: + Bã ổi đào sau khi chiết xuất polyphenol có trọng lượng khô là 28,42% và hàm lượng chất chống oxy hóa dạng polyphenol như sau: 0,40 mg/100g, quercetin, 8,70 mg/100g axit gallic, 62,60 mg/100g tanin, và không có phát hiện của apigenin. Nghiên cứu khám phá ứng dụng của bốn dung môi hữu cơ và nước để chiết xuất hợp chất polyphenol từ bã ổi đào sau chế biến nước ép ổi. Nghiên cứu cho thấy phần còn lại của hàm lượng polyphenol tổng của bã ổi 9.59 mg/100g. Hàm lượng polyphenol tổng cao nhất thu được bằng cách sử dụng metanol làm dung môi và cao thứ hai thu được bằng cách sử dụng nước làm dung môi. Hàm lượng polyphenol cao nhất là kết quả của hỗn hợp metanol và nước ở các nồng độ khác nhau, trong đó tỷ lệ tối ưu là 60% metanol/nước, sau đó là 50% metanol/nước. Biến thể trong tổng hàm lượng polyphenol phụ thuộc vào điều kiện dung môi và nồng độ giữa các dung môi. Hàm lượng polyphenol tổng là cao nhất khi sử dụng tỷ lệ bã trên dung môi là 1g bã còn lại đến 25ml metanol/nước 60%. 180 phút được chọn là thời gian lý tưởng để tách chiết polyphenol. - Seokwon Seo, Soojung Lee, Marcus L. Elam, Sarah A. Johnson, Jonghoon Kang, Bahram H. Arjmaandi, đã cùng nhau: “Nghiên cứu tìm ra dung môi chiết tốt nhất với lá ổi để cho hiệu quả chống oxy hóa cao”, sử dụng những phương pháp: + Xét nghiệm hàm lượng hợp chất Phenolic bằng phương pháp: Folin Ciocalteu. + Xét nghiệm hàm lượng Flavonoid bằng phương pháp của Moreno. + Thử nghiệm khử gốc 2, 2-Diphenyl-1picrylhydrazyl (DPPH). + Hoạt động của ABTS-Scavenging được đánh giá theo phương pháp được mô tả bởi Re et al. + Hoạt tính khử gốc oxit nitric (NO) được đo bằng thuốc thử Greiss. + Hoạt động quét nitrite: hoạt tính quét nitrite được đánh giá dựa trên độ hấp thụ ở bước sóng 520nm bằng máy quang phổ UV theo phương pháp được báo cáo bởi kato et al. + Phân tích thống kê. Từ việc nghiên cứu trên họ đã thu được kết quả: + Hàm lượng hợp chất phenolic của chiết xuất nước cao hơn chiết xuất ethanol và metanol tinh khiết. Hơn nữa, hàm lượng hợp chất phenolic của chiết xuất
17 hydroethanolic cao hơn chiết xuất nước. Hoạt tính chống oxy hóa của chiết xuất hydroethanolic cao hơn so với chiết xuất nước và cao đáng kể trong chiết xuất hydroethanolic 50% có hàm lượng hợp chất phenolic cao nhất. 2.5.2. Trong nước Nghiên cứu: “Tối ưu hóa chiết polyphenol từ lá ổi bằng phương pháp bề mặt đáp ứng”, của Hồ Bá Vương, Nguyễn Xuân Duy, Nguyễn Anh Tuấn sử dụng những phương pháp: + Thu mẫu: từ những lá ổi già từ một cây ổi. + Bố trí nghiệm tối ưu hóa điều kiện chiết: Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology) được lựa chọn để tối ưu hóa điều kiện chiết polyphenol từ lá ổi. + Xác định hàm lượng polyphenol tổng theo phương pháp của Singleton et al. (1999). + Xác định hoạt tính chống oxi hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH (được xác định theo phương pháp của Fu và Shieh). Và kết quả thu được: + Nghiên cứu đã xây dựng được mô hình toán học mô tả ảnh hưởng của bốn nhân tố chiết (nhiệt độ, thời gian, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu và nồng độ ethanol) đến hàm lượng polyphenol từ lá ổi xẻ. Các giá trị tối ưu để chiết polyphenol từ lá ổi xẻ như sau: Dung môi chiết ethanol 44,3%, nhiệt độ chiết 90oC, thời gian chiết 76,5 phút và tỉ lệ dung môi/nguyên liệu 70/1(ml/g). Tại điều kiện chiết tối ưu, hàm lượng polyphenol thu được là 233,76mg GAE/g chất khô. Dịch chiết polyphenol thu được ở điều kiện tối ưu thể hiện hoạt tính chống oxi hóa cao đối với phép thử khả năng thu gốc tự do DPPH, với giá trị IC50 là 2,1μg/ml. Những phát hiện trên chỉ ra tiềm năng sử dụng lá ổi xẻ như một nguồn chiết xuất chất chống oxi hóa tự nhiên để nâng cao khả năng ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm chức năng.
18 Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng, địa điểm, vật liệu và thời gian nghiên cứu 3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Dịch chiết polyphenol từ bã ổi đào được tách chiết tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Vật liệu nghiên cứu: - Quả ổi đào có độ chín 90% (Vỏ màu xanh nhạt, có mùi thơm, vị ngọt vừa phải, vẫn còn độ cứng vừa phải chưa bị mềm) được thu mua tại chợ Minh phương (Việt Trì - Phú Thọ). Quả được lựa chọn đồng đều về kích thước, màu sắc, độ chín, không bị dập nát, sâu bệnh, thối hỏng. Rửa quả bằng nước sạch, để khô tự nhiên. - Thức ăn chăn nuôi giàu chất béo: Cám lợn với hàm lượng chất béo 5,6% 3.1.2. Hoá chất sử dụng Bảng 3.1. Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm STT Hóa Chất Nơi sản xuất 1 EtOH Việt Nam 2 MeOH Việt Nam 3 Thuốc thử Folin Ciocalteu Trung Quốc 4 Na2CO3 Trung Quốc 5 Axit gallic Trung Quốc 6 DPPH Pháp 7 Cao thịt Trung Quốc 8 Agar Trung Quốc 9 Pepton Trung Quốc 10 Cao nấm men Trung Quốc 11 KOH Trung Quốc 12 Na2S2O3 Trung Quốc 13 CHCl3 Trung Quốc 14 Axit Acetic Việt Nam 15 KI Trung Quốc
19 3.1.3. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu Bảng 3.2. Dụng cụ, thiết bị sử dụng trong thí nghiệm STT Dụng cụ Nơi sản xuất 1 Bình tam giác Trung Quốc 2 Khay inox Việt Nam 3 Ống đong Trung Quốc 4 Máy xay Trung Quốc 5 Cốc đong có mỏ Trung Quốc 6 Bình định mức Trung Quốc 7 Hộp Petri Trung Quốc 8 Pipet Trung Quốc 9 Đầu côn Trung Quốc 10 Giấy lọc Trung Quốc 11 Que trang Trung Quốc 12 Ống nghiệm Trung Quốc Thiết bị thí nghiệm Nơi sản xuất 1 Tủ sấy SRN Pháp 2 Cân phân tích có độ chính xác 0,001g Trung Quốc 3 Máy quang phổ 4 Máy lắc Shaking Incubator NB-205 Trung Quốc 5 Tủ lạnh Samsung Việt Nam 6 Tủ ấm Trung Quốc 7 Tủ cấy vi sinh LV-VC 1200 Trung Quốc 8 Nồi hấp thanh trùng paster Nhật Bản Cùng các trang thiết bị, dụng cụ khác phục vụ nghiên cứu của phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm. 3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 3.2.1. Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu một số thông số tách chiết thu dịch chiết tổng từ bã ổi đào. Tối ưu hóa các điều kiện của quá trình tách chiết polyphenol. Phân tích, đánh giá tác dụng của dịch chiết polyphenol.
20 3.2.2. Địa điểm nghiên cứu Địa điểm: Phòng thí nghiệm hóa sinh và vi sinh Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. 3.2.3. Thời gian nghiên cứu Thời gian thực hiện: từ 12/2019 - 5/2020. 3.3. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Đánh giá thành phần nguyên liệu ban đầu - Trọng lượng khô của nguyên liệu - Hàm lượng polyphenol trong nguyên liệu Nội dung 2: Nghiên cứu lựa chọn một số thông số tách chiết polyphenol thích hợp - Nghiên cứu lựa chọn dung môi thích hợp - Nghiên cứu thời gian chiết thích hợp - Nghiên cứu nhiệt độ chiết thích hợp Nội dung 3: Tối ưu hóa điều kiện chiết polyphenol trên dung môi đã chọn Nội dung 4: Đánh giá hoạt tính sinh học của chế phẩm polyphenol và ứng dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo - Đánh giá khả năng chống oxy hóa của polyphenol bằng thử nghiệm DPPH - Ứng dụng kiểm soát quá trình oxy hóa trong quá trình bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo Nội dung 5: Hoàn thiện quy trình dựa trên các thông số công nghệ đã phân tích - Quy trình tách chiết polyphenol. 3.4. Phương pháp phân tích Phương pháp phân tích nội dung 1: phương pháp Đánh giá thành phần nguyên liệu ban đầu 3.4.1. Xác định trọng lượng khô của nguyên liệu Sử dụng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi theo TCVN 5631:1991 Nguyên tắc: Dùng sức nóng để tách ẩm trong vật liệu, đồng thời giữ lại tất cả các chất có trong vật liệu. Do đó nhiệt độ sấy không được quá cao hay quá thấp.
21 Nhiệt độ quá cao thì ẩm sẽ bốc hơi nhanh nhưng dễ gây hiện tượng làm thay đổi tính chất hóa học của các chất, nhất là các chất có tính bay hơi thoát đi sẽ làm ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Nhiệt độ quá thấp thì hơi thoát ra chậm, làm kéo dài thời gian và các chất bị biến đổi. Độ ẩm được xác định bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi. - Xác định độ ẩm TCVN 5613 – 1991 - Bản chất của phương pháp: Phương pháp dựa trên việc sấy mẫu bã quả ổi đào đến khối lượng không đổi trong điều kiện xác định - Thiết bị và vật liệu để tiến hành xác định độ ẩm, cần sử dụng: + Cân phân tích với sai lệch cho phép không vượt quá 0,001g + Tủ sấy đảm bảo điều chỉnh được nhiệt độ (105˚C) hoặc (120˚C) + Chén cân bằng thủy tinh, sứ hoặc nhôm đường kính 50mm và có nắp đậy kín + Bình hút ẩm Cách tiến hành: - Lấy chén cân có thể đựng được 10g mẫu, rửa sạch sau đó đem sấy ở 1050C cho đến khi trọng lượng không đổi. Để nguội trong bình hút ẩm 20-25 phút và sau đó cân với trọng lượng chính xác - Sau đó cho vào cốc khoảng 10 g mẫu. Cân tất cả ở cân phân tích một cách chính xác. - Cho tất cả vào tủ sấy ở 1050C, sấy trong vòng từ 6h cho đến khi trọng lượng không đổi. - Sấy xong, làm nguội trong bình hút ẩm (20 - 25 phút) và đem cân ở cân phân tích một cách chính xác. - Cho lại vào tủ sấy 1050C trong 1giờ, lấy ra làm nguội trong bình hút ẩm (20-25 phút) và đem cân ở cân phân tích một cách chính xác tới khi trọng lượng không đổi. Tính kết quả: Độ ẩm (W) được tính theo phần trăm khối lượng xác định bằng công thức: − ₁ W = × 100 Trong đó: - W: Độ ẩm của thực phẩm (%).
22 - m: Khối lượng mẫu trước khi sấy (g). - m₁: Khối lượng mẫu sau khi sấy (g). 3.4.2. Xác định hàm lượng polyphenol tổng số Hàm lượng polyphenol tổng số của dịch chiết bã quả ổi đào được xác định bằng phương pháp của Singlton và cộng sự (1999) với một vài hiệu chỉnh nhỏ như sau: dịch chiết từ bã quả ổi đào được pha loãng đến một tỷ lệ nhất định, sau đó 0,1 ml dịch chiết đã pha loãng được trộn với 0,9 ml nước cất trước khi thêm 1 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu (10%) và 2,5 ml Na2CO3 7,5%. Hỗn hợp được giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút trước khi đo bước sóng ở 760 nm trên máy quang phổ kế. Gallic acid được dùng làm chất chuẩn. Hàm lượng polyphenol tổng số được biểu diễn theo mg đương lượng gallic acid (Gallic Acid Equivalent-GAE) trên 1g chất khô (Dry Weight-DW) hay mg GAE/g DW. Tính kết quả: TPC = X * V * k / v * m * (1 - w) Trong đó: - TPC là hàm lượng polyphenol tổng số (mg GAE/g DW) - X là nồng độ acid gallic xác định theo đường chuẩn (mg/ml) - V là thể tích dịch chiết từ m (g) mẫu bã quả ổi đào (ml) - K là hệ số pha loãng - V là thể tích dịch chiết được sử dụng (ml) - m là khối lượng mẫu thí nghiệm (g) - w là độ ẩm của mẫu (%) 3.5. Phương pháp nghiên cứu 3.5.1. Phương pháp xử lý nguyên liệu Quả ổi đào có độ chín 90% được thu hái về mang đi loại bỏ tạp chất, sâu bệnh, thối hỏng. Rửa quả bằng nước sạch, để khô tự nhiên sau đó mang đi xay lấy bã. Bã của quả ổi đào được tách chiết bằng phương pháp trích ly trong điều kiện: Dung môi chiết là nước, nhiệt độ và thời gian chiết lần lượt là 40oC và 30 phút, tỉ lệ nguyên liệu so với dung môi chiết là 1/10 (w/v). Dịch chiết thu được sau khi tách chiết được mang đi xác định hàm lượng polyphenol.
23 3.5.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm 3.5.2.1. Phương pháp nghiên cứu nội dung 2: phương pháp xác định một số thông số tách chiết polyphenol từ bã quả ổi đào Phương pháp nghiên cứu đơn yếu tố được sử dụng. Thí nghiệm sau kế thừa kết quả nghiên cứu của thí nghiệm trước.  Tách chiết polyphenlol từ bã ổi đào: Ổi đào được thu hái, sau đó rửa sạch để ráo nước rồi tiến hành xay nhỏ để lấy phần bã, tách chiết polyphenol bằng các loại dung môi: methanol, ethanol, nước. Cân 4g bã ổi đào cho vào bình tam giác, bịt kín miệng bình và để vào thiết bị rung lắc để tiến hành trích ly. Tiến hành tách chiết bằng phương pháp trích ly trong vòng 30 phút, cường độ 200 vòng/phút và nhiệt độ là 40oC. Sau khi kết thúc quá trình chiết tiến hành ly tâm ở 4oC, 5000rpm/phút, tiếp tục lọc lại dịch chiết để thu dịch chiết trong, dịch chiết có màu hồng phớt nhẹ. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại dung môi chiết Để nghiên cứu ảnh hưởng của loại dung môi chiết, sử dụng 3 loại dung môi o o khác nhau bao gồm: Nước (H20), methanol (CH3OH) 60 và ethanol (C2H5OH) 60 . Để đánh giá ảnh hưởng của loại dung môi chiết tới khả năng trích ly bố trí thí nghiệm theo công thức thí nghiệm sau: Cân 4g (Bã ổi đào) Trích ly ở các loại dung môi H20 CH3OH C2H5OH Dịch chiết Phân tích Chiết ở cùng các điều kiện: Thời gian chiết: 30 phút
24 Nhiệt độ tách chiết: 400C Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu: 1/10 (w/v) Kết thúc quá trình chiết, xác định được hàm lượng polyphenol. Dựa vào kết quả phân tích, lựa chọn loại dung môi tốt nhất. Kết quả của thí nghiệm 1 được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu nồng độ dung môi phù hợp: Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol Được bố trí gồm 4 công thức, lặp lại 3 lần Cân 4g (bã ổi đào) Trích ly ở các nồng độ dung môi 20% 40% 60% 80% Dịch chiết Phân tích Chiết ở cùng các điều kiện: Dung môi sử dụng là dung môi tốt nhất được tìm thấy ở thí nghiệm 1 Thời gian chiết: 30 phút Nhiệt độ tách chiết: 400C Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu :1/10 (w/v) Kết thúc quá trình chiết, xác định được hàm lượng polyphenol. Dựa vào kết quả phân tích chỉ tiêu, lựa chọn nồng độ dung môi chiết tốt nhất. Kết quả của thí nghiệm 2 được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu phù hợp: Để đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu tới khả năng chiết, bố trí thí nghiệm theo công thức thí nghiệm sau:
25 Cân 4g (bã ổi đào) Trích ly ở các tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu 1/5 1/10 1/15 1/20 Dịch chiết Phân tích Chiết ở cùng điều kiện: Loại dung môi và nồng độ dung môi tốt nhất được tìm thấy ở thí nghiệm 1,2 Nhiệt độ tách chiết 400C Thời gian tách chiết 30 phút Kết thúc quá trình chiết, xác định được hàm polyphenol. Dựa vào kết quả phân tích, lựa chọn được tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu tách chiết tốt nhất. Kết quả của thí nghiệm 3 được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết Để đánh giá ảnh hưởng của thời gian tới khả năng chiết, bố trí thí nghiệm theo công thức thí nghiệm sau: Cân 4g (bã ổi đào) Trích ly ở các khoảng thời gian 25phút 30phút 35 phút 40 phút Dịch chiết Phân tích
26 Chiết ở cùng điều kiện: Loại dung môi, nồng độ dung môi, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu tốt nhất được tìm thấy ở thí nghiệm 1, 2, 3. Nhiệt độ tách chiết 400C Kết thúc quá trình chiết, xác định hàm lượng polyphenol. Dựa vào kết quả phân tích, lựa chọn được thời gian chiết tách tốt nhất. Kết quả của thí nghiệm 4 được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ chiết Để đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng chiết, bố trí thí nghiệm theo công thức thí nghiệm sau: Cân 4g (bã ổi đào) Trích ly ở các nhiệt độ 350C 400C 450C 500C Dịch chiết Phân tích Chiết ở cùng điều kiện: Loại dung môi, nồng độ dung môi, tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu, thời gian tách chiết tốt nhất được tìm thấy ở thí nghiệm 1, 2, 3, 4. Kết thúc quá trình chiết, xác định hàm lượng polyphenol. Dựa vào kết quả phân tích, lựa chọn được nhiệt độ tốt nhất. Kết quả của thí nghiệm 5 được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.5.2.2. Phương pháp nghiên cứu nội dung 3 Thí nghiệm 6: Tối ưu hóa điều kiện tách chiết bã ổi đào Sau khi tiến hành khảo sát các đơn nhân tố, chúng tôi lựa chọn 03 yếu tố ký hiệu là A, B, C là các yếu tố ảnh hưởng lớn nhất đến hàm lượng polyphenol trong
27 bã ổi đào để đánh giá khả năng ảnh hưởng của chúng, tôi sử dụng phương pháp bề mặt chỉ tiêu theo thiết kế thí nghiệm của Box-Benhken với ba yếu tố, ba cấp độ. Bảng 3.3. Bảng mã hóa các điều kiện tối ưu Biến chữ Yếu tố Đơn vị Mức -1 Mức +1 A Thời gian tách chiết phút 25 35 B Nhiệt độ tách chiết oC 35 45 C Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 1/g 5/1 15/1 Lập ma trận thực nghiệm Box - Behnken: Gồm 17 thí nghiệm kết hợp các yếu tố với 3 mức +1 (mức cao nhất), -1 (mức thấp nhất) và mức 0 (mức trung bình), trong đó 5 thí nghiệm lặp lại ở tâm (các yếu tố đều ở mức 0) (bảng 3.4). Bảng 3.4. Ma trận thực nghiệm Box- Behnken ba yếu tố và hàm lượng polyphenol của dịch chiết bã ổi đào Biến mã hóa Công C. Tỷ lệ dung môi/ thức A. Thời gian B. Nhiệt độ nguyên liệu 1 25 35 10 2 35 35 10 3 25 45 10 4 35 45 10 5 25 40 5 6 35 40 5 7 25 40 15 8 35 40 15 9 30 35 5 10 30 45 5 11 30 35 15 12 30 45 15 13 30 40 10 14 30 40 10 15 30 40 10 16 30 40 10 17 30 40 10
28 Dựa vào kết quả thí nghiệm, lựa chọn được điều kiện tối ưu sao cho có kết quả hàm lượng polyphenol là cao nhất. 3.5.3. Phương pháp nghiên cứu nội dung 4: Đánh giá khả năng chống oxy hóa của dịch chiết polyphenol bằng thử nghiệm DPPH và ứng dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo 3.5.3.1. Đánh giá khả năng chống oxy hóa của dịch chiết polyphenol bằng thử nghiệm DPPH Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo phương pháp của Fu và CS (2002) với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Khoảng 30 µl đến 120 µl dịch chiết trộn với nước cất để đạt thể tích tổng cộng 3 ml. Sau đó thêm 1 ml dung dịch DPPH 0,2 mM, lắc đều và để yên trong bóng tối 30 phút. Độ hấp thụ quang học được đo ở bước sóng 517 nm trên máy đo quang phổ. Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo công thức sau: DPPH (%) = 100 * (ACT – ASP) / ACT. Trong đó: - ACT: Độ hấp thu quang học của mẫu trắng không chứa dịch chiết - ASP: Độ hấp thu quang học của mẫu có chứa dịch chiết. Kết quả báo cáo bởi giá trị IC50 là nồng độ của dịch chiết khử được 50% gốc tự do DPPH ở điều kiện xác định. Giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính khử gốc tự do DPPH càng cao. Mỗi phân tích được tiến hành lặp lại ba lần, kết quả báo cáo là giá trị trung bình. 3.5.3.2. Ứng dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo Thức ăn chăn nuôi rất dễ bị hư hỏng trong quá trình bảo quản. Tiến hành kiểm tra mức độ hư hỏng của thức ăn chăn nuôi bằng cách thông qua việc xác định chỉ tiêu vi sinh vật tổng số, chỉ số axit và chỉ số peroxyt của thức ăn chăn nuôi giàu chất béo.  Phương pháp xác định chỉ tiêu vi sinh vật tổng số Giới hạn vi khuẩn, nấm mốc (3113/1999/QĐ-BYT ngày 11/10/1999 của Bộ trưởng Bộ Y tế)  Vi sinh vật tổng số
29 Vi sinh vật là cơ thể sống có kích thước rất nhỏ quan sát được bằng kính hiển vi, bao gồm vi khuẩn, nấm, động vật nguyên sinh và virus. Vi sinh vật tổng số là tất cả vi sinh vật có thể tồn tại và phát triển được trên môi trường dinh dưỡng chung, ở 30 10C sau một thời gian nuôi cấy nhất định trong 24-72 h. Xác định tổng số vi sinh vật tổng số để đánh giá mức độ nhiễm tạp của nguyên liệu và sản phẩm, từ đó đánh giá tình trạng vệ sinh, điều kiện bảo quản và dự đoán khả năng hư hỏng của sản phẩm Phương pháp này cho phép phát hiện những tế bào vi sinh vật còn sống có trong mẫu (ở cả dạng rắn và lỏng). Mặc dù đây không phải là một phương pháp đếm vi sinh vật một cách nhanh chóng nhưng nó thường được dùng như là phương pháp chuẩn để xác định số lượng vi sinh vật thực phẩm. - Nguyên tắc: Cấy chính xác một thể tích mẫu (hoặc dịnh pha loãng) vào trong hoặc lên trên bề mặt môi trường thạch. Từ mỗi độ pha loãng cần cấy lặp lại ít nhất là 2 hộp. Mỗi mẫu cần làm ít nhất 2 độ pha loãng liên tiếp để làm sao trên mỗi hộp có từ 30- 300 khuẩn lạc/hộp. Nuôi cấy trong điều kiện thích hợp cho các vi sinh vật phát triển, sau đó đếm số lượng các khuẩn lạc mọc lên. Có thể coi mỗi khuẩn lạc là kết quả của sự phát triển từ một tế bào [7]. - Thiết bị: + Hộp Petri + Que trang thủy tinh hoặc kim loại + Ống nghiệm dùng để pha loãng mẫu - Hóa chất: + Thức ăn chăn nuôi + Nước cất vô trùng, đã qua lọc. + Môi trường thạch thích hợp. Thực hiện cấy trên môi trường thạch TGA: - Pepton: 5g
30 - Glucose: 5g - Thạch: 15 g - Cao nấm men: 2,5g - Nước cất: 1000 ml - Cách tiến hành [7] Hoà tan các chất trong nước, đun nhỏ lửa, khuấy đều cho tan hoàn toàn. Đóng vào các bình dung tích 250ml, mỗi bình 150ml. Hấp tiệt trùng trong nồi hấp 121oC trong thời gian 15 - 20 phút. Môi trường nếu không dùng ngay, cần được bảo quản nơi khô ráo, trong bóng tối, ở nhiệt độ từ 0 đến 5oC không quá 30 ngày. Chuẩn bị dịch pha loãng. Pha loãng mẫu đến nồng độ cần thiết. - Cấy trong môi trường thạch + Đưa một cách vô trùng 1ml mẫu đã pha loãng đến nồng độ cần thiết vào đĩa Petri vô trùng. + Rót khoảng 15–18 ml môi trường thạch đã hóa lỏng trên nồi cách thủy (nhiệt độ khoảng 45˚C) vào mỗi đĩa đã có mẫu. Mỗi mẫu cần làm ít nhất 2 độ pha loãng liên tiếp và từ mỗi độ pha loãng cần lặp lại ít nhất là 2 hộp. + Trộn theo kỹ thuật được chuẩn hóa. Đĩa được xếp trên mặt phẳng ngang cho đến khi thạch nguội. - Cấy trên môi trường thạch + Rót khoảng 15 – 18 ml môi trường thạch đã hóa lỏng trên nồi cách thủy (nhiệt độ khoảng 45˚C) vào mỗi đĩa petri đã vô trùng. + Đĩa được xếp trên mặt phẳng ngang cho đến khi thạch nguội. + Đưa một cách vô trùng một thể tích 0,05 – 0,1 ml mẫu đã pha loãng đến nồng độ cần thiết lên bề mặt thạch chứa trong đĩa Petri. + Dùng que trang vô trùng dàn đều thể tích này lên khắp bề mặt môi trường. Mỗi mẫu cần làm ít nhất 2 độ pha loãng liên tiếp sao cho trên mỗi hộp sẽ có từ 30 – 300 khuẩn lạc và từ mỗi độ pha loãng cần cấy lặp lại ít nhất là 2 hộp.
31 + Lật hộp lại và đem nuôi cấy ở nhiệt độ và thời gian tùy theo sản phẩm cần nghiên cứu và tùy theo lọai vi sinh vật mà người ta muốn đánh giá sự phát triển của nó. Nhiệt độ thường 22˚C, 30˚C hay 37˚C và thời gian nuôi cấy là 24 giờ, 48 giờ. - Tính kết quả : Số lượng vi sinh vật trung bình có trong 1ml hay 1g mẫu được tính như sau [34]: N A (CFU/g hay CFU/ml) = ———————————– n1Vf1 + + n2Vf2 Trong đó : A : số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu N : tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn Ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i V : thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa Fi : độ pha loãng tương ứng  Nấm men – Nấm mốc Đếm nấm men và nấm mốc theo TCVN 4993-89 - Nguyên tắc: + Dùng môi trường nuôi chọn lọc quy định và 1 lượng mẫu thử quy định, nếu sản phẩm ban đầu là chất lỏng, hoặc một lượng huyền phù ban đầu, nếu sản phẩm có dạng khác để đổ đĩa. + Chuẩn bị các đĩa khác trong cùng điều kiện bằng cách sử dụng các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc huyền phù ban đầu. + Nuôi cấy hiếu khí các đĩa ở 25oC trong 3, 4 hoặc 5 ngày. + Tính số nấm men và nấm mốc trên gam hoặc trên mililít mẫu thử theo số khuẩn lạc xác định được trên đĩa ở độ pha loãng đã chọn sao cho đạt được kết quả có ý nghĩa. Môi trường nuôi cấy: - Chất chiết nấm men: 5g - Dectroza ( C6H12O6): 20g
32 - Cloramphenicol ( C11H12Cl2O5): 0,1g - Thạch: 12 – 15g - Nước: 1000ml - Cách tiến hành: Sử dụng 2 đĩa petri vô trùng. Dùng pipet vô trùng lấy 1 ml mẫu thử (nếu sản phẩm là chất lỏng) hoặc 1 ml huyền phù (nếu sản phẩm có dạng khác) lần lượt cho vào từng đĩa. Sử dụng tiếp 2 đĩa petri nữa. Dùng pipet vô trùng khác lấy 1 ml dung dịch phaloãng 10-1 lần lượt cho vào từng đĩa (nếu sản phẩm là chất lỏng) hoặc 1 ml dung dịch pha loãng 10-2 (nếu sản phẩm có dạng khác). Nếu cần, lặp lại thao tác trên với các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo. Từ bình lấy thêm khoảng 15 ml môi trường thạch - chất chiết nấm men - dectroza - cloramphenicol làm lỏng và đã được giữ ở 45 ± 1oC trong bếp cách thủy rồi lần lượt cho vào từng đĩa petri. Thời gian từ khi kết thúc chuẩn bị huyền phù ban đầu (hoặc dung dịch pha loãng 10-1, nếu là sản phẩm lỏng) đến khi rót môi trường vào đĩa không quá 15 phút. Trộn cẩn thận chất nuôi cấy với môi trường và để đông đặc lại bằng cách đặt đĩa petri trên 1 mặt phẳng mát nằm ngang. Chuẩn bị đĩa kiểm tra chứa 15 ml môi trường để kiểm tra độ tiệt trùng. - Đọc kết quả: + Úp các đĩa và đặt chúng vào tủ ấm ở 25 ± 1 oC. Đếm số khuẩn lạc trên các đĩa sau khi nuôi 3, 4 và 5 ngày. + Sau 5 ngày, giữ lại các đĩa chứa ít hơn 150 khuẩn lạc. Nếu nấm mốc phủ kín trên các đĩa hoặc khó đếm được các khuẩn lạc tách biệt hẳn thì giữ lại số đếm được sau khi nuôi 4 ngày hoặc thậm chí 3 ngày. Trong trường hợp này, cần ghi lại thời gian nuôi là 3 hoặc 4 ngày vào biên bản. + Nếu cần có thể kiểm tra bằng kính hiển vi để phân biệt các khuẩn lạc của nấm men và nấm mốc với khuẩn lạc của vi khuẩn dựa vào các hình thái của chúng.
33 - Tính kết quả: Số nấm men và nấm mốc, X, trên gam hoặc trên mililit được tính theo công thức: ∑C X = (n1 +0,1n2).d Trong đó: ΣC - tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa; n1 - số đĩa đếm được ở dung dịch pha loãng thứ nhất; n2 - số đĩa đếm được ở dung dịch pha loãng thứ hai; d - độ pha loãng cho số đếm thứ nhất  Phương pháp đánh giá chất lượng của chất béo Để kiểm tra mức độ ôi hóa của thức ăn chăn nuôi khi được bảo quản ở điều kiện thường so với khi được bảo quản trong dịch chiết polyphenol, 4g bã ổi đào được sử dụng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi sau đó xác định chỉ số axit và chỉ số peroxyt của thức ăn chăn nuôi bằng việc kiểm tra định kỳ 5 ngày 1 lần trong khoảng thời gian là 30 ngày khi được bảo quản ở nhiệt độ thường và khi được bảo quản trong dịch chiết polyphenol như sau:  Phương pháp xác định chỉ số axit (theo TCVN 6127:2010) - Chỉ số axit là số mg KOH dùng để trung hòa các axit béo tự do có trong 1g chất béo. Chỉ số axit càng cao, tức là lượng axit tự do càng nhiều chứng tỏ chất béo đó đã thủy phân nhiều và chất lượng chất béo càng giảm. - Nguyên lý: Mẫu thử được hòa tan trong dung môi thích hợp và các axit béo có mặt được chuẩn độ bằng dung dịch Kali hoặc Natri Hydroxyt trong ethanol hoặc methanol, với chất chỉ thị phenolphtaelein. - Cách tiến hành: Cân chính xác 5g mẫu cho vào bình tam giác 250ml. Sau đó cho 15ml etanol 96% thể tích và 15ml dietyl ete, lắc nhẹ cho dần tan hết sau đó cho vài giọt phenolphthalein rồi đem chuẩn độ bằng KOH 0,1N trong cồn 95o đến khi dung dịch xuất hiện màu hồng bền trong 30 giây thì kết thúc chuẩn độ.
34 - Tính kết quả: Tính chỉ số axit (WAV), biểu thị bằng số mg KOH dùng để trung hòa các axit béo tự do có trong 1g chất béo, sử dụng công thức sau: WAV = 5,61*C*V M Trong đó: C là nồng độ của dung dịch chuẩn KOH, tính bằng ,mol/lít (mol/l) V là thể tích dung dịch chuẩn KOH 0,1N đã sử dụng, tính bằng mililit (ml) M là khối lượng phần mẫu thử tính bằng gam (g)  Phương pháp xác định định chỉ số peroxit - Chỉ số peroxyt là số gram iod được giải phóng ra khi cho dung dịch Iodua Kali (KI) tác dụng với 100g dầu mỡ nhờ tác dụng của cả peroxyt trong dầu mỡ (oxy hoạt động). Chỉ số peroxyt đặc trưng cho sự ôi hóa của chất béo - Thức hiện theo “TCVN 6121:2010 dầu mỡ động vật & thực vật - xác định chỉ số peroxyt - phương pháp xác định điểm kết thúc chuẩn độ iod (quan sát bằng mắt)”. - Nguyên tắc Dựa vào tác dụng của peroxyt với dung dịch Iodua Kali (KI) tạo ra I2 tự do (trong môi trường acid acetic và cloroform). Sau đó chuẩn độ I2 tự do bằng dung dịch chuẩn Na2S2O3 với chỉ thị hồ tinh bột. Điểm tương đương nhận được khi dung dịch chuyển từ màu tím đen sang không màu. - Cách tiến hành: Cân vào erlen có nút nhám chính xác 5g mẫu thức ăn chăn nuôi. Hòa tan mẫu thử bằng 10ml chloroform (CHCL3). Thêm 15ml axetic acid hoặc cho vào 15 - 30ml hỗn hợp chloroform-axetic acid bang (tỷ lệ 1:2). Thêm 1ml dung dịch KI bão hòa. Đậy kín erlen ngay, lắc trong 1 phút và để yên 5 phút ở nơi tối và nhiệt độ từ 15 - 25oC. Thêm 30ml nước cất, lắc mạnh, thêm 5 giọt hồ tinh bột 1% làm chất chỉ thị. Chuẩn độ iod tạo thành bằng dung dịch Na2S2O3 0,002N cho mẫu có chỉ số peroxyt nhỏ và Na2S2O3 0,01N cho mẫu có chỉ số peroxyt lớn.
35 Lưu ý: - Cần chuẩn độ 2 - 3 mẫu trong cùng điều kiện. - Chuẩn độ một mẫu trắng song song (thay 5ml dung dịch mẫu thử bằng 5ml nước cất). Nếu kết quả của mẫu trắng vượt quá 0,1ml dung dịch Na2S2O3 0,01N thì đổi hóa chất do không tinh khiết. - Tính kết quả: Tính chỉ số peroxit (PV), biểu thị bằng mili đương lượng (meq) ôxy hoạt động trên kilogam, sử dụng Công thức sau: PV= (V-V0)*Cthio*F*1000 m Trong đó: V là thể tích dung dịch chuẩn natri thiosulfat dùng để xác định, tính bằng mililit (ml) V0 là thể tích dung dịch chuẩn natri thiosulfat dùng trong phép thử trắng, tính bằng mililit (ml) cthio là nồng độ của dung dịch natri thiosulfat, tính bằng mol trên lít (mol/l) m là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g) F là nồng độ đường lượng gam của Na2S2O3 3.5.4. Phương pháp nghiên cứu nội dung 5: Hoàn thiện quy trình thu dịch chiết từ bã quả ổi đào - Tổng hợp và lựa chọn các chỉ tiêu sau khi phân tích - Vẽ sơ đồ - thuyết minh quy trình tách chiết polyphenol từ bã qua ổi đào. 3.6. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 20. So sánh sự sai khác giữa các giá trị trung bình bằng so sánh Duncan. Các số liệu thu thập được thống kê và xử lý theo phương pháp bề mặt chỉ tiêu theo thiết kế thí nghiệm của Box- Behnken với ba biến ba cấp độ. Các số liệu được xử lý trên phần mềm Design - Expert 7.0.
36 Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả đánh giá thành phần nguyên liệu ban đầu 4.1.1. Kết quả xác định trọng lượng khô của nguyên liệu Hàm lượng chất khô của bã ổi đào là 32,637% cho thấy bã ổi đào có hàm lượng nước khá cao chiếm 67,363% trọng lượng khô. Hàm lượng ẩm cao là một bất lợi trong quá trình bảo quản mẫu. Vì vậy, để thuận tiện trong quá trình bảo quản và chiết tách thì ta phải tiến hành làm khô sao cho hàm lượng nước trong bã ổi đào xuống đến ẩm độ khoảng 10%. Hơn nữa làm khô giúp thuận tiện cho quá trình xay nhỏ, giảm kích thước, tạo độ đồng đều cho mẫu giúp quá trình tách chiết đem lại hiệu quả cao hơn. 4.1.2. Kết quả xác định hàm lượng polyphenol tổng số Kết quả cho thấy hàm lượng polyphenol tổng của bã quả ổi đào 38,465mg GAE/g DW cao hơn so với hàm lượng polyphenol thu được từ vỏ thân quao nước khi sử dụng dung môi là hexan, thời gian chiết tách là 3 giờ, nhiệt độ chiết tách là 30oC với tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu là 1/10 theo nghiên cứu của Phạm Ngọc Khôi (2017) với hàm lượng polyphenol là 36,79 mgGAE/g DW. Một số tác giả đã công bố hàm lượng polyphenol trong một số loại thực vật. Kết quả nghiên cứu của Marja và cộng sự (1999) khi nghiên cứu hàm lượng polyphenol của 92 loại thực vật ăn được và không ăn được đã báo cáo rằng hàm lượng polyphenol của chúng dao động khá rộng trong khoảng từ 0,2 đến 155,3 mg GAE/g DW. Theo nhóm tác giả này những loại thực vật có hàm lượng polyphenol lớn hơn 20 mg GAE/g DW thì có hoạt tính chống oxi hóa mạnh mẽ. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy hàm lượng polyphenol của bã ổi đào còn lại là tương đối cao chúng có thể được dùng để ứng dụng trong một số lĩnh vực, trong đó có thực phẩm. Tuy nhiên, để khẳng định khả năng chống oxi hóa cần tiến hành các phân tích in vitro để khẳng định khả năng chống oxi hóa của bã ổi đào.
37 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện tách chiết thu dịch chiết tổng từ bã ổi đào 4.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi và nồng độ của dung môi chiết đến hàm lượng polyphenol Nhìn vào bảng 4.1 cho thấy hàm lượng polyphenol thu được thấp nhất là 36.87 mg GAE/g DW khi sử dụng dung môi là meOH, cao thứ 2 là nước với hàm lượng polyphenol là 37,19 mg GAE/g DW và cao nhất là EtOH với hàm lượng polyphenol là 37,23 mg GAE/g DW. Ta thấy ở dung môi là nước và EtOH cho hàm lượng polyphenol không có sự sai khác về giá trị trung bình. Chính vì vậy chúng tôi đã lựa chọn nước là dung môi để tránh ô nhiễm, giảm công đoạn thu hồi dung môi và tiết kiệm được chi phí tách chiết. Bởi vì lựa chọn dung môi nước cho nên không có nồng độ dung môi. Bảng 4.1. Bảng so sánh hàm lượng polyphenol thu được ở các loại dung môi khác nhau Hàm lượng polyphenol Dung môi (mg GAE/ g DW) MeOH 36,87b Nước 37,19a EtOH 37,23a 4.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu đến hàm lượng polyphenol Tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu ảnh hưởng tới hàm lượng polyphenol thu được. Nếu lượng dung môi quá ít thì không đủ để hòa tan, chiết rút các cấu tử ra bên ngoài môi trường, chỉ đủ làm ướt nguyên liệu. Nếu dùng lượng dung môi lớn thì gây lãng phí, tốn kém dung môi, chi phí cao. Thí nghiệm tiến hành để khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hàm lượng polyphenol thu được và tìm ra tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tốt nhất cho quá trình chiết, kết quả được trình bảy ở bảng 4.2.
38 Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu đến hàm lượng polyphenol Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu Hàm lượng polyphenol Công thức (ml/g) (mg GAE/ g DW) CT1 5/1 36,22b CT2 10/1 37,06a CT3 15/1 35,93b CT4 20/1 35,49c Ghi chú: Các chữ trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức α<0,05 Qua bảng trên ta thấy được tỷ lệ dung môi/nguyên liệu có ảnh hưởng tới hàm lượng polyphenol được chiết từ bã ổi đào. Ở tỷ lệ 10/1, hàm lượng polyphenol đạt cao nhất là 37,06 mg GAE/g DW, hàm lượng polyphenol cao thứ 2 là 36,22 mg GAE/g DW ở tỷ lệ 5/1 và giảm dần ở 2 tỷ lệ 15/1 và 20/1 với hàm lượng polyphenol lần lượt là 35,93 mg GAE/g DW và 35.8 mg GAE/g DW. Đạt hàm lượng polyphenol cao nhất 37,06 mg GAE/g DW ở tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu là 10/1 (v/w). Vì vậy chúng tôi lựa chọn tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu thích hợp là 10/1 (v/w). Kết quả này được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo. 4.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol Thời gian chiết là một trong những yếu tố ảnh hưởng rất lớn tới hàm lượng polyphenol. Nếu thời gian chiết kéo dài không những hàm lượng polyphenol giảm mà còn có thể khiến polyphenol bị oxy hóa. Nhưng nếu thời gian chiết ngắn thì không đủ cho dung môi xâm nhập vào trong tế bào để hòa tan polyphenol và chiết rút ra ngoài ít khiến hàm lượng polyphenol thu được thấp. Do vậy cần phải xác định thời gian chiết tối ưu. Kết quả được biểu diễn ở bảng 4.3: Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol Thời gian chiết Hàm lượng polyphenol Công thức (phút) (mg GAE/ g DW) CT1 25 36,34b CT2 30 37,07a CT3 35 36.87a CT4 40 36.93a Ghi chú: Các chữ trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức α<0,05
39 Từ bảng 4.3 cho thấy thời gian tách chiết có ảnh hưởng đến quá trình chiết tách polyphenol từ bã ổi đào. Ta có thể nhận thấy hàm lượng polyphenol tăng khi thời gian chiết từ 25 lên 30 phút là 36,34 mg GAE/g DW lên 37,07 mg GAE/g DW. Nhưng khi tăng thời gian chiết lên 35 và 40 phút thì hàm lượng polyphenol giảm xuống còn 36.78 và 36,93 mg/g DW. Khi chiết ở thời gian là 30 phút thì cho hàm lượng polyphenol là cao nhất, vì vậy chúng tôi chọn thời gian chiết thích hợp là 30 phút. Kết quả này được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo. 4.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng lớn tới hàm lượng polyphenol thu được sau quá trình chiết. Nhiệt độ làm giảm độ nhớt của dung dịch, tăng tốc độ thẩm thấu của dung môi vào tế bào và tăng hiệu suất trích ly. Tuy nhiên, khi tăng nhiệt độ quá cao sẽ làm giảm hiệu quả của quá trình chiết vì đã làm bay hơi một phần dung môi và gây ảnh hưởng tới trạng thái, cấu trúc của polyphenol. Ngược lại, nhiệt độ thấp thời gian chiết kéo dài, không chiết kiệt được các chất trong bã. Vì vậy cần tìm ra một giá trị nhiệt độ chiết phù hợp, kết quả thu được như sau: Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol Nhiệt độ chiết Hàm lượng polyphenol Công thức (0C ) (mg GAE/ g DW) CT1 35 36,74b CT2 40 37,13a CT3 45 36,95ab CT4 50 36,96ab Ghi chú: Các chữ trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức α<0,05 Qua bảng 4.4 ta thấy rằng, hàm lượng polyphenol trong dịch chiết tăng nhanh ở 35oC từ 36,74 mg GAE/g DW lên đến 37,17 mg GAE/g DW ở 40oC. Tuy nhiên khi tiếp tục tăng nhiệt độ lên 45 và 500C thì hàm lượng polyphenol có xu hướng giảm, giảm tương đối. Hàm lượng polyphenol thu được cao nhất cao nhất ở nhiệt độ 400C . Vì vậy nhiệt độ chiết thích hợp cho quá trình chiết là 400C, kết quả này được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
40 4.3. Thử nghiệm tách chiết trên điều kiện tối ưu 4.3.1. Kết quả thử nghiệm tối ưu hóa quá trình tách chiết polyphenol từ bã ổi đào Sử dụng phương pháp bề mặt chỉ tiêu theo thiết kế thí nghiệm của Box- Behnken với ba biến ba cấp độ. Các số liệu thu được từ dịch chiết polyphenol được xử lý trên phần mềm Design-Expert 7.0 (Stat-Ease Inc, Minneapolis, USA) ANOVA được dùng để đánh giá cao thu được. Tiến hành giải bài toán tối ưu theo phương pháp “hàm mong đợi”. Sử dụng phần mềm Design-Expert 7.0 để tiến hành tối ưu hóa nhằm xác định được giá trị của ba yếu tố mà tại đó hàm lương polyphenol là cao nhất. Áp dụng phương pháp phân tích hồi quy các số liệu thực nghiệm, thu được mô hình đa thức bậc hai thể hiện hàm lượng polyphenol : Y = + 6.20 + 0.029 * A + 8.803 E - 0.003 * B + 0.026 * C + 0.018 * A * B + 0.012 * A * C - 0.11 * A2 - 0.055 * B2 - 0.060 * C2 Trong đó Y là hàm lượng polyphenol trong dịch chiết dự báo thu được. Bảng 4.5. Kết quả ma trận thực nghiệm Box- Behnken ba yếu tố chiết Polyphenol từ bã ổi đào Biến thực Hàm lượng C TN A B polyphenol (dung môi/ (thời gian chiết) (nhiệt độ chiết) (mg GAE /g DW) nguyên liệu) 1 25 35 10 36,13 2 35 35 10 36,44 3 25 45 10 35,98 4 35 45 10 37,18 5 25 40 5 35,87 6 35 40 5 36,24 7 25 40 15 36,23 8 35 40 15 37,17 9 30 35 5 36,79 10 30 45 5 36,54 11 30 35 15 37,04 12 30 45 15 37,56 13 30 40 10 38,33 14 30 40 10 38,51 15 30 40 10 38,36 16 30 40 10 38,59 17 30 40 10 38,21
41 Để đánh giá mô hình chúng tôi sử dụng phân tích ANOVA. Kết quả phân tích ANOVA được thể hiện qua bảng sau: Bảng 4.6. Kết quả ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố chiết polyphenol từ bã ổi đào Nguồn SS DF MS Chuẩn F Giá trị p Model 0.099 9 0.011 107.39 < 0.0001 A 6.806E-003 1 6.806E-003 66.70 < 0.0001 B 6.199E-004 1 6.199E-004 6.08 0.0432 C 5.570E-003 1 5.570E-003 54.59 0.0002 AB 1.350E-003 1 1.350E-003 13.23 0.0083 AC 5.470E-004 1 5.470E-004 5.36 0.0538 BC 9.990E-004 1 9.990E-004 9.79 0.0166 A2 0.047 1 0.047 459.10 < 0.0001 B2 0.013 1 0.013 127.00 < 0.0001 C2 0.015 1 0.015 148.78 < 0.0001 Residual 7.142E-004 7 1.020E-004 Lack of Fit 1.231E-004 3 4.105E-005 0.28 0.8395 Sai số (pure error) 5.911E-004 4 1.478E-004 SS tổng Số 0.099 16 SS: Tổng phương sai; DF:Bậc tự do; MS: Trung bình phương sai; chuẩn F: Chuẩn Fisher; Residual: Phần dư; “Lack of Fit”: Chuẩn đánh giá độ không tương thích của mô hình với thực nghiệm. Từ kết quả phân tích ANOVA ta thấy giá trị xác suất của mô hình P-value = 0,0214 < 0,05 do đó mô hình được lựa chọn để giải thích cho kết quả của thí nghiệm, Lack of fit test = (not significant) có ý nghĩa đối với mô hình.
42 Hình 4.1. Bề mặt đáp ứng hàm lượng polyphenol a. Mô hình tương tác giữa nhiệt độ chiết tách và thời gian chiết tách b. Mô hình tương tác giữa tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu và thời gian chiết tách c. Mô hình tương tác giữa tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu và nhiệt độ chiết tách Phương án tốt nhất được dự đoán nhiệt độ chiết tách là 30,73oC, thời gian chiết tách là 40,52 phút khi đó hàm lượng, tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu là 10/1 (v/w), polyphenol đạt 38,4322 mg/g DW. Kết quả kiểm tra bằng thực nghiệm cho kết quả tương ứng. Hình 4.2. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu ở hàm lượng polyphenol 4.4. Kết quả xác định khả năng chống oxy hóa của dịch chiết bã ổi đào thông qua khả năng khử gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) và ứng dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo 4.4.1. Kết quả xác định khả năng chống oxy hóa của dịch chiết bã ổi đào thông qua khả năng khử gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) Khả năng quét gốc tự do DPPH là một trong những phép phân tích để đánh giá hoạt tính chống oxi hóa trong in vitro thường sử dụng nhất trong nghiên cứu, có
43 đến 90% các nghiên cứu về chất chống oxi hóa sử dụng phép phân tích này (Joon- Kwan và Takayuki, 2009). Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết bã ổi đào thể hiện khả năng chống oxi hóa thông qua khả năng khử gốc tự do DPPH. Trong phạm vi nghiên cứu này, sự tăng khả năng khử gốc tự do DPPH có mối tương quan tuyến tính khá chặt với thể tích dịch chiết sử dụng (R2 = 0,9981). Mối tương quan giữa thể tích dịch chiết và khả năng khử gốc tự do có dạng: y = 0,4637x + 7.435, trong đó y là khả năng khử gốc tự do DPPH, x là thể tích dịch chiết. Giá trị IC50 của dịch chiết có khả năng khử được 50% gốc tự do DPPH trong điều kiện thí nghiệm được xác định từ mối quan hệ tuyến tính giữa thể tích dịch chiết và khả năng khử gốc tự do DPPH, Giá trị IC50 càng thấp khả năng chống oxy hóa càng cao [10, 11]. Kết quả cho thấy giá trị IC50 của dịch chiết là 91,8 µl thấp hơn 0,91µl so với kết quả trong nghiên cứu của Hồ Minh Hiệp (2013) với giá trị IC50 là 92,71µl. Điều này cho thấy dịch chiết polyphenol trong nghiên cứu này có khả năng chống oxi hoá cao hơn, thể hiện thông qua khả năng khử gốc tự do DPPH có thể được lý giải là do trong dịch chiết bã quả ổi đào có chứa các chất chống oxi hóa, mà điển hình là các hợp chất polyphenol. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tiềm năng có thể sử dụng bã ổi đào làm nguồn chiết xuất các chất chống oxi hóa và khả năng áp dụng dịch chiết này trong một số lĩnh vực, trong đó có thực phẩm. Hình 4.3. Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết bã ổi đào
44 4.4.2. Kết quả ứng dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo 4.4.2.1. Kết quả xác định về chỉ tiêu vi sinh vật tổng số Kết quả khảo sát giới hạn vi sinh vật & nấm men, nấm mốc trong thức ăn chăn nuôi. Tiến hành thí nghiệm xác định chỉ tiêu vi sinh vật tổng số, kết quả thu được trình bày ở bảng 4.7: Bảng 4.7. Kết quả đáng giá chỉ tiêu vi sinh vật theo 10TCN 863:2006 Tên chỉ tiêu Kết quả Mức tối đa Tổng số vsv hiếu khí 8,9.104 1.106 Nấm men, nấm mốc 6,7.103 1.105 Qua bảng 4.7 cho thấy chỉ tiêu vi sinh vật tổng số đạt yêu cầu theo quy định ban hành. 4.4.3. Khảo sát hàm lượng chất béo có trong thức ăn chăn nuôi giàu chất béo Thức ăn chăn nuôi trong quá trình bảo quản có thể bị hư hỏng do bị chua do chất béo bị thủy phân sinh ra các axit béo tự do và glyxerin và bị ôi khét do bị oxy hóa chất béo bởi oxy của không khí, chúng kết hợp với các mạch cacbon không bão hòa của dầu mỡ và cho các peroxyt không bền vững. Các peroxyt này bị phân hủy thành các aldehyt và xeton làm cho thức ăn chăn nuôi bị ôi khét, Để đánh giá mức độ thủy phân và oxy hóa của thức ăn chăn nuôi cần xác định chỉ số axit và chỉ số peroxyt Từ đó đánh giá được chất lượng của thức ăn chăn nuôi trong quá trình bảo quản. Bảng 4.8. Chỉ số axit và chỉ số peroxyt ban đầu của thức ăn chăn nuôi Giá trị đo Chỉ số axit (mg KOH/g) Chỉ số peroxyt (meq/g) Chất béo trong cám lợn 3,08 7,13
45 Bảng 4.9. Sự biến đổi chỉ số axit và chỉ số peroxyt của thức ăn chăn nuôi có bổ sung dịch chiết polyphenol trong 30 ngày bảo quản Bảo quản trong dịch chiết Bảo quản điều kiện thường Ngày bảo polyphenol quản Chỉ số axit Chỉ số peroxyt Chỉ số axit Chỉ số peroxyt (mg KOH/g) (meq/kg) (mg KOH/g) (meq/kg) 0 3,08 7,13 3,08 7,13 5 4,12 7,41 4,06 7,28 10 5,34 8,03 5,12 7,35 15 6,89 8,59 6,11 7,48 20 7,16 9,12 6,29 7,78 25 7,97 9,87 6,48 8,32 30 8,21 10,05 6,51 8,85 Theo QCVN 01 - 78: 2011/BNNPTNT (Phụ lục 7) với thức ăn chăn nuôi có nguồn gốc từ một số nguyên liệu khác nhau có chỉ số peroxyt tối đa cho phép không lớn hơn 40 meq/kg và chỉ số axit tối đa cho phép không vượt quá 60 mg KOH/100g bột. Qua việc khảo sát chúng ta thấy được hàm lượng polyphenol trong bã ổi đào thu được tương đối cao vì vậy khi bảo quản thức ăn chăn nuôi trong dịch chiết đã giúp làm chậm quá trình oxy hóa chất béo. Bên cạnh đó chúng ta có thể tận dụng được triệt để bã ổi đào sau khi sản xuất nước ép.
46 4.5. Hoàn thiện quy trình tách chiết polyphenol từ bã ổi đào Quả ổi đào Xử lý ( rửa, xay ) Bã ổi đào Chiết chất chống Dung môi chiết :nước Nhiêt độ chiết: 40,52o C oxy hóa Thời gian chiết: 30,73 phút Tỷ lệ dung môi/ nguyên Dịch chiết liệu: 10/1 (w/v). Xác định hàm lượng Polyphenol Hình 4.4. Sơ đồ hoàn thiện quy trình tách chiết polyphenol Thuyết minh quy trình: Quả ổi đào có độ chín 90% được thu hái về mang đi loại bỏ tạp chất, sâu bệnh, thối hỏng. Rửa quả bằng nước sạch, để khô tự nhiên sau đó mang đi xay lấy bã. Bã của quả ổi đào được tách chiết bằng phương pháp trích ly trong điều kiện: Dung môi chiết là nước, nhiệt độ và thời gian chiết lần lượt là 40,52o C và 30,73 phút, tỉ lệ nguyên liệu so với dung môi chiết là 1/10 (w/v). Dịch chiết thu được được mang đi xác định hàm lượng polyphenol.
47 Phần 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận Qua những kết quả nghiên cứu đạt được, có thể đưa ra một số kết luận như sau: Xác định được trọng lượng khô trong nguyên liệu là 32,637% Xác định được hàm lượng polyphenol trong nguyên liệu là 38,465 mg GAE/g DW. Sử dụng phương pháp phân tích đơn yếu tố, thí nghiệm sau kế thừa kết quả nghiên cứu của thí nghiệm trước. Lựa chọn dung môi chiết là nước, thời gian chiết 30 phút, nhiệt độ chiết 40oC tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu là 10/1 (ml/g). Bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm Box- Behnken đã tìm đươc điều kiện tối ưu quá trình tách chiết dịch chiết của bã ổi đào: Dung môi chiết là nước, tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu là 10/1 (v/w), thời gian chiết là 30,73 phút và nhiệt độ chiết là 40,52oC cho hàm lượng Polyphenol là 38,4322 mg/g DW. Khả năng quét gốc tự do DPPH: cứ 91,8 µg dịch chiết bã quả ổi đào ở điều kiện chiết tối ưu thì khử được 50% gốc tự do. Ứng dụng hợp chất polyphenol chiết được từ bã quả ổi đào trong bảo quản thức ăn chăn nuôi cho thấy Polyphenol trong bã quả ổi đào có khả năng chống oxi hóa trong bảo quản thức ăn chăn nuôi. 5.2. Kiến nghị Do điều kiện nghiên cứu còn giới hạn nên còn nhiều khía cạnh vẫn chưa thể khai thác được triệt để, chúng tôi xin đề nghị một số vấn đề cần nghiên cứu tiếp theo như: Khảo sát thêm một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết polyphenol từ bã quả ổi đào, đồng thời tiến hành thử nghiệm khả năng chống oxy hóa của dịch chiết bã ổi đào đối với thức ăn chăn nuôi giàu chất béo và nhiều đối tượng khác để đưa ra được kết quả chính xác hơn nữa về khả năng chống oxy hóa của chúng.
48 TÀI LIỆU THAM KHẢO I. TIẾNG VIỆT [1] Hồ Bá Vương, Nguyễn Xuân Duy, Nguyễn Anh Tuấn, “Tối ưu hóa chiết polyphenol từ lá ổi bằng phương pháp bề mặt đáp ứng”, Tạp chí Khoa học và Nông nghiệp Việt Nam - Vol. 7, No.13. [2] Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, quyển II, tr.59. [3] Đỗ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr.5p431. [4] Viện dược liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Khoa học và kỹ thuật, tr.499-504. [5] Ngô Thanh Hùng (2013), “Tối ưu hóa điều kiện chiết polyphenol từ lá vối (cleistocalyx operculatus) và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết”, Đại học Nha Trang. [6] Ngô Xuân Mạnh (2006). GT Hóa sinh thực vật. NXB Nông Nghiệp [7] Nguyễn Thị Đoàn (2010), Phân tích thực phẩm, Giáo trình nội bộ - Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên. [8] Phạm Ngọc Khôi, Nguyễn Thị Mỹ Duyên (2017), “Khảo sát điều kiện tách chiết và hoạt tính kháng oxy hóa, kháng khuẩn của hợp chất polyphenol từ vỏ thân cây quao nước”, tạp chí Đại học sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh, tập 14, số 12, tr.181-193. [9] Hồ Minh Hiệp (2013), “Nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết lá Ổi và ứng dụng hạn chế sự oxi hóa chất béo thịt cá Dầu bảo quản lạnh ”, khóa luận tốt nghiệp - trường Đại học Nha Trang. [10] Nguyễn Minh Cẩm Tiên, Phạm Ngọc Khôi, “Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng oxy hóa của hợp chất polyphenol chiết xuất từ rễ cây mướp gai (Lasia spinosaL.)”,Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, tập 20, Phụ bản số 20, tr.436 -446, 2016.
49 [11] Phạm Ngọc Khôi, Lê Trọng Nghĩa, “Khảo sát các điều kiện thu hồi dịch chiết và hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa của dịch chiết bắp cải tím (Brassica oleracea),”Tạp chí Khoa học Yersin, số 1 (11/2016), tr.23 -29, 2016 II. TIẾNG ANH [12]. Chirinos Gallardo(2008), “Polyphenols from the Andean mashua (Tropaeolum tuberosum) tuber: Evaluation of genotypes, extraction,chemical characterization and antioxidant properties”, These doctorale de University catholique de Louvain. [13]. Unno, T., Kondo, K., Itakura, H. and Takeo, T.(1996), “Analysis of Epigallocatechin Gallate in Human Serum Obtained after Ingesting Green Tea in Biosci, Biotech. Biochem, 60, 2066-2148 [14] Luximon - Ramma A., Bahorun T., and Crozier A. (2003), “Antioxidant actions and phenolics and vitamin C contents of common Mauritian exotic fruits”, Journal of the Science of Food and Agriculture, 83(5), 496-502. [15] Mercadante, A., Z., Teck, Z., and Pfander, H. 1999, “Carotenoids from guava (Psidium Guajava L.): isolation and structure elucidatio”, Journal Agriculture Food Chemistry”, 47(1), 145-151. [16] Dassgupta, A., and Klein, K. (2014), “Antioxidants in Food, Vitamin and Supplements, Prevention and Treatment of Disease”, Elsevier, pp. 209-235. [17] Lim, T., K., and Khoo, K., C. (1990), “Guava in Malaysia: Production, pests and diseases”, Tropical Press Malaysia. Kuala Lumpur. [18] Jimenez-Escrig, A., Rincon, M., Pulido, R., and Saura-Calixto, F. (2001), “Guava fruit (Psidium guajava L.) as a new source of antioxidant dietary fiber”, Journal of Agricultural and Food Chemistry. 49(11), 5489-5493. [19] Arima, H, Danno, G (2002), “ Isolation of antimicrobial compounds from guava”, Bioscience, Biotechnology and Biochemistry. Vol.66, issue 8, p.1727-1730. [20] Paniandy, J.C. Chane – ing, J Pieribattesti (2000), “ Chemical composition of the essential oil and headspeace solid phase microextraction of the guava
50 fruit ( Psidium guajava L.)”. Journal of Esential oil Research, Vol.12, Issue 2, p.153-158. [21] Deguchi Y, Miyazaki K (2010), Anti-hyperglycemic and anti-hyperlipidemic effects of guava leaf extract, Nutr Metab (Lond), 7:9. [22] Chen Y, Zhou T, Zhang Y, Zou Z, Wang F, Xu D (2015), Evaluation of antioxidant and anticancer activities of guava, Int J Food Nutr Saf, 6(1):1–9. [23] Venkatesan N, Thiyagarajan V, Narayanan S, Arul A, Raja S, Kumar SGV, Rajarajan T, Perianayagam JB (2005), Antidiarrheal potential of Asparagus racemous wild root extracts in laboratoire animals, J Pharm Pharmaceut Sci, 8:39–45. [24] Vieira RHSF, Rodrigues DP, Gonçalves FA, Menezes FGR, Aragoo JS, Sousa OV(2001), Microbicidal effect of medicinal plant extracts (Psidium guajava linn. And Carica papaya linn.) upon bacteria isolated from fish muscle and known to induce dirrhea in children, Rev Inst Med trop S Paulo, 43:145–8. [25] Ojewole J, Awe EO, Chiwororo WDH (2008), Antidiarrhoeal activity of Psidium guajava Linn. (Myrtaceae) leaf aqueous extract in rodents. J Smooth Muscle Res, 44(6):195–207. [26] Denny C, Melo PS, Franchin M, Massarioli AP, Bergamaschi KB, Alencar SM De, et al (2013), Guava pomace: a new source of anti-inflammatory and analgesic bioactives. [27] Roy CK, Kamath JV, Asad M (2006), Hepatoprotective activity of Psidium guajava Linn. leaf extract. Indian J Exp Biol, 2006;44(4):305–11. [28] Masuda T, Inaba Y, Maekawa T, Takeda Y, Yamaguchi H, Nakamoto K, Kuninaga H, Nishizato S, Nonaka A(2003), Simple detection method of powerful antiradical compounds in the raw extract of plants and its application for the identification of antiradical plant constituents, J Agric Food Chem, 51:1831–8. [29] Feskanich D, Ziegler RG, Michaud DS, Giovannucci EL, Speizer FE, Willett WC, Colditz GA (2000), Prospective study of fruit and vegetable
51 consumption and risk of lung cancer among men and women, J Natl Cancer Inst, 92:1812–23. [30] Fleuriet A, Macheix JJ (2003), “Phenolic acids in fruits and vegetables. In C.A. Rice-Evans & L. packer, flavonoids in health and disease”, New York: Marcel Dekker Inc. [31] Jiminez-Escrig A, Rincon M, Pulido R, Saura-Calixto F (2001), “Guava fruit (Psidium guajava L.) as a new source of antioxidant dietary fiber”, J Agric Food Chem. 49(11):5489–93. [32] He Q, Venant N, Antioxidant power of phytochemicals from Psidium guajava leaf, J Zhejiang Univ Sci A 2004; 5(6):676-83. [33] C.A Rice-Evans, N. J. Miller, G. Paganga (1997), “Antioxidant properties of phenolic compounds, Trends Plant Sci, 2(4). TRANG WEB [34]
PHỤ LỤC Phụ lục 1: Một số hình ảnh trong quá trình nghiên cứu Dãy nồng độ pha loãng axit gallic Quá trình rung lắc dịch chiết bã ổi đào Bã ổi đào Dịch chiết Polyphenol
Phụ lục 2: Xử lý số liệu 1. Xử lý kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tách chiết polyphenol từ bã ổi đào 1.1. Xử lý kết quả khảo sát loại dung môi chiết ANOVA TPC Sum of df Mean Square F Sig. Squares Between Groups .233 2 .116 187.125 .000 Within Groups .004 6 .001 Total .237 8 TPC Duncan Dungmoi N Subset for alpha = 0.05 1 2 CT1 3 36.8700 CT2 3 37.1933 CT3 3 37.2267 Sig. 1.000 .153 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.
1.2. Xử lý kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu ANOVA TPC Sum of df Mean Square F Sig. Squares Between Groups 3.925 3 1.308 24.435 .000 Within Groups .428 8 .054 Total 4.353 11 TPC Duncan dungmoi.nguyenlieu N Subset for alpha = 0.05 1 2 3 CT4 3 35.4900 CT3 3 35.9300 CT1 3 36.2167 CT2 3 37.0567 Sig. 1.000 .168 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.
1.3. xử lý kết quả khảo sát thời gian chiết ANOVA TPC Sum of df Mean Square F Sig. Squares Between Groups .927 3 .309 8.924 .006 Within Groups .277 8 .035 Total 1.204 11 TPC Duncan thoigian N Subset for alpha = 0.05 1 2 CT1 3 36.3400 CT3 3 36.8700 CT4 3 36.9333 CT2 3 37.0733 Sig. 1.000 .235 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.
1.4. xử lý kết quả khảo sát tỷ lệ nhiệt độ chiết ANOVA TPC Sum of df Mean Square F Sig. Squares Between Groups .233 3 .078 5.982 .019 Within Groups .104 8 .013 Total .337 11 TPC Duncan nhietdo N Subset for alpha = 0.05 1 2 CT1 3 36.7400 CT2 3 36.9467 36.9467 CT4 3 36.9600 36.9600 CT3 3 37.1333 Sig. .053 .091 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.
1.5. Tối ưu hóa quá tình tách chiết Polyphenol từ bã ổi đào Nguồn SS DF MS Chuẩn F Giá trị p Model 0.099 9 0.011 107.39 < 0.0001 A 6.806E-003 1 6.806E-003 66.70 < 0.0001 B 6.199E-004 1 6.199E-004 6.08 0.0432 C 5.570E-003 1 5.570E-003 54.59 0.0002 AB 1.350E-003 1 1.350E-003 13.23 0.0083 AC 5.470E-004 1 5.470E-004 5.36 0.0538 BC 9.990E-004 1 9.990E-004 9.79 0.0166 A2 0.047 1 0.047 459.10 < 0.0001 B2 0.013 1 0.013 127.00 < 0.0001 C2 0.015 1 0.015 148.78 < 0.0001 Residual 7.142E-004 7 1.020E-004 Lack of Fit 1.231E-004 3 4.105E-005 0.28 0.8395 Sai số (pure error) 5.911E-004 4 1.478E-004 SS tổng Số 0.099 16 2. Xác ịđ nh trọng lượng khô Chỉ tiêu phân tích Lặp lại Hàm lượng Đơn vị 1 32,635 Trọng lượng khô 2 32,554 % 3 32,723
3. Xác định hàm lượng polyphenol của dịch chiết bã ổi đào Tên chỉ tiêu lặp lại Hàm lượng Đơn vị 1 38,421 Polyphenol 2 38,513 mg GAE/ g DW 3 38,461 4. Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết bã ổi đào Thể tích dịch Khả năng khử gốc tự do DPPH (%) Trung Bình chiết (µg) Lần 1 Lần 2 Lần 3 30 17,47 23,36 21,26 20,7 60 31,34 37,38 38,83 35,85 90 45,85 49,41 54,49 49,92 120 57,16 66,26 63,71 62,38 5. Kết quả xác định chỉ tiêu vi sinh vật tổng số trong quá trình bảo quản thức ăn chăn nuôi Tên chỉ tiêu Kết quả Mức tối đa Tổng số vsv hiếu khí 8,9.104 1.106 Nấm men, nấm mốc 6,7.103 1.105
6. Kết quả sự biến đổi chỉ số axit và chỉ số peroxyt của mẫu cám lợn có bổ sung dịch chiết polyphenol trong 30 ngày bảo quản Bảo quản trong dịch chiết Bảo quản điều kiện thường Ngày bảo polyphenol quản Chỉ số axit Chỉ số peroxyt Chỉ số axit Chỉ số peroxyt (mg KOH/g) (meq/kg) (mg KOH/g) (meq/kg) 0 3,08 7,13 3,08 7,13 5 4,12 7,41 4,06 7,28 10 5,34 8,03 5,12 7,35 15 6,89 8,59 6,11 7,48 20 7,16 9,12 6,29 7,78 25 7,97 9,87 6,48 8,32 30 8,21 10,05 6,51 8,85
7. Chỉ tiêu chất lượng thức ăn chăn nuôi Tên Tên chỉ Hàm lượng tối đa STT nguyên Phương pháp tiêu cho phép liệu TCVN Tính theo meq/kg Chỉ số 6121:2010 dầu, không lớn peroxyt (ISO hơn 40 3960:2007) 1 Cám gạo Tính theo các loại mgKOH để ISO Chỉ số axit trung hòa 7305:1998 100g bột, không quá 60. TCVN Cám mì Tính theo meq/kg Chỉ số 6127:2010 2 (dạng dầu, không lớn peroxyt (ISO viên, bột) hơn 40. 660:2009) Tính theo Bột mì mgKOH để loại dùng ISO 3 Chỉ số axit trung hòa trong 7305:1998 100g bột, chăn nuôi không quá 60. Dầu mỡ TCVN Tính theo meq/kg động vật Chỉ số 6121:2007 4 dầu, không lớn và thực peroxyt (ISO hơn 40. vật 03960:2001)