›

Đồ án Khảo sát tần số gen PIT-1 (Pituitary specific transcription factor 1) trên đàn gà Tàu vàng nuôi tại một Trung tâm Giống Vật nuôi

pdf 67 trang thiennha21 12/04/2022 4620
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát tần số gen PIT-1 (Pituitary specific transcription factor 1) trên đàn gà Tàu vàng nuôi tại một Trung tâm Giống Vật nuôi", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_khao_sat_tan_so_gen_pit_1_pituitary_specific_transcrip.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát tần số gen PIT-1 (Pituitary specific transcription factor 1) trên đàn gà Tàu vàng nuôi tại một Trung tâm Giống Vật nuôi

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐH KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT TẦN SỐ GENE PIT-1 (PITUITARY SPECIFIC TRANSCRIPTION FACTOR 1) TRÊN ĐÀN GÀ TÀU VÀNG NUÔI TẠI MỘT TRUNG TÂM GIỐNG VẬT NUÔI Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Th.S LÊ THỊ THU HÀ Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ THÙY TIÊN MSSV: 0851110247 Lớp: 08DSH2 TP. Hồ Chí Minh, 8/2012
  2. Khoa: Môi trường & CNSH PHIẾU GIAO ĐỀ TÀI ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP (Phiếu này được dán ở trang đầu tiên của quyển báo cáo ĐATN) 1. Họ và tên sinh viên/ nhóm sinh viên được giao đề tài (sĩ số trong nhóm: 01): Họ và tên sinh viên: NGUYỄN THỊ THÙY TIÊN MSSV: 0851110247 Lớp: 08DSH2 Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC 2. Tên đề tài: Khảo sát tần số gen PIT-1 (Pituitary specific transcription factor 1) trên đàn gà Tàu vàng nuôi tại một Trung Tâm Giống Vật Nuôi. 3. Các dữ liệu ban đầu: Tài liệu tổng quan Các bài báo khoa học trong và ngoài nước 4. Các yêu cầu chủ yếu: Lấy mẫu máu gà Tàu vàng tại Trung Tâm Giống Vật Nuôi Tách chiết DNA các mẫu máu Xác định tần số gene PIT-1 bằng kỹ thuật PCR – RFLP 5. Kết quả tối thiểu phải có: Tách chiết được DNA trong mẫu máu Sản phẩm PCR có kết quả tốt Enzyme cắt giới hạn cho kết quả đặc hiệu và xác định được tần số gene PIT-1 trên đàn gà Tàu vàng Ngày giao đề tài: 02/04/2012 Ngày nộp báo cáo: 01/08/2012 TP. HCM, ngày . tháng . năm Chủ nhiệm ngành Giảng viên hướng dẫn chính (Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên) Giảng viên hướng dẫn phụ (Ký và ghi rõ họ tên) i
  3. CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc LỜI CAM ĐOAN Tôi tên là Nguyễn Thị Thùy Tiên, sinh viên trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ Tp.Hồ Chí Minh, Khoa Môi trường và Công nghệ Sinh học, lớp 08DSH2. Tôi xin cam đoan tất cả các số liệu trích dẫn trong đồ án này là trung thực được lấy từ quá trình nghiên cứu thực tế tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam. Tự tôi đã thực hiện tất cả các nội dung trong đồ án của mình mà không có sự sao chép đồ án nào khác dưới mọi hình thức. Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước hội đồng Khoa Môi trường và Công nghệ Sinh học, trước ban giám hiệu trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ Tp.Hồ Chí Minh về lời cam đoan của mình. Tp.Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 07 năm 2012 Người viết Nguyễn Thị Thùy Tiên ii
  4. LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành quá trình học đại học và được làm đồ án tốt nghiệp này, em xin gửi lời cám ơn chân thành đến quý thầy cô trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, đặc biệt là các thầy cô Khoa Môi trường và Công nghệ Sinh học đã nhiệt tình giảng dạy, truyền đạt những kiến thức quý báu về chuyên ngành cũng như về cuộc sống trong suốt thời gian em học tập tại trường. Em cũng gửi lời biết ơn sâu sắc đến Thạc sĩ Lê Thị Thu Hà và Thạc sĩ Phạm Minh Nhựt đã tạo điều kiện thuận lợi cho em được làm đồ án ở Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam và tận tình hướng dẫn nghiên cứu, giúp đỡ, động viên em trong suốt thời gian làm đồ án tại đây. Ngoài ra, em cũng gửi lời cám ơn đến trại gà giống nơi em xuống lấy mẫu, cùng các cô chú trên Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam và các anh chị ở Phòng thí nghiệm (anh Nam, chị Hiền ) đã hướng dẫn, chỉ bảo và tạo điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành tốt đồ án này. Không kém phần quan trọng, em xin gửi lời biết ơn đến gia đình những người đã luôn chăm sóc động viên và là chỗ dựa vững chắc về tinh thần giúp em vượt qua khó khăn. Và lời cám ơn đến tất cả những người bạn – tập thể lớp 08DSH2 đã giúp đỡ tôi trong suốt 4 năm học tập tại trường. Cuối cùng, em xin cám ơn thầy cô Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã dành thời gian đọc và phản biện đề tài. Xin chân thành cám ơn! Tp.Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2012 iii
  5. MỤC LỤC PHIẾU GIAO ĐỀ TÀI ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP i LỜI CAM ĐOAN ii LỜI CÁM ƠN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ix MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tìm hiểu chung về gà 5 1.1.1 Sơ lược về nguồn gốc của gà 5 1.1.2 Tình hình chăn nuôi gà tại Việt Nam 6 1.1.3 Một số giống gà địa phương 7 1.1.3.1 Gà Ri 7 1.1.3.2 Gà Đông Tảo 7 1.1.3.3 Gà Hồ 8 1.1.3.4 Gà Mía 8 1.1.3.5 Gà Ác 8 1.1.3.6 Gà Tre 8 1.1.3.7 Gà Nòi 9 1.1.3.8 Gà Tàu vàng 9 1.2 Gà Tàu vàng và các nghiên cứu trên gà Tàu vàng tại Việt Nam 11 1.2.1 Tìm hiểu chung về gà Tàu vàng 11 1.2.2 Các nghiên cứu trên gà Tàu vàng tại Việt Nam 12 1.3 Các nghiên cứu gene PIT-1 trên gà 13 1.4 Giới thiệu về DNA 15 1.4.1 Cấu trúc DNA 15 1.4.2 Phương pháp tách chiết DNA 16 iv
  6. 1.4.3 Định tính DNA bằng phương pháp điện di 17 1.5 Phương pháp PCR 17 1.5.1 Nguyên tắc 17 1.5.2 Phản ứng PCR 18 1.5.3 Các yếu tố tham gia ảnh hưởng đến phản ứng PCR 20 1.5.3.1 Taq polymerase 20 1.5.3.2 Mồi 20 1.5.3.3 Các nucleotide 21 1.5.3.4 Dung dịch đệm 21 1.5.3.5 DNA mẫu 22 1.5.3.6 Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR 22 1.5.3.7 Nhiệt độ và pH 23 1.5.3.8 Ứng dụng của kỹ thuật PCR 23 1.6 Giới thiệu về kỹ thuật RFLP và kỹ thuật PCR-RFLP 24 1.6.1 Kỹ thuật RFLP 24 1.6.2 Kỹ thuật PCR – RFLP 26 1.7 Enzyme cắt giới hạn 26 CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm 30 2.2 Nội dung nghiên cứu 30 2.3 Vật liệu, hóa chất và dụng cụ 30 2.3.1 Vật liệu 30 2.3.2 Hóa chất 30 2.3.2.1 Hóa chất dùng trong ly trích DNA 30 2.3.2.2 Hóa chất dùng trong phản ứng khuếch đại DNA 31 2.3.2.3 Hóa chất dùng trong phương pháp điện di 31 2.3.3 Dụng cụ 31 2.4 Phương pháp nghiên cứu 32 2.4.1 Thu thập mẫu 32 v
  7. 2.4.2 Tách chiết DNA 33 2.4.3 Định tính DNA bằng phương pháp điện di 35 2.4.4 Ứng dụng phương pháp PCR – RFLP khảo sát đa hình gene PIT-1 37 2.3.4.1 Tiến hành phản ứng PCR 37 2.4.4.2 Kiểm tra sản phẩm PCR 39 2.4.4.3 Tiến hành cắt sản phẩm PCR bằng enzyme cắt giới hạn 40 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thu thập và bảo quản mẫu 42 3.2 Hiệu quả tách chiết DNA 42 3.3 Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR 43 3.3.1 Kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.2 43 3.3.2 Kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.4 45 3.4 Cắt sản phẩm PCR bằng RE 46 3.4.1 Sản phẩm PCR gene PIT-1.2 được cắt bằng enzyme TaqI 46 3.4.2 Sản phẩm PCR gene PIT-1.4 được cắt bằng enzyme EcoRI 48 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận 53 4.2 Kiến nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 vi
  8. DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT bp: base pair cDNA: complementary Desoxyribose Nucleic Acid ctv: cộng tác viên DNA: Desoxyribose Nucleic Acid dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA: Ethylene Diamine Tetra acetic Acid GH: Growth Hormone GHF-1: Growth Hormone Facetor -1 MAS: Marker Assisted Selection MR: Maker mRNA: messenger Riconucleic Acid PCR: Polymerase Chain Reaction PIT-1: Pituitary specific transcription factor 1 PTN: Phòng Thí Nghiệm PRL: Prolactin QTL: Quantative Trait Locus RAPD: Random Amplified Polymorphic Desoxyribose Nucleic Acid RE: restriction enzyme RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism SDS: Sodium Sodecyl Sulphate SNP: Single nucleotide polymorphism SSR: Single Sequence Repeat TBE: Tris-Boric acid-EDTA Tm: melting temperature TSH- β: Thyroid Stimulating Hormone - β UV: Ultraviolet vii
  9. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần bộ Kit EZ-10 Spin Column Genomic DNA Minipreps 30 Bảng 2.2: Trình tự đoạn mồi PIT-1.2 và PIT-1.4 37 Bảng 2.3: Thành phần hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR 38 Bảng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 38 Bảng 2.5: Thành phần hóa chất trong phản ứng cắt bằng RE 40 Bảng 3.1: Tỷ lệ tách chiết DNA tổng số 43 Bảng 3.2: Tỷ lệ kiểu gene và tần số gene PIT-1.2 47 Bảng 3.3: Tỷ lệ kiểu gene và tần số gene PIT-1.4 50 Bảng 3.4: Tổng hợp kiểu gene và tần số gene PIT-1 51 viii
  10. DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Một số giống gà địa phương được nuôi ở Việt Nam 10 Hình 1.2: Gà Tàu vàng 11 Hình 1.3: Quy trình khuếch đại DNA 19 Hình 1.4: Nguyên tắc của kỹ thuật RFLP 25 Hình 2.1: Mẫu máu gà Tàu vàng sau khi lấy về PTN 33 Hình 2.2: Bộ kit EZ-10 Spin Column Genomic DNA Minipreps 34 Hình 2.3: Bộ điện di 36 Hình 2.4: Máy chạy PCR 39 Hình 3.1: Kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số 42 Hình 3.2: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.2 44 Hình 3.3: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.4 45 Hình 3.4: Kết quả kiểm tra sản phẩm cắt bằng enzyme TaqI 46 Hình 3.5: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ kiểu gene của gene PIT-1.2 47 Hình 3.6: Kết quả kiểm tra sản phẩm cắt bằng enzyme EcoRI 49 Hình 3.7: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ kiểu gene của gene PIT-1.4 50 ix
  11. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Trong vài chục năm trở lại đây, ngành chăn nuôi gia cầm trên thế giới đã đạt được nhiều thành tựu to lớn. Sản phẩm trứng và thịt gia cầm không ngừng tăng lên. Có được thành tựu đó là do việc ứng dụng các tiến bộ kỹ thuật về di truyền giống, dinh dưỡng, công nghệ sinh học, các thành tựu về cơ giới hóa, điện khí hóa trong chăn nuôi gia cầm nhất là chăn nuôi gia cầm công nghiệp. Mặt khác, xuất phát từ việc hiểu biết sâu sắc và khai thác triệt để các đặc điểm sinh học vốn có của gia cầm đã đưa lại hiệu quả cao trong chăn nuôi. Trong ngành nông nghiệp nước ta, chăn nuôi gà chiếm 72 – 73 % tổng đàn gia cầm hàng năm. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã xây dựng chiến lược phát triển chăn nuôi gia cầm Việt Nam giai đoạn 2006 – 2015. Theo đó, ngành chăn nuôi phải phấn đấu đến năm 2015 tăng tỷ trọng thịt gia cầm lên 32 % tổng sản lượng thịt các loại, trong đó sản lượng thịt gà phải đạt 88 % tổng đàn gia cầm – đạt 350 triệu con, khối lượng thịt 1.992.000 tấn, sản lượng trứng 9.236 tỷ quả. (Trích dẫn: Tình hình chăn nuôi gà giai đoạn 2001 – 2005 và phương hướng phát triển giai đoạn 2006 – 2015. Cục chăn nuôi) Hiện nay chăn nuôi gà Tàu vàng để lấy thịt và trứng là một nghề rất phổ biến và được phân bố nhiều ở các tỉnh thành trong cả nước. Do chất lượng thịt thơm ngon, gà có sức sống tốt, khả năng thích nghi cao, chống chịu bệnh tốt. Công tác giống đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao hiệu quả của ngành chăn nuôi, chính vì vậy chọn lọc và lai tạo các giống vật nuôi luôn được các nhà khoa học quan tâm. Ngày nay với sự phát triển của các kỹ thuật hiện đại trong sinh học, đã hình thành xu hướng nghiên cứu chọn lọc giống vật nuôi dựa vào các chỉ thị DNA. Chọn lọc giống vật nuôi dựa vào các chỉ thị DNA, sẽ rút ngắn thời gian, tăng khả năng chính xác và hiệu quả hơn đối với các tính trạng kinh tế ở vật nuôi. Việc kiểm soát di truyền của tính trạng sẽ giúp cải thiện năng suất và sinh lý ở gà (Li và ctv, 1990).  1 
  12. Đồ án tốt nghiệp Gene PIT-1 (Pituitary specific transcription factor 1) – yếu tố phiên mã đặc hiệu ở tuyến yên là một gene trong họ gene mã hoá cho các protein đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của cơ thể. PIT-1 đóng vai trò như một gene điều hòa các hormone sinh trưởng như GH, prolactin và gene hormone tuyến giáp TSH-β. Do vậy, PIT-1 đã được khuyến cáo như 1 gene ứng viên cho tính trạng sản xuất (Bodner và ctv, 1988; Li và ctv, 1990; Cohen và ctv, 1996; Miyai và ctv, 2005). Đa hình gene PIT -1 có liên quan đáng kể đến khả năng tăng trưởng cơ thể và những đặc điểm thành phần thân thịt ở gà. Hiện nay, với nhu cầu thực tế ngày càng cao về các sản phẩm thịt gà sạch thì việc làm sao để chọn lọc tạo giống gà Tàu vàng có năng suất cao, cải thiện khả năng tăng trọng mà vẫn giữ được đặc điểm quý của gà Tàu vàng là vấn đề thực sự đáng quan tâm của các nhà khoa học. Một trong số giải pháp đó là việc khai thác các gene quy định năng suất tăng trọng và đưa ra hướng chọn lọc tạo giống gà thương phẩm có năng suất tốt là hết sức cấp bách hiện nay. Xuất phát từ thực tế trên, được sự cho phép của Khoa Môi trường và Công nghệ Sinh học, trường Đại học Khoa học Kỹ thuật Công nghệ Tp.Hồ Chí Minh với sự hướng dẫn trực tiếp của Th.S Lê Thị Thu Hà chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Khảo sát tần số gene PIT-1 (Pituitary specific transcription factor 1) trên đàn gà Tàu vàng nuôi tại một Trung Tâm Giống Vật Nuôi”. 2. Tình hình nghiên cứu  Các nghiên cứu về gà Tàu vàng: Nguyễn Văn Bắc và ctv (2005) đã nghiên cứu về khả năng sinh trưởng và sinh sản của gà Tàu vàng Việt Nam; Trần Văn Tịnh và ctv (2011) đã nghiên cứu chọn lọc và nhân thuần nâng cao năng suất gà Tàu vàng; nhóm tác giả Trần Xuân Hoàn và Phạm Doãn Lân (2000) đã nghiên cứu phân tích gene hormone sinh trưởng ở gà Ri bằng kỹ thuật PCR – RFLP. Trên đà gà Tàu vàng cho đến nay chưa thấy kết quả nghiên cứu nào dựa vào chỉ thị gene được công bố.  Các nghiên cứu về gene PIT-1 trên gà: kết quả của Nie và ctv (2008) cho rằng đa hình gene PIT-1 (MR1 – MR5) trong quần thể gà có tác động đến tính trạng  2 
  13. Đồ án tốt nghiệp tăng trưởng, thành phần thân thịt và không có tác động đến đặc điểm béo ở gà. Theo Rodbari và ctv (2011) cho thấy đa hình gene PIT-1 nhờ vào gene đánh dấu có ý nghĩa đáng kể với sự tăng trưởng cơ thể và thành phần thân thịt ở gà thương phẩm tại Iran. Jiang và ctv (2004) báo cáo rằng các đột biến A980T của cDNA gen PIT-1 ở gà tương quan đáng kể với khối lượng cơ thể ở 8 tuần. Nie và ctv (2005) đã phát hiện 23 SNP trong gen Pit-1 ở gà bằng kỹ thuật HPLC, có 3 trong khu vực 3' UTR có 16 ở trong vùng intron, và có 57 bp indel (đoạn khuyết/điểm gắn) trong intron 2. 57 bp indel trong intron 2 bị ảnh hưởng đáng kể bởi trọng lượng cơ thể, trọng lượng cơ ngực và trọng lượng cơ bắp chân ở gà 1 – 8 tuần tuổi (Qiu và ctv, 2006). Chưa có nghiên cứu chính thức nào về ảnh hưởng của gene PIT-1 trên gà Tàu vàng tại Việt Nam. 3. Mục đích nghiên cứu Xác định tần số gene PIT-1 trên đàn gà Tàu vàng nuôi tại một Trung Tâm Giống Vật Nuôi. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu Lấy mẫu máu gà Tàu vàng tại Trung Tâm Giống Vật Nuôi. Tách chiết DNA từ mẫu máu. Xác định tần số gene PIT-1 bằng kỹ thuật PCR – RFLP. 5. Phương pháp nghiên cứu Sử dụng bộ Kit EZ-10 Spin Column Genomic DNA Minipreps để tách chiết DNA. Xác định gene PIT-1 bằng phản ứng PCR với bộ Kit Green Master Mix, 2X. Xác định tần số gene bằng kỹ thuật PCR – RFLP (sử dụng RE). 6. Các kết quả đạt được của đề tài Tách chiết DNA khi sử dụng bộ Kit EZ-10 Spin Column cho kết quả thành công cao đạt 95,12 %.  3 
  14. Đồ án tốt nghiệp Phản ứng PCR khi sử dụng bộ Kit Green Master Mix, 2X với mồi PIT-1.2 (599 bp) và mồi PIT-1.4 (442 bp) cho kết quả thành công 100 %. Phản ứng cắt của gene PIT-1.2 với enzyme TaqI cho 3 kiểu gene: AA chiếm 12,5 %, kiểu gene BB chiếm 12,5 %, kiểu gene AB chiếm tỷ lệ cao nhất 75 %. Tần số gene A (0,5), tần số gene B (0,5). Phản ứng cắt của gene PIT-1.4 với enzyme EcoRI cho 3 kiểu gene: AA chiếm 30,77 %, kiểu gene BB chiếm 12,82 %, kiểu gene AB chiếm tỷ lệ cao nhất 56,41 %. Tần số gene A (0,6), tần số gene B (0,4). 7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp Chương I. Tổng quan tài liệu Chương II. Nội dung và phương pháp nghiên cứu Chương III. Kết quả và thảo luận Chương IV. Kết luận và kiến nghị  4 
  15. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tìm hiểu chung về gà 1.1.1 Sơ lược về nguồn gốc của gà Để có bằng chứng chính xác về tổ tiên sống hoang dã của gia cầm, các nhà khoa học đã nghiên cứu những dạng động vật hoang hiện nay còn đang sống có quan hệ họ hàng với chúng. Hầu hết các nhà nghiên cứu về gia cầm của thế giới đều cho rằng gà hoang miền Bắc Ấn Độ hay gà Banquiva (Gallus gallus murghi) một trong bốn loại hình của gà rừng là được thuần hóa đầu tiên. Nguồn gốc của gà rừng Bắc Ấn Độ phân bố từ thượng nguồn sông Ấn tới miền Nam Gođovani, từ Đông đến Đông Nam dãy núi Hymalaya. Gà Banquiva thường đẻ 10 – 12 trứng trong tổ bằng cỏ khô và lá cây. Sau 20 – 21 ngày ấp thì trứng nở. Lúc trưởng thành khối lượng cơ thể gà mái đạt 0,7 kg, gà trống đạt 1 – 1,1 kg. Gà trống có bộ lông sặc sỡ nhiều màu: lông cổ có màu vàng da cam đến vàng, lông thân màu đỏ nâu và lông cánh ánh đen, lông bụng pha lẫn màu đen. Gà mái có bộ lông từ vàng nhạt, vàng trắng đến hoa mơ. Màu sắc mỏ, chân cũng không đồng nhất: vàng đậm, vàng nhạt và đen. Sự thuần hóa đầu tiên của gà nhà vào thời kỳ đồ đồng. Vị trí của gà nhà trong hệ thống động vật được sắp xếp theo sự phát sinh và nguồn gốc của chúng (Lê Hồng Mận – Nguyễn Thanh Sơn, 2001). Gà nhà (Gallus gallus domesticus) là loài vật nuôi có từ hàng ngàn năm trước với bằng chứng khảo cổ học cho thấy gà đã tồn tại ở Trung Quốc cách đây 8.000 năm (FAO, 2004). Gà nuôi được thuần hóa từ gà rừng nhiệt đới thuộc Châu Á, trải qua quá trình thuần hóa, chọn lọc (tự nhiên và nhân tạo) đã hình thành nên các dòng, giống khác nhau theo hướng thịt, trứng và kiêm dụng. Trong hệ thống phân loại sinh giới, gà nhà có vị trí phân loại như sau: Giới: Ðộng vật (Animalia) Ngành: Ðộng vật có xương sống (Chordata) Lớp: Chim (Aves)  5 
  16. Đồ án tốt nghiệp Bộ: Gà (Galiformes) Họ: Trĩ (Phasianidae) Giống: Gallus Loài: Gallus gallus Phân loài: Gallus gallus domesticus 1.1.2 Tình hình chăn nuôi gà tại Việt Nam Theo số liệu thống kê, năm 2010 số lượng gia cầm đạt hơn 300 triệu con, sản lượng thịt đạt 615 nghìn tấn. Tổng sản phẩm chăn nuôi trong nước đạt 4.006 nghìn tấn thịt, 306 nghìn tấn sữa tươi và 5,87 tỷ quả trứng (Báo cáo Hội nghị phát triển Chăn Nuôi – Thú Y, 2011). Theo chủ trương của Nhà nước về phát triển chăn nuôi, trong đó chăn nuôi gia cầm nói chung phấn đấu tăng tỷ trọng thịt gia cầm lên 32 % trong năm 2015 so với tổng sản lượng thịt các loại (năm 2003 là 16 – 17 %), tăng sản lượng thịt gà nói riêng lên 88 % năm 2015 (năm 2010 là 82 %). Dự kiến giai đoạn 2011 – 2015, tốc độ tăng đàn là 8,5 % trên 1 năm, sản lượng thịt tăng 10,9 %. Đến năm 2015 số lượng gà dự kiến đạt 350 triệu con; sản lượng thịt đạt 1.992 nghìn tấn; sản lượng trứng 9.236 triệu quả. Để đạt được mục tiêu đó cần phải có những giải pháp thực hiện, một trong số các giải pháp là nhập nội các giống gà ngoại cùng với việc phát triển, bảo tồn các giống gà địa phương. Vật nuôi bản địa nói chung và gia cầm nói riêng ngày càng được quan tâm bởi khả năng thích nghi, chịu đựng được với khí hậu khắc nghiệt và chất lượng thịt thơm ngon. Ngoài ra, gà địa phương còn là nguồn nguyên liệu cho bảo tồn, đa dạng nguồn gene và là giống nền để lai tạo với gà cao sản cải thiện năng suất gà địa phương. Mặt khác, chất lượng thịt gà địa phương được nhiều người tiêu dùng ưa thích hơn thịt gà công nghiệp, đặc biệt là người Châu Á bởi thịt hơi dai, có mùi vị thơm ngon. Ngoài ra, hàm lượng chất béo thấp, protein cao, hàm lượng collagen tổng số của cơ đùi và cơ ngực cao (Wattanachant và ctv, 2004; Promwatee và Duangjinda, 2010). Nhược điểm của giống gà bản địa là khả năng sinh sản thấp, sinh trưởng chậm và chi phí thức ăn rất cao đã làm giảm hiệu quả kinh tế và từ đó  6 
  17. Đồ án tốt nghiệp cản trở đến việc phát triển chăn nuôi các giống gà bản địa ở quy mô trang trại. Điều này đồng nghĩa với việc thoái hóa và biến mất của nhiều nguồn gene gà bản địa quý hiếm đã được cảnh báo từ rất lâu. Cùng với sự tiến bộ của sinh học phân tử, phương pháp chọn lọc dựa trên chỉ thị phân tử hay chọn lọc giống dựa vào dấu chuẩn (MAS) hiện nay rất dễ dàng, kinh tế hơn và hiệu quả hơn cho các tính trạng tăng năng suất, tính trạng tăng chất lượng của vật nuôi nói chung và của gà nói riêng. Vì di truyền số lượng không thể phân tích được các kiểu gene đơn lẻ. Hay nói cách khác, gen đánh dấu liên kết với QTL (Quantative Trait Locus) – điều khiển nhiều đặc điểm kinh tế quan trọng như tăng trưởng, sản xuất trứng cho phép chọn lọc trực tiếp trên các kiểu gene (Lamont và ctv, 1996). Sử dụng kỹ thuật gene đánh dấu giúp cải thiện các đặc điểm sản xuất, chất lượng. Do đó việc kiểm soát di truyền các tính trạng quan trọng sẽ giúp cải thiện năng suất và sinh lý ở gà (Li và ctv, 1990). 1.1.3 Một số giống gà địa phương 1.1.3.1 Gà Ri Phân bố rộng trên toàn miền đất nước nhưng đã bị pha tạp nhiều. Gà mái lông có màu vàng, nâu, nâu nhạt, đen hoặc lốm đốm hoa mơ. Gà trống lông có màu tía hoặc vàng, có nơi pha lông đen như ở vùng Sơn Tây, Ninh Bình. Gà Ri đa số có mào đơn, da chân vàng, thịt vàng. Khối lượng 1 năm tuổi của con trống đạt 1,8 – 2,5 kg; con mái đạt 1,3 – 1,8 kg. Sản lượng trứng 90 – 110 quả/năm, khối lượng trứng trung bình 42 – 43 gam. Thịt và trứng của gà Ri thơm ngon, tỷ lệ lòng đỏ cao (33,8 %), gà có đặc tính nuôi con khéo nhưng tầm vóc nhỏ, trứng bé, sản lượng trứng thấp. 1.1.3.2 Gà Đông Tảo Gà này có xuất xứ từ thôn Đông Tảo, Khoái Châu, Hưng Yên. Gà mái lông có màu nâu bạc. Gà trống lông có màu tía. Đặc điểm: đầu to, mào nụ, mắt sâu, chân to xù xì có nhiều hàng vảy, xương to, nhiều thịt nhưng thịt không mịn, da đỏ, tiếng gáy đục và ngắn. Gà trống trưởng thành nặng 3,5 – 4 kg, gà mái trưởng thành nặng  7 
  18. Đồ án tốt nghiệp 2,5 – 3 kg. Sản lượng trứng đạt 55 – 60 quả/năm, khối lượng trứng trung bình 55 – 57 gam. Gà Đông Tảo có ưu điểm: tầm vóc lớn, khối lượng trứng to; nhược điểm: xương to, đẻ ít, mọc lông muộn. 1.1.3.3 Gà Hồ Gà có xuất xứ từ làng Hồ, Bắc Ninh. Gà mái lông có màu trắng sữa, màu vỏ nhãn hay màu đất thô. Gà trống lông có màu tía, đầu cổ to, da đỏ. Đặc điểm: chân hai hàng vảy, mào đơn. Gà trống trưởng thành nặng 3,5 – 4 kg, gà mái trưởng thành nặng 2,5 – 3 kg. Sản lượng trứng đạt 50 – 55 quả/năm, khối lượng trứng trung bình 55 – 58 gam. 1.1.3.4 Gà Mía Gà này có xuất xứ ở huyện Tùng Thiện, xã Phùng Hưng, Hà Tây. Gà mái lông có màu nâu xám hoặc vàng. Gà trống lông có màu tía. Đặc điểm: đầu to, mắt sâu, mào đơn, chân thô có 3 hàng vảy, da ở bụng có màu đỏ. Khối lượng gà trống trưởng thành đạt 3,5 – 4 kg, gà mái trưởng thành đạt 2,5 – 3 kg. Sản lượng trứng 50 – 55 quả/năm, khối lượng trứng trung bình 50 – 55 gam. 1.1.3.5 Gà Ác Gà Ác được nuôi nhiều ở các tỉnh miền Tây Nam Bộ như: Trà Vinh, Long An, Tiền Giang Đặc điểm: gà có lông màu trắng xù như bông, tầm vóc nhỏ bé, da, thịt, xương, mỏ, chân đều màu đen, mào có màu đỏ bầm, chân có hoặc không có lông và có 5 ngón nên còn được gọi là “ngũ trảo”. Sản lượng trứng đạt 70 – 80 quả/năm, khối lượng trứng trung bình 30 – 32 gam. Đây là loại gà thuốc, bổ dưỡng sức khỏe cho tất cả mọi người. Tỷ lệ sắt (Fe) trong thịt gà Ác cao hơn gà bình thường 45 %, tỷ lệ acid amin cao hơn 25 %. 1.1.3.6 Gà Tre Gà mái lông có màu xám xen lẫn màu trắng. Gà trống lông có màu vàng ở cổ và đuôi, phần còn lại màu đen, lông dài. Đặc điểm: tầm vóc nhỏ, thịt thơm ngon, đầu nhỏ, mào hạt đậu. Giai đoạn 6 tháng tuổi: gà trống nặng 0,8 – 0,85 kg; gà mái  8 
  19. Đồ án tốt nghiệp nặng 0,6 – 0,62 kg. Sản lượng trứng đạt 50 – 60 quả/năm, khối lượng trứng trung bình 21 – 22 gam. Ngoài công dụng cung cấp thịt và trứng thì gà Tre còn có thể làm cảnh và thi chọi. 1.1.3.7 Gà Nòi Gà Nói còn được gọi là gà Chọi. Số lượng gà này không nhiều, rải rác ở nhiều nơi, thường nuôi để thi chọi gà. Đặc điểm: gà có màu lông đen xám, pha lẫn màu vàng tươi, lông đuôi đen, đầu to, mỏ màu đen, mào hạt đậu, mắt đen có vòng đỏ, cổ dài và to, thân dài rộng, lưng ngang phẳng, chân cao có vảy đen xám, cựa sắc và dài. Giai đoạn 1 năm tuổi con trống nặng 2,5 – 3 kg, con mái nặng 1,8 – 1,9 kg. Sản lượng trứng đạt 50 – 60 quả/năm, khối lượng trứng trung bình 45 – 50 gam. 1.1.3.8 Gà Tàu vàng Phổ biến chủ yếu ở miền Nam, bị pha tạp nhiều. Đặc điểm: mào đơn hoặc hạt đậu, lông vàng, chân có lông ở bàn chân, có khi ở cả ngón chân. Gà trống trưởng thành nặng 3 kg, gà mái trưởng thành nặng 2 kg. Sản lượng trứng 70 – 90 quả/năm, khối lượng trứng trung bình 45 – 50 gam. (Trích dẫn: Hội chăn nuôi Việt Nam, 2002. Chăn nuôi gà thả vườn và gà Tây. Nhà xuất bản Nông Nghiệp).  9 
  20. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.1: Một số giống gà địa phương được nuôi ở Việt Nam. A: Gà Ri; B: Gà Đông Tảo; C: Gà Hồ; D: Gà Mía; E: Gà Ác; F: Gà Tre; G: Gà Nòi; H: Gà Tàu vàng (Nguồn: gioi#axzz21t2NH4Lj).  10 
  21. Đồ án tốt nghiệp 1.2 Gà Tàu vàng và các nghiên cứu trên gà Tàu vàng tại Việt Nam 1.2.1 Tìm hiểu chung về gà Tàu vàng Gà Tàu vàng có ngoại hình khá đẹp, lông màu vàng đến vàng rơm, vàng sẫm, cổ có cườm đen từ ít đến nhiều, có đốm đen ở cánh và đuôi. Chân màu vàng, da màu vàng và thịt màu trắng. Mào gà Tàu vàng phần lớn là mào đơn và một số ít con có mào nụ. Ngoài ra, một số con còn xuất hiện lông ở chân và ngón chân. Gà rất nhanh nhẹn và ưa thích tìm kiếm mồi trong vườn. Gà Tàu vàng có trọng lượng vừa phải thường vào giai đoạn 6 tuần tuổi gà trống có khối lượng 2 kg, gà mái có khối lượng 1,4 kg. Gà Tàu vàng có khả năng sinh sản kém, nếu nuôi tập trung và áp dụng kỹ thuật cai ấp thì tỷ lệ đẻ bình quân toàn đàn đạt 25 – 30 %. Nếu không áp dụng kỹ thuật cai ấp thì tỷ lệ đẻ bình quân toàn đàn nhiều khi đạt dưới 20 %. Đặc thù của giống gà Tàu vàng là đẻ sớm (khoảng 20 tuần tuổi), ham ấp và khéo nuôi con. Gà mái bắt đầu đẻ lúc 17 – 20 tuần tuổi, năng suất trứng đạt từ 90 – 120 quả. Trọng lượng trứng bình quân chỉ đạt 42 – 45 gam. Trong môi trường chăn thả và ấp tự nhiên thì tỷ lệ nở thành công đạt từ 90 – 95 %. Còn khi nuôi nhốt và ấp máy theo lối công nghiệp thì tỷ lệ nở thành công chỉ đạt 73 – 77 % (Át lát vật nuôi, 2004). Hình 1.2: Gà Tàu vàng (Nguồn: Gà Tàu vàng được nuôi nhiều ở các tỉnh miền Đông và Tây Nam Bộ như Bà Rịa Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dương, Tây Ninh, Long An, Tiền Giang số lượng gà được nuôi nhiều nhất phải kể đến Long An, Tiền Giang, còn tại Tp.Hồ Chí Minh  11 
  22. Đồ án tốt nghiệp gà được nuôi rải rác ở các huyện ngoại thành như Củ Chi, Hóc Môn. Gà Tàu vàng là một trong số những giống gia cầm được ưa chuộng nhất trong chăn nuôi hộ gia đình hay công nghiệp do chất lượng thịt thơm ngon, có sức sống tốt, khả năng thích nghi cao, chống chịu bệnh tật tốt hơn gà công nghiệp. Tuy nhiên năng suất của giống gà này tương đối thấp, khả năng tăng trưởng chậm. Trong những năm gần đây, nhiều giống gà mới (Tam Hoàng, Lương Phượng, Sasso ) đã được du nhập rất nhanh vào chăn nuôi gà thả vườn ở Nam Bộ. Tuy vậy giống gà Tàu vàng vẫn được nuôi giữ trong nhiều hộ dân, một phần là do đặc tính sinh học quý báu của giống gà này, một phần là do thị hiếu của người tiêu dùng ngày càng cao – người tiêu dùng rất ưa chuộng và chấp nhận mua giá cao hơn các loại gà địa phương khác. Gà Tàu vàng mái dầu thường có giá cao gấp hai lần gà Lương Phượng. Tập quán nuôi và bán gà mái dầu, gà trống thiến vẫn còn tồn tại ở các tỉnh Nam bộ. Có thể nói đây là đặc sản của vùng đất Nam bộ còn giữ được trong quá trình công nghiệp hoá hiện nay, những món ăn đặc sản không thể thiếu khi bảo tồn văn hoá của mỗi vùng đất (Đinh Công Tiến và Nguyễn Quốc Đạt, 2005). 1.2.2 Các nghiên cứu trên gà Tàu vàng tại Việt Nam Kết quả nghiên cứu của Lâm Minh Thuận và ctv (2003) cho thấy tỷ lệ đẻ từ 25 tuần tuổi đến 52 tuần tuổi là khá cao đạt 41 – 62 %; về khả năng sinh trưởng thì khối lượng con trống đạt từ 1,47 – 1,58 kg và con mái từ 1,17 – 1,33 kg lúc 12 tuần tuổi. Khảo sát khả năng sản xuất thịt gà tại Bà Rịa Vũng Tàu khối lượng con trống và con mái 12 tuần tuổi tương ứng là 1,95 – 2,04 kg và 1,49 – 1,6 kg, kết quả này khá cách biệt với chính kết quả của tác giả nêu trên. Theo tác giả thì sự khác biệt này là do quy mô nghiên cứu trên gà Tàu vàng nhỏ, kinh phí thấp chưa đáp ứng tốt cho chương trình giống. Trong nghiên cứu về gà Tàu vàng Nam Bộ của Nguyễn Văn Bắc và ctv (2005) cho thấy khả năng sinh sản của gà khi nuôi nhốt thì năng suất trứng ở 40 tuần tuổi đạt 73,25 trứng/mái, nuôi gà chăn thả trong hộ dân thì năng suất trứng năm đầu đạt 125 trứng/mái/năm, năm thứ 2 là 95 trứng/mái/năm. Gà Tàu vàng nuôi  12 
  23. Đồ án tốt nghiệp lấy thịt theo phương thức nuôi nhốt ở giai đoạn 16 tuần tuổi khối lượng con trống đạt 2 kg và khối lượng con mái đạt 1,4 kg, tỷ lệ sống sót của gà đạt 92,5 % và tiêu tốn 3,79 kg thức ăn/mái. Nếu nuôi theo quy trình giống thì ở giai đoạn 19 tuần tuổi khối lượng con trống đạt 1,94 kg, khối lượng con mái đạt 1,47 kg; tỷ lệ sống sót của gà đạt 91 % và tiêu tốn 10,07 kg thức ăn/mái. Kết quả nghiên cứu của Trần Văn Tịnh và ctv (2011), bước đầu đã chọn lọc và lai tạo ra được quần thể gà Tàu vàng khá đồng nhất (trên 80 % quần thể lúc 1 ngày tuổi có màu lông vàng). Kết quả vào 14 tuần tuổi con trống có khối lượng 2,1 kg, con mái có khối lượng 1,4 kg; tỷ lệ sống sót của gà đạt 95,56 % và tiêu tốn 3,66 – 3,95 kg thức ăn/mái. Năng suất trứng thế hệ xuất phát (gà giống) là 94 trứng/mái/năm, các thế hệ tiếp theo đạt 100 – 110 trứng/mái/năm tăng 6 – 17 %. Khối lượng trứng trung bình là 46 gam vào giai đoạn 40 tuần tuổi. Tuy nhiên, quần thể chọn lọc còn nhỏ, vẫn còn phân ly, chưa tạo được dòng trống, dòng mái riêng để khai thác tối đa tiềm năng giống (sinh trưởng, sinh sản). 1.3 Các nghiên cứu gene PIT-1 trên gà POU (Pit-Oct-UNC) là một loại yếu tố phiên mã vùng có chứa hai vùng được bảo tồn: một vùng đặc hiệu-POU và một vùng cân bằng-POU, yếu tố phiên mã đặc hiệu ở tuyến yên (PIT-1, hoặc GHF-1, hoặc POU1F1) đã được chứng minh để liên kết và mã hóa gene khởi động cho hormone tăng trưởng (GH), prolactin (PRL) và hormone kích thích tuyến giáp-β (TSH-β) (Bodner và ctv, 1988; Cohen và ctv, 1996; Miyai và ctv, 2005). Hoạt động sinh học khác của gene PIT-1 cũng đã được báo cáo, như điều hòa sự phát triển của thùy trước tuyến yên và tăng sinh tế bào tuyến yên, làm bất hoạt hoặc trì hoãn adrenarche (tuyến thượng thận) ở người, liên quan đến kiểu hình lùn ở chuột , cũng như gây ra sự khác biệt giữa các tế bào tiền thân gan và các tế bào sản xuất PRL (Li và ctv, 1990; Taha và ctv, 2005; Lee và ctv, 2005). Gene PIT-1 ban đầu kích hoạt dưới sự kiểm soát của Phophet (PROP- 1), gene PIT-1 tự động quy định trong mRNA của nó và hiện diện trong bất kỳ loại tế bào nào của tuyến yên, trong khi protein PIT-1 chủ yếu hiện diện trong  13 
  24. Đồ án tốt nghiệp lactotrophs, somatotrophs và thyrotrophs, nơi tiết PRL, GH và TSH-β (Simmos DM và ctv, 1990). Cho đến nay, cDNA PIT-1 đã được xác định trong một loạt các loài và các nghiên cứu trước đây cho thấy rằng gene PIT-1 bao gồm 6 exon trong động vật có vú và 7 exon trong các loài chim và các loài cá, xem như là sự khác biệt trong chiều dài tiền thân. cDNA của gene PIT-1 trên gà lần đầu tiên được phân lập và giải trình tự bởi Tanaka và ctv (1999) và ba đồng dạng là PIT-1, PIT-1β và PIT-1ω được gây ra bởi thay thế ghép nối cũng đã được phân lập và được tìm thấy bao gồm 335, 363, và 327 acid amin tương ứng (Van và ctv, 2000). Thay thế ghép nối gene PIT-1 đã được báo cáo ở các loài khác.Theo trình tự hệ gene gà phát hành tháng 5 năm 2006 (http:/ /mgc.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway), gene PIT-1 gà nằm ở nhiễm sắc thể số 1 (GGA1) và kéo dài hơn 14 kb (Nie và ctv, 2008). Một vài nghiên cứu gene PIT-1 trên gà: . Kết quả nghiên cứu của Zahra Rodbari và ctv (2011) cho biết: các kiểu gene và tần số gene ở locus gene PIT-1 cắt bằng enzyme TaqI cho kết quả kiểu gene AA (0,61); kiểu gene AB (0,32); kiểu gene BB (0,07). Tần số gene A (0,77), tần số gene B (0,23). Alen A xuất hiện thường xuyên hơn so với alen B và kiểu gene AA cũng xuất hiện nhiều hơn các kiểu gene khác trong quần thể. Kiểm tra Chi-square (P < 0,05) và được tính dựa theo định luật cân bằng Hardy-Weinberg. Kiểu gene ở locus gene PIT-1 cắt bằng enzyme TaqI có mối liên quan đáng kể với trọng lượng cơ thể, trọng lượng cơ ức, trọng lượng cánh (P 0,1). Không kiểu gene nào trong đa hình gene PIT-1 có liên quan đáng kể đến đặc điểm béo ở gà. . Kết quả nghiên cứu của Nie và ctv (2008) cho biết: 5 đa hình của gene PIT-1 trong quần thể gà có liên quan đến tốc độ tăng trưởng của gà. Cụ thể MR1 (nằm ở vùng intron 2 – kích thước 387 hoặc 330 bp) có liên quan đáng kể đến đường kính chân, trọng lượng trứng mới nở, chiều dài chân gà ở 84 ngày tuổi (P < 0,01); MR2 (nằm ở vùng intron 5 – kích thước 599 bp – được cắt bằng enzyme cắt TaqI) có liên quan đáng kể với trọng lượng cơ thể ở 42 ngày tuổi và tăng khối lượng trung bình hàng ngày ở giai đoạn 0 – 4 tuần tuổi (P < 0,05); MR3 (nằm ở  14 
  25. Đồ án tốt nghiệp vùng intron 5 – kích thước 599 bp – được cắt bằng enzyme cắt MspI) có liên quan đáng kể đến tăng khả năng tăng khối lượng trung bình hàng ngày ở giai đoạn 4 – 8 tuần tuổi (P < 0,05); MR4 (nằm ở vùng intron 5 – kích thước 442 bp – được cắt bởi enzyme EcoRI) có liên quan đến chiều dài chân, đường kính chân ở 77 ngày tuổi, trọng lượng cơ thể ở 84 ngày tuổi (P < 0,01); MR 5 (nằm ở vùng exon 6 – kích thước 483 bp – được cắt bằng enzyme cắt TasI) có liên quan đáng kể với trọng lượng cơ thể ở 35 ngày tuổi, đường kính chân ở 77 ngày tuổi và tăng khối lượng trung bình hàng ngày ở giai đoạn 0 – 4 tuần tuổi. Không có sự liên quan đáng kể của các SNP và kiểu gene với các tính trạng béo ở gà. 1.4 Giới thiệu về DNA (Desoxyribose Nucleic Acid) 1.4.1 Cấu trúc DNA DNA là polymer của những nucleotide và là vật chất mang thông tin di truyền của các hệ thống sống. Những nucleotide được nối với nhau bằng liên kết phosphate 5’ – 3’. Cầu nối phosphate này là cầu nối ester đồng hóa trị, còn gọi là cầu nối phosphodiester. Do những cầu nối phosphodiester, đại phân tử polynucleotide có cấu trúc phân cực tại vị trí 3’ – hydroxyl (3’ – OH) và 5’ – phosphate (5’ – P) ở đầu và cuối của bất cứ acid nucleic nào. Mỗi nucleotide gồm nhóm phosphate, đường desoxyribose và một trong bốn base (adenine, thymine, guanine và cytosine). Các base hữu cơ thuộc hai nhóm: các purine gồm adenine và guanine; các pyrimidine gồm thymine, cytosine và uracil. Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đơn, mỗi mạch đơn là một chuỗi nucleotide. Hai mạch đơn liên kết với nhau nhờ các liên kết hydro hình thành giữa các base bổ sung nằm trên hai mạch (A liên kết với T bằng hai liên kết hydro và G liên kết với C bằng ba liên kết hydro). Mỗi mạch đơn là một trình tự có định hướng với một đầu là đầu 5’ – phosphate tự do, đầu kia là đầu 3’ – hydroxyl tự do (hướng quy ước là 5’ – 3’). Hướng của hai mạch đơn trong chuỗi xoắn kép là ngược nhau, người ta gọi chúng là hai mạch đối song song.  15 
  26. Đồ án tốt nghiệp Cầu nối hydro dễ bị phá vỡ làm hai dây đơn của phân tử DNA tách rời nhau, tiến trình này gọi là sự biến tính (denaturation) và tiến trình ngược lại gọi là sự hồi tính (renaturation). Phương pháp thường được sử dụng để tách hai dây đơn của phân tử DNA là nhiệt độ hay các tác nhân hóa học (dung dịch kiềm, urê). Sau đó, nếu điều chỉnh nhiệt độ (hạ dần nhiệt độ) và nồng độ muối thích hợp, các sợi đơn có thể bắt cặp trở lại phân tử DNA ban đầu. Dây đơn DNA sẽ không hoàn nguyên một cách hoàn toàn nếu nhiệt độ giảm quá nhanh như trong trường hợp đặt mẫu DNA vào nước đá (trích dẫn Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). Tiến trình tách đôi phân tử DNA có thể được ghi nhận bằng nhiều phương pháp. Phương pháp đơn giản và hiệu quả nhất là xem xét sự thay đổi của mật độ quang (optical density). Những nucleotide hấp thụ tia cực tím với độ dài sóng tối đa 260 nm. Trong quá trình tách đôi dây, giá trị ở bước sóng 260 nm sẽ tăng nhiều trên dây đơn so với dây đôi. Người ta sẽ có đồ thị giữa nhiệt độ và sự hấp thụ quang phổ. Trong đó điểm giữa khoảng nhiệt độ trong quá trình tách đôi dây DNA được gọi là nhiệt độ nóng chảy (Tm: melting temperature). Hình dạng của đường biểu diễn giống nhau nhưng Tm thay đổi tùy theo thành phần base của DNA và một vài yếu tố khác nhau (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). 1.4.2 Phương pháp tách chiết DNA DNA được tách chiết từ mô và các cơ quan của động thực vật. Ở động vật DNA được tách từ da, cơ vân, mô mỡ và từ máu. Quy trình cơ bản này gồm 3 bước: . Bước 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân. Tiến hành nghiền mô, tế bào trong dung dịch SDS (sodium dodecyl sulphate) và proteinase (proteinase K). Hỗn hợp này sẽ phá hủy màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường, đồng thời phân hủy các protein liên kết DNA. . Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong dung dịch chứa DNA bằng hỗn hợp dung dịch phenol và chloroform kết hợp với phương pháp ly tâm.  16 
  27. Đồ án tốt nghiệp . Bước 3: Tủa dung dịch acid nucleic, thu nhận acid nucleic dạng cô đặc trong ethanol hoặc isopropanol. 1.4.3 Định tính DNA bằng phương pháp điện di Phương pháp điện di là phương pháp cho phép xác định kích thước của các đoạn DNA dựa vào đặc tính cấu trúc của các DNA. Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác dụng của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Tính di động của phân tử phụ thuộc vào khối lượng phân tử (số lượng nucleotide hay cặp nucleotide) và nồng độ chất cấu thành bản thạch (gel). Hai loại gel được sử dụng trong nghiên cứu DNA là polyacrylamide và agarose. Gel agarose là loại gel thông dụng nhất, do thao tác đơn giản. Agarose là một trong các dạng của polysaccharide. Agarose sẽ tạo thành hạt agarose sau khi tan ở nhiệt độ cao hoặc đun sôi vài phút. Khi nguội lại những hạt agarose sẽ kết tụ lại với nhau, giữa những hạt như vậy có những lỗ rất nhỏ. Tùy theo nồng độ của gel mà kích thước của các lỗ nhỏ này khác nhau. Khi thay đổi nồng độ agarose, kích thước lỗ giữa các hạt agarose cũng thay đổi. Nồng độ gel càng cao thì kích thước các lỗ càng nhỏ và ngược lại. Trong điện trường, DNA di chuyển từ cực âm sang cực dương vì DNA mang điện âm (do tính chất của gốc phosphate). Khi DNA di chuyển qua các lỗ của agarose, sự cọ xát giữa các hạt agarose và phân tử DNA tạo ra lực kháng làm ngăn cản sự chuyển dịch này của DNA. DNA có kích thước càng lớn thì lực trở kháng càng mạnh do đó sự di chuyển càng chậm và ngược lại. Các DNA cùng kích thước sẽ di chuyển về cùng vị trí và tạo thành các băng, các băng này có thể được quan sát sau khi nhuộm chúng trong ethidium bromide và đặt dưới tia tử ngoại (UV) (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). 1.5 Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) 1.5.1 Nguyên tắc PCR là phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase do Kary Mullis và ctv phát minh năm 1985. Đây là một kỹ thuật phân tử tạo dòng DNA rất đơn giản  17 
  28. Đồ án tốt nghiệp và hiệu quả. Thông qua PCR hàng triệu DNA đồng nhất được thu thập một cách dễ dàng từ một hỗn hợp các phân tử bao gồm RNA, protein, polysaccharide, DNA không có chức năng di truyền và DNA có chức năng di truyền. Tất cả các DNA polymerase khi tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR đã được hình thành dựa vào đặc tính đó của các DNA polymerase. Thật vậy, nếu cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định, ta phải có đủ thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt; các mồi này gồm một mồi xuôi (forward primer) và một mồi ngược (reverse primer). 1.5.2 Phản ứng PCR Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: . Giai đoạn biến tính (Denaturation): tách chuỗi DNA từ sợi đôi thành 2 sợi đơn. Nhiệt độ tăng lên 94 – 95 0C đế tách 2 sợi DNA ra. Bước này gọi là biến tính, vì nhiệt độ tăng sẽ phá vỡ cầu nối hydrogen của chuỗi DNA. Thời gian ở giai đoạn này khoảng 30 giây đến 1 phút. . Giai đoạn bắt cặp (Annealing): gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung. Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn. Nhiệt độ này dao động khoảng 40 – 60 0C và kéo dài 30 giây đến 1 phút. Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn 1 cách tùy tiện. . Giai đoạn kéo dài (Extension): tổng hợp chuỗi DNA mới giống chuỗi DNA gốc. Nhiệt độ được tăng lên khoảng 72 0C giúp cho DNA polymerase tác dụng, vốn polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc  18 
  29. Đồ án tốt nghiệp vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài 30 giây đến nhiều phút. Mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần và mỗi lần lặp lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân. Hình 1.3: Quy trình khuếch đại DNA (Nguồn:  19 
  30. Đồ án tốt nghiệp 1.5.3 Các yếu tố tham gia ảnh hưởng đến phản ứng PCR 1.5.3.1 Taq polymerase Taq polymerase là các DNA polymerase xúc tác sự tổng hợp DNA theo chiều 5’ – 3’. Phần lớn các DNA polymerase dùng một bản mẫu là DNA để làm khuôn cho sự tổng hợp. Các DNA polymerase để hoạt động cần một cặp mồi (primer). DNA polymerase được phân lập từ vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus, nó không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính. Taq polymerase cho phép chúng ta có thể tổng hợp dây DNA mới có tính chất lặp đi lặp lại nhiều lần. Taq polymerase có một mức tối hảo về nhiệt độ trong sinh tổng hợp DNA (70 – 72 0C). Ở khoảng nhiệt độ này, hoạt động đặc biệt của Taq polymerase có thể cao như 150 nucleotide/giây/enzyme. Do đó người ta phải cố gắng phát triển ở khoảng nhiệt độ 70 – 72 0C trong vòng một phút (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). Taq polymerase nhạy cảm với ion Mg++. Nồng độ tối hảo của Mg++ là 1,5 – 2,5 mM. Vì deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) có thể gắn với Mg++, cho nên nồng độ chính xác của Mg++ tùy thuộc vào nồng độ của dNTP. Các thành phần khác ít mẫn cảm với Taq polymerase là KCl và Tris. Nồng độ Taq polymerase cao sẽ hình thành nhiều sản phẩm giả. Nếu nồng độ Taq polymerase quá thấp dẫn đến không đủ số lượng enzyme xúc tác để tạo ra sản phẩm PCR (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). 1.5.3.2 Mồi (Primer) Chiều dài tối thiểu của mồi cho hầu hết các ứng dụng PCR là 18 nucleotide. Đối với việc khuếch đại các chuỗi có mức độ dị hợp cao thường sử dụng mồi có 28 – 35 nucleotide. Mồi khởi đầu cho quá trình tổng hợp mạch mới. Khi mồi bắt cặp vào mạch khuôn thì Taq polymerase bắt đầu kéo dài chuỗi DNA. Khái niệm quan trọng nhất của PCR là tối hảo giữa mồi và khuôn DNA. Nếu nồng độ mồi cao quá hiện tượng primer – dimer (vật giả primer) sẽ xuất hiện giống  20 
  31. Đồ án tốt nghiệp như trường hợp mẫu DNA loãng. Nếu tỉ lệ này quá nhỏ, kết quả sản phẩm PCR sẽ không nhiều, nồng độ primer có thể biến động khoảng 0,1 – 1 mM (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). Thông thường nồng độ mồi xuôi và mồi ngược phải bằng nhau. Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao. Việc chọn mồi là giai đoạn quan trọng quyết định của phương pháp PCR và phải tuân thủ một số nguyên tắc: . Trình tự của mồi được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “xuôi”, mồi “ngược” và cũng không có những cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ sung giữa các thành phần khác nhau của mồi. . “Nhiệt độ nóng chảy” Tm của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt quá xa. Thành phần nucleotide của các mồi cân bằng tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần. . Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gene. . Trình tự nằm giữa hai mồi mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1 kb. 1.5.3.3 Các nucleotide dNTP – deoxyribonucleotide triphosphate. Đây là hỗn hợp 4 loại nucleotide: dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp mạch mới. Nồng độ dNTP biến thiên khoảng 50 – 400 M. Thường người ta khuyến cáo mỗi loại được sử dụng là 200 M. Nồng độ nucleotide trong phản ứng PCR mất cân bằng sẽ làm cho phát sinh các lỗi sao chép của Taq polymerase. (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). 1.5.3.4 Dung dịch đệm Thành phần quan trong nhất trong dung dịch đệm là Mg++. Nó rất cần thiết cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase, làm tăng  21 
  32. Đồ án tốt nghiệp nhiệt độ nóng chảy của các DNA mạch kép. Nồng độ MgCl2 tối ưu là 1,5 mM, theo Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (1999), nồng độ Mg++ cho phép là 1 – 10 mM. ++ Có thể tối hảo nồng độ Mg bằng đường cong chuẩn độ từ 1 đến 9 mM MgCl2 (dẫn liệu của Trần Thị Dân, 2001). Nồng độ ion Mg++ cao ngăn cản sự biến tính hoàn toàn của sản phẩm trong mỗi chu kì. Ngược lại nếu nồng độ Mg++ quá thấp (< 0,5 mM), nó sẽ làm xấu đi quá trình kéo dài chuỗi, trong đó Mg++ đóng vai trò co-factor của Taq polymerase. Một vài ion Mg++ sẽ được kẹp giữ bởi dNTP trong phản ứng. Do đó, người ta cần phải xác định nồng độ tối ưu của Mg++ nhằm đảm bảo kết quả số lượng sản phẩm và sự chuyên tính của sản phẩm PCR. 1.5.3.5 DNA mẫu Phản ứng PCR tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch. Tuy nhiên có nhiều nghiên cứu cho thấy chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt trên DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào, các vết máu, mẫu khảo cổ Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có khuynh hướng giảm từ 1 g xuống khoảng 20 ng nhằm giảm khuếch đại “ký sinh” tạo các sản phẩm phụ không mong muốn (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). Tỷ lệ mồi/DNA template (DNA xét nghiệm) ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng PCR, nếu tỷ lệ này quá cao sẽ dẫn đến hiện tượng primer – dimer, còn nếu quá thấp sẽ có ít sản phẩm PCR (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). Vì vậy cần xác định hàm lượng DNA để việc bổ sung mồi cho phù hợp. 1.5.3.6 Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR Số lượng chu kỳ phản ứng PCR trong thực tế không vượt quá 40 chu kỳ. Sở dĩ như vậy là vì phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn, trong giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì những nguyên nhân sau: . Sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng. . Sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng.  22 
  33. Đồ án tốt nghiệp . Các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau. 1.5.3.7 Nhiệt độ và pH Những enzyme sử dụng trong phản ứng PCR rất mẫn cảm với nhiệt độ. Trong thao tác luôn giữ các chất đó trong đá lạnh và trả lại điều kiện bảo quản khi đã dùng xong. Theo Trần Thị Dân (2001), sự thay đổi nhiệt độ của phản ứng có thể ảnh hưởng mạnh đến năng suất và độ chuyên biệt của sản phẩm PCR. Để biến tính, 94 – 95 0C là khoảng nhiệt độ thường sử dụng vì nếu lớn hơn 95 0C thì Taq polymerase nhanh chóng mất hoạt lực. Để kéo dài chuỗi, thường dùng 72 0C vì nhiệt độ này gần với nhiệt độ tối hảo cho Taq polymerase hoạt động. Theo Bùi Chí Bửu, phức tạp nhất là nhiệt độ trong giai đoạn ủ bắt cặp, nhiệt độ này là yếu tố quyết định của phản ứng, khoảng nhiệt độ này được xác định tùy từng loại primer. Primer có trình tự càng nhiều G, C thì nhiệt độ bắt cặp càng cao. Tác giả cho rằng, nhiệt độ này khoảng 56 0C sẽ cung cấp những cơ hội tốt nhất để duy trì mức độ chuyên tính và hiệu quả cao. Nhiệt độ ủ có thể thay đổi lớn. Nếu nhiệt độ ủ quá thấp sự bắt cặp các primer không chuyên biệt có thể xảy ra và làm cho sản phẩm nhân lên quá mức. Nếu nhiệt độ ủ quá cao năng suất của sản phẩm mong muốn giảm nhiều. Hầu hết các enzyme, DNA mẫu được đệm trong môi trường tối ưu có pH = 8. Ở pH này DNA rất ổn định. Trong môi trường acid các bazơ purin rất dễ bị tách khỏi sợi DNA, cầu nối phosphodiester bị phá vỡ. Tuy nhiên theo chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR thì pH có thể thay đổi từ 6,8 – 7,8 (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). 1.5.3.8 Ứng dụng của kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, từ nghiên cứu khoa học đến sản xuất và đời sống xã hội. Những ứng dụng chính của kỹ thuật PCR là:  23 
  34. Đồ án tốt nghiệp . Xác định các đoạn trình tự cần nghiên cứu. . Phát hiện đột biến. . Nghiên cứu quá trình tiến hóa phân tử. . Phục hồi các gene đã tồn tại hàng triệu năm. . Chọn giống vật nuôi, cây trồng. . Lựa chọn các cặp cha mẹ thuần chủng trong thời gian ngắn. . Chuẩn đoán chính xác các bệnh nhiễm trùng từ vi khuẩn, nấm, virus . Chuẩn đoán sớm các bệnh gây ra do ung thư, các bệnh di truyền. . Xác định huyết thống, truy tìm dấu vết tội phạm. . Là kỹ thuật nền cho các kỹ thuật khác như RAPD, SSR 1.6 Giới thiệu về kỹ thuật RFLP và kỹ thuật PCR-RFLP 1.6.1 Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Đây là phương pháp so sánh DNA của các cá thể khác nhau sau khi cắt mẫu bằng một enzyme giới hạn (restriction endonuclease) nhằm tìm hiểu xem có hay không đột biến điểm (làm mất hay xuất hiện một vị trí giới hạn mới) hoặc có hay không sự thay đổi một trình tự DNA. Trường hợp trình tự DNA của hai cá thể cùng loài hoàn toàn giống nhau về số lượng và kích thước thì sẽ có sự giống nhau về các băng DNA. Ngược lại, nếu có xuất hiện đột biến điểm hoặc thay đổi một trình tự đoạn DNA trên sợi DNA thì sẽ có sự khác nhau về các băng DNA. Các bước để tiến hành kỹ thuật RFLP: . Tiến hành phân lập DNA của sinh vật mong muốn kiểm tra sự đa hình của DNA. . Xác định enzyme cắt phù hợp nhất với genome của sinh vật kiểm tra. . Tiến hành phân cắt mẫu DNA thu được với enzyme cắt. . Chạy điện di sản phẩm cắt trên gel agarose hoặc polyarylamid.  24 
  35. Đồ án tốt nghiệp . Tiến hành lai Southern blot với mẫu dò thích hợp. . Xác định kích thước của các đoạn đa hình trên phim sau khi thực hiện Southern blot và đưa ra kết luận. Quá trình phân tích RFLP trên nhiễm sắc thể gặp rất nhiều khó khăn. Việc xử lý enzyme giới hạn của DNA này sẽ tạo ra hàng triệu mảnh DNA có kích thước rất khó phân biệt. Nếu chạy điện di trên gel agarose và nhuộm bằng ethium bromide thì không dễ gì phát hiện ra được sự khác biệt giữa chúng. Kết quả ta nhận được hình ảnh là một dãy liên tục gồm nhiều vệt đậm. Do đó việc thiết kế probe (mẫu dò) để xác định đa hình trong kỹ thuật Sonthern blot là vô cùng quan trọng (Nguyễn Tuấn Kiệt, 2009). Hình 1.4: Nguyên tắc của kỹ thuật RFLP (Nguồn: Nguyễn Tuất Kiệt, 2009) Ưu điểm khi dùng RFLP: . Thích hợp cho phân tích đa dạng di truyền đối với DNA có kích thước nhỏ. . Chi phí áp dụng thấp. . Kỹ thuật này rất có ý nghĩa trong nghiên cứu dịch tễ học. Nhược điểm khi dùng RFLP: . Dùng một lượng mẫu DNA lớn.  25 
  36. Đồ án tốt nghiệp . Môi trường đệm đặc biệt quan trọng đối với hiệu quả hoạt động của enzyme cắt khi phối hợp giữa các enzyme cắt với nhau. . Độ chính xác không cao, kết quả không ổn định. Ứng dụng: . Đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể. . Phân tích tương quan di truyền giữa các cá thể. . Lập bản đồ di truyền phục vụ công tác chọn giống. 1.6.2 Kỹ thuật PCR – RFLP (polymerase chain reaction – restriction fragment length polymorphism) Nhằm khắc phục hiện tượng tạo ra quá nhiều băng DNA khi phân cắt genome bằng một enzyme giới hạn và phải thiết kế probe thích hợp trong việc phân tích sự đa hình DNA của kỹ thuật RFLP người ta đưa ra kỹ thuật PCR – RFLP. PCR – RFLP là kỹ thuật dựa trên cơ sở khuếch đại có chọn lọc một đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR trước. Sau đó tiến hành phân cắt đoạn DNA này bằng một enyme thích hợp. Sự khác nhau của các băng DNA sau khi chạy điện di và nhuộm ethium bromide cho ta biết được sự đa hình của đoạn DNA (Nguyễn Tuấn Kiệt, 2009). Như vậy quá trình thực hiện kỹ thuật PCR – RFLP gồm các giai đoạn sau: . Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi thích hợp để phân lập đoạn DNA cần phân tích sự đa hình. . Tiến hành phân cắt đoạn DNA này với một enzyme cắt thích hợp. . Chạy điện di xác định sự khác nhau của các băng DNA và đưa ra kết luận. 1.7 Enzyme cắt giới hạn (RE – restriction enzyme) Hiện tượng giới hạn và enzyme giới hạn do Hamilton phát hiện đầu tiên (1970) ở vi khuẩn Haemophilus influenzae, chủng Rd đặt tên là Hind II (Khuất Hữu Thanh, 2003). Enzyme giới hạn (Restriction enzyme – RE) thuộc nhóm enzyme edonuclease, có khả năng cắt những phân tử DNA sợi kép tại những điểm rất chính xác. Mỗi RE nhận biết và cắt đặc hiệu một đoạn DNA theo trình tự giới hạn (vị trí  26 
  37. Đồ án tốt nghiệp giới hạn) 4 hoặc 6 cặp base. Đặc trưng quan trọng nhất của các trình tự giới hạn là chúng có cấu trúc polindromic, nghĩa là hai mạch của trình tự hoàn toàn giống nhau khi chúng được đọc theo chiều 5’ – 3’. Như vậy cắt giống nhau trên hai mạch khuôn. Dựa vào khả năng nhận biết và cắt trình tự giới hạn, người ta chia enzyme giới hạn làm 3 loại: . Loại thứ nhất gồm các enzyme giới hạn nhận biết trình tự giới hạn di chuyển dọc theo DNA, đến cách vị trí giới hạn khoảng 1.000 – 5.000 nucleotide cắt tại đó và giải phóng vài chục nucleotide . Loại thứ hai gồm các enzyme giới hạn nhận biết vị trí giới hạn cắt ngay tại đó. Loại này được sử dụng nhiều trong kỹ thuật gene và công nghệ DNA tái tổ hợp . Loại thứ ba gồm các enzyme giới hạn nhận biết vị trí giới hạn và cắt ở vị trí cách đó khoảng 20 nucleotide về phía trước. Từ khả năng cắt của các RE nên chúng ta chỉ quan tâm đến các RE loại thứ hai vì đó là nhóm duy nhất được sử dụng trong các thao tác sinh học phân tử. Mỗi RE nhận biết một trình tự nucleotide đặc trưng. Các trình tự này thường bao gồm 4 – 8 nucleotide (thường là 4 hay 6). Các RE khác nhau có cùng một trình tự nhận biết gọi là các đồng phân. Đối với một số RE, trình tự nhận biết không có tính chuyên biệt tuyệt đối – một số nucleotide của trình tự có thể được thay thế bởi nucleotide khác. Mỗi RE hoạt động tối ưu trong những điều kiện phản ứng xác định, nhất là về mặt dung dịch đệm. Tốt nhất ta nên tuân thủ đúng các khuyến cáo của hãng sản xuất. Các dung dịch đệm dùng cho phản ứng RE thường cơ bản khác nhau ở nồng độ NaCl. RE sẽ giữ hoạt tính trong một dung dịch đệm chứa 50 % glycerol nếu luôn luôn được bảo quản ở -20 0C. Khi tiến hành phản ứng thủy giải, chỉ lấy RE ra vào phút chót sau khi đã cho đủ các thành phần khác và giữ trong đá trong thời gian càng ngắn càng tốt trước khi cất trở lại vào -20 0C.  27 
  38. Đồ án tốt nghiệp Nên tiến hành phản ứng trong một thể tích càng nhỏ càng tốt để tạo thuận lợi cho sự tiếp xúc enzyme – cơ chất. Tuy nhiên, phải đảm bảo thể tích RE không vượt quá 1/10 thể tích phản ứng vì glycerol ức chế hoạt động enzyme. Enzyme giới hạn HhaI có vị trí cắt theo kiểu đầu so le: 5’ GCG C 3’ 3’ C GCG 5’ Enzyme giới hạn PvuII có vị trí cắt theo kiểu đầu thẳng: 5’ CAG CTG 3’ 3’ GTC GAC 5’ (Dấu mũi tên thẳng đứng chỉ vị trí cắt) Enzyme giới hạn cắt cả hai mạch DNA cùng một điểm tạo các đầu bằng (blunt ends), các đầu bằng bị cắt của phân tử DNA không có khả năng tự kết hợp lại với nhau. Ðể nối các đoạn DNA với nhau cần sử dụng enzym nối – DNA ligase hoặc các adaptor chuyên dụng cho mỗi loại enzyme. Enzyme giới hạn nhận biết và cắt phân tử DNA ở các vị trí lệch nhau giữa hai mạch đơn tạo nên các đầu so le (hay đầu dính – cohesive ends). Các đầu so le tạo ra sau khi cắt có thể tự nối lại với nhau mà không cần sự có mặt của enzyme nối DNA ligase (Khuất Hữu Thanh, 2003). Enzyme EcoRI và enzyme TaqI dùng trong đề tài nghiên cứu: . Enzyme EcoRI là RE đầu tiên được phát hiện ở Escherichia coli, chủng RY 13. Nó bao quanh các phân tử DNA ở điểm nó cần cắt (chuỗi GAATTC). Cắt giảm một sợi xoắn kép DNA tại một điểm và sợi thứ hai tại một điểm bổ sung khác (giữa base G và base A). Các phần tách ra đơn lẻ bị kẹt lại "đầu dính", mà cho phép các phần bổ sung kết hợp lại. Các phần mới tham gia được ổn định bởi DNA ligase. 5’ G AATTC 3’ 3’ CTTAA G 5’ . Enzyme TaqI là RE thứ nhất được tìm thấy ở vi khuẩn Thermus aquaticus YT-1. Nó bao quanh các phân tử DNA ở điểm nó cần cắt (chuỗi TCGA).  28 
  39. Đồ án tốt nghiệp Cắt giảm một sợi xoắn kép DNA tại một điểm và sợi thứ hai tại một điểm bổ sung khác (giữa base T và base C). Các phần tách ra đơn lẻ bị kẹt lại "đầu dính", mà cho phép các phần bổ sung kết hợp lại. Các phần mới tham gia được ổn định bởi DNA ligase. 5’ T CGA 3’ 3’ AGC T 5’  29 
  40. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm Thời gian thực hiện đề tài từ 01/03/2012 đến 30/06/2012 tại Phòng thí ngiệm Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam. 2.2 Nội dung nghiên cứu Thu thập mẫu máu gà Tàu vàng từ trại gà. Tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu. Thực hiện phản ứng PCR trên các mẫu với 2 cặp primer. Tiến hành phản ứng cắt bằng kỹ thuật PCR – RFLP với 2 RE. Xác định tần số gene của gene PIT-1. 2.3 Vật liệu, hóa chất và dụng cụ 2.3.1 Vật liệu Mẫu máu gà Tàu vàng lấy từ Trung Tâm Giống Vật Nuôi thuộc địa phận tỉnh Bình Dương, số lượng 41 mẫu. 2.3.2 Hóa chất 2.3.2.1 Hóa chất dùng trong ly trích DNA (sử dụng bộ Kit EZ-10 Spin Column Genomic DNA Minipreps, Blood) Bảng 2.1: Thành phần bộ Kit EZ-10 Spin Column Genomic DNA Minipreps EZ-10 Spin Column Genomic DNA Minipreps Thể tích Kit, Blood TBP Buffer 120 ml TBM Buffer 25 ml TE (pH 8,0) 15 ml Proteinase K 2 mg  30 
  41. Đồ án tốt nghiệp Wash Solution 12 ml Elution Buffer 5 ml EZ-10 Spin Column 2.0-ml Collection Tube 50 Protocol 1 2.3.2.2 Hóa chất dùng trong phản ứng khuếch đại DNA  GoTaq Green Master Mix (Promega)  F Primer  R Primer  Nuclease free water  DNA mẫu 2.3.2.3 Hóa chất dùng trong phương pháp điện di  Gel agarose (Bio Basic)  TBE 0,5 X (Bio Basic)  Loading dye (Promega)  Dung dịch ethidium bromide (Promega)  Ladder 100 bp (Fermentas)  SYBR 10.000X 2.3.3 Dụng cụ  Buồng thao tác (Nuaire)  Máy ly tâm lạnh (Hettich – Mikro 22 R)  Lò vi ba (SamSung)  Máy mini spin (Eppendorf)  Cân điện tử (Sartoriuos)  Máy ủ rung nhiệt (Eppendorf)  Máy Vortex-Genie 2  31 
  42. Đồ án tốt nghiệp  Máy PCR (Eppendorf)  Máy điện di (Biorad)  Tủ lạnh 40C (Alaska)  Tủ lạnh -200C (Fiocchetti)  Tủ lạnh -800C (Sanyo)  Máy chụp gel (UVP) 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Thu thập mẫu Các mẫu máu được lấy ngẫu nhiên trên đàn gà Tàu vàng được nuôi ở Trung Tâm Giống. Mẫu máu được lấy từ tĩnh mạch cánh gà vào buổi sáng trước lúc cho gà ăn. Chúng tôi lấy tất cả 100 mẫu và được chia làm 2 đợt, nhưng chỉ sử dụng 41 mẫu cho nghiên cứu này: . Đợt 1(04/2012): 17 mẫu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. (không có mẫu số 10) . Đợt 2 (06/2012): 24 mẫu A31, A32, A33, A35, A36, A37, A38, A39, A40, A41, A42, A43, A44, A45, A46, A47, A48, A49, A50, A51, A52, A53, A54, A55 (không có mẫu số A34) Cách thu thập và bảo quản mẫu: lấy khoảng 1 – 1,5 ml máu ở mỗi cá thể gà. Máu được cho vào ống nghiệm vô trùng có chứa sẵn Na2ETDA. Tất cả các mẫu máu được mang về PTN của Viện. Chia mẫu ra làm 3 phần tương đương nhau bảo quản ở -80 0C (lưu trữ trong thời gian dài) hoặc -200C (lưu trữ trong thời gian ngắn), khi dùng thì tiến hành rã đông và phân tích.  32 
  43. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.1: Mẫu máu gà Tàu vàng sau khi lấy về PTN 2.4.2 Tách chiết DNA Hiện nay có rất nhiều thuốc thử và bộ kit thương mại tiện lợi cho việc tách chiết DNA (QiaGen, Promega, Bio Basic ). Người sử dụng có thể lựa chọn bộ kit thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng bộ kit EZ-10 Spin Column Genomic DNA Minipreps của hãng Bio Basic. Bộ kit EZ-10 Spin Column Genomic DNA Minipreps mang đến một phương pháp nhanh chóng, đơn giản và hiệu quả tinh sạch DNA cao từ các nguồn khác nhau như vi khuẩn, động vật, thực vật và máu. DNA được chọn lọc và hấp thụ vào trong nền gel silica của EZ-10 Spin Column trong khi các thành phần khác và tạp chất được rửa sạch đi. Bộ gene DNA được tách ra khỏi cột và dễ dàng sử dụng trong bất kì ứng dụng nào bao gồm PCR, Southern blot Các phương pháp tinh sạch được sử dụng trong protocol không yêu cầu sử dụng thêm phenol, chloroform. Chuẩn bị hóa chất trước khi tách chiết DNA: TBM Buffer: có thể gây kết tủa trên mẫu. Tốt nhất nên hòa tan chất kết tủa bằng cách ủ ở 37 0C Proteinase K: trước khi sử dụng thêm 150 l nước cất vào tube chứa 2 mg Proteinase K tương ứng. Giữ ở -20 0C để lưu trữ  33 
  44. Đồ án tốt nghiệp Wash Solution: trước khi sử dụng thêm 48 ml ethanol tuyệt đối vào 12 ml Wash Solution. Ở những mức dung dịch rửa khác nhau đảm bảo tỉ lệ ethanol : Wash Solution là 4 : 1. Elution Buffer: là 2,0 mM Tris-HCl pH 8,0  8,5. Có thể sử dụng TE Buffer pH 8,0 hoặc nước nhưng năng suất thường thấp hơn 20 %. Hình 2.2: Bộ kit EZ-10 Spin Column Genomic DNA Minipreps Quy trình ly trích sử dụng bộ kit EZ-10 Spin Column Genomic DNA Minipreps, Blood gồm các bước sau: . Bước 1: Lấy 500 l tất cả mẫu máu cho vào tube ly tâm 1,5 ml. Thêm 800 l TBP Buffer vào tube. Lắc nhẹ trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. . Bước 2: Ly tâm 4.000 vòng/phút trong 3 phút. Loại bỏ dịch nổi, lấy cặn. . Bước 3: Tiếp tục lặp lại bước trên đến khi cặn có màu trắng hoặc tím hoa cà. Sau đó thêm vào 200 l TE Buffer. . Bước 4: Thêm 500 l TBM Buffer vào tube ly tâm. Vortex mạnh và sau đó thêm 3 l Proteinase K. Ủ ở 55 0C trong 30 phút. . Bước 5: Nếu chưa hòa tan thì ly tâm 5.000 vòng/phút trong 2 phút. Chuyển dịch lỏng bên trên vào tube ly tâm 1,5 ml khác, sau đó thêm 260 l ethanol tuyệt đối.  34 
  45. Đồ án tốt nghiệp . Bước 6: Cho hỗn hợp qua cột EZ-10 Spin Column được đựng trong tube 2 ml (kèm theo bộ kit). Đem ly tâm 10.000 vòng/phút trong 2 phút. Loại bỏ dịch phía dưới trong tube. . Bước 7: Thêm 500 l Wash Solution và ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút. . Bước 8: Lặp lại bước 7 . Bước 9: Bỏ dịch phía dưới tube. Ly tâm thêm 10.000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ toàn bộ Wash Solution còn dư. . Bước 10: Chuyển phần cột EZ-10 Spin Column bên trong qua một Eppendorf 1,5 ml. Thêm 80 l Elution Buffer vào trung tâm màng cột. Ủ tube 50 0C trong 2 phút. . Bước 11: Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút để tách DNA ra khỏi cột. . Bước 12: Giữ lạnh DNA ở -20 0C đến khi sử dụng. Lưu ý: Tách chiết DNA phụ thuộc vào việc phân giải hay hòa tan các mô và sự phân tách của DNA từ máu. Hầu hết các quy trình đều sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu chúng ta thao tác không cẩn thận. Do vậy nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này. 2.4.3 Định tính DNA bằng phương pháp điện di Do đặc điểm tích điện âm của nhóm phosphate trên DNA, dưới tác dụng của điện trường các đoạn DNA khác nhau sẽ di chuyển về phía cực dương với vận tốc khác nhau tùy thuộc vào cấu trúc và kích thước của chúng. Gel agarose khi nấu chảy rồi để đông lại sẽ hình thành cấu trúc mạng lưới, giúp ngăn cản dòng di chuyển của DNA trong điện trường, nhờ đó mà các DNA có độ dài khác nhau sẽ được phân tách rõ trên bản gel. Kết quả điện di sẽ được xem trực tiếp trên bản gel có nhuộm ethidium bromide dưới đèn cực tím; do ethidium bromide có khả năng gắn chèn giữa các base của DNA và phát huỳnh quang màu cam khi kích thích bằng tia UV.  35 
  46. Đồ án tốt nghiệp Cân 1 g agarose cho vào 100 ml dung dịch TBE 0,5 X, lắc nhẹ cho agarose phân tán đều. Đun sôi bằng lò vi ba cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Để nguội đến khoảng 60 0C. Đổ gel vào khay đã cài sẵn răng lược, chờ gel đông và ổn định. Sau khi gel đông lại thì rút răng lược ra và đặt khuôn gel vào bể điện di, đổ đệm TBE 0,5 X vào khay gel sao cho đệm cao hơn mặt gel khoảng 2 – 5 mm. Load mẫu vào các giếng với tỷ lệ 2 l loading dye và 8 l DNA mẫu, đậy nắp bản gel và cắm điện cực. Tiến hành điện di ở điều kiện 200 V, 400 mA, thời gian 30 phút. Sau khi kết thúc điện di, lấy bản gel ra khỏi khay và nhuộm gel bằng dung dịch ethidium bromide 10 g/ml trong 20 phút, lấy bản gel ra và rửa trong nước sạch. Sau đó đưa vào máy UVP đọc kết quả. Nếu mẫu có DNA thì băng DNA sẽ phát sáng dưới dạng vạch trên gel điện di. Độ tập trung và độ đậm nhạt của băng điện di phản ánh độ tinh sạch và nồng độ cao hay thấp của mẫu DNA. Hình 2.3: Bộ điện di  36 
  47. Đồ án tốt nghiệp 2.4.4 Ứng dụng phương pháp PCR – RFLP khảo sát đa hình gene PIT-1 2.3.4.1 Tiến hành phản ứng PCR Khảo sát sự khuếch đại DNA trên mẫu máu sau khi tách chiết với 2 primer PIT-1.2 và PIT-1.4. Trình tự cặp mồi được nêu ở Bảng 2.2. Bảng 2.2: Trình tự cặp mồi PIT-1.2 và PIT-1.4 (Nie và ctv, 2008). Mồi Trình tự đoạn mồi (xuôi và ngược) Kích thước F Primer: 5’ GGACCCTCTCTAACAGCTCTC 3’ PIT-1.2 599 bp R Primer: 5’ GGGAAGAATACAGGGAAAGG 3’ F primer: 5’ GGGGATTTTGCCACTTTAGGG 3’ PIT-1.4 442 bp R primer: 5’ TGGGTAAGGCTCTGGCACTGT 3’ Chuẩn bị mồi: . Mồi ở trạng thái đông phải được rã đông và ly tâm để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở. . Mồi được sử dụng ở nồng độ 5 mM: pha loãng mồi gốc (100 mM) bằng nước không có nuclease (2,5 l mồi gốc và 47,5 l nước). Tùy theo điều kiện trong phòng thí nghiệm mà chúng ta chọn lựa hỗn hợp Mix phản ứng cho phù hợp và sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Trong đề tài nghiên cứu này, phản ứng PCR được chúng tôi tiến hành dựa trên chu trình nhiệt và các thành phần hóa chất theo bộ kit GoTaq Green Master Mix 2X của Promega có thành phần 2X Green GoTaq Reaction Buffer (pH 8,5); 400 µM dATP; 400 µM dGTP; 400 µM dTTP; 400 µM dCTP; 3 mM MgCl2; Taq DNA polymerase và chất đệm tải mẫu (yellow dye và blue dye) nên khi chạy gel không cần thêm chất đệm tải mẫu (loading dye).  37 
  48. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.3: Thành phần hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR Thành phần Thể tích (l) sử dụng GoTaq Green Master Mix, 2X 10 F Primer 5 mM 1 R Primer 5mM 1 DNA mẫu 1 Nuclease free water 7  20 Ở đây chúng tôi tiến hành phản ứng PCR cho 16 mẫu đầu tiên có kết quả tách chiết DNA tốt với mồi PIT-1.2 và 39 mẫu với mồi PIT-1.4. Mix hỗn hợp phản ứng PCR sử dụng thể tích ở Bảng 2.3. Tiến hành đánh số theo thứ tự lên các Eppendorf 0,2 ml; mix hóa chất vào các Eppendorf sử dụng thể tích ở Bảng 2.3 theo đúng thứ tự và đoạn mồi cần thực hiện; sau đó đem ly tâm nhẹ để hỗn hợp lắng xuống đáy Eppendorf; tiến hành khuếch đại DNA theo chu trình nhiệt được trình bày ở Bảng 2.4 với a là nhiệt độ bắt cặp cho từng đoạn mồi. Bảng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Bước Nhiệt độ (0C) Thời gian (giây) 1 94 180 2 94 30 3 a 45 4 72 60 5 72 300 6 4 Từ bước 2 đến bước 4 lặp lại 35 lần  38 
  49. Đồ án tốt nghiệp Lưu ý: Mẫu và thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng PCR cần đặt trong khay đá trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng. Hình 2.4: Máy chạy PCR 2.4.4.2 Kiểm tra sản phẩm PCR Sau khi chạy PCR xong lấy mẫu ra và tiến hành kiểm tra sản phẩm PCR với từng đoạn mồi riêng biệt, xem kích thước đoạn gene có đúng như Nie và ctv (2008) đã công bố không. Cân 1,65 g agarose cho vào 110 ml dung dịch TBE 0,5 X, lắc nhẹ cho agarose phân tán đều. Đun sôi bằng lò vi ba cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Lấy ra cho vào 11 l SYBR – ít độc hại hơn ethidium bromide. Để nguội đến khoảng 600C. Đổ gel vào khay đã cài sẵn răng lược, chờ gel đông và ổn định. Sau khi gel đông lại thì rút răng lược ra và đặt khuôn gel vào bể điện di, đổ đệm TBE 0,5 X vào khay gel sao cho đệm cao hơn mặt gel khoảng 2 – 5 mm. Load mẫu PCR vào các giếng với 5 l cho mỗi giếng, để thang chuẩn (Ladder) 100 bp ở giữa các mẫu cho dễ quan sát. Đậy nắp bản gel và cắm điện cực  39 
  50. Đồ án tốt nghiệp Tiến hành điện di ở điều kiện 180 V, 400 mA, thời gian 60 phút. Sau khi điện di xong lấy bản gel ra khỏi khuôn và đưa vào máy UVP đọc kết quả. 2.4.4.3 Tiến hành cắt sản phẩm PCR bằng enzyme cắt giới hạn Dựa vào tính đặc hiệu của enzyme cắt giới hạn (Restriction enzyme – RE) là chúng chỉ cắt đúng trình tự nhận diện, nên chúng tôi sử dụng nó để phân biệt các vị trí đa hình trên gene hay trên một vùng trình tự xác định. Trong đề tài nghiên cứu này, phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn được thực hiện dựa trên việc khuếch đại trình tự một đoạn gene. Sau đó khi thực hiện phản ứng phân cắt và ủ qua đêm, chúng tôi tiến hành điện di trên gel agarose 1,5 % nhằm xác định đa hình kiểu gene PIT-1. Bảng 2.5: Thành phần hóa chất trong phản ứng cắt bằng RE Thành phần Thể tích (l) sử dụng H2O deion 9 Buffer 10X 1 Enzyme 0,5 PCR Product 5  15,5 Ủ 1 – 16 tiếng ở 650C với enzyme TaqI và 37 0C với enzyme EcoRI. Sau khi kiểm tra sản phẩm PCR với các mẫu cho kết quả tốt, chúng tôi tiến hành sử dụng enzyme cắt giới hạn TaqI và EcoRI để cắt các sản phẩm PCR thành công ứng với mồi PIT-1.2 và mồi PIT-1.4. Ở đây, chúng tôi sử dụng thành phần hóa chất ở Bảng 2.5 để tiến hành phản ứng cắt. Hóa chất sử dụng thích hợp cho cả 2 enzyme cắt giới hạn TaqI và EcoRI, trộn đều các thành phần phản ứng theo đúng thứ tự và theo đúng enzyme cắt, ly tâm bằng máy spin vài giây rồi ủ tại nhiệt độ hoạt động tối ưu của RE đó. Thời gian ủ từ 1 – 16 tiếng. Sản phẩm cắt sau đó được  40 
  51. Đồ án tốt nghiệp đem điện di trên gel agarose nồng độ 1,5 % để phân biệt đoạn bị cắt và không cắt (khả năng cắt đặc hiệu của RE), qua đó xác định đa hình kiểu gene và tần số gene PIT-1 mong muốn. Quy trình điện di giống như quy trình điện di kiểm tra sản phẩm PCR.  41 
  52. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thu thập và bảo quản mẫu Chúng tôi đã thu được 100 mẫu máu tại trại gà giống thuộc địa phận tỉnh Bình Dương, nhưng chỉ tiến hành nghiên cứu 41 mẫu. Các mẫu máu lấy về đều tốt, không bị đông. Hạn chế của việc lấy mẫu là đường đi hơi xa, phải đi vào lúc sáng sớm lúc gà chưa ăn. Mẫu máu không nên để lâu, cách bảo quản tốt nhất là chia ra và trữ ở -80 0C, khi lấy mẫu về thì nên dùng ngay trong 2 – 3 ngày. 3.2 Hiệu quả tách chiết DNA Các mẫu máu (1 – 41) thu từ trại gà giống sau khi được ly trích DNA theo protocol chuẩn Kit EZ-10 Spin Column Genomic DNA Minipreps thì được định tính bằng cách điện di trên gel agarose 1 % và được đọc bằng máy UVP để kiểm tra kết quả điện di. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 Hình 3.1: Kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số  42 
  53. Đồ án tốt nghiệp Dựa vào kết quả ở Hình 3.1 chúng tôi nhận thấy chất lượng DNA thu được khá tốt, không bị đứt gãy. Việc sử dụng bộ Kit EZ-10 Spin Column Genomic DNA Minipreps cho DNA tổng số từ các mẫu khá ổn định. Trong đó, giếng số 5 và 33 không thấy có sự hiện diện của DNA. Điều này có thể do quá trình lấy mẫu máu bị đông một phần nên không ly trích được DNA, do thao tác kỹ thuật khi ly trích DNA. Tỷ lệ tách chiết DNA tổng số: được nêu trong Bảng 3.1 Bảng 3.1: Tỷ lệ tách chiết DNA tổng số Số mẫu Tỷ lệ (%) Sự hiện diện DNA tổng số 39 95,12 Không có sự hiện diện của DNA tổng số 2 4,88 Dựa vào kết quả trong Bảng 3.1 chúng thôi nhận thấy có 39 trong tổng số 41 mẫu có sự hiện diện của DNA tổng số chiếm tỉ lệ 95,12 %, chỉ có 2 mẫu không có DNA tổng số nằm ở giếng số 5 và 33. Qua đó chúng tôi nhận thấy chất lượng DNA ly trích được là khá cao, có thể dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử, khuếch đại DNA. 3.3 Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR 3.3.1 Kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.2 Để tiến hành kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.2, chúng tôi chỉ thực hiện trên 16 mẫu đầu tiên có kết quả tách chiết DNA thành công (trừ mẫu số 5) sử dụng thể tích ở Bảng 2.3. Các mẫu được chọn có hàm lượng ly trích DNA cao, độ tinh sạch tương đối chuẩn, phù hợp với yêu cầu của phản ứng PCR. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR được thực hiện trên gel agarose 1,5 % cùng với thang chuẩn nồng độ để xác định được kích thước sản phẩm PCR. Tiến hành đọc bản gel trên máy UVP.  43 
  54. Đồ án tốt nghiệp LD ĐC 1 2 3 4 5 6 7 8 100 (-) 599 bp 500 bp LD 9 10 11 12 13 14 15 16 100 Hình 3.2: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.2. Giếng 1 – 16: sản phẩm PCR với mồi PIT-1.2 kích thước 599 bp; LD 100: Ladder 100 bp; ĐC (-): Đối chứng âm Với kết quả điện di Hình 3.2 chúng tôi nhận thấy được các băng sáng rất rõ thể hiện quy trình PCR khá tốt, phát hiện được 100 % sự hiện diện của gene PIT-1.2 với kích thước sản phẩm PCR là 599 bp. Kết luận thành phần phản ứng và chu trình nhiệt sử dụng cho đoạn mồi PIT-1.2 là thích hợp. Như vậy 16 sản phẩm PCR của gene PIT-1 với mồi PIT-1.2 có thể dùng để tiến hành phản ứng cắt với enzyme cắt giới hạn TaqI. Tuy nhiên, ladder 100 bp vẫn còn chưa phân tách rõ, có thể là do thao tác khi load mẫu và điện di. Đối chứng âm được sử dụng để so sánh các mẫu không cho sản phẩm PCR.  44 
  55. Đồ án tốt nghiệp 3.3.2 Kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.4 Để tiến hành kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.4, chúng tôi chỉ thực hiện trên 39 mẫu có kết quả tách chiết DNA thành công (trừ mẫu số 5 và số 33) sử dụng thể tích ở Bảng 2.3. Các mẫu được chọn có hàm lượng ly trích DNA cao, độ tinh sạch tương đối chuẩn, phù hợp với yêu cầu của phản ứng PCR. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR được thực hiện trên gel agarose 1,5 % và được đọc trên máy UVP. 1 2 3 4 5 6 7 8 LD 9 10 11 12 13 14 15 16 100 bp 500 bp 442 bp 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 LD ĐC 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 100 (-) Hình 3.3: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.4. Giếng 1 – 39: sản phẩm PCR của gene PIT-1.4 kích thước 442 bp; LD 100: Ladder 100 bp; ĐC (-): Đối chứng âm Dựa vào kết quả Hình 3.3 chúng tôi nhận thấy được băng ở các giếng sáng rất rõ, đều và đẹp thể hiện quy trình PCR khá tốt, phát hiện được 100 % sự hiện diện của gene PIT-1.4 với kích thước sản phẩm PCR là 442 bp. Kết luận thành phần phản ứng và chu trình nhiệt sử dụng cho đoạn mồi PIT-1.4 là thích hợp. Như vậy 39 sản phẩm PCR của gene PIT-1 với mồi PIT-1.4 có thể được dùng để tiến hành phản  45 
  56. Đồ án tốt nghiệp ứng cắt với enzyme cắt giới hạn EcoRI. Đối chứng âm được sử dụng để so sánh các mẫu không cho sản phẩm PCR. 3.4 Cắt sản phẩm PCR bằng RE 3.4.1 Sản phẩm PCR gene PIT-1.2 được cắt bằng enzyme TaqI Việc xử lý enzyme là một trong những công đoạn quan trọng trong việc xác định đa hình kiểu gene và tần số xuất hiện gene PIT-1. Đây là công đoạn rất tốn kém, đòi hỏi chi phí cao và kỹ thuật tốt khi thao tác trên số lượng mẫu lớn. Do đó, việc xác định nồng độ cũng như thể tích của các enzyme tham gia vào quá trình phân cắt sao cho hiệu quả nhất và kinh tế nhất là rất cần thiết. Tiến hành xử lý enzyme cho 16 mẫu (trừ mẫu số 5) đã kiểm tra sản phẩm PCR cho kết quả tốt. Sử dụng thể tích ở Bảng 2.5 để tiến hành cắt sản phẩm PCR bằng enzyme cắt giới hạn TaqI sau đó ủ ở 65 0C qua đêm. Tiến hành kiểm tra sự phân cắt của enzyme trên gel agarose 1,5 % và đọc dưới máy UVP. LD 100 1 2 3 4 5 6 7 8 599 bp 500 bp 467 bp 132 bp AA BB AB BB AA AB AB AB 9 10 11 12 13 14 15 16 LD 100 AB AB AB AB AB AB AB AB  46 
  57. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.4: Kết quả kiểm tra sản phẩm cắt bằng enzyme TaqI. LD 100: Ladder 100 bp; AA : Tương ứng với vạch băng có kích thước 599 bp; BB : Tương ứng với vạch băng có kích thước 467/132 bp; AB : Tương ứng với vạch băng có kích thước 599/467/132bp Dựa vào kết quả Hình 3.4 chúng tôi nhận thấy các băng sáng đều, rõ, có 1 số băng phụ xuất hiện mờ nhưng không ảnh hưởng đến kết quả. Kết quả trên thể hiện được khả năng cắt đặc hiệu của enzyme TaqI khi sử dụng hóa chất ở Bảng 2.5 và nhiệt độ ủ 65 0C là thích hợp. Sản phẩm PCR sau khi cắt bằng enzyme TaqI thu được 3 kiểu gene BB, AB, AA. Trên gel điện di Hình 3.4, chúng tôi nhận thấy kiểu gene BB thể hiện 2 băng có kích thước là 467 bp và 132 bp; kiểu gene AB thể hiện 3 băng có kích thước là 599 bp, 467 bp và 132 bp; cuối cùng là kiểu gene AA do không bị cắt nên thể hiện 1 băng duy nhất kích thước 599 bp. Trong 16 sản phẩm PCR được cắt bằng enzyme TaqI thì kiểu gene AA xuất hiện 2 lần, kiểu gene BB xuất hiện 2 lần và kiểu gene AB xuất hiện 12 lần. Bảng 3.2: Tỷ lệ kiểu gene và tần số gene PIT-1.2 Tỷ lệ kiểu gen (%) Tần số gene n (cá thể) = 16 AA BB AB A B 12,5 12,5 75 0,5 0,5  47 
  58. Đồ án tốt nghiệp 80 75 70 60 50 40 30 Tỷ lệ lệ Tỷ(%) 20 12.5 12.5 10 0 BB AA AB Kiểu gene Hình 3.5: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ kiểu gene của gene PIT-1.2 Dựa vào Bảng 3.2 và Hình 3.5 chúng tôi nhận thấy tỷ lệ xuất hiện của kiểu gene AA và kiểu gene BB trong quần thể gà (16 cá thể) là tương đương nhau chiếm 12,5 %, kiểu gene AB chiếm tỷ lệ cao nhất 75 %. Tần số gene A và tần số gene B có giá trị tương đồng. Kết quả này khác với kết quả của Zahra Rodbari và ctv (2011), theo báo cáo của Zahra Rodbari và ctv khảo sát trên 120 con gà thương mại ở Iran thì tỷ lệ kiểu gene AA chiếm cao nhất với 61 %, tiếp đến là kiểu gene AB 32 %, thấp nhất là kiểu gene BB 7 %; alen A cao hơn alen B (A: 0,77; B: 0,23). Sở dĩ, kết quả của chúng tôi khác với kết quả của Zahra Rodbari và ctv, 2011 là do số cá thể gà được khảo sát còn rất ít, chưa có ý nghĩa; gà của chúng tôi khảo sát là gà Tàu vàng không phải gà thương mại như của tác giả. 3.4.2 Sản phẩm PCR gene PIT-1.4 được cắt bằng enzyme EcoRI Tiến hành xử lý bằng enzyme cắt EcoRI cho 39 mẫu (trừ mẫu số 5 và 33) đã kiểm tra sản phẩm PCR cho kết quả tốt. Sử dụng thể tích ở Bảng 2.5 để tiến hành cắt sản phẩm PCR bằng enzyme cắt EcoRI sau đó ủ ở 37 0C qua đêm. Tiến hành kiểm tra sự phân cắt của enzyme trên gel agarose 1,5 % và đọc dưới máy UVP.  48 
  59. Đồ án tốt nghiệp LD 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 100 500 bp 442 bp 246 bp 196 bp AB AB AA AA AB AA AB AB BB AB AB AA AA AB AB BB 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 LD ĐC 100 (-) AB AB AB AB AB AB AB AB AA AA AA AA LD 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 100 BB AA AB BB BB AA AA AB AB AB AB Hình 3.6: Kết quả kiểm tra sản phẩm cắt bằng enzyme EcoRI. LD 100: Ladder 100 bp; ĐC (-): Đối chứng âm; AA: Tương ứng với vạch băng có kích thước 442 bp; BB:AB Tương ứng với vạch băng có kích thước 246/196 bp; AB: Tương ứng với vạch băng có kích thước 442/246/196 bp Dựa vào Hình 3.6, chúng tôi nhận thấy các băng sáng đều, rõ. Kết quả trên thể hiện được khả năng cắt đặc hiệu của enzyme EcoRI sử dụng hóa chất ở Bảng  49 
  60. Đồ án tốt nghiệp 2.5 và nhiệt độ ủ 37 0C là thích hợp. Sản phẩm PCR khi cắt bằng enzyme EcoRI thu được 3 kiểu gene tương ứng là BB, AB, AA. Trên gel điện di Hình 3.6, chúng tôi nhận thấy kiểu gene BB thể hiện 2 băng có kích thước là 246 bp và 196 bp; kiểu gene AB thể hiện 3 băng 442 bp, 246 bp và 196 bp; cuối cùng là kiểu gene AA do không bị cắt nên thể hiện 1 băng duy nhất 442 bp. Trong 39 sản phẩm PCR được cắt bằng enzyme EcoRI thì kiểu gene AA xuất hiện 12 lần, kiểu gene BB xuất hiện 5 lần và kiểu gene AB xuất hiện 22 lần. Bảng 3.3: Tỷ lệ kiểu gene và tần số gene PIT-1.4 Tỷ lệ kiểu gene (%) Tần số gene n (cá thể) = 39 AA BB AB A B 30,77 12,82 56,41 0,6 0,4 60 56.41 50 40 30.77 30 Tỷ lệ lệ Tỷ(%) 20 12.82 10 0 BB AA AB Kiểu gene Hình 3.7: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ kiểu gene của gene PIT-1.4 Dựa vào Bảng 3.3 và Hình 3.7 chúng tôi nhận thấy tỷ lệ xuất hiện của kiểu gene AA chiếm 30,77 %, kiểu gene BB chiếm thấp nhất 12,82 %, kiểu gene AB chiếm tỷ lệ cao nhất 56,41 %. Tần số gene A xuất hiện nhiều hơn tần số gene B (A:  50 
  61. Đồ án tốt nghiệp 0,6; B: 0,4). Kết quả này khác với kết quả của Zahra Rodbari và ctv (2011), theo báo cáo của Zahra Rodbari và ctv khảo sát trên 120 con gà thương mại ở Iran thì tỷ lệ kiểu gene AA chiếm cao nhất với 61%, tiếp đến là kiểu gene AB 32%, thấp nhất là kiểu gene BB 7%; alen A cao hơn alen B (A: 0,77; B: 0,23). Sở dĩ, kết quả của chúng tôi khác với kết quả của Zahra Rodbari và ctv, 2011 là do số cá thể gà được khảo sát còn tương đối ít, chưa có ý nghĩa; gà của chúng tôi khảo sát là gà Tàu vàng không phải gà thương mại như của tác giả. Tổng kết: Tỷ lệ kiểu gene và tần số gene PIT-1 trong đề tài nghiên cứu. Bảng 3.4: Tổng hợp kiểu gene và tần số gene PIT-1 Kiểu gene (%) Tần số gene Số mẫu Gene TN BB AA AB A B PIT-1.2 (TaqI) 16 12,5 12,5 75 0,5 0,5 PIT-1.4 (EcoRI) 39 12,82 30,77 56,41 0,6 0,4 Nhiều nghiên cứu đã ứng dụng các đa hình gene PIT-1 để kiểm tra mối liên hệ với đặc tính tăng trưởng, thành phần thân thịt cũng như những tính trạng béo ở gà. Gene PIT-1 đã được chọn để nghiên cứu đa hình kiểu gene và xác định tần số gene ở gà Tàu vàng. Nghiên cứu của đề tài chỉ dừng lại ở việc xác định đa hình gene và tần số gene PIT-1. Trong đề tài nghiên cứu này, kết quả đa hình gene và tần số gene PIT-1 trong đàn gà Tàu vàng nuôi tại một Trung Tâm Giống Vật Nuôi được thể hiện trong Bảng Bảng 3.4, chúng tôi nhận thấy kết quả ở gene PIT-1.2 cắt bằng enzyme TaqI và gene PIT-1.4 cắt bằng enzyme EcoRI đều xuất hiện 3 kiểu gene BB, AA và AB trong đó kiểu gene AB chiếm tỷ lệ (%) cao hơn kiểu gene AA và BB trong quần thể 41 cá thể gà; điều này khác so với kết quả nghiên cứu của Zahra Rodbari và ctv (2011) là do đàn gà chúng tôi sử dụng là gà Tàu vàng còn đàn gà của tác giả là gà thương mại, vị trí địa lí cũng như kỹ thuật chăm sóc khác nhau. Còn tần số gene A  51 
  62. Đồ án tốt nghiệp thì xuất hiện tương đối cao hơn tần số gene B; điều này tương đối giống với kết quả nghiên cứu của Zahra Rodbari và ctv (2011) về gà thương mại tại Iran. Kết quả báo cáo của Zahra Rodbari và ctv (2011) về đa hình đơn nucleic của gene PIT-1 có liên quan đáng kể với thành phần thân thịt của gà thương phẩm tại Iran và báo cáo của Nie và ctv (2008) về đa hình gene PIT-1 có liên quan đáng kể đến đặc điểm tăng trưởng gà. Kết quả của 2 báo cáo trên đều cho rằng đa hình kiểu gene PIT-1 có ảnh hưởng đáng kể đến các đặc điểm tăng trưởng của gà như: trọng lượng cơ thể, trọng lượng cơ ức, trọng lượng cánh, trọng lượng thịt, chiều dài cơ thể, khả năng tăng khối lượng trung bình hàng ngày ở các giai đoạn phát triển khác nhau của gà thương phẩm. Ngoài ra, cả 2 báo cáo trên đều khẳng định các đa hình kiểu gene này không có liên quan đến đặc tính béo, độ dày mỡ bụng, độ dày mỡ dưới da của gà thương phẩm. Từ các kết quả trên, chúng tôi nhận thấy các kết quả của đề tài nghiên cứu có thể sử dụng để tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về mối liên hệ giữa đa hình kiểu gene, tần số gene và tính trạng tăng năng suất của gà Tàu vàng Việt Nam trên quy mô số lượng mẫu nhiều hơn.  52 
  63. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận  Tách chiết DNA Quy trình ly trích DNA sử dụng Bộ Kit EZ-10 Spin Column Genomic DNA Minipreps, Blood với 41 mẫu máu gà Tàu vàng thì kết quả cho thấy 39 mẫu có sự hiện diện của DNA chiếm tỉ lệ 95,12 % so với tổng số mẫu đem ly trích.  Phản ứng PCR Thành phần hóa chất theo protocol nhà sản xuất có điều chỉnh ở PTN và chu trình nhiệt thích hợp cho kết quả khuếch đại DNA với mồi PIT-1.2 (599 bp) và mồi PIT-1.4 (442 bp) đạt tỉ lệ 100% thành công. Sản phẩm PCR đạt kết quả tốt.  Phản ứng cắt với enzyme cắt giới hạn Kết quả sản phẩm cắt của gene PIT-1.2 với enzyme TaqI là: kiểu gene AA với kích thước 599 bp chiếm 12,5 %, kiểu gene BB với kích thước 467 bp, 132 bp chiếm 12,5 %, kiểu gene AB với kích thước 599 bp, 467 bp, 132bp chiếm tỷ lệ cao nhất 75 %. Tần số gene A (0,5), tần số gene B (0,5) Kết quả sản phẩm cắt của gene PIT-1.4 với enzyme EcoRI là: kiểu gene AA với kích thước 442 bp chiếm 30,77 %, kiểu gene BB với kích thước 246 bp, 196 bp chiếm 12,82 %, kiểu gene AB với kích thước 442 bp, 246 bp, 196 bp chiếm tỷ lệ cao nhất 56,41 %. Tần số gene A (0,6), tần số gene B (0,4) 4.2 Kiến nghị Tiếp tục khảo sát với số lượng mẫu lớn hơn. Thu thập đầy đủ các số liệu về năng suất sinh trưởng của giống gà Tàu vàng để đánh giá ảnh hưởng của kiểu gene PIT-1 đến năng suất sinh sản, sinh trưởng và phẩm chất thịt của gà Tàu vàng.  53 
  64. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt 1. Nguyễn Văn Bắc, Lê Viết Ly, Đinh Công Tiến và Nguyễn Ngọc Dương, 2005. Khả năng sinh trưởng và sinh sản của gà Tàu vàng Việt Nam. 2. Nguyễn Văn Bắc, Võ Văn Sự, Hoàng Văn Tiệu, Phạm Văn Thìn và Hoàng Văn Hải, 2005. Kết quả bước đầu bảo tồn In-situ gà Tàu vàng 3. Báo cáo Hội nghị phát triển Chăn Nuôi – Thú Y toàn quốc, 2011 4. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang.1999. Di Truyền Phân Tử. Nhà xuất bản Nông nghiêp, Tp. Hồ Chí Minh. 5. Trần Thị Dân, 2000. Tiến bộ di truyền về “số con đẻ ra/lứa” tại trại chăn nuôi heo công nghiệp của Tp.HCM. Tạp chí chăn nuôi số 3 6. Trần Thị Dân và Nguyễn Ngọc Tuân, 2001. Ảnh hưởng của gene gây stress (gene halothane) đối với sức tăng trưởng, phẩm chất thân thịt và năng suất sinh sản của lợn. Tạp Chí Chăn Nuôi, 7 (41): 13 – 14 7. Hồ Huỳnh Thùy Dương. 1998. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Giáo Dục, Tp. Hồ Chí Minh. 8. Trần Xuân Hoàn, Phạm Doãn Lân, 2000. Phân tích gene hormone sinh trưởng ở gà Ri bằng kỹ thuật PCR – RFLP. Tạp chí KHCN Chăn Nuôi. 9. Hội chăn nuôi Việt Nam, 2002. Chăn nuôi gà thả vườn và gà tây. Nhà xuất bản Nông Nghiệp 10. Nguyễn Tuấn Kiệt, 2009. Luận văn: Ứng dụng kỹ thuật PCR - RFLP xác dịnh các kiểu gen thụ thể prolactin trên giống heo Yorkshire. Đại Học Nông Lâm 11. Lê Hồng Mận, Nguyễn Thanh Sơn, 2001.Kỹ thuật nuôi gà Ri và gà Ri pha. Nhà xuất bản Nông nghiệp 12. Khuất Hữu Thanh, 2006. Kỹ thuật gene – Nguyên lý và ứng dụng. Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật. 13. Lâm Minh Thuận và ctv, 2003. Khảo sát khả năng sản xuất thịt của gà Tàu vàng tại Bà Rịa Vũng Tàu. Tạp chí KHKT Nông Lâm Nghiệp (4) 14. Đinh Công Tiến và Nguyễn Quốc Đạt,2005. Bảo tồn quỹ gene gà Tàu vàng.  54 
  65. Đồ án tốt nghiệp 15. Tình hình chăn nuôi gà giai đoạn 2001 – 2005 và phương hướng phát triển giai đoạn 2006 – 2015. Cục chăn nuôi 16. Trần Văn Tịnh, 2011. Nghiên cứu chọn lọc và nhân thuần nâng cao năng suất gà Tàu Vàng. Báo cáo tổng kết nghiệm thu đề tài cấp Bộ 2008 – 2010. Tài liệu tiếng nước ngoài 17. Bodner M, Castrillo JL, Theill LE, Deerinck T, Ellisman M, Karin M (1988) . The pituitary-specific transcription factor GHF-1 is a homeobox-containing protein. Cell. 55: 505-518. 18. Cohen LE, Wondisford FE, Radovick S (1996). Role of Pit-1 in the gene expression of growth hormone, prolactin, and thyrotropin. Endocrinol Metab Clin North Am. 25: 523-540. 19. E. Bastos, S. Ávila, A. Cravador, R. Renaville, H. Guedes-Pinto, J.L. Castrillo, Identification and characterization of four splicing variants of ovine POU1F1 gene, Gene 382 (2006) 12–19. 20. FAO, 2004. Animal Production and Health Manual. 21. Jiang RS, Li J, Qu L, Li H, Yang N (2004). A New single nucleotide polymorphism in the chicken pituitary-specific transcription factor (POU1F1)gene associated with growth rate. Animal Genet. 35(4): 344-346. 22. Lamont, M. M., J. T. Vida, J. T. Harvey, S. Jeffries, R. Brown, H. H. Huber, R. DeLong, and W. K. Thomas. 1996. Genetic substructure of the Pacific harbor seal (Phoca vitulina richardsi) off Washington, Oregon, and California. Mar. Mamm. Sci. 12(3):402-413. 23. Lee EJ, Russell T, Hurley L, Jameson JL: Pituitary transcription fac- tor-1 induces transient differentiation of adult hepatic stem cells into prolactin- producing cells in vivo. Mol Endocrinol 2005, 19:964-971. 24. Li S, Crenshaw EB, Rawson EJ, Simmons DM, Swanson LW, Rosenfeld MG (1990). Dwarf locus mutants lacking three pituitary cell types result from mutations in the POU-domain gene pit-1. Nature. 347: 528533.  55 
  66. Đồ án tốt nghiệp 25. Miyai S, Yoshimura S, Iwasaki Y, Takekoshi S, Lioyd RV, Osamura RY (2005). Introduction of GH, PRL, and TSH beta mRNA by transcription Pit- 1 in a human pituitary adenoma-derived cell line. Cell TISSUE Res. 322: 269-277. 26. Nie Q, Fang M, Xie L, Zhau M, Liang Z, Luo Z, Wang G, Bi W, Liang C, Zhang W, Zhang X (2008). The PIT 1 gene polymorphism were associated with chicken growth traits. BMC Genet. 9: 20-29. 27. Nie Q, Lei M, Ouyang J, Zeng H, Yang G, Zhang X: Identification and characterization of single nucleotide polymorphisms in 12 chicken growth correlated genes by denaturing high performance liquid chromatography. Genet Sel Evol 2005, 37:339-360. 28. Promwatee N, and Duangjinda M, 2010. Association of Single Nucleotide Polymorphisms in GHSR, IGF-I, cGH and IGFBP2 Gen with Growth Traits in Thai Native Chickens. The 14th AAAP: pp 44-47 29. Qiu FF, Nie QH, Jin WY, Ouyang JH, Lin SM, Sun H, Zhang XQ (2006). Association of a 57 bp insertion/deletion in chicken PIT-1 gene with growth and carcass traits. Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis. 28(2): 284- 288. 30. Rodbari Z, Alipanah M, Seyedabadi HR, Amirinia C, 2011: Identification of a single nucleotide polymorphism of the pituitary-specific transcriptional factor 1 (Pit 1) gene and its association with body composition trait in Iranian commercial broiler line. ISSN 1684-5315. 31. Simmons DM, Voss JW, Ingraham HA, Holloway JM, Broide RS, Rosenfeld MG, Swanson LW: Pituitary cell phenotypes involve cell-specific Pit-1 mRNA translation and synergistic interactions with other classes of transcription factors. Genes Dev 1990, 4:695-711. 32. Taha D, Mul l i s PE, I banez L, de Zegher F: Absent or delayed adrenarche in Pit-1/POU1F1 deficiency. Horm Res 2005, 64:175-179.  56 
  67. Đồ án tốt nghiệp 33. Tanaka M, Yamamoto I, Ohkubo T, Wakita M, Hoshino S, Nakashima K (1999). cDNA cloning and developmental alterations in gene expression of the two Pit-1/GHF-1 transcription factors in the chicken pituitary. Gen. Comp. Endocrinol. 114: 441-448. 34. Van As P, Buys N, Onagbesan OM, Decuypere E: Complementary DNA cloning and ontogenic expression of pituitary-specific transcription factor of chickens (Gallus domesticus) from the pituitary gland. Gen Comp Endocrinol 2000, 120:127-136. 35. Wattanachant S, Benjakul S, Ledward DA., 2004. Composition, color and texture of Thai indigenous and broiler chicken muscles. Poult Sci. 83(1): 123-8 Các trang web từ internet:  57 