›

Đồ án Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên sự nhân chồi và tạo cây lan Giả Hạc (Dendrobium anosmum) in vitro

pdf 85 trang thiennha21 13/04/2022 4150
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên sự nhân chồi và tạo cây lan Giả Hạc (Dendrobium anosmum) in vitro", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_nghien_cuu_anh_huong_cua_mot_so_dieu_kien_nuoi_cay_len.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên sự nhân chồi và tạo cây lan Giả Hạc (Dendrobium anosmum) in vitro

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY LÊN SỰ NHÂN CHỒI VÀ TẠO CÂY LAN GIẢ HẠC CHÂU NHƢ IN VITRO Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hƣớng dẫn : TS. HUỲNH HỮU ĐỨC KS. VÕ THANH HUY Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ LAN HƢƠNG MSSV: 1411100329 Lớp: 14DSH03 TP. Hồ Chí Minh, 2018
  2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của TS. Huỳnh Hữu Đức – Phó trƣởng phòng Thực nghiệm Cây trồng và KS. Võ Thanh Huy – cán bộ phòng Thực nghiệm Cây trồng Trung tâm Công Nghệ Sinh Học TPHCM. Các số liệu thu thập và kết quả phân tích trong đồ án là trung thực, không sao chép từ bất cứ đề tài nghiên cứu khoa học nào. Mọi sự tham khảo sử dụng trong đồ án đều đƣợc trích dẫn các nguồn tài liệu trong đồ án và danh mục tài liệu tham khảo. Nếu không đúng nhƣ đã nêu trên, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đề tài của mình. Tp.HCM, ngày 31 tháng 07 năm 2018 Ngƣời cam đoan Nguyễn Thị Lan Hƣơng
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Quý Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện, trang thiết bị đầy đủ để em có thể hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp này. Với lòng biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cám ơn đến TS. Huỳnh Hữu Đức – Phó trƣởng phòng Thực nghiệm Cây trồng – ngƣời đã hƣớng dẫn em trong suốt những tháng ngày vừa qua, đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ và trao đổi với em những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này. Em xin chân thành cảm ơn đến KS. Võ Thanh Huy – một ngƣời anh đã tận tình hƣớng dẫn em một cách tận tâm, truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho em. Cám ơn anh luôn động viên, giúp đỡ, trao đổi và giảng giải tận tình những vƣớng mắc mà em gặp phải trong quá trình thực hiện đề tài, giúp em nhanh chóng vƣợt qua khó khăn và hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp này. Em xin gửi lời cảm ơn đến các anh, chị làm việc tại Phòng Thực nghiệm cây trồng, Trung tâm Công nghệ sinh học Thành Phố Hồ Chí Minh đã chỉ dẫn và nhiệt tình giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, đặc biệt là Quý Thầy Cô bộ môn Công Nghệ Sinh học, đã tạo điều kiện cho sinh viên chúng em tiếp cận với môi trƣờng thực tế và nâng cao kỹ năng thực hành, bên cạnh đó cũng đã truyền đạt nhiều kiến thức giúp em hoàn thành đồ án tốt nghiệp của mình. Con xin gửi lời cám ơn sâu sắc và chân thành đến ba, mẹ những ngƣời đã sinh thành và nuôi dƣỡng dạy dỗ con nên ngƣời. Ba mẹ đã luôn ở bên cạnh động viên, lo lắng, tạo mọi điều kiện cho con đƣợc học tập trong suốt thời gian qua. Cuối cùng, em xin kính chúc Quý Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Thành Phố Hồ Chí Minh, các anh, chị làm việc tại Phòng Thực nghiệm cây trồng và Quý Thầy Cô luôn dồi dào sức khỏe và thành công trong cuộc sống! Em xin chân thành cảm ơn!
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN 1 LỜI CẢM ƠN 2 MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BIỂU ĐỒ vii LỜI MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu và nội dung của đề tài 2 3. Ý nghĩa của đề tài 3 4. Phƣơng pháp nghiên cứu 3 5. Kết quả đạt đƣợc của đề tài 4 6. Kết cấu của đồ án 4 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1. Tổng quan về phong lan 5 1.2. Tổng quan về Dendrobium 6 1.3. Tổng quan về lan Giả Hạc (Dendrobium anosmum) 7 1.3.1. Nguồn gốc và phân bố 7 1.3.2. Phân loại 9 1.3.3. Đặc điểm hình thái 9 1.3.4. Điều kiện sinh trƣởng của lan Dendrobium anosmum 14 1.3.5. Giá thể trồng lan (compost) 16 1.3.6. Giá trị sử dụng cây lan Giả Hạc Dendrobium anosmum 18 i
  5. Đồ án tốt nghiệp 1.4. Tổng quan về nuôi cấy mô thực vật 19 1.4.1. Khái niệm 19 1.4.2. Một số phƣơng pháp nuôi cấy mô 19 1.4.3. Ƣu, nhƣợc điểm của phƣơng pháp nhân giống in vitro 21 1.5. Các chất hữu cơ tự nhiên đƣợc bổ sung vào trong quá trình nuôi cấy in vitro 23 1.5.1. Nƣớc dừa 23 1.5.2. Chuối 23 1.5.3. Độ pH và Agar 23 1.5.4. Pepton 24 1.6. Các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật đƣợc bổ sung 24 1.6.1. Cytokinin 25 1.6.2. Auxin 25 1.6.3. Sự kết hợp giữa Auxin và Cytokynin 26 1.7. Tổng quan về đèn 26 1.7.1. Vai trò của nguồn chiếu sáng đến sự phát triển của cây giống in vitro . 27 1.7.2. Đèn huỳnh quang 27 1.7.3. Đèn LED 29 1.7.4. Xác định hàm lƣợng chlorophyll (Arnon, 1949) 30 1.7.5. Tình hình nghiên cứu sử dụng ánh sáng đèn LED trong nuôi cấy mô 32 1.8. Tình hình nghiên cứu cây Lan Dendrobium thế giới và Việt Nam: 35 1.8.1. Tình hình nghiên cứu trên Thế giới 35 1.8.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 36 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 ii
  6. Đồ án tốt nghiệp 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 37 2.2. Vật liệu và phƣơng pháp 37 2.2.1. Vật liệu nghiên cứu 37 2.2.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất 37 2.2.3. Điều kiện phòng nuôi cấy 39 2.2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu 40 2.3. Nội dung nghiên cứu 40 2.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA, NAA kết hợp với ánh sáng lên sự nhân chồi lan Giả hạc Châu Nhƣ 40 2.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của chất hữu cơ (chuối và nƣớc dừa) lên sự nhân chồi và tạo cây lan Giả hạc Châu Nhƣ. 41 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA, NAA kết hợp với ánh sáng lên sự nhân chồi lan Giả hạc Châu Nhƣ 43 3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của chuối và nƣớc dừa lên sự nhân chồi và tạo cây lan Giả hạc Châu Nhƣ. 51 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 4.1. Kết luận 59 4.2. Kiến nghị 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC 1 iii
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BA : 6-Benzyl Adenine CNSH : Công Nghệ Sinh Học CĐHSTTV : Chất điều hòa sinh trƣởng thực vật C : Chuối Chl : Chlorophyll Cs : Cộng sự CW : NSSƣớc dừa IBA : Indolebutyric Acid LED : Light Emitting Diode MS : Murashige - Skoog NAA : Napthalene Acetic Acid NT : Nghiệm thức TDZ : 1-phenyl-3-(1,2,3-Thiadiazol-5 yl)-urea TP.HCM : Thành Phố Hồ Chí Minh iv
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Các trang thiết bị trong thí nghiệm 38 Bảng 2.2. Hóa chất môi trƣờng MS 39 Bảng 2.3. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA, NAA kết hợp với ánh sáng lên sự nhân chồi lan Giả hạc Châu Nhƣ. 41 Bảng 2.4. Ảnh hƣởng của chuối và nƣớc dừa lên sự nhân chồi và tạo cây lan Giả hạc Châu Nhƣ 42 Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA, NAA kết hợp với ánh sáng lên sự nhân chồi lan Giả hạc Châu Nhƣ sau 8 tuần nuôi cấy 44 Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của chuối và nƣớc dừa lên sự nhân chồi và tạo cây lan Giả hạc Châu Nhƣ sau 8 tuần nuôi cấy 52 v
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Một số loại lan Giả Hạc 7 Hình 1.2. Mặt hoa và màu sắc khác nhau của Giả hạc Châu Nhƣ 8 Hình 1.3. Rễ lan Giả Hạc 10 Hình 1.4. Thân lan Giả Hạc 11 Hình 1.5. Lá lan giả hạc 11 Hình 1.6. Hoa lan Giả Hạc 13 Hình 1.7. Quả lan Giả Hạc 14 Hình 1.8. Đèn Huỳnh Quang 28 Hình 1.9. Đèn LED 29 Hình 1.10. Phổ hấp thụ ánh sáng của thực vật 31 Hình 3.1. Cụm chồi lan Giả hạc Châu Nhƣ ở các nồng độ BA, NAA và ánh sáng sau 8 tuần nuôi cấy 48 Hình 3.2. Ảnh hƣởng của chuối và nƣớc dừa lên sự nhân chồi và tạo cây lan Giả hạc Châu Nhƣ sau 8 tuần nuôi cấy 55 vi
  10. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA, NAA kết hợp với ánh sáng tới khả năng nhân chồi lan Giả hạc Châu Nhƣ sau 8 tuần nuôi cấy 45 Biểu đồ 3.2. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA, NAA kết hợp với ánh sáng tới trọng lƣợng tƣơi lan Giả hạc Châu Nhƣ sau 8 tuần nuôi cấy 45 Biểu đồ 3.3. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA, NAA kết hợp với ánh sáng tới trọng lƣợng khô lan Giả hạc Châu Nhƣ sau 8 tuần nuôi cấy 46 Biểu đồ 3.4. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA, NAA kết hợp với ánh sáng tới Hàm lƣợng chất khô lan Giả hạc Châu Nhƣ sau 8 tuần nuôi cấy 46 Biểu đồ 3.5. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA, NAA kết hợp với ánh sáng tới hàm lƣợng chlorophyll lan Giả hạc Châu Nhƣ sau 8 tuần nuôi cấy 47 Biểu đồ 3.6. Ảnh hƣởng của Chuối và nƣớc dừa đến số chồi lan Giả hạc Châu Nhƣ sau 8 tuần nuôi cấy 53 Biểu đồ 3.7. Ảnh hƣởng của Chuối và nƣớc dừa đến chiều cao lan Giả hạc Châu Nhƣ sau 8 tuần nuôi cấy 53 Biểu đồ 3.8. Ảnh hƣởng của Chuối và nƣớc dừa đến số lá lan Giả hạc Châu Nhƣ sau 8 tuần nuôi cấy 54 Biểu đồ 3.9. Ảnh hƣởng của Chuối và nƣớc dừa đến số rễ lan Giả hạc Châu Nhƣ sau 8 tuần nuôi cấy 54 vii
  11. Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Lan rừng luôn đƣợc ƣa chuộng bởi một vẻ đẹp thanh thoát cao sang, có hƣơng thơm rất nồng nàn. Cái đẹp của hoa lan thể hiện từ những đƣờng nét của cánh hoa, cấu trúc đặc biệt quyến rũ của môi lan, cho đến những điểm xuyến ngộ nghĩnh trên các lá lan, hay cấu trúc đa dạng của thân lan đã góp phần tạo nên vẻ đẹp kiêu sa, đƣợc ví von nhƣ một thiếu nữ e ấp khi khoe sắc thắm dịu dàng, thƣớt tha nhƣng có lúc cũng vô cùng mạnh mẽ [5]. Lan rừng Việt Nam thƣờng mọc trong những khu rừng sâu thẳm âm u, hiểm trở với bao nguy hiểm rình rập, do đó mà đa phần lan rừng trở thành loài cây cảnh hiếm và giá thành khá cao. Thế giới lan rừng rất phong phú với nhiều chủng loại, trong đó lớn nhất phải kể đến là chi Dendrobium. Trong chi này, Giả Hạc là loài hoa tuyệt đẹp và quý hiếm. Ngoài tự nhiên rất khó tìm thấy Giả Hạc do tình trạng thu hái, buôn bán trái phép phổ biến nhƣ hiện nay sẽ dẫn đến nguy cơ làm mất nguồn gen quý trong một tƣơng lai gần. Để bảo tồn, khai thác nguồn gen và phát triển loài lan quý hiếm này cần phải tiến hành nhân giống và nuôi trồng chúng ở quy mô lớn. Ngành Công nghệ Sinh học đang ngày càng phát triển và đã có nhiều thành tựu trong các lĩnh vực sản xuất, nông nghiệp, công nghiệp, vi sinh, y tế, dƣợc phẩm, Một trong những thành tựu nổi bật nhất của Công nghệ Sinh học là lĩnh vực nhân giống cây trồng bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro, tạo ra số lƣợng cây lớn, cây con đảm bảo chất lƣợng về mặt di truyền của cây mẹ. Lan là một trong những đối tƣợng đƣợc áp dụng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro nhiều nhất, nhằm tạo ra số lƣợng cây con lớn để đáp ứng nhu cầu thị trƣờng. Trong đó, họ lan hay phong lan (Orchidaceae) là một trong những họ thực vật lớn nhất với khoảng trên 35.000 loài phân bố rộng rãi trên toàn thế giới. Việt Nam là quốc gia thuộc khí hậu nhiệt đới, thích hợp cho sự phát triển của các loài phong lan. 1
  12. Đồ án tốt nghiệp Trong những năm gần đây, nhu cầu thƣởng thức hoa của ngƣời Việt ngày càng phát triển và đƣợc chú trọng. Chính vì vậy, việc cung cấp lan giống cho thị trƣờng cần đƣợc quan tâm. Tuy nhiên, các giống hoa lan phổ biến trên thị trƣờng nƣớc ta chủ yếu là do nhập ngoại từ Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc, Việc nghiên cứu nhân giống cây lan Giả hạc Châu Nhƣ (Dendrobium anosmum) sẽ góp phần vào công việc bảo tồn các nguồn gen lan rừng của Việt Nam. Do đó, đề tài “Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số điều kiện nuôi cấy lên sự nhân chồi và tạo cây lan Giả Hạc (Dendrobium anosmum) in vitro” nhằm mục đích xác định loại môi trƣờng khoáng, các chất điều hòa sinh trƣởng và các chất bổ sung phù hợp nhất cho quá trình nhân nhanh chồi lan Giả hạc Châu Nhƣ nhằm góp phần vào công tác bảo tồn, khai thác nguồn gen loài lan rừng Việt Nam cũng nhƣ hƣớng tới việc nhân nhanh cây con phục vụ thƣơng mại hóa loài hoa đẹp và có giá trị thẩm mĩ cao này. 2. Mục tiêu và nội dung của đề tài Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu sự ảnh hƣởng của các chất điều hòa sinh trƣởng BA, NAA, ánh sáng và các chất hữu cơ đến sự nhân chồi lan Giả hạc Châu Nhƣ. Nội dung của đề tài: Khảo sát ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA, NAA kết hợp với ánh sáng lên sự nhân chồi lan Giả hạc Châu Nhƣ. Khảo sát ảnh hƣởng của chất hữu cơ (chuối và nƣớc dừa) lên sự nhân chồi và tạo cây lan Giả hạc Châu Nhƣ. 2
  13. Đồ án tốt nghiệp 3. Ý nghĩa của đề tài Ý nghĩa khoa học: - Rất có ý nghĩa trong học tập và nghiên cứu. Giúp sinh viên củng cố lại kiến thức đã học và nghiên cứu khoa học. - Thông qua đề tài, tìm hiểu đƣợc các yếu tố ảnh hƣởng đến sự phát triển cây lan Giả Hạc. - Biết đƣợc phƣơng pháp nghiên cứu một số vấn đề khoa học, xử lý và phân tích số liệu, biết cách trình bài một bài báo khoa học. - Cung cấp cho công tác nuôi cấy mô điều kiện tối ƣu cho quá trình sinh chồi và tạo cây lan Giả Hạc có giá trị kinh tế. - Tạo tiền đề giúp cho việc phát triển lan Giả Hạc thành nuôi cấy công nghiệp lan rừng với số lƣợng lớn, đáp ứng nhu cầu thị trƣờng trong nƣớc và quốc tế. Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu cung cấp đƣợc những điều kiện nuôi cấy tốt nhất cho sự tăng trƣởng cây lan Giả Hạc in vitro, tạo ra cây giống có chất lƣợng cao đáp ứng nhu cầu sản xuất tại Trung tâm Công Nghệ Sinh Học TP.HCM. Xác định đƣợc nồng độ của các chất điều hòa sinh trƣởng BA và NAA kết hợp với cƣờng độ ánh sáng lên sự nhân nhanh chồi lan Giả hạc Châu Nhƣ. Xác định đƣợc nồng độ chuối và nƣớc dừa thích hợp cho sự nhân chồi và tạo cây ở lan Giả hạc Châu Nhƣ. 4. Phƣơng pháp nghiên cứu Các thí nghiệm đƣợc bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên. Các nghiệm thức thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 chai. Số liệu thu thập đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm SAS V8 và chƣơng trình Microsoft Excel 2016®, sử dụng trắc nghiệm phân hạng Duncan’s test với độ tin cậy P 0,05. 3
  14. Đồ án tốt nghiệp 5. Kết quả đạt đƣợc của đề tài - Xác định đƣợc nồng độ của các chất điều hòa sinh trƣởng BA và NAA kết hợp với cƣờng độ ánh sáng lên sự nhân nhanh chồi lan Giả hạc Châu Nhƣ. - Xác định đƣợc nồng độ chuối và nƣớc dừa thích hợp cho sự nhân chồi và tạo cây ở lan Giả hạc Châu Nhƣ. 6. Kết cấu của đồ án Đồ án bao gồm các chƣơng sau: Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu Chƣơng 2: Vật liệu và phƣơng pháp Chƣơng 3: Kết quả và thảo luận Chƣơng 4: Kết luận và kiến nghị 4
  15. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về phong lan Họ Phong lan (Orchidaceae) là một họ thực vật có hoa, thuộc ngành thực vật hạt kín, lớp một lá mầm (Monocotylendons), họ Lan (Orchidaceae). Họ phong lan đã biết khoảng 850 chi (APG III, 2009). Ngày nay, dựa vào đặc tính di truyền các nhà khoa học đã chia họ lan thành 6 họ phụ: Apostasioideae, Cypridioideae, Neottioideae, Orchidioideae, Epidendroideae, Vandoideae. Họ Lan là một họ thực vật lớn và phân bố gần nhƣ trên toàn thế giới (ngoại trừ châu Nam Cực). Danh sách dƣới đây liệt kê gần đúng sự phân bố của họ này: Nhiệt đới châu Mỹ: 250 – 270 chi Nhiệt đới châu Á: 260 – 300 chi Nhiệt đới châu Phi: 230 – 270 chi Châu Đại Dƣơng: 50 – 70 chi Châu Âu và ôn đới châu Á: 40 – 60 chi Bắc Mỹ: 20 – 25 chi [35]. Ở Việt Nam có 137 – 140 chi gồm trên 1000 loài lan rừng, bao gồm cả địa lan, thạch lan và phong lan, phân bố rộng khắp cả nƣớc, hầu hết đều có hoa đẹp nên đƣợc trồng làm cây cảnh [6]. Dựa theo đặc điểm hình thái của thân cây, phong lan đƣợc chia ra làm hai nhóm: Nhóm cây đơn thân (monopodial): đây là nhóm chỉ tăng trƣởng về chiều cao, lá mầm từ đỉnh mọc thêm hàng năm kéo theo thân cây phát triển dài ra có thể đạt kích thƣớc tối đa đến vài mét. Thân mầm phát triển từ thân gốc gọi là “mắt” cây, các mắt cây phát triển. Nhóm cây đa thân (sympodial): thân cây lan tăng trƣởng có giới hạn, đến một kích thƣớc nào đó thì ngừng phát triển, chồi mới ở gốc lại sẽ phát triển tiếp. Cứ thế 5
  16. Đồ án tốt nghiệp tiếp tục, chồi nọ sinh ra từ gốc của chồi có trƣớc đến một kích thƣớc nào đó sẽ phát triển thêm lá và rễ tạo nên một thân cây. Thân cây cứ phát triển theo cách này tạo nên một tập hợp phân nhánh. Dựa theo khả năng thích nghi với điều kiện môi trƣờng họ lan đƣợc chia thành 4 nhóm chính [36]: - Phong lan (Epiphyte): Là loài sống ký gửi nhờ vào thân cây cao ẩm mục ở trong rừng hoặc trên núi cao, rễ bám vào các cây to, thân rủ xuống. - Địa lan (Terrestrial): Là loài có thân giả dạng củ, rễ chùm sống nhờ đất ở sƣờn núi, bờ suối hay dƣới tán rừng ẩm ƣớt. Địa lan có nhiều loài với hình dáng, màu sắc phong phú đẹp mắt. - Hoại lan (Saprophyte): Gồm những loại mọc trên rêu và gỗ mục. - Thạch lan (Lithophyte): Gồm một số loại mọc trên đá. 1.2. Tổng quan về Dendrobium Chi lan Hoàng thảo (Dendrobium) là chi lớn thứ 2 trong họ hoa lan đứng sau lan lọng. Chữ “Dendrobium” có nguồn gốc từ Hy Lạp, “Dendro” hiểu là cây gỗ lớn và “bio” hiểu là sống [2]. Lan Dendrobium rất phong phú và đa dạng với hơn 1600 loài, phân bố ở các vùng Châu Úc, Châu Á tập trung nhiều nhất ở Đông Nam Á. Lan Dendrobium rất đa dạng về cấu tạo sinh học, hình thái và phong phú về dạng cây, dạng hoa. Vì vậy các nhà khoa học đã chia thành 40 nhóm nhỏ và chia thành 2 dạng chính: - Dạng đứng (Dendrobium phalaenopsis) thƣờng mọc ở xứ nóng, chịu ẩm và rất siêng ra hoa: Nhất điểm hồng, Nhất điểm hoàng, Báo hỉ, Ý thảo, Thủy tiên, Sonia, - Dạng thòng (Dendrobium nobile) chịu khí hậu mát mẻ: Giả hạc, Hạc vĩ, Long tu, Phi điệp vàng, Với 1600 loài khác nhau đòi hỏi nhiều cách chăm sóc khác nhau, nguyên do là vì chúng du nhập từ nhiều địa danh khác nhau: Nhật Bản, Triều Tiên và Newzealand, đặc biệt là New Guinea là nơi sản sinh ra nhiều loài Dendrobium nhất. 6
  17. Đồ án tốt nghiệp 1.3. Tổng quan về lan Giả Hạc (Dendrobium anosmum) 1.3.1. Nguồn gốc và phân bố  Nguồn gốc Giả hạc, lƣỡng điểm hạc, phi điệp hay giả hạc tím, có tên khoa học là Dendrobium anosmum, thuộc chi Dendrobium. Đƣợc khoa học gia Lindleyi đặt tên Giả hạc từ năm 1845. Đặc điểm của giống là sai hoa, hoa to, đẹp và có hƣơng thơm nên rất đƣợc ƣa chuộng trong chi Lan Hoàng Thảo, đƣợc xếp vào loại dòng thân thòng bởi thân của chúng mọng nƣớc và mọc hƣớng xuống dƣới khi ra hoa tạo thành một dải nhƣ thác nƣớc. Giả hạc đƣợc mệnh danh là nữ vƣơng lan rừng, là phong lan quý của rừng nhiệt đới.  Phân bố Dendrobium anosmum là đối tƣợng quý hiếm có ở Việt Nam, Lào, Thái Lan, Philippines, New Guinea, Bomeo, Indonesia, Malaya và Sri Lanka. Lan Giả hạc có nhiều trên dãy Trƣờng Sơn từ Nam ra Bắc [17]. Thƣờng mọc trên các cành cây ở cao độ khoảng 1000 – 1300 m tại các rừng cây nhiệt đới thuộc Đô Lƣơng, Vinh, Krong Pha, Đà Lạt, Bảo Lộc, Đắc Lắk, Sông Bé, Lộc Ninh v.v Nhƣng hiện nay có nhiều nhất tại Di Linh - Lâm Đồng. Hình 1.1. Một số loại lan Giả Hạc (Nguồn: 7
  18. Đồ án tốt nghiệp Lan Giả hạc Châu Nhƣ Giả hạc Châu Nhƣ là sự kết hợp của hai dòng cây lan rừng Việt Nam là: Giả hạc Xuân Di Linh lai với Đại Ý Thảo Xuân Lâm Đồng do chị Châu Nhƣ thực hiện. Giả hạc Xuân Di Linh: sống trên những thân cây cao và mọc rủ xuống dƣới. Thân có thể dài tới 3 m, lá mọc đối cách, hoa nở to khoảng 7 cm ra hoa ở các đốt đã rụng lá, ra hoa vào mùa xuân và hoa có mùi rất thơm, là hoa chơi tết. Về màu sắc giả hạc Xuân Di Linh có các màu chính nhƣ: tím hồng và trắng. Ngoài ra còn có hồng nhạt hồng thẫm hoặc cánh trắng lƣỡi tím. Đại Ý Thảo Xuân Lâm Đồng: là loại hoa lan dòng thân thòng mọc ở vùng Di Linh - Lâm Đồng, có thân rất dài và rất mảnh, đƣờng kính thân chỉ bằng 1/3 đến 1/2 thân giả hạc, lá cũng nhỏ và mỏng. Hoa chỉ mọc trên những đốt trụi lá, mỗi cụm hoa có từ 1 đến 3 hoa màu tím nhạt, cánh môi trắng có nhiều lông mịn, phía trong cánh môi có những đƣờng gân ngang màu tím đậm, thân Đại Ý Thảo rất dài nên khi hoa nở tập trung sẽ tạo thành một khóm hoa lớn tha thƣớt nhƣ đuôi hạc, ra hoa vào mùa xuân. Chính sự kết hợp trên đã tạo ra loài lan Giả hạc Châu Nhƣ độc đáo với kết cấu hoa rất đẹp, lạ, màu đậm, hoa nở vào mùa xuân, là loài lan lai nổi tiếng, đa dạng mặt hoa với nhiều màu sắc đẹp đáng để sƣu tầm. Hình 1.2. Mặt hoa và màu sắc khác nhau của Giả hạc Châu Nhƣ (Nguồn: 8
  19. Đồ án tốt nghiệp 1.3.2. Phân loại Giới: Plantae (Thực vật) Ngành: Angiospermae (Thực vật hạt kín) Lớp: Monocotyledoneac (Một lá mầm) Bộ: Asparagales (Măng Tây) Họ: Orchidaceae (Phong lan) Chi: Dendrobium (Hoàng Thảo) Loài: Dendrobium anosmum (Giả hạc, Lƣỡng điểm hạc, Phi điệp tím, ). 1.3.3. Đặc điểm hình thái [37]  Rễ lan Lan là họ sống phụ (bì sinh) bám, treo lơ lửng trên các cây thân gỗ khác. Các dạng thân gỗ nạc dài, ngắn, mập hay mảnh mai đƣa cơ thể bò đi xa hay chụm lại thành các bụi dày. Rễ làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dƣỡng, chúng đƣợc bao bởi lớp mô hút dày, ẩm bao gồm những lớp tế bào chết chứa đầy không khí, do đó nó ánh lên màu xám bạc. Với lớp mô xốp đó, rễ có khả năng hấp thu nƣớc mƣa chảy dọc dài trên vỏ cây, lấy nƣớc lơ lửng trên không khí, hơi sƣơng và hơi nƣớc, giúp cây bám chặt vào giá thể, không bị gió cuốn. Một số loài có lá kém phát triển thậm chí tiêu giảm hoàn toàn, có hệ rễ chứa diệp lục tố giúp cây hấp thụ ánh sáng cần thiết cho sự ra hoa và quang hợp [14]. Nếu rễ quá ít, cây sẽ không đủ nƣớc, không bám cành cây hốc đá đƣợc, hoa sẽ không nhiều và không đẹp. Nếu rễ không mọc đƣợc, bị thối, bị bệnh hay bị chết, cây sẽ thiếu nƣớc, thiếu chất bổ dƣỡng cây sẽ còi cọc và sẽ chết dần chết mòn. Rễ của lan Dendrobium không chịu đƣợc lạnh, nếu bị lạnh trong thời gian dài, rễ cây sẽ bị mục nát và cây sẽ chết [9]. 9
  20. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.3. Rễ lan Giả Hạc (Nguồn:  Thân lan Lan có 2 loại thân: đa thân và đơn thân. Ở các loài lan sống phụ có nhiều đoạn phình lớn thành củ giả (giả hành). Đó là bộ phận dự trữ nƣớc và các chất dinh dƣỡng để nuôi cây trong điều kiện khô hạn khi sống bám trên cao. Mầm hoa và mầm lá đều mọc từ phần gốc của bộ phận thân rễ. Củ giả rất đa dạng: Hình cầu hoặc hình thuôn dài xếp sát nhau hay rải rác đều đặn hoặc hình trụ xếp chồng chất lên nhau thành một thân giả. Cấu tạo củ giả: Gồm nhiều mô mềm chứa đầy dịch nhầy, phía ngoài là lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ, tránh sự mất nƣớc do trời nóng. Đa số củ giả đều có màu xanh bóng, nên cùng với lá nó làm nhiệm vụ quang hợp. 10
  21. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.4. Thân lan Giả Hạc (Nguồn:  Lá lan Hầu hết các loài phong lan là cây tự dƣỡng, nó phát triển đầy đủ hệ thống lá. Hình dạng của lá thay đổi rất nhiều, từ loại lá mọng nƣớc đến loại lá phiến mỏng. Phiến lá trải rộng hay gấp lại theo các gân vòng cung hay chỉ gấp lại theo gân hình chữ V. Màu sắc lá thƣờng xanh bóng, nhƣng có trƣờng hợp 2 mặt lá khác nhau. Thƣờng mặt dƣới có màu xanh đậm hay tía, mặt trên lại khảm nhiều màu sặc sỡ. Hình 1.5. Lá lan giả hạc (Nguồn: 11
  22. Đồ án tốt nghiệp  Hoa lan Cấu trúc của một đóa hoa lan thực là độc nhất vô nhị trong số các loài thực vật có hoa. Hoa không những mọc trên những giả hành mới mà còn mọc trên các giả hành cũ. Trên cánh có phủ lông mịn và có ánh kim, hƣơng thơm ngào ngạt. Hoa mọc từ các mắt ngủ giữa các đọt lá trên thân gần ngọn và cả trên ngọn cây. Sự biểu hiện trƣớc khi ra hoa khác biệt nhƣ có nhiều loài rụng hết lá trƣớc khi ra hoa. Thời gian ra hoa đầu mùa mƣa hay đầu tết. Giống Dendrobium anosmum khi đủ dinh dƣỡng thì cho hoa thành từng chùm, phát hoa dài và thời gian ra hoa trung bình 1 – 2 tháng [14]. Hoa lan tiêu biểu có 3 cánh phía ngoài, 3 cánh phía trong và một trụ nhụy hoa ở giữa. Phía ngoài cùng là 3 cánh đài, trong đó một cánh đài phía trên hay phía sau của hoa gọi là lá đài lý và hai cánh đài ở 2 bên gọi là lá đài cạnh. Ba cánh đài giống nhau về hình dạng, kích thƣớc, màu sắc. Hầu hết các giống lan, lá đài có cùng kích thƣớc và giống nhƣ cánh hoa. Tuy nhiên, trong một số giống, lá đài lý trở nên to lớn và lòe loẹt, 2 lá đài cạnh thấp ở hai bên đôi khi hợp nhất lại thành ra một, và trong những giống khác tất cả 3 lá đài hợp nhất thành kết cấu hình chuông chung quanh hoa. Trong một vài giống, các lá đài hoàn toàn lấn áp hoa thật. Nằm kề bên trong và xen kẽ với 3 cánh đài là 3 cánh hoa. Cánh hoa bảo vệ bao bọc nụ hoa. So với 2 cánh hoa hai bên sƣờn, cánh hoa phía dƣới còn lại gọi là cánh môi. Cánh môi đôi khi đặc biệt to lớn khác hẳn với 2 cánh kia. Cánh môi thƣờng sặc sỡ, viền cánh hoa dợn sóng hoặc dƣới dạng một cái túi, trang hoàng với những cái mũ mào (nhƣ mào gà), những cái đuôi, cái sừng, những nốt màu, những cái lông, Cánh môi quyết định giá trị thẩm mỹ của hoa lan. Trong một số trƣờng hợp, cánh môi còn là một cái bẫy dụ dỗ các côn trùng giúp thụ phấn. Trụ nhụy hoa mang phần đực ở phía trên và phần cái ở phía trƣớc mặt. Nhị gồm hai phần bao phấn và hốc phấn. Bao phấn nằm ở cột nhị nhụy còn hốc phấn thì 12
  23. Đồ án tốt nghiệp lõm lại mang khối phấn và thƣờng song song với bao phấn. Khối phấn gồm toàn bộ hạt phấn dính lại với nhau, rất cứng. Hình 1.6. Hoa lan Giả Hạc (Nguồn:  Quả và hạt lan Sự tạo quả của hoa lan trong tự nhiên rất khó do cấu tạo đặc biệt của hoa và thƣờng phải nhờ côn trùng. Quả lan thuộc loại quả nang, quả có dạng cải dài đến hình trụ ngắn phình ở giữa. Khi chín quả nở ra theo 3 đến 6 đƣờng nứt dọc, mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía đỉnh và phía gốc. Ở một số loài, khi chín quả không nứt ra nên hạt chỉ ra khỏi quả khi quả bị mục nát [9]. Bên trong chứa rất nhiều hạt, nhỏ li ty, phải trải qua 2 – 18 tháng hạt mới chín khi chín hạt có màu vàng. Hạt cấu tạo bởi một khối chƣa phân hóa, trên một mạng lƣới nhỏ xốp chứa đầy không khí, toàn bộ hạt trong một quả nặng chỉ bằng một phần mƣời đến một phần nghìn và hầu nhƣ không có trọng lƣợng mg [19], rất nhẹ nên dễ phát tán nhờ gió. Thông thƣờng, cần có nấm cộng sinh hỗ trợ các chất cần thiết để hạt lan nảy mầm, đặc biệt ở đầu các giai đoạn phát triển [7]. 13
  24. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.7. Quả lan Giả Hạc (Nguồn: 1.3.4. Điều kiện sinh trưởng của lan Dendrobium anosmum  Ánh sáng Ánh sáng rất cần thiết cho sự tăng trƣởng, phát triển của cây lan. Ánh sáng đem lại năng lƣợng cần thiết cho phản ứng quang tổng hợp [19]. Lan Giả hạc cần nhiều ánh sáng gần nhƣ có thể để ở ngoài trời, nhƣng cần phải có lƣới che phòng khi lá non bị cháy nắng. Khi thấy cây quặt quẹo, đó là dấu hiệu thiếu nắng. Hãy đƣa cây ra chỗ có nhiều nắng hơn. Nhất là vào mùa đông, nếu thiếu nắng cây khó lòng ra hoa.  Nhiệt độ Nhiệt độ là nhân tố có tính chất quyết định đến sự phân bố các loài lan trên thế giới và sự sinh trƣởng phát triển của các loài lan [8]. Lan Giả hạc cần nuôi trong nhiệt độ từ 40 – 80°F hay 8 – 25°C. Tuy nhiên lan có thể chịu nóng tới 100°F hay 38°C và có thể chịu lạnh tới 38°F hay 3,3°C. Ngoài ra nếu vào mùa đông không lạnh dƣới 50°F hay 15,6°C trong vòng 4 – 6 tuần lan sẽ khó lòng ra nụ.  Độ ẩm Độ ẩm cũng là yếu tố ảnh hƣởng rất lớn đến sinh trƣởng, phát triển của các loài lan. Nếu thiếu nƣớc quá trình quang hợp và hô hấp ngừng trệ [8]. 14
  25. Đồ án tốt nghiệp Lan Giả Hạc mọc mạnh nếu ẩm độ từ 60 – 70%. Nếu quá thấp cây non sẽ không lớn đƣợc và bị teo đi. Cây cũng không mọc mạnh nếu không thoáng gió và trong thời kỳ lan ra nụ nếu không thoáng gió nụ sẽ ít đi.  Vật liệu trồng Nên trồng với những vật liệu lâu mục và dễ thoát nƣớc nhƣ vỏ thông, vỏ dừa, đá v.v cũng có thể trồng vào những vật liệu bằng sơ dừa, bó vào dớn, vào các khúc gỗ. Có thể trồng trong chậu nhƣng phải để chậu nằm và đặc biệt chậu phải thoát nƣớc tốt, rất nhiều ngƣời cũng trồng Giả Hạc trong chậu, họ khoét một lỗ để cây thòng xuống. Đặc biệt Giả Hạc ƣa sống trong các chậu nhỏ, có diện tích chật chội cho nên đừng dùng chậu quá lớn.  Tƣới nƣớc Vào mùa hè khi lan ra mầm non và mọc mạnh, tƣới 2 – 3 lần một tuần. Vào mùa thu, khi cây đã ngừng tăng trƣởng, nên tƣới nƣớc thƣa đi. Mỗi tuần chỉ cần tƣới 1 lần cho thân cây khỏi bị teo lại. Vào mùa đông, đây là thời gian lan chuẩn bị để ra hoa, ngƣng hẳn việc tƣới nƣớc. Nếu ẩm độ quá thấp nên phun sƣơng mỗi tháng 1 – 2 lần.  Độ thông thoáng Sự thông gió, đặc biệt quan trọng đối với loài đơn thân hơn là đa thân. Do cấu trúc đã thích nghi với điều kiện khí hậu, các loài đơn thân thƣờng có rễ trên không mọc thẳng từ thân và lơ lửng trong không khí. Trong rừng, các loại đơn thân có thể móc vắt vẻo từ cành này sang cành khác và các rễ rủ xuống lơ lửng trong không khí hay bám vào các cành cây [14]. Độ thông thoáng cũng là yếu tố rất cần thiết cho cây lan sinh trƣởng. Lƣợng CO2 trong không khí khoảng 0,03%, trên mặt lá lƣợng CO2 thƣờng xuyên bị giảm nhiều vì liên tục bị cây hấp thu do vậy không khí cần liên tục thay đổi để cân bằng lƣợng CO2 ở trên mặt lá [19]. 15
  26. Đồ án tốt nghiệp Yêu cầu độ thông thoáng tùy thuộc vào loài lan, các loài phong lan thƣờng yêu cầu thông gió cao, do vậy trong điều kiện tự nhiên lan thƣờng mọc trên các cây cao, ở tầng giữa của rừng. Sự thông gió rất quan trọng đối với các loài lan đơn thân, vì hầu hết các loài này đều có rễ mọc thẳng từ thân và lơ lửng trong không khí [19].  Bón phân Lan Giả Hạc không ƣa phân bón có nhiễu chất Nitrogen cho nên bón với phân 15:15:15 cho đến tháng 9, từ tháng 9 đến tháng 11 bón với phân 10:30:10. Từ tháng 12 cho đến hết tháng giêng ngƣng hẳn việc bón phân. Nếu tiếp tục bón hoặc phân bón có nhiều chất Nitrogen quá, cây sẽ ra cây con (keiki) thay vì ra nụ.  Sâu bệnh và các vấn đề khác Lan cũng giống nhƣ các cây trồng khác là đối tƣợng tấn công của nhiều loại sâu bệnh. Một môi trƣờng không khí sạch sẽ cùng với một độ ẩm thích hợp, ánh sáng phù hợp và ấm áp thì chắc chắn sẽ mang lại sự tƣơi tốt cho cây trồng. Tuy nhiên, ở những điều kiện tốt nhất thì sâu bệnh cũng có thể tấn công [7]. Việc bón phân hữu cơ hay dùng giá thể xơ dừa (sẽ mục nát sau một thời gian ngắn) là nguyên nhân chủ yếu gây nhiều sâu bệnh hại nhƣ gián, rệp, côn trùng cắn phá, nấm và virut, [9]. 1.3.5. Giá thể trồng lan (compost) Ngƣời ta trồng Dendrobium anosmum với nhiều vật liệu khác nhau nhƣ: mảnh cây dƣơng sỉ, cành cây, mảnh gỗ hay trong chậu với vỏ thông, vỏ dừa v.v nhƣng tốt hơn cả là trồng trong chậu gỗ và treo lên bởi vì cây cần thoáng gió và thoáng gốc. Trồng Phong lan ta phải sử dụng đến giá thể. Giá thể là những chất liệu dùng đế cải thiện độ ẩm là chính, còn cung cấp chất dinh dƣỡng cho lan chỉ là việc phụ, không đáng kể. Theo Nguyễn Công Nghiệp (2004) và Nguyễn Thị Mỹ Duyên (2006), thì có các loại giá thể trồng lan và đặc tính của từng loại nhƣ sau: 16
  27. Đồ án tốt nghiệp Than gỗ: trồng lan bằng những thanh than gỗ ngắn, với kích cỡ khoảng 4 – 5 cm. Đặc tính của than gỗ là hút nƣớc và giữ ẩm đƣợc lâu. Nên chọn loại than xốp, với than chắc quá nhƣ than đƣớc không nên dùng vì khả năng giữ ẩm kém. Than không mục nhƣ gỗ, cũng không có mầm bệnh nên giới nghệ nhân trồng lan không ai chê thứ giá thể quí giá này. Xơ dừa: dừa là thổ sản của nƣớc mình nên xơ dừa gần nhƣ không cần phải mua, mà mua cũng với giá rẻ. Khi cần dùng đến quanh năm lúc nào cũng có. Xơ dừa làm giá thể để trồng lan chính là vỏ của trái dừa khô. Xơ dừa đƣợc tách ra thành từng mảng lớn, tuỳ theo nhu cầu mà nhà vƣờn để nguyên miếng, hoặc xé ra, chặt khúc ra để sắp xếp trồng lan trên vạt tre hoặc cho vào chậu. Xơ dừa hút ẩm rất tốt, tốt hơn cả than gỗ, nhƣng khuyết điểm là mau mục và là nơi đeo bám lý tƣởng của rêu và cỏ dại. Trong xơ dừa có chất tanin là chất chát, vì vậy trƣớc khi dùng ta nên ngâm nƣớc nhiều ngày, sau đó vớt ra phơi khô, rồi cẩn thận hơn nên phun thuốc trừ sâu bệnh, Gạch: gạch là chất hút nƣớc tốt, giữ ẩm cao. Gạch đƣợc nung chín xốp vừa nhẹ vừa hút nƣớc nhiều. Khi dùng làm giá thể, gạch đƣợc đập vụn ra từng thanh nhỏ khoảng 3 – 5 cm. Khuyết điểm của gạch là dễ mọc rêu và nặng, vì vậy ít ai trồng lan với giá thể là gạch không thôi, mà trộn lẫn với vài giá thể khác nhƣ than gỗ hay vỏ cây hoặc xơ dừa, mỗi thứ một ít. Vỏ cây: trong các loại cây nhƣ vú sữa, sao, me, thông, thì vỏ thông là loại vỏ cây đƣợc ƣa chuộng nhất vì trong vỏ thông có chất resin là chất sát khuẩn cao, lâu mục, không đóng rêu, ít có mầm bệnh nên trồng lan rất tốt. Cây lan đƣợc trồng bằng vỏ cây thời gian đầu phát triển tốt. Sau 1 năm vỏ bị phân huỷ thành mùn, gây úng nƣớc, thối rễ và cũng là môi trƣờng thích hợp cho sự xuất hiện một số loài côn trùng cắn phá rễ. Vì vậy khi trồng bằng vỏ cây, cây lan phải đƣợc thay chậu thƣờng xuyên. Dớn: dớn là chất liệu làm giá thể trồng lan mới đƣợc sử dụng gần đây thôi. Dớn là chất trồng đƣợc lấy từ thân và rễ của cây Dƣơng xỉ. Giống cây thảo này 17
  28. Đồ án tốt nghiệp đƣợc mọc nhiều ở cao nguyên Đà Lạt. Ƣu điểm của dớn là giữ ẩm tốt. Có hai loại dớn: dớn sợi và dớn vụn - Thứ đƣợc ƣa chuộng nhất là dớn sợi do thân rễ cây dƣơng xỉ già tạo nên. Dớn sợi thích hợp cho việc trồng lan xứ nóng vì nó có độ thông thoáng. - Dớn vụn: Là loại thứ cấp của dớn do các phần vỏ, lá, rễ của dớn sau khi khai thác sợi bị nát vụn ra. Loại này sử dụng trồng lan rất tốt ở vùng lạnh vì độ hút ẩm cao, thiếu thoáng khí nên nhiệt độ trong chậu cao hơn bên ngoài. Tuy nhiên ở vùng nhiệt đới Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) không nên dùng loại dớn này, vì nhiệt độ cao và ẩm độ thấp, nên phải tƣới nƣớc nhiều, dớn vụn bị bít dễ làm thối rễ lan. Ngoài ra điều kiện nóng ẩm rất thuận lợi cho một số loại côn trùng và nấm bệnh chọn dớn làm mục tiêu cắn phá. Rong biển: rất đƣợc ƣa chuộng đối với lan Hồ điệp. Tuy nhiên, loại giá thể này hút nƣớc nhiều và giữ ẩm cao nên hết sức cẩn thận khi sử dụng. Rễ lục bình: có khắp nơi và rất dễ kiếm. Rễ lục bình có độ hút ẩm cao, có nhiều đạm giúp cây ra rễ và tăng trƣởng rất mạnh trong thời gian đầu, nhƣng dễ bị mục rã nên mắc các khuyết điểm nhƣ xơ dừa và dớn vụn. Phụ phẩm nông nghiệp: vỏ hạt cà phê, vỏ đậu phộng, vỏ hạt điều. 1.3.6. Giá trị sử dụng cây lan Giả Hạc Dendrobium anosmum Với tính chất khí hậu cận nhiệt đới gió mùa nhƣ ở Việt Nam, có thể trồng đƣợc đa dạng giống hoa khác nhau nhƣ Dendrobium, Mokara, Cattleya, Hồ điệp Nhƣng trong đó lan Dendrobium đƣợc trồng nhiều nhất vì không chỉ mang lại giá trị thẩm mỹ và kinh tế, bên cạnh đó Dendrobium còn đƣợc sử dụng để tách chiết phục vụ cho một số ngành công nghiệp mỹ phẩm. Ngoài ra, loài hoa này cũng mang ý nghĩa nhất định đối với y học [10]. Chẳng hạn chỉ với loại hoa chủ lực là Dendrobium, Thái Lan đã xuất khẩu đạt doanh thu gần 600 triệu USD mỗi năm. Theo thống kê của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ, năm 2000, tổng sản lƣợng lan bán ra thị trƣờng đạt xấp xỉ 100.000.000 USD, trong đó Phairaenopsis chiếm 75% (Griesbach, R.J. 2002). Bên cạnh đó, ở các 18
  29. Đồ án tốt nghiệp nƣớc phát triển nhƣ: Anh, Mỹ, Đức, Ý, Singgapore, Hồng Kông, đều nhập khẩu rất nhiều phong lan. Việt Nam chúng ta cũng có nhiều triển vọng kinh doanh xuất khẩu phong lan. 1.4. Tổng quan về nuôi cấy mô thực vật 1.4.1. Khái niệm “Nuôi cấy mô - tế bào thực vật” – là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các loại vi sinh vật, trên môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng [1]. Nuôi cấy mô (tissue culture) là thuật ngữ để chỉ quá trình nuôi cấy vô trùng in vitro các bộ phận tách rời khác nhau của thực vật. Nhân giống in vitro đƣợc sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thƣớc nhỏ, sinh trƣởng ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi cấy khác. Phƣơng pháp nhân giống in vitro thực chất là một tiến bộ vƣợt bậc của các phƣơng pháp nhân giống vô tính cổ điển nhƣ giâm cành, chiết, ghép, Ở đây giá trị thực tiễn của các tiến bộ khoa học kỹ thuật là đã biến những phƣơng thức cổ điển đó thành những phƣơng thức hoàn toàn mới về chất, cho phép giải quyết những khó khăn mà phƣơng pháp cổ điển không thể vƣợt qua [1]. 1.4.2. Một số phương pháp nuôi cấy mô [1] 1.4.2.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Phƣơng thức này sử dụng các bộ phận nhỏ nhất của đỉnh chồi hay đỉnh sinh trƣởng làm mẫu vật nuôi cấy. Nó bao gồm mô phân sinh đỉnh và các phần lá non. Một đỉnh sinh trƣởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ tạo một hay nhiều chồi và mỗi chồi sẽ phát triển thành một cây hoàn chỉnh. Xét về nguồn gốc của các cây đó, có các khả năng: - Cây phát triển từ chồi đỉnh. 19
  30. Đồ án tốt nghiệp - Cây phát triển từ chồi nách phá ngủ. - Cây phát triển từ chồi mới phát sinh. - Phát triển cây trực tiếp: chủ yếu ở các đối tƣợng hai lá mầm nhƣ khoai tây, thuốc lá, cam chanh: mầm (đỉnh sinh trƣởng) chồi nách cây. - Phát triển thông qua giai đoạn protocorm: chủ yếu gặp ở các đối tƣợng một lá mầm nhƣ: phong lan, dứa, huệ, cùng một lúc đỉnh sinh trƣởng tạo hàng loạt protocorm và các protocorm này có thể tiếp tục phân chia thành các protocorm mới hoặc phát triển thành cây hoàn chỉnh. Bằng phƣơng thức này trong một thời gian ngắn ngƣời ta có thể thu đƣợc hàng triệu cá thể. - Ghép đỉnh chồi hay vi ghép: về nguyên tắc, vi ghép là nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng nhƣng thông qua dinh dƣỡng tự nhiên của gốc ghép. Đỉnh sinh trƣởng dùng làm mắt ghép có kích thƣớc từ 0,2 – 0,5 mm, đƣợc tách từ búp non đang sinh trƣởng mạnh của cây mẹ trƣởng thành, gốc ghép là mầm giả mới nảy mầm từ hạt của giống hoang dại, toàn bộ cây ghép đƣợc nuôi dƣỡng trong điều kiện ống nghiệm vô trùng. Phƣơng thức này thƣờng dùng để tạo ra các giống cây ăn quả sạch bệnh virus nhằm cung cấp mắt ghép và cành chiết đầu dòng làm nguyên liệu nhân giống cho sản xuất đại trà. Phƣơng thức này cho phép thu đƣợc cây hoàn toàn sạch bệnh và mang đặc điểm di truyền của cây mẹ cho mắt ghép. 1.4.2.2. Nuôi cấy mô sẹo Trong điều kiện môi trƣờng nuôi cấy có chứa nhiều Auxin, mô sẹo đƣợc hình thành từ mặt cắt của thân hay rễ, bao gồm tế bào nhu mô và thành phần tế bào rây (Esau, 1977). Mô sẹo hình thành ở hầu hết các bộ phận của cây (thân, lá, rễ), khi nơi đó có vết cắt (Street, 1969). Mô sẹo là một khối tế bào phát triển không có định hƣớng, có hình dạng không nhất định. Đặc tính của mô sẹo là mô sẹo phát triển không theo quy luật nhƣng có khả năng biệt hóa thành rễ, chồi và phôi để có thể hình thành cây hoàn chỉnh [11]. Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống nhƣ cây mẹ và từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc cho nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng, tuy nhiên, mức độ biến dị tế bào soma rất cao. 20
  31. Đồ án tốt nghiệp 1.4.2.3. Nuôi cấy tế bào đơn Khối mô sẹo đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng và đƣợc đặt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp. Khối mô sẹo dƣới tác dụng của cơ học và các hóa chất hỗ trợ tách ra nhiều tế bào riêng lẻ gọi là tế bào đơn. Tế bào đơn đƣợc lọc và nuôi cấy trên môi trƣờng đặc biệt và tăng sinh khối. 1.4.2.4. Nuôi cấy tế bào trần (protoplast) Nuôi cấy protoplats là phƣơng pháp dùng enzym hoặc hóa chất để thuỷ phân thành tế bào và tách đƣợc protoplast. Trong điều kiện nuôi cấy phù hợp protoplast có thể tái sinh thành tế bào mới, phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Do không có thành tế bào nên protoplast trở thành một đối tƣợng lý tƣởng trong nghiên cứu biến đổi di truyền ở thực vật. Bằng phƣơng pháp dung hợp hai protoplast có thể tạo ra các cây lai soma. Ngoài ra còn có thể sử dụng kỹ thuật dung hợp protoplast để chuyển các bào quan và chuyển gene. 1.4.2.5. Nuôi cấy hạt phấn Nuôi cấy bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy in vitro. Bao phấn chứa các bào tử hoặc hạt phấn chƣa chín trong môi trƣờng dinh dƣỡng xác định nhằm mục đích tạo cây đơn bội. Nuôi cấy bao phấn đƣợc ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong việc tạo ra các dòng, giống thuần ở các cây tự thụ phấn. 1.4.3. Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro Ƣu điểm [1]: - Phƣơng pháp đƣợc tiến hành trong điều kiện vô trùng nên cây giống tạo đƣợc sẽ không bị nhiễm bệnh từ môi trƣờng bên ngoài. - Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: có thể sản xuất đƣợc số lƣợng cây con lớn trong thời gian ngắn. - Sản phẩm cây giống đồng nhất: Vi nhân giống về cơ bản là công nghệ nhân dòng nên nó tạo ra các cây con có độ đều cao và có tính di truyền từ cây mẹ - Tiết kiệm không gian: Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng thí nghiệm, các vật liệu ban đầu có kích thƣớc nhỏ. 21
  32. Đồ án tốt nghiệp - Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phƣơng pháp truyền thống. - Sản xuất quanh năm: Quá trình sản xuất có thể tiến hành vào bất kỳ thời gian nào, không phụ thuộc mùa vụ. - Chủ động trong việc điều chỉnh các yếu tố tăng trƣởng, nhiệt độ, độ ẩm giúp tối ƣu hóa khả năng nhân giống phù hợp cho từng loại cây. Nhƣợc điểm [4]: - Tính bất định về mặt di truyền: mặc dù kỹ thuật nhân giống in vitro đƣợc sử dụng nhằm mục đích tạo ra quần thể cây trồng đồng nhất với số lƣợng lớn nhƣng phƣơng pháp cũng tạo ra những quần thể biến dị tế bào soma qua nuôi cấy mô sẹo và nuôi cấy tế bào đơn. - Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không phải tất cả cây trồng đều đƣợc nhân giống bằng phƣơng pháp in vitro. Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chƣa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thƣơng mại hoặc bảo quản nguồn gen. - Chi phí sản xuất cao, trang thiết bị hiện đại. - Vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo. - Cây con sinh ra có thể có kích thƣớc nhỏ và đôi khi xuất hiện những dạng cây không nhƣ ý muốn. - Những vấn đề cần lƣu ý trong phƣơng pháp nhƣ: Sự nhiễm mẫu và hoại mẫu. Các độc tố sản sinh từ trong mô nuôi cấy. Hiện tƣởng thủy tinh hóa. 22
  33. Đồ án tốt nghiệp 1.5. Các chất hữu cơ tự nhiên đƣợc bổ sung vào trong quá trình nuôi cấy in vitro Dịch chiết hữu cơ có thể kích thích có hiệu quả qua việc cung cấp các thành phần dinh dƣỡng acid hữu cơ không xác định và các thành phần có tác dụng nhƣ chất kích thích sinh trƣởng [11]. 1.5.1. Nƣớc dừa [22] Công bố đầu tiên về sử dụng nƣớc dừa trong nuôi cấy mô thuộc về Van Overbreek và cs (Van Ovebreek cs, 1941). Nƣớc dừa đã đƣợc xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, các axit amin, đƣờng. Đặc biệt trong nƣớc dừa có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy in vitro đó là: Myo-inositol, các hợp chất có hoạt tính Auxin, các glucoside của Cytokinin. Nƣớc dừa đã đƣợc sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây. Nƣớc dừa thƣờng đƣợc lấy từ quả dừa để sử dụng tƣơi hoặc sau bảo quản. Thông thƣờng nƣớc dừa thƣờng đƣợc xử lý để loại trừ protein, sau đó đƣợc lọc qua màng lọc để khử trùng trƣớc khi bảo quản lạnh. Tồn dƣ của protein trong nƣớc dừa không gây ảnh hƣởng đến sinh trƣởng của mô hoặc tế bào nuôi cấy, nhƣng sẽ dẫn đến kết tủa dung dịch khi bảo quản lạnh. Chất cặn có thể đƣợc lọc hoặc để lắng rồi gạn bỏ phần cặn. Nƣớc dừa thƣờng sử dụng với nồng độ 5 – 20% thể tích môi trƣờng, kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi. 1.5.2. Chuối [38] Chuối là chất hữu cơ có tác động mạnh nhất lên quá trình tăng trƣởng, tạo chồi và số chồi trong nhóm chuối, khoai tây và nƣớc dừa. Thành phần hóa học có đƣờng, axit nucleic, axit amin, vitamin, khoáng 1.5.3. Độ pH và Agar [38] pH của môi trƣờng ảnh hƣởng trực tiếp đến khả năng thu nhận các chất dinh dƣỡng từ môi trƣờng vào tế bào. pH của môi trƣờng nuôi cấy thích hợp cho đa số các loại cây trồng dao động từ 5,5 – 6,0. Nếu pH thấp thì agar sẽ không đông sau 23
  34. Đồ án tốt nghiệp khi hấp khử trùng. Khi pH 7 thì sẽ làm kết tủa một số muối vô cơ và phân giải một số chất hữu cơ sẽ làm chết cây. Trong môi trƣờng nuôi cấy đặc, ngƣời ta thƣờng sử dụng agar để làm rắn hóa môi trƣờng. Ở 80oC thạch ngậm nƣớc chuyển sang trạng thái sol còn ở 40oC thì trở về trạng thái gel. Nồng độ agar sử dụng thƣờng là 0,6 – 1%, đây là loại tinh bột đặc chế từ rong biển để tránh hiện tƣợng mô chìm trong môi trƣờng hoặc bị chết vì thiếu oxi nếu môi trƣờng lỏng và tĩnh. 1.5.4. Pepton [38] Peptone còn đƣợc gọi là cao thịt, chứa các chất đạm hữu cơ, đƣờng, muối khoáng và các vitamin, đƣợc thủy phân bằng Protease, hoặc bằng các Acid sau đó cô lại (làm khô) thành dạng bột. Peptone đƣợc sử dụng nhƣ là một nguồn nitơ hữu cơ trong môi trƣờng nuôi cấy mô. 1.6. Các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật đƣợc bổ sung Năm 1926, F. W. Went ở Hà Lan lần đầu tiên nghiên cứu một nhóm chất gọi là Auxin. Đây là nhóm chất điều hòa sinh trƣởng thực vật (CĐHSTTV) đầu tiên đƣợc xác định (Tomic và cs, 1998). CĐHSTTV đƣợc xem là một hợp chất hữu cơ hiện diện trong cây và hoạt động với một lƣợng nhỏ có tác dụng điều khiển sự tăng trƣởng và các chức năng khác nhau. Các chất này gồm các phytohormone đóng vai trò điều hòa sinh trƣởng và phát triển của thực vật bao gồm tái sinh các thực vật từ những tế bào và mô tách rời. Về đại cƣơng, các chất này đƣợc chia thành hai nhóm có tác dụng đối kháng về sinh lý: các chất kích thích sinh trƣởng và các chất ức chế sinh trƣởng. Trong nuôi cấy in vitro, thƣờng sử dụng hai nhóm chính có vai trò cơ bản là Auxin và Cytokinin. Ngoài hai nhóm chất căn bản trên, các chất điều hòa khác có thể cần thiết nhƣng phần lớn chúng chỉ kích thích hoặc thuận lợi cho mô và hiếm khi là chất thiết yếu [20]. 24
  35. Đồ án tốt nghiệp 1.6.1. Cytokinin Mô phân sinh ngọn rễ là nơi tổng hợp chủ yếu các Cytokinin tự do cho cả cơ thể thực vật. Các Cytokinin có tác dụng kích thích sự phân bào và phân hóa chồi. Trong môi trƣờng nuôi cấy tỷ lệ Auxin/Cytokinin quyết định sự phân chia tế bào, phân hóa chồi từ mô sẹo, tạo phôi vô tính. Cytokinin gồm có kinetin, BAP, zeatin, TDZ. Vai trò sinh lý của Cytokinin - Hoạt hóa sự phân chia tế bào. - Hình thành chồi và kích thích mạnh mẽ sự phân hóa chồi. - Kìm hãm sự già hóa và kéo dài tuổi thọ của cây. - Phân hóa giới tính cái, tăng tỷ lệ hoa cái. - Kích thích sự nảy mầm của hạt, củ. 1.6.2. Auxin Auxin đƣợc xem là hormone thực vật quan trọng nhất vì chúng có vai trò rất cơ bản trong quá trình phối hợp sinh trƣởng và biệt hóa tế bào cần thiết cho sự phát triển bình thƣờng của thực vật. Auxin đƣợc tổng hợp chủ yếu ở đỉnh ngọn chồi và từ đó đƣợc vận chuyển xuống dƣới (hƣớng gốc). Ngoài đỉnh ngọn, các cơ quan khác nhƣ lá non, quả non, phôi hạt đang sinh trƣởng và cả tầng phát sinh cũng có khả năng tổng hợp Auxin. Auxin có tác dụng tốt đến các quá trình sinh trƣởng của tế bào, hoạt động của tầng phát sinh, sự hình thành rễ, hiện tƣợng ƣu thế ngọn, tính hƣớng động của thực vật, sự sinh trƣởng của quả và tạo ra quả không hạt Auxin kích thích sự sinh trƣởng giãn của tế bào. Nhƣng nếu kích thích với hàm lƣợng quá cao, tác dụng quá mạnh sẽ xảy ra hiện tƣợng ức chế ngƣợc trở lại, lúc này Auxin sẽ trở thành chất ức chế. Trong nuôi cấy mô thực vật, Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần dinh dƣỡng khác trong môi trƣờng nuôi cấy để kích thích sự tăng trƣởng của mô sẹo, 25
  36. Đồ án tốt nghiệp NAA và IBA đƣợc sử dụng phổ biến thay cho 2,4-D vì hạn chế đƣợc hiện tƣợng đột biến. Auxin còn là yếu tố ngăn cản sự tổng hợp diệp lục tố. 1.6.3. Sự kết hợp giữa Auxin và Cytokynin Sự kết hợp giữa Auxin và Cytokynin trong môi trƣờng nuôi cấy với những tỷ lệ nhất định có vai trò rất quan trọng trong sự biệt hóa tạo mô sẹo, hình thành cơ quan chồi, rễ, cho từng loại cây nhất định. Một cách hệ thống, ngƣời ta có thể chấp nhận là tính chất về sinh lý của một mô lúc đƣợc nuôi cấy sẽ nhƣ sau (theo Skoog): nếu tỷ lệ Auxin/Cytokinin cao, ngƣời ta sẽ thu đƣợc chức năng sinh tạo rễ; nếu tỷ lệ Auxin/Cytokinin thấp, mô sẽ phát triển về chức năng sinh tạo thân; và nếu tỷ lệ này gần một ngƣời ta sẽ thu đƣợc mô sẹo. Theo Kaminek và cs (1997) có thể Auxin ảnh hƣởng lên hoạt động của Cytokinin trong tế bào thực vật bằng cách điều hòa thuận quá trình sinh tổng hợp và phát huy sự thoái hóa của Cytokinin. Dominov và cs (1992) nhận thấy Cytokinin kích thích Auxin đáp ứng bằng cách làm tế bào nhạy cảm hơn hoặc bằng cách khóa kìm hãm ngƣợc của đáp ứng Auxin. Sự kết hợp tạo nên tác động hỗ trợ hay kìm hãm giữa hai loại hormone này là một yếu tố quan trọng giúp kiểm soát sự phát triển. 1.7. Tổng quan về đèn [39] Trồng cây có thể không cần đất nhƣng nhất định không thể thiếu ánh sáng. Mặc dù ánh sáng mặt trời là nguồn sáng lý tƣởng nhất cho sự phát triển của cây trồng, chúng ta vẫn có thể sử dụng ánh sáng nhân tạo có quang phổ màu thích hợp để thay thế cho ánh sáng mặt trời. Nguồn ánh sáng đang đƣợc sử dụng thông dụng trong nuôi cấy in vitro hiện nay là ánh sáng huỳnh quang. Trong nền nông nghiệp công nghệ cao, nhân giống nuôi cấy mô là lĩnh vực đặc biệt quan trọng nhằm tạo ra các giống cây tốt, mạnh khỏe sạch bệnh, đem lại hiệu quả về năng suất. Ở Việt Nam có hàng trăm phòng nuôi cấy mô để sản xuất cây giống bao gồm cây hoa cảnh, cây lâm nghiệp, cây nông nghiệp. Nhiều lĩnh vực 26
  37. Đồ án tốt nghiệp sản xuất ở Việt Nam bắt buộc phải sử dụng cây nuôi cấy mô nhƣ sản xuất cây giống hoa, cây lâm nghiệp. Vấn đề đặt ra là cần phải có các nguồn sáng chuyên dụng vừa tiết kiệm năng lƣợng vừa cho kết quả nhân giống tốt. Đèn huỳnh quang sử dụng trong các phòng nuôi cấy mô hiện nay chỉ phù hợp cho mục đích chiếu sáng thông thƣờng (phổ ánh sáng thích hợp theo mắt ngƣời có bƣớc sóng tập trung trong khoảng 500 – 600 nm), trong khi vùng ánh sáng đỏ là vùng diệp lục hấp phụ quan trọng nhất cho quang hợp thì rất thiếu. Vì thế, đèn LED đang dần đƣợc thay thế đèn huỳnh quang trong nguồn chiếu sáng nhƣ vi nhân giống [31]. 1.7.1. Vai trò của nguồn chiếu sáng đến sự phát triển của cây giống in vitro Chất lƣợng ánh sáng (chất lƣợng quang phổ), số lƣợng (photon thông lƣợng) và thời gian chiếu sáng có ảnh hƣởng sâu sắc đến sự phát triển và phát sinh hình thái của các mô nuôi cấy [21], [30]. Ánh sáng là yếu tố quan trọng trong sự sinh trƣởng của thực vật: ánh sáng tác động đến quá trình quang hợp, quang phát sinh hình thái (hiện tƣợng đóng mở khí khổng, ƣu thế ngọn, ra hoa ) và đáp ứng hƣớng sáng. Sự đáp ứng này phụ thuộc vào cƣờng độ ánh sáng, chất lƣợng ánh sáng (quang phổ ánh sáng, quang kì, hƣớng chiếu sáng) và thời gian chiếu sáng [32]. Việc nắm vững tác động của ánh sáng đến quá trình sinh lý thực vật có thể điều khiển đƣợc sự sinh trƣởng và phát triển của cây trồng trong nhà kính cũng nhƣ trong điều kiện in vitro. Nhiều nghiên cứu cho thấy ánh sáng đóng vai trò quan trọng trong việc tạo hình thái cây nuôi cấy mô. 1.7.2. Đèn huỳnh quang Đèn huỳnh quang hay gọi đơn giản là đèn tuýp gồm điện cực (vonfram) vỏ đèn và lớp bột huỳnh quang. Ngoài ra, ngƣời ta còn bơm vào đèn một ít hơi thủy ngân và khí trơ (neon, argon ) để làm tăng độ bền của điện cực và tạo ánh sáng màu. Khi đóng điện, hiện tƣợng phóng điện giữa hai điện cực làm phát ra tia tử ngoại (tia cực tím). Tia tử ngoại tác dụng vào lớp bột huỳnh quang làm đèn phát sáng. Ngoài ra, để giúp cho hiện tƣợng phóng điện xảy ra, ngƣời ta phải lắp thêm chấn lƣu (tăng phô) và tắc te (chuột bàn). 27
  38. Đồ án tốt nghiệp Do ít tỏa nhiệt ra môi trƣờng nên đèn huỳnh quang sẽ cho hiệu suất phát sáng cao hơn nhiều so với đèn sợi đốt và lại có tuổi thọ cao hơn. Bình quân, dùng đèn huỳnh quang tiết kiệm hơn đèn sợi đốt 8 đến 10 lần. Hiện nay, ngoài thị trƣờng xuất hiện đèn huỳnh quang thu nhỏ (còn gọi là compact). Nó cũng rất giống với đèn huỳnh quang nhƣng hiệu suất phát quang cao hơn và tiết kiệm điện năng hữu hiệu hơn. Hình 1.8. Đèn Huỳnh Quang (Nguồn: Ƣu điểm: Công nghệ huỳnh quang đã đƣợc sử dụng trong khoảng hơn 100 năm và nó từng là giải pháp trong việc sử dụng năng lƣợng với hiệu quả cao. Công nghệ này mang đến nhiều ánh sáng hơn và tiết kiệm hơn so với đèn sợi đốt, tuy nhiên, chúng không thể sánh bằng với công nghệ đèn LED hiện tại. Nhƣợc điểm: - Đèn huỳnh quang chứa thủy ngân độc hại. Thủy ngân cũng nhƣ phosphor bên trong các bóng đèn là các vật liệu độc hại phải xử lý chất thải khi kết thúc vòng đời của đèn. Khi bóng đèn bị phá vỡ giải phóng một lƣợng nhỏ thủy ngân độc hại vào không khí, và phần còn lại tồn đọng tại lớp vỏ thủy tinh của đèn. - Đèn huỳnh quang sẽ giảm tuổi thọ đáng kể nếu chúng thƣờng xuyên bật và tắt. Tuổi thọ đèn điển hình là Compact Huỳnh Quang (CFL) khoảng 10.000 giờ 28
  39. Đồ án tốt nghiệp nhƣng điều này có thể làm suy giảm do hậu quả của việc chuyển mạch thƣờng xuyên (bật và tắt) - Đèn huỳnh quang phát ra ánh sáng đa hƣớng 360 độ. Đây là việc hoạt động không hiệu quả vì đến hơn phân nửa ánh sáng cần đƣợc phản xạ và chuyển hƣớng đến khu vực mong muốn đang đƣợc chiếu sáng. Việc phản xạ và chuyển hƣớng của ánh sáng đƣợc coi là không hiệu quả tổn thất hơn ánh sáng sẽ không giữ đƣợc nguyên chất lƣợng ban đầu. Đồng thời sử dụng nhiều phụ kiện phản xạ do đó tăng chi phí đèn. - Đèn huỳnh quang phát ra một lƣợng nhỏ bức xạ UV (cực tím). Ánh sáng tia cực tím đƣợc biết có thể làm bay màu nhuộm của sản phẩm may mặc hoặc các bức tranh nằm dƣới ánh sáng của chúng. - Đèn huỳnh quang yêu cầu một chấn lƣu để ổn định ánh sáng. Trong trƣờng hợp có một lỗ hở nhỏ trong chấn lƣu, ánh sáng có thể tạo ra tiếng ồn hoặc tiếng vo vo. 1.7.3. Đèn LED LED viết tắt là Light Emitting Diode: Diode là một thiết bị điện hay thành phần có hai điện cực (một cực dƣơng và cực âm) qua đó dòng điện đặc trƣng chỉ ở một hƣớng (từ cực dƣơng và đi qua cực âm). Diode thƣờng đƣợc làm từ vật liệu bán dẫn nhƣ chất silic hoặc selen, chất rắn dẫn điện trong một số trƣờng hợp chứ không phải ở các điện cực khác (ví dụ ở điện áp nhất định, mức hiện tại, hoặc cƣờng độ ánh sáng). Khi dòng điện đi qua vật liệu bán dẫn, thiết bị phát ra ánh sáng khả kiến. Nó rất giống với một tế bào quang điện (một thiết bị chuyển ánh sáng nhìn thấy thành dòng điện). Hình 1.9. Đèn LED (Nguồn: 29
  40. Đồ án tốt nghiệp Ƣu điểm: Có bốn ƣu điểm chính của đèn LED: - Đèn LED có tuổi thọ rất dài so với bất kì một công nghệ chiếu sáng khác (bao gồm cả đèn huỳnh quang). LED mới có thể kéo dài từ 50.000 đến 100.000 giờ hoặc nhiều hơn thế nữa. Nếu lấy đèn huỳnh quang so sánh với đèn LED thì tuổi thọ chúng chỉ bằng 10% – 25% đèn LED. - Đèn LED có hiệu suất năng lƣợng rất cao tƣơng đối so với mọi công nghệ chiếu sáng thƣơng mại khác. Có một số lý do cho điều này bao gồm thực tế là chúng gần nhƣ không phát ra bức xạ hồng ngoại nhƣ các loại đèn khác (bao gồm cả đèn huỳnh quang) và chúng phát ra ánh sáng hƣớng (trên dƣới 180 độ so với 360 độ nghĩa là có ít tổn thất nhiều hơn từ sự cần thiết phải chuyển hƣớng hoặc phản ánh ánh sáng). - Chất lƣợng ánh sáng rất cao. - Chi phí bảo trì rất thấp. Nhƣợc điểm: Đèn LED tƣơng đối đắt. Giá của đèn LED thƣờng lớn hơn hầu hết các loại đèn truyền thống. Đây là nhƣợc điểm lớn nhất cần đƣợc xem xét. Nhƣng giá của đèn LED đang giảm nhanh chóng và khi chúng tiếp tục đƣợc ứng dụng rộng rãi thì giá sẽ tiếp tục giảm. 1.7.4. Xác định hàm lượng chlorophyll (Arnon, 1949) Chlorophyll (diệp lục) là sắc tố chính đóng vai trò quan trọng nhất trong quang hợp. Diệp lục có vai trò hấp thụ năng lƣợng ánh sáng mặt trời, chuyển thành dạng năng lƣợng kích thích điện tử của phân tử diệp lục. Diệp lục có vai trò vận chuyển năng lƣợng vào trung tâm phản ứng. Từ phân tử diệp lục hấp thu ánh sáng đầu tiên cho đến trung tâm phản ứng của quang hợp là phải qua một hệ thống cấu trúc trong màng thilacoit gồm rất nhiều phân tử diệp lục khác nhau. Năng lƣợng ánh sáng phải truyền qua các phân tử diệp lục để đến đƣợc trung tâm phản ứng (P700). Tham gia biến đổi năng lƣợng ánh sáng thành năng lƣợng hóa học tại trung tâm phản ứng P700 30
  41. Đồ án tốt nghiệp nhờ quá trình quang phosphoryl hóa để hình thành nên ATP và NADPH. Diệp lục có khả năng hấp thụ ánh sáng một cách có chọn lọc, một số vùng ánh sáng đƣợc diệp lục hấp thụ mạnh nhất, một số vùng bị hấp thụ ít hơn, và có vùng thì hầu nhƣ không bị hấp thụ. Điều này đã tạo nên quang phổ hấp thụ của diệp lục. Trong quang phổ hấp thụ của diệp lục, có hai vùng ánh sáng mà diệp lục hấp thụ mạnh nhất tạo nên hai đỉnh hấp thu cực đại. Đó là vùng ánh sáng đỏ với cực đại là 662 nm và vùng ánh sáng xanh tím với cực đại là 430 nm. Hình 1.10. Phổ hấp thụ ánh sáng của thực vật (Nguồn: Mỗi nghiệm thức lấy 10 mẫu. Mỗi mẫu cân 15 mg lá và cắt nhuyễn. Cho mẫu lá vào ống nghiệm với 10 ml aceton 80%. Đậy kín ống nghiệm và đặt trong tối ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ. Sau 72 giờ tiến hành đo mật độ quang của từng ống nghiệm ở 2 bƣớc sóng 645 nm và 663 nm bằng máy đo phổ quang. Hàm lƣợng chlorophyll đƣợc tính theo công thức sau: Chl a (mg/g lá) = {[(12,7 x Abs663) – (2,63 x Abs645)] x 10}/15 Chl b (mg/g lá) = {[(22,9 x Abs663) – (4,68 x Abs645)] x 10}/15 Tổng chlorophyll = Chl a + Chl b (mg/g lá) Tỷ lệ chlorophyll a/b = Chl a/Chl b 31
  42. Đồ án tốt nghiệp 1.7.5. Tình hình nghiên cứu sử dụng ánh sáng đèn LED trong nuôi cấy mô 1.7.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước Trong năm 2014, Nguyễn Bá Nam và cs đã nghiên cứu trong đèn LED với sự phối trộn giữa hai LED xanh và LED đỏ với các tỉ lệ lần lƣợt: 100% LED đỏ; 90% LED đỏ kết hợp với 10% LED xanh; 80% LED đỏ kết hợp với 20% LED xanh; 70% LED đỏ kết hợp với 30% LED xanh; 60% LED đỏ kết hợp với 40% LED xanh; 50% LED đỏ kết hợp với 50% LED xanh đƣợc sử dụng để chiếu sáng bổ sung vào ban đêm nhằm nghiên cứu ảnh hƣởng của chúng lên sự sinh trƣởng và phát triển của ba giống Cúc (Đóa vàng, Sapphire và Kim cƣơng) đƣợc trồng trong nhà kính. Đèn compact 3U đƣợc sử dụng làm nghiệm thức đối chứng. Kết quả cho thấy, tỉ lệ 70% LED đỏ kết hợp với 30% LED xanh phù hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển của cây Cúc giống Sapphire và Kim cƣơng. Trong khi đó, tỉ lệ 60% LED đỏ kết hợp với 40% LED xanh phù hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển của cây Cúc giống Đóa vàng. Kết quả này có thể khẳng định, đèn LED thích hợp để thay thế đèn compact 3U trong việc chiếu sáng cây Cúc trồng trong nhà kính [12]. Nguyễn Thanh Phƣơng và cs (2014) nghiên cứu về tác động của phổ ánh sáng trên các loại bình nuôi cấy đến sự sinh trƣởng, phát triển của giống cẩm chƣớng Hồng Hạc đã đƣợc tiến hành trong giai đoạn nhân nhanh và tạo cây hoàn chỉnh. Kết quả chỉ ra trong giai đoạn nhân nhanh, sử dụng bình trụ nút bông hoặc túi nilon thoáng khí để nuôi cấy cho chất lƣợng cây giống tốt nhất. Đèn LED 13R-4B-3W cho cây sinh trƣởng chiều cao tốt, tuy nhiên đèn LED 17R-3B lại có tác dụng kích thích cây tăng số lá, số chồi cao hơn và cho chất lƣợng cây giống tốt (nuôi cấy cây trong bình trụ nút bông đạt 21,53 lá/cây, số chồi là 5,67 chồi/cây. Khi nuôi cấy trong túi nilon thoáng khí đạt 26,60 lá/cây và cho số chồi là 7,30 chồi/cây). Bên cạnh đó, đèn LED 17R-3B cũng cho chất lƣợng cây nhân giống tốt hơn ở các công thức đèn khác. Trong giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh, sử dụng bình trụ nút bông hoặc túi nilon thoáng khí để nuôi cấy kết hợp với sử dụng đèn LED 13R-4B-3W là tốt nhất (Chiều cao cây khi nuôi cấy trong bình trụ nút bông đạt 4,74 cm, nuôi cấy trong túi nilon thoáng khí là 5,13 cm. Số lá/cây đạt 11,73 lá trong bình trụ nút bông 32
  43. Đồ án tốt nghiệp và đạt 12,20 lá trong túi nilon thoáng khí). Ngoài ra, đèn LED 13R-4B-3W còn làm tăng chất lƣợng cây giống so với các loại đèn khác trên tất cả các loại bình nuôi [15]. Nguyễn Bá Nam và cs (2014) đã nghiên cứu về một hệ thống đèn LED mới đƣợc tạo ra, sự kết hợp giữa công nghệ chiếu sáng LED và truyền điện không dây đƣợc thực hiện và ứng dụng trong nghiên cứu sinh trƣởng cây Dâu tây, qua đó, nó có thể tiết kiệm không gian nuôi cấy. Hệ thống bao gồm hai bộ phận: mạch phát, mạch thu. Kết quả thí nghiệm cho thấy, cây Dâu tây sinh trƣởng dƣới hệ thống mới có khả năng tăng trƣởng tốt hơn với các chỉ tiêu khối lƣợng tƣơi (1,02 g), khối lƣợng khô (59,75 mg), chiều cao cây (6,67 cm), giá trị SPAD (48,05) so với đèn huỳnh quang và tƣơng đƣơng dƣới các hệ thống chiếu sáng LED khác [13]. Năm 2014, Nguyễn Thanh Sang và cs cũng đã nghiên cứu về tác động của các điều kiện chiếu sáng khác nhau đến sự nhân chồi; sinh trƣởng, phát triển và tổng hợp chlorophyll a và b của cây cúc in vitro. Các đốt thân và các chồi đỉnh cúc đƣợc nuôi cấy dƣới các điều kiện chiếu sáng khác nhau bao gồm LED đỏ, LED xanh, LED vàng, LED xanh lá cây, LED trắng và LED đỏ kết hợp với LED xanh theo nhiều tỷ lệ khác nhau (10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20 và 90:10). Kết quả thu đƣợc sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng nhân chồi cho thấy chiều dài lá, chiều rộng lá, khối lƣợng tƣơi và khối lƣợng khô của chồi đạt tốt nhất ở 50% LED đỏ và 50% LED xanh. Sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng tạo cây cho thấy khối lƣợng tƣơi, khối lƣợng khô, chiều dài lá và chiều rộng lá của cây đạt tốt nhất ở 70% LED đỏ và 30% LED xanh. Bên cạnh đó, hàm lƣợng chlorophyll a và chlorophyll b của cây đạt cao nhất ở 70% LED đỏ và 30% LED xanh. Nhƣ vậy, kết quả từ nghiên cứu cho thấy khả năng nhân chồi tốt nhất là các đốt thân đƣợc nuôi cấy ở 50% LED đỏ và 50% LED xanh và sự hình thành cây tốt nhất là các chồi đỉnh nuôi cấy ở 70% LED đỏ và 30% LED xanh [16]. 33
  44. Đồ án tốt nghiệp 1.7.5.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Tanaka và đồng tác giả (1998) đã chứng minh đƣợc sự sinh trƣởng của Cymbidium có thể đƣợc cải thiện sinh trƣởng khi đƣợc nuôi cấy bằng phƣơng pháp quang tự dƣỡng không bổ sung đƣờng dƣới sự chiếu sáng của đèn LED (ánh sáng LED đỏ và ánh sáng LED xanh kết hợp) [31]. Wang và cộng sự (2001) đã chứng minh trong nuôi cấy lông rễ của cây Artemisia annua L cho thấy sinh khối lông rễ và hàm lƣợng artemisia dƣới ánh sáng đỏ cao hơn 17% đến 67% so với dƣới ánh sáng trắng [34]. Linan và đồng tác giả (2002) đã nghiên cứu về sự phát sinh hình thái và sự sinh trƣởng của vẩy củ Lilium với nguồn chiếu sáng đèn LED đỏ, LED xanh và LED đỏ kết hợp với LED xanh [26]. Nhut và đồng tác giả (2003) đã chứng minh đƣợc cây dâu tây in vitro phát triển tốt nhất khi đƣợc nuôi cấy với nguồn chiếu sáng đèn LED (70% ánh sáng LED đỏ + 30% ánh sáng LED xanh) với cƣờng độ chiếu sáng là 60 µmol/m2.s [27]. Nhut (2005) đã chứng minh đƣợc cây con Lan Ý đƣợc nuôi cấy trong hộp -1 CPRW (Culture Pack - Rockwool), sục khí CO2 (3.000 μmol.mol ), có hệ thống nuôi cấy sử dụng đèn LED và film thoáng khí thích hợp trong vi nhân giống cây Lan Ý và cho chất lƣợng cây tốt nhất [28]. Gần đây, trong nghiên cứu của Heo và đồng tác giả (2006) cũng cho thấy với nguồn chiếu sáng đèn LED cây nho tăng khả năng sinh trƣởng và tổng hợp carbohydrate [24]. Trong năm 2012, Huiminli và cs cũng đã nghiên cứu về những tác động của nguồn ánh sáng khác nhau đến tốc độ tăng trƣởng và chất lƣợng của cây cải Bắp Trung Quốc (Brassica campestris L.). Tác động của các nguồn ánh sáng khác nhau (màu xanh, màu xanh kết hợp với màu đỏ, màu đỏ), đèn huỳnh quang, ánh sáng mặt trời, sự tăng trƣởng và hàm lƣợng vitamin C, protein hòa tan, sucrose, đƣờng, tinh bột và nồng độ sắc tố trong không gian của cây Bắp cải. Cho ra kết quả khối lƣợng khô của chồi và khối lƣợng khô của rễ cao nhất trong cây con trồng dƣới ánh sáng 34
  45. Đồ án tốt nghiệp đèn LED màu đỏ với ánh sáng yếu. Khối lƣợng tƣơi của rễ có tinh bột cao nhất dƣới đèn LED màu đỏ. Hàm lƣợng chlorophyll và vitamin C cao nhất là dƣới đèn LED màu xanh. Đèn LED màu xanh cộng với màu đỏ hỗ trợ tăng trƣởng sinh sản ở cây Bắp cải Trung Quốc, nguồn ánh sáng có thể đƣợc lựa chọn để đáp ứng các yêu cầu của giai đoạn phát triển khác nhau của thực vật [25]. 1.8. Tình hình nghiên cứu cây Lan Dendrobium thế giới và Việt Nam: 1.8.1. Tình hình nghiên cứu trên Thế giới Thị trƣờng phong lan ngày nay đã trở thành một mặt hàng lớn trên quốc tế, thu rất nhiều ngoại tệ. Ở các nƣớc phát triển nhƣ: Anh, Mỹ, Đức, Ý, Singgapore, Hồng Kông, đều nhập khẩu rất nhiều phong lan, Thái Lan là nƣớc xuất khẩu phong lan nhiều nhất Đông Nam Á. Năm 2010, Fadelah Abdul Aziz đã nghiên cứu sự tƣơng thích trong chọn giống cha mẹ để tăng giá trị thu nhỏ Dendrobium Doctor Sharil nhƣ một loài phong lan trong chậu và có hƣơng thơm. Để đạt đƣợc điều này, chọn các giống lan loài Dendrobium thơm hoang dã MARDI của bộ sƣu tập là lƣỡng điểm hạc Dendrobium anosmum, Dendrobium crumenotum, Dendrobium Leonis và Dendrobium farmeri. Từ những lựa chọn cha mẹ sau đó đã đƣợc lai với Dendrobium Doctor Sharif. Kết quả cho thấy loài Dendrobium sử dụng nhƣ là cha mẹ giống cái đã không thành công so với chúng đƣợc sử dụng nhƣ là cha mẹ giống đực [23]. Năm 2012, S. Tuhuteru và cs đã nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ của nƣớc dừa đến sự tăng trƣởng và phát triển của các loài phong lan Dendrobium anosmum. Kết quả cho thấy nồng độ nƣớc dừa trong môi trƣờng nuôi cấy ảnh hƣởng khác nhau đến sự tăng trƣởng và nhân chồi lan Dendrobium anosmum. Ở nồng độ nƣớc dừa 100 ml/l + MS cho môi trƣờng tối ƣu của sự tăng trƣởng và phát triển của chồi và rễ, chiều cao và trọng lƣợng của cây con Dendrobium anosmum [33]. Năm 2016, Ni Putu Yuni Astriani Dewi đã nghiên cứu sự tạo phôi trên Dendrobium anosmum Lindl. Trong nuôi cấy in vitro nhằm xác định tỷ lệ nảy mầm, ảnh hƣởng của việc thêm nƣớc cốt dừa vào môi trƣờng nuôi cấy trên số lƣợng phôi 35
  46. Đồ án tốt nghiệp giai đoạn cuối cùng của sự phát triển phôi thai cũng nhƣ các giai đoạn cuối cùng trong Dendrobium anosmum Lindl [29]. 1.8.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam Việt Nam là một trong những nƣớc có lan nhiều trên thế giới, và lan rừng nƣớc ta có rất nhiều loài quí do màu sắc đẹp, hƣơng thơm nồng nàn. Đây là ƣu điểm chính của lan rừng Việt Nam. Mặc dù lan rừng Việt Nam có nhƣợc điểm là nhanh tàn và kích thƣớc nhỏ hơn các loài lan lai, nhƣng vẫn hấp dẫn đƣợc nhiều ngƣời yêu lan nhờ đa số đều có hƣơng thơm nồng nàn, quyến rũ nhƣ Giả hạc, Ngọc điểm, Mỹ dung dạ hƣơng, Năm 2007, Lê Văn Hòa và cs đã tiến xa hơn trong việc tạo ra giống lan mới bằng kỹ thuật gây đột biến nhân tạo hoa lan cắt cành Dendrobium bằng tia gamma, trích trong Hội nghị khoa học – Công nghệ sinh học thực vật trong công tác và chọn tạo giống hoa của Dƣơng Tấn Nhựt. Năm 2009, Nguyễn Thị Mỹ Duyên, nhân giống lan Dendrobium anosmum, Dendrobium mini bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô. Nghiên cứu các loại giá thể trồng lan Dendrobium mini thích hợp và cho hiệu quả cao [3]. Năm 2013, Nguyễn Quỳnh Trang và cộng sự đã nhân giống in vitro lan phi điệp tím Dendrobium anosmum từ phôi hạt trong ống nghiệm thành công [18]. 36
  47. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian: Thực hiện đề tài từ tháng 04/2018 đến tháng 07/2018. Địa điểm: Phòng Thực nghiệm cây trồng thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh, số 2374, Quốc lộ 1, khu phố 2, phƣờng Trung Mỹ Tây, quận 12, Thành phố Hồ Chí Minh. 2.2. Vật liệu và phƣơng pháp 2.2.1. Vật liệu nghiên cứu Giống lan đƣợc nghiên cứu trong đề tài này là Giả hạc Châu Nhƣ đƣợc cung cấp bởi phòng Thực nghiệm Cây Trồng, Trung Tâm công Nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh. 2.2.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất 2.2.2.1. Dụng cụ - trang thiết bị  Dụng cụ: - Chai thủy tinh 500 ml, chai thủy tinh 100 ml. - Ống đong 50 ml, ống đong 100 ml, ống đong 500 ml, ống đong 1000 ml - Pipet 2 ml, pipet 5 ml, pipet 10 ml, micropipet 20 – 200 µl, micropipet 100 – 1000 µl. - Cốc thủy tinh. - Bao PE chịu nhiệt, giấy, nút cao su, bông, giấy thấm. Bộ dụng cụ cấy gồm: dao cấy, kẹp cấy, đĩa cấy, đèn cồn, - Đèn huỳnh quang, đèn LED (đỏ, xanh, trắng), nhiệt kế, ẩm kế.  Trang thiết bị: - Tủ sấy: để sấy khô các dụng cụ. - Tủ lạnh: để bảo quản hóa chất và môi trƣờng dự trữ. - Bếp điện: để nấu môi trƣờng và hấp cách thủy hóa chất. - Cân phân tích: để cân đƣờng, agar, các hóa chất. 37
  48. Đồ án tốt nghiệp - Nồi hấp autoclave: hấp vô trùng môi trƣờng và dụng cụ nuôi cấy. - Máy đo pH. - Máy điều hòa nhiệt độ để đảm bảo nhiệt độ phòng nuôi cây là 25± 2oC. Bảng 2.1. Các trang thiết bị trong thí nghiệm Tên thiết bị Model & Hãng sản xuất Tủ cấy vô trùng ESCo LHC - A41 - Indonesia Tủ sấy Member t UNE 550 - Đức Mấy cất nƣớc hai lần Bibby Scientific (Stuart) A4000D – Anh Tủ lạnh Hitachi - Nhật Bếp từ Philips - Hà Lan Cân phân tích 2 số lẻ Denver Instrument TP 1502 - Đức Máy đo pH Schott Lab 860 - SI Analytic - Đức Nồi hấp tiệt trùng (Nồi hấp 1 cửa ALP) CL - 40M - Nhật Kính hiển vi (3 mắt kính) Meiji MT4300H - Nhật 2.2.2.2. Hóa chất - Cồn 96o, 70o. - Saccharose. - Agar. - Chất hữu cơ: nƣớc dừa, chuối. - Các chất kích thích sinh trƣởng thực vật: NAA (MERCK - Đức), BA (BIO BASIC - Canada). - Peptone. - Môi trƣờng MS (Murashiga & Skoog) (1962): 38
  49. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.2. Hóa chất môi trƣờng MS Nguyên tố đa lượng: NH4NO3 1650 mg/l KNO3 1900 mg/l MgSO4 370 mg/l KH2PO4 170 mg/l CaCl2.H2O 440 mg/l Nguyên tố vi lượng: H3BO5 6,2 mg/l MnSO4.4H2O 22,5 mg/l ZnSO4.7H2O 8,6 mg/l KI 0,83 mg/l Na2MoO4.2H2O 0,25 mg/l CuSO4.5H2O 0,025 mg/l CoCl2.6H2O 0,025 mg/l Vitamins: Inositol 100 mg/l Nicotinic 0,5 mg/l Pyridoxin HCl 0,5 mg/l Thiamin HCl 0,1 mg/l Fe EDTA: FeSO4.7H2O 27,8 mg/l Na2EDTA.2H2O 37,3 mg/l 2.2.3. Điều kiện phòng nuôi cấy Mẫu cấy đƣợc chuyển vào phòng nuôi cây với điều kiện ánh sáng 2000 ± 500 lux, nhiệt độ 25oC ± 2, độ ẩm 50%, chiếu sáng 12 giờ/ngày. 39
  50. Đồ án tốt nghiệp 2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu - Các thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, số liệu thu thập đƣợc xử lý bằng phần mềm SAS V8 và Microsoft Excel 2016®. - Phân tích thống kê qua phép Duncan’s ở mức ý nghĩa 5%. - Số mẫu tạo chồi = số chồi mới nhân trong tổng số mẫu chồi. - Chiều cao chồi (mm) = Tổng chiều cao/tổng số chồi theo dõi. - Số lá/chồi = Tổng số lá thu đƣợc/tổng số chồi. - Số rễ/cây (rễ) = Tổng số rễ thu đƣợc/tổng số cây theo dõi. - Chiều dài rễ (mm) đƣợc đo từ gốc rễ đến chóp rễ dài nhất. 2.3. Nội dung nghiên cứu 2.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA kết hợp với ánh sáng lên sự nhân chồi lan Giả hạc Châu Như Vật liệu thí nghiệm: sử dụng mẫu cụm chồi lan Giả hạc Châu Nhƣ (đồng nhất, có kích thƣớc khoảng 0,5 – 1 cm). Phƣơng pháp thí nghiệm: sử dụng cụm chồi lan Giả hạc Châu Nhƣ cấy trên môi trƣờng nhân chồi. Môi trƣờng nhân chồi: môi trƣờng MS có bổ sung 30 g/l đƣờng, 0,5 g/l pepton, 0,1 g/l Myo-inositol, 0,02 g/l glycine, 6,5 g/l agar, 70 g/l chuối. Với điều kiện ánh sáng và chất điều hòa sinh trƣởng thực vật BA, NAA đƣợc bổ sung vào môi trƣờng với nồng độ đƣợc bố trí theo bảng 2.3, pH môi trƣờng 5,5. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm gồm 12 nghiệm thức, với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 3 chai. Mỗi chai 5 cụm chồi. Cƣờng độ chiếu sáng: đèn huỳnh quang Rạng Đông: 2 bóng, đèn LED Rạng Đông: 2 dãy. 40
  51. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.3. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA, NAA kết hợp với ánh sáng lên sự nhân chồi lan Giả hạc Châu Nhƣ. Nghiệm thức Nồng độ BA + NAA (mg/l) Ánh sáng HQ0,5 Huỳnh quang LT0,5 LED trắng 0,5 + 0,1 LD0,5 LED đỏ LX0,5 LED xanh HQ1 Huỳnh quang LT1 LED trắng 1 + 0,1 LD1 LED đỏ LX1 LED xanh HQ1,5 Huỳnh quang LT1,5 LED trắng 1,5 + 0,1 LD1,5 LED đỏ LX1,5 LED xanh  Chỉ tiêu theo dõi: - Số chồi: lấy trung bình của số chồi mới tạo thành. - Tỷ lệ mẫu nhân chồi (%) - Trọng lƣợng tƣơi (mg) - Trọng lƣợng khô (mg) - Đo hàm lƣợng Chlorophyll Số liệu đƣợc ghi nhận 7 ngày/lần, thời gian: 8 tuần. 2.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của chất hữu cơ (chuối và nước dừa) lên sự nhân chồi và tạo cây lan Giả hạc Châu Như. Vật liệu thí nghiệm: chồi đơn (rễ bị cắt bỏ trƣớc khi cấy) lan Giả hạc Châu Nhƣ. 41
  52. Đồ án tốt nghiệp Môi trƣờng nhân nhanh chồi: môi trƣờng MS có bổ sung 30 g/l đƣờng, 0,5 g/l pepton, 0,1 g/l Myo-inositol, 0,02 g/l glycine, 6,5 g/l agar, với hàm lƣợng chuối và nƣớc dừa đƣợc bố trí theo bảng 2.4, pH môi trƣờng 5,5. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức, với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 3 chai. Mỗi chai 5 chồi. Bảng 2.4. Ảnh hƣởng của chuối và nƣớc dừa lên sự nhân chồi và tạo cây lan Giả hạc Châu Nhƣ Nghiệm thức Chuối (g/l) Nƣớc dừa (ml/l) H1 50 H2 20 100 H3 150 H4 50 H5 40 100 H6 150 H7 50 H8 60 100 H9 150  Chỉ tiêu theo dõi: - Số chồi mới hình thành - Chiều cao chồi mới nhân(mm): lấy trung bình chiều cao của các chồi mới nhân lên. - Số lá chồi mới nhân: trung bình của tổng số lá trên các chồi mới nhân lên. - Số rễ mới phát sinh - Trọng lƣợng tƣơi (mg) - Trọng lƣợng khô (mg) Số liệu đƣợc ghi nhận 7 ngày/lần, thời gian: 8 tuần. 42
  53. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA, NAA kết hợp với ánh sáng lên sự nhân chồi lan Giả hạc Châu Nhƣ Môi trƣờng nuôi cấy, ngoài các chất dinh dƣỡng cần thiết, cần phải bổ sung các chất điều hoà sinh trƣởng thuộc nhóm Auxin và Cytokinin. CĐHSTTV là thành phần quan trọng của môi trƣờng nuôi cấy. Đối với sự phát sinh hình thái thực vật Cytokinin là nhóm CĐHSTTV ảnh hƣởng đến sự phân chia tế bào, thay đổi ƣu thế ngọn và phân hóa chồi. BA là CĐHSTTV thuộc nhóm Cytokinin, đƣợc dùng khá phổ biến trong việc kích thích phân hóa chồi ở nhiều loài thực vật, giúp tái sinh chồi mạnh mẽ từ mô nuôi cấy và hạn chế sự phát triển rễ. Bên cạnh đó, Auxin thƣờng gây tạo các bƣớu ở mô và cơ quan, kích thích sự phân chia tế bào (tạo mô sẹo hay PLBs). NAA có tác dụng kích thích sinh trƣởng giãn của tế bào và hình thành rễ. Trong thí nghiệm sử dụng nồng độ NAA 0,1 mg/l cố định. Sự cân bằng tỷ lệ giữa Auxin và cytokynin có ý nghĩa quyết định trong quá trình phát sinh hình thái, sinh trƣởng và phát triển chồi của mô nuôi cấy in vitro. Từ bảng 3.1, ở các nghiệm thức bổ sung các nồng độ BA 0,5; 1; 1,5 mg/l + 0,1 mg/l NAA, số chồi có sự khác biệt rõ rệt về mặt thống kê. Trong đó, ở nồng độ 1 mg/l BA + 0,1 mg/l NAA có số chồi cao hơn hẳn 2 nồng độ còn lại. Bên cạnh đó các chỉ tiêu nhƣ trọng lƣợng tƣơi, trọng lƣợng khô, hàm lƣợng chất khô cũng đạt cao hơn. Ở nồng độ BA 0,5 mg/l thì không đủ để kích thích mẫu cảm ứng tạo chồi và phát triển. Còn ở nồng độ BA 1,5 mg/l gây ức chế quá trình tạo chồi cũng nhƣ kéo dài chồi, bên cạnh đó BA tăng cao sẽ gây độc cho mẫu, mẫu bị kìm hãm phát triển. Ngoài yếu tố chất điều hòa sinh trƣởng thì ánh sáng cũng có vai trò quyết định đến quá trình sinh trƣởng của cây. Trong phƣơng pháp nuôi cấy mô, với các đối 43
  54. Đồ án tốt nghiệp tƣợng cây, và tùy vào từng giai đoạn sinh trƣởng lại cần mức độ chiếu sáng khác nhau nhằm cung cấp đủ lƣợng sáng cho cây quang hợp. Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA, NAA kết hợp với ánh sáng lên sự nhân chồi lan Giả hạc Châu Nhƣ sau 8 tuần nuôi cấy Hàm Trọng Trọng BA + lƣợng Chl a Chl b Tổng Chl Ánh Số Chồi lƣợng lƣợng NT NAA chất (mg/ (mg/ (a + b) sáng mới tƣơi khô (mg/l) khô g lá) g lá) (mg/g lá) (mg) (mg) (%) HQ0,5 HQ 10,9f 2320 138,3 6 4,41 2,62 7,03b LT0,5 0,5 + LT 10,8f 1084 62,4 5,7 3,35 1,86 5,2c LD0,5 0,1 LD 18,6c 3440 165,4 4,8 3,71 2,14 5,8c LX0,5 LX 9,06g 536 35,2 6,6 3,76 1,99 5,7c HQ1 HQ 19,6bc 2346 107,1 4,6 5,41 2,82 8,2a LT1 LT 16,2d 2100 120,8 5,8 4,96 2,57 7,5ab 1 + 0,1 LD1 LD 22,7a 3864 279,1 7,2 3,12 1,71 4,8c LX1 LX 14,2e 984 51 5,2 3,99 1,96 5,95c HQ1,5 HQ 14,3e 540 36,8 6,8 4,94 2,70 7,6ab LT1,5 1,5 + LT 14,1e 1142 75,2 6,6 3,51 1,95 5,5c LD1,5 0,1 LD 20,5b 2388 153,1 6,4 3 1,86 4,9c LX1,5 LX 10,2fg 900 53,3 5,9 3,90 1,95 5,8c CV 8,11 19,1 BA ĐÈN BA x ĐÈN Ghi chú: - Các chữ cái: a, b, c, d, trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê theo trắc nghiệm phân hạng Duncan's test với độ tin cậy P 0,05. - ns: p > 0,05; : p < 0,01; *: 0,01< p < 0,05. 44
  55. Đồ án tốt nghiệp Chồi 24 20 16 BA 0.5 12 BA 1 BA 1.5 8 4 0 HQ LT LĐ LX Nghiệm thức Biểu đồ 3.1. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA, NAA kết hợp với ánh sáng tới khả năng nhân chồi lan Giả hạc Châu Nhƣ sau 8 tuần nuôi cấy (g) 4 3.5 3 2.5 BA 0.5 2 BA 1 1.5 BA 1.5 1 0.5 0 HQ LT LĐ LX Nghiệm thức Biểu đồ 3.2. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA, NAA kết hợp với ánh sáng tới trọng lƣợng tƣơi lan Giả hạc Châu Nhƣ sau 8 tuần nuôi cấy 45
  56. Đồ án tốt nghiệp (mg) 300 250 200 BA 0.5 150 BA 1 100 BA 1.5 50 0 HQ LT LĐ LX Nghiệm thức Biểu đồ 3.3. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA, NAA kết hợp với ánh sáng tới trọng lƣợng khô lan Giả hạc Châu Nhƣ sau 8 tuần nuôi cấy % 8 7 6 5 BA 0.5 4 BA 1 3 BA 1.5 2 1 0 HQ LT LĐ LX Nghiệm thức Biểu đồ 3.4. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA, NAA kết hợp với ánh sáng tới Hàm lƣợng chất khô lan Giả hạc Châu Nhƣ sau 8 tuần nuôi cấy 46
  57. Đồ án tốt nghiệp mg/g lá 9 8 7 6 5 BA 0.5 4 BA 1 3 BA 1.5 2 1 0 HQ LT LĐ LX Nghiệm thức Biểu đồ 3.5. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA, NAA kết hợp với ánh sáng tới hàm lƣợng chlorophyll lan Giả hạc Châu Nhƣ sau 8 tuần nuôi cấy 47
  58. Đồ án tốt nghiệp HQ0.5 LT0.5 LD0.5 LX0.5 HQ1 LT LD1 LX1 HQ1.5 LT1.5 LD1.5 LX1.5 Hình 3.1. Cụm chồi lan Giả hạc Châu Nhƣ ở các nồng độ BA, NAA và ánh sáng sau 8 tuần nuôi cấy. (1cm: ) Ghi chú: Đèn Huỳnh quang Đèn LED đỏ HQ0,5: 0,5 mg/l BA + 0,1 mg/l NAA LD1,5: 1,5 mg/l BA + 0,1 mg/l NAA HQ: 1 mg/l BA + 0,1 mg/l NAA LD1: 1 mg/l BA + 0,1 mg/l NAA HQ1,5: 1,5 mg/l BA + 0,1 mg/l NAA LD0,5: 0,5 mg/l BA + 0,1 mg/l NAA Đèn LED trắng Đèn LED xanh LT0,5: 0,5 mg/l BA + 0,1 mg/l NAA LX0,5: 0,5 mg/l BA + 0,1 mg/l NAA LT1: 1 mg/l BA + 0,1 mg/l NAA LX1: 1 mg/l BA + 0,1 mg/l NAA LT1,5: 1,5 mg/l BA + 0,1 mg/l NAA LX1,5: 1,5 mg/l BA + 0,1 mg/l NAA 48
  59. Đồ án tốt nghiệp Sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng MS có bổ sung BA và NAA với cƣờng độ chiếu sáng của các loại đèn huỳnh quang, LED trắng, LED đỏ, LED xanh thì có sự khác biệt rõ rệt giữa các nghiệm thức. Qua bảng số liệu (bảng 3.1) ta thấy quá trình nhân nhanh chồi của cây lan Giả hạc Châu Nhƣ có sự khác biệt khi đƣợc nuôi dƣới các loại đèn khác nhau. Ở đèn LED đỏ cho kết quả số chồi đạt cao nhất so với các loại đèn còn lại. Các chỉ tiêu nhƣ trọng lƣợng tƣơi, trọng lƣợng khô và hàm lƣợng chất khô cũng đạt cao nhất so với các nghiệm thức sử dụng đèn huỳnh quang, LED trắng, LED xanh. Điều này cho thấy ánh sáng đỏ có những bƣớc sóng cần thiết cho sự phát triển của cây lan giả hạc Châu Nhƣ ở giai đoạn nhân chồi, mặt khác số chồi ở các nghiệm thức đƣợc nuôi dƣới ánh sáng của đèn huỳnh quang và LED trắng thì không có sự khác biệt nhiều về mặt thống kê. Tuy nhiên lại cho số chồi cao hơn số chồi trong điều kiện chiếu sáng của đèn LED xanh, điều này cho thấy rằng đèn LED xanh có những bƣớc sóng ức chế sự phát triển chồi của lan Giả hạc Châu Nhƣ. Tuy nhiên lại có một vài nghiên cứu lại cho thấy dƣới ánh sáng đèn LED xanh, các chồi và chiều dài đốt thân đều kéo dài ở nhiều loài thực vật, nhƣ nghiên cứu của Nguyễn Thị Na và cs trên đối tƣợng cây lan gấm (ludisia discolor (ker gawler) blume). Bên cạnh đó, một số thí nghiệm lại cho thấy sự kết hợp giữa ánh sáng LED đỏ và LED xanh thì cho kết quả tốt nhất nhƣ trong thí nghiệm của Dƣơng Tấn Nhựt và cộng sự trên đối tƣợng là cây Cúc. Qua đó cho thấy đối với từng loài thực vật khác nhau có sự sinh trƣởng và phát triển khác nhau dƣới sự ảnh hƣởng của các điều kiện ánh sáng khác nhau. Khi kết hợp BA, NAA và các loại đèn chiếu sáng thì ở nghiệm thức bổ sung 1 mg/l BA + 0,1 mg/l NAA và sử dụng ánh sáng đèn LED đỏ cho kết quả đạt chất lƣợng tốt nhất về số chồi, trọng lƣợng tƣơi, trọng lƣợng khô và hàm lƣợng chất khô so với các nghiệm thức còn lại, mẫu phát triển tốt, số chồi đạt 22,7 chồi/mẫu, trọng lƣợng tƣơi 3864 mg, trọng lƣợng khô 279,1 mg, hàm lƣợng chất khô đạt 7,2% cho thấy khả năng hấp thu ánh sáng và làm tăng khả năng quang hợp giúp cho quá trình hình thành carbohidrat cung cấp chất dinh dƣỡng cho cây cao. Tuy nhiên, hàm lƣợng chlorophyll ở nghiệm thức này lại thấp chỉ đạt 4,85 mg/g lá so với nghiệm 49
  60. Đồ án tốt nghiệp thức bổ sung 1mg/l BA kết hợp đèn huỳnh quang là 8,22 mg/g lá, điều này có thể giải thích do trọng lƣợng tƣơi cao lên đến 3864 mg, chồi đang phát triển chứa nhiều nƣớc, nồng độ sẽ loãng làm cho hàm lƣợng chlorophyll thấp. Mặt khác, chlorophyll a là sắc tố quan trọng nằm trong trung tâm phản ứng tham gia trực tiếp vào sự chuyển hóa năng lƣợng ánh sáng hấp thụ thành năng lƣợng hóa học ATP và NADPH, chl a trong nghiệm thức này cao giúp cây phát triển tốt. Chlorophyll b là sắc tố phụ hoạt động gián tiếp trong quá trình quang hợp có chức năng truyền ánh sáng cho chl a, việc sử dụng cả hai sắc tố a và b cùng nhau nhằm tăng cƣờng sự hấp thụ ánh sáng để tạo ra năng lƣợng. Ở nghiệm thức bổ sung 0,5 mg/l BA và sử dụng đèn LED xanh cho kết quả thấp nhất về mặt số chồi, trọng lƣợng tƣơi, trọng lƣợng khô, mẫu phát triển chậm, chồi ít và bé 9,06 chồi/mẫu. Nồng độ BA thấp không đủ kích thích cảm ứng tạo chồi, đèn LED xanh ức chế sự kéo dài và mở rộng lá theo chiều ngang. Tuy nhiên, ở nghiệm thức này hàm lƣợng chất khô 6,57% và hàm lƣợng chlorophyll 6,03 mg/g lá tƣơng đối cao, cho thấy khả năng hấp thụ ánh sáng và tích tụ chất dinh dƣỡng giúp cây phát triển. Sự kết hợp giữa Auxin và Cytokynin có ý nghĩa quyết định trong quá trình phát sinh hình thái, sinh trƣởng và phát triển chồi của mô nuôi cấy, việc bổ sung BA và NAA vào môi trƣờng với nồng độ thích hợp sẽ cho kết quả tối ƣu. Theo kết quả thí nghiệm cho thấy sử dụng BA với nồng độ 1 mg/l thích hợp nhất cho khả năng nhân chồi lan Giả hạc Châu Nhƣ. Việc kết hợp ánh sáng giúp kích thích khả năng nhân chồi, hấp thu chất dinh dƣỡng, từ bảng kết quả 3.1 cho thấy ánh sáng đỏ có tác dụng kích thích sự phát triển chồi cây. Trong khi ánh sáng đỏ kéo dài thân và phát triển chồi, thì ánh sáng xanh lại ức chế sự kéo dài và mở rộng lá theo chiều ngang, chứng tỏ ánh sáng xanh đã làm thay đổi nồng độ hormone nội sinh dẫn đến sự mất cân bằng trong nồng độ của các chất nội sinh này ở thực vật. Có rất ít nghiên cứu sử dụng ánh sáng đơn sắc đèn LED lên sinh trƣởng của lan Giả hạc, chỉ có một vài công bố trên họ lan nhƣ nghiên cứu của Tanaka và cs trên lan Cymbidium đã chứng minh sự sinh trƣởng của lan Cymbidium có thể đƣợc cải thiện dƣới sự chiếu sáng 50
  61. Đồ án tốt nghiệp của đèn LED với tỷ lệ LED đỏ cao hơn LED xanh [31]. Ảnh hƣởng của yếu tố ánh sáng lên sinh trƣởng của thực vật cũng đƣợc nhiều tác giả khác quan tâm trên các đối tƣợng khác nhau nhƣ cúc, chuối, dâu tây. Appelgren thấy rằng ánh sáng đỏ kích thích sự kéo dài thân trên đối tƣợng Pelargonium in vitro, trong khi ánh sáng trắng và xanh lại ức chế hiện tƣợng này. 3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của chất hữu cơ (chuối và nƣớc dừa) lên sự nhân chồi và tạo cây lan Giả hạc Châu Nhƣ. Nƣớc dừa có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy in vitro đó là: rất nhiều các glucoside của Cytokinin, các hợp chất có hoạt tính Auxin, các vitamins, myo-inositol, các khoáng chất Nƣớc dừa đã đƣợc sử dụng để kích thích phân hóa, nhân nhanh chồi và thúc đẩy tăng trƣởng ở nhiều loại cây. Yong và cộng sự cho thấy nƣớc dừa chứa 94 % là nƣớc và là chất thúc đẩy tăng trƣởng của chồi (Yong và cs, 2009). Trong một số loài thực vật, quá trình tái sinh đƣợc gia tăng bằng cách bổ sung nƣớc dừa vào môi trƣờng nuôi cấy. Ngoài ra, nƣớc dừa đã đƣợc báo cáo là có khả năng làm tăng quá trình sinh trƣởng và phát triển của hoa lan trong ống nghiệm do có sự liên quan đến sự hiện diện của một loại Cytokinin (Bhasker J, 1996). Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu của Shantz và cộng sự (Shantz và cs, 1952) khi bổ sung nƣớc dừa có tác dụng kích thích quá trình nhân nhanh tế bào và mô do nƣớc dừa có chứa một số yếu tố tăng trƣởng. Năm 2012, Saranjeet và cộng sự nhận thấy bổ sung 10 % nƣớc dừa đã thúc đẩy quá trình nhân nhanh protocorm và hình thành chồi có từ 2 – 3 lá và 1 – 2 rễ, đạt 73,75 % (Saranjeet và cs, 2012). Chuối có hàm lƣợng fructose, glucose và nitrat cao, khi đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy làm tăng hàm lƣợng đƣờng cũng nhƣ hàm lƣợng khoáng của môi trƣờng (Aktar và cs, 2008). Tác dụng kích thích của chuối hiệu quả do khả năng ổn định pH của môi trƣờng nuôi cấy (Pierik, 1988). Bổ sung chuối vào môi trƣờng đóng vai trò nhƣ một chất kháng acid và trung hòa nồng độ acid. Ngoài ra, chuối có chứa một hàm lƣợng lớn nhƣ sắt, kali, vitamin B6, B12 và trypthophan thúc đẩy PLBs tăng trƣởng (Pavallekoodi và cs, 2010). 51
  62. Đồ án tốt nghiệp Trong thí nghiệm này, khảo sát ảnh hƣởng của chuối và nƣớc dừa lên sự nhân chồi và tạo cây lan Giả hạc Châu Nhƣ và kết quả đƣợc thu nhận sau 8 tuần nuôi cấy đƣợc trình bày ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của chuối và nƣớc dừa lên sự nhân chồi và tạo cây lan Giả hạc Châu Nhƣ sau 8 tuần nuôi cấy Hàm Trọng Trọng Nƣớc Chiều lƣợng Chuối Số Số lá Số rễ lƣợng lƣợng TN dừa cao chồi chất (g/l) chồi (lá/mẫu) (rễ/mẫu) tƣơi khô (ml/l) (mm) khô (mg) (mg) (%) H1 50 1,1e 11,4e 3,53cde 1,8e 499,2 43,4 8,7 H2 20 100 3,02b 15,6b 4,04bc 3,1b 834 72,3 8,6 H3 150 2,93b 15,5b 3,93cd 2,7cd 739,2 64 8,6 H4 50 2,24cd 14,5c 2,82f 0f 671,2 59,8 8,9 H5 40 100 3,68a 17,2a 5,08a 2,9bc 1238,4 121,7 9,8 H6 150 2,02d 14d 3,15e 2,4d 982,7 86,1 8,7 H7 50 1,84d 14,1d 3,48de 0f 548,2 49,6 9,04 H8 60 100 3,3ab 15,8b 4,46b 3,8a 731,8 66,6 9,1 H9 150 2,5c 14,7C 3,68cd 2,1e 710 64,7 9 CV 16,15 4,2 13,61 13,5 CHUOI CW CHUOI x CW Ghi chú: - Các chữ cái: a, b, c, d, trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê theo trắc nghiệm phân hạng Duncan's test với độ tin cậy P 0,05. - ns: p > 0,05; : p < 0,01; *: 0,01< p < 0,05. 52
  63. Đồ án tốt nghiệp Số chồi 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 Số chồi 0.5 0 Nghiệm thức Biểu đồ 3.6. Ảnh hƣởng của Chuối và nƣớc dừa đến số chồi lan Giả hạc Châu Nhƣ sau 8 tuần nuôi cấy Chiều cao 20 18 16 14 12 10 8 6 Chiều cao 4 2 0 Nghiệm thức Biểu đồ 3.7. Ảnh hƣởng của Chuối và nƣớc dừa đến chiều cao lan Giả hạc Châu Nhƣ sau 8 tuần nuôi cấy 53
  64. Đồ án tốt nghiệp Số lá 6 5 4 3 2 Số lá 1 0 Nghiệm thức Biểu đồ 3.8. Ảnh hƣởng của Chuối và nƣớc dừa đến số lá lan Giả hạc Châu Nhƣ sau 8 tuần nuôi cấy Số rễ 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 Số rễ 0.5 0 Nghiệm thức Biểu đồ 3.9. Ảnh hƣởng của Chuối và nƣớc dừa đến số rễ lan Giả hạc Châu Nhƣ sau 8 tuần nuôi cấy 54
  65. Đồ án tốt nghiệp H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 Hình 3.2. Ảnh hƣởng của chuối và nƣớc dừa lên sự nhân chồi và tạo cây lan Giả hạc Châu Nhƣ sau 8 tuần nuôi cấy. (1cm: ) Sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng MS có bổ sung chuối và nƣớc dừa, nhận thấy sự tăng trƣởng chồi lan Giả hạc Châu Nhƣ có sự khác biệt rõ rệt giữa các nghiệm thức (bảng 3.2). Việc bổ sung nƣớc dừa và chuối dẫn đến sự tăng trƣởng và phát triển khác nhau về số chồi, chiều cao chồi, số lá, số rễ, trọng lƣợng tƣơi, trọng lƣợng khô. Từ bảng kết quả 3.2, nhận thấy có sự khác biệt về số chồi giữa các nghiệm thức về mặt thống kê. Ở các nghiệm thức bổ sung 40 g/l chuối cho kết quả số chồi cao nhất trong 3 nồng độ đƣợc bổ sung. Số chồi tăng từ nồng độ 20 g/l chuối đến 40 55
  66. Đồ án tốt nghiệp g/l chuối, sau đó số chồi giảm khi tiếp tục tăng nồng độ chuối lên 60 g/l. Tƣơng tự khi bổ sung nƣớc dừa, nồng độ 100 ml/l nƣớc dừa cho số chồi cao nhất trong 3 nồng độ đƣợc bổ sung, số chồi tăng khi tăng nồng độ từ 50 ml/l lên 100 ml/l và giảm số chồi khi tiếp tục tăng nồng độ nƣớc dừa lên 150 ml/l. Vậy nồng độ 40 g/l là nồng độ thích hợp nhất khi bổ sung chuối và 100 ml/l là nồng độ phù hợp nhất khi bổ sung nƣớc dừa vào môi trƣờng nuôi cấy. Khi kết hợp chuối với nƣớc dừa, nghiệm thức tốt nhất là nghiệm thức bổ sung 40 g/l chuối + 100 ml/l nƣớc dừa, cao nhất với 3,68 chồi và có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Ở chỉ tiêu chiều cao chồi có sự khác biệt giữa các nghiệm thức về mặt thống kê. Chiều cao ở hầu hết các nghiệm thức có sự phát triển tốt, chỉ riêng nghiệm thức bổ sung 20 g/l chuối + 50 ml/l nƣớc dừa cho kết quả thấp nhất. Chiều cao chồi cao nhất với kết quả 17,2 mm ở nghiệm thức bổ sung 40 g/l chuối + 100 ml/l nƣớc dừa và có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Hầu hết các nghiệm thức cho thấy mối liên quan giữa số chồi và chiều cao chồi, số chồi càng nhiều thì chiều cao chồi càng tăng. Nghĩa là ở các nghiệm thức có sự phát triển tốt về số chồi thì sẽ phát triển đồng thời cả về chiều cao. Ở chỉ tiêu số lá sau 8 tuần nuôi cấy, nhận thấy không có sự khác biệt nhiều về số lá giữa các nghiệm thức về mặt thống kê. Chỉ riêng nghiệm thức bổ sung 20 g/l chuối + 50ml/l nƣớc dừa cho kết quả số lá ít. Do các mẫu đƣợc cấy vào phần lớn bị vàng lá và chết dần. Số rễ giữa các nghiệm thức có sự khác biệt dựa trên kết quả thống kê. Ở nghiệm thức bổ sung 20 g/l chuối hầu hết mẫu đều phát sinh rễ, ở 2 nồng độ chuối 40 g/l và 60 g/l không có sự phát sinh rễ hoặc ra rễ rất ít. Các nghiệm thức bổ sung nƣớc dừa ở nồng độ 100 ml/l và 150 ml/l đều cho số rễ rất cao, số rễ giảm tại nồng độ nƣớc dừa là 50 ml/l. Khi kết hợp chuối và nƣớc dừa với nhau số rễ tăng khi nồng độ nƣớc dừa tăng. Nghiệm thức có số rễ cao nhất là nghiệm thức bổ sung 60 g/l chuối và 150 ml/l nƣớc dừa cho số rễ là 3,8 rễ/mẫu. Tuy nhiên ở thí nghiệm này khảo sát ảnh hƣởng của chuối và nƣớc dừa lên sự nhân chồi và tạo cây, với các nồng độ chuối và nƣớc dừa trong thí nghiệm này phù hợp cho khả năng 56
  67. Đồ án tốt nghiệp nhân chồi của lan Giả hạc Châu Nhƣ hơn là tạo cây. Kết quả cho thấy số chồi đƣợc nhân lên nhiều, đồng đều còn sự phát sinh rễ ít có một số nghiệm thức không tạo rễ. Vì vậy thí nghiệm này có thể là bƣớc đệm cho các bƣớc tiếp theo nghiên cứu các nồng độ chuối và nƣớc dừa khác tác động tạo rễ cây lan Giả hạc Châu Nhƣ. Khi bổ sung chuối với các nồng độ 20, 40, 60 g/l thì ở các nghiệm thức bổ sung chuối với nồng độ 40 g/l cho trọng lƣợng tƣơi cao hơn 2 nồng độ còn lại. Với các nghiệm thức bổ sung nƣớc dừa thì trọng lƣợng tƣơi tăng khi tăng nồng độ bổ sung của nƣớc dừa từ 50 ml/l lên 100 ml/l và giảm khi tăng nồng độ nƣớc dừa lên 150 ml/l. Nghiệm thức khi kết hợp nồng độ chuối là 40 g/l và nƣớc dừa là 100 ml/l cho kết quả trọng lƣợng tƣơi cao nhất so với các nghiệm thức còn lại. Tuy nhiên, khi kết hợp 20 g/l chuối + 50 ml/l nƣớc dừa cho trọng lƣợng tƣơi thấp nhất so với các nghiệm thức còn lại. Kết quả trọng lƣợng khô tƣơng tự trọng lƣợng tƣơi, các nghiệm thức có trọng lƣợng tƣơi càng cao thì trọng lƣợng khô cũng cao và ngƣợc lại. Chồi cây sinh trƣởng trên môi trƣờng bổ sung 40 g/l chuối + 100 ml/l nƣớc dừa cho sự tăng trƣởng và phát triển tốt ở các chỉ tiêu số chồi, chiều cao chồi, số lá, với trọng lƣợng tƣơi và trọng lƣợng khô cao nhất trong các nghiệm thức. Trong đó, nghiệm thức này cũng cho phần trăm chất khô đạt giá trị cao nhất với 9,8%. Ở nghiệm thức bổ sung 20 g/l chuối + 50 ml/l nƣớc dừa cho kết quả thấp nhất ở hầu hết các chỉ tiêu theo dõi do nồng độ chuối và nƣớc dừa quá thấp không đủ để kích thích chồi phân hóa, nhân nhanh chồi và tăng trƣởng dẫn đến tình trạng chồi chậm phát triển, khiến số chồi, chiều cao chồi, số lá giảm. Nghiệm thức bổ sung 60 g/l chuối + 150 ml/l nƣớc dừa các chỉ tiêu cũng không phát triển tốt, điều này cho thấy bổ sung chuối và nƣớc dừa quá nhiều sẽ làm ức chế sự phát triển của chồi, có thể do áp lực thẩm thấu của môi trƣờng cao và ngăn chặn sự hấp thu nƣớc và các chất cần thiết cho sự phát triển của chồi lan Giả hạc Châu Nhƣ. Ở nghiệm thức bổ sung 40 g/l chuối và 100 ml/l nƣớc dừa lại cho kết quả tối ƣu ở các chỉ tiêu theo dõi. Các chồi đang trong quá trình sinh trƣởng và phát triển mạnh, do có sự bổ sung của 100 ml/l nƣớc dừa chứa chất thuộc nhóm Cytokinin, có tác dụng cho sự phân chia tế bào, giúp tăng chiều cao chồi. Sự bổ sung của 40 g/l chuối làm tăng hàm lƣợng 57
  68. Đồ án tốt nghiệp đƣờng và khoáng giúp cây phát triển, giúp rễ phát triển tuy số rễ phát sinh ở nghiệm thức này không phải nhiều nhất nhƣng cũng không chênh lệch quá nhiều so với nghiệm thức cho số rễ cao nhất. Nhờ tất cả các yếu tố trên nên nghiệm thức bổ sung nồng độ 40 g/l chuối + 100 ml/l nƣớc dừa là nghiệm thức tốt nhất cho sự nhân chồi và phát triển của lan Giả hạc Châu Nhƣ. Cụ thể kết quả các chỉ tiêu đạt giá trị cao với số chồi 3,68 chồi/mẫu, chiều cao chồi 17,2 mm, số lá đạt 5,08 lá/mẫu, trọng lƣợng tƣơi đạt 1238,4 mg, trọng lƣợng khô đạt 121,7 mg, hàm lƣợng chất khô 9,8%. Chồi phát triển tốt, mập, xanh, cao, khỏe. Vậy ở giai đoạn này môi trƣờng bổ sung 40 g/l chuối và 100 ml/l nƣớc dừa thích hợp nhất cho sự nhân chồi và tạo cây lan Giả hạc Châu Nhƣ. 58
  69. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Qua quá trình thực hiện đề tài và dựa vào các kết quả thí nghiệm đƣợc ghi nhận nhƣ sau: - Sau 8 tuần nuôi cấy, ở môi trƣờng bổ sung 1 mg/l BA + 0,1 mg/l NAA kết hợp với LED đỏ là thích hợp nhất đến khả năng nhân nhanh chồi lan Giả hạc Châu Nhƣ với 22,7 chồi, chồi nhiều, to. Trọng lƣợng tƣơi cao 3864 mg, trọng lƣợng khô cũng cho kết quả cao 279,1 mg. - Trong môi trƣờng khảo sát sự nhân chồi và tạo cây lan Giả hạc Châu Nhƣ, thì môi trƣờng có bổ sung 40 g/l chuối + 100 ml/l nƣớc dừa là thích hợp nhất với số chồi 3,68 chồi và chiều cao chồi 17,2 mm, chồi cao, thân to, nhiều lá, phiến lá to, nhiều rễ. 4.2. Kiến nghị Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên tôi xin đƣa ra những kiến nghị nhƣ sau: - Trên cơ sở nghiên cứu ảnh hƣởng của chất hữu cơ (chuối và nƣớc dừa) lên sự nhân chồi và tạo cây lan Giả hạc Châu Nhƣ, cho thấy hàm lƣợng chuối và nƣớc dừa trong thí nghiệm không tác động nhiều đến sự tạo rễ của lan. Do đó, cần những nghiên cứu thêm các môi trƣờng khác nhau nhằm tăng khả năng tạo rễ trên lan Giả hạc. - Tiếp tục khảo sát ảnh hƣởng của các loại đèn đến tỷ lệ sống của lan Giả hạc Châu Nhƣ ở giai đoạn hậu cấy mô. 59
  70. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1]. Ngô Xuân Bình ( 2009). Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Nhà xuất bản Khoa học và kĩ thuật. [2]. Võ Văn Chi, Dƣơng Đức Tiến (1987). Phân loại thực vật bậc cao, Nhà xuất bản Đại học và Trung học chuyên nghiệp Hà Nội. [3]. Nguyễn Thị Mỹ Duyên (2009). Nhân giống lan Dendrobium anosmum, Dendrobium mini bằng phương pháp nuôi cấy mô. Nghiên cứu các loại giá thể trồng lan Dendrobium mini thích hợp và cho hiệu quả cao, Trƣờng Đại học Công Nghiệp Thực Phẩm TP HCM. [4]. Lê Văn Hoàng (2008), Công nghệ nuôi cấy mô & tế bào thực vật, Nhà xuất bản Đà Nẵng. [5]. Nguyễn Thị Kim Hồng (2008). Ảnh hưởng của chất hữu cơ, nồng độ BA lên sự sinh trưởng và phát triển của lan Dendrobium sp. in vitro, ĐH Cần Thơ. [6]. Trần Hợp (1998). Phong lan Việt Nam, Nhà xuất bản Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh, 20. [7]. Trần Văn Huân, Văn Tích Lƣợm (2004). Kỹ thuật nuôi trồng cấy lan, Nhà xuất bản Mỹ Thuật. [8]. Phan Phúc Huân (2005). Hoa lan nuôi trồng và kinh doanh, Nhà xuất bản Phƣơng Đông. [9]. Dƣơng Công Kiên (2006). Nuôi cấy mô thực vật_tập 3, Tủ sách Đại học Quốc Gia TPHCM. [10]. Vũ Ngọc Lan và Nguyễn Thị Lý Anh (2013). Nhân giống in vitro loài lan bản địa Dendrobium nobile lindl, Viện Sinh học Nông nghiệp, Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội. 60
  71. Đồ án tốt nghiệp [11]. Trần Văn Minh (2010). Giáo trình nuôi cấy mô tế bào thực vật, Trung tâm Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia. [12]. Nguyễn Bá Nam, Lê Thị Thanh, Lê Thị Thanh Trà, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Đình Lâm, Dƣơng Tấn Nhựt (2014). Ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED bổ sung vào ban đêm sự sinh trưởng và phát triển trên ba giống Cúc (đóa vàng, sapphire và kim cương) được trồng trong nhà kính, Tạp chí Khoa học và Công nghệ. 52(3), 311-328. [13]. Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Phúc Huy, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Đình Lâm, Dƣơng Tấn Nhựt (2014). Hệ thống mới-Kết hợp công nghệ chiếu sáng LED và truyền điện không dây trong nghiên cứu sinh trưởng cây Dâu tây (Fragaria SP.) nuôi cấy in vitro, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 12(4), 667-677. [14]. Nguyễn Công Nghiệp (2004). Trồng hoa lan (in lần 3), Nhà xuất bản trẻ. [15]. Nguyễn Thanh Phƣơng, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Hồng Thắm (2014). Ảnh hưởng của một số loại đèn chiếu sáng và bình nuôi cấy đến sự sinh trưởng, phát triển của giống Cẩm chướng Hồng Hạc cấy mô, Tạp chí khoa học và phát triển, 12(7), 1015-1022. [16]. Nguyễn Thanh Sang, Nguyễn Bá Nam, Hoàng Thanh Tùng, Nguyễn Phúc Huy, Nguyễn Thị Kim Loan, Nguyễn Ngọc Thảo, Vũ Đức Trung, Nguyễn Văn An, Trần Thị Minh Loan, Nguyễn Văn Kết, Dƣơng Tấn Nhựt (2014). Sinh trưởng phát triển và hàm lượng chlorophyll trong chồi cây cúc (Chrysanthemum Morifolium Ramat. CV. “Jimba”) nuôi cấy in vitro dưới ánh sáng LED, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 12(2), 339-347. [17]. Nguyễn Thiện Tịch (1999). Hội HLCC - Tp HCM đƣợc trích bởi Trần Văn Bảo. [18]. Nguyễn Quỳnh Trang, Vũ Thị Huệ, Khuất Thị Hải Ninh, Nguyễn Thị Thơ (2013). Nhân giống in vitro lan phi điệp tím (Dendrobium anosmum), Tạp chí Khoa Học và Công nghệ Lâm nghiệp số 3 (kỳ I). 61
  72. Đồ án tốt nghiệp [19]. Đào Thanh Vân, Trịnh Thị Tố Nga (2008). Giáo trình hoa lan, Nhà xuất bản Nông nghiệp. [20]. Bùi Trang Việt (2002). Sinh lý thực vật đại cương, Nhà xuất bản quốc gia Tp. Hồ Chí Minh. Tài liệu Tiếng Anh [21]. Economou AS, Read PE (1987). Light treatments to improve efficiency of in vitro propagation systems, Hort Sci, 22, 751-754. [22]. Edwin F. George Ph. D (1993). Plan propagation by tissue culture, Part 2, Exexegetics Limited. [23].Fadelah Abdul Aziz (2010). Studied the compatibility in parental selection to increase the Dendrobium Doctor Sharil value. [24]. Heo Jw, Shin KS, Kim SK, Paek KY (2006). Light quality affects in vitro growth of grape Teleki 5BB7, Plant Biol, 49, 276-280. [25]. Huimin Li, Canming Tang, Zhigang Xu, Xiaoying Liu, Xuelin Han (2012). Effects of Different Light Sources on the Growth of Non-heading Chinese Cabbage (Brassica campestris L.), Journal of Agricultural Science Vol 4, 262-273. [26]. Lian ML, Murthy HH, Paek KY (2002). Effects of light emitting diodes (LEDs) on the in vitro induction and growth of bulblets of Lilium oriental hybid Pesaro, Sci Hortic Amsterdam, 94, 365-370. [27]. Nhut DT, Takamura T, Watanabe H, Okamoto K, Tanaka M (2003). Responses of strawberry plantlets cultured in vitro under superbright red and blue lightemitting diodes (LEDs), Plant Cell Tiss Org, 73, 43-52. [28]. Nhut D. T., Takamura T., Watanabe H., Okamoto K., and Tanaka M.- Artificial (2005). Light source using light-emitting diodes (LEDs) in the 62
  73. Đồ án tốt nghiệp efficient micropropagation of Spathiphyllum plantlets, Acta. Hort, 692, 137-142. [29]. Ni Putu Yuni Astriani Dewi (2016). Dendrobium anosmum Lindl was studied on embryo development. [30]. Smith, H. (1982). Light quality, photoperception, and plant strategy, Annu. Rev. Plant Physiol, 33, 481-518. [31]. Tanaka M, Takamura T, Watanabe H, Endo M, Panagi T, Okamoto K (1998). In vitro growth of Cymbidium plantlets cultured under superbright red and blue light-enmitting diodes, J Hortic Sci Biotech., 73, 39-44. [32]. Taiz L. and Zeiger E (2002), Plant Physiology, Benjamin/Cummings Publishing Co, NY, 111-143. [33]. Tuhuteru, S., M.L. Hehanussa, dan S.H.T, 2012. Pertumbuhan Dan Perkembangan Anggrek Dendrobium anosmum Pada Media Kultur In vitro Dengan Beberapa Konsentrasi Air Kelapa. Agrologia, 1(1), 1-12. [34]. Wang W.R., Zhang H.X., Zhao B., Zuan X.F. (2001). Improved growth of Artemisia annua L. hairy roots and artemisinin production under red light conditions, Biotechnol. Lett., 23, 1971-1973. Tài liệu Internet [35]. [36]. [37]. [38]. [39]. 63
  74. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC Phụ lục A: Bảng ANOVA phân tích kết quả thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA, NAA kết hợp với ánh sáng lên sự nhân chồi lan Giả hạc Châu Nhƣ Số chồi The GLM Procedure Dependent Variable: SOCHOI Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 11 1989.785185 180.889562 120.33 F BADEN 11 1989.785185 180.889562 120.33 F BADEN 11 1989.785185 180.889562 120.33 <.0001 The GLM Procedure Duncan's Multiple Range Test for SOCHOI NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 96 Error Mean Square 1.503241 Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Critical Range 1.147 1.207 1.247 1.276 1.299 1.317 1.332 1.345 1.356 1.366 1.374 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N BADEN A 22.7333 9 1LD B 20.5556 9 1.5LD 1
  75. Đồ án tốt nghiệp B C B 19.6222 9 1HQ C C 18.6444 9 0.5LD D 16.2000 9 1LT E 14.2889 9 1.5HQ E E 14.2222 9 1LX E E 14.1333 9 1.5LT F 10.8889 9 0.5HQ F F 10.8444 9 0.5LT F G F 10.1778 9 1.5LX G G 9.0667 9 0.5LX 2
  76. Đồ án tốt nghiệp Hàm lƣợng Chlorophyll The GLM Procedure Dependent Variable: CHLOROPHYLL Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 11 143.4438439 13.5858040 9.28 F BADEN 11 143.4438439 13.5858040 9.28 F BADEN 11 143.4438439 13.5858040 9.28 <.0001 The GLM Procedure Duncan's Multiple Range Test for CHLOROPHYLL NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 108 Error Mean Square 1.448941 Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Critical Range 1.051 1.107 1.143 1.170 1.191 1.208 1.222 1.233 1.244 1.252 1.260 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N BADEN A 8.2365 10 1HQ A B A 7.6462 10 1.5HQ B A B A 7.5395 10 1LT B B 7.0405 10 0.5HQ C C 5.9597 10 1LX C 3