Đồ án Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ cây Xidi Klung tại vườn Quốc gia Bidoup - Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng

129 trang thiennha21 12/04/2022 3550

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ cây Xidi Klung tại vườn Quốc gia Bidoup - Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_khao_sat_anh_huong_cua_dung_moi_tach_chiet_den_hoat_ti.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ cây Xidi Klung tại vườn Quốc gia Bidoup - Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA DUNG MÔI TÁCH CHIẾT ĐẾN HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT TỪ CÂY XIDI KLUNG TẠI VƢỜN QUỐC GIA BIDOUP – NÚI BÀ, TỈNH LÂM ĐỒNG Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hƣớng dẫn : ThS. Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Thanh Phƣớc MSSV: 1211100297 Lớp: 12DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2016
Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi đƣợc thực hiện trên cơ sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dƣới sự hƣớng dẫn của ThS. Phạm Minh Nhựt. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Tp.Hồ Chí Minh, ngày tháng năm Sinh viên Nguyễn Thị Thanh Phƣớc
Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trƣờng cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến thức quý báu cho em trong suốt những năm học vừa qua. Qua đây em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt, ngƣời đã định hƣớng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian làm khoá luận tốt nghiệp. Bên cạnh đó em xin cảm ơn các thầy cô ở Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trƣờng cùng các anh chị, bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài của mình. Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên con những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng nhƣ trong cuộc sống. Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm Sinh viên Nguyễn Thị Thanh Phƣớc
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vii MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 4 1.1. Vai trò của cây thuốc dân gian trong đời sống 4 1.1.1. Sơ lƣợc về nguồn tài nguyên cây thuốc 4 1.1.2. Vai trò của cây thuốc dân gian 4 1.1.3. Hoạt tính sinh học của cây thuốc 6 1.2. Các thành phần hóa học từ thực vật 7 1.2.1. Carbohydrate 7 1.2.2. Alkaloid 8 1.2.3. Glycoside 10 1.2.4. Tannin 16 1.2.5. Steroid 16 1.2.6. Amino acid 17 1.2.7. Isoprenoid (terpene) 19 1.3. Tổng quan về cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật.19 1.3.1. Khái niệm về hoạt tính kháng khuẩn 19 1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn 20 1.3.3. Một số hợp chất có khả năng kháng khuẩn từ thực vật 22 1.3.4. Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn của thực vật trên thế giới và tại Việt Nam . 28 1.3.5. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 31 1.4. Ảnh hƣởng của dung môi đến khả năng tách chiết cao từ thực vật 32 1.5. Tổng quan về một số nhóm vi khuẩn gây bệnh 33 1.5.1. Nhóm vi khuẩn Escherichia coli 33 i
Đồ án tốt nghiệp 1.5.2. Nhóm vi khuẩn Salmonella spp. 35 1.5.3. Nhóm vi khuẩn Shigella spp. . 36 1.5.4. Nhóm vi khuẩn Listeria spp. 37 1.5.5. Nhóm vi khuẩn Vibrio spp. 38 1.5.6. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Pseudomonas spp. 40 1.5.7. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Enterococcus spp 41 1.5.8. Nhóm vi khuẩn Staphylococcus aureus. 42 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44 2.1. Địa điểm và thời gian 44 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu 44 2.1.2. Thời gian nghiên cứu 44 2.2. Vật liệu nghiên cứu 44 2.2.1. Nguồn mẫu 44 2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị 44 2.2.3. Hóa chất, dung môi 44 2.2.4. Dụng cụ và thiết bị 45 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 46 2.3.1. Phƣơng pháp thu và xử lý nguồn mẫu 46 2.3.2. Phƣơng pháp tách chiết và thu nhận cao thực vật 46 2.3.3. Phƣơng pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 47 2.3.4. Phƣơng pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi sinh vật chỉ thị 48 2.3.5. Phƣơng pháp pha loãng mẫu 49 2.3.6. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 49 2.3.7. Phƣơng pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC 51 2.3.8. Phƣơng pháp xác định thành phần hóa học có trong cao chiết 51 2.3.9. Phƣơng pháp xử lý số liệu 54 2.4. Bố trí thí nghiệm 55 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của dung môi tách chiết đến hiệu suất thu hồi cao chiết từ Xidi Klung 56 ii
Đồ án tốt nghiệp 2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của các loại dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết. 59 2.4.3. Thí nghiệm 3: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết ethanol 70% từ cây Xidi Klung đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh. 62 2.4.4. Thí nghiệm 4: Định tính một số thành phần hóa học cơ bản của cao chiết ethanol 70% từ cây Xidi Klung. 65 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 68 3.1. Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi cao chiết Xidi Klung từ các dung môi tách chiết khác nhau 68 3.2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Xidi Klung với các loại dung môi tách chiết khác nhau trên các chủng vi khuẩn gây bệnh 69 3.2.1. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli 70 3.2.2. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp. 71 3.2.3. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Salmonella spp. 73 3.2.4. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp. 75 3.2.5. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp. 77 3.2.6. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da 78 3.2.7. Tổng hợp kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với 20 vi khuẩn gây bệnh 80 3.3. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết Xidi Klung từ ethanol 70% đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh 84 3.4. Kết quả định tính một số thành phần hóa học cơ bản của cao chiết Xidi Klung từ ethanol 70% 87 iii
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 91 4.1. Kết luận 91 4.2. Đề nghị 91 TÀI LIỆU THAM KHẢO 92 iv
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DMSO: Dimethyl sulfoxide DNA: Deoxyribonucleic acid MIC: Minimum Inhibition Concentration: Nồng độ ức chế tối thiểu RNA: Ribonucleic acid TSA: Trypton Soya Agar TSB: Trypton Soya Broth v
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Chức năng sinh lý của một số amino acid trong quá trình trao đổi chất 18 Bảng 1.2. Những nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn (theo Cowan, 1999) 21 Bảng 3.1. Kết quả đƣờng kính vòng ức chế (mm) của cao chiết Xidi Klung từ các loại dung môi khác nhau trên 20 chủng vi khuẩn gây bệnh 81 Bảng 3.2. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết Xidi Klung từ ethanol 70% đối với 20 chủng vi khuẩn gây bệnh 85 Bảng 3.3. Kết quả định tính một số thành phần hóa học của cao chiêt Xidi Klung từ ethanol 70% 88 vi
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Sơ đồ phân loại nhóm carbohydrate 7 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học một số chất thuộc nhóm alkaloid 9 Hình 1.3. Sơ đồ phân loại glycoside 10 Hình 1.4. Sơ đồ phân loại nhóm saponin 11 Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của flavonoid (A) và các dạng flavonoid 14 (B) Euflavonoid, (C) Isoflavonoid, (D) Neoflavonoid 14 Hình 1.6. Caffeic acid 15 Hình 1.7. Phân loại nhóm phenolics theo cấu trúc hóa học 15 Hình 1.8. Những vị trí của vi khuẩn bị tác động bởi các hợp chất thực vật (Burt, 2004) 20 Hình 1.9. Cấu trúc hóa học của phân tử quinone, anthraquinone và hypericin 23 Hình 1.10. Cấu trúc hóa học của catechine 24 Hình 1.11. Cấu trúc hóa học của coumarine 25 Hình 1.12. Cấu trúc hóa học của phân tử Solamargine 26 Hình 1.13. Cấu trúc hóa học của berberine 27 Hình 1.14. E.coli quan sát dƣới kính hiển vi với kích thƣớc 2 µm (Bact, 2005) 34 Hình 1.15. Hình thái vi khuẩn Salmonella spp. (Taragui, 2005) 35 Hình 1.16. Hình thái của vi khuẩn Shigella spp. (Reynolds, 2011) 37 Hình 1.17. Vi khuẩn Listeria spp. 38 Hình 1.18. Hình thái vi khuẩn Vibrio spp. (Microscopy, 2004) 39 Hình 1.19. Vi khuẩn Pseudomonas 40 Hình 1.20. Vi khuẩn Enterococcus 41 vii
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.21. Vi khuẩn Staphylococcus aureus 42 Hình 2.1. Mẫu Xidi Klung ngâm trong ethanol (tỷ lệ 1:20 (w/v)) 47 Hình 2.2. Phƣơng pháp pha loãng mẫu 49 Hình 2.3. Đƣờng kính vùng ức chế vi khuẩn của cao ethanol 70% và Ciprofloxacin 50 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 55 Hình 2.5. Quy trình tách chiết và thu hồi cao từ cây Xidi Klung 56 Hình 2.6. Mẫu bột Xidi Klung 57 Hình 2.7. Dịch chiết mẫu từ cây Xidi Klung ngâm với ethanol 70% 58 Hình 2.8. Quy trình đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết 60 Hình 2.9. Giếng thạch trƣớc và sau khi bổ sung cao 61 Hình 2.10. Vòng kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% (100 mg/ml) đối với chủng Staphylococcus aureus (A) và Samolnella enteritidis (B) 62 Hình 2.11. Quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết 63 Hình 2.12. Vòng kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% (25 mg/ml) đối với chủng Listeria monocytogenes 64 Hình 2.13. Quy trình định tính một số thành phần hóa học của cao chiết ethanol 70% từ cây Xidi Klung 65 Hình 3.1. Hiệu suất thu hồi cao chiết từ Xidi Klung với các dung môi khác nhau 68 Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Xidi Klung từ các loại dung môi khác nhau và Ciprofloxacin đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli 70 Hình 3.3. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Xidi Klung từ các loại dung môi khác nhau và Ciprofloxacin trên nhóm vi khuẩn Listeria spp. 72 Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Xidi Klung từ các loại dung môi khác nhau và Ciprofloxacin trên nhóm vi khuẩn Salmonella spp. 74 viii
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Xidi Klung từ các loại dung môi khác nhau và Ciprofloxacin trên nhóm vi khuẩn Shigella spp. 75 Hình 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Xidi Klung từ các loại dung môi khác nhau và Ciprofloxacin trên nhóm vi khuẩn Vibrio spp. 77 Hình 3.7. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Xidi Klung từ các loại dung môi khác nhau và Ciprofloxacin trên nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da 79 ix
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Thuốc chữa bệnh là một thành phần không thể thiếu trong cuộc sống chúng ta. Từ thời xa xƣa, ông cha ta vẫn luôn sử dụng các loại cây cỏ thiên nhiên để làm thuốc trị bệnh. Ngày nay, khi xã hội ngày càng phát triển cùng với những tiến bộ của khoa học kỹ thuật thì các nhà khoa học đã không ngừng nghiên cứu tạo ra các loại thuốc tây y giúp hỗ trợ điều trị bệnh tốt hơn, trong đó, phần lớn các loại thuốc là kháng sinh. Kháng sinh đƣợc biết đến nhƣ một nhóm thuốc chữa các bệnh do vi khuẩn gây ra, chúng có tác dụng tiêu diệt trực tiếp hoặc làm chậm sự phát triển của vi khuẩn để tạo điều kiện cho hệ miễn dịch của cơ thể ngƣời giải quyết tình trạng nhiễm khuẩn. Tuy nhiên, ngay từ khi kháng sinh ra đời thì cũng là lúc xuất hiện hiện tƣợng kháng thuốc. Mà nguyên nhân chủ yếu là do con ngƣời sử dụng kháng sinh tùy tiện, tràn lan, thiếu kiểm soát và lạm dụng nó nhƣ một loại thần dƣợc trị bệnh. Đặc biệt, tình trạng kháng thuốc ở nƣớc ta diễn ra trầm trọng hơn vì ngƣời dân có thể tự do mua kháng sinh ở các hiệu thuốc. Song, cũng xảy ra tình trạng không ít các dƣợc sỹ bán thuốc không đúng quy định, các bác sỹ điều trị kê đơn thuốc lạm dụng kháng sinh hoặc chỉ định kháng sinh không phù hợp dẫn đến hiện trạng nhiều chủng vi khuẩn kháng nhiều loại kháng sinh kể cả kháng sinh thế hệ mới. Bên cạnh đó, việc phát triển các kháng sinh mới đã chững lại từ hơn 30 năm nay, trong khi tỷ lệ kháng của vi khuẩn ngày càng gia tăng. Hậu quả của những việc trên là làm cho hiện tƣợng kháng thuốc trở thành vấn đề mang tính toàn cầu và gia tăng nhanh ở các nƣớc đang phát triển. Trên thế giới, mỗi năm có hàng trăm ngàn ngƣời chết do kháng thuốc và chi phí cho kháng thuốc lên đến hàng trăm tỷ USD. Điều đáng quan tâm hiện nay là Việt Nam là nƣớc sử dụng kháng sinh cao gấp 5 lần so với các nƣớc Châu Âu. Theo số liệu báo cáo của 15 bệnh viện trực thuộc Bộ Y, bệnh viện đa khoa tỉnh ở Hà Nội, Hải Phòng, Huế, Đà Nẵng, Hồ Chí Minh về việc sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh năm 2009 cho thấy có đến 30 – 70% vi khuẩn gram 1
Đồ án tốt nghiệp âm đã kháng với cephalosporin thế hệ 3 và thế hệ 4, gần 40 – 60% kháng với aminoglycosid, fluoroquinolon và tình trạng kháng ngày càng tăng nhanh. Để tìm ra giải pháp cho vấn đề kháng kháng sinh, ngày nay ngƣời ta bắt đầu quay trở lại với thiên nhiên. Sử dụng các nhóm chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ thực vật để thay thế dần các loại kháng sinh đã cấm sử dụng vì gây ảnh hƣởng xấu đến cơ thể con ngƣời. Tuy nhiên, phần lớn các cây thuốc đƣợc con ngƣời sử dụng chủ yếu dựa vào kinh nghiệm dân gian và truyền miệng từ đời này sang đời khác. Do đó, hoạt tính trị liệu và độc tính của 1 số loại vẫn chƣa đƣợc xác định cụ thể. Vì thế, việc đánh giá hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của 1 số cây thuốc là điều hết sức cần thiết. Với cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát ảnh hƣởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ cây Xidi Klung tại vƣờn Quốc gia Bidoup – Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng”. Đề tài này đƣợc thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh. 2
Đồ án tốt nghiệp 2. Mục tiêu nghiên cứu - Khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết Xidi Klung với nhiều loại dung môi tách chiết khác nhau. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết Xidi Klung. - Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của cao chiết từ cây Xidi Klung. 3. Nội dung nghiên cứu - Đánh giá ảnh hƣởng của các loại dung môi đến hiệu suất thu hồi cao chiết từ cây Xidi Klung với các dung môi methanol 75%, ethanol 50%, 70%, 90% và nƣớc. - Khảo sát sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết Xidi Klung từ các loại dung môi khác nhau đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh. - Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết Xidi Klung. - Xác định sự hiện diện một số thành phần hóa học của cao chiết Xidi Klung. 4. Phạm vi nghiên cứu - Mẫu cây Xidi Klung đƣợc tách chiết cao từ các loại dung môi khác nhau: methanol 75%, ethanol ( 50%, 70%, 90% ) và nƣớc khảo sát hoạt tính kháng khuẩn trên các nhóm vi khuẩn: Escherichia Coli, Samonella spp., Vibrio spp., Shigella spp., Listeria spp., Pseudomonas spp., Enterococcus spp., Staphylococcus spp. - Định tính các thành phần hóa học: carbohydrate, saponin, alkaloid, cardiac glycoside, anthraquinone glycoside, flavonoid, phenolic compound, tannin, steroid, amino acid. 3
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Vai trò của cây thuốc dân gian trong đời sống 1.1.1. Sơ lược về nguồn tài nguyên cây thuốc Lãnh thổ Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, có tới 3/4 diện tích cả nƣớc là rừng núi. Với đặc điểm khí hậu và địa hình nhƣ vậy nên nƣớc ta đƣợc đánh giá là nƣớc có nguồn tài nguyên sinh vật đa dạng và phong phú, đƣợc xếp thứ 16 trong số 25 quốc gia có mức độ đa dạng sinh vật cao nhất thế giới. Nguồn thực vật phong phú này đã cung cấp cho con ngƣời nhiều sản phẩm thiên nhiên có giá trị. Các sản phẩm thiên nhiên có hoạt tính sinh học đƣợc ứng dụng rất lớn trong nhiều lĩnh vực khác nhau của cuộc sống, đặc biệt là dùng làm thuốc chữa bệnh. Theo các nhà phân loại thực vật, nƣớc ta có khoảng 12 000 loài thực vật bậc cao, trong đó khoảng 3.948 loài đƣợc dùng làm dƣợc liệu (Viện dược liệu, 2007). Nếu so với khoảng 20.000 loài cây làm thuốc đã biết trên thế giới (IUCN, 1992) thì số loài cây thuốc ở Việt Nam chiếm khoảng 19%. Tuy có nguồn thực vật đa dạng và phong phú nhƣng do chúng phân bố rải rác ở nhiều nơi, cùng với sự khai thác nhƣng không có kế hoạch bảo tồn nên dẫn đến tình trạng trữ lƣợng các loài cây ngày càng ít đi. Thế nên, hiện nay chúng ta cần khai thác có hiệu quả về hoạt tính sinh học của các loài cây và duy trì trồng lại các giống đã khai thác, để tạo ra các loại thuốc trị bệnh mới đem lại lợi ích cho con ngƣời nhƣng không làm cạn kiệt nguồn tài nguyên nƣớc nhà. 1.1.2. Vai trò của cây thuốc dân gian 1.1.2.1. Trong y học Cây thuốc đƣợc coi là di sản quý báu của dân tộc ta. Từ xa xƣa, cây thuốc gắn liền với cuộc sống của các gia đình ngƣời Việt và có giá trị lớn trong điều trị bệnh. Tuy chỉ là những cỏ cây gần gũi, thân quen xung quanh con ngƣời nhƣng chúng đƣợc sử dụng tạo ra các bài thuốc rất hữu hiệu. Các loài thuốc thảo mộc ít gây tác dụng phụ, độc hại cho ngƣời sử dụng và có khả năng dung nạp tốt với cơ thể sống. Hiện nay, hoạt tính kháng khuẩn của cây thuốc ngày càng đƣợc nghiên cứu và phát triển nhiều hơn bởi các nhà khoa học đã nhận ra các giá trị to lớn từ cây thuốc mang 4
Đồ án tốt nghiệp lại cho việc điều trị bệnh. Trong thời đại mà việc sử dụng thuốc kháng sinh không còn hiệu quả thì thảo dƣợc tự nhiên là câu trả lời đáng tin cậy và dài hạn cho việc ức chế vi sinh vật có hại và nâng cao đề kháng, hỗ trợ tốt cho quá trình điều trị bệnh. Theo một số nghiên cứu, các loại thảo dƣợc điển hình nhƣ Trầu không (Piper betle L.), Sống đời (Kalanchoe pinnata (Lam). Pers.), Lô hội (Aloe barbadensis), Dâu Tằm (Morus acidosa Griff), Khổ qua (Momordica charantia L.) đã đƣợc xác định là có hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh đối với nhiều loại vi khuẩn nhƣ Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp. Chính vì thế mà ngày nay, không chỉ riêng ở Việt Nam mà cả trên thế giới, các nhà khoa học không ngừng nghiên cứu và tìm hiểu sâu hơn về hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của các loài thực vật. Điều này giúp họ sử dụng hiệu quả hơn các nguồn dƣợc liệu sẵn có, đồng thời phát hiện thêm các loại thảo dƣợc mới, quý hiếm, có khả năng kháng đƣợc nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh. 1.1.2.2. Trong đời sống – kinh tế Cây thuốc không chỉ có giá trị trực tiếp để chữa bệnh và chăm sóc sức khoẻ, nếu biết bảo tồn và khai thác hợp lý thì đó còn là một nguồn thu nhập trong phạm vi hộ gia đình và các cộng đồng địa phƣơng. Nếu tổ chức trồng cây thuốc trên quy mô lớn để tạo ra nguồn hàng hoá trên thị trƣờng thì nó còn góp phần vào sự tăng trƣởng kinh tế cho đất nƣớc. Trên thế giới, nhiều nƣớc đã xuất khẩu dƣợc liệu và thu đƣợc nguồn ngoại tệ đáng kể. Ví dụ: ở Trung Quốc, vị thuốc Đông trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis) có giá tới 2000 - 5000 USD/Kg. Hoặc ở Triều Tiên, cây Nhân sâm đã mang lại một nguồn lợi kinh tế khá lớn cho những cơ sở trồng trọt và sản xuất thuốc từ cây này. Hằng năm, công ty Hồng sâm (Hàn Quốc) đã sử dụng trên 6.000 tấn Nhân sâm, để tạo ra giá trị sản phẩm trên 460 triệu USD. Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, thích hợp cho sự phát triển của cây trồng nói chung. Một số vùng cao lại có khí hậu á nhiệt đới, phù hợp với việc trồng cây thuốc ƣa khí hậu mát mẻ. Đất đai ở miền núi nƣớc ta, đặc biệt trên dãy Trƣờng Sơn rộng lớn, còn rất nhiều đất hoang chƣa đƣợc khai thác sử dụng để phát triển kinh tế. Nếu ngƣời dân biết cách chuyển đổi cơ cấu cây trồng, kết hợp 5
Đồ án tốt nghiệp trồng rừng với trồng cây thuốc ở những nơi có khí hậu và đất đai phù hợp sẽ làm nâng cao thu nhập, cải thiện đời sống, góp phần tích cực trong việc xoá đói giảm nghèo cho ngƣời dân ở vùng núi (Trần Công Khánh, 2008). 1.1.3. Hoạt tính sinh học của cây thuốc Cây cỏ là nguồn không thể thiếu của các sản phẩm tự nhiên sử dụng làm thuốc, tác dụng chữa bệnh của chúng là do các hợp chất tự nhiên bên trong quyết định. Các hợp chất thiên nhiên từ thực vật rất phong phú về mặt cấu trúc hóa học và thể hiện nhiều hoạt tính sinh học đáng quan tâm nhƣ: kháng khuẩn, kháng sinh, kháng viêm, chống oxy hóa, chống ung thƣ, chống sốt rét, điều hòa miễn dịch Hiện nay, thảo dƣợc chủ yếu đƣợc sử dụng ở 2 dạng: một là trong hỗn hợp các thành phần khác nhau (hỗn hợp tinh dầu, dịch chiết, dịch cô, chƣng cất ), hai là sử dụng các hoạt chất đơn lẻ. Các hoạt chất đơn lẻ đƣợc cho là thành phần có hoạt tính chính trong thảo dƣợc, chúng thể hiện hoạt tính rất cao, đặc hiệu nhƣng yêu cầu liều dùng và cách sử dụng chính xác. Còn các dịch chiết, hỗn hợp sẽ áp dụng cho các loại thảo dƣợc thể hiện dƣợc tính thấp hoặc chƣa phát hiện ra hoạt chất chủ yếu có trong chúng. Nhiều hoạt chất từ cây cỏ đã và đang đƣợc ứng dụng làm thuốc và đƣợc quan tâm sản xuất ở nhiều nƣớc nhƣ reserpin từ cây ba gạc (Rawofia serpantina (L.) Benth. ex Kurz), quinidin, quinin tử cây canh ki na (Cinchona spp.) Và gần đây, nhiều hoạt chất sinh học có tác dụng chữa trị các bệnh hiểm nghèo (chống ung thƣ, chống HIV, tăng cƣờng miễn dịch cơ thể ) đã đƣợc phát hiện từ cây cỏ nhƣ taxol, 10-deacetyl baccatin từ loài thông đỏ (Taxus spp.), (+)-calanoid A và (-)-calanoid B từ các loài mù u (Calophyllum lanigerum Miq., C. teysmanii Miq.), các nhóm chất cucurmin từ chi nghệ (Cucurma L.) và rất nhiều hợp chất thiên khác có trong nhiều loài thực vật. Việt Nam có lợi thế nguồn tài nguyên thực vật phong phú, với khoảng 4000 loài cây đƣợc dùng làm dƣợc liệu đang thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trong nƣớc và trên thế giới. Do đó việc điều tra nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của các loài cây thuốc có giá trị nhằm đặt cơ sở khoa học cho việc phát 6
Đồ án tốt nghiệp triển các dƣợc phẩm và sử dụng chúng một cách hợp lý, hiệu quả có tầm quan trọng đặc biệt. 1.2. Các thành phần hóa học từ thực vật 1.2.1. Carbohydrate 1.2.1.1. Khái niệm Carbohydrate là một nhóm chất hữu cơ phổ biến khá rộng rãi trong cơ thể sinh vật. Đƣợc cấu tạo từ các nguyên tố: C, H, O với công thức cấu tạo chung Cm(H2O)n, thƣờng m = n (Phùng Trung Hùng và ctv, 2013). Nhìn chung hàm lƣợng carbohydrate ở thực vật cao hơn động vật. Ở thực vật, carbohydrate thay đổi tùy theo loài, giai đoạn sinh trƣởng và phát triển. - Thực vật: chiếm khoảng 75% trong các bộ phận nhƣ củ, quả, lá, thân, cành. - Động vật: chiếm khoảng 2% trong gan, cơ máu, (Phùng Trung Hùng và ctv, 2013). 1.2.1.2. Phân loại Dựa vào cấu tạo, tính chất carbohydrate đƣợc chia làm ba nhóm lớn: monosaccharide, oligosaccharide (Disaccharide) và polysaccharide (Phùng Trung Hùng và ctv, 2013). Hình 1.1. Sơ đồ phân loại nhóm carbohydrate 7
Đồ án tốt nghiệp 1.2.1.3. Vai trò Trong cơ thể sống carbohydrate giữ nhiều vai trò quan trọng: - Đảm bảo cung cấp khoảng 60% năng lƣợng cho các quá trình sống. - Có vai trò cấu trúc, tạo hình (ví dụ: cellulose, peptidoglican ). - Có vai trò bảo vệ (mucopolysaccharide). - Chống tạo thể cetone (mang tính acid gây độc cho cơ thể) (Nguyễn Phƣơng Hà Linh Linh, 2011). 1.2.2. Alkaloid 1.2.2.1. Khái niệm Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thƣờng gặp trong thực vật và đôi khi trong động vật. Thông thƣờng các alkaloid kiềm không tan trong nƣớc, dễ tan trong các dung môi hữu cơ. Trái lại các muối alkaloid thì dễ tan trong nƣớc và hầu nhƣ không tan trong các dung môi hữu cơ ít phân cực. Từ đó, dựa vào độ tan khác nhau của các loại alkaloid mà sử dụng dung môi thích hợp để chiết xuất và tinh chế alkaloid. Alkaloid là amin có nguồn gốc tự nhiên do thực vật tạo ra, nhƣng các amin do động vật và nấm tạo ra cũng đƣợc gọi là các alkaloid. Nhiều alkaloid có các tác động dƣợc lý học đối với con ngƣời và các động vật khác. Các alkaloid thông thƣờng là các dẫn xuất của các acid amin và phần nhiều trong số chúng có vị đắng. Chúng đƣợc tìm thấy nhƣ là các chất chuyển hóa phụ trong thực vật (ví dụ khoai tây hay cà chua), động vật (ví dụ các loại tôm, cua, ốc, hến) và nấm. Nhiều alkaloid có thể đƣợc tinh chế từ các dịch chiết thô bằng phƣơng pháp chiết acid - base (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010). Alkaloid có 2 phản ứng chính là phản ứng tạo tủa và phản ứng tạo màu. Có 2 nhóm thuốc thử tạo tủa với alkaloid. Nhóm thứ nhất cho tủa rất ít tan trong nƣớc, tủa này sinh ra hầu hết là do sự kết hợp của 1 cation lớn là alkaloid với 1 nhóm anion lớn thƣờng là anion phức hợp của thuốc thử và nhóm thứ hai cho kết tủa ở dạng tinh thể. Đối với phản ứng tạo màu, có 1 số thuốc thử tác dụng với alkaloid cho những màu đặc biệt khác nhau. Phản ứng tạo tủa cho ta biết có alkaloid hay 8
Đồ án tốt nghiệp không, còn phản ứng tạo màu cho biết những chất có trong alkaloid (Phạm Thanh Kỳ, 1998). 1.2.2.2. Phân loại Các nhóm alkaloid hiện nay bao gồm: - Nhóm pyridine: piperin, coniin, trigonellin, arecaidin, guvacin, pilocarpin, nicotin, spartein, pelletierin. - Nhóm isoquinolin: các ancaloit gốc thuốc phiện nhƣ morphin, codein, thebain, papaverin, narcotin, sanguinarin, narcein, hydrastin, berberin. - Nhóm pyrrolidin: hygrin, cuscohygrin, nicotin. - Nhóm tropan: atropine, cocain, ecgonin, scopolamine. - Nhóm quinolin: quinine, quinidine, dihydroquinin, dihydroquinidin, strychnine, brucin, veratrin, cevadin. - Nhóm phenothylamin: mescalin, ephedrine, dopamine, amphetamine. - Nhóm indole: o Các tryptamin: DMT, N-metyltryptamin, psilocybin, serotonin o Các ergolin: Các ancaloit từ nhựa ngũ cốc/cỏ nhƣ ergin, ergotamine, acid lysergic v.v o Các beta-cabolin: harmin, harmalin, yohimbin, reserpine, emetin - Nhóm purin: Các xanthin nhƣ caffeine, theobromin, theophylline (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010). Hình 1.2. Cấu trúc hóa học một số chất thuộc nhóm alkaloid 9
Đồ án tốt nghiệp 1.2.2.3. Vai trò Đa số các alkaloid đều có tác dụng diệt khuẩn, một số loại có tác động lên hệ thần kinh nhƣ morphin, codein, cocain, Ngoài ra, alkaloid còn làm hạ huyết áp và giúp chống ung thƣ (Vũ Xuân Tạo, 2013). 1.2.3. Glycoside 1.2.3.1. Khái niệm Glycoside là những sản phẩm ngƣng tụ của đƣờng. Cấu tạo gồm 1 phần đƣờng (glycon) kết hợp với 1 phần không phải là đƣờng (aglycon) theo Vũ Kim Dung và ctv (2011). Hai phần liên kết với nhau bằng dây nối acetal vì vậy phân tử glycoside dễ bị phân huỷ khi có nƣớc dƣới ảnh hƣởng của các enzyme (men) có chứa trong cây. Bản chất glycoside gồm cả phần carbohydrate và phi carbohydrate (alcohol). Đây là dạng tinh thể không màu và tác dụng của glycoside phụ thuộc vào phần aglycon còn phần glycon giúp tăng hoặc giảm tác dụng của chúng. Glycoside dễ bị hòa tan trong nƣớc, có vị đắng và tạo mùi thơm đặc trƣng (Trần Trƣờng Hận, 2010). 1.2.3.2. Phân loại Glycoside có 3 cách phân loại dựa vào thành phần glycon, aglycon và kiểu liên kết giữa chúng (Vũ Kim Dung và ctv, 2011). Hình 1.3. Sơ đồ phân loại glycoside 10
Đồ án tốt nghiệp 1.2.3.3. Vai trò Glycoside giữ vai trò là nguồn dinh dƣỡng cho cơ thể. Ngoài ra chúng còn có vai trò bảo vệ bằng cách tạo ra thể gây độc, qua quá trình thủy phân tạo ra một số chất kháng khuẩn thƣờng tập trung ở vỏ và hạt nhƣ độc tố Solanine ở khoai tây (Trần Trƣờng Hận, 2010). Một số glycoside quan trọng:  Saponin a. Khái niệm Saponin là một glycoside tự nhiên thƣờng gặp trong nhiều loài thực vật. Dƣới tác dụng của các enzyme thực vật, vi khuẩn hay acid loãng, saponin bị thuỷ phân thành genin (sapogenin) và phần carbohydrate (Ngô Văn Thu, 2011). Saponin thƣờng ở dạng vô định hình, có vị đắng, tan đƣợc trong nƣớc, alcohol và rất ít tan trong aceton, ether, hexan. Khi hòa tan saponin vào nƣớc sẽ làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo bọt (Nguyễn Tấn Thịnh, 2013). b. Phân loại Saponin đƣợc chia thành 2 nhóm là saponin triterpenoid và saponin steroid (Nguyễn Tấn Thịnh, 2013). Hình 1.4. Sơ đồ phân loại nhóm saponin 11
Đồ án tốt nghiệp c. Vai trò Vai trò của saponin: - Tác dụng long đờm, chữa ho, lợi tiểu (liều cao gây nôn mửa, đi lỏng). - Một số saponin có tác dụng chống viêm. - Một số có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế virus. - Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt.  Anthraquinone glycoside a. Khái niệm Anthraquinone glycoside thƣờng tồn tại dƣới dạng glycoside. Ða số các anthraquinone glycoside là các polyoxy anthraquinone và nhân thƣờng gắn các nhóm chức -OH, -OCH3, -CH3, -COOH, Tuỳ theo vị trí các nhóm chức đính vào nhân mà có các dẫn chất khác nhau (Ngô Văn Thu, 2011). Những dẫn xuất anthraquinone glycoside đều có màu từ vàng, vàng cam đến đỏ. Ở thể glycoside thì dễ tan trong nƣớc, còn thể tự do (aglycon) thì tan trong ether, chloroform và một số dung môi hữu cơ khác (Ngô Văn Thu, 2011). b. Phân loại Dẫn xuất anthraquinone glycoside có thể chia thành ba nhóm: - Nhóm phẩm nhuộm (các dẫn chất 1,2 dihydroxy anthraquinone). - Nhóm nhuộm tẩy (các dẫn chất 1,8 dihydroxy anthraquinone). - Nhóm dimer (Ngô Văn Thu, 2011). c. Vai trò Một số nghiên cứu cho thấy các dẫn xuất anthraquinon glycoside có tác dụng kích thích miễn dịch chống ung thƣ (Ngô Văn Thu, 2011).  Cardiac glycoside a. Khái niệm Cardiac glycoside là các glycoside thực vật, bao gồm hai phần là phần aglycone (không đƣờng) và các glycine hay phần đƣờng (Karkare, 2007). Cardiac glycoside là những chất kết tinh, không màu, có vị đắng. Chúng tan trong các dung môi phân cực và dễ bị thủy phân trong môi trƣờng acid (Karkare, 2007). 12
Đồ án tốt nghiệp b. Vai trò Vai trò của cardiac glycoside: - Ở nồng độ thấp: có tác dụng điều hòa nhịp tim. - Ở nồng độ cao: gây nôn mửa, loạn nhịp tim, tiêu chảy, giảm sức co bóp của tim (Karkare, 2007).  Flavonoid a. Khái niệm Flavonoid là 1 nhóm hợp chất lớn thƣờng gặp trong thực vật, đây còn là sắc tố sinh học giúp tạo màu sắc cho hoa. Flavonoid có cấu tạo gồm 2 vòng benzen A và B đƣợc nối với nhau qua một mạch 3 carbon. Phần lớn các chất flavonoid có màu vàng, tuy nhiên 1 số có màu xanh, tím, đỏ và 1 số khác lại không màu. Trong thực vật cũng có 1 số hợp chất không thuộc flavonoid cũng có màu vàng nhƣ carotenoid, anthranoid, xanthon (Quỳnh Ngọc, 2011). Chúng thƣờng đƣợc cải biến bằng cách gắn thêm các gốc (-OH) hoặc (-OCH3) và thƣờng ở dạng phức với glucose và hữu cơ. Trong số này có những nhóm chất phổ biến nhƣ flavonone, anthocyanin, flavon, catechine và rotenone Chỉ riêng hai nhóm flavon, flavonone với các nhóm thế là OH và OCH3 thì theo lý thuyết có thể gặp 38 627 chất (Ngô Văn Thu, 1998). Các flavonoid có hoạt tính kháng khuẩn do chúng có khả năng tạo phức với các protein ngoại bào và thành tế bào vi khuẩn. Flavonoid càng ƣa béo thì càng có khả năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật (Quỳnh Ngọc, 2011). b. Phân loại Dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và các mức độ oxy hóa của mạch 3 C nên các flavonoid đƣợc chia thành 3 nhóm chính: - Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-2: Euflavonoid. - Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-3: Isoflavonoid. - Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-4: Neoflavonoid (Ngô Văn Thu, 2011). 13
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của flavonoid (A) và các dạng flavonoid (B) Euflavonoid, (C) Isoflavonoid, (D) Neoflavonoid c. Vai trò - Các chất flavonoid là những chất oxy hóa chậm hay ngăn chặn quá trình oxy hóa bởi các gốc tự do nhƣ OH+, ROO- (là các yếu tố gây biến dị, hủy hoại tế bào, ung thƣ, tăng nhanh sự lão hóa, ) làm cho tế bào hoạt động khác thƣờng. - Flavonoid còn có khả năng tạo phức với các ion kim loại hay các hợp chất hữu cơ chứa các gốc nitrite, carboxyl, carbonyl, giúp bảo vệ sinh vật chống lại quá trình oxy có hại nhƣ những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hóa. Do đó, các chất flavonoid có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hóa, tổn thƣơng do bức xạ. Flavonoid còn có tác dụng chống độc, làm giảm thƣơng tổn ở gan và bảo vệ chức năng gan. - Flavonoid còn có tác dụng chống dị ứng, kháng viêm bằng cách ngăn chặn sự phóng thích hay tổng hợp các hợp chất làm tăng tình trạng viêm và dị ứng nhƣ histamine, serine protease, prostaglandin, leukotrien, (Quỳnh Ngọc, 2011).  Phenolic a. Khái niệm Hợp chất phenolic là các hợp chất có 1 hoặc nhiều vòng thơm với 1 hoặc nhiều nhóm hydroxyl, chúng đƣợc phân bố rộng rãi trong thực vật và các sản phẩm trao đổi chất của thực vật. Hơn 8000 cấu trúc phenolic đã đƣợc tìm thấy từ các phân tử đơn giản nhƣ các acid phenolic đến các hợp chất polymer nhƣ tannin. Sự tích lũy 14
Đồ án tốt nghiệp các hợp chất phenolic phụ thuộc vào loài, trạng thái sinh lý và vị trí địa lý của các loài cây (Shetty và ctv, 2006). Đa số các hợp chất phenolic đƣợc tổng hợp từ phenylalanine. Ở thực vật nhóm phenolic chủ yếu đƣợc tìm thấy là caffeic acid, đây là 1 trong những hợp chất đơn giản có độc tính sinh học và đƣợc cấu tạo từ dẫn xuất thế vòng phenolic. Một số phenolic nhƣ furanocoumarins thì không gây độc, nhƣng khi tiếp xúc với nhiệt độ cao, dƣới ánh sáng có bƣớc sóng gần với tia tử ngoại (UV-A) thì nó trở nên rất độc (Nguyễn Thị Quỳnh Hoa, 2012). Hình 1.6. Caffeic acid b. Phân loại Phenolic chia làm hai nhóm: Hình 1.7. Phân loại nhóm phenolics theo cấu trúc hóa học c. Vai trò Vai trò của nhóm phenolic: - Bảo vệ thực vật chống lại mầm bệnh, côn trùng và các động vật ăn cỏ. - Khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật và nấm sợi. - Chất chống oxi hóa tự nhiên và tìm thấy trong táo, trà xanh. - Chống ung thƣ, ngăn ngừa bệnh tim và kháng viêm (Nguyễn Thị Quỳnh Hoa, 2012). 15
Đồ án tốt nghiệp 1.2.4. Tannin 1.2.4.1. Khái niệm “Tannin” đƣợc dùng đầu tiên vào năm 1796 để chỉ những chất có mặt trong dịch chiết từ thực vật có khả năng kết hợp với protein của da sống động vật làm cho da biến thành da thuộc không thối và bền. Do đó, tanin đƣợc định nghĩa là những hợp chất polyphenol có trong thực vật, có vị chát đƣợc phát hiện dƣơng tính với “thí nghiệm thuộc da”. Tannin có khả năng tạo liên kết bền vững với các protein và các hợp chất hữu cơ cao phân tử khác (amino acid và alkaloid). Chúng thƣờng gặp chủ yếu trong thực vật bậc cao ở những cây hai lá mầm. Tannin tan trong nƣớc, kiềm loãng, cồn, glycerin và aceton, đa số không tan trong các dung môi hữu cơ và đồng thời tủa với alkaloid, muối kim loại nặng (chì, thuỷ ngân, kẽm, sắt). 1.2.4.2. Phân loại Tannin có thể chia thành hai loại chính: - Tannin thủy phân đƣợc hay còn gọi là tanin pyrogalli (Gallic acid). - Tannin ngƣng tụ hay còn gọi là tanin pyrocatechic (Flavone). 1.2.4.3. Vai trò Vai trò của tannin: - Bảo vệ thực vật khỏi các loài côn trùng, tác dụng nhƣ thuốc trừ sâu. - Tác dụng kháng khuẩn, thƣờng dùng làm thuốc súc miệng. - Công dụng chữa viêm ruột, tiêu chảy (Ngô Thị Thùy Dƣơng, 2012). 1.2.5. Steroid 1.2.5.1. Khái niệm Steroid là một loại hợp chất hữu cơ, có bộ khung carbon stenan chứa bốn vòng cycloalkane đƣợc nối với nhau theo những cách đặc trƣng riêng (Đặng Văn Hoài, 2009). Steroid là hợp chất chất béo hữu cơ hòa tan, có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp dễ tan trong chloroform, ether, rƣợu nóng và không tan trong nƣớc (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2011). 16
Đồ án tốt nghiệp 1.2.5.2. Phân loại Steroid đƣợc chia làm 4 nhóm chính (Đặng Văn Hoài, 2009): - Nhóm steroid động vật: Cholesterol, cholestan-3β-ol, coprostan-β-ol, desosterol, coprosterol, cerebrosterol và lathosterol. - Nhóm steroid của động vật biển không xƣơng sống: Spongesterol, clionasterol, 24-methylencholesterol và fucosterol. - Nhóm steroid thực vật: Sistosterol (có các đồng phân α,β,y), stigmasterol, α- spinasterol và brassicasterol. - Nhóm sterol nấm men: Ergosterol, zymosterol, acosterol và fecosterol. 1.2.5.3. Vai trò - Tham gia vào các quá trình sinh học trong cơ thể sống. - Thƣờng dùng làm các thuốc kích thích (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2011). 1.2.6. Amino acid 1.2.6.1. Khái niệm Amino acid là đơn vị cấu trúc cơ bản của protein. Amino acid là một phân tử chứa cả nhóm amin và carboxylate, chúng tạo thành các xích polymer ngắn gọi là peptide hay polypeptides.Tất cả amino acid tự nhiên đều thuộc loại α-amino acid, nhóm amino (-NH2) gắn vào cacbon thứ 2 (hay cacbon α) của acid hữu cơ. Ngoài các nhóm –NH2, −COOH, trong amino acid tự nhiên còn chứa các nhóm chức khác nhƣ: −OH, HS−, −CO− 1.2.6.2. Phân loại Dựa vào cấu tạo gốc R để phân 20 amino acid cơ bản thành các nhóm. Một trong các cách phân loại là 20 amino acid đƣợc phân thành 5 nhóm nhƣ sau (Hồ Chí Tuấn, 2009): - Nhóm 1: Các amino acid có gốc R không phân cực kị nƣớc, thuộc nhóm này có 6 amino acid: Glysine (G), Alanine (A), Valine (V), Leucine (L), Isoleucine (I), Proline (P). - Nhóm 2: Các amino acid có gốc R là nhân thơm thuộc nhóm này có 3 amino acid: Phenylanine (F), Tyrosine (Y), Tryptophan (W). 17
Đồ án tốt nghiệp - Nhóm 3: Các amino acid có gốc R bazơ, tích điện dƣơng, thuộc nhóm này có 3 amino acid: Lysine (K), Arginine (R), Histidine (H). - Nhóm 4: Các amino acid có gốc R phân cực, không tích điện, thuộc nhóm này có 6 amino acid: Serine (S), Threonine (T), Cysteine (C), Methionine (M), Asparagine (N), Glutamine (Q). - Nhóm 5: Các amino acid có gốc R acid, tích điện âm, thuộc nhóm này có 2 amino acid: Aspartate (D), Glutamate (E). 1.2.6.3. Vai trò Vai trò của amino acid trong cơ thể thực vật: - Thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp trao đổi chất. - Tăng hiệu quả của thuốc bảo vệ thực vật. - Tăng khả năng ra hoa và quả. Bảng 1.1. Chức năng sinh lý của một số amino acid trong quá trình trao đổi chất Amino Acid Hoạt động sinh hóa Glycine Là tiền chất của cholorophyll Proline Điều chỉnh trạng thái cân bằng nƣớc Hydroxyproline Cấu tạo nên thành tế bào (nematostatic action) Thiết yếu để tạo phấn hoa (tốt cho đậu trái) Glutamic Đạm hữu cơ dự trữ để tạo thành các amino acid khác Glutamine và protein thông qua phản ứng trao đổi Serine Điều chỉnh trạng thái cân bằng nƣớc, rất quan trọng cho quá trình tổng hợp cholorophyll Arginine Là tiền chất của polyamine, rất quan trọng để để phân chia tế bào Phenylalanine Tiền chất cấu tạo nên lignine, tạo các chồi gỗ khỏe hơn 18
Đồ án tốt nghiệp Alanine Vai trò rất quan trọng trong việc tạo hoocmon trao đổi chất và kháng virus Tryptophan Tiền tố của indol-acetic acid, các chất kích thích sinh trƣởng tự nhiên 1.2.7. Isoprenoid (terpene) 1.2.7.1. Khái niệm Isoprenoid (terpene) là một nhóm chất lớn và đa dạng. Bộ khung carbon đƣợc tạo thành từ đơn vị cơ bản isoprene - C5H8. Terpene có nhiều ở thực vật đặc biệt là loài họ thông. 1.2.7.2. Phân loại Phân loại dựa và số đơn vị isoprene cấu thành phân tử: - Sesterterpenoid (5 đơn vị) - Triterpenoid (6 đơn vị) - Tetraterpenoid (8 đơn vị) - Polyterpenoid (n đơn vị) - Monoterpenoid (2 đơn vị) - Sesquiterpenoid (3 đơn vị) - Diterpenoid (4 đơn vị) 1.2.7.3. Vai trò - Ức chế sự tăng trƣởng của vi khuẩn ngăn ngừa ung thƣ. - Bảo vệ thực vật. - Có khả năng xua đuổi côn trùng. 1.3. Tổng quan về cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật. 1.3.1. Khái niệm về hoạt tính kháng khuẩn Kháng khuẩn thực vật là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực vật, có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật. Các chất kháng 19
Đồ án tốt nghiệp khuẩn thƣờng có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở một nồng độ thƣờng rất nhỏ (Silva và Fernandes, 2010). 1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn Cơ chế hoạt động khác nhau của các hợp chất kháng khuẩn có trong thực vật đã đƣợc nghiên cứu. Chúng có thể ức chế các vi sinh vật, gây trở ngại cho một số quá trình trao đổi chất hoặc có thể điều chỉnh biểu hiện gen và con đƣờng truyền tín hiệu (Etherton và ctv, 2002; Manson, 2003; Surh, 2003). Không phải tất cả các cơ chế hoạt động đều làm việc trên các mục tiêu cụ thể, và một số vùng khác của tế bào có thể bị ảnh hƣởng bởi các cơ chế khác (Hình 1.8). Hình 1.8. Những vị trí của vi khuẩn bị tác động bởi các hợp chất thực vật (Burt, 2004) Cao chiết từ các loại thực vật có thể biểu hiện hoạt tính kháng lại các chủng vi khuẩn ở các mức độ khác nhau nhƣ sự can thiệp vào các lớp đôi phospholipid của màng tế bào gây hậu quả làm gia tăng độ thấm, tổn hại các thành phần tế bào, phá hủy các enzyme tham gia vào việc hình thành năng lƣợng tế bào, tổng hợp các thành phần cấu trúc, và đồng thời phá hủy hoặc làm bất hoạt các vật liệu di truyền. Nói chung, cơ chế tác động của hợp chất kháng khuẩn tự nhiên có liên quan đến sự 20
Đồ án tốt nghiệp rối loạn, phá vỡ màng tế bào chất, làm gián đoạn mất ổn định lực chuyển động của proton (PMF), dòng điện tử, sự vận chuyển tích cực, và đông tụ các thành phần của tế bào (Kotzekidou và ctv, 2008) cụ thể ở Bảng 1.2. Bảng 1.2. Những nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn (theo Cowan, 1999) Nhóm Phân nhóm Ví dụ Cơ chế Catechol Phá vỡ màng sinh chất Phenol đơn Epicatechin Phá vỡ vách tế bào Phenolic acid Cinnamic acid ? Liên kết bám dính, tạo Quinone Hypericin phức hợp với thành tế bào, làm bất hoạt enzyme Flavonoid Chrysin Liên kết bám dính - Tạo phức hợp với thành tế bào Flavone Khử hoạt tính enzyme Abyssinone Ức chế phiên mã ngƣợc Phenolic HIV Flavonol ? Bám dính Protein Bám dính Adhesin Ức chế enzyme Phá vỡ màng sinh chất Tannin Ellagitannin Tạo phức hợp với thành tế bào Phá vỡ vách tế bào Tạo phức kim loại-ion Coumarin Warfarin Tƣơng tác với DNA nhân 21
Đồ án tốt nghiệp thực (hoạt tính kháng vius) Terpenoid - Phá vỡ vách tế bào Capsaicin Tinh dầu - Berberine Xen vào thành tế bào hoặc Alkaloid Piperine DNA - Mannose- Khóa sự kết hợp của virus Lectin specific hoặc hấp phụ Polypeptide agglutinin Falxatin Hình thành cầu Disulfide - 8s-heptadeca- ? 2(Z),9(Z)- Polyacetylen diene-4,6- diyne-1,8-diol 1.3.3. Một số hợp chất có khả năng kháng khuẩn từ thực vật 1.3.3.1. Hợp chất phenolic Nguyên nhân chính tạo ra độc tính của các hợp chất phenolic đối với vi sinh vật là sự ức chế enzyme bởi các hợp chất oxy hóa, có thể thông qua phản ứng với nhóm sulfhydryl hoặc thông qua sự tƣơng tác không đặc hiệu của các chất này với protein. a. Quinone Quinone là những vòng thơm với hai nhóm thế ketone. Chúng là những hợp chất màu, tồn tại khắp nơi trong tự nhiên và có phản ứng đặc trƣng cao. Quinone có thể tạo phức không thay đổi với các amino acid ái nhân trong protein, thƣờng dẫn đến làm vô hoạt và mất chức năng của protein. Do đó khả năng kháng khuẩn của quinone rất lớn. Mục tiêu tác động lên tế bào vi sinh vật là bề mặt tế bào, polypeptide ở thành tế bào và các enzyme trên màng. Quinone cũng tạo ra chất nền không thể sử dụng đƣợc cho các vi sinh vật. 22
Đồ án tốt nghiệp Ngƣời ta nhận thấy rằng anthraquinone đƣợc lấy từ một loài cây có nguồn gốc từ Pakistan có khả năng kìm hãm vi khuẩn Bacillus anthracis, Corynebacterium pseudodiphthericum, và Pseudomonas aeruginosa, có khả năng diệt khuẩn đối với Pseudomonas pseudomalliae. Hypericin, một anthraquinone cho thấy là có khả năng chống bệnh trầm cảm và có hoạt tính kháng khuẩn tổng hợp (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010). Quinone Anthraquinone Hypericin Hình 1.9. Cấu trúc hóa học của phân tử quinone, anthraquinone và hypericin b. Flavonoid Các hợp chất flavonoid tổng hợp bởi cây trồng để phản ứng lại sự nhiễm khuẩn và có tác dụng kháng khuẩn đối với nhiều loài vi sinh vật. Hoạt tính kháng khuẩn của flavonoid là do khả năng tạo phức với các protein tan ngoại bào, tạo phức với thành tế bào vi khuẩn, và ức chế transpeptidase làm cho mucopeptide – yếu tố đảm bảo cho thành tế bào vi khuẩn vững chắc không tổng hợp đƣợc. Các flavonoid càng ƣa béo càng có khả năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010). Catechin là những hợp chất flavonoid đƣợc nghiên cứu rộng rãi do chúng có mặt trong trà xanh oolong. Qua những nghiên cứu, ngƣời ta nhận thấy trà xanh có hoạt tính kháng khuẩn đã ức chế Vibrio cholerae O1, Streptococcus mutans, Shigella spp., và các vi khuẩn, vi sinh vật khác. Catechin vô hoạt độc tố gây bệnh tả của Vibrio, ức chế enzyme glucosyltransferase của vi khuẩn S. mutans, cơ chế tác dụng cũng là do khả năng tạo phức nhƣ đƣợc mô tả ở phần quinone. Hoạt động 23
Đồ án tốt nghiệp nghiên cứu gần đây đƣợc tiến hành trên cơ thể chuột. khi chuột đƣợc cho ăn khẩu phần ăn có chứa 0,1% catechine có nguồn gốc từ trà thì khe nứt do sâu răng của chuột do S.mutans gây ra giảm 40% (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010). Hình 1.10. Cấu trúc hóa học của catechine Nhiều nghiên cứu khác cũng cho thấy rằng các dẫn xuất của flavones có khả năng ức chế virus (RSV). Ngƣời ta đã tìm ra hoạt tính và phƣơng thức hoạt động của quercetin, naringin, hesperetin và catechin. Trong khi naringin không ức chế virus type 1(HSV-1) gây bệnh mụn giộp, polyvirus type 1, virus type 3 gây bệnh khó thở ở trẻ hoặc RSV, thì ba flavanoid khác lại có tác dụng theo những phƣơng thức khác nhau. Hesperetin làm giảm sự sao chép nội bào của các loài virus trên, catechin ức chế sự lây nhiễm nhƣng không làm giảm sự sao chép nội bào của RSV và HSV-1, quercetin là chất có hiệu quả tốt trong việc giảm tính lây nhiễm các loại bệnh do vi sinh vật gây ra. Ngƣời ta cho rằng sự khác nhau nhỏ về cấu tạo trong các hợp chất cũng ảnh hƣởng rất quan trọng đến hoạt tính kháng khuẩn của chúng. c. Coumarine Coumarine là hợp chất phenolic đƣợc tạo thành bởi benzene nóng chảy và vòng α-pyrone. Chúng có hoạt tính chống đông máu, chống viêm và giãn mạch máu. Warfarin là một coumarin đặc biệt nổi tiếng khi sử dụng nhƣ chất chống đông máu sử dụng theo đƣờng miệng và đồng thời cũng đƣợc sử dụng để diệt động vật gặm nhấm. 24
Đồ án tốt nghiệp Nhiều dẫn chất coumarine có tác dụng kháng khuẩn đặc biệt là chất novobiocine là một chất kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng có trong nấm Stretptomyces niveus. Nó cũng có hoạt tính chống lại virus. Coumarin đƣợc biết là có độc tính cao vì thế cần đƣợc xử lí rất cẩn thẩn bởi y tế cộng đồng. Một vài coumarine khác cũng có hoạt tính chống lại vi sinh vật và có khả năng ức chế nấm Candida albicans (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010). Hình 1.11. Cấu trúc hóa học của coumarine d. Tannin Một trong những tính chất rất đặc trƣng của tannin là tạo phức với các protein thông qua các liên kết không đặc hiệu nhƣ liên kết hydro và các liên kết cộng hóa trị. Khi liên kết với protein chúng có thể làm mất hoạt tính của các protein chức năng. Các protein này có thể là enzyme, các protein vận chuyển hay thành tế bào polypeptide Scalbert xem xét lại các tính chất kháng khuẩn của tannin vào năm 1991. Ông đƣa ra 33 nghiên cứu ghi nhận tính kháng khuẩn của tannin. Theo các nghiên cứu này, tannin có thể ức chế sự phát triển của nấm sợi, nấm men và các vi khuẩn. Tính kháng khuẩn của tannin đƣợc tăng cƣờng bởi tia cực tím (UV) ở mức ánh sáng kích hoạt bƣớc sóng khoảng 320 đến 400nm. Ngoài ra, có ít nhất hai nghiên cứu đã chỉ ra rằng tannin có thể ức chế virus nhờ cơ chế đảo ngƣợc quá trình phiên mã DNA của virus. 1.3.3.2. Nhóm alkaloid a. Solamargine Solamargine là một glycoalkaloid kháng khuẩn tốt nhất đối với 2 nhóm Giardia và Entamoeba, chúng liên quan trực tiếp đến việc kháng khuẩn đối với 25
Đồ án tốt nghiệp các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy. Thƣờng có trong các cây quả mọng họ cà (Solanum khasianum) và các alkaloid khác trong loài cây này có tác dụng chống lại sự lây nhiễm khi đã mắc phải HIV. Hình 1.12. Cấu trúc hóa học của phân tử Solamargine b. Berberine Berberine là một đại diện quan trọng của alkaloid có trong các cây: hoàng đằng, hoàng bá, hoàng liên có tác dụng kháng khuẩn rộng đối với Shigella spp., Staphylococcus spp. (tụ cầu khuẩn), Vibrio spp., Streptococcus spp. Những năm gần đây, một số nghiên cứu mới nhất cho thấy berberine có tính kháng khuẩn với nhiều vi khuẩn Gram dƣơng, Gram âm và các vi khuẩn acid. Ngoài ra có còn chống lại một số nấm men gây bệnh và một số động vật nguyên sinh. Berberine kháng khuẩn hiệu quả đối với các nhóm vi khuẩn gây bệnh sốt rét do berberine có khả năng gây đột biến RNA của vi khuẩn gây bệnh sốt rét, chính điều này mà tác dụng kháng khuẩn của Berberine khá mạnh đối với loại vi khuẩn gây bệnh này. 26
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.13. Cấu trúc hóa học của berberine 1.3.3.3. Nhóm terpenoid và tinh dầu Terpenene và terpenoid có hoạt tính kháng khuẩn đối với nấm, vi khuẩn, virus và động vật nguyên sinh. Năm 1977, có nghiên cứu cho rằng 60% các dẫn xuất của tinh dầu có khả năng ức chế nấm, trong khi khoảng 30% ức chế đƣợc vi khuẩn. Đồng thời, các acid betulinic triterpenoid là một trong nhiều terpenoid có khả năng ức chế đƣợc HIV. Cơ chế tác động của tecpen chƣa đƣợc khẳng định rõ ràng, nhƣng đƣợc suy đoán là liên quan đến sự phá vỡ màng tế bào bởi các hợp chất lipophilic. Các nhà khoa học cũng đã tìm thấy các terpenoid hiện diện trong các loại tinh dầu thực vật có ích trong việc kiểm soát Listeria monocytogene. Theo Mendoza, việc tăng nhóm ƣa nƣớc (hydrophilicity) của kaurene diterpenoids thì làm giảm mạnh tính kháng khuẩn của chúng. Các nhà khoa học thực phẩm cũng đã tìm thấy các terpenoids hiện diện trong các loại tinh dầu thực vật có ích trong việc kiểm soát Listeria monocytogenes. Dầu hung quế, một thảo dƣợc đƣợc thƣơng mại hóa, đƣợc xác định là hiệu quả kháng khuẩn tƣơng đƣơng với 125 ppm clo khử trùng trong lá rau diếp (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010). 1.3.3.4. Nhóm lectin và polypeptide Cơ chế kháng khuẩn của lectin và polypeptide là do có sự hình thành của các ion trên màng vi sinh vật, hoặc do sự cạnh tranh và ức chế sự bám dính protein trên cơ quan thụ cảm vật chủ ở vi sinh vật. Bên cạnh đó chúng còn phá vỡ màng tế bào, cản trở sự trao đổi chất và ảnh hƣởng tới các thành phần tế bào chất. 27
Đồ án tốt nghiệp Thionin là peptide thƣờng đƣợc tìm thấy trong lúa mạch và lúa mì, bao gồm 47 amino acid. Chúng có khả năng ức chế nấm men, vi khuẩn Gram âm và Gram dƣơng. Fabatin là một loại peptide có trong đậu fava, có cấu trúc liên quan tới γ- thionins từ ngũ cốc và nó ức chế đƣợc E. coli, P. aeruginosa, và Enterococcus hirae nhƣng lại không ức chế Candida hoặc Saccharomyces. 1.3.4. Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn của thực vật trên thế giới và tại Việt Nam. 1.3.4.1. Trên thế giới - Năm 1858, nhà bác học Pháp Louis Pasteur đã chứng minh đƣợc công dụng diệt khuẩn của tỏi. Năm 1944, nhà hóa học Chester J. Cavallito đã phân tích đƣợc hợp chất Alicin trong tỏi có công dụng nhƣ thuốc kháng sinh. Năm 1949, Dold và Knapp đã kiểm tra hoạt động kháng khuẩn của 27 chất chiết xuất từ thực vật chống lại 8 chủng sinh vật thử nghiệm nhƣ: E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhosa, Shigella paradysenteria và cho thấy tỏi có hoạt động chống lại tất cả các sinh vật đƣợc kiểm tra. Một nghiên cứu khác tại Brazil năm 1982 đã chứng minh, nƣớc tinh chất từ tỏi có thể chữa đƣợc nhiều bệnh nhiễm độc bao tử, do thức ăn có lẫn vi khuẩn, nhất là loại Salmonella spp. (Fulder, 2005). - Năm 1959, Horak đã nghiên cứu khả năng kháng khuẩn từ chiết xuất cây Cannabit sativa có nguồn gốc từ Ấn Độ, ông đã tìm thấy cannabiriolic là 1 chất có tác dụng ức chế với vi khuẩn lao ở ngƣời và 1 số vi khuẩn gram dƣơng nhƣ Staphylococcus pyogenes aureus, Streptococcus alpha haemolyticus, Streptococcus beta haemolyticus, Enterococcus, Diplococcus pneumoniae, B.subtilis, B.anthracis, Corynebacterium diphtheriae và Corynebacterium cutis, đặc biệt có thể ức chế vi khuẩn kháng lại penicilin (Kabelik và ctv, 1960). - Năm 1982, Ueda cũng đã thử nghiệm chất chiết xuất từ cây thuốc và gia vị bằng dung môi ethanol để ức chế vi khuẩn và nấm trong môi trƣờng nuôi cấy tại pH khác nhau. Đinh hƣơng đƣợc nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn có thể chống lại tất cả các sinh vật thử nghiệm bao gồm cả vi khuẩn B. subtilis PCI, S.aureus 209P, E. 28
Đồ án tốt nghiệp coli, S. typhimurium, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Proteus morganii. - Năm 1997 tại Thái Lan, Satapon Direkbusarakom và ctv đã thử nghiệm thành công khả năng kháng khuẩn của các loài cây thảo dƣợc nhƣ: O.sanctum, C.alata, Tinospora cordifolia, Eclipa alba, Tinospora cripspa, Psidium guajava, Clinacanhusnutans, Andrographic panniculata, Momordica charatina, Phyllanthus reticulates, P.pulcher, P.acidus, P.debelis, P.amarus, và P.urinaria đối với Vibrio spp. Tuy nhiên, chỉ có hai cây Momordica charatina và Psidium guajava có hiệu quả ức chế đối với Vibrio spp. - Năm 2000 nghiên cứu của Avancini CAM, Wiest JM, Mundstock EA. cho kết quả hoạt tính kháng khuẩn của “carqueja” (Baccharis trimera Less.) ức chế đƣợc nhóm vi khuẩn gram dƣơng (S.aureus, Streptococcu uberis) và gram âm (Salmonella gallinarumand, Escherichia coli) . - Vào năm 2003 nhóm Candan và ctv đã nghiên cứu tinh dầu trong lá cỏ thi (Achillea millefolium) có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn mẫu cao đƣợc chiết từ methanol. Tinh dầu có thể ngăn chặn sự phát triển của các nhóm vi khuẩn Streptococcus pneumoniae, Clostridium perfringes, nấm Candida albicans và ức chế yếu hơn đối với Mycobacterium smegmatis, Acinetobacter lwoffiiand, Candida krussei. - Vào năm 2006, nghiên cứu của nhóm Asolini và ctv cho kết quả nhóm hợp chất phenolic tồn tại trong mẫu cao chiết ethanol có khả năng kháng khuẩn rất tốt. Mẫu dịch chiết từ a-ti-sô (Cynara scolymus) và mẫu cao ethanol (80%) của cả a-ti- sô và “macela” (Achyrocline satureioides) ức chế sự phát triển của Bacillus cereus, B. subtilis, Pseudomonas aeruginosa và S. aureus. - Năm 2011, Naveed Ahmad và ctv đã nghiên cứu về sự chống oxi hóa và kháng khuẩn của chiết xuất từ lá và hoa của cây Calotropis procera bằng nhiều loại dung môi khác nhau. Firdaus Jahan và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt động kháng khuẩn của chiết xuất từ lá của cây Syzygium cumini (Jamun), Lawsonia inermis 29
Đồ án tốt nghiệp (Mehndi), Zizyphus mauritiana (Ber), Ocimum sanctum (Tulsi) and Ficus religiosa (Peepal) chống lại Staphylococcus aureus. - Chaghaby và ctv (2014) đã chứng minh các dịch chiết khác nhau từ lá cây Annona Squamosa L. đều có hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn gram dƣơng mạnh hơn gram âm. Kết quả của ông đƣợc nghiên cứu dựa trên cơ sở khoa học của Chopra và Greenwood, cho rằng vi khuẩn gram âm ít bị ảnh hƣởng nhiều bởi những chất có chiết xuất từ thực vật hơn so với vi khuẩn gram dƣơng là do chúng có một lớp màng ngoài bao gồm các lipoprotein và lipopolysaccharide. Đó là lớp màng chọn lọc cho phép chúng có khả năng điều hòa lƣu thông các chất ra vào bên trong cơ cấu nội bào. Mỗi một dịch chiết đều thể hiện khả năng kháng ít nhất 6/27 chủng vi khuẩn chỉ thị, tuy nhiên hoạt tính kháng khuẩn ở những dịch chiết lên các chủng vi sinh vật là khác nhau. Sự khác nhau đó là do sự khác biệt giữa các hợp chất hóa học có trong mỗi loại dịch chiết. 1.3.4.2. Tại Việt Nam - Năm 1956, Phạm Văn Ngữ đã tiến hành nghiên cứu trên 500 cây thuốc và khẳng định nhiều cây có tác dụng kháng khuẩn mạnh. Năm 1959, Nguyễn Văn Hƣởng và ctv đã nghiên cứu trên 1000 cây thuốc và chỉ ra việc sử dụng những cây thuốc rất an toàn và có hoạt tính kháng khuẩn cao, từ đó nhóm đã đƣa ra chế phẩm cây Tô Mộc trị tiêu chảy (Trần Nam Hà, 2008). - Năm 2007, Nguyễn Ngọc Phƣớc và ctv đã tiến hành nghiên cứu sử dụng lá trầu không để trị bệnh do nấm, vi khuẩn gây ra trên đối tƣợng nuôi động vật thuỷ sản, bƣớc đầu đã có kết quả tốt ở quy mô phòng thí nghiệm. - Tác giả Đặng Xuân Cƣờng (Đại học Nha Trang, 2009) đã nghiên cứu các phƣơng pháp thu nhận dịch chiết có hoạt tính kháng khuẩn từ loài rong nâu Dictyota dichotoma Việt Nam. Tác giả cũng cho thấy dịch chiết thu nhận từ loài rong nâu này có hoạt tính kháng khuẩn khá tốt và đã phân tích đƣợc các thành phần có trong dịch chiết từ rong nâu. Cùng năm 2009, Võ Thị Mai Hƣơng đã nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá Muồng trâu trên 5 nhóm vi khuẩn Vibrio spp., Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus và 30
Đồ án tốt nghiệp cho kết quả kháng khuẩn cao hơn so với nghiên cứu tƣơng tự vào năm 2002 của Elysha và ctv. - Năm 2010, Phạm Văn Ngọt và ctv đã thông báo kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của loài Mộc kí ngũ hùng (Dendrophthoepentadra (L.) Miq.) thuộc họ Tầm gửi. - Năm 2011, Nguyễn Thị Thu Hƣơng nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ tỏi (Allium Sativum) đối với một số vi khuẩn gây bệnh ở ngƣời. - Năm 2012, tại Nha Trang, Lê Thị Hƣơng Hà nghiên cứu tách chiết và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn – chống oxi hóa của cao dịch chiết từ củ hành tăm (Allium schoenoprasum) trên các chủng vi khuẩn gây bệnh: Salmonella, E. coli, S. aureus, Pseudomonas, B. subtilis, B. cereus, Aspergillus, Penicillium. - Võ Thị Mai Hƣơng và Trần Thanh Phong (2013) đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn từ các loại dịch chiết ethanol, methanol và các phân đoạn n-Hexan, EtOAC, n-Butanol của methanol từ quả Nhàu và kết quả cho thấy các loại dung môi trên đều cho hoạt tính kháng khuẩn cao với các vi khuẩn khảo sát Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Escherichia coli, Bacillus pumilus. - Năm 2014, Huỳnh Kim Diệu và Võ Thị Tuyết đã đánh giá sự thuần chủng và hoạt tính kháng khuẩn của cây hẹ (Allium tuberosum Roxb. et Spreng) trên 8 chủng vi khuẩn: Staphylococus aureus, Streptococcus faecalis, Escherichia coli, Aeromonas hydrophila, Edwardsiella ictaluri, Edwardsiella tarda, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp. Kết quả nghiên cứu cao hẹ có khả năng ức chế trên tất cả các chủng vi khuẩn thí nghiệm (512 µg/ml ≤ MIC ≤ 4096 µg/ml). 1.3.5. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 1.3.5.1. Khái niệm - Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum inhibitory concentration (MIC)) là nồng độ thấp nhất của chất kháng khuẩn (hoặc kháng sinh) có khả năng ức chế sự tăng trƣởng của vi sinh vật sau khoảng 24 giờ nuôi cấy. - Khi cho vi khuẩn tiếp xúc với chất kháng khuẩn (hoặc kháng sinh) ở các liều lƣợng nồng độ khác nhau, vi khuẩn bị ức chế hoặc bị tiêu diệt. Một số vi khuẩn có 31
Đồ án tốt nghiệp thể nhạy cảm với một ít hoặc với rất nhiều chất kháng khuẩn (hoặc kháng sinh). Chỉ số MIC có tác dụng là tiêu chuẩn so sánh để lựa chọn chất kháng khuẩn (hoặc kháng sinh) phù hợp với từng loại vi khuẩn gây bệnh. Việc loại trừ sạch vi khuẩn có thể dự đoán dựa vào dữ liệu MIC, đồng thời xác định đƣợc nồng độ tối ƣu để làm chậm sự chọn lọc vi khuẩn kháng thuốc. 1.3.5.2. Phương pháp xác định Tùy theo phƣơng pháp áp dụng mà có nhiều cách xác định chỉ số MIC khác nhau. Các phƣơng pháp phổ biến nhƣ: phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch, phƣơng pháp pha loãng, phƣơng pháp đặt khoanh giấy . Sau đó ta có thể xác định nồng độ kháng sinh thấp nhất ức chế hoàn toàn sự tăng trƣởng của vi khuẩn bằng cách quan sát với mắt thƣờng. 1.4. Ảnh hƣởng của dung môi đến khả năng tách chiết cao từ thực vật Tách chiết bằng dung môi là quá trình di chuyển vật chất trong hệ hai pha rắn - lỏng. Quá trình này sẽ sử dụng một số dung môi thích hợp để hoà tan các hợp chất tan có trong thực vật, sau đó tách chúng ra khỏi phần không tan. Phần dung môi hoà tan các chất tan đƣợc gọi là dịch chiết, phần không tan đƣợc gọi là bã thực vật. Dung môi sẽ đƣợc loại khỏi dịch chiết bằng nhiều phƣơng pháp và sau đó tiến hành thu hồi lƣợng cao có chứa nhiều hợp chất khác nhau của mẫu thực vật. Dựa vào tính phân cực của dung môi và của các nhóm hợp chất ta có thể dự đoán sự có mặt của các chất trong mỗi phân đoạn ly trích, từ đó lựa chọn dung môi tách chiết thích hợp: - Trong dịch chiết ete và ete dầu hỏa sẽ có các thành phần của tinh dầu nhƣ monoterpen, các chất không phân cực nhƣ chất béo, carotene, các sterol, các chất màu thực vật, chlorophyl - Trong dịch chiết nƣớc sẽ có các glycoside, tannin - Trong dịch chiết chloroform sẽ có mặt quinone, các aglycol do glycoside thủy phân, sesquiterpen, diterpen - Methanol và ethanol là những dung môi phân cực hơn các hydrocacbon thế clo. Ngƣời ta cho rằng dung môi thuộc nhóm rƣợu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào, 32
Đồ án tốt nghiệp hòa tan đƣợc các chất không phân cực đồng thời cũng có khả năng tạo dây nối hydro với các nhóm phân cực khác, nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu đƣợc lƣợng lớn thành phần các hợp chất tự nhiên.  Yêu cầu đối với dung môi: - Dễ thấm vào dƣợc liệu: dung môi có độ nhớt thấp, sức căng bề mặt nhỏ. - Hoà tan nhiều hoạt chất, ít tạp chất. - Có tính trơ về mặt hoá học: không làm biến đổi hoạt chất, không gây khó khăn trong quá trình bảo quản, không bị phân huỷ bởi nhiệt độ cao. - Dễ dàng đƣợc loại bỏ, phải bay hơi đƣợc khi cần cô đặc dịch chiết. - Không làm cao có mùi đặc biệt, khó chịu. - Cần có độ tinh khiết nhất định để không làm ảnh hƣởng đến hiệu quả và chất lƣợng của quá trình chiết cao. - Rẻ tiền, dễ kiếm. 1.5. Tổng quan về một số nhóm vi khuẩn gây bệnh 1.5.1. Nhóm vi khuẩn Escherichia coli 1.5.1.1. Đặc điểm hình thái E.coli là trực khuẩn Gram âm, hình que thẳng. Kích thƣớc dài, ngắn khác nhau trung bình từ 2 – 3 µm, rộng 0,5 µm; trong những điều kiện nuôi cấy không thích hợp (ví dụ trong môi trƣờng có kháng sinh) trực khuẩn có thể rất dài (6 – 8 µm). Rất ít chủng E.coli có vỏ, không sinh bào tử, hầu hết có lông và có khả năng di động (Bùi Thị Hải Hòa, 2012). Trực khuẩn E. coli hiếu khí và kỵ khí tùy nghi, có thể phát triển ở nhiệt độ từ 150C – 400C, phát triển thích hợp ở nhiệt độ 370C với pH = 7,2 –7,4 ; phát triển đƣợc ở pH = 5,5 – 8,0 (Nguyễn Nhƣ Thanh và ctv, 1997). Trong môi trƣờng lỏng, sau 4 – 5 giờ, E. coli đã làm đục nhẹ môi trƣờng, càng để lâu càng đục nhiều và sau vài ngày có thể có váng mỏng trên mặt môi trƣờng, để lâu vi khuẩn lắng xuống đáy ống. Trên môi trƣờng thạch thƣờng, sau 18 – 24 giờ, khuẩn lạc tròn, bờ đều, bóng, không màu hay màu xám nhẹ, đƣờng kính 2 – 3 mm. 33
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.14. E.coli quan sát dƣới kính hiển vi với kích thƣớc 2 µm (Bact, 2005) 1.5.1.2. Khả năng gây bệnh E.coli là nguyên nhân gây ra các bệnh ở ngƣời nhƣ tiêu chảy, gây viêm đƣờng tiêu hóa, tiết niệu, sinh dục, đƣờng mật, đƣờng hô hấp. Là một trong những nguyên nhân chính gây ra bệnh nhiễm khuẩn huyết, là căn nguyên thƣờng gặp trong bệnh viêm màng não, viêm phổi ở trẻ mới sinh. Nhƣng nhiễm khuẩn quan trọng nhất là viêm dạ dày ruột ở trẻ em. E.coli còn gặp trong nhiễm trùng ngoại khoa, nhiễm trùng trong bỏng. Trong các loại độc tố của E.coli, độc tố shiga là nguy hiểm nhất đƣợc biết đến trên ngƣời, làm hủy hoại các vi nhung mao hấp thu của tế bào biểu mô ruột. Nó xâm nhập vào tế bào biểu mô đại tràng, ức chế quá trình tổng hợp protein làm chết tế bào. Hậu quả là gây viêm đại tràng xuất huyết, gây tiêu chảy phân nhƣ máu. Những trƣờng hợp hoại tử nặng có thể gây thủng ruột (Bùi Thị Hải Hòa, 2012). E.coli gây bệnh thực nghiệm: khả năng gây bệnh cho súc vật tƣơng đối thấp, phải cần một số lƣợng lớn vi khuẩn vào phúc mạc chuột nhắt hoặc đƣờng tĩnh mạch cho thỏ mới gây chết đƣợc súc vật. 34
Đồ án tốt nghiệp 1.5.2. Nhóm vi khuẩn Salmonella spp. 1.5.2.1. Đặc điểm hình thái Salmonella spp. là trực khuẩn Gram âm, hình que, kích thƣớc trung bình 3,0 x 0,5 µm. Có nhiều lông xung quanh thân (trừ S.gallinarum và S.pullorum), có khả năng di động, không có vỏ, không sinh bào tử (Trần Kim Hùng Nguyên, 2005). Là vi khuẩn kị khí tùy nghi, phát triển đƣợc trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng. Vi khuẩn có thể phát triển ở nhiệt độ 6 - 42oC và pH từ 6 - 9, nhƣng điều kiện thích hợp nhất cho sự phát triển của vi khuẩn là 37oC ở pH 7,2. Nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng: sau khi cấy vài giờ Salmonella spp. làm môi trƣờng đục nhẹ, sau 18 giờ làm đục nhiều, nuôi cấy lâu sẽ có cặn ở đáy ống nghiệm và có màng mỏng trên bề mặt môi trƣờng (Nguyễn Nhƣ Thanh, 1997). Nuôi cấy trên môi trƣờng thạch: vi khuẩn mọc thành các khuẩn lạc tròn, nhỏ, trong hoặc xám, nhẵn, bóng hay lồi lên ở giữa. Hình 1.15. Hình thái vi khuẩn Salmonella spp. (Taragui, 2005) 1.5.2.2. Khả năng gây bệnh Salmonella spp. là căn nguyên gây ra nhiều loại bệnh do thực phẩm nhiễm độc hay còn gọi là ngộ độc thực phẩm. Các triệu chứng thƣờng gặp nhƣ tiêu chảy , co thắt da ̣dày , đau đầu, sốt, nôn mƣ̉ a và mất nƣớc (mất dic̣ h cơ thể ). Triêụ chƣ́ ng có thể tiến triển tƣ̀ 12 – 72 giờ sau khi nhiêm̃ khuẩn . Các triệu chứng thƣờng kéo dài 35
Đồ án tốt nghiệp trong vòng tƣ̀ 4 – 7 ngày và sau đó tự hồi phục . Tuy nhiên 1 số ít trƣờng hợp có thể diễn biến nặng và gây tử vong (Phạm Thị Cẩm Hà, 2013). Salmonella spp. còn gây bệnh thƣơng hàn chủ yếu do S. typhii gây thƣơng tổn mảng Peyer, xuất huyết tiêu hóa, có thể gây thủng ruột; ngoài ra, còn gây trạng thái sốt kéo dài, li bì, biến chứng trụy tim mạch Các bệnh khác (không phải thƣơng hàn) thƣờng là nhiễm trùng giới hạn ở ống tiêu hóa chủ yếu là do 2 tác nhân S. typhimurium, S. enteritidis gây ra, bệnh có biểu hiện gây sốt, nôn, tiêu chảy. Ngoài ra, Salmonella có thể gây nên các tổn thƣơng ở ngoài đƣờng tiêu hóa nhƣ viêm màng não, thể nhiễm trùng huyết đơn thuần, nhiễm trùng phổi Salmonella spp. gây bệnh thực nghiệm trên gia cầm: vi khuẩn Salmonella gây 3 thể bệnh: bệnh thƣơng hàn, phó thƣơng hàn và bệnh bạch lỵ. Đối với gia súc, S. choleraesuis chủng Kunzendorf và S. typhisuis chủng Voldagsen gây bệnh phó thƣơng hàn cho heo, S. enteritidis chủng Dublin và Rostok gây bệnh phó thƣơng hàn cho bò, bê, S. abortusovis gây bệnh sẩy thai ở cừu, S. gallinarum – pullorum gây bệnh thƣơng hàn cho gà (Nguyễn Nhƣ Thanh, 1997). 1.5.3. Nhóm vi khuẩn Shigella spp. 1.5.3.1. Đặc điểm hình thái Shigella spp. thuộc họ Enterobacteriae (vi khuẩn đƣờng ruột) là trực khuẩn gram âm, nhỏ, dài với kích thƣớc 0.5-0.6 x 1-3 µm, không sinh bào tử, không di động, thuộc nhóm vi khuẩn hiếu hoặc kỵ khí tùy nghi nhƣng phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí, nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 370C. Chúng có thể sống nhiều ngày với điều kiện lý hóa khắc nghiệt nhƣ trong tủ lạnh, đông đá, trong môi trƣờng chứa 5% NaCl hay trong môi trƣờng có pH 4,5. Shigella spp. nhạy với nhiệt và bị tiêu diệt khi khử trùng bằng phƣơng pháp khử trùng Pasteur. - Trong môi trƣờng lỏng, sau 18-24 giờ nuôi cấy vi khuẩn Shigella spp. làm đục đều môi trƣờng. - Trên môi trƣờng đặc, sau 24 giờ nuôi cấy khuẩn lạc có đƣờng kính khoảng 1mm, tròn, lồi, mặt nhẵn, bờ đều. 36
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.16. Hình thái của vi khuẩn Shigella spp. (Reynolds, 2011) 1.5.3.2. Khả năng gây bệnh Nhiễm khuẩn Shigella spp. thƣờng chỉ giới hạn ở đƣờng tiêu hóa. Chỉ cần số lƣợng nhỏ 10 – 100 vi khuẩn đủ gây bệnh. Sau khi xâm nhập, vi khuẩn tấn công lớp biểu mô niêm mạc ruột già, tạo những áp xe nhỏ li ti rồi hoại tử, làm ung loét và xuất huyết. Triệu chứng chủ yếu là tiêu chảy phân nhầy máu, số lần đi tiêu 10 – 20 lần/ngày và kèm theo đau bụng và sốt cao. Đa số sự hiện diện bạch cầu trong phân. Bệnh thƣờng kéo dài dƣới 7 ngày (Nguyễn Văn Minh Hoàng, 2013). Ngoài ra, Shigella spp. còn gây các bệnh ở ngoài đƣờng tiêu hoá nhƣ viêm kết mạc, viêm âm đạo, viêm phổi, viêm khớp, viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết, theo Nguyễn Đức Hiền (2013). 1.5.4. Nhóm vi khuẩn Listeria spp 1.5.4.1. Đặc điểm hình thái Các loài Listeria spp. là trực khuẩn Gram dƣơng, có kích thƣớc ngắn (0,4 – 0,5 x 0,5 – 2,0 µm), chúng mọc trên các môi trƣờng nuôi cấy không acid, không sinh nha bào. Ở 200C chúng di chuyển bằng lông mọc xung quanh thân (peritrichous flagella), nhƣng sự di dộng không quan sát đƣợc ở 370C. Chúng là vi khuẩn kị khí không bắt buộc và có thể sinh trƣởng trong một khoảng nhiệt độ dao động rộng từ 3 – 450C (tối ƣu là 30 – 360C), mặc dù tốc độ mọc ở nhiệt độ thấp là 37
Đồ án tốt nghiệp rất chậm. Chúng có thể mọc ở pH 9,6, nhƣng đạt điều kiện tối ƣu ở pH hơi kiềm hoặc môi trƣờng trung tính (Nguyễn Hữu Liêm, 2013). Hình 1.17. Vi khuẩ n Listeria spp. 1.5.4.2. Khả năng gây bệnh Bệnh do Listeria spp. gây ra là bệnh hiếm gặp ở ngƣời với các triệu chứng rất nguy hiểm và có tỷ lệ tử cong cao. Ngƣời nhiễm bệnh sẽ có các dấu hiệu cận lâm sàng nhẹ nhƣ sốt, viêm dạ dày-ruột. Đồng thời L. monocytogenes là tác nhân gây chết đặc biệt ở trẻ em dƣới 1 tháng tuổi, phụ nữ mang thai, những ngƣời nhận mô cấy ghép và có hệ miễn dịch kém. Ở phụ nữ mang thai khi ngƣời mẹ bị nhiễm Listeria spp. thì có triệu chứng rõ ràng hoặc có những triệu chứng giống nhƣ bị cảm cúm nhƣng bào thai và thai nhi sẽ bị ảnh hƣởng nghiêm trọng bao gồm sảy thai, chết non, viêm màng não ở trẻ sơ sinh hay nhiễm trùng. Listeria spp. gây bệnh cho động vật: bệnh do Listeria spp .tác động chuyên biệt trên gia súc, cừu và dê với các dấu hiệu lâm sàng nhƣ viêm não, viêm màng não, nhiễm trùng máu, sảy thai, đẻ non. 1.5.5. Nhóm vi khuẩn Vibrio spp. 1.5.5.1. Đặc điểm hình thái Vibrio spp. còn gọi là phẩy khuẩn, thuộc họ Vibrionaceae là nhóm vi khuẩn Gram âm, hình que hai đầu không đều nhau tạo thành hình dấu phẩy, kích thƣớc 38
Đồ án tốt nghiệp 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6 µm. Chúng không sinh bào tử và chuyển động nhờ một hay nhiều tiên mao mảnh nằm ở một đầu. Tất cả những loài vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio spp. đều là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, phát triển trong môi trƣờng bổ sung muối (NaCl) và không sinh H2S. Hình 1.18. Hình thái vi khuẩn Vibrio spp. (Microscopy, 2004) 1.5.5.2. Khả năng gây bệnh Bệnh tả là 1 bệnh truyền nhiễm cấp tính do Vibrio cholerae gây ra. Biểu hiện lâm sàng của bệnh là nôn nhiều lần, dịch nôn lúc đầu là nƣớc và thức ăn, về sau giống nhƣ dịch phân. Cơ thể bị sốt, sôi bụng hoặc đau bụng nhẹ, chuột rút, đi ngoài phân lỏng có mùi tanh, dẫn đến cơ thể mất nƣớc, điện giải, suy tim, suy kiệt và dẫn đến tử vong nếu không điều trị kịp thời. Ngoài ra, khi ta ăn phải thức ăn có chứa độc tố của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus sẽ gây ra các biểu hiện lâm sàng nhƣ tiêu chảy nhiều lần trong ngày, đau bụng, buồn nôn và nôn (Hoàng Ngân, 2013). Một số loài vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio spp. đã đƣợc công bố là tác nhân gây bệnh nghiêm trọng ở một số đối tƣợng thủy sản (Austin & Austin 1993). Một số bệnh ở thủy sản do Vibrio spp. gây ra nhƣ sau: bệnh phát sáng ở ấu trùng tôm, bệnh xuất huyết lở loét ở một số cá biển, bệnh hoại tử cục bộ ở giáp xác và một số bệnh 39
Đồ án tốt nghiệp khác nhƣ: gây chết ở ấu trùng động vật thân mềm, gây bệnh đƣờng ruột, bệnh hoại tử gan ở giáp xác (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004). 1.5.6. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Pseudomonas spp. 1.5.6.1. Đặc điểm Pseudomonas spp. là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc; có hình thẳng, hai đầu tròn, dài 1–5 µm, rộng 0,5 – 1 µm. Trực khuẩn ít khi có vỏ, có một tiêm mao đơn cực, di động, không sinh bào tử, tồn tại ở dạng đơn, bắt cặp hoặc tạo thành chuỗi ngắn. Trực khuẩn mọc dễ dàng trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng, nhiệt độ phát triển tối ƣu ở 370C, phát triển đƣợc ở nhiệt độ 50C – 420C. Trên môi trƣờng đặc, thƣờng có hai loại khuẩn lạc, một loại to, nhẵn, dẹt, trung tâm hơi lồi; một loại nhỏ, xù xì, lồi. Hình 1.19. Vi khuẩn Pseudomonas 1.5.6.2. Khả năng gây bệnh Pseudomonas spp. gây bệnh cho ngƣời: trực khuẩn Pseudomonas spp. gây bệnh có điều kiện nhƣ khi cơ thể bị suy giảm miễn dịch, bị bệnh ác tính hoặc mãn tính, khi dùng corticoid lâu dài, sử dụng các dụng cụ thăm khám hoặc bị các vết bỏng, các vết thƣơng hở, 40
Đồ án tốt nghiệp Tại chỗ, trực khuẩn gây viêm mủ (mủ có màu xanh). Khi có điều kiện thuận lợi, chúng gây bệnh toàn thân nhƣ nhiễm trùng hệ thống hô hấp, nhiễm trùng máu hoặc nhiễm trùng đƣờng tiểu, viêm phế quản, viêm phổi, viêm tai giữa, viêm màng não, viêm tủy xƣơng Pseudomonas spp. gây bệnh thực nghiệm: súc vật cảm nhiễm là chuột lang, tiêm vào màng bụng chuột 0,1 –0,5 ml canh khuẩn, khoảng 50% chuột chết sau vài giờ, những con chuột sống dần dần đƣợc hình thành những ổ mủ. 1.5.7. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Enterococcus spp. 1.5.7.1. Đặc điểm Enterococcus faecalis có đầy đủ đặc tính của streptococcus, là vi khuẩn gram dƣơng thuộc nhóm liên cầu khuẩn, có đƣờng kính < 2 µm. Nhiệt độ thích hợp cho sinh trƣởng và phát triển là 30 – 350C. Enterococcus faecalis có thể sống sót trên các bề mặt môi trƣờng, không chịu đƣợc sự thành trùng, pH < 6,3, chất kháng sinh, chất sát trùng. Không sinh độc tố (Dƣơng Văn Sĩ, 2010). Hình 1.20. Vi khuẩn Enterococcus faecalis. 41
Đồ án tốt nghiệp 1.5.7.2. Khả năng gây bệnh Vi khuẩn Enterococcus faecalis là vi khuẩn sống trong vi hệ bình thƣờng của ngƣời, chúng là một trong những nguyên nhân gây ra các nhiễm trùng cơ hội trên cơ thể ngƣời khi cơ thể đang bị bệnh, hệ miễn dịch suy yếu hay do dùng kháng sinh lâu dài. Vi khuẩn Enterococcus faecalis thƣờng gây nhiễm khuẩn đƣờng tiết niệu, gây nhiễm trùng vết thƣơng (chủ yếu là phẫu thuật, vết loét và vết bỏng) và nhiễm khuẩn huyết. 1.5.8. Nhóm vi khuẩn Staphylococcus aureus 1.5.8.1. Đặc điểm Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus spp.) có hình cầu, đƣờng kính 0,8 – 1µm, đứng tụ lại với nhau thành từng đám nhƣ chùm nho, có thể đứng lẻ tẻ hoặc thành từng đôi hay thành từng chuỗi ngắn. Staphylococcus spp. là nhóm vi khuẩn Gram dƣơng, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi, không có vỏ, không di động, không sinh bào tử và có khả năng sinh nội độc tố. Chúng phát triển đƣợc trong điều kiện nhiệt độ và pH chênh lệch nhiều (nhiệt độ từ 100C – 450C). Hình 1.21. Vi khuẩn Staphylococc us aureus 42
Đồ án tốt nghiệp 1.5.8.2. Khả năng gây bệnh Tụ cầu khuẩn có nhiều loại: có loại gây bệnh, thƣờng gặp nhất là tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) và có loại bình thƣờng sống trên da và niêm mạc, không gây bệnh. Staphylococcus aureus cƣ trú trên ngƣời và động vật, có trong sữa bò bị bệnh, thịt heo tƣơi, trong đất là vi sinh vật gây bệnh cơ hội mạnh nhất. Vi khuẩn Staphylococcus aureus gây bệnh bằng cách bám dính vào da, niêm mạc (khoang miệng, mũi hầu, đƣờng tiết niệu) hay các tổ chức sâu hơn nhƣ tổ chức lympho, biểu mô dạ dày ruột, bề mặt phế nang, tổ chức nội mô. Ngoài ra Staphylococcus aureus còn là tác nhân gây nhiều bệnh nhiễm trùng nhƣ: Nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng vết thƣơng hậu phẩu, tác động lên hệ thần kinh trung ƣơng. Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus spp.) gây bệnh thực nghiệm: thỏ là động vật dễ cảm nhiễm nhất. Ngoài ra, có thể dùng mèo non, chuột non để tìm độc tố ruột. 43
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng Thí Nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công Nghệ Tp. HCM. 2.1.2. Thời gian nghiên cứu Đề tài đƣợc thực hiện từ 01/2015 đến 08/2015. 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Nguồn mẫu Mẫu cây Xidi Klung (cành, lá) đƣợc thu tại Vƣờn quốc gia Bidoup Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng. 2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị Vi khuẩn chỉ thị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu là 20 chủng vi khuẩn đƣợc cung cấp bởi Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh và Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II, bao gồm: - Nhóm vi khuẩn Escherichia Coli: E. coli, ETEC, E. coli 0208, E. coli O157:H7. - Nhóm vi khuẩn Salmonella: S. enteritidis, S. typhii, S. typhimurium, S. dublin. - Nhóm vi khuẩn Shigella: S. sonnei, S. boydii, S. flexneri. - Nhóm vi khuẩn Vibrio: V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. harveyi, V.cholerae. - Nhóm vi khuẩn Listeria: L. monocytogenes, L. innocua. - Các vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da: E. feacalis, S. aureus, P. aeruginosa. 2.2.3. Hóa chất, dung môi a. Môi trường nuôi cấy và tăng sinh - Môi trƣờng TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia - Ấn Độ). - Môi trƣờng TSA (Trypton Soya Agar) (HiMedia - Ấn Độ). 44
Đồ án tốt nghiệp b. Hóa chất - Ciprofloxacin 500 mg (Việt Nam). - H2SO4 đậm đặc, H2SO4 loãng, HCl đậm đặc, chloroform. - Na nitro prusside, pyridine, ninhydrin, ammonia, gelatin 1%, glycerol. - Acid acetic glacial, acetic anhydride, benzene, bột Magnesium. - NaOH 10%, Ferric chloride (FeCl3) 10%, lead acetate (Pb(C2H3O2)) 10%. - Thuốc thử: Molisch, Fehling A, Fehling B, Barfoed, Mayer, Dragendorff, Hager, Wagner. c. Dung môi: - Ethanol 50 %, 70 %, 90% (Việt Nam). - Methanol 75%. - Nƣớc cất. - Dimethylsulfoxid (DMSO) (Trung Quốc). 2.2.4. Dụng cụ và thiết bị a. Dụng cụ. - Đĩa petri - Dụng cụ đục lỗ (d= 6 mm) - Ống nghiệm lớn, nhỏ - Thƣớc đo - Becher 100 ml, 250 ml, 500 ml - Bông thấm và bông không thấm - Ống đong 100 ml, 250 ml, 500 nƣớc ml - Đũa thuỷ tinh - Pipet 1 ml, 10 ml - Các loại đầu típ - Ống ly tâm ependoff 2 ml - Micropipette 100 µl, 1000 µl - Bình môi trƣờng 250 ml, 500 - Eppendorf ml, 1000 ml - Các loại dụng cụ khác nhƣ: bao - Que cấy trang chịu nhiệt, kéo, giấy giói, kẹp - Đèn cồn gấp, muỗng, dao, thun, 45
Đồ án tốt nghiệp b. Thiết bị - Autoclave (Huxky Đài Loan) - Máy đo UV – VIS (Hach) - Tủ ấm 300C, 370C (Memmert - Cân phân tích (Orbital mermany) Germany) - Máy ly tâm (Tuttligen - Bếp từ (Billy – England) Germany) - Máy nƣớc cất (Branstead USA) - Máy cô cách thủy -Thiết bị cô quay chân không 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu Mẫu thực vật đƣợc thu một lƣợng lớn toàn bộ các bộ phận lá và cành mang đi rửa sạch và phơi khô để có đƣợc khối lƣợng không đổi. Mẫu cây khô đƣợc tiến hành cắt nhỏ và xay nhuyễn thành dạng bột. Lƣợng bột mẫu thu đƣợc sẽ đƣợc đóng gói trong túi nhựa và lƣu trữ trong một bình kín hơi dùng để tách chiết cao sử dụng trong các thí nghiệm. 2.3.2. Phương pháp tách chiết và thu nhận cao thực vật Mẫu thực vật đƣợc tách chiết bởi nhiều loại dung môi khác nhau bằng phƣơng pháp chiết ngâm ở nhiệt độ thƣờng và thu nhận cao chiết bằng cách cho bay hơi, loại bỏ lƣợng dung môi của dịch chiết bằng các thiết bị cô thích hợp. Nguyên tắc: sử dụng phƣơng pháp chiết ngâm, mẫu thực vật đƣợc ngâm trong lƣợng lớn dung môi (w/v) ở khoảng thời gian nhất định để các chất tan trong mẫu hòa tan vào dung môi. Cách tiến hành: ngâm một lƣợng bột mẫu vào lƣợng lớn dung môi (tỷ lệ 1:20 (w/v)) trong một bình kín để ở nhiệt độ phòng. Mẫu đƣợc ngâm trong khoảng 24h, thỉnh thoảng có khuấy trộn hoặc lắc sau đó đem đi lọc hoặc ly tâm, ép bã thu dịch chiết. Tiếp tục cho thêm lƣợng dung môi mới vào phần bã bột thực vật và chiết thêm một số lần nữa cho đến khi dịch lọc thu đƣợc có màu trong suốt. Phần dịch chiết đƣợc cô đặc, thu hồi cao bằng phƣơng pháp cô quay chân không ở 400C (đối với dung môi methanol) và cô cách thủy ở 70oC (đối với dung môi ethanol, nƣớc). Các cao chiết đƣợc bảo quản ở nhiệt độ 40C để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. 46
Đồ án tốt nghiệp Hình 2.1. Mẫu Xidi Klung ngâm trong ethanol (tỳ lệ 1:20 (w/v)) 2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 2.3.3.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật Nguyên tắc: Đây là phƣơng pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật đƣợc cấy trên môi trƣờng thạch nghiêng và ủ trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng này đƣợc chuyển vào tủ mát (3 – 50C) để bảo quản. Quá trình này đƣợc lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo vi sinh vật luôn đƣợc chuyển đến môi trƣờng mới trƣớc khi già và chết. Tùy từng nhóm vi sinh vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyền khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa là 3 tháng cấy chuyền một lần. Cách tiến hành: Giống vi sinh vật thuần khiết, đƣợc bảo quản trong ống thạch nghiêng và giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 40C. Sau 1 - 3 tháng phải cấy truyền vi sinh vật qua ống thạch nghiêng mới bằng cách dùng que cấy vòng lấy sinh khối vi sinh vật trong ống thạch nghiêng cũ ria vào ống thạch nghiêng mới, sau đó đem ống thạch nghiêng mới đi ủ, tùy từng loại vi sinh vật mà quyết định nhiệt độ ủ, nhiệt độ ủ dao động từ 48 – 72 giờ. Ống thạch nghiêng chứa vi sinh vật sau khi ủ xong đƣợc bảo quản trong tủ lạnh ở 40C (Nguyễn Lân Dũng và Dƣơng Văn Hợp, 2007). 47
Đồ án tốt nghiệp 2.3.3.2 Phương pháp bảo quản lạnh sâu Nguyên tắc: Ngoài phƣơng pháp giữ giống trên môi trƣờng thạch nghiêng, có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phƣơng pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nƣớc trong tế bào. Để khắc phục nhƣợc điểm này ngƣời ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh nhƣ glycerol. Cách tiến hành: Vi khuẩn đƣợc tăng sinh trong môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp rồi hút 1ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và thu cặn có chứa sinh khối vi khuẩn. Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh -150C (Nguyễn Lân Dũng và Dƣơng Văn Hợp, 2007). 2.3.4. Phương pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi sinh vật chỉ thị Nhằm hoạt hoá các vi khuẩn đƣợc giữ giống phát triển lại bình thƣờng vì chúng có thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản. Nguyên tắc: Sử dụng phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp. Môi trƣờng dinh dƣỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh dƣỡng (đa lƣợng và vi lƣợng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hoá lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và môi trƣờng. Cách tiến hành: Đối với các giống vi khuẩn đang khảo sát và các giống vi khuẩn chỉ thị đƣợc giữ trên môi trƣờng TSA hay trong glycerol 40%, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10 ml môi trƣờng TSB trong điều kiện vô trùng. Sau đó tiến hành lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sinh khối vi khuẩn tăng lên làm đục môi trƣờng nuôi cấy (Lê Ngọc Thuỳ Trang, 2013). Mật độ tế bào vi khuẩn đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo mật độ quang OD ở bƣớc sóng 600nm. Công thức tính toán xác định mật độ tế bào (công thức McFahrland): 9 Mật độ = OD600 x 1,02 x 10 (cfu/ml) 48
Đồ án tốt nghiệp 2.3.5. Phương pháp pha loãng mẫu Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhƣng có vai trò quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật. Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều cho quá trình định lƣợng cũng nhƣ phân tích vi sinh vật. Phƣơng pháp pha loãng mẫu (mẫu lỏng và mẫu rắn) chỉ đƣợc sử dụng trong trƣờng hợp vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lƣợng vi sinh vật trong mẫu. Cách tiến hành: Dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ đƣợc nồng độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta đƣợc nồng độ pha loãng 10-2. Tiếp tục tiến hành nhƣ vậy cho đến khi đƣợc nồng độ cần thiết (Phạm Minh Nhựt, 2013). Hình 2.2. Phƣơng pháp pha loãng mẫu 2.3.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp khuếch tán trên giếng thạch (well diffusion agar method) dựa trên phƣơng pháp của Anonymous (1996) và Hadacek và ctv (2000) có sự điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm. 49
Đồ án tốt nghiệp Nguyên tắc: Dịch cao chiết ở các giếng sẽ khuếch tán vào môi trƣờng thạch và tác động lên các chủng khuẩn chỉ thị. Nếu cao chiết có khả năng ức chế các chủng vi khuẩn thì sẽ xuất hiện quầng trong bao quanh các giếng thạch (vòng ức chế). Từ đó, đánh giá khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết bằng cách đo đƣờng kính vòng ức chế (mm). Cách tiến hành: Các chủng vi khuẩn đƣợc hoạt hóa từ ống giống gốc trong môi trƣờng lỏng TSB, lắc qua đêm. Hút 0,1 ml dịch vi khuẩn đã đƣợc hoạt hóa ở mật độ 106 cfu/ml lên đĩa TSA và tiến hành trang đều vi khuẩn lên đĩa. Đục lỗ để tạo giếng đƣờng kính d = 6 mm sao cho mỗi giếng cách nhau khoảng 2-3 cm. Chuẩn bị dịch cao chiết bằng cách hòa tan lƣợng cao chiết trong Dimethyl Sulfoxide (DMSO)1% theo nồng độ yêu cầu 100 mg/ml. Bổ sung 100 µl dịch cao chiết vào các giếng thạch trên đĩa petri và giữ các đĩa ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ để dịch cao đƣợc khuyếch tán đều vào môi trƣờng thạch. Sau đó, ủ các đĩa vào tủ ấm 370C trong 24 giờ và tiến hành đọc kết bằng cách đo giá trị đƣờng kính vòng ức chế (mm) trên đĩa thạch (Hình 2.3). Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần. Đối chứng là dung dịch kháng sinh Ciprofloxacin . Ethanol 70% Ciprofloxacin Hình 2.3. Đƣờng kính vùng ức chế vi khuẩn của cao ethanol 70% và Ciprofloxacin 50
Đồ án tốt nghiệp 2.3.7. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC Nguyên tắc: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cho cao chiết có số lƣợng vi sinh vật bị kháng cao nhất. Nhằm mục đích xác định nồng độ ức chế nhỏ nhất của cao chiết đối với các vi sinh vật bị kháng. Sử dụng phƣơng pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method) ở các nồng độ khác nhau. Cách tiến hành: Hút 0,1 ml dịch vi khuẩn đã đƣợc hoạt hóa ở mật độ 106 cfu/ml lên đĩa TSA và tiến hành trang đều vi khuẩn lên đĩa. Đục lỗ để tạo giếng có đƣờng kính 6 mm trên đĩa TSA. Cao chiết đƣợc pha loãng trong DMSO 1% với nồng độ gốc là 100 mg/ml. Từ nồng độ gốc pha loãng theo cấp số 2 thành nhiều dãy nồng độ thấp hơn cụ thể nhƣ sau: 50 mg/ml; 25 mg/ml; 12,5 mg/ml. Sau khi có dịch cao chiết ở nhiều nồng độ, tiến hành bổ sung 100 µl dịch cao chiết vào các giếng thạch trên đĩa petri và giữ các đĩa ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ để dịch cao đƣợc khuyếch tán đều vào môi trƣờng thạch. Sau đó, ủ các đĩa vào tủ ấm 370C trong 24 giờ và tiến hành đọc kết bằng cách đo giá trị đƣờng kính vòng ức chế (mm) trên đĩa thạch. Mỗi nồng độ cao thí nghiệm đƣợc lặp lại ba lần. 2.3.8. Phương pháp xác định thành phần hóa học có trong cao chiết Nguyên tắc: Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thành phần cao chiết bằng các phản ứng hóa học theo các phƣơng pháp thông dụng trong phòng thí nghiệm đã đƣợc chuẩn hóa để sơ bộ hóa thành phần hoạt chất (Lƣơng Văn Tiến và ctv, 2015). Cách tiến hành: Cao chiết đƣợc đem ngâm trong dung môi thích hợp, tiến hành lọc và thu dịch lọc. Sau đó dùng dịch cao chiết này tiến hành định tính các thành phần hóa học với các loại hóa chất, thuốc thử đặc trƣng. 2.3.8.1. Định tính carbohydrate Thử nghiệm Molisch: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó cho 2 giọt thuốc thử Molisch vào, tiếp tục nhỏ từ từ 2 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc vào và đọc kết quả. Kết quả đƣợc xem là dƣơng tính khi có hình thành phức hợp màu đỏ - tím. 51
Đồ án tốt nghiệp Thử nghiệm Fehling: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, cho lần lƣợt 1 ml thuốc thử Fehling A và 1 ml Fehling B vào. Đun cách thủy 5 phút và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi có xuất hiện tủa màu đỏ của CuO. Thử nghiệm Benedict: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử Barfoed. Đun cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, làm lạnh và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi hình thành kết tủa màu đỏ gạch (Yadav và ctv, 2013). 2.3.8.2. Định tính saponin Thử nghiệm tạo bọt: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó thêm 2 ml nƣớc cất vào lắc mạnh. Kết quả dƣơng tính khi ống nghiệm có xuất hiện bọt và ổn định (Abba và ctv, 2009). 2.3.8.3. Định tính alkaloid Thử nghiệm Mayer: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính là khi quan sát đƣợc kết tủa màu trắng đục tạo thành. Thử nghiệm Dragendorff: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi hình thành kết tủa màu vàng cam. Thử nghiệm Hager: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml thuốc thử Hager và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi hình thành kết tủa màu vàng. Thử nghiệm Wagner: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và bổ sung 2 ml thuốc thử Wagner vào và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính là khi hình thành kết tủa màu nâu đỏ (Yadav và ctv, 2013). 2.3.8.4. Định tính cardiac glycoside Thử nghiệm Legal: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml pyridine và 1 ml Na nitro prusside, sau đó bổ sung 5 giọt NaOH 10% vào và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi xuất hiện màu đỏ đậm. Thử nghiệm Keller Killiani: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml acid acetic glacial và 1 ml dung dịch FeCl3, cho từ từ 1 ml H2SO4 đậm 52
Đồ án tốt nghiệp đặc vào và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi xuất hiện màu xanh trong lớp acid acetic (Yadav và ctv, 2013) 2.3.8.5. Định tính anthraquinone glycoside Thử nghiệm Bontrager: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml dung dịch H2SO4 loãng và đun sôi, sau đó tiến hành lọc nóng và để nguội dịch lọc, bổ sung thêm 3 ml benzene lắc đều rồi để yên, tách lấy lớp benzene cho vào ống nghiệm khác, tiếp tục thêm 2 ml ammonia và quan sát màu trong lớp ammonia. Kết quả dƣơng tính khi xuất hiện màu hồng hoặc đỏ (Abba và ctv, 2009). 2.3.8.6. Định tính flavonoid Thử nghiệm Alkaline: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm rồi cho vào 5 giọt NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng, thêm vài giọt HCl loãng vào thấy ống nghiệm về màu cao ban đầu chứng tỏ có sự hiện diện của Flavonoid (mẫu đối chứng làm tƣơng tự, thay NaOH 10% thành nƣớc cất). Kết quả dƣơng tính nếu xuất hiện màu vàng đậm khi bổ sung NaOH và trở về màu cao ban đầu khi bổ sung HCl. Có thực hiện ống đối chứng dƣơng thay NaOH thành nƣớc cất. Thử nghiệm Shinoda: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, cho một ít bột Magnesium vào, cho từ từ 1 ml HCl đậm đặc vào sát thành ống nghiệm. Sau đó thêm 5 ml ethanol 95% và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính là khi mẫu có xuất hiện cam, hồng, đỏ đến tím, Thử nghiệm Ferric chloride: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó thêm vài giọt thuốc thử Ferric chloride 10% và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi ống nghiệm xuất hiện màu xanh hoặc tím (Mamta và ctv, 2012). 2.3.8.7. Định tính các hợp chất phenol Thử nghiệm lead acetate: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, rồi cho vào 3 ml lead acetate 10% sau đó đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi xuất hiện kết tủa trong ống nghiệm. Thử nghiệm Gelatin: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt galatin 10% vào và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi xuất hiện kết tủa trắng. (Mamta và ctv, 2012). 53
Đồ án tốt nghiệp 2.3.8.8. Định tính tannin Thử nghiệm ferric chloride: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%, cho 4 giọt thuốc thử ferric chloride 10% và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi ống nghiệm xuất hiện tủa màu xanh, xanh – đen (Abba và ctv, 2009). Thử nghiệm lead acetate: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%, cho 4 giọt thuốc thử lead acetate 10% vào và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi ống nghiệm xuất hiện màu vàng (Mamta và ctv, 2012). 2.3.8.9. Định tính steroid Thử nghiệm Salkowski: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm vào 2 ml chloroform và nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc, lắc mạnh rồi để yên cho tách thành 2 lớp đọc kết quả ở mặt phân cách. Kết quả xác định đƣợc chia thành 2 trƣờng hợp: ở lớp dƣới xuất hiện màu đỏ là sterol, xuất hiện màu vàng là triterpenoid. Thử nghiệm Libermann Burchard: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm thêm 2 ml acid anhydride, sau đó nhỏ từ từ H2SO4 đậm đặc theo thành ống nghiệm rồi đọc kết quả. Kết quả xác định đƣợc chia thành 2 trƣờng hợp: Xuất hiện vòng màu nâu ở mặt phân cách và lớp trên có màu xanh lá là sterol. Hình thành màu đỏ đậm là triterpenoid (Mamta và ctv, 2012). 2.3.8.10. Định tính amino acid Thử nghiệm Ninhydrin: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó cho vào một vài giọt thuốc thử Ninhydrin, đun sôi 5 phút và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi thấy xuất hiện màu tím (Yadav và ctv, 2013). 2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2007 và phần mềm Statgraphics Centurion XV version 15.1.02 với trắc nghiệm Tukey. Dữ liệu phân tích theo phƣơng sai One-way ANOVA (P < 0,05) có ý nghĩa thống kê. 54
Đồ án tốt nghiệp 2.4. Bố trí thí nghiệm Các thí nghiệm tiến hành khảo sát sự ảnh hƣởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cây Xidi Klung đƣợc trình bày ở Hình 2.4. Mẫu Xidi Klung Xử lý mẫu Tách chiết và thu hồi cao Cao chiết Xidi Klung của các loại dung môi khác nhau Khảo sát hoạt tính Xác định sự hiện diện kháng khuẩn của cao một số thành phần hóa học của cao Xác định chỉ số MIC của cao chiết ethanol 70% Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 55
Đồ án tốt nghiệp 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hiệu suất thu hồi cao chiết từ Xidi Klung 2.4.1.1. Quy trình thí nghiệm Mẫu Xidi Klung Xử lý mẫu: phơi khô, xay nhuyễn Ngâm với dung môi (1:20) (w/v) Methanol Nƣớc Ethanol Ly tâm 5000v/phú 50% 70% 90% t Lọc tinh Bã Dịch chiết Dịch lọc Bã Cô quay chân Cô cách thủy 0 không 400C 70 C Cao Đánh giá hiệu suất thu hồi cao Bảo quản lạnh (40C) Hình 2.5. Quy trình tách chiết và thu hồi cao từ cây Xidi Klung 56
Đồ án tốt nghiệp 2.4.1.2. Thuyết minh quy trình - Xidi Klung sau khi đƣợc thu nhận tiến hành xử lý mẫu cây. Trƣớc tiên cây đƣợc rửa sạch và đem đi phơi trong mát, sau khi khô đem xay nhuyễn thành dạng bột. Hình 2.6. Mẫu bột Xidi Klung - Tiến hành ngâm mẫu bột với các loại dung môi khác nhau theo tỷ lệ 1:20 (w/v):  Đối với dung môi methanol: bột mẫu đƣợc ngâm với lƣợng lớn methanol 75% trong erlen thủy tinh khoảng 48 giờ. Sau đó, tiến hành ly tâm 5000 vòng/phút trong thời gian 5 phút. Dịch sau ly tâm đƣợc đem đi lọc chân không bằng giấy lọc Whatman với đƣờng kính lỗ lọc là 11 µm để thu dịch trong. Phần bã tiếp tục đƣợc ngâm và ly tâm với lƣợng methanol nhƣ lần đầu cho đến khi dịch có màu nhạt dần. Thu tất cả dịch lọc, sau đó tiến hành loại bỏ dung môi bằng phƣơng pháp cô quay chân không ở 400C để thu nhận cao chiết.  Đối với dung môi nƣớc cất: bột mẫu đƣợc ngâm với lƣợng lớn nƣớc cất chứa trong erlen thủy tinh. Cách 4 giờ, tiến hành lọc chân không thu nhận dịch chiết, phần bã bột tiếp tục đƣợc ngâm và lọc với lƣợng nƣớc cất nhƣ lần đầu cho đến 57
Đồ án tốt nghiệp khi dịch chiết nhạt màu. Thu tất cả dịch lọc, sau đó tiến hành loại bỏ dung môi bằng phƣơng pháp cô cách thủy ở 700C để thu nhận cao chiết.  Đối với dung môi ethanol: ngâm mẫu bột với lƣợng lớn ethanol (50%, 70%, 90%) trong erlen thủy tinh đậy kín để tránh hiện tƣợng bay hơi khoảng 48 giờ. Sau đó, tiến hành lọc chân không mẫu thu nhận dịch chiết, phần bã bột tiếp tục đƣợc ngâm, lọc với lƣợng dung môi nhƣ lần đầu cho đến khi dịch chiết có màu nhạt dần. Thu tất cả dịch lọc, sau đó tiến hành loại bỏ dung môi bằng phƣơng pháp cô cách thủy ở 700C để thu nhận cao chiết. Hình 2.7. Dịch chiết mẫu từ cây Xidi Klung ngâm với ethanol 70% - Xác định hiệu suất thu hồi cao: Lƣợng cao của các loại dung môi khác nhau sau khi đƣợc cô, đem đi cân để xác định hiệu suất thu hồi cao so với khối lƣợng bột mẫu ban đầu. Hiệu suất thu hồi cao đƣợc tính theo công thức sau: (%) Trong đó: H: hiệu suất cao thu đƣợc (%) m1: khối lƣợng cốc thủy tinh có chứa bột cao (g) m2: khối lƣợng cốc thủy tinh ban đầu (g) m: khối lƣợng mẫu bột ban đầu dùng để ngâm với dung môi (g) 58
Đồ án tốt nghiệp - Sau khi xác định hiệu suất thu hồi các loại cao thu hồi đƣợc bảo quản ở nhiệt độ 40C trong tủ lạnh để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Mỗi nghiệm thức trong thí nghiệm đƣợc thực hiện lặp lại 3 lần. 2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của các loại dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết 2.4.2.1. Quy trình thí nghiệm 59
Đồ án tốt nghiệp Vi sinh vật chỉ thị Tăng sinh trong Môi trƣờng TSA môi trƣờng TSB Hấp tiệt trùng Lắc nhiệt độ phòng 0 (18 – 24 giờ) 121 C – 1 atm trong 15 phút Đo OD600nm Đổ đĩa Cao chiết Hút 100 µl dịch Pha loãng về vi khuẩn Hòa tan 106 cfu/ml Cấy trang DMSO 1% Đục lỗ (d= 6 mm) Nhỏ dịch Nồng độ 100 Nhỏ dịch mg/ml 0 Ủ 37 C/24 giờ Đo đƣờng kính vòng kháng khuẩn Hình 2.8. Quy trình đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết 60
Đồ án tốt nghiệp 2.4.2.2. Thuyết minh quy trình Trong thí nghiệm này, tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết Xidi Klung bằng phƣơng pháp khuếch tán trên giếng thạch. Các chủng vi khuẩn chỉ thị đƣợc tăng sinh trong erlen chứa 10 ml môi trƣờng TSB (riêng với các chủng Vibrio spp. có bổ sung thêm 1,5% NaCl), để lắc với tốc độ 120 vòng/phút từ 18 - 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau khi lắc đƣợc đo OD ở bƣớc sóng 600 nm để xác định mật độ tế bào và pha loãng bằng các ống nƣớc muối sinh lí vô trùng để đạt mật độ tế bào vi khuẩn 106 cfu/ml. Hút 100 µl dịch vi khuẩn đã đƣợc pha loãng cho lên trung tâm đĩa thạch TSA đã chuẩn bị sẵn (riêng các chủng Vibrio spp. môi trƣờng TSA có bổ sung 1,5% NaCl). Tiến hành trang khô, đều dịch vi khuẩn khắp bề mặt đĩa thạch trong điều kiện vô trùng, dán nhãn các chủng vi khuẩn tƣơng ứng. Dùng que đục đã khử trùng có đƣờng kính d = 6 mm, đục 3 hoặc 6 giếng trên bề mặt đĩa thạch sau khi trang, mỗi giếng cách nhau 2 cm và cách mép đĩa 1cm. Dùng dao vô trùng lấy phần thạch đã đục ra khỏi đĩa. Các loại cao chiết đƣợc hòa tan bằng DMSO 1% theo nồng độ 100 mg/ml. Hút vào mỗi giếng 100 µl dịch cao hoặc chất kháng sinh (đối với mẫu đối chứng). Hình 2.9. Giếng thạch trƣớc và sau khi bổ sung cao 61
Đồ án tốt nghiệp Các đĩa petri đƣợc để yên ở nhiệt độ phòng 2 giờ để dịch cao chiết từ các giếng khuếch tán vào môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn, sau đó ủ ở tủ ấm 370C trong thời gian 18 - 24h và đọc kết quả. Đọc kết quả bằng cách đo đƣờng kính vòng ức chế (tính bằng mm) và so sánh đƣờng kính vòng ức chế của các loại cao đƣợc chiết bằng dung môi khác nhau và với mẫu đối chứng để khảo sát sự ảnh hƣởng của dung môi tách chiết. Mẫu đối chứng là ciprofloxacin 8 µg/ml với chủng Vibro spp. và 500 µg/ml với các chủng còn lại. Thí nghiệm đƣợc lặp lại ba lần và lấy giá trị đƣờng kính trung bình. A B Hình 2.10. Vòng kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% (100 mg/ml) đối với chủng Staphylococcus aureus (A) và Samolnella enteritidis (B) 2.4.3. Thí nghiệm 3: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết ethanol 70% từ cây Xidi Klung đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh Kết thúc thí nghiệm 2 nhận thấy cao chiết Xidi Klung ethanol 70% có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất. Vì vậy, mẫu cao chiết này sẽ đƣợc sử dụng để xác định chỉ số MIC đối với các chủng vi khuẩn đối kháng bằng phƣơng pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method). 62
Đồ án tốt nghiệp 2.4.3.1. Quy trình thí nghiệm Vi sinh vật chỉ thị Môi trƣờng TSA Tăng sinh trong môi trƣờng TSB Hấp tiệt trùng 1210C – 1 atm Lắc nhiệt độ phòng trong 15 phút (18 – 24 giờ) Cao chiết Đo OD 600nm Đổ đĩa ethanol 70% 70%Cao chiếtCaoDMSO 1% Hút 100 µl chiếtCao Pha loãng về Caochiế tCaochiết chi100ế t 6 dịch vi khuẩn mg/ml 10 cfu/ml cấy trang Pha loãng Đục lỗ (d= 6 mm) nhỏ 100µl Cao ở các nồng độ: 50-25-12.5 mg/ml Ủ 370C/24h Đo đƣờng kính vòng kháng khuẩn Hình 2.11. Quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết 63
Đồ án tốt nghiệp 2.4.3.2. Thuyết minh quy trình Các chủng vi khuẩn chỉ thị đƣợc tăng sinh trong erlen chứa 10 ml môi trƣờng TSB (riêng với các chủng Vibrio spp. có bổ sung thêm 1,5% NaCl), để lắc với tốc độ 120 vòng/phút từ 18 - 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau khi lắc đƣợc đo OD ở bƣớc sóng 600 nm để xác định mật độ tế bào và pha loãng bằng các ống nƣớc muối sinh lí vô trùng để đạt mật độ tế bào vi khuẩn 106 cfu/ml. Hút 100 µl dịch vi khuẩn đã đƣợc pha loãng cho lên trung tâm đĩa thạch TSA đã chuẩn bị sẵn (riêng các chủng Vibrio spp. môi trƣờng TSA có bổ sung 1,5% NaCl). Tiến hành trang khô, đều dịch vi khuẩn khắp bề mặt đĩa thạch trong điều kiện vô trùng, dán nhãn các chủng vi khuẩn tƣơng ứng. Dùng que đục đã khử trùng có đƣờng kính d = 6 mm, đục 3 hoặc 6 giếng trên bề mặt đĩa thạch sau khi trang, mỗi giếng cách nhau 2 cm và cách mép đĩa 1cm. Dùng dao vô trùng lấy phần thạch đã đục ra khỏi đĩa. Cao chiết ethanol 70% đƣợc hòa tan bằng DMSO 1% theo nồng độ 100 mg/ml. Sau đó pha loãng mẫu cao theo dãy nồng độ 50 – 25 – 12.5 mg/ml vào mỗi bình thủy tinh đã đƣợc khử trùng. Hút vào mỗi giếng 100 µl dịch cao. Mỗi nồng độ lặp lại 3 lần trên từng chủng vi sinh vật chỉ thị. Dán nhãn lên đĩa với các nồng độ tƣơng ứng. Các công đoạn trên đều thực hiện trong điều kiện vô trùng với ngọn lửa đèn cồn. Các đĩa petri đƣợc để yên ở nhiệt độ phòng 2 giờ để dịch cao chiết từ các giếng khuếch tán vào môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn, sau đó ủ ở tủ ấm 370C trong thời gian 18 - 24h và đọc kết quả. Chỉ số MIC đƣợc xác định ở nồng độ dịch chiết thấp nhất mà tại đó đƣờng kính vòng kháng khuẩn bắt đầu xuất hiện. Hình 2.12. Vòng kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% (25 mg/ml) đối với chủng Listeria monocytogenes 64
Đồ án tốt nghiệp 2.4.4. Thí nghiệm 4: Định tính một số thành phần hóa học cơ bản của cao chiết ethanol 70% từ cây Xidi Klung 2.4.4.1. Quy trình thí nghiệm Cao chiết Hòa tan trong dung dịch Hòa tan trong dung dịch H2SO4 10% DMSO 1% Lọc Lọc Dịch trong Dịch trong Phân tích thành phần Phân tích thành phần hoá học hoá học Alkaloid Saponin Cardiac Phenolic Steroid glycoside Carbohydrate Athraquinone Flavonoid Tannin Amino glycoside acid Hình 2.13. Quy trình định tính một số thành phần hóa học của cao chiết ethanol 70% từ cây Xidi Klung 65
Đồ án tốt nghiệp 2.4.4.2. Thuyết minh quy trình - Chuẩn bị mẫu : Đối với chỉ tiêu alkaloid: mẫu cao chiết đƣợc hòa tan trong dung dịch H2SO4 10% trong khoảng 30 phút đến 60 phút. Sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc và thu phần dịch trong để tiến hành các thử nghiệm. Đối với các chỉ tiêu còn lại: mẫu cao đƣợc hòa trong dung dịch DMSO 1% cho đến khi tan hoàn toàn. Sau đó, lọc dung dịch cao qua giấy lọc và thu dịch trong để tiến hành các thử nghiệm. a. Định tính thành phần carbohydrate - Thử nghiệm Molisch - Thử nghiệm Fehling - Thử nghiệm Benedict b. Định tính thành phần saponin - Thử nghiệm Foam (xà phòng) c. Định tính thành phần alkaloid - Thử nghiệm Mayer - Thử nghiệm Dragendroff - Thử nghiệm Hager - Thử nghiệm Wagner d. Định tính thành phần cardiac glycoside - Thử nghiệm Legal - Thử nghiệm Keller Killiani e. Định tính thành phần anthraquinone glycoside - Thử nghiệm Bontrager f. Định tính thành phần flavonoid - Thử nghiệm Alkaline - Thử nghiệm Shinoda - Thử nghiệm Ferric chloride 66