›

Khóa luận Nghiên cứu tác dụng điều trị viêm đại tràng từ cao chiết cây vối (Cleistocalyx Operculatus)

pdf 53 trang thiennha21 18/04/2022 6301
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu tác dụng điều trị viêm đại tràng từ cao chiết cây vối (Cleistocalyx Operculatus)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_nghien_cuu_tac_dung_dieu_tri_viem_dai_trang_tu_cao.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu tác dụng điều trị viêm đại tràng từ cao chiết cây vối (Cleistocalyx Operculatus)

  1. x ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC DƯƠNG THỊ HẢI LINH NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ VIÊM ĐẠI TRÀNG TỪ CAO CHIẾT CÂY VỐI (Cleistocalyx Operculatus) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2021
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC DƯƠNG THỊ HẢI LINH NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ VIÊM ĐẠI TRÀNG TỪ CAO CHIẾT CÂY VỐI (Cleistocalyx Operculatus) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2016.Y Người hướng dẫn: 1.PGS.TS. Bùi Thanh Tùng 2.ThS. Phan Hồng Minh Hà Nội – 2021
  3. LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt khóa luận này, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Bùi Thanh Tùng; ThS.Phan Hồng Minh, Bộ môn Dược lý và Dược lâm sàng, Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội; là những người thầy, người cô đã tận tâm hướng dẫn và chỉ bảo nhiệt tình, kĩ lưỡng cũng như luôn tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khoá luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các giảng viên thuộc Dược lý và Dược lâm sàng, Bộ môn Bào chế và Công nghệ dược phẩm, Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc, Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện khóa luận. Tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc đến tập thể quý thầy cô giáo trong Đại học Y Dược đã hết sức tận tình dạy dỗ, trang bị kiến thức cho tôi trong suốt 5 năm theo học tại trường. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường. Và cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn theo sát động viên, quan tâm và tạo mọi điều kiện giúp tôi có thể hoàn thành khóa luận này. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn những giúp đỡ quý báu đó! Hà Nội, ngày 10 tháng 06 năm 2021 Sinh viên Dương Thị Hải Linh
  4. MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 3 1.1. Bệnh viêm đại tràng 3 1.1.1. Khái niệm 3 1.1.2. Dịch tễ học và yếu tố nguy cơ 3 1.1.3. Cơ chế bệnh sinh 4 1.1.4. Biến chứng 5 1.1.5. Phương pháp điều trị hiện nay 6 1.1.5.1. Mục tiêu và phương pháp điều trị 6 1.1.5.2. Sulfasalazin 7 1.2. Mô hình gây viêm đại tràng 8 1.2.1. Cysteamin 8 1.2.2. Mô hình gây viêm đại tràng trên chuột bằng Cysteamin 9 1.3. Stress oxy hóa và phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa- Phương pháp định lượng Malondialdehyd. 10 1.3.1. Stress oxy hóa 10 1.3.2. Cơ chế chống oxy hóa 11 1.3.3. Các chất chống oxy hóa 11 1.3.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa-phương pháp định lượng Malondialdehyd. 12 1.4. Tổng quan về cây Vối (Cleistocalyx Operculatus) 13 1.4.1. Giới thiệu thực vật 13 1.4.2. Đặc điểm thực vật 14
  5. 1.4.3. Phân bố 14 1.4.4. Thành phần hóa học 14 1.4.5. Tác dụng và công dụng 15 CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. Đối tượng nghiên cứu 19 2.1.1. Mẫu nghiên cứu 19 2.1.2. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 19 2.2. Phương tiện nghiên cứu 20 2.2.1. Hóa chất 20 2.2.2. Thiết bị và dụng cụ 20 2.3. Nội dung nghiên cứu 21 2.4. Phương pháp nghiên cứu 22 2.4.1. Xác định các thành phần trong cao chiết cây vối 22 2.4.2. Xây dựng mô hình chuột Viêm đại tràng bằng cysteamin 24 2.4.3. Đánh giá tác dụng điều trị viêm đại tràng của dịch chiết lá cây vối (Cleistocalyx Operculatus) 24 2.5. Phương pháp xử lý số liệu 28 CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1. Kết quả 29 3.2. Bàn luận 35 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39
  6. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 1. UC : Viêm đại tràng 2. TNF-α : Yếu tố hoại tử khối u 3. IL : Interleukin 4. TGF : Yếu tố tăng trưởng biến đổi 5. ROS : Các loại oxy phản ứng 6. RNS : Các loại nitơ phản ứng 7. 5-ASA : 5-aminosalicylat 8. COPD : Bệnh viêm phổi tắc nghẽn mạn tính 9. PUFAs : axit béo không bão hòa đa 10. MDA : malondialdehyd 11. 4-HNE : 4 ‐ hydroxynonenal 12. TBARS : phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa 13. DMC (38) : 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcon 14. HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao 15. GC-MS/MS : Sắc ký khí khối phổ song song 16. DDPH : 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 17. DSS : dextran sulfat natri 18. TNBS : axit trinitrobenzen sulfonic 19. AMPK : protein hoạt hóa kinase
  7. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình vẽ Tên hình vẽ Trang Hình 1.1 Cơ chế bệnh sinh của viêm đại tràng 5 Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của Sulfasalazin 7 Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của Cysteamin 9 Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của DMC 15 Hình 2.1 Hình ảnh cây Vối 19 Hình 2.2 Hình ảnh cao chiết EtOH từ cây vối 20 Hình 2.3 Sơ đồ nghiên cứu 22 Hình 2.4 Cơ chế phản ứng của phương pháp định lượng MDA 26 Hình 3.1 Sắc ký đồ GC-MS/MS của cao chiết EtOH từ cây Vối 30 Hình 3.2 Hình ảnh quan sát đại thể của các lô nghiên cứu 32-33 Hình 3.3 Chỉ số trung bình về mức độ phù và viêm 33 Hình 3.4 Nồng độ MDA/protein của các nhóm 34
  8. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 2.1 Pha dãy dung dịch chuẩn TMOP 26 Các chất chính được xác định trong chiết xuất ethanol Bảng 3.1 của cây Vối bởi GC – MS/MS 30-31
  9. MỞ ĐẦU Các bệnh lý nội khoa của ống tiêu hoá được xem là căn bệnh của xã hội hiện đại. Cùng với các yếu tố về vệ sinh an toàn thực phẩm, ô nhiễm môi trường và thói quen ăn uống, sinh hoạt không hợp lý là những nguyên nhân làm các bệnh này trở nên phổ biến hơn trong cộng đồng. Viêm đại tràng là một trong những bệnh tiêu hóa phổ biến, có xu hướng gia tăng tỷ lệ mắc trong cộng đồng người châu Á và bệnh có tính mạn tính, gây ra cảm giác khó chịu cho bệnh nhân, làm giảm chất lượng cuộc sống, ảnh hưởng đến cả thể chất và tinh thần của người bệnh; đặt ra gánh nặng về tài chính và nguồn lực cho hệ thống chăm sóc sức khỏe của nhiều quốc gia đặc biệt là khi sử dụng các sản phẩm tân dược [9]. Việt Nam là một trong những nước nhiệt đới với hệ thực vật phong phú với nguồn tài nguyên dược liệu dồi dào, là điều kiện thuận lợi cho việc phát triển các sản phẩm chăm sóc sức khỏe và làm đẹp từ thiên nhiên. Do đó, các nghiên cứu về các hoạt chất thiên nhiên và nghiên cứu chuyển hóa chúng thành dẫn xuất mới bằng nhiều con đường khác nhau để đánh giá hoạt tính sinh học là một lĩnh vực hấp dẫn và rất quan trọng trong việc phát huy và nâng cao giá trị nguồn dược liệu trong nước. Cây Vối (Cleistocalyx Operculatus) thuộc chi Cleistocalyx là một dược liệu quý được sử dụng nhiều trong Y học cổ truyền [3]. Cây mọc nhiều ở vùng nhiệt đới, hoang dại hoặc được trồng ở nhiều nơi trên cả nước, đặc biệt nhiều ở vùng đồng bằng và trung du phía Bắc nước ta. Các nghiên cứu khoa học đã công bố về thành phần hóa học cũng như tác dụng sinh học của loài cây này tại Việt Nam khá ít. Để tạo tiền đề và đánh giá tiền lâm sàng bước đầu cho các đề tài nghiên cứu tiếp theo, đề tài: “Nghiên cứu tác dụng điều 1
  10. trị viêm đại tràng từ cao chiết cây Vối (Cleistocalyx Operculatus)” được thực hiện nhằm những mục tiêu sau: 1. Xác định được các nhóm chất có trong cây Vối. 2. Đánh giá tác dụng điều trị viêm đại tràng của dịch chiết cây Vối trên mô hình invivo chuột gây viêm đại tràng bằng cysteamin. 2
  11. CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1. Bệnh viêm đại tràng 1.1.1. Khái niệm Theo Tổ chức Crohn's and Colitis Vương quốc Anh, viêm đại tràng được định nghĩa là một trong hai dạng chính của bệnh viêm ruột (Inflammatory Bowel Disease – IBD). Bệnh liên quan đến tình trạng viêm lan tỏa ở niêm mạc đại tràng. Trong viêm đại tràng, các vết loét phát triển trên bề mặt niêm mạc ruột, có thể tiết nhầy hoặc là chảy máu. Đây là một viêm ruột vô căn; mạn tính, diễn ra liên tục, suốt đời [10]. 1.1.2. Dịch tễ học và yếu tố nguy cơ Tỷ lệ phổ biến và tỷ lệ mắc viêm đại tràng (UC) trên toàn cầu đã tăng lên trong những thập kỷ gần đây ở các quốc gia phát triển và các quốc gia đang phát triển [9]. Nghiên cứu của Johan Burisch chỉ ra rằng, tỷ lệ mắc bệnh viêm loét đại tràng tăng ở châu Âu từ 6,0/100.000 người vào năm 1962 lên 9,8/100.000 người vào năm 2010 [12]. Tỷ lệ mắc bệnh UC của cộng đồng châu Á đang tăng lên song song với tốc độ đô thị hóa nhanh chóng; cao nhất ở Đông Á (Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc, Hồng Kông) và Nam Á (Ấn Độ) từ 0,54 đến 3,44 trên 100.000 người. Tỷ lệ thấp hơn đã được báo cáo ở các nước Đông Nam Á [13]. Một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến tỷ lệ mắc bệnh và bùn phát các triệu chứng đã được phân tích trong một nghiên cứu của Ashwin N Ananthakrishnan bao gồm: hút thuốc lá, cắt ruột thừa, chế độ ăn uống, vitamin D [12,13]. Viêm loét đại tràng có tỷ lệ mắc với đỉnh điểm khởi phát chính ở độ tuổi từ 15 đến 30 tuổi, và đỉnh thứ hai là trong độ tuổi từ 50 đến 70 tuổi. Tiền sử gia đình mắc bệnh viêm ruột là yếu tố nguy cơ độc lập quan trọng nhất. Nguy cơ đặc biệt cao ở những người thân cấp độ một: 5,7–15,5% 3
  12. bệnh nhân viêm loét đại tràng có người thân cấp độ một mắc bệnh tương tự [16]. 1.1.3. Cơ chế bệnh sinh Sự biểu hiện của các bệnh viêm ruột nói chung và viêm đại tràng nói riêng, được cho là phụ thuộc vào sự tác động lẫn nhau của các yếu tố môi trường, di truyền và miễn dịch [9]. Rối loạn chức năng miễn dịch trong niêm mạc ruột được công nhận là cơ chế sinh học trong sự phát triển của UC [14]. Ở bệnh nhân UC, một số lượng lớn các tế bào miễn dịch (tế bào T, tế bào B, đại thực bào và tế bào đuôi gai) và các cytokin [các cytokin tiền viêm như yếu tố hoại tử khối u (TNF-α), interferon (IFN) -γ, interleukin (IL) - 6, IL-12, IL-17, IL-21, IL-23; các cytokin chống viêm như IL-10, yếu tố tăng trưởng biến đổi (TGF) -β và IL-35] được biểu hiện bất thường ở đại tràng [17]. La Kruidenier chỉ ra một số cơ chế tác động liên quan đến các chất oxy hóa hay các loại oxy/ nitơ phản ứng (ROS/RNS), có thể gây ra tổn thương tế bào hoặc mô quá mức, viêm mạn tính và phá hủy mô; các triệu chứng thường được quan sát thấy trong bệnh viêm ruột. Sản xuất quá nhiều gốc tự do làm gây ra tình trạng viêm trong ruột; chịu trách nhiệm cho việc tăng cường chất điện giải và bài tiết nước, dẫn đến tiêu chảy ở những bệnh nhân mắc bệnh viêm ruột [30]. 4
  13. Hình 1.1: Tương tác giữa các loài phản ứng đường ruột (RSI) và các chất oxy hóa khử có hệ thống trong niêm mạc đường ruột khỏe mạnh và bị viêm. 1.1.4. Biến chứng Bệnh nếu không được phát hiện và điều trị đúng, kịp thời thì có thế dẫn đến một trong các biến chứng nguy hiểm như sau: - Xuất huyết tiêu hóa: à triệu chứng của bệnh nhưng trong các đợt tiến triển thấy dấu hiệu xuất huyết tiêu hóa nặng lên. Dấu hiệu là phân có máu đỏ tươi số lượng nhiều kèm tình trạng mất máu. - Thủng đại tràng: bệnh cảnh viêm phúc mạc. Là cấp cứu ngoại khoa. - Giãn đại tràng cấp tính: thường gặp ở thể viêm loét đại tràng nặng, viêm toàn bộ đại tràng. Đại tràng giãn to chù yếu giãn đại tràng ngang, đường kính > 6cm. Đây là những trường hợp có nguy cơ thủng đại tràng. 5
  14. - Ung thư đại tràng: Khi niêm mạc đại tràng bị viêm loét kéo dài hoặc viêm loét tái phát nhiều lần làm các tế bào biểu mô niêm mạch dễ có nguy cơ bị loạn sản sau đó chuyển thành u ác tính ở đại tràng. Ung thư bắt đầu xuất hiện khoảng 7 năm sau khi khởi phát bệnh ở những bệnh nhân viêm đại tràng lan rộng và sau đó tiến triển khoảng 0,5 đến 1% bệnh nhân mỗi năm. Do đó, sau 20 năm bị bệnh, khoảng 7% đến 10% bệnh nhân sẽ tiến triển thành ung thư và khoảng 30% sau 35 năm bị bệnh. 1.1.5. Phương pháp điều trị hiện nay 1.1.5.1. Mục tiêu và phương pháp điều trị [1] Viêm đại tràng là bệnh mạn tính, yêu cầu chăm sóc y tế lâu dài và suốt đời. Mục tiêu điều trị hướng đến là giảm triệu chứng bệnh và cải thiện chất lượng cuộc sống của từng bệnh nhân. Một số thuốc được sử dụng trong điều trị viêm đại tràng được sử dụng hiện nay bao gồm thuốc chống viêm và thuốc ức chế miễn dịch. - Thuốc chống viêm nhóm 5-ASA (5-aminosalicylat): sulfasalazin (Azulfidine), olsalazin (Dipentum), và mesalazin (Pentasa, Asacol, Rowasa) - Thuốc chống viêm glucocorticoid dùng đường uống và tiêm tĩnh mạch: prednisolon, dexamethason, betamethason - Thuốc ức chế miễn dịch: azathioprine (Imuran), infliximab (Remicade) hoặc Cyclosporine (Sandimum) Các thuốc này thường được báo cáo là gây ra một số tác dụng phụ trên mắt, xương, đường tiêu hóa, gan, tuyến tụy và hệ thống miễn dịch [18]. 6
  15. Ngoài ra một số thuốc được sử dụng để làm giảm triệu chứng của bệnh như: Thuốc chống tiêu chảy (loperamid, diphenoxylat ); thuốc giảm đau, hạ sốt (acetaminophen ); kháng sinh (metronidazole, ciprofloxacin). 1.1.5.2. Sulfasalazin Sulfasalazin là sulfonamid tổng hợp bằng diazo hóa sulfapyridin và ghép đôi muối diazoni với axit salicylic. Liên kết diazo khi vào cơ thể bị phân cắt tạo thành sulfapyridin và 5-ASA (mesalamin) [5]. Hình 1.1: CTCT của Sulfasalazin Sulfasalazin ban đầu được sử dụng để điều trị viêm khớp dạng thấp vào những năm 1940, sau đó qua các nghiên cứu nhanh chóng được công nhận là có hiệu quả trong điều trị viêm đại tràng; là thuốc điều trị UC chính trong hơn 50 năm. Tại đại tràng, azo reductase trong hệ vi khuẩn đại tràng phân chia phân tử thuốc giải phóng 5-ASA và sulfapyridin tự do [19]. Nhóm hoạt động trong sulfasalazin là 5-ASA; tiếp xúc trực tiếp với niêm mạc đại tràng, ức chế cyclooxygenase và sự sản xuất prostaglandin E2; ức chế tổng hợp leukotrien; ngăn ngừa các phản ứng viêm bằng việc ức chế sinh IL-1, IL-6 and TNF-a [20]. Trong đó, cơ chế bảo vệ được thể hiện rõ rệt qua việc bảo vệ niêm mạc ruột với các sản phẩm sinh ra trong quá trình ức chế superoxid dismutase (SOD)- một chất 7
  16. bảo vệ chống oxy hóa rất quan trọng chống lại stress oxy hóa trong cơ thể. Phần lớn sulfasalazin được hấp thu được bài tiết vào mật; chỉ một phần nhỏ được thải qua nước tiểu. 5-ASA được hấp thu kém từ ruột kết và phần lớn được bài tiết qua phân. Sulfapyridine được hấp thu nhanh chóng từ ruột kết, chuyển hóa qua gan và bài tiết qua nước tiểu, chỉ còn lại một lượng nhỏ trong phân [19]. 1.2. Mô hình gây viêm đại tràng Bởi các mô hình thực nghiệm viêm đại tràng trên chuột cố khả năng mô phỏng chặt chẽ các đặc điểm hình thái, mô bệnh học và triệu chứng bệnh ở người nên việc gây ra UC thực nghiệm đã được sử dụng rộng rãi trên quy mô phòng thí nghiệm để xác định cơ chế bệnh sinh của bệnh và nghiên cứu các đáp ứng điều trị với thuốc mới. Trong số các mô hình viêm đại tràng do hóa chất, viêm đại tràng do axit trinitrobenzen sulfonic (TNBS), oxazolon và dextran sulphat natri (DSS) được sử dụng rộng rãi nhất. TNBS tạo ra phản ứng miễn dịch theo hướng Th-1, trong khi oxazolon biểu hiện chủ yếu phản ứng miễn dịch của kiểu hình Th-2. Mô hình viêm đại tràng do DSS cũng gây ra những thay đổi trong hồ sơ cytokin Th-1/Th-2. Bên cạnh đó, cysteamin liều cao với cơ chế làm tăng tính nhạy cảm của niêm mạc với stress oxy hóa cũng là một tác nhân được sử dụng để gây mô hình viêm đại tràng ở chuột liên quan đến stress oxy hóa [4]. 1.2.1. Cysteamin Cysteamin (công thức hóa học là HSCH2CH2NH2) là một sản phẩm tự nhiên của quá trình chuyển hóa coenzym A đã được cấp phép 20 năm để điều trị bệnh xơ nang [21]. Hiện nay, cysteamin được phát triển hướng tới điều trị các bệnh như: Huntington, Parkinson, gan nhiễm mỡ không do rượu, ung thư [22]. 8
  17. Khi sử dụng ở liều lượng cao hơn 140 mg/kg, Quá trình oxy hóa cysteamin khi có mặt các kim loại chuyển tiếp tạo ra các phân tử hydrogen peroxid (H2O2), gây ra quá stress oxy hóa. Ngoài ra, liều cao cysteamin làm giảm hoạt động của glutathion peroxidase, enzym xúc tác quá trình oxy hóa của glutathion thành disulfid của nó [21, 22]. Cysteamin làm giảm các yếu tố bảo vệ của đường tiêu hóa và gây ra loét tá tràng- đại tràng ở chuột [23, 24]. Cysteamin là chất gây độc tế bào, trực tiếp làm tổn thương niêm mạc đại tràng. Theo thí nghiệm của Sikiric, việc áp dụng liều 200 mg/kg cysteamin, tổn thương niêm mạc đại tràng đã đạt đến mức tối đa sau 30 phút, cùng với các tổn thương ít hơn trong khoảng thời gian kéo dài hơn [21, 23]. Hình 1.2: CTCT của Cysteamin 1.2.2. Mô hình gây viêm đại tràng trên chuột bằng Cysteamin Chuột được nhịn ăn một ngày trước khi cho uống cysteamin. Ngày đầu tiên của thí nghiệm, chuột được gây mô hình bằng cysteamin. Mô hình được thực hiện bằng cách cho chuột uống cysteamin liều 200 mg/kg thể trọng vào lúc 9h sáng và 13h chiều (uống 2 lần, mỗi lần cách nhau 4 tiếng) [4, 23]. 9
  18. 1.3. Stress oxy hóa và phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa- Phương pháp định lượng Malondialdehyd. 1.3.1. Stress oxy hóa Stress oxy hóa có vai trò quan trọng trong việc khởi phát và làm tăng mức độ nghiêm trọng của viêm đại tràng. Stress oxy hóa được định nghĩa là sự mất cân bằng giữa việc sản xuất các gốc tự do và các chất chuyển hóa phản ứng, được gọi là chất oxy hóa hoặc các loại oxy phản ứng (ROS) [25]. Cơ chế chính làm phá hủy tế bào và mô của stress oxy hóa là việc giải phóng quá mức các chất oxy hóa [26]. Khi hệ thống miễn dịch suy giảm, các chất oxy hóa được sản xuất quá mức làm tổn thương niêm mạc ruột và gây cản trở quá trình phục hồi của chúng trong điều trị [27]. Ảnh hưởng của stress oxy hóa đến cơ thể: - Stress oxy hóa làm tổn hại đến lipid: làm thay đổi tính thấm và tính chọn lọc qua màng do làm mất các dây nội chưa bão hòa; thay đổi tính đồng nhất của enzym màng do tạo ra những chất có hoạt tính mạnh. - Stress oxy hóa làm tổn hại đến protein: làm kết tập, phân mảnh, phân tách protein; phản ứng với ion sắt của nhân Hem; biến đổi nhóm chức năng dẫn đến thay đổi hoạt tính enzym và phân giải protein - Stress oxy hóa làm tổn hại đến DNA: làm đứt gãy chuỗi, tách vòng saccharide làm tăng tỷ lệ đột biến DNA hoặc gây ra tổn thương DNA, mất ổn định bộ gen và tăng sinh tế bào [28]. - Một số bệnh hay gặp do stress oxy hóa: Lão hóa, COPD, Alzheimer, Xơ vữa động mạch, ung thư, tim mạch, tiểu đường, viêm xương khớp, viêm ruột, báo phì, Parkinson, viêm khớp dạng thấp [29]. 10
  19. 1.3.2. Cơ chế chống oxy hóa Gồm 3 cấp độ chống oxy hóa : - Ức chế sản xuất lượng lớn các chất oxy hóa ROS, RNS. - Bắt giữ các gốc tự do như : khóa, bẫy, dập tắt lan truyền. - Sửa đổi cơ chế của các phân tử sinh học bị phá hủy. 1.3.3. Các chất chống oxy hóa Các chất chống oxy hóa là các chất có khả năng loại bỏ stress oxy hóa bằng các cơ chế bảo vệ. Gồm chất chống oxy hóa enzym và chất chống oxy hóa không phải enzym [30]. 1.3.3.1. Chất chống oxy hóa enzym [29, 30] Hệ thống enzym chống oxy hóa bao gồm - Superoxid dismutases (SOD) [8]: Ba loại SOD khác nhau được biểu hiện trong tế bào người, đồng-kẽm SOD (Cu-ZnSOD), Mn-SOD và SOD ngoại · - bào (EC-SOD), tất cả đều có thể chuyển hai anion O2 thành H2 O2 và oxi phân tử. - Catalase và glutathion peroxidase (CAT và GOP): Catalase sau đó chịu trách nhiệm giải độc H2O2. GOP là một nhóm enzym khác có khả năng khử hydroperoxit, bao gồm hydroperoxit lipid, sử dụng GSH làm chất nền. 1.3.3.2. Chất chống oxy hóa không enzym - Trái cây, rau và chiết xuất thực có đặc tính chống oxy hóa (óc chó, việt quất, cà rốt, socola đen, lúa mạch). Đặc biệt, một số khoáng chất (ví dụ như kẽm), vitamin (C và E) và các flavonoid có trong các chất chiết xuất dược liệu. 11
  20. - Chất chống oxy hóa không phải enzym nội sinh trong hệ thống đường ruột. Chúng bao gồm các chất hòa tan trong nước, chẳng hạn như glutathion, metallothionein, axit ascorbic (vitamin C), axit uric và một số protein huyết tương, cũng như các chất hòa tan trong lipid, chẳng hạn như α ‐ tocopherol (vitamin E), bilirubin và ubiquinol (giảm coenzym Q 10). 1.3.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa-phương pháp định lượng Malondialdehyd. Kỹ thuật đo ROS và RNS trực tiếp trong tế bào và mô gặp nhiều khó khăn do thời gian bán hủy sinh học của chúng khá ngắn vì vậy gây hạn chế cho việc định lượng trực tiếp mức ROS/RNS trong niêm mạc ruột [30]. Quá trình peroxy hóa lipid là một cơ chế gây tổn thương tế bào cơ bản của stress oxy hóa và được sử dụng như một chất chỉ thị trong tế bào và mô. Lipid peroxit có nguồn gốc từ axit béo không bão hòa đa (PUFAs), không ổn định và dễ bị thủy phân hủy để tạo thành một chuỗi phức tạp các hợp chất như malondialdehyd (MDA), 4 ‐ hydroxynonenal (HNE) và 15 (S) -8-iso-PGF 2α. [31]. Mức độ tăng của MDA và HNE cho biết về sự dư thừa chuyển hóa. Phép đo tổn thương oxy hóa in vivo phổ biến nhất là dựa trên việc định lượng các phân tử đánh dấu MDA. Định lượng MDA dùng để đánh giá mức độ oxy hóa trong các mô sinh học, có thể sử dụng 2 phương pháp: định lượng trực tiếp và gián tiếp [7].  Định lượng trực tiếp Các phép phân tích định lượng trực tiếp MDA đều dựa trên nguyên lý kết hợp HPLC với đo quang phổ tử ngoại [7]. - Ưu điểm: Độ nhạy và độ đặc hiệu cao [7]. 12
  21. - Nhược điểm: Đòi hỏi thiết bị HPLC có detector có đội nhạy cao. Thời gian tiến hành dài, tùy vào mỗi loại mẫu, thời gian có thể rất khác nhau. MDA có thể liên kết với các thành phần trong mẫu nên cần phải phá hủy các liên kết này trước khi tiến hành chạy HPLC. Đồng thời, phải xác định chính xác được lượng MDA liên kết để có thể tính đúng được MDA tổng số và lượng MDA tự do[7].  Định lượng gián tiếp Nguyên tắc định lượng gián tiếp là dựa trên các dẫn xuất có khả năng phát huỳnh quang, các dẫn xuất màu hoặc hấp thụ tia tử ngoại hay các sản phẩm khí [7]. - Ưu điểm: thực hiện dễ dàng, có thể thực hiện được nhiều mẫu với tốc độ nhanh chóng [7]. - Nhược điểm: Độ chính xác không cao bằng phương pháp xác định trực tiếp [7]. Phương pháp TBARS là phương pháp định lượng gián tiếp thường được sử dụng để đo lường MDA trong mẫu sinh học. Tuy nhiên, phản ứng này tương đối không đặc hiệu; cả MDA tự do và dạng liên kết với protein hay các aldehyd khác có khối lượng phân tử nhỏ cũng có thể phản ứng. Phương pháp MDA-586 được thiết kế để kiểm tra MDA tự do hoặc sau khi thủy phân (tăng tính đặc hiệu sau khi loại bỏ các yếu tố ảnh hưởng của HNE) [31]. 1.4. Tổng quan về cây Vối (Cleistocalyx Operculatus) 1.4.1. Giới thiệu thực vật Tên khoa học: Cleistocalyx Operculatus [1]. Tên nước ngoài: Syzygium nervosum [1]. 13
  22. Tên tiếng việt: Cây trâm nắp, vối nhà [1]. Họ Sim (Myrtaceae) [1]. 1.4.2. Đặc điểm thực vật Vối là cây thân gỗ có kích thước trung bình, cao khoảng 5-6m, hoặc có thể cao hơn; cành non tròn hay hình 4 cạnh. Lá đơn, mọc đối, có hình bầu dục hoặc hình trứng rộng, dài 8-20cm, rộng 5-10cm, dai, cứng; hai mặt có những đốm nâu; có cuống là 1-1,5cm. Hoa gần như không có cuống, mọc thành cụm hình tháp, trải ra ở nách những lá đã rụng; hoa nhỏ, màu lục nhạt, trắng. Quả hình cầu, hay hơi hình trứng, đường kính 7-12cm, xù xì, nhớt. Lá, cành non và nụ vò có có mùi thơm dễ chịu đặc biệt của vối [1,2,3]. 1.4.3. Phân bố Cây vối mọc hoang và được trồng ở các nước nhiệt đới như Trung Quốc, Lào, Ấn Độ, Việt Nam. Xuất hiện nhiều ở các tỉnh đồng bằng Bắc Bộ và Trung Bộ. Cây mọc ở những nơi có thời tiết ẩm ướt. 1.4.4. Thành phần hóa học Các thành phần chính của C. Operculatus được xác định là triterpenoid loại oleanan và ursan [32], flavonoid C-methyl hóa [6], và phloroglucinols đa vòng [ 33, 34]. - Triterpenoid: Các terpenoid phân lập chủ yếu là loại oleanan- (β - amyrin triterpenoid) và loại ursan- (α-amyrin triterpenoid). Bên cạnh đó, ba triterpenoid loại lupin- và hai dẫn xuất megastigmane bất thường cũng được phân lập và làm sáng tỏ cấu trúc [32]. - Flavonoid: C-methyl hóa flavonoid (có một hoặc hai nhóm metyl liên kết trực tiếp với vòng thơm) là nhóm đặc trưng của hợp chất trong C. Operculatus với sự xuất hiện chủ yếu của DMC (38). Phương pháp định 14
  23. lượng được phát triển và xác nhận trên cột HPLC pha đảo C18, pha động bao gồm dung môi hữu cơ (axetonitril hoặc metanol) và dung môi nước (chứa axit photphoric hoặc axit trifluoroacetic), và bộ phát hiện tia cực tím ở bước sóng khoảng 330 nm, là một bước sóng UV cực đại của DMC (38). Các nghiên cứu định lượng này cho thấy hàm lượng DMC trong nụ hoa dao động từ 0,75% đến 1,85% trong các chiết xuất khác nhau [33]. Bên cạnh đó, các flavonoid phổ biến và glycosid của chúng cũng được xác định, chẳng hạn như kaempferol, quercetin, tamarixetin, các dẫn xuất myricetin và glycosid của chúng. Hình 1.3: DMC (2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcon; 38) - Phloroglucinols: Các phloroglucinols được phân lập từ C. Operculatus có các đặc điểm cấu trúc đặc trưng, chẳng hạn như nhóm metyl liên kết C trong vòng thơm, sự lai tạo của các đơn chất terpen và acylphloroglucinol, và chất dimers phloroglucinol đa vòng [56]. Ngoài ra trong lá còn chứa ít tanin, alkaloid. Các bộ phận khác có chứa sterol, các chất béo, tanin catechic và gallic (3). Độc tính: Không độc với cơ thể [3]. 1.4.5. Tác dụng và công dụng  Theo Y học cổ truyền 15
  24. Tính vị: Vị đắng, chát, tính mát Tác dụng: Thanh nhiệt giải biểu, sát trùng, chỉ dương, tiêu trệ. Hay được sử dụng làm trà, phối hợp với lá Hoắc hương làm nước hãm uống lợi tiêu hóa [2,3]. Tác dụng kháng sinh trên một số vi trùng Gram (+) và Gram (-), mạnh nhất đối với Streptococus (hemolytic và staman), Bạch hầu và Staphylococus và Pneumcoccus [2,3]. Lá vối tươi hay khô sắc đặc có tính sát trùng, rửa mụn nhọt, lở loét, ghẻ [1,3]. Lá, vỏ, thân, hoa làm thuốc chữa đầy bụng, khó tiêu, ỉa chảy, mụn nhọt, viêm đại tràng mạn tính, lỵ trực trùng. Ở Ấn Độ, rễ sắc đặc dạng siro đắp vào các khớp sưng đỏ, quả dùng ăn trị phong thấp. Ở Trung Quốc, dùng trị cảm mạo, đau đầu phát sốt, lỵ trực khuẩn, viêm gan, bệnh mẩn ngứa, viêm tuyến sữa, ngứa ngáy ngoài da, bệnh nấm ở chân, vết thương do dao súng [3].  Theo Y học hiện đại - Tác dụng điều trị tiểu đường Các chất chiết xuất của C. Operculatus cho thấy tác dụng điều trị đái tháo đường typ 2 bằng cơ chế ức chế hoạt động của các enzym tiêu hóa khác nhau in vitro và in vivo, như α –glucosidase, maltase, sucrose. Cụ thể, thí nghiệm kéo dài 8 tuần, đánh giá mức đường huyết của chuột mắc bệnh tiểu đường được điều trị với C. Opercualtus 500 mg/kg thể trọng/ngày đã giảm rõ rệt với mức giảm tối đa sau 6 giờ so với những con chuột bị tiểu đường không được điều trị [35], lipase, và α –amylase [36]. Mai và cộng sự đã tiến hành một nghiên cứu 9 tuần khác năm 2010 cho 16
  25. thấy các hoạt động bảo vệ của dịch chiết từ nụ hoa Vối trên tế bào β của đảo tụy trong mô hình chuột mắc bệnh tiểu đường [37]. Choi và cộng sự [38] đã nghiên cứu tác dụng chống đái tháo đường của DMC (38) trong cả mô hình in vitro và in vivo; cho thấy khả năng cải thiện dung nạp glucose, giảm trọng lượng trung bình và tăng quá trình oxy hóa axit béo trong các mô cơ bởi sự hoạt hóa AMPK trong cơ và kích thích FAO. - Tác dụng chống viêm DMC được phát hiện có khả năng điều hòa biểu hiện của các chất trung gian gây viêm và tiền viêm, bao gồm TNF- α (yếu tố hoại tử khối u- α), IL-1 β (interleukin-1 β), IL-6 (interleukin-6), và HMGB1 [39]. Tran PL và cộng sự [40] đã chỉ ra cơ chế chống viêm của dịch chiết cây Vối thông qua kích hoạt con đường Nrf2/HO-1 trong đại thực bào. - Tác dụng chống virut Các dẫn xuất C-methyl flavonoid của dịch chiết methanol lá vối cho tác dụng ức chế không cạnh tranh enzym neuraminidase của một sốc hủng cúm như H1N1, H9N2 [6]. Trong thử nghiệm được tiến hành năm 2018 của Su SJ và cộng sự [34], ngoài flavonoid thì các dẫn xuất phloroglucinol đặc biệt là cleistoperlon A thể hiện tác dụng ức chế mạnh nhất đối với HSV-1. - Tác dụng điều trị ung thư DMC (38) được phát hiện có hoạt tính chống lại nhiều dòng tế bào ung thư với mức độ độc tế bào khác nhau, mạnh nhất là chống lại các tế bào A549 với giá trị IC 50 là 2,3 ± 0,44 μ M [41]. Ngoài ra, khi phối hợp với các thuốc điều trị ung thư khác như 5-FU, doxorubicin hoặc Taxol, DMC cho thấy khả năng hiệp đồng, tăng tác dụng trong điều trị u kháng thuốc. [42]. DMC thể hiện các hoạt động chống ung thư thông qua nhiều cơ chế hoạt động, bao gồm biểu hiện di truyền của các protein apoptotic 17
  26. (Bcl-2 và Bax), tăng cường hoạt động của caspase-3 và caspase-9, hoặc thu gom các ROS [43]. - Tác dụng chống oxy hóa DMC đã được chứng minh là làm giảm nồng độ ROS trong và ngoài tế bào từ đó cho thấy tác dụng bảo vệ mạnh mẽ đối với quá trình peroxy hóa lipid trong microsom gan chuột, và tổn thương do H2O2 gây ra của pheochromocytima chuột (PC12) [44]. Một số dẫn xuất flavonoid của dịch chiết nụ lá vối cho thấy tác dụng chống oxy hóa tương đương DDPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) [45]. - Tác dụng dược lý khác: Trong các nghiên cứu ban đầu khác, một số tác dụng tiềm năng của cây Vối được chỉ ra chẳng hạn như các hoạt động bảo vệ tế bào, kháng khuẩn và kháng nguyên bào tủy [46] 18
  27. CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Mẫu nghiên cứu Mẫu nghiên cứu là cây Vối được thu hái tại huyện Ý Yên tỉnh Nam Định vào tháng 5 năm 2020, rửa sạch, sấy khô ở 50°C đến khối lượng không đổi và bảo quản trong túi nilon. Mẫu được Bộ môn Dược liệu và Dược cổ truyền, Đại học Y Dược giám định tên khoa học là Cleistocalyx Operculatus, họ Sim (Myrtaceae) và được lưu trữ tại Bộ môn Dược liệu và Dược cổ truyền, Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. Hình 2.1: Cây Vối (tại Ý Yên – Nam Định) 2.1.2. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu Lá và thân cây Vối (500 mg) sau khi được rửa sạch, sấy khô, cắt nhỏ được tiến hành chiết với EtOH 30°. Siêu âm 30 phút, và chiết 2 lần. Thu và gộp các dịch chiết. Cô loại bỏ dung môi thu được cao chiết dạng sệt (136,35 gram). Hàm ẩm đo được là 7,07. 19
  28. Hình 2.2: Cao chiết EtOH của cây Vối 2.2. Phương tiện nghiên cứu 2.2.1. Hóa chất - EtOH 30° - N-methyl-2-phenylindole (R1, NMPI) - HCl 37.5 % (R2) - 1,1,3,3-tetramethoxypropane (TMOP, 99%, Sigma-Aldrich) - BHT (butylated hydroxytoluene) - Sulfasalazine (500 mg, Pfizer) - Tris- HCl (Sigma) 2.2.2. Thiết bị và dụng cụ - Máy đo quang UV Aligent technologies Cary 60 UV-VIS, Mỹ - Máy đo pH HANA H18314, Mỹ 20
  29. - Cân phân tích AY 220 của hãng Shimadzu, Nhật Bản. - Máy khuấy từ của hãng Shimadzu, Nhật Bản. - Máy ly tâm - Máy ly tâm nhiệt độ - Micro pipet một đầu kênh - Dụng cụ thí nghiệm: Pipet, ống nghiệm, bình nón, bình chiết, đầu côn, đũa thủy tinh 2.3. Nội dung nghiên cứu Đề tài nghiên cứu được thiết kế bao gồm các nội dung: Nội dung 1: Xác định các thành phần trong cao chiết cây vối Nội dung 2: Xây dựng mô hình chuột Viêm đại tràng Hoạt động 1: Phân lô nghiên cứu Hoạt động 2: Gây viêm đại tràng bằng cysteamin Nội dung 3: Đánh giá tác dụng điều trị viêm đại tràng của dịch chiết lá cây vối (Cleistocalyx Operculatus) Hoạt động 1: Phân lô nghiên cứu Hoạt động 2: Đánh giá đại thể Hoạt động 3: Định lượng MDA trong các mẫu; đánh giá tổn thương do stress oxy hóa 21
  30. 2.4. Phương pháp nghiên cứu Mẫu cây Vối Phân lô nghiên cứu Lô 1 Lô 2 Lô 3 Lô 4 Lô 5 Chiết bằng EtOH 30° Sinh Chứng Vối Vối Chứng Lý bệnh thuốc 100 200 Cô đặc loại bỏ dung môi mg/kg mg/kg Gây mô hình viêm đại tràng Cao đặc Xác định Đánh gía tác dụng điều trị viêm đại tràng thành phần - Đánh giá đại thể bằng GC- MS/MS - Định lượng MDA Hình 2.3: Sơ đồ nghiên cứu 2.4.1. Xác định các thành phần trong cao chiết cây vối - Phương pháp: Định tính bằng GC-MS/MS. - Thiết bị: Máy phân tích sắc ký khí khối phổ GC-MS/MS 7000D Triple Quad của hãng Agilent - Nguyên lý: Mẫu được làm bay hơi và đi qua một cột mao quản chứa pha tĩnh. Các hợp chất trong mẫu được khí trơ (argon, heli) đẩy ra một cách lần lượt theo thời gian. 22
  31. Khi ra khỏi cột phân tích, các chất phân tích đi vào khối phổ kế song song (MS/MS) bao gồm hai máy phân tích khối lượng được ngăn cách bằng một ô va chạm. Các mảnh được chọn trong máy phân tích đầu tiên được phản ứng với khí trơ trong ô va chạm, dẫn đến phân mảnh tiếp tục. Các ion sản phẩm con này sau đó được phân giải trong ba tứ cực để phân tích. Các ion được phân tích dựa trên tỷ lệ khối lượng và điện tích (m/z) khác nhau của chúng. - Cách tiến hành: + Mẫu được chiết trong dung môi methanol bằng sóng siêu âm, được lọc qua màng lọc PTFE 0,45um + Điều kiện chạy sắc ký khối phổ như sau:  Sắc ký Cột DB-5ms: 30m x 250um x 0.25um Nhiệt độ: 50oC - 2 phút; 10oC/phút tới 160oC; 10 oC/ phút tới 250 oC; 250 oC trong 8 phút Tổng thời gian chạy là 30 phút  Khối phổ: Nguồn ion hóa: EI Nhiệt độ nguồn: 230 oC Chế độ chạy: Scan Năng lượng ion hóa: 70 eV Dải quét: mass= 100- 350 - Cách đọc kết quả Sử dụng dữ liệu của thư viện NIST 14 để xác định chất. 23
  32. 2.4.2. Xây dựng mô hình chuột Viêm đại tràng bằng cysteamin Động vật thí nghiệm được nuôi 3 ngày để thích nghi trước khi tiến hành nghiên cứu. Chuột được nhịn ăn một ngày trước khi cho uống cysteamin. Ngày đầu tiên của thí nghiệm, chuột được gây mô hình bằng cysteamin. Mô hình được thực hiện bằng cách cho chuột uống cysteamin liều 200 mg/kg thể trọng vào lúc 9h sáng và 13h chiều (uống 2 lần, mỗi lần cách nhau 4 tiếng) [4, 23]. Nhóm sinh lý được cho uống nước muối sinh lý NaCl 0,9% thay thế cho cysteamin. 2.4.3. Đánh giá tác dụng điều trị viêm đại tràng của dịch chiết lá cây vối (Cleistocalyx Operculatus) 2.4.3.1. Phân lô nghiên cứu Chuột nhắt trắng được chia thành 5 lô chia đực/cái riêng ở mỗi lô. Tiến hành nghiên cứu trong 7 ngày. - Lô chứng âm: uống nước cất. - Lô chứng bệnh: gây tổn thương đại tràng vào ngày đầu tiên với liều cysteamin là 200 mg/kg, uống nước cất. - Lô uống dịch chiết cây vối 100 mg/kg: gây tổn thương đại tràng vào ngày đầu tiên với liều cysteamin là 200 mg/kg và uống thuốc với liều 100 mg/kg. - Lô uống dịch chiết cây vối 200 mg/kg: gây tổn thương đại tràng vào ngày đầu tiên với liều cysteamin là 200 mg/kg và uống thuốc với liều 200 mg/kg. - Lô uống thuốc chứng sufasalazin: gây tổn thương đại tràng vào ngày đầu tiên với liều cysteamin là 200 mg/kg và uống sufasalazin với liều 222 mg/kg. 24
  33.  Cách pha mẫu: Cao chiết cây vối được hòa tan với nước với liều thích hợp (liều 100 mg/kg: 0,1g/20ml và liều 200 mg/kg: 0,2g/20ml) sau đó cho chuột uống dựa vào cân nặng của chuột theo tỷ lệ 0,2 ml/10 g.  Sau 7 ngày, chuột được bỏ đói qua đêm, vào 13h ngày thứ 8, tất cả các chuột bị giết và tách phần đại tràng. Mở đại tràng, rửa sạch bằng nước muối sinh lý, thấm khô, cố định lên tấm xốp bằng định ghim. 2.4.3.2. Đánh giá đại thể Đánh giá đại thể được chấm điểm dựa trên thang điểm được nêu trong các quy trình đánh giá trước đây [47]: Điểm số mức độ nghiêm trọng của phù là: 0 = phù không có trong ruột kết; 1 = phù nề nhẹ ở niêm mạc; 2 = phù nề ở niêm mạc và dưới niêm mạc; 3 = phù nề toàn bộ thành đại tràng; và 4 = phù nề nghiêm trọng ở toàn bộ thành đại tràng. Điểm mức độ nghiêm trọng của viêm là: 0 = không; 1 = nhẹ nhàng; 2 = vừa phải; và 3 = nghiêm trọng 2.4.3.3. Phương pháp định lượng MDA: MDA – 586 [48, 49] Hàm lượng MDA được tính toán từ đường chuẩn được xây dựng với chất chuẩn 1,1,3,3-tetramethoxypropan (TMOP). Kết quả được tính bằng nồng độ MDA/ mg protein.  Nguyên lý: Dựa trên phản ứng của thuốc thử tạo màu, N-metyl-2-phenylindol (R1, NMPI), với MDA ở 45°C. Một phân tử MDA phản ứng với 2 phân tử NMPI để tạo ra thuốc nhuộm carbocyanin ổn định như trong Hình 2.4. Sản phẩm có cực đại hấp thu tại bước sóng 586 nm. 25
  34. Hình 2.4: N-metyl-2-phenylindol (NMPI) phản ứng với malondialdehyd để tạo thành màu nhuộm cacbocyanin với cực đại hấp thụ ở bước sóng 586 nm.  Tiến hành: Bước 1: Xây dựng đường chuẩn định lượng với chất chuẩn Pha các dung dịch chuẩn: Sử dụng mẫu chuẩn là TMOP, pha thành dung dịch gốc có nồng độ 20µM. Sau đó từ dung dịch gốc pha loãng thành dãy dung dịch chuẩn theo bảng sau: Nồng độ dung dịch chuẩn 0 0.10 0.20 0.50 1.00 2.00 3.00 4.00 µM Số µL hút từ dung dịch gốc 0 1 2 5 10 20 30 40 Số µL nước/dd đệm thêm 200 199 198 195 190 180 140 160 vào Bảng 1: Pha dung dịch chuẩn TMOP + Tiến hành đo quang và xây dựng đường chuẩn với các dung dịch trên + Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng gồm: 0.64 ml 1-methyl-2-phenylindol 10.3 mM (thuốc thử R1) , 0.2ml mẫu thử, 10 µL butylated hydroxytoluen µg/mL (thuốc thử R2). + Vortex 15 giây + Thêm 0.15mL HCl 37% + Ủ hỗn hợp ở 45 độ C trong 45 phút 26
  35. + Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút + Hút lấy phần dịch trong và đem đi đo quang ở bước sóng 586 nm Xây dựng đường chuẩn từ kết quả đo được Bước 2: Nghiền đồng thể các mẫu ruột : + Lấy 250 mg đoạn ruột bị viêm, rửa sạch bằng nước muối sinh lý + Nghiền đồng thể ở nhiệt độ thấp trong đệm Tris- HCl với tỷ lệ thể tích mẫu: đệm = 1:9, thu dịch nghiền + Thêm 10 µl BHT 0.5M + Ly tâm 3000 vòng/phút ở 4 độ C, hút lấy dịch trong + Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng gồm: 0.64 ml 1-methyl-2-phenylindol 10.3 mM (thuốc thử R1) , 0.2ml mẫu thử, 10 µL butylated hydroxytoluen µg/mL (thuốc thử R2). + Vortex 15 giây + Thêm 0.15 mL HCl 37% + Ủ hỗn hợp ở 45 độ C trong 45 phút + Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút + Hút lấy phần dịch trong và đem đi đo quang ở bước sóng 586 nm Bước 3: Đánh giá kết quả: + Lập phương trình đường chuẩn từ chất chuẩn A586 = a * [MDA] + b + Tính nồng độ của các mẫu tương ứng theo phương trình [MDA] = (A586 – b)/ a * df Trong đó: [MDA]: nồng độ MDA của mẫu 27
  36. A586: Độ hấp thu ở 586nm của mẫu a: hệ số góc b: tung độ gốc df: Hệ số pha loãng 2.5. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu được phân tích thống kê bằng phần mềm Excel 2010. So sánh giá trị trung bình giữa các nhóm bằng one-way ANOVA bằng phần mềm IBM SPSS 16.0. Sự khác biệt giữa các nhóm được coi là có ý nghĩa thống kê khi p<0,05. 28
  37. CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả 3.1.1. Quy trình tạo cao chiết từ cây Vối Tiến hành chiết 500 gam lá và cành Vối khô theo quy trình đã nêu, chúng tôi thu được 136,35 gam cao chiết. Hiệu suất của quy trình là 27,27 %. Hàm ẩm của cao chiết được là 7,07. Kết quả chiết cho thấy cây Vối có chứa nhiều hợp chất tự nhiên. Phương pháp chiết bằng EtOH cho phép thu được các chất có độ phân cực, các chất kém phân cực khó được tách ra hoàn toàn. 3.1.2. Định tính các thành phần của cao chiết Xác định các thành phần bằng phương pháp GC-MS/MS ở các điều kiện như trên, đối chiếu với dữ liệu của thư viện NIST 14 để xác định chất. Kết quả cho thấy, có khoảng ba mươi lăm chất được xác định từ chiết xuất EtOH của C. Operculatus bằng phân tích GC-MS/MS. Các hợp chất được tìm thấy trong cao chiết bao gồm các hợp chất alkaloid: Carbazol, 1-Acetyl-3-(6- methyl-3-pyridyl)-pyrazolin, 5-Methylpyrimido[3,4-a] indol, 1-Formyl-2- phenyl-5-methyl-pyrrol; flavonoid: 4,4'-bi-4H-pyran, 2,2',6,6'-tetrakis(1,1- dimethylethyl)-4,4'-dimethyl-; chất chống nấm: 1H-1,2,3-Triazol, 4-methyl-5- (5-methyl-1H-pyrazol-3-yl); chất chống khối u: 4-Propylacridin; chất chống oxy hóa: Succinic axit, Sắc ký đồ GC - MS/MS của cao chiết EtOH từ cây Vối thu được như hình 3.1. Bảng 2 cho ta kết quả của các chất định tính được trong mẫu cao chiết. 29
  38. Hình 3.1. Sắc ký đồ GC-MS/MS của dịch chiết ethanol từ cây vối Peak Thời gian Tên hợp chất Độ tin Công thức Khối sắc lưu cậy phân tử lượng ký (%) phân tử 1 8,91 4,4'-bi-4H-pyran, 2,2',6,6'- 65,76 C28H46O2 414 tetrakis(1,1-dimethylethyl)-4,4'- dimethyl- 2 8,91 4-tert-Octylphenol, TMS derivative 73,40 C17H30OSi 278 3 12,99 1H-1,2,3-Triazol, 4-methyl-5-(5- 68,15 C7H9N5 163 methyl-1H-pyrazol-3-yl)- 4 14,21 Quinolin, 2,7-dimethyl- 64,23 C11H11N 157 5 14,77 Anthracen, 9,10-dihydro-9-(1- 78,63 C18H20 236 methylpropyl)- 6 15,48 5-Methylpyrimido[3,4-a]indol 76,48 C12H10N2 182 7 15,54 1-Acetyl-3-(6-methyl-3-pyridyl)- 60,07 C11H13N3O 203 pyrazolin 8 16,210 9-Anthracenamin, 9,10-dihydro- 61,73 C14H13N 195 9 16,66 Carbazol 65,60 C12H9N 167 10 16,66 Succinic acid, 2-fluorophenyl 66,56 C23H19FO4 378 diphenylmethyl este 30
  39. 11 16,81 7-Isoquinolinol, 1,2,3,4-tetrahydro- 62,88 C17H19NO3 285 6-methoxy-1-salicyl- 12 16,99 Pyrolo[3,2-d]pyrimidin-2,4(1H,3H)- 70,80 C6H5N3O2 151 dion 13 19,01 1-Formyl-2-phenyl-5-methyl-pyrrol 61,58 C12H11NO 185 14 23,17 Anthracen, 9,10-diethyl-9,10- 67,91 C18H20 236 dihydro- 15 24,58 4H-1-Benzopyran-4-one, 2,3- 64,86 C17H16O4 284 dihydro-5,7-dihydroxy-6,8- dimethyl-2-phenyl-, (S)- 16 25,48 Anthron 71,46 C14H10O 194 17 26,79 4-Propylacridin 60,48 C16H15N 221 Bảng 2: Các chất chính được xác định trong chiết xuất ethanol của cây Vối bởi GC – MS/MS 3.1.3. Tạo mô hình viêm đại tràng thực nghiệm Một thí nghiệm xác định liều gây viêm đại tràng thực nghiệm được tiến hành trước và độc lập với nghiên cứu. Chuột được chọn là chuột nhắt trắng, chủng Swiss do Viện vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp với khối lượng 15-20 g, phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô 3 con. Các lô nghiên cứu được nuôi với chế độ giàu chất dinh dưỡng với chu kỳ 12 giờ sáng/tối dưới nhiệt độ kiểm soát (25 °C ± 3 °C). Chuột được gây mô hình bằng cysteamin liều 200 mg/kg (2 lần/ ngày) và 400 mg/kg (2 lần/ngày) và mổ vào 9h ngày hôm sau khi gây mô hình. Thu mẫu ruột chuột và đánh giá định lượng MDA. Kết quả cho thấy, cả hai liều đều gây viêm loét trên đại tràng và tăng chỉ số MDA và việc gây mô hình bằng liều 200 mg/kg hay 400 mg/kg khác biệt về chỉ số MDA không có ý nghĩa thống kê. Vì thế, liều 200 mg/kg cysteamin 2 lần/ngày được sử dụng để gây mô hình cho nghiên cứu 7 ngày sau đó. Mô hình gây viêm đại tràng đại tràng thực nghiệm thành công. 3.1.4. Tác dụng của cao chiết cây Vối lên chuột gây viêm đại tràng 31
  40. 3.1.4.1. Đánh giá mức độ tổn thương đại tràng- quan sát đại thể - Lô chứng âm: không quan sát thấy ổ loét, đại tràng bình thường. - Lô chứng bệnh: quan sát thấy rõ ổ loét, như vậy cysteamin với liều 200mg/kg gây ra loét đại tràng trên chuột nhắt. - Lô thuốc chứng sufasalazin: không loét, không xuất huyết. Sufasalazin thể hiện tác dụng trong việc bảo vệ đại tràng, điều trị viêm loét đại tràng trên mô hình tổn thương do cysteamin gây ra trên nhắt trắng. - Lô uống cao chiết cây Vối liều 100 mg/kg: vẫn xuất hiện loét nhẹ, hơi phù nề. - Lô uống cao chiết cây Vối liều 200 mg/kg: không xuất hiện loét, thành đại tràng mỏng, không có phù nề. (Hình 3.2) Chứng âm Chứng bệnh Sulfasalazin Vối 100 mg/kg 32
  41. Vối 200 mg/kg Hình 3.2. Quan sát đại thể các mẫu ruột chuột theo các lô nghiên cứu Đánh giá mức độ phù và viêm theo thang điểm ta có hình 3.3: Hình 3.3: Chỉ số trung bình về mức độ phù và mức độ viêm của các nhóm nghiên cứu. Ghi chú: #: p < 0,05 so với nhóm bệnh lý (chứng dương) 33
  42. Điểm số đánh giá về mức độ phù của các nhóm nằm trong khoảng từ 1-2; không có khác biệt rõ rệt giữa các nhóm nghiên cứu. Ở nhóm uống cao chiết liều 200 mg/kg, chỉ số viêm trung bình được cải thiện so với nhóm chứng dương và có ý nghĩa thống kê (p<0,05). 3.1.4.2. Định lượng MDA Tác dụng chống oxy hóa của các mẫu nghiên cứu được thể hiện qua khả năng ức chế quá trình peroxid hóa lipid. Khả năng này được đánh giá thông qua việc xác định hàm lượng MDA – sản phẩm của quá trình oxy hóa lipid màng tế bào và được thể hiện ở hình 3.4. Hình 3.4. Nồng độ MDA/protein của các nhóm nghiên cứu. Ghi chú: *: p < 0.05 so với nhóm chứng dương; #: p <0.05 so với nhóm sinh lý. Từ hình 3.4, ta thấy khả năng ức chế quá trình peroxid hóa lipid thể hiện qua sự khác nhau về hàm lượng MDA giữa các nhóm. Nhóm chứng dương có MDA tăng so với nhóm sinh lý và có ý nghĩa thống kê (p<0.05). Nhóm được uống sulfasalazine cho thấy hiệu quả giảm MDA so với nhóm chứng dương có ý nghĩa thống kê (p<0.05). Cả 2 nhóm điều trị bằng cao chiết cây Vối đều cho thấy hàm lượng MDA giảm so với nhóm chứng dương và có ý nghĩa thống kê (p<0.05); trong đó, mức giảm của liều 200 mg/kg thể trọng nhiều hơn không đáng kể so với liều 100 mg/kg thể trọng. 34
  43. 3.2. Bàn luận Viêm loét đại tràng là một bệnh chưa rõ căn nguyên, gây tổn thương đường ruột đặc biệt là tổn thương đại tràng. Các triệu chứng lâm sàng thường gặp bao gồm tiêu chảy, phân có mủ và máu, đau bụng; gây khó chịu và giảm chất lượng cuộc sống của bệnh nhân. Viêm loét đại tràng là những bệnh mạn tính, tái phát và có thể gặp ở mọi lứa tuổi, cả nam và nữ, thường gặp ở người trẻ và trung niên, ở mọi quốc gia trên toàn thế giới [11]. Các yếu tố nguy cơ chủ yếu liên quan đến di truyền, nhiễm trùng, môi trường và miễn dịch [11]. Một trong những mục đích của chúng tôi là xác định vai trò của stress oxy hóa và hệ thống bảo vệ chống oxy hóa trong bệnh viêm loét đại tràng do cysteamin gây ra. Rất nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng stress oxy hóa là một trong những yếu tố quan trọng nhất gây ra UC. ROS/RNS được tạo ra dưới dạng sản phẩm phụ của trao đổi chất tế bào, chủ yếu trong ti thể. Khi tế bào sản xuất quá mức các chất chuyển hóa này lấn át khả năng chống oxy hóa của nó, gây hại cho tế bào các đại phân tử như lipid, protein. Sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid, malondialdehyd (MDA) có hại và có thể chịu trách nhiệm cho một số của hiệu ứng tổng thể, dẫn đến giải phóng nội dung ô và chết tế bào, gây tổn thương mô và cơ quan. Viêm loét đại tràng có mối quan hệ mật thiết với sự gia tăng của stress oxy hóa. Việc sử dụng các chất chống oxy hóa cho thấy lợi ích trong điều trị viêm ở viêm ruột mạn tính [51]. Cysteamin là một chất gây độc tế bào trực tiếp, tạo ra các phân tử hydrogen peroxid (H2O2), gây ra quá stress oxy hóa. Bên cạnh đó, việc sử dụng liều cao cysteamin làm giảm hoạt động của glutathion peroxidase, gây tổn thương các mô và cơ quan trong đó có đại tràng. Hơn nữa, cysteamin còn làm giảm các yếu tố bảo vệ của đường tiêu hóa dẫn đến cản trở quá trình lành vết loét và giảm viêm [23, 24]. Nghiên cứu của chúng tôi cũng tương tự với các nghiên cứu trước đây. Theo Sikiric và cộng sự (năm 2001) [23], với liều 200 mg/kg, tổn thương niêm mạc đại tràng đã đạt đến mức tối đa sau 30 phút, 35
  44. cùng với các tổn thương ít hơn trong khoảng thời gian kéo dài hơn. Sau 7 ngày không điều trị, trên đại tràng vẫn xuất hiện vết loét và chỉ số MDA của nhóm bệnh lý cao hơn hẳn so với các nhóm điều trị và nhóm sinh lý, cho thấy cysteamin gây ra viêm loét đại tràng trên chuột. Sulfasalazin, là một hợp chất 5-aminosalicylic axit (5-aminosalicylat) và là tác nhân được sử dụng phổ biến nhất để điều trị viêm loét đại tràng. Cơ chế tác động của nó có liên quan con đường cyclooxygenase (COX) và lipoxygenase (LOX), do đó làm giảm sự hình thành của prostaglandin và các leukotrien gây viêm. Sulfasalazin cho thấy tác dụng chống oxy hóa (bằng cách bình thường hóa các dấu hiệu stress oxy hóa) và chống viêm (bằng cách giảm mức TNF-α) trong bệnh viêm đại tràng do axít acetic gây ra ở chuột [52]. Kết quả này cũng tương tự với kết quả của tác giả Mi-Rae Shin và cộng sự (năm 2020) khi nghiên cứu mô hình viêm đại tràng do DSS trong 7 ngày, đã làm cải thiện phục hồi các thay đổi mô học và giảm tổn thương oxy hóa của SOD, MDA, IL-1β và TNF-α [53]. Kết quả nghiên cứu thực nghiệm của chúng tôi cũng cho thấy tác dụng làm giảm viêm, giảm MDA ở mô hình viêm đại tràng do cysteamin; hiệu quả tương tự với những phát hiện trước đây về tác dụng bảo vệ đại tràng của sulfasalazin, tiền chất của mesalazin. Các nghiên cứu gần đây cho thấy ưu điểm của việc sử dụng các dược liệu đang ngày càng được quan tâm trong điều trị viêm loét đại tràng [55]. Flavonoid là hợp chất tự nhiên được quan tâm gần đây với tác dụng chống oxy hóa mạnh có thể bảo vệ cơ thể con người khỏi các gốc tự do. Hợp chất chính của cây Vối là DMC (38), thể hiện tác dụng bảo vệ chống lại các tổn thương do H 2 O 2 gây ra trong các tế bào nội mô; làm giảm mức NO và lactate dehydrogenase (LDH), ức chế sự tích tụ MDA [54]. Theo kết quả của Min [45], một số flavonoid khác trong nụ Vối có tác dụng chống oxy hóa, cải thiện tình trạng viêm do stress oxy hóa gây ra. Nghiên cứu của Tung và cộng sự [49] cũng phát hiện DMC (38) có khả năng điều hòa biểu hiện của các chất 36
  45. trung gian gây viêm và tiền viêm, bao gồm TNF- α, IL-1 β, IL-6 và HMGB1. Dựa trên những nghiên cứu có sẵn, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này để khẳng định vai trò của cao chiết từ cây Vối đối với viêm loét đại tràng và kết quả cho thấy hiệu quả kích hoạt hệ thống bảo vệ chống oxy hóa trong mô hình viêm loét đại tràng do cysteamin gây ra và bảo vệ mô ruột kết chống lại tổn thương oxy hóa bằng cả hai cơ chế chống viêm và chống oxy hóa. Hiệu quả làm giảm MDA ở các nhóm điều trị tuy thấp hơn nhóm chứng dương, nhưng vẫn cao hơn nhóm sinh lý có thể là do thời gian thử nghiệm chưa đủ dài và viêm đại tràng là bệnh mạn tính nên không có tác dụng điều trị hoàn toàn. 37
  46. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN 1. Về việc xác định các thành phần của cao chiết từ cây Vối. Đã xác định được các hoạt chất trong cao chiết từ cây Vối bằng phương pháp sắc ký khối phổ; xác định được sự có mặt của hợp chất sinh học như alkaloid với độ tin cậy cao. 2. Về tác dụng điều trị viêm đại tràng của dịch chiết cây Vối trên mô hình in vivo chuột gây viêm đại tràng bằng cysteamin. Kết quả nghiên cứu cho thấy cao chiết EtOH từ cây vối có khả năng hỗ trợ điều trị viêm loét đại tràng, giảm lipid peroxid hóa cải thiện và làm lành vết loét, giảm viêm và phù nề. ĐỀ XUẤT Từ các nghiên cứu chứng minh tác dụng của cây Vối, chúng tôi đề xuất: o Định lượng các hoạt chất trong cao chiết EtOH của cây Vối, xác định hàm lượng, làm rõ cơ chế tác dụng của một số chất có hoạt chất sinh học để phục vụ nghiên cứu và điều trị. o Kết quả thu được chứng minh cây Vối có tác dụng hỗ trợ điều trị viêm loét đại tràng, vì vậy, tiến hành nghiên cứu bào chế các chế phẩm từ cây Vối để điều trị viêm loét đại tràng. 38
  47. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Đỗ Tất Lợi (2004); Những Cây Thuốc Và Vị Thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y học. 2. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, tập 2, tr58 3. Viện Dược liệu Quốc gia (2006). Cây thuốc và Động vật ở Việt Nam- Tập 2. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. 4. Luc Thi Thanh Hang, Nguyen TT, Bui TTD, Nguyen TN, Nguyen TH, Dang KT, Bui TT (2019); Nghiên cứu tác dụng làm lành viêm loét đại tràng và cải thiện hội chứng ruột kích thích của sản phẩm SColona, Tạp chí Y Dược cổ truyền Việt Nam, Số 02 (21); tr41-49. 5. Bộ Y Tế (2002), Dược thư Quốc gia Việt Nam, tr 3050. 6. Dao TT, Tung BT, Nguyen PH, Thuong PT, Yoo SS, Kim EH, Kim SK, Oh WK (2010); C-Methyl hóa Flavonoid từ Cleistocalyx operculatus và tác dụng ức chế của chúng đối với Neuraminidase mới lạ về bệnh cúm A (H1N1); Tạp chí các sản phẩm tự nhiên; 73(10):1636-42. 7. Lê Thị Mai (2016), Nghiên cứu tình trạng stress oxi hóa ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng, Đại học Khoa học tự nhiên 8. Nguyễn Văn Mùi (2015), Enzym học. NXB ĐHQGHN, tập 1 Tiếng Anh 9. Windsor, J. W., & Kaplan, G. G. (2019). Evolving Epidemiology of IBD. Current Gastroenterology Reports, 21(8). 10. Crohn’s và colitis UK (2017), Ucerative colitis. 11. Bruno César da Silva, Andre Castro Lyra, Raquel Rocha, and Genoile Oliveira Santana (2014).Epidemiology, demographic characteristics and prognostic predictors of ulcerative colitis, World J Gastroenterol; 20(28): 9458–9467 39
  48. 12. Johan Burisch & Pia Munkholm (2015) The epidemiology of inflammatory bowel disease, Scandinavian Journal of Gastroenterology, 50:8, 942-951 13. Ng, W. K., Wong, S. H., & Ng, S. C. (2016). Changing epidemiological trends of inflammatory bowel disease in Asia. Intestinal Research, 14(2), 111. 14. Ashwin N Ananthakrishnan, MD, MPH (2015) Environmental Risk Factors for Inflammatory Bowel Diseases: A Review, Dig Dis Sci.; 60(2): 290–298 15. Stephen B Hanauer (2004), “Update on the etiology, pathogenesis and diagnosis of ulcerative colitis”, Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol, 1(1):26-31 16. Ordás, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., & Sandborn, W. J. (2012). Ulcerative colitis. The Lancet, 380(9853), 1606–1619. 17. Guan, Q. (2019), A Comprehensive Review and Update on the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Disease, Journal of Immunology Research, 2019, 1–16. 18. Mowat C, Cole A, Windsor A, et al (2011). Guidelines for the management of inflammatory bowel disease in adults. Gut.;60(5):571– 607. 19. Kiron M. Das, Sherif A. Farag (2000). “Current medical therapy of inflammatory bowel disease” ;World J Gastroenterol; 6(4): 483–489. 20. Linares, V., Alonso, V., & Domingo, J. L. (2011). “Oxidative stress as a mechanism underlying sulfasalazine-induced toxicity”. Expert Opinion on Drug Safety, 10(2), 253–263 21. Besouw, M., Masereeuw, R., van den Heuvel, L., & Levtchenko, E. (2013). “Cysteamine: an old drug with new potential”. Drug Discovery Today, 18(15-16), 785–792. 40
  49. 22. Jeitner, T. M. (2001). Mechanisms for the Cytotoxicity of Cysteamine. Toxicological Sciences, 63(1), 57–64 23. Sikiric, P., Seiwerth, S., Grabarevic, Z., Balen, I., Aralica, G., Gjurasin, M., Sjekavica, I. (2001). “Cysteamine-colon and cysteamine-duodenum lesions in rats. Attenuation by gastric pentadecapeptide BPC 157, cimetidine, ranitidine, atropine, omeprazole, sulphasalazine and methylprednisolone”, Journal of Physiology-Paris, 95(1-6), 261–270. 24. Sikiric, P., Seiwerth, S., Aralica, G., Perovic, D., Staresinic, M., Anic, T., Sjekavica, I. (2001). “Therapy effect of antiulcer agents on new chronic cysteamine colon lesion in rat”. Journal of Physiology-Paris, 95(1-6), 283–288. 25. Z Ďuračková 1 , (2010)“Some current insights into oxidative stress” ;Physiol Res ;59(4):459-469.]. 26. McCord JM (2000). The evolution of free radicals and oxidative stress. Am J Med; 108: 652–9 27. Nikkhah-Bodaghi, M., Maleki, I., Agah, S., & Hekmatdoost, A. (2019). Zingiber officinale and oxidative stress in patients with ulcerative colitis: A randomized, placebo-controlled, clinical trial. Complementary Therapies in Medicine, 43, 1–6. 28. Visconti R, Grieco D (2009). New insights on oxidative stress in cancer. Curr Opin Drug Discov Devel. 12:240–245 29. Simone R, Subash C. G.; (2010) “Oxidative stress, inflammation, and cancer: How are they linked?”; Aggarwa Free Radic Biol Med. 49(11): 1603–1616. 30. La Kruidenier, Verspaget H. oxidative stress as a pathogenic factor in inflammatory bowel disease—radicals or ridiculous? Aliment Pharmacol Ther. 2002;16(12):1997–2015 41
  50. 31. Tsikas, D. (2017). Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges. Analytical Biochemistry, 524, 13–30. 32. Wang C, Wu P, Tian S, Xue J, Xu L, Li H, Wei X (2016), Bioactive Pentacyclic Triterpenoids from the Leaves of Cleistocalyx operculatus, J Nat Prod; 79(11):2912-2923. 33. Song JG, Su JC, Song QY, Huang RL, Tang W, Hu LJ, Huang XJ, Jiang RW, Li YL, Ye WC, Wang Y (2019); Cleistocaltones A and B, Antiviral Phloroglucinol-Terpenoid Adducts from Cleistocalyx operculatus, Org Lett; 21(23):9579-9583 34. Su JC, Wang S, Cheng W, Huang XJ, Li MM, Jiang RW, Li YL, Wang L, Ye WC, Wang Y; (2018) Phloroglucinol Derivatives with Unusual Skeletons from Cleistocalyx operculatus and Their in Vitro Antiviral Activity.J Org Chem; 83(15):8522-8532 35. Mai TT, Chuyen NV (2007), Anti-hyperglycemic activity of an aqueous extract from flower buds of Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr and Perry.Biosci Biotechnol Biochem. 71(1):69-76 36. Zhang L., Lu Y (2012). Inhibitory activities of extracts from Cleistocalyx operculatus flower buds on pancreatic lipase and α- amylase. European Food Research and Technology;235(6):1133–1139. 37. Mai, T. T., Yamaguchi, K., Yamanaka, M., Lam, N. T., Otsuka, Y., & Chuyen, N. V. (2010). Protective and Anticataract Effects of the Aqueous Extract of Cleistocalyx operculatus Flower Buds on β-Cells of Streptozotocin-Diabetic Rats. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58(7), 4162–4168. 38. Choi JW, Kim M, Song H, Lee CS, Oh WK, Mook-Jung I, Chung SS, Park KS (2016); DMC (2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'- 42
  51. dimethylchalcone) improves glucose tolerance as a potent AMPK activator. Metabolism; 65(4):533-42. 39. Yu WG, He H, Yao JY, Zhu YX, Lu YH (2015); Dimethyl Cardamonin Exhibits Anti-inflammatory Effects via Interfering with the PI3K-PDK1-PKCα Signaling Pathway.; Biomol Ther (Seoul ; 23(6):549-56 40. Tran PL, Kim O, Tran HNK, Tran MH, Min BS, Hwangbo C, Lee JH (2019); Protective effects of extract of Cleistocalyx operculatus flower buds and its isolated major constituent against LPS-induced endotoxic shock by activating the Nrf2/HO-1 pathway. Food Chem Toxicol; 129():125-137. 41. Chailungka, A., Junpirom, T., Pompimon, W., Nuntasaen, N., Meepowpan, P. (2017), Two flavonoids first isolated from the seed of Syzygium nervosum and preliminary study of their anticancer and anti- HIV-1 reverse transcriptase activities, Maejo International Journal of Science and Technology; 11(1):58-67 42. Qian F, Ye CL, Wei DZ, Lu YH, Yang SL (2005), In vitro and in vivo reversal of cancer cell multidrug resistance by 2',4'-dihydroxy-6'- methoxy-3',5'-dimethylchalcone; J Chemother; 17(3):309-14 43. Ye CL, Lai YF (2016); 2',4'-Dihydroxy-6'-methoxy-3',5'- dimethylchalcone, from buds of Cleistocalyx operculatus, induces apoptosis in human hepatoma SMMC-7721 cells through a reactive oxygen species-dependent mechanism; Cytotechnology; 68(2):331-41. 44. Ye C.-L., Liu X.-G., Huang Q. (2013); Antioxidant activity and protection of human umbilical vein endothelial cells from hydrogen peroxide-induced injury by DMC, a chalcone from buds of Cleistocalyx operculatus. South African Journal of Botany; 86:36– 40. 43
  52. 45. Min BS, Thu CV, Dat NT, Dang NH, Jang HS, Hung TM (2008); Antioxidative flavonoids from Cleistocalyx operculatus buds.; Chem Pharm Bull (Tokyo); 56(12):1725-8. 46. Tran P. T., Ngo T. Q.-M., Lee S., et al (2019). Identification of anti- osteoclastogenic compounds from Cleistocalyx operculatus flower buds and their effects on RANKL-induced osteoclastogenesis. Journal of Functional Foods; 60:p. 103388. 47. Ghasemi-Pirbaluti, M., Motaghi, E., Najafi, A., & Hosseini, M. J. (2017). The effect of theophylline on acetic acid induced ulcerative colitis in rats. Biomedicine & Pharmacotherapy, 90, 153–159. 48. BIOXYTECH (2010), MDA-586™ Spectrophotometric Assay for Malondialdehyde, OXIS Health Products, Inc; Catalog Number 21044 49. Tung, B. T., Rodríguez-Bies, E., Ballesteros-Simarro, M., Motilva, V., Navas, P., & López-Lluch, G. (2013). “Modulation of Endogenous Antioxidant Activity by Resveratrol and Exercise in Mouse Liver is Age Dependent”. The Journals of Gerontology: Series A, 69(4), 398– 409 50. Falah Hassan Almiahy, Farouk F. Jum' (2017), GC-MS Analysis of Phytochemical Constituents in Ethanoic Extract of Pomegranate (Punica granatum L.) "Salami variety") grown in Iraq, IOSR Journal of Agriculture and Veterinary Science (IOSR-JAVS); 10(10):48-53 51. Moura, F. A., de Andrade, K. Q., dos Santos, J. C. F., Araújo, O. R. P., & Goulart, M. O. F. (2015). “Antioxidant therapy for treatment of inflammatory bowel disease: Does it work?” Redox Biology, 6, 617– 639. 52. Allgayer, H. (2003). Review article: mechanisms of action of mesalazine in preventing colorectal carcinoma in inflammatory bowel disease. Alimentary Pharmacology and Therapeutics, 18(s2), 10–14 44
  53. 53. Mi-Rae Shin, Hae-Jin Park, Bu-Il Seo, Seong-Soo Roh (2020), New approach of medicinal herbs and sulfasalazine mixture on ulcerative colitis induced by dextran sodium sulfate, World J Gastroenterol. 26(35): 5272–5286. 54. Ye, C.-L., Liu, X.-G., & Huang, Q. (2013). “Antioxidant activity and protection of human umbilical vein endothelial cells from hydrogen peroxide-induced injury by DMC, a chalcone from buds of Cleistocalyx operculatus”. South African Journal of Botany, 86, 36–40 55. Triantafyllidi, A., Xanthos, T., Papalois, A., & Triantafillidis, J. K. (2015). Herbal and plant therapy in patients with inflammatory bowel disease. Annals of gastroenterology, 28(2), 210–220. 56. Pham, G. N., Nguyen, T. T. T., & Nguyen-Ngoc, H. (2020). Ethnopharmacology, Phytochemistry, and Pharmacology of Syzygium nervosum. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2020, 1–14. 57. 45