Báo cáo tổng kết đề tài: Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero ở quy mô phòng thí nghiệm

pdf 176 trang yendo 4270
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Báo cáo tổng kết đề tài: Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero ở quy mô phòng thí nghiệm", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfbao_cao_tong_ket_de_tai_nghien_cuu_xay_dung_quy_trinh_cong_n.pdf

Nội dung text: Báo cáo tổng kết đề tài: Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero ở quy mô phòng thí nghiệm

  1. C«ng ty V¾cxin vµ Sinh phÈm sè 1 B¸o c¸o tæng kÕt ®Ò tµi: Nghiªn cøu x©y dùng quy tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin d¹i trªn nu«i cÊy tÕ bµo Vero ë quy m« phßng ThÝ nghiÖm Cn®t: §ç TuÊn §¹t 8514 Hµ néi – 2010
  2. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABLV Lyssavirus dơi Úc (Australian Bat Lyssavirus) BPL Β-propiolactone CVS Chủng virút thử thách (Challenge Virus Standard) EBLV Lyssavirus dơi châu Âu (European Bat Lyssavirus) EP Dược điển châu Âu (European Pharmacopoeia) IU Đơn vị quốc tế (International unit) LAL Thử nghiệm xác định nội độc tố theo phương pháp LAL (Limulus amoebocyte lysate) LD50 Liều lượng gây chết 50% (Lethal Dose) MEM Môi trường dinh dưỡng tối thiểu (Minimum Essential medium) MNA Tế bào nguyên bào thần kinh chuột (Murine Neuroblastoma cell) MOI Multiplicity of Infection MSV Chủng vi rút giống gốc (Master seed virus) NIH Viện Sức khỏe Quốc gia Hoa Kỳ (National Institute of Health) NMR Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance) PM Chủng Pitman-Moore PPLO Pleuropneumonia - like organism PV Chủng Pasteur Virus RFFIT Thử nghiệm ức chế điểm huỳnh quang nhanh (Rapid fluorescent focus inhibition test) SDS-PAGE Điện di trên gel acrylamide (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) TCYTTG Tổ chức Y tế thế giới (WHO) VABIOTECH Công ty Vắcxin và sinh phẩm số 1 VVSDT Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương WCB Ngân hàng tế bào sản xuất (Working cell bank) WSV Chủng vi rút giống sản xuất (Working seed virus)
  3. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng số Tên bảng Trang 1.1. Các loại vắcxin dại thế hệ thứ nhất được sử dụng cho người và thú y 14 1.2. Các loại vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào và quy trình sản xuất 21 2.1. Số lượng tế bào Vero thu được qua các đời cấy chuyển trong quá trình nhân nuôi trên chai nuôi cấy một lớp 49 2.2. Kết quả nuôi cấy virút dại với các liều gây nhiễm khác nhau 51 2.3. Kết quả nuôi cấy virút dại theo ngày sau gây nhiễm virút vào 66 tế bào 2.4. Kết quả nuôi cấy virút dại theo thời điểm thay môi trường duy trì tế bào khác nhau 69 2.5. Kết quả nuôi cấy virút dại trên các dạng chai nuôi cấy khác nhau 72 2.6. Kết quả tinh sạch hỗn dịch virút bằng các loại màng lọc khác nhau 75 2.7. Kết quả bất hoạt virút dại bằng các phương pháp bất hoạt khác nhau 76 2.8. Kết quả cô đặc hỗn dịch virút dại theo các tỷ lệ khác nhau 78 2.9. Kết quả kiểm tra chất gây sốt trong bán thành phẩm vắcxin dại 91 3.1. Kết quả nhân nuôi tế bào Vero của các loạt sản xuất thử nghiệm 95 3.2. Kết quả gây nhiễm virút dại của các loạt sản xuất thử nghiệm 96 3.3. Kết quả nuôi cấy virút dại và thu hoạch nước nổi loạt 0109 97 3.4. Kết quả nuôi cấy virút dại và thu hoạch nước nổi loạt 0209 98 3.5. Kết quả nuôi cấy virút dại và thu hoạch nước nổi loạt 0309 99 3.6. Kết quả tinh sạch hỗn dịch virút của các loạt sản xuất thử nghiệm 100 3.7. Kết quả bất hoạt virút của các loạt sản xuất thử nghiệm 101
  4. 3.8. Kết quả cô đặc hỗn dịch virút của các loạt sản xuất thử nghiệm 101 3.9. Kết quả tinh chế virút của các loạt sản xuất thử nghiệm 102 3.10. Kết quả pha bán thành phẩm cuối cùng của các loạt sản xuất thử nghiệm 105 3.11. Kết quả sản xuất vắcxin thành phẩm của các loạt sản xuất thử nghiệm 105 3.12. Kết quả kiểm tra chất lượng vắcxin thành phẩm tại cơ sở của các loạt sản xuất thử nghiệm vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero dạng đông khô (VERAPVAX) 106 3.13. Kết quả kiểm tra chất lượng vắcxin thành phẩm tại cơ sở của các loạt sản xuất thử nghiệm vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero dạng lỏng (VERALVAX) 107 4.1. Tiêu chuẩn cơ sở cho vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero (dạng lỏng hấp phụ nhôm) 141 4.2. Tiêu chuẩn cơ sở cho vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero 142 (dạng đông khô) 5.1. Kết quả kiểm tra an toàn đặc hiệu của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero 153 5.2. Kết quả kiểm tra tính an toàn chung của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero 153 5.3. Kết quả kiểm tra chất gây sốt của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero dạng lỏng (VERALVAX) 154 5.4. So sánh đáp ứng miễn dịch của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero do VABIOTECH sản xuất với vắcxin Verorab 155
  5. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình số Tên hình Trang 1.1. Cấu trúc hạt virút dại 6 1.2. Nguồn gốc của các chủng dại cố định được sử dụng trong sản xuất vắcxin trên nuôi cấy tế bào 18 2.1. Tóm tắt quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero 39 2.2. Hình ảnh tế bào Vero qua các đời cấy chuyển 41 2.3. Hình ảnh chuột liệt do chủng virút dại cố định PV 56 2.4. Hình ảnh nhiễm virút dại vào tế bào Vero dưới kính hiển vi huỳnh quang 60 2.5. Kết quả siêu ly tâm phân vùng bằng rotor zonal tinh chế virút dại 85 2.6. Hình ảnh điện di sản phẩm sau khi tinh chế virút dại theo phương pháp siêu ly tâm phân cùng bằng rotor zonal 86 2.7. Hình ảnh siêu ly tâm phân vùng bằng rotor góc cố định tinh chế virút dại 86 2.8. Hình ảnh điện di các phân đoạn sau khi tinh chế virút dại theo phương pháp siêu ly tâm phân cùng bằng rotor góc cố định 87 2.9. Phương pháp lai điểm xác định hàm lượng ADN tế bào tồn dư trong các sản phẩm của quá trình sản xuất vắcxin dại 88 3.1. Xác định hàm lượng ADN tế bào tồn dư trong các sản phẩm của loạt sản xuất vắcxin dại 0209 102 3.2. Xác định hàm lượng ADN tế bào tồn dư trong các sản phẩm của loạt sản xuất vắcxin dại 0109 và 0309 103 3.3. Hình ảnh chạy điện di trên gel SDS-PAGE các sản phẩm của loạt sản xuất vắcxin dại 0109 103 3.4. Hình ảnh chạy điện di trên gel SDS-PAGE các sản phẩm của loạt sản xuất vắcxin dại 0209 và 0309 104 5.1. Sơ đồ gây miễn dịch và lấy máu chuột 146
  6. MỤC LỤC NỘI DUNG Trang MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1-TỔNG QUAN 5 1.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH DẠI 5 1.1.1. Tác nhân gây bệnh và đặc điểm bệnh lý 5 1.1.2. Đáp ứng miễn dịch với virút dại 7 1.1.3. Tác động của bệnh dại đối với sức khỏe cộng đồng 8 1.1.4. Các khuyến cáo về tiêm phòng bệnh dại hiện nay 9 1.2. TỔNG QUAN VỀ VẮCXIN DẠI 13 1.2.1. Các vắcxin thế hệ thứ nhất 13 1.2.2. Các vắcxin thế hệ thứ hai 17 1.3. QUY TRÌNH SẢN XUẤT VÀ KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO 20 1.3.1. Quy trình sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào 20 1.3.2. Kiểm tra chất lƣợng vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào 24 1.4. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC, TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT VẮCXIN DẠI TẠI VIỆT NAM 31 CHƯƠNG 2-XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM 36 2.1. QUY TRÌNH NUÔI CẤY VÀ CHUẨN BỊ TẾ BÀO VERO 39 2.1.1. Các thử nghiệm kiểm tra nƣớc nổi nuôi cấy tế bào 43 2.1.2. Thử nghiệm kiểm tra các virút hấp phụ hồng cầu 47 2.1.3. Kết quả quy trình nuôi cấy tế bào Vero trên chai tế bào một lớp 48 2.2. QUY TRÌNH GÂY NHIỄM VIRÚT DẠI VÀO TẾ BÀO VERO 49 2.3. QUY TRÌNH NUÔI CẤY VIRÚT VÀ THU HOẠCH NƢỚC NỔI 53 2.3.1. Các phƣơng pháp xác định hiệu giá virút dại 54 2.3.2. Kết quả nuôi cấy virút dại theo các điều kiện nhân nuôi khác nhau 65
  7. 2.4. QUY TRÌNH TINH SẠCH HỖN DỊCH VIRÚT 74 2.5. QUY TRÌNH BẤT HOẠT VIRÚT 76 2.6. QUY TRÌNH CÔ ĐẶC HỖN DỊCH VIRÚT 77 2.7. QUY TRÌNH TINH CHẾ VIRÚT 79 2.7.1. Thử nghiệm phát hiện ADN tế bào Vero tồn dƣ trong các sản phẩm của quy trình tinh chế vắcxin dại bằng phƣơng pháp lai điểm 79 2.7.2. Các phƣơng pháp tinh chế virút dại 84 2.8. QUY TRÌNH PHA BÁN THÀNH PHẨM CUỐI CÙNG 89 2.9. QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮCXIN THÀNH PHẨM 92 CHƯƠNG 3-SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM VẮCXIN DẠI Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM 94 3.1. KẾT QUẢ NUÔI CẤY VÀ CHUẨN BỊ TẾ BÀO VERO 94 3.2. KẾT QUẢ GÂY NHIỄM VIRÚT DẠI VÀO TẾ BÀO VERO 95 3.3. KẾT QUẢ NUÔI CẤY VIRÚT VÀ THU HOẠCH NƢỚC NỔI 96 3.4. KẾT QUẢ TINH SẠCH HỖN DỊCH VIRÚT 100 3.5. KẾT QUẢ BẤT HOẠT VIRÚT 100 3.6. KẾT QUẢ CÔ ĐẶC HỖN DỊCH VIRÚT 101 3.7. KẾT QUẢ TINH CHẾ VIRÚT 101 3.8. KẾT QUẢ PHA BÁN THÀNH PHẨM CUỐI CÙNG 104 3.9. KẾT QUẢ SẢN XUẤT VẮCXIN THÀNH PHẨM 105 3.10. KẾT QUẢ KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG VẮCXIN THÀNH PHẨM TẠI CƠ SỞ 105 CHƯƠNG 4 - XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG VÀ TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO VẮCXIN VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO 109 4.1. CÁC PHƢƠNG PHÁP KIỂM TRA SINH HỌC 110 4.1.1. Phƣơng pháp kiểm tra vô khuẩn 110 4.1.2. Phƣơng pháp kiểm tra an toàn chung 113 4.1.3. Phƣơng pháp kiểm tra chất gây sốt 116 4.1.4. Phƣơng pháp kiểm tra an toàn đặc hiệu 119 4.1.5. Phƣơng pháp kiểm tra công hiệu 121
  8. 4.1.6. Thử nghiệm nhận dạng 125 4.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP KIỂM TRA HÓA LÝ 126 4.2.1. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein tổng số 126 4.2.2. Xác định pH trong vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero 130 4.2.3. Định lƣợng thimerosal trong vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào 131 Vero 4.2.4. Định lƣợng nhôm trong vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero dạng lỏng 134 4.2.5. Xác định độ ẩm tồn dƣ trong vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero dạng đông khô 136 4.2.6. Kiểm tra tính chất vật lý vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero 139 5.3. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO VERO 140 CHƯƠNG 5- ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ HIỆU LỰC VẮCXIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM 143 5.1. CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA VẮCXIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM 144 5.1.1. Các phƣơng pháp đánh giá tính an toàn của vắcxin trên động vật thí nghiệm 144 5.1.2. Các phƣơng pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch của vắcxin trên chuột 144 5.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ HIỆU LỰC CỦA VẮCXIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM 152 5.2.1. Tính an toàn của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào trên động vật thí nghiệm 152 5.2.2. Đáp ứng miễn dịch của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero trên động vật thí nghiệm 154 KẾT LUẬN 157 KIẾN NGHỊ 160 TÀI LIỆU THAM KHẢO 161 PHỤ LỤC
  9. MỞ ĐẦU Tại trên 100 nước và vùng lãnh thổ, dại là một bệnh gây dịch trên động vật. Bệnh dại ở chó là nguồn lây nhiễm chiếm đến 99% sang cho người và là nguy cơ đe dọa tính mạng trên 3,3 tỷ người, chủ yếu tại các nước châu Á và châu Phi. Cùng với chó nuôi tại nhà, nhiều giống thú ăn thịt và dơi cũng có thể làm lây truyền bệnh dại sang cho người. Khi đã có biểu hiện trên lâm sàng, phần lớn các ca bệnh dại đều tử vong do vậy việc tiêm phòng là biện pháp phòng bệnh cũng như điều trị bệnh dại cho hiệu quả cao nhất. Gần 10 triệu người được tiêm phòng sau khi phơi nhiễm hàng năm chủ yếu tại các nước châu Á. Tiêm phòng dại sau khi phơi nhiễm đã tránh được trên 300.000 ca tử vong hàng năm tại châu Á và châu Phi. Chi phí toàn cầu hàng năm cho phòng bệnh dại ước tính khoảng trên 1 tỷ đô la Mỹ. Chi phí này cũng như tỷ lệ đi tiêm phòng sau khi phơi nhiễm dự tính sẽ tăng lên một cách đáng kể khi tất cả các nước thay thế vắcxin sản xuất từ mô thần kinh bằng vắcxin trên nuôi cấy tế bào. Trên 100 năm trước đây, Louis Pasteur và cộng sự đã phát triển vắcxin dại thô đầu tiên để tiêm phòng sau khi phơi nhiễm dựa trên việc bất hoạt virút trên mô thần kinh. Từ đó trở đi một số loại vắcxin đã được phát triển và sử dụng trên thế giới. Các vắcxin thế hệ thứ nhất đều sử dụng mô động vật để có được hỗn dịch chứa virút. Các vắcxin này đã được sử dụng rộng rãi để phòng bệnh cho cả người và động vật. Tuy nhiên, các vắcxin này có rất nhiều nhược điểm như còn virút sống tồn dư, hay gặp các phản ứng não tủy sau khi tiêm vắcxin và hàm lượng kháng nguyên cho một liều tiêm thấp đòi hỏi phải có một liệu trình điều trị kéo dài với một số lượng lớn các mũi tiêm. Dù đã có những cải tiến bằng cách nhân nuôi virút trên não các động vật sơ sinh trước 1
  10. khi myelin phát triển, các vắcxin bất hoạt sản xuất trên não động vật chưa dứt sữa vẫn có thể gây ra các phản ứng thần kinh không mong muốn. Do vậy, các vắcxin thế hệ thứ hai sản xuất trên nuôi cấy tế bào đã ra đời nhằm khắc phục các nhược điểm của các dạng vắcxin cổ điển. Vắcxin này có tính an toàn và công hiệu cao do đó được các nước phát triển lựa chọn để tiêm phòng cho người trước và sau khi phơi nhiễm với virút. Đáp ứng miễn dịch và hiệu lực của vắcxin trên nuôi cấy tế bào đã được chứng minh trên động vật thí nghiệm và thực địa lâm sàng trên người. Ở cả phương pháp tiêm phòng trước và sau khi phơi nhiễm, các vắcxin này đều tạo được đáp ứng kháng thể ở trên 99% người được tiêm. Sử dụng các vắcxin thế hệ mới kết hợp với xử lý vết cắn đúng cách và tiêm phòng globulin miễn dịch kháng dại đã tạo ra hiệu quả phòng bệnh dại là 100% thậm chí cả với những trường hợp bị cắn có nguy cơ mắc bệnh cao. Do vậy việc nghiên cứu, phát triển, sản xuất và tiến tới đưa ra sử dụng rộng rãi vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào là cần thiết. Các quốc gia trên thế giới cần sớm có các chiến lược để sử dụng và triển khai rộng khắp loại vắcxin tiên tiến và cho hiệu quả cao này. Tại Việt Nam, trong những năm 1991-1995, bệnh dại là vấn đề y tế nghiêm trọng gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe, tính mạng và kinh tế của người dân. Bệnh xảy ra quanh năm, lưu hành ở hầu hết các tỉnh, thành phố trên cả nước. Nếu tính một người tiêm vắcxin dại phí tổn 300.000 đồng (gồm tiền thuốc, công lao động, tiền đi lại ) thì trong năm 1995 cả nước tốn gần 100 tỷ đồng. Thêm vào đó, mỗi năm có trên dưới 500 người thiệt mạng do bệnh dại. Trước tình hình nghiêm trọng của bệnh dại, năm 1996, Chính phủ đã ban hành chỉ thị về việc tăng cường phòng chống bệnh dại và Bộ Y tế đã thành lập ban chỉ đạo Phòng chống bệnh dại Quốc gia. Thành công của Chương trình là đến năm 2006 số ca tử vong do bệnh dại đã giảm 81% so với năm 1995. Tuy nhiên, trong năm 2007, số ca tử vong do bệnh dại đã lại tăng 2
  11. lên đến trên 100 trường hợp. Nguyên nhân có thể là do việc kiểm soát nguồn gây bệnh mà chủ yếu là chó - nguồn gây bệnh chính tại Việt Nam còn nhiều hạn chế. Bên cạnh đó, việc thay đổi chính sách sử dụng vắcxin, ngừng sử dụng vắcxin thế hệ cũ rẻ tiền thay thế bằng vắcxin nhập ngoại sản xuất trên nuôi cấy tế bào đắt tiền hơn, làm giảm khả năng được tiếp cận với vắcxin phòng bệnh của các bệnh nhân nghèo, đặc biệt tại các vùng nông thôn, vùng sâu, vùng xa. Ở Việt Nam, trước năm 1974, vắcxin phòng bệnh dại cho người chủ yếu là vắcxin sản xuất từ não cừu, dê (Fermi, Semple). Các vắcxin này có chứa một lượng virút chưa bất hoạt và tính sinh miễn dịch thấp nên phải tiêm nhiều mũi cùng với liều tiêm lớn. Từ năm 1974, Viện Vệ sinh dịch tễ học Hà Nội đã nghiên cứu sản xuất vắcxin dại trên não chuột ổ theo phương pháp của Fuenzalida-Palacios được chuyển giao kỹ thuật từ Viện Pasteur Paris (Pháp). Ưu điểm chính của vắcxin này là không chứa hoặc chứa rất ít myelin của não nên ít gây các tai biến thần kinh hơn. Hiệu giá virút thu hoạch từ não chuột ổ cao hơn do đó tính sinh miễn dịch tốt hơn do vậy làm giảm số liều tiêm. Việc sử dụng vắcxin dại trên não chuột ổ trong hơn 30 năm qua đã góp phần hạn chế nguy cơ tử vong do bệnh dại. Theo kết quả báo cáo từ các Trung tâm Y tế Dự phòng trên cả nước, trên 80% các trường hợp sau khi tiêm vắcxin Fuenzalida có các phản ứng không mong muốn, các phản ứng không mong muốn nghiêm trọng như viêm não tủy gây liệt vĩnh viễn và tử vong gặp với tỷ lệ 1-2 trường hợp/10.000 mũi tiêm. Do các phản ứng không mong muốn nghiêm trọng này, nên từ năm 2007, Bộ Y tế đã ra quyết định ngừng việc sử dụng vắcxin dại Fuenzalida trên toàn quốc thay thế bằng các vắcxin nhập ngoại sản xuất trên nuôi cấy tế bào trong đó chủ yếu là vắcxin Verorab của Hãng Aventis Pasteur. Tỷ lệ bệnh nhân được tiêm phòng bằng vắcxin trên nuôi cấy tế bào được nhập ngoại trước đây chỉ chiếm 15% số người được tiêm 3
  12. vắcxin dại và giá thành cho một liệu trình tiêm loại vắcxin này rất đắt (gần 800.000 đồng) do đó cơ hội để các bệnh nhân nghèo, vùng sâu, vùng xa được tiêm loại vắcxin này là rất hạn chế. Đứng trước yêu cầu cần sớm có được vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào được sản xuất trong nước nhằm làm giảm chi phí tiêm phòng cho bệnh nhân, để nhiều người có cơ hội được tiêm phòng vắcxin dại từ đó giảm tỷ lệ tử vong do bệnh dại, từ năm 2005 nhóm nghiên cứu của Công ty Vắcxin và sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) đã hướng đến việc nghiên cứu và phát triển vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero tại Việt Nam. Nhận được sự hợp tác và giúp đỡ của của Trung tâm Kiểm soát bệnh tật và Dự phòng Hoa kỳ (CDC) trong việc cung cấp các chủng giống sản xuất vắcxin dại, nhóm nghiên cứu đã tiến hành các nghiên cứu ở cấp cơ sở và lựa chọn ra được chủng virút PV (Pasteur Virus) và môi trường nuôi cấy không huyết thanh đạt các yêu cầu cho sản xuất vắcxin. Từ những thành công này, nhóm nghiên cứu bắt đầu tiến hành xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero ở quy mô phòng thí nghiệm. Với kinh nghiệm trên 30 năm sản xuất và kiểm định chất lượng vắcxin dại sản xuất trên não chuột ổ, cùng với những kinh nghiệm và thành công trong việc phát triển các vắcxin mới, VABIOTECH đưa ra các mục tiêu và nội dung trong Đề tài nghiên cứu này với mong muốn sớm có được sản phẩm vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào đạt tiêu chuẩn được sản xuất tại Việt Nam. Các mục tiêu nghiên cứu của Đề tài 1. Xây dựng được qui trình công nghệ ổn định sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero ở qui mô phòng thí nghiệm. 2. Sản xuất được các loạt vắcxin dại có chất lượng đạt yêu cầu của Tổ chức Y tế thế giới và tương đương với các vắcxin cùng loại của nước ngoài như vắcxin Verorab của Aventis Pasteur. 4
  13. CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH DẠI 1.1.1. Tác nhân gây bệnh và đặc điểm bệnh lý Virút dại thuộc nhóm Rhabdoviridae, họ Lyssavirus. Trong họ Lyssavirus, virút dại cổ điển (các chủng virút hoang dại ở chó, mèo và các chủng virút dại cố định) thuộc genotype đầu tiên trong 7 genotype của nhóm. Các virút thuộc các genotype còn lại thường gây bệnh ở động vật, tuy nhiên đã có những trường hợp tử vong do nhiễm các virút này ở người như nhiễm Lyssavirus dơi Úc (ABLV) hay nhiễm Lyssavirus dơi châu Âu (EBLV). Hạt virút dại có hình viên đạn với chiều dài trung bình là 180 nm và đường kính là 75nm. Mỗi hạt virút có chứa nucleocapsid xoắn bao quanh bởi lớp một vỏ lipid kép (Hình 1.1). Hệ gen là một ARN chuỗi đơn âm không phân đoạn có chiều dài 11,9 kb. Bề mặt ngoài bao phủ bởi các gai có chiều dài khoảng 10 nm gắn vào lớp lipid. Virút dại có 5 protein cấu trúc chính. Phức hợp ribonucleoprotein hạt nhân xoắn chứa ARN hệ gen liên kết với 3 protein bên ngoài là enzyme ARN polymerase phụ thuộc ARN (L) (190kd), nucleoprotein (N) (55 Kd) và phosphoprotein (NS) (38 KD). Các protein này cùng với ARN tạo thành phức hợp ARN hoạt động kiểm soát cả quá trình phiên mã và nhân lên của virút. Các protein cấu trúc khác là protein phức hợp (M) (26 kD) nằm ở mặt trong vỏ của virút tạo thành cấu trúc ống và glycoprotein (G) (67K) tạo thành các gai trên bề mặt virút [46], [52]. Bệnh dại bản chất là bệnh thú y và lây nhiễm sang người qua vết cắn và vết cào xuyên da của động vật nhiễm. Lây truyền cũng có thể xảy ra khi chất lây nhiễm thường là nước bọt xâm nhập trực tiếp vào niêm mạc hoặc tổn 5
  14. thương da mới của nạn nhân. Bệnh dại rất hiếm xảy ra do hít phải các chất tiết có chứa virút hoặc cấy ghép phủ tạng nhiễm bệnh. Hệ gen ARN Protein phức hợp cuộn xoắn Phức hợp Màng lipid Nucleoprotein ribonucleoprotein từ vật chủ hoặc nucleocapsid Vỏ bao ngoài Phosphoprotein Glycoprotein ARN polymerase Hình 1.1. Cấu trúc hạt virút dại Đối với các ca bệnh ở người, giai đoạn ủ bệnh thường từ vài tuần đến vài tháng nhưng cũng có thể thay đổi từ dưới 1 tuần đến trên 1 năm. Thời gian ủ bệnh phụ thuộc vào nhiều yếu tố như lượng virút lây nhiễm, mức độ tổn thương và vị trí gần với thần kinh trung ương không của nơi virút xâm nhập [13], [55]. Virút lây nhiễm di chuyển vào hệ thống thần kinh trung ương qua các dây thần kinh ngoại vi, khi đến não bộ vi rút nhân lên và phát tán ngược trở ra hệ thống thần kinh và nhiều phủ tạng khác nhau như tuyến nước bọt. Virút dại lan truyền đến toàn bộ cơ thể thì bắt đầu các triệu chứng khởi phát tuy nhiên lúc đó cơ thể không có được đáp ứng miễn dịch với vi rút [52]. Hiện chưa có thử nghiệm nào được sử dụng để chẩn đoán bệnh dại ở người trước khi bệnh khởi phát trên lâm sàng. Do vậy, chẩn đoán bệnh sẽ chỉ dựa trên tiền sử bệnh, các biểu hiện và triệu chứng có liên quan đến tình hình 6
  15. dịch tễ của bệnh trên động vật. Biểu hiện đầu tiên của bệnh dại thường là sốt nhẹ, đau và dị cảm tại vết thương. Khi virút lan truyền vào hệ thần kinh trung ương, viêm não tiến triển sẽ xuất hiện có các đặc trưng là sợ nước hoặc sợ gió, tăng động và mất ngủ, co giật toàn thân, sau đó một vài ngày sẽ ngừng thở ngừng tim. Bệnh dại gây liệt có thể xảy ra ở 30% ca bệnh ở người, tiến triển ít trầm trọng hơn tuy nhiên kết cục cuối cùng cũng là tử vong. Dạng bệnh dại này thường bị chẩn đoán nhầm là bệnh lý khác [55]. Các chất kháng virút, interferon và liều lượng cao huyết thanh kháng dại được sử dụng trong điều trị các ca bệnh ở người nhưng thường không tránh được nguy cơ tử vong. Cho dù hiện đã có 1 trường hợp bệnh dại lây truyền từ dơi được cứu sống sau khi dùng các thuốc gây ức chế thần kinh và thuốc kháng virút nhưng liệu trình điều trị tích cực này lại gặp thất bại khi áp dụng trên một số bệnh nhân khác cũng bị nhiễm dại do dơi [52]. 1.1.2. Đáp ứng miễn dịch với vi rút dại Sau khi nhiễm, virút dại chủ yếu xâm nhập vào hệ thần kinh do dó kháng nguyên thường bị tách biệt ra khỏi hệ thống miễn dịch. Đáp ứng kháng thể thường không được phát hiện ở người nhiễm trước 2 tuần đầu tiên của bệnh. Các vắcxin trên nuôi cấy tế bào hiện nay cho kháng thể trung hòa virút với protein G cao và sớm [46]. Với vắcxin dại, không thể tiến hành các thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên có nhóm chứng và theo dõi dọc ở các nhóm so sánh không điều trị. Do vậy, thông tin về hiệu quả vắcxin sẽ chủ yếu dựa trên các kết quả thực địa tiêm phòng sau phơi nhiễm ở người đã bị phơi nhiễm với chó có chẩn đoán chắc chắn mắc dại trong phòng thí nghiệm. Đánh giá gián tiếp hiệu quả vắcxin có thể được tiến hành qua các nghiên cứu về tính sinh miễn dịch so sánh giữa hiệu giá kháng thể trung hòa virút sau khi tiêm vắcxin thử nghiệm 7
  16. với kháng thể có được khi tiêm vắcxin đối chứng đã biết hiệu quả bảo vệ. Thêm vào đó, mô hình động vật sẽ được sử dụng để chứng minh lợi ích của tiêm phòng vắcxin. Tuy hiệu giá kháng thể trung hòa virút bảo vệ ở người chưa được thiết lập nhưng nồng độ tối thiểu là 0,5 IU/ml được coi là tương đương với khả năng bảo vệ. Ở người khỏe mạnh sau khi tiêm vắcxin, nồng độ kháng thể có thể đạt được vào ngày thứ 14 của liệu trình tiêm sau phơi nhiễm không phụ thuộc vào độ tuổi [46], [55]. 1.1.3. Tác động của bệnh dại đối với sức khỏe cộng đồng Tại trên 100 nước và vùng lãnh thổ, dại là một bệnh gây dịch trên động vật. Bệnh dại ở chó là nguồn lây nhiễm chiếm đến 99% sang cho người và là nguy cơ đe dọa tính mạng trên 3,3 tỷ người, chủ yếu tại các nước châu Á và châu Phi. Cùng với chó nuôi tại nhà, nhiều giống thú ăn thịt và dơi cũng có thể làm lây truyền bệnh dại sang cho người [55]. Khi đã có biểu hiện trên lâm sàng, phần lớn các ca bệnh dại đều tử vong. Tuy nhiên, các ca tử vong do bệnh dại còn ít được báo cáo tại một số nước có bệnh dại lưu hành đặc biệt ở nhóm tuổi nhỏ. Số ca tử vong hàng năm ước tính là 55.000 có thể là thấp hơn so với con số thực. Châu Á và châu Phi chiếm phần lớn các ca tử vong do bệnh dại. Tính riêng tại Ấn Độ, ước tính có khoảng 20.000 ca chết mỗi năm với tỷ lệ là 2 /100.000 dân; tại châu Phi con số này cũng tương đương là 24.000 ca (hoặc 4 ca /100.000 dân). Cho dù tất cả các lứa tuổi đều có thể mắc bệnh nhưng trẻ dưới 15 tuổi là đối tượng thường mắc nhất với 30-50% số trường hợp được tiêm phòng sau khi bị cắn là trẻ từ 5-14 tuổi và phần lớn là con trai [55]. Khoảng 98% trường hợp bệnh dại ở người xảy ra tại những vùng nuôi nhiều chó mà đa phần được thả rông. Bệnh dại ở người là một bệnh hiếm gặp tại các nước công nghiệp phát triển và ở phần lớn các nước Mỹ La tinh nơi 8
  17. bệnh dại trên chó đã gần được loại trừ do giảm thiểu số lượng chó thả rông và tiêm phòng cho chó nuôi tại nhà. Tại các nước như Thái Lan, việc triển khai tiêm phòng rộng rãi cho chó và tăng cường tiêm phòng sau khi bị cắn đã làm giảm đáng kể số ca chết do bệnh dại ở người. Gần 10 triệu người được tiêm phòng sau khi bị cắn hàng năm chủ yếu là tại Trung Quốc và Ấn Độ. Tiêm phòng dại sau khi bị cắn đã tránh được 330.304 ca tử vong hàng năm tại châu Á và châu Phi. Chi phí toàn cầu hàng năm cho phòng bệnh dại ước tính khoảng trên 1 tỷ đô la Mỹ. Chi phí này cũng như tỷ lệ đi tiêm phòng sau khi bị cắn dự tính sẽ tăng lên một cách đáng kể khi tất cả các nước thay thế vắcxin sản xuất từ mô thần kinh bằng vắcxin trên nuôi cấy tế bào hiện đại, an toàn và có hiệu lực cao [55]. 1.1.4. Các khuyến cáo về tiêm phòng bệnh dại hiện nay 1.1.4.1. Tiêm phòng trước khi phơi nhiễm Tiêm phòng trước phơi nhiễm được chỉ định cho những người có nguy cơ phơi nhiễm cao với virút dại. Những đối tượng này bao gồm nhân viên phòng thí nghiệm, nhân viên thú y, người nuôi giữ động vật, nhân viên bảo vệ động vật hoang dại thường xuyên phải tiếp xúc với những động vật có khả năng lây nhiễm cao cũng như các khách du lịch đến các khu vực có nguy cơ mắc bệnh dại cao. Tuy nhiên, theo các nghiên cứu về độ tuổi mắc bệnh, nguy cơ nhiễm bệnh cao nhất là trẻ em sống trong vùng động vật nhiễm bệnh dại tại các nước đang phát triển [13], [55]. Chỉ định tiêm bắp Tiêm phòng vắcxin dại trước phơi nhiễm cần liều tiêm bắp 1 ml hoặc 0,5 ml tùy thuộc vào loại vắcxin, tiêm theo lịch 0, 7, 28 ngày (ngày thứ 28 được lựa chọn nhưng có thể tiêm sớm hơn vào ngày 21 nếu có giới hạn về 9
  18. mặt thời gian). Chỉ định tiêm trong da Tiêm trong da 0,1 ml vào ngày 0, 7, 28 (ngày thứ 28 được lựa chọn nhưng có thể tiêm sớm hơn vào ngày 21 nếu có giới hạn về mặt thời gian) là một liệu pháp được lựa chọn thay thể đường tiêm bắp. Tuy nhiên, tiêm trong da đòi hỏi phải thực hành đúng kỹ thuật, cán bộ tiêm cần được đào tạo và đượcgiám sát tốt. Tiêm nhắc lại Tiêm nhắc lại định kỳ chỉ dành cho các đối tượng thường xuyên và liên tục tiếp xúc với virút dại. Trong các trường hợp này, liều nhắc cần được tiêm với khoảng cách phù hợp được dự tính tùy theo kết quả xét nghiệm kháng thể. Các nhân viên phòng thí nghiệm có nguy cơ lây nhiễm vỉ rút dại cao cần được xét nghiệm 6 tháng một lần. Hiệu giá kháng thể trung hòa virút ít nhất là 0,5 IU/ml được cho là có khả năng bảo vệ. Ở những nơi không có điều kiện xét nghiệm huyết thanh học, tiêm phòng nhắc lại được tiến hành 5 năm một lần. 1.1.4.2. Tiêm phòng sau khi phơi nhiễm Chỉ định tiêm phòng sau phơi nhiễm kết hợp hoặc không kết hợp với huyết thanh kháng dại tùy thuộc vào mức độ tiếp xúc với động vật nghi dại: Độ I - Sờ hoặc cho động vật ăn, liếm trên bề mặt da (không tiếp xúc) Độ II - Ngậm, cắn trên da không tổn thương, các vết sây xướt hoặc trợt nhẹ không gây chảy máu. Độ III - Một hoặc nhiều vết cắn hoặc vết cào trên da, liếm trên da tổn thương, lây nhiễm niêm mạc với nước bọt, tiếp xúc với dơi. 10
  19. Đối với độ I không cần tiêm phòng, độ II tiêm vắcxin ngay lập tức, độ II tiêm vắcxin kết hợp với huyết thanh. Đối với độ II và độ III, rửa và sát xà phòng (trong khoảng 15 phút) toàn bộ vết thương và vết cắn ngay lập tức hoặc càng sớm càng tốt. Không tiếp tục tiêm phòng sau phơi nhiễm nữa nếu động vật nghi dại đã được khằng định bằng các xét nghiệm là không nhiễm dại hoặc chó hoặc mèo nuôi vẫn khỏe mạnh sau 10 ngày theo dõi. Các yếu tố để quyết định xem có bắt đầu tiêm phòng sau phơi nhiễm hay không là mức độ nghi ngờ động vật mắc dại, mức độ tiếp xúc (độ I-III), đặc điểm lâm sàng của động vật cũng như khả năng xét nghiệm của phòng thí nghiệm. Trong phần lớn các trường hợp tại các nước đang phát triển, tình trạng tiêm phòng vắcxin của động vật cũng là một trong những yếu tố cần được quan tâm đến [55]. Chỉ định tiêm bắp Lịch tiêm phòng sau phơi nhiễm với liều tiêm bắp là 1 hoặc 0,5 ml tùy thuộc vào nhà sản xuất. Liệu trình tiêm khuyến cáo bao gồm 4 hoặc 5 liều tiêm. - Liệu trình tiêm 5 liều là tiêm bắp 1 liều vào các ngày 0, 3, 7, 14, 28. - Liệu trình tiêm 4 liều là tiêm bắp 2 liều vào ngày 0 tiếp theo tiêm 1 liều vào ngày 7 và 21 Chỉ định tiêm trong da Có thể tiêm theo liệu trình 2 vị trí hoặc 8 vị trí tùy thuộc theo khuyến cáo của nhà sản xuất 11
  20. - Liệu trình tiêm trong da 8 vị trí là vào ngày 0, tiêm 8 vị trí (1 mũi vào mỗi bên cánh tay, 1 mũi vào mỗi bên đùi, 1 mũi vào mỗi bên vùng thượng đòn và 1 mũi vào mỗi bên vùng bụng dưới); vào ngày thứ 7, tiêm 1 mũi vào mỗi bên cánh tay và mỗi bên đùi và vào ngày 30 và 90, tiêm 1 mũi vào một bên cánh tay. Một liều tiêm vào ngày 90 có thể thay thế bằng 2 liều tiêm ngày thứ 30. - Liệu trình tiêm trong da 2 vị trí là tiêm 1 mũi 0,1 ml tại 2 vị trí vào ngày 0, 3, 7 và 28. Đối với những đối tượng đã tiêm phòng đầy đủ trước phơi nhiễm hoặc đã từng tiêm phòng sau phơi nhiễm với vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào hoặc hiện có hiệu giá kháng thể trung hòa virút ít nhất là 0,5 IU/ml, chỉ cần tiêm 2 liều tiêm bắp hoặc dưới da vào ngày 0 và 3 là đủ. 1.1.4.3. Tiêm kháng huyết thanh phòng dại Huyết thanh phòng dại được chỉ định cho phơi nhiễm độ III và phơi nhiễm độ II ở người suy giảm miễn dịch. Do mức độ thải trừ tương đối chậm, globulin miễn dịch kháng dại ở người (HRIG) thường được lựa chọn đặc biệt trong trường hợp bị phơi nhiễm nghiêm trọng và đa vị trí. Tuy nhiên, dạng HRIG rất hiếm, chỉ đủ sử dụng tại các nước công nghiệp phát triển. Globulin miễn dịch ngựa tinh chế (ERIG) hoặc sản phẩm F(ab’) của ERIG cũng có thể được sử dụng. Phần lớn các chế phẩm ERIG mới đều tốt, có độ tinh khiết cao, an toàn và rẻ hơn so với HRIG. Tuy nhiên, do có nguồn gốc khác loài nên khi tiêm ERIG sẽ có nguy cơ gặp phải các phản ứng quá mẫn. Huyết thanh kháng dại không được tiêm muộn quá 7 ngày sau khi bắt đầu tiêm phòng sau phơi nhiễm. Liều lượng của HRIG là 20IU/kg cân nặng còn đối với ERIG và sản phẩn F(ab’) là 40IU/kg cân nặng. Toàn bộ các sản 12
  21. phẩm huyết thanh kháng dại cần được tiêm vào trong hoặc xung quanh vết thương. Phần còn lại của huyết thanh phải được tiêm bắp vào vị trí xa chỗ tiêm vắcxin [55]. 1.2. TỔNG QUAN VỀ VẮC XIN DẠI Trên 100 năm trước đây, Louis Pasteur và cộng sự đã phát triển vắcxin dại thô đầu tiên để tiêm phòng sau khi bị cắn dựa trên việc bất hoạt virút trên mô thần kinh. Từ đây trở đi một số loại vắcxin đã được phát triển và sử dụng trên thế giới. 1.2.1. Các vắcxin thế hệ thứ nhất Các vắcxin thế hệ thứ nhất đều sử dụng mô động vật để có được hỗn dịch chứa virút. Các vắcxin này đều đã được sử dụng rộng rãi cho cả người và động vật. Các loại vắcxin dại chủ yếu thuộc thế hệ thứ nhất được sử dụng cho người và thú y được trình bày trong Bảng 1.1 [27], [36]. 13
  22. Bảng 1.1. Các loại vắc xin dại thế hệ thứ nhất đƣợc sử dụng cho ngƣời và thú y Chủng Loại Phƣơng pháp Sử dụng Dạng Mô đƣợc sử dụng virút vắcxin bất hoạt cho ngƣời vắcxin Mô thần kinh: Cừu, dê Pasteur Bất hoạt Phenol (1 ngày) Có Dung dịch Mô thần kinh: Thỏ, cừu, Pasteur Bất hoạt Phenol, 300C Có Dung dịch dê Mô thần kinh: Cừu Pasteur Bất hoạt Ether-Phenol Có Dung dịch Mô thần kinh: Cừu Pasteur Bất hoạt Phenol (14 ngày) Có Đông khô Mô thần kinh: Cừu PV11 Bất hoạt -propiolactone Có Đông khô Não chuột nhắt chưa CVS, 51, Bất hoạt Tia cực tím Có Dung dịch dứt sữa 91 Não thỏ chưa dứt sữa PV Bất hoạt Tia cực tím Có Đông khô Não chuột chưa dứt sữa PV Bất hoạt Phenol (14 ngày) Có Đông khô Phôi vịt PM Bất hoạt -propiolactone Có Đông khô Phôi gà Flury Giảm độc - Không (chỉ Đông khô LEP lực sử dụng cho chó) Phôi gà Kelev Giảm độc - Không (chỉ Đông khô lực sử dụng cho chó) Phôi gà Flury Giảm độc - Không (sử Đông khô HEP lực dụng cho gia súc, mèo) Dựa trên các loại mô được sử dụng để sản xuất khác nhau, các vắcxin thế hệ thứ nhất có thể được xếp loại theo: Vắcxin sản xuất từ mô thần kinh động vật trưởng thành Các vắcxin này có rất nhiều các nhược điểm như: - Còn virút sống tồn dư: các vắcxin như vắcxin Fermi thường có chứa virút sống do chưa được bất hoạt hoàn toàn bởi phenol nên được coi như là 14
  23. vắcxin hỗn hợp có cả virút sống tồn dư và virút đã bất hoạt, do vậy vắcxin này nguy hiểm khi sử dụng. - Phản ứng não tủy sau khi tiêm vắcxin: một số vắcxin thuộc nhóm này như vắcxin Semple và vắcxin Hempt tuy đã được bất hoạt hoàn toàn và đáp ứng được yêu cầu về mặt công hiệu nhưng những phản ứng não tủy nghiêm trọng do tiêm vắcxin vẫn xảy ra trong hoặc sau khi tiêm phòng. Phản ứng do yếu tố gây phản ứng trong não (một protein cơ bản liên quan đến myelin) tăng cao khi sử dụng các mô thần kinh động vật trưởng thành. Những phản ứng này là các tai biến liệt thần kinh từ liệt nhẹ thoáng qua đến các thương tổn thần kinh vĩnh viễn và thậm chí là tử vong. - Hàm lượng kháng nguyên cho một liều tiêm thấp: đặc tính này đòi hỏi phải có một liệu trình điều trị kéo dài với một số lượng lớn các mũi tiêm. Các vắcxin này thường được đóng dưới dạng dung dịch nên có tính ổn định thấp chỉ trong vòng gần 6 tháng [27]. Vắcxin sản xuất trên trứng có phôi Thích ứng các chủng vắcxin dại trên trứng có phôi (chủng Pitman Moore) đã phát triển được các vắcxin dại sử dụng cho người an toàn hơn, giảm thiểu các phản ứng não tủy sau tiêm vắcxin. Tỷ lệ có các phản ứng thần kinh thấp hơn (dưới 3/100.000 mũi tiêm) ở các vắcxin dùng cho người được sản xuất trên phôi vịt so với các vắcxin được sản xuất trên mô thần kinh. Tuy nhiên các phản ứng tại chỗ lại rất hay gặp như có đến 70% gặp ở các liệu trình tiêm vắcxin dự phòng và 100% ở các liệu trình tiêm điều trị với 14 liều tiêm. Tính sinh miễn dịch của loại vắcxin này cần được xem xét thêm do trong một số trường hợp lượng kháng thể đạt được rất thấp. Các chủng virút cố định Flury và Kelev đã thích ứng trên phôi gà được cấy chuyển nhiều đời (180 đối với Flury và 70 đối với Kelev) tạo ra các chủng virút giảm độc lực. 15
  24. Các vắcxin sản xuất với các chủng giảm độc lực trên phôi gà đã được sử dụng cho chó, mèo và bò. Trứng có phôi sử dụng trong sản xuất vắcxin đòi hỏi một chất lượng rất cao, phải đảm bảo loại trừ được tất cả virút ngoại lai (bệnh đốm trắng ở gia cầm) và vi khuẩn (Salmonella) [27], [36]. Vắcxin sản xuất từ não động vật chưa dứt sữa Yếu tố gây phản ứng trong não là nguyên nhân của các tai biến thần kinh sau tiêm vắcxin có trong mô thần kinh động vật trưởng thành nhưng có không đáng kể hoặc không có ở trong các mô thần kinh của một số động vật chưa dứt sữa. Thêm vào đó, một lượng lớn hơn virút có được khi nhân nuôi trên các mô thần kinh của động vật sơ sinh, do đó vắcxin dại đã được phát triển trên những động vật này. Vắcxin đầu tiên thuộc loại này được phát triển bởi Fuenzalida và Palacios trên não chuột ổ với việc sử dụng 3 chủng virút dại cố định (CVS, 51 và 91). Dù đã có những cải tiến bằng cách nhân nuôi virút trên não các động vật sơ sinh trước khi myelin phát triển, các vắcxin bất hoạt sản xuất trên não động vật chưa dứt sữa vẫn có thể có các phản ứng thần kinh không mong muốn. Khoảng 0,3 - 0,8 trên 1.000 cá thể được tiêm vắcxin có biểu hiện viêm não tủy nặng do trong vắcxin vẫn tồn dư các protein thần kinh. Thêm vào đó, các vắcxin trên mô thần kinh có hiệu lực thấp hơn so với vắcxin trên nuôi cấy tế bào nên đòi hỏi một liệu trình tiêm phòng dài hơn. Trong những năm gần đây, Ấn Độ và Nepal đã dần thành công trong việc ngừng sản xuất và sử dụng vắcxin trên mô thần kinh. Tuy nhiên, với giá thành rẻ và điều kiện kinh tế còn khó khăn, vắcxin trên mô thần kinh hiện vẫn được sử dụng tại một số nước chủ yếu là tại vùng Đông Nam châu Á [36], [55]. 16
  25. 1.2.2. Các vắcxin thế hệ thứ hai Đây là các vắcxin được sản xuất trên nuôi cấy tế bào. Vắcxin chứa virút bất hoạt sau khi nhân nuôi trên các dòng tế bào như tế bào lưỡng bội người, tế bào thận khỉ phôi thai, tế bào thận chuột đất vàng tiên phát, tế bào Vero, tế bào phôi gà Các vắcxin này sử dụng tiêm phòng trước và sau phơi nhiễm [22], [34]. Vắcxin sản xuất trên tế bào lưỡng bội người là vắcxin được đưa vào sử dụng đầu tiên vào năm 1967. Vắcxin này có tính an toàn và công hiệu cao do đó được các nước phát triển lựa chọn để tiêm phòng cho người trước và sau khi phơi nhiễm với virút [11]. Với cố gắng tìm ra các vắcxin có giá thành thấp hơn và nhưng đặc tính lại tương đương với vắcxin sản xuất trên tế bào lưỡng bội người, trong những năm gần đây vắcxin tinh khiết trên tế bào phôi gà và vắcxin tinh khiết trên tế bào Vero đã được phát triển [30]. Các vắcxin trên nuôi cấy tế bào đều sử dụng các virút cố định thuộc genotype 1 [36]. Nguồn gốc của các chủng virút dại cố định chính được sử dụng để sản xuất vắcxin trên nuôi cấy tế bào được trình bày trong Hình 1.2. Đáp ứng miễn dịch và hiệu quả cả vắcxin trên nuôi cấy tế bào được chứng minh qua các nghiên cứu trên động vật thí nghiệm và các đánh giá lâm sàng trên người. Đối với cả phòng trước và sau khi phơi nhiễm, vắcxin cho đáp ứng kháng thể ở trên 99% người được tiêm. Sử dụng đúng thời điểm vắcxin mới kết hợp với việc xử trí vết thương đúng cách và tiêm huyết thanh kháng dại cho hiệu quả phòng dại gần 100% thậm chí đối với cả các trường hợp phơi nhiễm nguy cơ cao. Tuy nhiên, việc tiêm phòng muộn hoặc không tiêm phòng đủ mũi đặc biệt với các tổn thương ở đầu, cổ, tay hoặc đa vết cắn có thể vẫn bị tử vong do mắc bệnh dại [55]. Các vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào cũng được cho là các vắcxin có độ 17
  26. an toàn cao. Sau khi tiêm bắp vắcxin trên nuôi cấy tế bào lưỡng bội người, các phản ứng tại chỗ nhẹ và tự khỏi như đau, sưng tấy, đỏ tại chỗ tiêm xảy ra ở 21-74% số người được tiêm. Các phản ứng toàn thân nhẹ như sốt, đau đầu, chóng mặt, rối loạn tiêu hóa gặp ở 5-40% trường hợp. Phản ứng quá mẫn xảy ra ở 6% người được tiêm liều nhắc lại và rất ít gặp ở tiêm liều ban đầu [43]. Khi thêm bước tinh chế, các phản ứng toàn thân đã hiếm gặp hơn. Với vắcxin trên nuôi cấy tế bào Vero và tế bào phôi gà, tỷ lệ gặp các phản ứng tại chỗ và toàn thân nhẹ tương đương với vắcxin sử dụng tế bào lưỡng bội người, tuy nhiên không gặp các phản ứng quá mẫn hệ thống [34], [55]. Pháp (Paris) Trung Quốc Mỹ (Alabama) Mỹ (Georgia) 1882 1931 1935 1939 Dại ở bò Dại ở chó Dại ở chó Dại ở người > 1500 lần cấy chuyển Não thỏ Não thỏ Não chuột Não gà Argentina Mỹ - K.Habel Tế bào thận 1940 chuột đất vàng Pháp (Paris) 1965 Não thỏ Não thỏ Phôi gà Phôi gà Nuôi cấy Nuôi cấy Nuôi cấy tế bào Nuôi cấy tế tế bào Vero tế bào Vero thận chuột đất vàng bào phôi gà SAD PV PM Beijing-31 Vnukovo-32 Flury HEP/LEP Hình 1.2. Nguồn gốc của các chủng dại cố định đƣợc sử dụng để sản xuất vắcxin trên nuôi cấy tế bào 18
  27. Kinh nghiệm 20 năm (1985-2005) sử dụng một trong các vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào, vắcxin Verorab, đã cho thấy vắcxin an toàn và cho hiệu quả phòng bệnh dại cao [45]. Trên 40 triệu liều vắcxin Verorab đã được tiêm tại trên 100 quốc gia. Không có phản ứng không mong muốn nghiêm trọng nào do vắcxin Verorab được báo cáo trong thử nghiệm lâm sàng trên 3937 đối tượng và vắcxin này được cho là dung nạp tốt hơn so với vắcxin sản xuất trên tế bào lưỡng bội người. Tiêm phòng sau phơi nhiễm đã khẳng định khả năng sinh miễn dịch trên 1437 đối tượng bằng tất cả các đường tiêm với đáp ứng sớm sau liều nhắc lại; Verorab cho đáp ứng nhắc lại có hiệu quả ở các đối tượng đã được tiêm trước với vắcxin sản xuất trên tế bào lưỡng bộ người. Không như dạng vắcxin sử dụng tế bào lưỡng bội người, Verorab không gây ra các phản ứng quá mẫn huyết thanh ở người được tiêm nhắc lại. 2183 đối tượng tại nhiều quốc gia ở châu Âu và châu Á trong đó có 874 đối tượng có nguy cơ cao đã được tiêm phòng sau phơi nhiễm và cho hiệu quả bảo vệ. Verorab đã được tiêm phòng sau phơi nhiễm có hiệu quả và an toàn cho 251 phụ nữ có thai không làm tăng các dị tật bẩm sinh hoặc sảy thai tự nhiên. Đối với trẻ em, tính an toàn và hiệu quả cũng được thấy trên 759 trẻ (từ 0-15 tuổi) [45]. Liệu trình sử dụng Verorab tiêm trong da sau phơi nhiễm cho hiệu quả tốt và giảm giá thành tại các nước đang phát triển. Từ các kết quả nghiên cứu lâm sàng sử dụng Verorab tiêm bắp và tiêm trong da trước và sau phơi nhiễm cho thấy vắcxin có hiệu quả bảo vệ tốt và an toàn trên người [3]. Với việc cho ra đời và sử dụng vắcxin trên nuôi cấy tế bào đã làm giảm đáng kể số các trường hợp tử vong ở người trên toàn thế giới mà phần lớn là tại các nước mà bệnh dại trên chó vẫn còn lưu hành phổ biến. Một ví dụ điển hình nhất là tại Thái Lan, việc triển khai tiêm phòng vắcxin trên nuôi cấy tế bào cùng với việc giảm liều lượng tiêm bằng liệu trình tiêm trong da đã làm cho tỷ lệ mắc dại mới ở người giảm đến 80% trong vòng 15 năm. Các kết quả 19
  28. tương tự cũng được báo cáo tại nhiều nước khác khi vắcxin trên mô thần kinh được thay thế bằng vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào. Do vậy việc nghiên cứu, phát triển, sản xuất và tiến tới đưa ra sử dụng rộng rãi vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào là cần thiết, các nước cần sớm có các chiến lược để sử dụng và triển khai rộng khắp để tiêm phòng loại vắcxin tiên tiến và có hiệu quả cao này [22], [55]. 1.3. QUY TRÌNH SẢN XUẤT VÀ KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG VẮC XIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO 1.3.1. Quy trình sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Hiện nay, các vắcxin trên nuôi cấy tế bào được chia thành 3 nhóm chính tùy thuộc vào hệ thống tế bào được sử dụng trong sản xuất [36]: - Nhóm 1: Nhóm này gồm các vắcxin sử dụng các dòng tế bào động vật có vú nguyên phát như thận chuột đất vàng, thận chó, thận bê bào thai hoặc các nuôi cấy tế bào của gia cầm như phôi gà, phôi chim cút dựa theo phương pháp của Kissling. - Nhóm 2: Nhóm này gồm các vắcxin được sản xuất trên các dòng tế bào lưỡng bội chủ yếu có nguồn gốc từ người (W138, MRC5) và một số có nguồn gốc động vật như bào thai khỉ Rhesus. - Nhóm 3: Nhóm này gồm các vắcxin được sản xuất trên các dòng tế bào thường trực như tế bào Vero. Các loại tế bào, các quy trình được sử dụng trong sản xuất và các phác đồ tiêm phòng đối với từng loại vắcxin được trình bày trong Bảng 1.2. 20
  29. Hình 1.2. Các loại vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào và quy trình sản xuất Tiêm phòng Tiêm Loại Chủng Phƣơng pháp Phƣơng pháp Tá dƣợc trƣớc khi bị phòng sau tế bào virút cô đặc bất hoạt cắn khi bị cắn WI 38 PM 1503 Siêu ly tâm TNBP/tween-80 - 0, 7, 21, 28 0, 3, 7, 14, 30, 90 MRC-5 PM 1503 Siêu ly tâm -propiolactone - 0, 28 0, 3, 7, 14, 30, 90 MRC-5 PM 1503 Ly tâm phân -propiolactone - 0, 30, 60 0, 3, 7, 14, vùng 30, 90 MRC-5 SAD-60 Siêu ly tâm -propiolactone - Thử nghiệm Thử nghiệm VERO PM 1503 Siêu ly tâm -  -propiolactone - 0, 7, 28 0, 3, 7, 14, Ly tâm phân 30, 90 vùng HKC Vnukovo- Ly tâm Tia cực tím - 0, 3, 7, 28 0, 3, 7, 14, 32 30, 90 HKC Beijing-31 Ly tâm Formol/Phenol Al(OH)3 0, 3, 7. 28 0, 3, 7, 14, 30, 90 DKC PM 1503 Siêu ly tâm – -propiolactone AlPO4 0, 28, 180 0, 3, 5, 7, Sepharose 6B 14, 30, 90 FBKC PV11/RV Siêu ly tâm -  -propiolactone - 0, 21 Thử nghiệm 31 Ly tâm phân vùng PCEC Flury HEP Siêu ly tâm -  -propiolactone - 0, 28, 180 0, 2, 4, 6, 8, Ly tâm hoặc tia cực tím 14, 28 PCEC Flury LEP Siêu ly tâm -  -propiolactone - 0, 28, 180 0, 2, 4, 6, 8, Ly tâm 14, 28 HKC: Tế bào thận chuột đất vàng nguyên phát; DKC: Tế bào thận chó nguyên phát; FBKC: Tế bào thận bào thai bê nguyên phát; PCEC: Tế bào phôi gà nguyên phát; TNBP: Tri(n)-butyl-phosphate. Các bước chính của quy trình sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào bao gồm: - Nhân nuôi tế bào: Chai nuôi cấy tế bào một lớp hoặc hệ thống lăn chai (roller bottle) là một trong những giải pháp được sử dụng để nhân nuôi tế bào. Để tăng hiệu suất và mở rộng quy mô sản xuất, các chai khuấy 21
  30. (spinner flask) hoặc hệ thống nuôi cấy sinh khối (bioreactor) được sử dụng. Các tiểu giá thể (microcarrier) trong hệ thống nuôi cấy sinh khối là một giải pháp tiên tiến cho phép tăng diện tích bề mặt bám dính của tế bào từ đó làm tăng số lượng tế bào lên nhiều lần. Đánh giá chính xác các chỉ số động học thông qua lượng các chất dinh dưỡng được tiêu thụ và lượng các chất gây độc sản sinh ra do quá trình chuyển hóa sẽ cho phép tìm ra các giải pháp làm tăng số lượng tế bào lên đến mức cần thiết để tạo ra một lượng kháng nguyên virút tối ưu [47], [48]. - Gây nhiễm và nhân nuôi virút: Gây nhiễm virút vào tế bào được tiến hành đối với hỗn dịch tế bào hoặc trên tế bào đã được nuôi cấy một lớp. Để đạt được hiệu suất virút cao nhất cần lưu ý một số yếu tố liên quan đến việc kết hợp giữa tế bào và virút như nhiệt độ nuôi cấy, liều lượng virút gây nhiễm, thời gian và số lần thu hoạch. Mối tương quan giữa mật độ tế bào và nồng độ kháng nguyên đạt được sau khi gây nhiễm là một vấn đề rất phức tạp. Về mặt lý thuyết, khi điều kiện gây nhiễm đã được tối ưu, số lượng tế bào càng nhiều thì lượng virút được sản xuất ra càng cao. Tuy nhiên, điều này không hoàn toàn đúng trong mọi trường hợp do tính không đồng nhất về tình trạng chuyển hóa đối với tất cả các tế bào. - Cô đặc và tinh khiết: Đối với các vắcxin sản xuất trên nuôi cấy tế bào, cô đặc và tính khiết kháng nguyên virút là những quy trình thường xuyên được tiến hành. Một vài phương pháp hiện được nhiều nhà sản xuất sử dụng là siêu ly tâm, ly tâm phân vùng và sắc ký lỏng. Ở quy mô sản xuất lớn, các kỹ thuật thường được áp dụng là siêu ly tâm và ly tâm trong gradient tỷ trọng. - Bất hoạt virút: Quy trình bất hoạt là bắt buộc đối với các vắcxin sử dụng cho người. Nếu bất hoạt bằng các chất hóa học thì nhiệt độ và thời gian bất 22
  31. hoạt cần được xác định đối với mỗi loại vắcxin. Một trong những chất được sử dụng có hiệu quả đối với vắcxin trên nuôi cấy tế bào là - propiolactone do bất hoạt tốt virút dại và giảm lượng ADN tồn dư từ tế bào. Nhược điểm của phương pháp này là giá thành còn cao và khá độc trước khi được xử lý nhiệt. Tia cực tím cũng được sử dụng để bất hoạt virút. Trong trường hợp này liều lượng và thời gian chiếu nên được xem xét kỹ để toàn bộ virút đều được bất hoạt mà không làm giảm đi lượng kháng nguyên. - Ổn định và đông khô: Phần lớn các vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào được giữ ở dạng đông khô để có được tính ổn định cao. Do vậy, thời hạn sử dụng của vắcxin dạng này kéo dài hơn nhiều so với vắcxin được giữ ở dạng dung dịch. Vắcxin sử dụng cho người thường được tiêm với mục đích điều trị sau khi đã phơi nhiễm với virút dại (5 liều tiêm hoặc nhiều hơn tùy thuộc vào loại vắcxin) hoặc là dự phòng do đó các vắcxin này phải đáp ứng được các yêu cầu nghiêm ngặt trong phát triển sản phẩm như: - Virút phải được bất hoạt hoàn toàn. - Các dòng tế bào lưỡng bội hoặc thường trực được sử dụng để nhân nuôi virút không được có các chất gây ung thư hoặc bị chuyển dạng. Do vậy, các dòng tế bào sử dụng trong sản xuất và hàm lượng ADN trong một liều tiêm cho người phải đáp ứng được yêu cầu của Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) đối với các vắcxin sản xuất trên nuôi cấy tế bào dùng để tiêm cho người [36]. Xu hướng phát triển các vắcxin dại mới hiện nay là tìm kiếm các công nghệ có giá thành rẻ nhưng vẫn có hiệu quả tốt. Một trong những xu hướng 23
  32. được nhiều nhà sản xuất áp dụng là tiến hành nuôi cấy virút trên hệ thống nuôi cấy sinh khối với các tiểu giá thể nuôi cấy tế bào và sử dụng các môi trường không chứa huyết thanh (serum-free medium) [19], [59]. Môi trường không chứa huyết thanh đã hạn chế được các nhược điểm của các môi trường có huyết thanh như dễ gây ra các phản ứng quá mẫn ở người được tiêm, không có tính đồng nhất giữa các mẻ huyết thanh, dễ bị nhiễm bởi các tác nhân vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, mycoplasma, virút ở động vật ) và giá thành cao hơn. Bên cạnh đó, một số xu hướng áp dụng các công nghệ sinh học tiên tiến như phát triển vắcxin tái tổ hợp của protein G, vắcxin ADN cũng đã được nghiên cứu, tuy nhiên hiện các nghiên cứu này chỉ được tiến hành với mục đích phát triển các vắcxin sử dụng cho động vật chứ không phải là các vắcxin để sử dụng cho người [22]. 1.3.2. Kiểm tra chất lƣợng vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Kiểm tra chất lượng nguyên vật liệu gốc Điều kiện cho nhân nuôi virút Sử dụng tế bào lưỡng bội hoặc tế bào thường trực để sản xuất vắcxin dại cần dựa trên hệ thống tế bào giống. Giống tế bào cũng như số lần cấy chuyển tối đa cần đạt các yêu cầu của TCYTTG và của kiểm định Quốc gia [54]. Thử nghiệm nhận dạng tế bào được tiến hành chủ yếu với ngân hàng tế bào giống gốc. Các thử nghiệm được tiến hành bao gồm thử nghiệm sinh hóa (phân tích isoenzyme), miễn dịch và gen tế bào. Môi trường nuôi cấy tế bào: - Huyết thanh sử dụng để nhân nuôi tế bào phải được thử nghiệm để xác 24
  33. định không nhiễm vi khuẩn, nấm, mycoplasma và các virút lây nhiễm từ động vật. Bất kỳ thành phẩn nào có nguồn gốc từ bò, cừu hoặc dê sử dụng cho nuôi cấy tế bào cần đạt các yêu cầu của TCYTTG và của kiểm định Quốc gia. Các thành phần này phải đáp ứng được các hướng dẫn hiện tại của TCYTTG liên quan đến spongiform gây bệnh lý não lây truyền ở động vật. Huyết thanh người được sử dụng cũng phải kiểm soát về chất lượng và quy trình sản xuất. - Các kháng sinh penicillin và thuộc họ beta-lactam khác không được sử dụng ở bất kỳ giai đoạn sản xuất nào. Nồng độ tối thiểu của các kháng sinh như kanamycin hay neomycin cũng phải đạt theo các yêu cầu của TCYTTG và của kiểm định Quốc gia. - Trypsin có nguồn gốc động vật sử dụng để chuẩn bị nuôi cấy tế bào cũng cần phải thử nghiệm và không được có vi khuẩn, nấm, mycoplasma và các virút lây nhiễm khác. Chủng virút Chủng virút dại sử dụng trong sản xuất các loạt giống cần được xác định đặc tính. Chủng cần có hồ sơ lý lịch ghi chép các thông tin và nguồn gốc đáp ứng được yêu cầu đối với việc sản xuất vắcxin bất hoạt an toàn và có hiệu quả miễn dịch. Chủng giống virút sản xuất không được cấy chuyển quá 5 đời từ chủng giống gốc. Vắcxin cần được sản xuất từ loạt giống sản xuất mà không cấy chuyển thêm. Chủng giống virút cần được bảo quản âm hoặc đông khô [54]. Các thử nghiệm đối với chủng giống virút bao gồm: - Thử nghiệm về vi khuẩn, nấm và mycoplasma - Thử nghiệm về tác nhân ngoại lai trên chuột sữa, chuột trưởng thành và nuôi cấy tế bào. 25
  34. - Xác định hàm lượng virút bằng phương pháp gây nhiễm vào não chuột. Hiệu giá tối thiểu của chủng giống được xác định tùy theo nhà sản xuất tùy thuộc vào sản phẩm, tế bào và chủng virút. Kiểm tra chất lượng quá trình sản xuất vắcxin Kiểm tra nuôi cấy tế bào Các thử nghiệm kiểm tra nuôi cấy tế bào bao gồm: - Thử nghiệm về virút hấp phụ hồng cầu - Thử nghiệm về tác nhân ngoại lai trong dung dịch nuôi cấy tế bào - Thử nghiệm nhận dạng (dòng tế bào) Kiểm tra mẻ gặt virút đơn và bán thành phẩm tinh chế - Thử nghiệm vô khuẩn trên các mẻ gặt virút đơn - Nhận dạng: mẻ gặt đơn chứa virút cần được xác định là virút bằng cách sử dụng kháng thể đặc hiệu. - Hiệu giá virút: mỗi mẻ gặt đơn cần được xác định đặc tính lây nhiễm bằng thử nghiệm có độ nhạy cao. Nhà sản xuất cần đưa ra các tiêu chuẩn đối với hiệu giá của các mẻ gặt đơn. - Xác định hàm lượng kháng nguyên: thử nghiệm xác định kháng nguyên glycoprotein được thiết lập để xác định lượng kháng nguyên trong bán thành phẩm cuối cùng. Thử nghiệm này được sử dụng để theo dõi tính ổn định của sản xuất. Các thử nghiệm được tiến hành theo phương pháp khuếch tán miễn dịch đơn (SRID) hoặc miễn dịch gắn men (EIA). 26
  35. - Thử nghiệm về ADN tế bào tồn dư: đối với virút phát triển trên dòng tế bào thường trực, bán thành phẩm tinh khiết cần được thử nghiệm về ADN tế bào tồn dư. Quá trình tinh chế cần làm giảm được lượng ADN tế bào của vật chủ. Theo quy định, lượng ADN tế bào tồn dư cần phải đạt dưới 10 ng cho 1 liều tiêm cho người [21], [56]. - Thử nghiệm về huyết thanh động vật tồn dư: nếu huyết thanh động vật được sử dụng trong quá trình sản xuất, nồng độ albumin huyết thanh bò (BSA) được sử dụng làm chỉ số đối với huyết thanh động vật trong bán thành phẩm tinh khiết và giá trị này không được vượt quá 50 ng cho một liều tiêm cho người [54]. - Thử nghiệm về các nguyên vật liệu tồn dư: nhà sản xuất phải cho thấy các nguyên vật liệu tồn dư khác sử dụng trong sản xuất phải giảm qua quá trình tinh chế đến mức có thể chấp nhận được theo yêu cầu của kiểm định Quốc gia [54]. Kiểm tra quá trình bất hoạt Mỗi bán thành phẩm tinh khiết cần phải thử nghiệm theo những phương pháp thích hợp để đánh giá hiệu quả bất hoạt virút trước khi cho thêm chất bảo quản và các chất khác. Độ nhạy của các thử nghiệm cần được xác định tùy theo chủng virút dại được sử dụng trong sản xuất và thử nghiệm có độ nhạy cao nhất sẽ được áp dụng. Thử nghiệm cần tiến hành ngay sau khi kết thúc quá trình bất hoạt. Các thử nghiệm được tiến hành để đánh giá sự có mặt của virút sống bao gồm thử nghiệm tiêm gây nhiễm trực tiếp vào não chuột và thử nghiệm nhân bội virút dại (amplification test) trên nuôi cấy tế bào [28]. Bán thành phẩn đạt kết quả về bất hoạt nếu đáp ứng được yêu cầu không có các virút sống tồn lưu [54]. 27
  36. Kiểm tra bán thành phẩm cuối cùng - Hàm lượng kháng nguyên của bán thành phẩm cuối cùng: thử nghiệm xác định kháng nguyên glycoprotein trong bán thành phẩm cuối cùng được tiến hành theo phương pháp khuếch tán miễn dịch đơn (SRID) hoặc miễn dịch gắn men (EIA). - Thử nghiệm vô khuẩn Kiểm tra chất lượng vắcxin thành phẩm - Thử nghiệm nhận dạng: thử nghiệm nhận dạng được thực hiện với ít nhất 1 lọ cho mỗi loạt sản xuất. Thử nghiệm công hiệu có thể được coi là một thử nghiệm nhận dạng. - Thử nghiệm vô khuẩn: thành phẩm cuối cùng cần được thử nghiệm vô khuẩn đối với nấm và vi khuẩn. - Thử nghiệm an toàn chung: mỗi loạt thành phẩm cần được thử nghiệm về độc tính không mong muốn (độc tính bất thường) sử dụng các thử nghiệm an toàn chung theo yêu cầu của kiểm định Quốc gia. - Hàm lượng kháng nguyên: nếu không chưa được làm đối với bán thành phẩm cuối cùng, hàm lượng kháng nguyên cần được xác định và giá trị nằm trong giới hạn yêu cầu. - Thử nghiệm công hiệu vắcxin thành phẩm Công hiệu của các loạt vắcxin thành phẩm cần được xác định. Trước khi tiến hành thử nghiệm, vắcxin đông khô cần được hồi chỉnh dưới dạng có thể sử dụng được cho người. Thử nghiệm NIH được trình bày trong tài liệu Kỹ thuật phòng thí 28
  37. nghiệm chẩn đoán dại [58], sử dụng để đánh giá độ ổn định sản xuất của vắcxin thử nghiệm. Thử nghiệm này cũng được sử dụng để đánh giá mức độ ổn định sản phẩm với mục đích xác định hạn sử dụng cũng như hiệu chỉnh chế phẩm chuẩn. Trong thử nghiệm này, chuột được tiêm miễn dịch sau đó thử thách với virút dại. Thử nghiệm được tiến hành bởi các nhóm chuột tiêm 2 mũi vắcxin cách nhau 7 ngày với độ pha loãng thích hợp của vật liệu chuẩn đã được hiệu chỉnh với mẫu vắcxin dại chuẩn quốc tế và vắcxin thử nghiệm. 7 ngày sau liều tiêm cuối, chuột được tiêm miễn dịch và nhóm chuột chứng được thử thách theo được tiêm não với > 5 LD50 chuẩn virút thử thách (CVS). Hiệu giá của virút thử thách cũng cần được khẳng định bằng cách gây nhiễm ít nhất ở 3 độ pha loãng 10 lần trên chuột. Chuột được theo dõi 14 ngày và liều hiệu quả 50% (ED50) của mẫu chuẩn và mẫu thử được xác định dựa trên tỷ lệ chuột sống sót. Công hiệu của vắcxin thử nghiệm tính theo IU được xác định bằng cách so sánh ED50 của mẫu vắcxin thử so với mẫu vắcxin chuẩn đã được hiệu chỉnh tính theo IU với mẫu vắcxin dại chuẩn quốc tế sử dụng phương pháp thống kê thích hợp. Thử nghiệm với tiêu chuẩn được xác định cho quy trình thử nghiệm và thẩm định, phương pháp thống kê cùng với số lượng tối thiểu các thử nghiệm được tiến hành để phân tích kết quả và xác định độ tin cậy của thử nghiệm (25-400%) đạt theo yêu cầu của kiểm định Quốc gia. Đặc biệt, hiệu chỉnh mẫu chuẩn vắcxin theo chuẩn quốc tế cũng như việc sử dụng, bảo quản và vận chuyển CVS cũng cần được xác định trong quy trình thử nghiệm. Số lượng thử nghiệm đối với mỗi mẻ sản xuất phụ thuộc vào độ ổn định của thử nghiệm tại mỗi phòng thí nghiệm. Nếu độ ổn định của thử 29
  38. nghiệm trong phòng thí nghiệm tốt, chỉ cần một thử nghiệm là đủ. Tuy nhiên, thử nghiệm bổ sung có thể làm tăng tính chính xác của công hiệu ước tính. Công hiệu cần đạt ít nhất là 2,5 IU cho một liều tiêm ở người. Nhà sản xuất cần đưa ra các dữ liệu hỗ trợ cho thử nghiệm công hiệu NIH qua các thử nghiệm in vitro xác định hàm lượng kháng nguyên để đảm bảo độ ổn định chắc chắn của quá trình sản xuất. - Độ ẩm tồn dư trong vắcxin đông khô: độ ẩm tồn dư trong mẫu của mỗi loạt vắcxin đông khô cần được xác định theo các phương pháp thích hợp. Nói chung, lượng độ ẩm tồn dư cần thấp dưới 3%. - Thử nghiệm chất gây sốt: mỗi loạt thành phẩm cần thử nghiệm về chất gây sốt. Thử nghiệm này cần được chấp thuận bởi kiểm định Quốc gia. - Thử nghiệm về protein huyết thanh động vật: mẫu của loạt thành phẩm được thử nghiệm về albumin huyết thanh bò trong vắcxin hồi chỉnh cuối cùng với lượng dưới 50 ng cho một liều tiêm cho người. - Chất bổ trợ: nếu một chất bổ trợ được cho vào vắcxin, hàm lượng chất này cần được xác định bằng phương pháp thích hợp. Nếu các phức hợp nhôm được sử dụng thì nồng độ nhôm không được vượt quá 1,25 mg cho một liều tiêm ở người. Nếu các chất khác được sử dụng như chất bổ trợ hoặc có tác dụng như chất bổ trợ, tiêu chuẩn về hàm lượng cần được đưa ra. Khi nhôm hydroxide được sử dụng làm chất bổ trợ, lượng hấp phụ trong bán thành phẩm cuối cùng không được ít hơn 95%. - Chất bảo quản: nếu chất bảo quản được cho vào vắcxin, hàm lượng chất này cần được xác định bằng phương pháp thích hợp. Lượng chất bảo quản cho vào vắcxin không được làm mất đi hiệu quả của kháng nguyên 30
  39. hoặc không làm giảm tính an toàn của vắcxin. - Kiểm tra cảm quan: mỗi lọ trong các loạt văc xin sau khi đóng lọ cần được kiểm tra cảm quan để loại bỏ các lọ bất thường. - Thử nghiệm đối với ADN tế bào tồn dư: thử nghiệm ADN tế bào tồn dư được tiến hành với thành phẩm vắcxin nếu thử nghiệm này chưa được làm với bán thành phẩm cuối cùng. 1.4. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC, TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT VẮC XIN DẠI TẠI VIỆT NAM Tại Việt Nam, trong những năm 1991-1995, bệnh dại là vấn đề y tế nghiêm trọng gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe, tính mạng và kinh tế của người dân. Bệnh xảy ra quanh năm, lưu hành ở hầu hết các tỉnh, thành phố trên cả nước. Theo thống kê chưa đầy đủ tại các Trung tâm Y tế dự phòng trên toàn quốc, trung bình mỗi năm có từ 300.000 đến gần 600.000 người bị súc vật cắn phải đi tiêm vắcxin phòng dại. Nếu tính một người tiêm vắcxin dại phí tổn 300.000 đồng (gồm tiền thuốc, công lao động, tiền đi lại ) thì trong năm 1995 cả nước tốn gần 100 tỷ đồng. Thêm vào đó, mỗi năm có trên dưới 500 người thiệt mạng do bệnh dại. Trước tình hình nghiêm trọng của bệnh dại, năm 1996, Chính phủ đã ban hành chỉ thị về việc tăng cường phòng chống bệnh dại và Bô Y tế đã thành lập ban chỉ đạo Phòng chống bệnh dại Quốc gia.Theo thống kê của khoa Dịch tễ, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, trong vòng 11 năm (từ 1996 đến 2006) vẫn có trên 6 triệu người được tiêm vắcxin phòng dại sau khi bị súc vật cắn với tỷ lệ tiêm phòng là 652,6 /100.000 dân vào năm 1996 và 670,8/100.000 dân vào năm 2006. Cũng trong 11 năm này có tổng số 1116 trường hợp người chết vì bệnh dại (0,35/100.000 dân vào 31
  40. năm 1996 và 0,09/100.000 dân vào năm 2006). Như vậy, số ca tử vong do bệnh dại vào năm 2006 đã giảm 81% so với năm 1995. Tuy nhiên, trong năm 2007, số ca tử vong do bệnh dại đã lại tăng lên đến trên 100 trường hợp. Nguyên nhân có thể là do việc kiểm soát nguồn gây bệnh mà chủ yếu là chó - nguồn gây bệnh chính tại Việt Nam còn nhiều hạn chế. Với số lượng ước tính từ 6-8 triệu con chó, trong đó phần lớn là nuôi thả rông tại các vùng nông thôn, không được giám sát và tiêm phòng đầy đủ, sẽ là một nguy cơ làm gia tăng số ca bệnh dại. Bên cạnh đó, việc thay đổi chính sách sử dụng vắcxin, ngừng sử dụng vắcxin thế hệ cũ rẻ tiền thay thế bằng vắcxin nhập ngoại sản xuất trên nuôi cấy tế bào đắt tiền hơn, làm giảm khả năng được tiếp cận với vắcxin phòng bệnh của các bệnh nhân nghèo, đặc biệt tại các vùng nông thôn, vùng sâu, vùng xa [4]. Ở Việt Nam, trước năm 1974, vắcxin phòng bệnh dại cho người chủ yếu là vắcxin sản xuất từ não cừu, dê (Fermi, Semple). Các vắcxin này có chứa một lượng virút chưa bất họa và tính sinh miễn dịch thấp nên phải tiêm nhiều mũi (18-21 mũi) cùng với liều tiêm lớn (1,5-2,5 ml/mũi). Do vậy khi tiêm vắcxin dại không chỉ đưa vào 1 lượng kháng nguyên cần thiết mà còn đưa cả protein - myelin vào cơ thể. Đây chính là nguyên nhân gây ra các tai biến viêm não tủy có thể dẫn tới liệt và tử vong [4]. Từ năm 1974, Viện Vệ sinh dịch tễ học Hà Nội đã nghiên cứu sản xuất vắcxin dại trên não chuột ổ theo phương pháp của Fuenzalida-Palacios được chuyển giao kỹ thuật từ Viện Pasteur Paris (Pháp). Sau khi đất nước thống nhất, nhằm đáp ứng kịp thời nhu cầu của nhân dân, việc sản xuất vắcxin dại đã được triển khai tại cả Viện Vắcxin Nha Trang và Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh. Chủng giống sản xuất là chủng VP-13 (Pasteur Virút) do cơ quan kiểm định quốc gia cung cấp. Chủng sản xuất được gây nhiễm trên não chuột nhắt trắng 1-4 ngày tuổi, bất hoạt bằng -propiolactone, bảo quản bằng 32
  41. merthiolate. Ưu điểm chính của vắcxin này là không chứa hoặc chứa rất ít myelin của não nên ít gây các tai biến thần kinh hơn. Hiệu giá virút thu hoạch từ não chuột ổ cao hơn do đó tính sinh miễn dịch tốt hơn do vậy số liều tiêm giảm còn từ 6-8 mũi tiêm. Việc sử dụng vắcxin dại trên não chuột ổ trong hơn 30 năm qua đã góp phần hạn chế nguy cơ tử vong do bệnh dại. Hàng năm, có từ 3,5 đến 4 triệu liều vắcxin Fuenzalida được sản xuất và 150.000 liều vắcxin Verorab được nhập để tiêm phòng cho người. Theo kết quả nghiên cứu về nguyên nhân tử vong, tác giả Đinh Kim Xuyến, Trần Văn Tiến cho thấy 87- 90% số trường hợp tử vong là do không được điều trị bằng vắcxin và huyết thanh kháng dại sau khi bị súc vật dại cắn; tuy nhiên 10-13% trường hợp tử vong được ghi nhận ở các bệnh nhân đã được tiêm phòng vắcxin Fuenzalida đầy đủ, nguyên nhân có thể là do vết cắn quá nặng và đi tiêm muộn. Theo tác giả Hoàng Minh Hiền, 78% người được tiêm có các phản ứng phụ như sưng đỏ, ngứa tại chỗ tiêm, mệt mỏi, nhức đầu. Kết quả báo cáo từ các Trung tâm Y tế Dự phòng trên cả nước cũng cho thấy trên 80% các trường hợp có các phản ứng không mong muốn sau khi tiêm vắcxin Fuenzalida, các phản ứng không mong muốn nghiêm trọng như viêm não tủy gây liệt vĩnh viễn và tử vong gặp với tỷ lệ 1-2 trường hợp/10.000 mũi tiêm. Do các phản ứng không mong muốn nghiêm trọng này, nên từ năm 2007, Bộ Y tế đã ra quyết định ngừng việc sử dụng vắcxin dại Fuenzalida trên toàn quốc. Do tỷ lệ bệnh nhân được tiêm phòng bằng vắcxin trên nuôi cấy tế bào được nhập ngoại trước đây chỉ chiếm 15% số người được tiêm vắcxin dại và giá thành cho một liệu trình tiêm loại vắcxin này rất đắt (gần 800.000 đồng) nên cơ hội để các bệnh nhân nghèo, vùng sâu, vùng xa được tiêm loại vắcxin này là rất ít. Điều này phần nào lý giải tại sao số ca tử vong do bệnh dại đã tăng lên trong năm 2007. Từ năm 2004, Việt Nam cũng đã bắt đầu áp dụng phác đồ tiêm trong da đối với vắcxin Verorab - một vắcxin trên nuôi cấy tế bào nhập ngoại được dùng phổ biến tại Việt Nam để làm giảm bớt chi phí cho tiêm phòng vắcxin dại [3]. 33
  42. Theo phác đồ này giá thành của liệu trình đã giảm xuống khoảng 300.000 đồng cho 8 mũi tiêm, tuy nhiên vấn đề kỹ thuật tiêm và chi phí vẫn là một thách thức đối với các vùng kinh tế còn kém phát triển. Đứng trước yêu cầu cần sớm có được vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào được sản xuất trong nước nhằm làm giảm chi phí tiêm phòng cho bệnh nhân, để nhiều người có cơ hội được tiêm phòng vắcxin dại từ đó giảm tỷ lệ tử vong do bệnh dại, nhiều cơ quan nghiên cứu tại Việt Nam đã tiến hành các nghiên cứu phát triển vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào. Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương đã có những thành công bước đầu trong việc nghiên cứu vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào thận chuột đất vàng nguyên phát. Chủng Vnukovo-32 dùng trong sản xuất và công nghệ được tiếp thu từ Liên bang Nga. Tuy nhiên, hạn chế của công nghệ này là nguồn cung cấp động vật (chuột đất vàng) có chất lượng và số lượng đảm bảo cho sản xuất vắcxin. Do vậy, việc phát triển vắcxin theo công nghệ này hiện chưa được triển khai trên quy mô lớn hơn để có được sản phẩm hoàn chỉnh. Để khắc phục hạn chế về nguồn tế bào nguyên phát cho sản xuất vắcxin, các nghiên cứu sử dụng dòng tế bào thường trực mà đặc biệt là tế bào Vero đã được các nhà khoa học đề cập đến. Cũng từ chủng Vnukovo-32, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã gây thích ứng trên dòng tế bào Vero với mong muốn có được chủng virút đạt được yêu cầu để sử dụng trong sản xuất vắcxin dại. Hiện nghiên cứu này đang tiếp tục được tiến hành. Nhóm nghiên cứu của Công ty Vắcxin và sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) đã bắt tay vào nghiên cứu và phát triển vắc xin dại trên nuôi cấy tế bào Vero từ năm 2005 với mục đích chọn lựa được chủng virút, điều kiện nuôi cấy và quy trình sản xuất phù hợp trong điều kiện Việt Nam. Với các chùng vi rút dại cố định nhận được từ Trung tâm Kiểm soát bệnh tật và Dự phòng Hoa kỳ (CDC) đã thích ứng trên dòng tế bào Vero - Pasteur virút (PV) và Pitman-Moore (PM) cùng với dòng tế bào Vero loạt gốc của 34
  43. TCYTTG, nhóm nghiên cứu đã lựa chọn được chủng PV và môi trường nuôi cấy không chứa huyết thanh để tiếp tục nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero tại Việt Nam. Quy trình này cần được tiếp tục nghiên cứu về tính ổn định các thông số và hiệu suất của từng bước của quy trình. Đồng thời, sau khi có được quy trình công nghệ ổn định, sản phẩm của quá trình sản xuất thử nghiệm phải đạt được chất lượng theo yêu cầu của kiểm định Quốc gia và tương đương với các vắcxin nhập ngoại như vắcxin Verorab. 35
  44. CHƢƠNG 2 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO VERO Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM Quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào được nghiên cứu và phát triển tại Việt Nam là quy trình nhân nuôi chủng virút dại cố định trên dòng tế bào Vero. Đây là công nghệ đã được nhiều Hãng sản xuất vắcxin lớn tại Pháp, Trung Quốc, Ấn Độ sử dụng. So với các công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào lưỡng bội người, quy trình này sản xuất ra vắcxin có giá thành rẻ hơn đồng thời lại có tính an toàn và tính sinh miễn dịch cao [34]. Lựa chọn dòng tế bào Vero để sản xuất vắcxin dại, nhóm nghiên cứu của Công ty Vắcxin và sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) đã tiến hành các đề tài nghiên cứu cấp cơ sở từ năm 2005 để lựa chọn chủng virút, điều kiện nuôi cấy và quy trình sản xuất phù hợp. Nghiên cứu đầu tiên là nghiên cứu lựa chọn chủng có khả năng tạo được hiệu giá virút cao nhất trong số hai chủng virút dại cố định nhận được từ Trung tâm Kiểm soát bệnh tật và Dự phòng Hoa kỳ (CDC) đều đã thích ứng trên dòng tế bào Vero - Pasteur virút-PV và Pitman-Moore. Cùng một điều kiện là được gây nhiễm vào tế bào Vero loạt gốc của TCYTTG và duy trì nhân nuôi virút trong môi trường tối ưu - MEM có chứa 0,3% albumin huyết thanh người, chủng PV luôn cho hiệu giá virút cao trong tất cả các mẻ gặt đơn từ ngày nuôi cấy thứ 6 đến ngày nuôi cấy thứ -6 -7 -4,5 21 (từ 10 LD50/ml đến 10 LD50/ml) so với chủng PM (chỉ từ <10 -6 LD50/ml cho tới 10 LD50/ml). Từ kết quả này, chủng PV được lựa chọn là 36
  45. chủng để tiếp tục nghiên cứu và phát triển vắcxin tại Việt Nam do có hiệu giá virút cao kéo dài, duy trì được nhiều mẻ gặt đơn đáp ứng được yêu cầu về hiệu giá virút và thể tích đầu vào cho quá trình sản xuất vắcxin. Từ chủng virút PV được lựa chọn, nhóm nghiên cứu đã xây dựng hệ thống chủng virút dại giống gốc (Master seed virus-MSV) và chủng virút dại giống sản xuất (Working seed virus-WSV) đủ để nghiên cứu và sản xuất vắcxin dại trong vòng nhiều năm tiếp theo tại VABIOTECH. Toàn bộ quá trình nhân chủng và chuẩn độ hiệu giá của chủng virút đều được thực hiện và ghi chép lại thành hồ sơ chủng theo đúng khuyến cáo của TCYTTG cho vắcxin dại bất hoạt sử dụng cho người được sản xuất trên nuôi cấy tế bào [54] (xem phần Phụ lục). Đồng thời, dòng tế bào Vero loạt gốc của TCYTTG cũng được nhóm nghiên cứu nhân nuôi và xây dựng thành ngân hàng tế bào Vero sản xuất của VABIOTECH (Working cell bank - WCB) - Tế bào giống gốc của TCYTTG CCL 81 đời 134 được nhân nuôi và tiếp tục cấy chuyển đến đời 137, sau đó được đóng ống và bảo quản trong dung dịch bảo quản tế bào. Các ống tế bào được làm đông băng và bảo quản trong nitrogen lỏng. Toàn bộ quá trình nhân nuôi tế bào và pha các môi trường để nhân nuôi cũng như bảo quản tế bào đều được ghi chép lại để xây dựng thành hồ sơ tế bào Vero sản xuất theo đúng quy định của TCYTTG về việc sử dụng các tế bào động vật cho sản xuất các sản phẩm sinh học [53] và khuyến cáo của TCYTTG cho vắcxin dại bất hoạt sử dụng cho người được sản xuất trên nuôi cấy tế bào [29], [54] (xem phần Phụ lục). Nghiên cứu tiếp theo được tiến hành là lựa chọn môi trường nhân nuôi virút tối ưu nhất trong số các môi trường dinh dưỡng được chấp nhận cho sản xuất vắcxin. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy hiệu giá virút dại của toàn bộ các mẻ gặt đơn sau khi thu hoạch đối với từng môi trường nuôi cấy lần lượt là -6 -6,33 10 LD50/ml cho môi trường chứa albumin huyết thanh người, 10 LD50/ml 37
  46. -5,34 cho môi trường không chứa huyết thanh của VABIOTECH, 10 LD50/ml -5,66 cho môi trường MEM không chứa huyết thanh, 10 LD50/ml cho môi -3 trường không chứa huyết thanh SFM của Gibco và <10 LD50/ml cho môi trường M199 không chứa huyết thanh. Với hiệu giá virút cao, môi trường không chứa huyết thanh của VABIOTECH được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu sản xuất vắcxin. Đặc biệt môi trường này sẽ có giá thành thấp hơn, dễ tinh khiết virút hơn và hạn chế được các nguy cơ lây nhiễm bởi các tác nhân vi sinh vật so với các môi trường dinh dưỡng có chứa huyết thanh. Sau khi có được tế bào Vero, chủng virút PV và môi trường nuôi cấy không huyết thanh đạt các yêu cầu cho sản xuất, nhóm nghiên cứu sẽ tiếp tục nghiên cứu xây dựng một quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào ở quy mô phòng thí nghiệm. Quy trình này cần có sự ổn định về các thông số và hiệu suất của từng bước sản xuất, đồng thời tiến hành các quá trình sản xuất thử nghiệm để có được sản phẩm đạt được chất lượng theo yêu cầu của TCYTTG và tương đương với các vắcxin nhập ngoại như vắcxin Verorab. Quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero bao gồm các bước chính sau đây (Hình 2.1): 38
  47. Nuôi cấy và chuẩn bị tế bào Vero Gây nhiễm virút dại vào tế bào Vero Nuôi cấy virút và thu hoạch nƣớc nổi Tinh sạch hỗn dịch virút Bất hoạt virút Cô đặc hỗn dịch virút Tinh chế virút Pha bán thành phẩm cuối cùng Sản xuất vắcxin thành phẩm Hình 2.1. Tóm tắt quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero 2.1. QUY TRÌNH NUÔI CẤY VÀ CHUẨN BỊ TẾ BÀO VERO - Mục đích: Tìm ra các điều kiện tối ưu để cho hiệu suất tế bào cao. Tính ổn định và chất lượng của tế bào là một trong những yếu tố quyết định đến hiệu giá thu hoạch virút sau gây nhiễm. - Các tham số về điều kiện nuôi cấy tế bào bao gồm: môi trường, nhiệt độ, thời gian, số đời cấy chuyển và loại chai nuôi cấy tế bào. Kết quả của quá 39
  48. trình nuôi cấy tế bào được đánh giá bằng các phương pháp theo dõi và kiểm tra chất lượng tế bào trong quá trình nuôi cấy. + Môi trường nuôi cấy: môi trường nhân nuôi tế bào Vero trước khi gây nhiễm virút là môi trường MEM có bổ sung huyết thanh động vật. Huyết thanh được sử dụng là huyết thanh bào thai bê (FBS) hoặc huyết thanh bò (BS). Các huyết thanh này đều phải đảm bảo yêu cầu về chất lượng sử dụng trong quá trình sản xuất các chế phẩm sinh học sử dụng cho người [53], [54]. + Nhiệt độ nuôi cấy: trong các nghiên cứu sản xuất vắcxin dại, nhiệt độ nuôi cấy của tế bào Vero thường giao động trong khoảng tương đối rộng từ 34oC [14], 36,5 oC [18] đến 37oC [26], [48], [59]. Trong nghiên cứu này, nhiệt độ để nhân nuôi tế bào trước cũng như sau khi gây nhiễm virút đều là 37oC theo đúng hướng dẫn của về nhân nuôi tế bào của cơ sở cung cấp tế bào Vero loạt gốc CCL 81. + Thời gian nuôi cấy: thời gian nuôi cấy tùy thuộc vào nồng độ tế bào đưa vào nuôi cấy ban đầu. Thời gian nuôi cấy giao động từ 3 ngày đến 7 ngày. Thời gian nuôi cấy sẽ kết thúc khi tế bào kín một lớp trên chai nuôi cấy và số lượng tế bào đạt được theo yêu cầu trên mỗi loại chai nuôi cấy khác nhau. + Số đời cấy chuyển tế bào: loạt tế bào Vero giống sản xuất của VABIOTECH ở đời cấy chuyển 137 (xem phần phụ lục). Theo kinh nghiệm của các chuyên gia sản xuất vắcxin của Hãng Pasteur Merieux, nơi hiện đang sử dụng hệ thống nuôi cấy tế bào Vero trong sản xuất vắcxin bại liệt bất hoạt và vắcxin dại, đời cấy chuyển cuối cùng của tế bào Vero trong sản xuất là đời 142 [29], [32]. Nghiên cứu của nhóm các tác giả này không thấy nguy cơ gây ung thư khi tiêm tế bào Vero ở các đời cấy chuyển dưới 169 trên chuột đã bị ức chế miễn dịch. Từ đời cấy chuyển 191, các nốt u xuất hiện với nghi ngờ là ung thư giống với khi tiêm cho chuột dòng tế bào HeLa gây ung thư [32]. Do vậy để chất lượng hóa các ngân hàng tế bào sản xuất, bên cạnh việc giám sát 40
  49. chất lượng về tế bào thì việc quy định đời cất giữ tế bào tối đa cũng được các nhà sản xuất đề cập đến [51]. Hình ảnh tế bào Vero CCL 81 của TCYTTG từ đời cấy chuyển 135 - đời ra chai nuôi cấy đầu tiên sau khi nhận dòng tế bào loạt gốc cho đến đời nuôi cấy cuối cùng (đời 142) sử dụng trong sản xuất vắcxin được trình bày trong hình 2.2. Các hình ảnh này đã cho thấy tính đồng nhất về hình thái của tế bào Vero qua các đời cấy chuyển. Đời cấy chuyển Hình ảnh tế bào Đời cấy chuyển Hình ảnh tế bào Đời 135 Đời 136 Đời 137 Đời 138 (Ngân hàng tế bào sản xuất) Đời 139 Đời 140 Đời 141 Đời 142 (Đời nuôi cấy sản xuất) Hình 2.2. Hình ảnh tế bào Vero qua các đời cấy chuyển 41
  50. + Loại chai nuôi cấy tế bào: Tế bào Vero được nuôi cấy trên các chai một lớp có diện tích nuôi cấy khác nhau. Các dạng chai thường được sử dụng trong nghiên cứu này là các chai nuôi cấy loại 75cm2 và 150 cm2. Ngoài ra sau khi gây nhiễm virút có sử dụng thêm các chai nuôi cấy nhiều tầng (3 tầng hoặc 10 tầng) nhằm đánh giá tính khả dụng của các chai nuôi cấy này trong việc làm tăng hiệu suất của hỗn dịch virút thu hoạch và làm giảm nguy cơ lây nhiễm trong quá trình gặt cũng như thay môi trường cho các mẻ gặt đơn virút. Kết quả duy trì tế bào cũng như nuôi cấy virút đối với các dạng chai nuôi cấy tế bào một lớp khác nhau được trình bày trong Phần 2.3- Quy trình nuôi cấy virút và thu hoạch nước nổi. Theo dõi các chai nuôi cấy tế bào trước khi gây nhiễm virút được tiến hành hàng ngày bằng phương pháp cảm quan (màu và độ trong của môi trường nuôi cấy) và kiểm tra dưới kính hiển vi soi tế bào. Soi tế bào nhằm đánh giá về hình thái tế bào, mức độ mọc kín một lớp và các bất thường của quá trình phát triển của tế bào như có hay không sự hủy hoại của tế bào (CPE). Lượng tế bào thu được trong các chai nuôi cấy được xác định bằng cách tách tế bào và nhuộm đếm số lượng bằng buồng đếm. Chất lượng tế bào được đánh giá bằng các phương pháp kiểm tra chất lượng trong quá trình nuôi cấy. Các phương pháp này không những giúp kiểm tra chất lượng của tế bào trước khi đưa vào gây nhiễm virút sản xuất mà còn giúp theo dõi toàn bộ quá trình duy trì tế bào trong quá trình nhân nuôi virút thông qua các chai tế bào chứng không gây nhiễm virút. Các thử nghiệm kiểm tra chất lượng tế bào trong quá trình nuôi cấy bao gồm: 2.1.1. Các thử nghiệm kiểm tra nƣớc nổi nuôi cấy tế bào 2.1.1.1. Thử nghiệm kiểm tra vô khuẩn - xem phần 4.1.1: Phương pháp kiểm tra vô khuẩn 42
  51. 2.1.1.2. Kiểm tra Mycoplasma Nguyên vật liệu Sinh phẩm và môi trường - Mẫu thử: Hộn nước nổi nuôi cấy tế bào - Môi trường PPLO lỏng - Môi trường PPLO thạch Dụng cụ - Pipét 1ml, 2ml, 5ml, 10 ml vô trùng - Pipet aid - Đèn cồn, cồn 700. - Quần áo, mũ, khẩu trang và găng tay vô trùng. Trang thiết bị - Hốt vô trùng - Tủ ấm 37 ± 10C - Kính hiển vi Các bước tiến hành Mẫu thử * Môi trường lỏng: cấy trực tiếp 0,2ml mẫu thử vào mỗi ống môi trường. Mỗi loạt mẫu thử cấy trên 5 ống môi trường lỏng. - Thể tích cấy: 0,2ml mẫu thử/ 1 ống môi trường. * Môi trường đặc: 0,2 ml mẫu thử/ 1 đĩa thạch. Mỗi loạt mẫu thử cấy trên 5 đĩa thạch. Dùng giấy parafilm bao quanh rìa đĩa thạch để tránh khô mặt thạch. Chứng môi trường 43
  52. - Chứng âm: để nguyên ống hoặc đĩa môi trường, không mở. - Chứng dưng: Lấy kết quả kiểm tra chất lượng môi trường làm chứng dương. Thời gian và nhiệt độ nuôi cấy - Nuôi cấy ở nhiệt độ 37 ± 10C trong 21 ngày. Cấy chuyển - Đến ngày thứ 7, cấy chuyển từ ống môi trường lỏng sang môi trường thạch: Hút 0,2 ml môi trường lỏng cấy vào 1 đĩa thạch. - Nuôi cấy ở nhiệt độ 37 ± 10C / 21 ngày. Theo dõi sau cấy - Môi trường PPLO (môi trường lỏng và thạch) sau cấy được theo dõi và ghi kết quả vào Nhật ký kiểm định vào các ngày 3, 5, 7, 14 và 21. - Đọc kết quả vào ngày thứ 21. + Môi trường lỏng: Quan sát sự đổi màu của môi trường. Nếu ống nào có sự chuyển màu (từ màu hồng nhạt chuyển sang màu vàng cam): cấy chuyển ra thạch để kiểm tra khuẩn lạc. + Môi trường đặc: Quan sát khuẩn lạc Mycoplasma mọc trên các đĩa thạch dưới kính hiển vi: khuẩn lạc nhỏ, vùng trung tâm khuẩn lạc có màu sẫm và dày, rìa khuẩn lạc mỏng và bẹt trông như quả trứng ốplết. Kết quả Giá trị của thử nghiệm - Loạt môi trường PPLO (lỏng và thạch) dùng cho thử nghiệm Mycoplasma phi đạt yêu cầu về kiểm tra chất lượng môi trường. Tiêu chuẩn chấp thuận 44
  53. - Mẫu thử: không có sự phát triển của Mycoplasma sau 21 ngày theo dõi trên cả 2 loại môi trường (lỏng và đặc). - Đối với ống chứng: . Chứng (-): Không có sự phát triển của Mycoplasma sau 21 ngày theo dõi. . Chứng (+): Có sự phát triển của Mycoplasma sau 21 ngày theo dõi. 2.1.1.3. Thử nghiệm kiểm tra các virút ngoại lai Nguyên vật liệu Dụng cụ - Chai nuôi cấy tế bào (25cm2) - Pipet 2ml, 5ml, 10ml Trang thiết bị - Kính hiển vi soi tế bào - Tủ ấm - Pipet Aid Hóa chất và môi trường - Tế bàoVERO - Tế bào HEp 2 - Tế bào thận thỏ - Môi trường nuôi cấy tế bào - MEM - Huyết thanh bào thai bê (FBS) - PBS (-) Các bước tiến hành 45
  54. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: Môi trường MEM chứa 2% FBS Chuẩn bị tế bào - Mỗi loại tế bào (HEp2, tế bào thận thỏ, tế bào VERO khác loạt với sản xuất) được nuôi cấy trong các chai nuôi cấy tế bào 25cm2, mỗi mẫu thử dùng 4 chai, mẫu chứng âm là 2 chai. Thử nghiệm phát hiện các tác nhân ngoại lai trên các dòng tế bào khác nhau * Mẫu thử: Hộn nước nổi nuôi cấy tế bào chứng. - Loại bỏ hết môi trường nuôi cấy trong các chai tế bào. Rửa tế bào 2 lần bằng PBS(-). - Cấy vào mỗi chai tế bào 3ml hộn nước nổi nuôi cấy tế bào. Cho thêm 9ml môi trường MEM 2% FBS vào mỗi chai. * Mẫu chứng âm: - Loại bỏ hết môi trường nuôi cấy trong các chai tế bào. Rửa tế bào 2 lần bằng PBS(-). - Cho vào mỗi chai 12ml môi trường nuôi cấy MEM 2% FBS. * Nuôi cấy: - Các chai tế bào đã gây nhiễm được nuôi cấy ở nhiệt độ 36OC±1OC trong 14 ngày, hàng ngày theo dõi tế bào và ghi kết quả vào Nhật ký kiểm định. Kết quả - Các chai tế bào chứng (mẫu chứng âm) phát triển bình thường, tế bào mọc kín một lớp, không có hiện tượng hủy hoại tế bào (CPE). - Không có CPE trong tất cả các chai tế bào đã gây nhiễm với hộn nước nổi nuôi cấy tế bào chứng. 46
  55. 2.1.2. Thử nghiệm kiểm tra các virút hấp phụ hồng cầu Nguyên vật liệu Dụng cụ - Pipet 10ml, 25ml Trang thiết bị - Kính hiển vi soi tế bào - Tủ lạnh - Pipet Aid Hóa chất và môi trường - Môi trường Hank - Dung dịch hồng cầu chuột lang 0,5% - Các chai tế bào chứng (75cm2) Các bước tiến hành Mẫu thử - Hút bỏ hết môi trường nuôi cấy trong các chai nuôi cấy tế bào chứng. - Cho 20ml dung dịch hồng cầu chuột lang 0,5% vào chai tế bào, láng đều. Mẫu chứng - Hút bỏ hết môi trường nuôi cấy trong các chai nuôi cấy tế bào chứng. - Cho 20ml môi trường Hank vào mỗi chai tế bào, láng đều. Nhiệt độ ủ - Ủ ở 2 nhiệt độ: 0- 4OC và 20 - 25OC. Thời gian ủ: 30 phút/khoảng nhiệt độ. Quan sát tế bào 47
  56. - Rửa tế bào 3 lần bằng môi trường Hank . - Quan sát tế bào dưới kính hiển vi soi tế bào. Kết quả Đọc kết quả - Dương tính: có hiện tượng hấp phụ hồng cầu: dưới kính hiển vi soi tế bào thấy các tế bào hồng cầu chuột lang bám vào lớp tế bào. - Âm tính: không có hiện tượng hấp phụ hồng cầu: dưới kính hiển vi soi tế bào không thấy các tế bào hồng cầu chuột lang bám vào lớp tế bào. Tiêu chuẩn chấp thuận - Không có hiện tượng hấp phụ hồng cầu trong các chai tế bào: Không có virút hấp phụ hồng cầu. 2.1.3. Kết quả quy trình nuôi cấy tế bào Vero trên chai tế bào một lớp Kết quả về tổng lượng tế bào thu được sau quá trình nhân nuôi tế bào Vero từ đời cấy chuyển 138 (cấy chuyển từ tế bào giống sản xuất đời 137) đến đời cấy chuyển 141 (cấy chuyển trước khi gây nhiễm virút) được trình bày trong Bảng 2.1. Bảng 2.1. Số lƣợng tế bào Vero thu đƣợc qua các đời cấy chuyển trong quá trình nhân nuôi trên chai nuôi cấy một lớp Đời cấy chuyển Số lƣợng tế bào Đời 138 1,4 x 107 Đời 139 9x107 Đời 140 5,5x108 Đời 141 3,5x109 48
  57. Theo kết quả trong Bảng 2.1, lượng tế bào tăng dần qua các đời nuôi cấy. Ở các đời cấy chuyển sau, lượng tế bào thường tăng gấp khoảng 6 lần so với đời nuôi cấy trước đó. Đây là lượng nhân nuôi tối đa đạt được đối với hầu hết các dòng tế bào thường trực [29], [32]. Quy trình này sẽ được áp dụng trong quá trình sản xuất thử nghiệm các loạt vắcxin ở quy mô phòng thí nghiệm. 2.2. QUY TRÌNH GÂY NHIỄM VIRÚT DẠI VÀO TẾ BÀO VERO Tế bào Vero đời 141 được tách và gây nhiễm với chủng virút dại trên các dạng chai nuôi cấy tế bào tế bào một lớp khác nhau. Phương pháp gây nhiễm là hấp phụ virút dại vào các tế bào Vero ở dạng hỗn dịch sau đó cấy chuyển vào các chai nuôi cấy tế bào và virút sẽ nhân lên cùng với quá trình nhân lên của tế bào. Do vậy, môi trường nuôi cấy tế bào được sử dụng trong quy trình này vẫn là môi trường phát triển của tế bào (MEM có chứa huyết thanh bào thai bê - FBS). Chủng giống virút dùng để gây nhiễm vào tế bào là loạt chủng giống -7,19 sản xuất WS-PV-010805. Chủng giống này có hiệu giá virút là 10 LD50/ml do vậy đạt được yêu cầu đối với chủng giống cho gây nhiễm sản xuất vắcxin -6,7 dại trên nuôi cấy tế bào Vero (không được thấp dưới 10 LD50/ml [30]. Trong quy trình gây nhiễm này, liều lượng virút gây nhiễm sẽ được khảo sát để tìm ra liều gây nhiễm (MOI) tối ưu cho hiệu giá virút cao đồng thời duy trì được sự phát triển của tế bào với mục tiêu thu hoạch được nhiều mẻ gặt đơn nhằm tiết kiệm tối đa môi trường, tế bào, virút và nhân công. Dựa vào đặc tính gây hủy hoại tế bào chậm của virút dại, các nhà sản xuất thường nghiên cứu tìm ra các điều kiện để kéo dài tối đa quá trình phát triển của tế 49
  58. bào với mong muốn có được số mẻ gặt đơn có hiệu giá virút đạt yêu cầu cho sản xuất cao nhất [30], [31]. Kết quả nghiên cứu về liều lượng gây nhiễm của virút dại trên nuôi cấy tế bào Vero được trình bày trong Bảng 2.2. Nghiên cứu này khảo sát 3 liều gây nhiễm (MOI) khác nhau là 0,1; 0,01 và 0,001. Liều lượng này được tính theo số đơn vị hiệu giá LD50 của virút dại trên một tế bào. Tế bào và nước nổi nuôi cấy sẽ được theo dõi và đánh giá trong vòng 9 ngày sau gây nhiễm để tìm ra đỉnh hiệu giá virút và mức độ duy trì của tế bào. Trong 6 ngày đầu tiên với mục đích tìm hiểu đỉnh hiệu giá virút nên môi trường được sử dụng sẽ là môi trường nuôi cấy có huyết thanh để đảm bảo cho tế bào luôn có được điều kiện dinh dưỡng tốt. Từ ngày thứ 6 trở đi, chuyển sang môi trường không có huyết thanh (môi trường sẽ được sử dụng để nhân nuôi và thu hoạch virút) để đánh giá mức độ duy trì của tế bào trong môi trường này. Tế bào Vero nuôi cấy được theo dõi hàng ngày bằng kính soi tế bào và hiệu giá virút trong nước nổi nuôi cấy được xác định bằng thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang phát hiện nucleocapsit của virút dại tính theo số đơn vị FFD50/0,05 ml(xem Phần 2.3 - Quy trình nuôi cấy virút và thu hoạch nước nổi) . Bảng 2.2. Kết quả nuôi cấy virút dại với các liều gây nhiễm khác nhau Ngày sau Liều gây nhiễm gây nhiễm 0,1 MOI 0,01 MOI 0,001 MOI Ngày 1 10-1,5 - - 50
  59. Ngày 2 10-2,3 - - Ngày 3 10-3,58 10-1,25 - Ngày 4 10-3,27 10-2,58 10-1,55 Ngày 5 10-3,16 10-3,82 10-2,15 Ngày 6 (thay môi trƣờng) 10-3,02 10-4,02 10-2,67 Ngày 7 10-1,05 10-2,32 10-2,02 51
  60. Ngày 8 10-1,15 10-3,12 10-2,65 Ngày 9 10-1,08 10-3,85 10-3,01 Kết quả trong Bảng 2.2 cho thấy ở liều gây nhiễm cao nhất (0,1 MOI), tế bào bị hủy hoại sớm từ ngày thứ 3 sau gây nhiễm và hiệu giá virút đã đạt đỉnh ngay vào thời điểm này. Vào những ngày tiếp theo ngay cả khi được thay sang môi trường duy trì, hiệu giá virút vẫn rất thấp không đạt được yêu cầu cho sản xuất vắcxin. Ngược lại, ở liều gây nhiễm thấp nhất (0,001 MOI), tế bào hầu như không bị hủy hoại nhưng hiệu giá virút luôn ở mức thấp và chỉ bắt đầu tăng lên vào ngày thứ 6. Khi thay sang môi trường duy trì, hiệu giá virút cũng chưa đạt được đỉnh sau 3 ngày nuôi cấy. Ở liều gây nhiễm trung bình (0,01 MOI), hiệu giá virút tăng cao sau 4-5 ngày nuôi cấy ở môi trường phát triển của tế bào (có huyết thanh) và khi thay sang môi trường duy trì tế bào (không huyết thanh) hiệu giá virút lại tiếp tục tăng sau 3 ngày nuôi cấy đồng thời tình trạng tế bào vẫn duy trì tốt trong 9 ngày theo dõi. Liều gây nhiễm này phù hợp với quá trình sản xuất do luôn tạo được đỉnh hiệu giá virút đạt yêu cầu sau từ 3-4 ngày nhân nuôi ở môi trường duy trì tế bào. Kết quả này cũng sẽ được khẳng định rõ rệt hơn trong các nghiên cứu tiếp theo ở Phần 2.3 - Quy trình nuôi cấy virút và thu hoạch nước nổi. Nghiên cứu của nhiều tác giả trên thế giới cũng cho thấy việc duy trì tế bào và tạo các đỉnh hiệu giá virút sau các lần thay môi trường duy trì đã tạo nên một quá trình 52
  61. nhân nuôi và thu hoạch virút dại được tiến hành với nhiều mẻ gặt đơn nước nổi nuôi cấy có hiệu giá virút cao [18], [19], [30]. Điều này giúp tiết kiệm tế bào, chủng giống virút, môi trường, giá thể nuôi cấy và nhân công. Trong mỗi quá trình nhân nuôi virút dại sẽ có từ 5-6 mẻ gặt đơn được thu hoạch [30]. Như vậy, liều gây nhiễm 0,01 MOI cho kết quả khả quan nhất sẽ được tiếp tục lựa chọn để nghiên cứu cũng như sản xuất thử nghiệm vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero trong các giai đoạn nghiên cứu tiếp theo. 2.3. QUY TRÌNH NUÔI CẤY VIRÚT VÀ THU HOẠCH NƢỚC NỔI Sau khi gây nhiễm, virút dại sẽ nhân lên trong tế bào Vero sau đó giải phóng ra nước nổi. Quá trình thu hoạch nước nổi nuôi cấy tế bào sẽ thu được virút dại và đây sẽ là nguyên liệu để tinh chế thành vắcxin. Trong quá trình ban đầu khi virút nhân lên cùng với tế bào Vero, môi trường được sử dụng vẫn là môi trường phát triển tế bào có chứa huyết thanh động vật. Nước nổi này sẽ không được sử dụng trong các công đoạn tiếp theo của quy trình sản xuất vắcxin. Chi nước nổi nuôi cấy tế bào thu được khi sử dụng môi trường không chứa huyết thanh mới là nguyên liệu để tiếp tục sản xuất ra vắcxin. Do vậy mục đích của các nghiên cứu trong quy trình này là nhằm tìm ra các điều kiện tối ưu để duy trì sự phát triển của virút dại trên tế bào Vero trong môi trường không có huyết thanh. - Các thông số được khảo sát để xác định điều kiện nuôi cấy virút tối ưu bao gồm: thời gian gặt, số mẻ gặt đơn thích hợp, thời điểm thay môi trường duy trì tế bào và loại chai tế bào một lớp dùng để nuôi cấy tế bào. - Kết quả của quá trình nuôi cấy virút sẽ được đánh giá bằng các phương pháp xác định hiệu giá virút dại. Các phương pháp này bao gồm: 53
  62. 2.3.1. Các phƣơng pháp xác định hiệu giá virút dại 2.3.1.1. Thử nghiệm xác định hiệu giá virút dại trên chuột (LD50/ml) Nguyên vật liệu và trang thiết bị Nguyên vật liệu - Chủng virút Dại cố định: + Chủng sản xuất PV 20% + Chủng virút thử thách CVS 20% - Các mẫu virút dại trước bất hoạt - Dung dịch pha loãng - Chuột nhắt 3-4 tuần tuổi (13-16g) Trang thiết bị - Pipetman 1000l và đầu côn - Ống nghiệm eppendorf 2ml - Bơm tiêm 0,3 ml - Máy lắc. - Tủ ấm 37OC. - Máy ly tâm - Ống nghiệm nhựa 15ml vô trùng - Găng cao su vô trùng - Nhãn dán lồng chuột 54
  63. Tiến hành Pha loãng mẫu thử Pha chủng - Lấy 8 ống nghiệm và ghi ký hiệu từ 1 đến 8, xếp theo thứ tự vào giá đựng ống nghiệm. - Dùng pipet nhựa loại 5ml vô trùng để hút dung dịch pha loãng. - Dùng pipetman 1000l với đầu côn để hút chủng virút dại. - Chủng kiểm tra được pha loãng bậc 10 từ10-1 đến 10-8 - Mỗi độ pha sau khi pha xong, trước khi chuyển sang độ pha tiếp theo phải được lắc kỹ trên máy lắc và thay đầu côn của pipetman. - Sau mỗi độ pha loãng để ngay ống nghiệm đã pha vào hộp có đá lạnh. Pha mẫu virút dại trước bất họat - Mẫu thử nghiệm được pha loãng bậc 10 từ từ10-1 đến 10-6 Đối với chủng PV: Dùng 4 độ pha loãng: 10-4, 10-5, 10-6 và 10-7. Đối với chủng CVS: Dùng 4 độ pha loãng: 10-5, 10-6, 10-7 và 10-8. Đối với mẫu virút dại trước bất hoạt: Dùng 4 độ pha loãng: 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6 Gây nhiễm cho chuột và theo dõi - Dùng 1 bơm tiêm. Tiêm từ độ pha loãng cao nhất đến độ pha loãng thấp nhất. - Mỗi độ pha loãng dùng 10 chuột, mỗi chuột tiêm 0,03ml vào não. 55
  64. - Theo dõi chuột đã được gây nhiễm virút dại trong vòng 14 ngày. Hàng ngày ghi số chuột chết hoặc liệt. Chỉ ghi nhận số chuột liệt chết từ ngày thứ 5, những chuột chết trước đó không được tính trong tổng số chuột. - Hình ảnh chuột liệt do chủng virút dại cố định PV được trình bày trong Hình 2.3. Hình 2.3. Hình ảnh chuột liệt do chủng virút dại cố định PV Kết quả Tính kết quả - Tính số chuột chết trên tổng số chuột của mỗi nhóm chuột. - Kết quả được tính theo phương pháp Reed – Muench. * Công thức : 50 a Lg(1/ LD50 ) = Lg(1/ A) - x k b a Trong đó: A: độ pha loãng của chủng gây chết ngay sát dưới 50% . a: % chuột chết ngay sát dưới 50% b: % chuột chết ngay sát trên 50% k =1 (logarit của hệ số pha loãng bậc 10) 56
  65. Tiêu chuẩn chấp thuận -4,5 - Hiệu giá của chủng PV phải đạt từ 10 LD50/ml trở lên 2.3.1.2. Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang phát hiện nucleocapsit của virút dại (FFD50/0,05 ml) Nguyên vật liệu và trang thiết bị Dụng cụ - Phiến Teflon 8 giếng - Bản kính đậy phiến - Hộp lồng 15 cm để ủ phiến - Phiến 96 giếng để pha loãng huyết thanh mẫu và huyết thanh chứng - Đầu côn: 20-1000 l - Giấy thấm. - Ống ly tâm 1,5 ml Trang thiết bị - Pipet nhiều kênh - Pipetman 20-1000 l - Tủ ấm 37C - Cóng rửa phiến - Kính hiển vi soi tế bào - Kính hiển vi huỳnh quang - Tủ lạnh 57
  66. Vật liệu và hóa chất - Chai tế bào Vero - MEM 10% FBS - Dung dịch Trysin 0,25% - Mẫu virut dại trước bất hoạt - Dung dịch PBS - Dung dịch đệm phủ phiến - Dung dịch cộng hợp thỏ kháng nucleocapsit của virút dại gắn huỳnh quang - Aceton lạnh - Nước pha tiêm Tiến hành Lập sơ đồ phiến - Trên mỗi bản sơ đồ phiến có 1 phiến chứng dương (mẫu virút dại đã biết hiệu giá) và 1 phiến chứng âm (phiến chứng tế bào không gây nhiễm virút). Chuẩn bị tế bào Vero - Từ chai tế bào Vero 75cm2 đã nuôi cấy 3 ngày trong môi trường MEM-10, tách tế bào và tạo khoảng 10 ml hỗn dịch tế bào. - Đếm số lượng tế bào có trong hỗn dịch. - Từ kết quả thu được pha loãng hỗn dịch tế bào để đạt được nồng độ 106 tế bào/ml. Pha loãng mẫu thử - Mẫu thử được pha loãng bậc 10 từ 10-1 đến 10-4 58
  67. Ủ mẫu thử với tế bào Vero - Nhỏ 50 μl các mẫu thử đã pha loãng vào từng giếng. Các giếng ở phiến chứng tế bào nhỏ 50 μl môi trường MEM 10% FBS. - Thêm vào từng giếng trên các phiến 100 μl hỗn dịch tế bào đã pha loãng. - Ủ tất cả các phiến trong hộp lồng có giấy thấm được làm ẩm ở nhiệt độ 370C trong 20 giờ. Cố định virút - Đổ hết nước nổi có ở các giếng trên các phiến. - Nhúng phiến trong cóng đựng dung dịch PBS sau đó nhúng tiếp vào cóng đựng acetone lạnh. - Vớt phiến ra và để khô tự nhiên. Nhuộm phiến - Nhỏ dung dịch cộng hợp thỏ kháng nucleocapsit của virút dại gắn huỳnh quang vào từng giếng trên các phiến. - Ủ tất cả các phiến trong hộp lồng có giấy thấm được làm ẩm ở nhiệt độ 370C trong 30 phút. Rửa phiến - Đổ hết nước nổi có ở các giếng trên các phiến. - Rửa phiến bằng dung dịch PBS. - Để khô phiến. Phủ phiến - Nhỏ dung dịch đệm phủ phiến vào từng giếng. - Đậy phiến bằng bản kính. 59
  68. Đọc bản phiến - Soi phiến dưới kính hiển vi huỳnh quang ở vật kính 20x và ghi kết quả vào phiếu ghi sơ đồ phiến. Mỗi giếng trên phiến sẽ được soi lần lượt từng vi trường cho hết toàn bộ diện tích của giếng. Vi trường nhiễm là vi trường soi thấy hình ảnh virút dại bắt màu xanh huỳnh quang trên nền tế bào Vero có màu đỏ (Hình 2.4). Hình 2.4. Hình ảnh nhiễm virút dại vào tế bào Vero dƣới kính hiển vi huỳnh quang Tính kết quả - Tính số vi trường nhiễm trên tổng số vi trường được soi trong mỗi giếng. - Kết quả được tính theo phương pháp Reed – Muench. * Công thức : 50 a Lg(1/ FFD50 ) = Lg(1/ A) - x k b a Trong đó: A: độ pha loãng của mẫu có mức độ nhiễm ngay sát dưới 50%. a: % vi trường nhiễm ngay sát dưới 50% b: % vi trường nhiễm ngay sát trên 50% k =1 (logarit của hệ số pha loãng bậc 10) 60
  69. Giá trị của thử nghiệm và tiêu chuẩn chấp thuận - Mẫu chứng tế bào phải cho kết quả âm tính -1,5 - Hiệu giá của chủng PV phải đạt từ 10 FFD50/0,05 ml trở lên 2.2.1.3. Thử nghiệm ELISA định lượng kháng nguyên glycoprotein của virút dại (EL.U/ml) Nguyên lý - Thử nghiệm áp dụng theo nguyên lý của thử nghiệm ELISA gián tiếp phát hiện kháng nguyên glycoprotein của virút dại [37]. - Trước tiên, các giếng phản ứng được gắn bản bằng kháng thể đa dòng ngựa kháng virút dại. Kháng nguyên trong mẫu thử sẽ kết hợp với kháng thể gắn bản sau đó tiếp tục gắn kết với kháng thể đơn dòng chuột kháng glycoprotein của virut dại. Phức hợp này sẽ được phát hiện bởi cộng hợp dê kháng IgG chuột có gắn peroxidase và cho hiện màu bằng cơ chất. - Đây là thử nghiệm in-house sử dụng trong quy trình sản xuất vắcxin dại nên đơn vị được tính theo EL.U/ml với mẫu chuẩn được xây dựng dựa trên mẫu chuẩn quốc tế đã biết hàm lượng glycoprotein của virút dại [25]. Thử nghiệm này khá đặc hiệu với chủng virút dại sản xuất do sử dụng kháng thể chuột đơn dòng kháng chính glycoprotein của virút dại chủng PV (clone 1C5) nên cũng sẽ được coi là thử nghiệm nhận dạng đối với vắcxin dại cho cả các mẫu sản phẩm bất hoạt và chưa bất hoạt virút. Nguyên vật liệu và trang thiết bị Vật liệu - Phiến gắn bản 8 giếng - Giá gắn bản 61
  70. - Falcon 50 ml - Pipet 5ml, 10ml, 25 ml. - Pipet aid - Pipet man 1μl, 10μl, 100μl, 200μl, 1000μl. - Pipet nhiều kênh - Đầu côn 10μl, 100μl, 200μl, 1000μl. - Chứng âm (môi trường nuôi cấy virút hoặc PBS) - Chứng dương (Mẫu chuẩn và vắcxin Verorab). - Kháng thể đa dòng ngựa kháng dại (PAb). - Kháng thể đơn dòng chuột kháng dại (MAb) clone 1C5 - Cộng hợp dê kháng IgG chuột. Hóa chất - Dung dịch đệm gắn bản - Dung dịch blocking sau gắn bản - Dung dịch rửa - Dung dịch pha loãng mẫu - Dung dịch pha loãng cộng hợp - Dung dịch đệm cơ chất - Dung dịch cơ chất - Dung dịch ngừng phản ứng 62
  71. Mẫu thử - Tất cả các bán thành phẩm trong quy trình sản xuất vắcxin dại như bán thành phẩm các mẻ gặt đơn virút dại, bán thành phẩm tinh sạch, bán thành phẩm bất hoạt và các bán thành phẩm cô đặc và tinh chế. Trang thiết bị - Máy rửa bản ELISA - Máy trộn - Hốt vô trùng - Máy đọc bản ELISA Tiến hành Gắn bản - Gắn bản kháng thể đa dòng ngựa kháng dại (PAb) đã được pha trong dung dịch đệm gắn bản. Ủ bản ở 37oC trong 3 giờ. - Rửa và đập khô bản phiến. - Cho dung dịch blocking vào mỗi giếng. Ủ bản ở 37oC trong 30 phút. - Rửa và đập khô phiến. - Dán phiến và bảo quản ở -20oC cho đến khi sử dụng. Chạy ELISA - Viết sơ đồ phiến - Lấy phiến ra từ tủ bảo quản, để 5 phút ở nhiệt độ phòng. Lấy số dãy giếng vừa đủ cho xét nghiệm. - Pha loãng mẫu chuẩn và mẫu thử theo 4 độ pha loãng từ 1/5; 1/25; 1/125; 1/625. 63
  72. - Nhỏ các mẫu đã pha loãng vào các giếng thử. Dán và ủ phiến ở 370C trong 1 giờ. - Rửa phiến bằng dung dịch rửa. Đập khô phiến. - Pha kháng thể đơn dòng (MAb) chuột kháng glycoprotein của virút dại - Nhỏ kháng thể đơn dòng đã được pha vào mỗi giếng. Dán và ủ phiến ở 370C trong 1 giờ. - Rửa phiến bằng dung dịch rửa. Đập khô phiến. - Pha dung dịch cộng hợp dê kháng IgG chuột có có gắn peroxidase. - Nhỏ dung dịch cộng hợp vào các giếng. Dán và ủ phiến ở 370C trong 30 phút. - Rửa phiến bằng dung dịch rửa. Đập khô phiến. - Pha chất hiện mầu và nhỏ vào các giếng. - Để phiến tại chỗ tối ở nhiệt độ phòng trong 5-10 phút. - Dừng phản ứng bằng dung dịch dừng phản ứng. - Đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 450/620 nm trên máy đọc ELISA. Kết quả Tính kết quả - Dựng đường chuẩn: Căn cứ vào OD và hàm lượng glycoprotein tương ứng ở mỗi độ pha loãng của các mẫu chuẩn, sử dụng chương trình Excel, xây dựng nên phương trình hồi quy tuyến tính thực nghiệm (phương trình đường chuẩn) y = ax + b. Dựa theo phương trình đường chuẩn tính ra hàm lượng glycoprotein của virut dại trong các mẫu thử. *Công thức: 64
  73. 1 Y y *d * y *d *20 0,05 Trong đó: Y: hàm lượng glycoprotein của mẫu thử tính trong 1 ml (EL.U/ml) d : độ pha loãng mẫu y : Hàm lượng glycoprotein của mẫu thử trong thử nghiệm ELISA tính theo mẫu chuẩn (EL.U) với phương trình đường chuẩn y = ax + b x: OD đo được tương ứng với từng hàm lượng glycoprotein. a, b: Hệ số của phương trình đường chuẩn. Giá trị của thử nghiệm - Thử nghiệm có giá trị khi: Giá trị OD của chứng âm ở các độ pha loãng khác nhau nhỏ hơn 0,15. Giá trị OD của chứng dương ở độ pha loãng 1/5 lớn hơn 0,5. 2.3.2. Kết quả nuôi cấy virút dại theo các điều kiện nhân nuôi khác nhau Các thông số khác nhau của điều kiện nhân nuôi chủng virút dại giống sản xuất PV được nghiên cứu. Kết quả thu được sẽ là căn cứ để xây dựng nên quy trình nhân nuôi virút và thu hoạch nước nổi. Đây là một công đoạn rất quan trọng trong quá trình sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào. Hiệu giá virút thu hoạch được sẽ quyết định đến hiệu suất của toàn bộ quá trình sản xuất vắcxin dại sau này. 2.3.2.1. Kết quả nuôi cấy virút dại theo ngày sau gây nhiễm virút vào tế bào Nghiên cứu được tiến hành với mục đích tìm ra thời điểm thu hoạch virút cũng như xác định số mẻ gặt đơn thu được trong quá trình nhân nuôi 65
  74. virút dại trên tế bào Vero. Tế bào và nước nổi nuôi cấy tế bào được theo dõi và xác định hiệu giá virút hàng ngày sau khi gây nhiễm virút vào tế bào Vero. Trong 3 ngày đầu tiên, môi trường sử dụng là môi trường phát triển tế bào có chứa huyết thanh, vào những ngày tiếp theo, môi trường duy trì tế bào không chứa huyết thanh sẽ được thay thế để nhân nuôi và thu hoạch virút dại cho sản xuất. Bảng 2.3. Kết quả nuôi cấy virút dại theo ngày sau gây nhiễm virút vào tế bào Ngày 3 (thay môi Ngày 1 Ngày 2 trƣờng duy trì tế bào) -4,5 <10 LD50/ml 10-1,78 FFD50/0,05 ml Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 -6,0 -6,0 -6,75 10 LD50/ml 10 LD50/ml 10 LD50/ml 10-2,86 FFD50/0,05 ml 10-2,71 FFD50/0,05 ml 10-3 FFD50/0,05 ml 1,28 EL.U/ml 1,67 EL.U/ml 2,58 EL.U/ml Ngày 9 (thay Ngày 7 Ngày 8 môi trƣờng -5,875 -5,333 duy trì -5,962 10 LD50/ml 10 LD50/ml tế bào) 10 LD50/ml 10-2,71 FFD50/0,05 ml 10-2,89 FFD50/0,05 ml 10-3,19 FFD50/0,05 ml 3,61 EL.U/ml 3,92 EL.U/ml 4,36 EL.U/ml 66
  75. Ngày 10 Ngày 11 Ngày 12 -5,125 -5,875 -5,875 10 LD50/ml 10 LD50/ml 10 LD50/ml 10-2,89 FFD50/0,05 ml 10-3,71 FFD50/0,05 ml 10-3,94 FFD50/0,05 ml 2,12 EL.U/ml 3,12 EL.U/ml 4,87 EL.U/ml Ngày 13 (thay môi Ngày 14 Ngày 15 trƣờng duy trì 10-6,125 LD /ml tế bào) 50 10-3,25 FFD50/0,05 ml 10-3 FFD50/0,05 ml 10-3,4 FFD50/0,05 ml 5,31 EL.U/ml Ngày 16 (thay môi Ngày 17 Ngày 18 trƣờng duy trì -6,0 tế bào) 10 LD50/ml 10-3,13 FFD50/0,05 ml 10-2,13 FFD50/0,05 ml 10-3 FFD50/0,05 ml 5,78 EL.U/ml Ngày 20 (thay Ngày 19 môi Ngày 21 trƣờng -5,0 duy trì -5,67 10 LD50/ml tế bào) 10 LD50/ml 10-3,17 FFD50/0,05 ml 10-3,4 FFD50/0,05 ml 10-2,19 FFD50/0,05 ml 4,82 EL.U/ml 5,12 EL.U/ml 67
  76. Ngày 22 Ngày 23 Ngày 24 -4,5 10 LD50/ml 10-2,08 FFD50/0,05 ml 10-1,58 FFD50/0,05 ml 10-1,54 FFD50/0,05 ml 3,66 EL.U/ml Theo bảng 2.3, hiệu giá virút đạt đỉnh sau từ 3-4 ngày nuôi cấy trong môi trường duy trì tế bào và đến ngày thứ 24 tế bào đã bị hủy hoại hoàn toàn. Như vậy, khoảng thời gian nuôi cấy cho mỗi mẻ gặt đơn virút và thay môi trường để duy trì tế bào là 3 ngày và số lần thu hoạch tối đa sẽ có được là 6 mẻ gặt đơn trong cả quá trình nuôi cấy virút này. Hiệu giá virút xác định theo phương pháp miễn dịch huỳnh quang sẽ được lựa chọn là phương pháp theo dõi hiệu giá virút của các mẻ gặt đơn do đơn giản, dễ thực hiện, dễ đọc kết quả và không tốn thời gian theo dõi. Hiệu giá virút xác định theo phương pháp ELISA cũng là một thông số có thể tham khảo. Tuy nhiên, phương pháp này có giá trị hơn khi áp dụng để tính hiệu suất của toàn bộ quá trình sản xuất vắcxin do có thể xác định được hiệu giá virút trong cả mẫu thử virút sống lẫn mẫu thử virút đã bất hoạt [17], [44]. Tiêu chuẩn để mỗi mẻ gặt đơn đạt yêu -4,5 cầu cho sản xuất phải có được hiệu giá virút dại ít nhất là 10 LD50/ml khi thử nghiệm tiêm trên chuột hoặc 10-1,5 FFD50/0,05 ml khi thử nghiệm theo phương pháp miễn dịch huỳnh quang và 1,5 EL.U/ml khi thử nghiệm theo phương pháp ELISA. 68