Khóa luận Nghiên cứu sơ bộ thành phần hoá học và tác dụng kháng khuẩn invitro của vị thuốc bạch cập

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu sơ bộ thành phần hoá học và tác dụng kháng khuẩn invitro của vị thuốc bạch cập

1. BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y Khóa luận tốt nghiệp NGHIÊN CỨU SƠ BỘ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN INVITRO CỦA VỊ THUỐC BẠCH CẬP Cán bộ hướng dẫn: TS Triệu Duy Điệt
2. Nội dung của khoá luận gồm 5 phần •Đặt vấn đề •Tổng quan •Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu •Kết quả và bàn luận •Kiến nghị
3. Đặt vấn đề • Vị bạch cập (Rhizoma Bletillae) là thân rễ phơi hay sấy khô của cây bạch cập Bletilla striata (Thunb) Reichb.f, họ Lan (Orchidaceae), được dùng để điều trị một số bệnh theo kinh nghiệm dân gian như chảy máu cam, nôn ra máu, đau mắt đỏ, mụn nhọt sưng tấy và bỏng lửa. • Một số tác giả đã nghiên cứu trong vị bạch cập có chất nhầy (khoảng 55%), một ít tinh dầu và các hoạt chất khác chưa rõ. Tuy nhiên, thành phần hoá học và tác dụng kháng khuẩn của vị thuốc này vẫn chưa có tài liệu nào đề cập một cách cụ thể.
4. Đặt vấn đề • Với mục đích tìm hiểu sâu hơn về thành phần hoá học cũng như các tác dụng sinh học nói chung và tác dụng kháng khuẩn nói riêng, nhằm phục vụ cho việc sử dụng bạch cập trong công tác điều trị một cách khoa học hơn. • Chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu sơ bộ thành phần hoá học và tác dụng kháng khuẩn invitro của vị thuốc bạch cập” với mục tiêu: – Xác định sơ bộ thành phần hoá học của vị thuốc bạch cập. – Đánh giá tác dụng kháng khuẩn invitro của dịch chiết nước vị bạch cập.
5. Chương 1: Tổng quan 1.1 Đặc điểm thực vật cây bạch cập (Hình 1.1)
6. 1.3 Thành phần hoá học Bạch cập Chất Tinh Flavonoid Phytosterol nhầy dầu
7. 1.4 Tác dụng và công dụng • Tính vị: Vị đắng, tính bình. • Quy kinh: Phế. • Tác dụng: Bổ phế sinh cơ, hoá ứ, chỉ huyết, sát trùng giải độc. • Chủ trị: Thổ ra máu, máu cam, chữa tà khí vào dạ dày, chứng huyết lỵ, nhiệt sang lâu khỏi. • Liều dùng: 4 – 12g dạng bột hay sắc.
8. Chương 2: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1 Nguyên vật liệu • Nguyên liệu: Vị bạch cập nhập từ Trung Quốc (Rhizoma Bletillae). • Dung môi và hoá chất tinh khiết. • Trang thiết bị và dụng cụ: Tủ sấy, tủ hốt, máy soi huỳnh quang, máy đo phổ tử ngoại Cintra 40 (Australia) • Các chủng vi khuẩn: – Staphylococcus aureus – Pseudomonas aeruginosa – Escherichia coli – Bacillus subtilis
9. 2.2 Phương pháp nghiên cứu • Phương pháp nghiên cứu hoá học: – Phân tích sơ bộ các nhóm hợp chất có trong dược liệu theo phương pháp của trường Đại học Dược khoa Rumani. – Định tính các nhóm hợp chất bằng các phản ứng hoá học. – Định tính các nhóm hợp chất trong dược liệu bằng sắc kí lớp mỏng. – Chiết xuất flavonoid trong vị bạch cập bằng cồn 90°. – Tinh chế flavonoid theo phương pháp sắc kí lớp chế hoá.
10. – Sơ bộ nhận dạng flavonoid bằng sắc kí lớp mỏng và phổ tử ngoại. – Đánh giá sơ bộ chất nhầy trong vị bạch cập theo phương pháp trương nở (Dược điển Pháp 1972). – Định lượng chất nhầy theo phương pháp cân (Dược điển Việt Nam 2002). – Thủy phân chất nhầy bằng acid sulfuric 2N đun nóng. – Định tính các monosaccharid trong chất nhầy sau thủy phân bằng sắc kí giấy.
11. 2.2 Phương pháp nghiên cứu • Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn: – Xác định tính kháng khuẩn theo phương pháp thạch lỗ. – Xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn theo phương pháp pha loãng.
12. 2.3 Xử lý số liệu • Theo phương pháp thống kê y học.
13. Chương 3: Kết quả và bàn luận 3.1 Kết quả nghiên cứu thành phần hoá học 3.1.1 Định tính sơ bộ thành phần hoá học vị bạch cập
14. Chiết xuất (Hình 3.1) Bét b¹ch cËp DÞch chiÕt ChiÕt b»ng ether ethylic trong dông ether ethylic cô Soxhlet liªn tôc trong 8 giê Bét dîc liÖu ®· bay h¬i ether ethylic DÞch chiÕt ChiÕt b»ng ethanol 900 trong dông ethanol 900 cô Soxhlet liªn tôc trong 8 giê Bét dîc liÖu ®· bay h¬i ethanol 900 DÞch chiÕt níc ChiÕt b»ng dung dÞch HCl 1% B· dîc liÖu bá ®i
15. Kết quả định tính (Bảng 3.1) Tên nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận sơ bộ DC ether DC cồn DC nước Antraquinon Với dd KOH 10% Không có Flavonoid Cyanidin Có Chất béo Vết dầu béo trên giấy Không có Alcaloid TT chung của alcaloid Không có Tinh dầu Cặn có mùi thơm Có Caroten H2SO4 đậm đặc Không có Phytosterol Lierbermann Có Tanin Với dd FeCl3 + Na acetat Không có Acid hữu cơ Với Na2CO3 Không có Đường khử Fehling A, B Có Anthocyanozid H2SO4 đậm đặ Không có NaOH Protid Acid nitric đặc Không có Chất nhầy Chì acetat Có
16. 3.1.2 Định tính các hợp chất bằng sắc kí lớp mỏng Định tính flavonoid: • Chất thử: Dịch chiết cồn của bột bạch cập, thu hồi cồn, hoà tan trong nước nóng và lọc. Chiết bằng ethyl acetat, bốc hơi ethyl acetat, hoà tan cắn trong một ít cồn 90° được dịch chấm sắc kí. • Hệ dung môi: Ethyl acetat – acid formic – H2O (8:1:1). • Chiều cao chạy là 12,7 cm. • Thuốc thử hiện màu: dung dịch AlCl3 2% trong methanol.
17. 3.1.2 Định tính các hợp chất bằng sắc kí lớp mỏng Định tính phytosterol: • Chất thử: Dịch chiết ether bột bạch cập, cô cạn, hoà tan cắn bằng cồn 90°. • Hệ dung môi: Cloroform – aceton (8:2). • Chiều cao chạy là 12,2 cm. • Thuốc thử hiện màu: dung dịch H2SO4 20%.
18. 3.1.2 Định tính các hợp chất bằng sắc kí lớp mỏng Định tính tinh dầu: • Chất thử: Dịch chiết ether bột bạch cập. • Hệ dung môi: Ether dầu – ether ethylic (95:5). • Chiều cao chạy là 12,8 cm. • Thuốc thử hiện màu: dung dịch Vanilin – H2SO4 mới pha.
19. 3.1.3 Tinh chế flavonoid (chất F1) • Chiết xuất Bột bạch cập Chiết bằng ethanol trong dụng (Hình 3.5) cụ Soxhlet đun liên tục trong 8 Dịch chiết cồn giờ Thu hồi cồn Cặn Hoà trong 20ml nước nóng Lọc Chiết bằng ethyl acetat Dịch chiết ethyl acetat Thu hồi ethyl acetat Cặn Hoà trong 5ml methanol Dịch chấm sắc kí
20. Tinh chế F1 bằng phương pháp sắc kí lớp chế hoá • Nhận dạng F1 bằng phản ứng hoá học (Bảng 3.2) Chất thử Phản ứng định tính Màu sắc Kết quả Dịch chiết F1 Cyanidin Đỏ thẫm ++ Dịch chiết F1 Diazoni Vàng cam ++ Dịch chiết F1 FeCl3 Xanh ++ Dịch chiết F1 NaOH Vàng cam ++ Dịch chiết F1 H2SO4 đặc Đỏ cam ++
21. • Nhận dạng F1 bằng sắc kí lớp mỏng: Chạy sắc kí lớp mỏng với 3 hệ dung môi: - Hệ 1: Ethyl acetat – acid formic – H2O (8:1:1). - Hệ 2: Benzen – pyridin – acid formic (36:9:5). - Hệ 3: Cloroform – methanol – acid acetic(7:1:1).
22. • Phổ tử ngoại F1 (Hình 3.7) 4.0 Abs 211.8 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 277.5 1.0 0.5 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 QUANG PHO nm
23. 3.1.4 Đánh giá sơ bộ chất nhầy trong vị bạch cập (Bảng 3.3) Mẫu Thể tích (V ml) V - Vtb (V – Vtb)² 1 11,00 0,40 0,16 2 11,00 0,40 0,16 3 12,00 0,60 0,36 SD = 0,54 4 11,00 0,40 0,16 5 12,00 0,60 0,36  57,00 1,20 Vtb 11,40 Chỉ số nở: 11,40 0,54 ml
24. 3.1.5 Định lượng chất nhầy trong bạch cập (Bảng 3.4) Mẫu M(g) m(g) X(%) 1 1,0000 0,5508 55,081 2 1,0020 0,5513 55,020 3 1,0001 0,5498 54,983 SD = 0,064 4 1,0032 0,5526 55,104 5 1,0040 0,5516 54,952  275,140 Xtb 55,028 Hàm lượng chất nhầy: 55,028 0,064 %
25. 3.1.6 Phân tích chất nhầy trong bạch cập • Chiết Bột bạch cập xuất + H2O (Hình 3.8) Đun cách thủy Dịch lọc + Cồn Lọc Tủa Bốc hơi cồn Hoà tan trong H2SO4 2N Dịch acid + Ba(OH)2 đến pH = 7 Dịch thủy phân chất nhầy
26. Định tính monosaccharid trong dịch thủy phân bằng sắc kí giấy: • Chất hấp phụ: giấy Wathman số 1. • Chất chuẩn: dung dịch glucose 50%. • Chất thử: dịch thủy phân chất nhầy. • Hệ dung môi: n butanol – acid acetic – H2O (4:1:5, phần trên). • Chiều cao chạy là 21,7 cm. • Thuốc thử hiện màu: dung dịch AgNO3 0,1 N / amoniac 10% (1:1).
27. 3.2 Kết quả nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn 3.2.1 Xác định độ kháng khuẩn • Dịch chiết nước 3/1 bạch cập Cấy kiểm tra định tính với 4 chủng vi khuẩn: - Staphylococcus aureus - Pseudomonas aeruginosa - Escherichia coli - Bacillus subtilis Đo đường kính vòng vô khuẩn (d)
28. 3.2.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu vi khuẩn • Tiến hành xác định MIC và MBC đối với 3 chủng: - Escherichia coli - Bacillus subtilis - Pseudomonas aeruginosa
29. Bacillus subtilis Sau 2 giờ Sau 6 giờ Vi khuẩn không giảm Sau 24 giờ
30. Pseudomonas aeruginosa Sau 2 giờ Sau 6 giờ Vi khuẩn không giảm Sau 24 giờ
31. Nhận xét • Với Escherichia coli: MIC = 1/16 MBC = 1/8 • Với Bacillus subtilis: Không thấy MIC, MBC • Với Pseudomonas aeruginosa: Không thấy MIC, MBC
32. Kết luận 1.Thành phần hoá học vị bạch cập: • Bằng các phản ứng hoá học đã sơ bộ xác định được trong vị bạch cập nghiên cứu có chất nhầy, tinh dầu, flavonoid, phytosterol và đường khử. • Định tính bằng sắc kí lớp mỏng: - Nhóm flavonoid tách được 1 vết có Rf x 100 = 74. - Nhóm tinh dầu tách được 3 vết có Rf x 100 = 11, 18, 27. - Nhóm phytosterol tách được 5 vết có Rf x 100 = 24, 40, 58, 84, 93.
33. • Phổ tử ngoại của chất F1 cho 2 pick là 211,8 nm và 277,5 nm mang đặc trưng của nhóm flavonoid thuộc phân nhóm flavan • Về chất nhầy trong bạch cập: - Chỉ số nở: 11,40 0,54 ml. - Hàm lượng: 55,028 0,064 %. • Phân tích monosaccharid của chất nhầy trong bạch cập bằng sắc kí giấy cho 2 vết: - 1 vết có Rf1 x 100 = 16 tương đương với glucose. - 1 vết có Rf2 x 100 = 22.
34. 2. Tác dụng kháng khuẩn của vị bạch cập: • Dịch chiết nước 3/1 của bạch cập có: - Tác dụng mạnh đối với Escherichia coli với MIC = 1/16, MBC = 1/8. - Tác dụng trung bình đối với Bacillus subtilis. - Tác dụng yếu đối với Pseudomonas aeruginosa. - Không có tác dụng đối với Staphylococcus aureus.
35. Kiến nghị • Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn nữa về thành phần hoá học của vị bạch cập. • Nghiên cứu thêm về tác dụng kháng khuẩn nói riêng và các tác dụng sinh học nói chung cũng như những ứng dụng thực tế trong điều trị bệnh của vị thuốc bạch cập.