›

Khóa luận Nghiên cứu các điều kiện tách chiết hoạt chất ức chế α-Glucosidase từ chủng Aspergillus niger

pdf 58 trang thiennha21 18/04/2022 2370
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu các điều kiện tách chiết hoạt chất ức chế α-Glucosidase từ chủng Aspergillus niger", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_nghien_cuu_cac_dieu_kien_tach_chiet_hoat_chat_uc_c.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu các điều kiện tách chiết hoạt chất ức chế α-Glucosidase từ chủng Aspergillus niger

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC BÙI HỒNG SƠN NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT HOẠT CHẤT ỨC CHẾ -GLUCOSIDASE TỪ CHỦNG ASPERGILLUS NIGER KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2021
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC BÙI HỒNG SƠN NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT HOẠT CHẤT ỨC CHẾ α-GLUCOSIDASE TỪ CHỦNG ASPERGILLUS NIGER KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2016.Y Người hướng dẫn: 1. TS. ĐỖ THỊ TUYÊN 2. ThS. ĐỖ THỊ QUỲNH HÀ NỘI - 2021
  3. LỜI CẢM ƠN Trước tiên em xin được cảm ơn sâu sắc tới TS. Đỗ Thị Tuyên, Trưởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người thầy đã truyền cảm hứng, tận tình hướng dẫn, đưa ra những góp ý và tạo mọi điều kiện thuận lợi cũng như kinh phí để thực hiện đề tài khóa luận này. Em xin được chân thành cảm ơn tới ThS. Đỗ Thị Quỳnh, Bộ môn Y Dược học cơ sở, Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội đã đưa ra những lời khuyên quý báu, những kinh nghiệm nghiên cứu cũng như giúp đỡ em tận tình trong thời gian làm khóa luận. Tiếp đến em xin cảm ơn tập thể các anh chị, cán bộ Phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học đã hướng dẫn, giúp đỡ tận tình cho em trong quá trình thực nghiệm vừa qua, cũng như là chia sẻ những kinh nghiệm rất đáng quý, có ứng dụng thực tế cao trong từng thí nghiệm. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô chủ nhiệm và các thầy cô bộ môn Y Dược học cơ sở, Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội trong suốt khoảng thời gian 5 năm vừa rồi đã cung cấp cho bản thân em rất nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu, đã quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập. Đồng thời em cũng xin cảm ơn tới những người thân trong gia đình và bạn bè đã luôn động viên và tiếp thêm sức mạnh cho tôi trong những lúc khó khăn nhất. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 25 tháng 5 năm 2021 Sinh viên Bùi Hồng Sơn
  4. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ ADA Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ AGIs Các chất ức chế α-glucosidase DC Đối chứng DNJ 1-deoxynojirimycin ĐTĐ Đái tháo đường HPLC Sắc lý lỏng hiệu năng cao IC50 Nồng độ ức chế 50% IDF Hiệp hội Đái tháo đường thế giới LC/MS Sắc ký lỏng khối phổi Mật độ quang học của mẫu tại bước sóng OD 405 405nm TLC Sắc ký lớp mỏng UV Tia tử ngoại
  5. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số hoạt chất ức chế α-glucosidase từ vi sinh vật 15 Bảng 2.1. Thiết bị thí nghiệm 22 Bảng 2.2. Các hóa chất sử dụng 23 Bảng 2.3. Thành phần các loại đệm và dung dịch 24 Bảng 2.4. Tính chất đặc trưng của đầu dò hấp thụ UV và đầu dò khối phổ 31 Bảng 3.1. Quá trình tách chiết hoạt chất ức chế α-glucosidase bằng các dung môi .33 Bảng 3.2. Tóm tắt quá trình tinh sạch thu nhận hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng A. niger VTCC 031 37 Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính tại các nồng độ khác nhau của dịch chiết n-butanol 40 Bảng 3.4. Kết quả thử hoạt tính tại các nồng độ khác nhau của mẫu tinh sạch cuối .42
  6. DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cơ chế tác dụng của các thuốc điều trị ĐTĐ tuýp 2 6 Hình 1.2. Lược đồ lựa chọn thuốc và phương pháp điều trị ĐTĐ tuýp 2 7 Hình 1.3. Cấu trúc không gian 3D của enzyme α-glucosidase GH13 10 Hình 1.4. Cấu trúc không gian 3D của enzyme α-glucosidase GH31 11 Hình 1.5. Cơ chế hoạt động của các chất ức chế enzyme α-glucosidase tại ruột non 12 Hình 1.6. Cấu trúc của acarbose, miglitol, voglibose và DNJ 13 Hình 1.7. Cấu trúc của các dẫn xuất monosaccharide 14 Hình 1.8. Đặc điểm hình thái bào tử sau khi nuôi cấy 7 ngày chủng A. niger VTCC 031 trên đĩa thạch 18 Hình 2.1. Sơ đồ quy trình nghiên cứu 25 Hình 2.2. Các bước tiến hành tinh sạch hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng A. niger VTCC 031 27 Hình 3.1. Thu hoạch bình nuôi cấy chủng A. niger 32 Hình 3.2. Khả năng tách các chất trong các mẫu dịch chiết khi sử dụng 9 hệ dung môi khác nhau 34 Hình 3.3. Sắc ký lớp mỏng kiểm tra độ tinh sạch các phân đoạn qua cột silica gel lần thứ nhất 35 Hình 3.4. Sắc ký lớp mỏng kiểm tra độ tinh sạch các phân đoạn từ 17 đến 21 sau khi qua cột silica gel lần thứ nhất 36 Hình 3.5. Sắc ký lớp mỏng kiểm tra độ tinh sạch các phân đoạn qua cột silica gel lần thứ hai 37 Hình 3.6. Kiểm tra độ tinh sạch cả quá trình bằng TLC 38 Hình 3.7. Kiểm tra độ tinh sạch bằng HPLC và LC/MS 39 Hình 3.8. Xây dựng đường chuẩn hoạt tính ức chế α-glucosidase của dịch chiết n- butanol 41 Hình 3.9. Xây dựng đường chuẩn hoạt tính ức chế α-glucosidase của acarbose tinh khiết (Sigma) 41 Hình 3.10. Xây dựng đường chuẩn hoạt tính ức chế α-glucosidase của mẫu tinh sạch cuối 42
  7. MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Bệnh đái tháo đường 2 1.1.1. Khái niệm 2 1.1.2. Phân loại 2 1.1.3. Cơ chế bệnh sinh và biến chứng 3 1.1.4. Các nguyên tắc điều trị bệnh đái tháo đường 5 1.2. Enzyme α-glucosidase 9 1.2.1. Giới thiệu chung về -glucosidase 9 1.2.2. Cấu trúc của -glucosidase 10 1.2.3. Cơ chế hoạt động của enzyme trong cơ thể 11 1.3. Chất ức chế α-glucosidase 12 1.3.1. Giới thiệu và cơ chế hoạt động của chất ức chế enzyme α-glucosidase 12 1.3.2. Phân loại chất ức chế enzyme α-glucosidase 14 1.3.3. Nguồn gốc chất ức chế enzyme α-glucosidase 15 1.4. Giới thiệu về chủng nấm sợi Aspergillus niger 18 1.5. Tình hình nghiên cứu hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ chủng Aspergillus trong nước và quốc tế 20 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. Đối tượng nghiên cứu 22 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22 2.3. Thiết bị phòng thí nghiệm và hóa chất 22 2.4. Môi trường nuôi cấy 24 2.5. Quy trình tiến hành nghiên cứu 24 2.6. Phương pháp nghiên cứu 25 2.6.1. Xác định hoạt tính chất ức chế α-glucosidase 25 2.6.2. Tách chiết, tinh sạch hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ dịch nuôi cấy 26
  8. 2.6.3. Xác định giá trị IC50 30 2.6.4. Kiểm tra độ tinh sạch bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao và sắc ký lỏng khối phổ 30 2.6.5. Phương pháp xử lý số liệu 31 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 32 3.1. Kết quả tinh sạch hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ chủng A. niger VTCC 031 32 3.1.1. Kết quả quá trình tách chiết hoạt chất ức chế α-glucosidase với các dung môi 32 3.1.2. Nghiên cứu chọn lựa các hệ dung môi pha động chạy sắc ký cột 34 3.1.3. Kết quả tinh sạch bằng cột sắc ký silica gel 60 35 3.2. Xác định IC50 của dịch chiết n-butanol và của mẫu tinh sạch cuối cùng 40 KẾT LUẬN 44 ĐỀ XUẤT 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46
  9. ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, bệnh đái tháo đường đang được coi là một trong những vấn đề sức khỏe toàn cầu. Theo báo cáo của Liên đoàn Đái tháo đường quốc tế (IDF), số lượng bệnh nhân đái tháo đường trên toàn thế giới dự kiến có thể gần 700 triệu người vào năm 2045. Tại Việt Nam, theo ước tính của Bộ Y tế, đối với người tuổi từ 20 - 79, bệnh đái tháo đường sẽ tăng khoảng 78,5% trong giai đoạn 2017 - 2045 (từ 3,53 triệu bệnh nhân năm 2017 có thể tăng lên 6,3 triệu người mắc đái tháo đường vào năm 2045). Không những thế, dưới ảnh hưởng nghiêm trọng của đại dịch toàn cầu COVID-19, quá trình điều trị cho những bệnh nhân đái tháo đường càng trở nên khó khăn hơn. Các nghiên cứu gần đây cho thấy bệnh nhân đái tháo đường kiểm soát đường huyết kém hơn khi mắc COVID-19 có tỷ lệ tử vong cao hơn khoảng 4 lần và thời gian nằm viện lâu hơn so với bệnh nhân không bị đái tháo đường [14, 64]. Một trong các nhóm thuốc đang được sử dụng để điều trị đái tháo đường hiện nay là nhóm chất ức chế α-glucosidase, được sử dụng phổ biến trên lâm sàng điển hình như: acarbose, voglibose, miglitol. Nhóm thuốc này thường được sử dụng phối hợp với các thuốc đầu tay khác như metformine, nhóm đồng vận thụ thể GLP-1 , cho kết quả điều trị tốt tuy nhiên chúng vẫn được ghi nhận những tác dụng không mong muốn như: đau đầu, mất ngủ, buồn nôn, đầy hơi và tiêu chảy [15]. Vì vậy việc tìm kiếm một hợp chất an toàn và thuận tiện cho việc sản xuất đang được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Hiện nay, một trong các nguồn nguyên liệu phong phú nhất là nguồn từ các chủng vi sinh vật do chúng có một quần thể vô cùng rộng lớn, có thể phát triển mạnh và không gây ô nhiễm môi trường xung quanh. Đặc biệt là chủng nấm Aspergillus với nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy ứng dụng của chúng đối với việc tổng hợp các hoạt chất thứ cấp do hoạt tính sinh học dùng để điều trị bệnh [16, 31, 39]. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu với đề tài: “Nghiên cứu các điều kiện tách chiết hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng Aspergillus niger” với các mục tiêu sau: - Mô tả kết quả tách chiết, tinh sạch hoạt chất chất ức chế α-glucosidase từ chủng Aspergillus niger; - Xác định độ tinh sạch và giá trị IC50 của dịch chiết và sản phẩm cuối tinh sạch chứa hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ chủng Aspergillus niger. 1
  10. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Bệnh đái tháo đường 1.1.1. Khái niệm Đái tháo đường (ĐTĐ) là hội chứng các rối loạn chuyển hóa mãn tính, phức tạp được đặc trưng bởi sự tăng glucose máu do tụy không sản xuất đủ insulin hoặc do cơ thể sử dụng insulin không hiệu quả hoặc cả hai [43]. Bệnh lý này có thể gây ra những tổn thương lâu dài trong nhiều hệ cơ quan như: tổn thương võng mạc, tim, thận, não và hệ thống mạch máu với các bệnh điển hình như bệnh thận do tiểu đường, bệnh võng mạc đái tháo đường, suy gan, tổn thương hệ thần kinh nếu bệnh nhân không phát hiện, điều trị và tuân thủ điều trị nghiêm ngặt [15]. 1.1.2. Phân loại Theo Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ (ADA) năm 2021, ĐTĐ có các loại sau: ĐTĐ tuýp 1, ĐTĐ tuýp 2, ĐTĐ thai kỳ, ĐTĐ do các nguyên nhân khác [11]. Đái tháo đường tuýp 1 ĐTĐ tuýp 1, trước đó được gọi là ĐTĐ tuổi vị thành niên, được gây ra bởi quá trình tự miễn làm tổn thương tế bào beta (β) đảo tụy dẫn đến tình trạng giảm sản xuất tuyệt đối insulin. Về mặt dịch tễ học, nó chiếm 5-10% số người mắc ĐTĐ. Đái tháo đường tuýp 2 ĐTĐ tuýp 2, hay còn gọi là ĐTĐ không phụ thuộc insulin, ĐTĐ người lớn, chiếm khoảng 90-95% số người mắc ĐTĐ. Bệnh được gây ra trên nền tảng cơ thể giảm tiết insulin tương đối ở tế bào β tuyến tụy và hình thành sự kháng insulin ở tế bào. Hầu như bệnh nhân không cần điều trị bằng liệu pháp insulin trong cả cuộc đời. Đái tháo đường do các nguyên nhân khác ĐTĐ do các nguyên nhân khác, hay còn gọi là đái tháo đường thứ cấp, gồm: hội chứng đái tháo đường đơn gen (gồm đái tháo đường khởi phát ở trẻ nhỏ và đái tháo đường sơ sinh), do bệnh tụy ngoại tiết, do bệnh nội tiết, do cảm ứng thuốc, đái tháo đường qua trung gian miễn dịch và đái tháo đường do các hội chứng di truyền. Đái tháo đường thai kỳ ĐTĐ thai kỳ - một loại rối loạn chuyển hóa phổ biến nhất ở phụ nữ mang thai - được định nghĩa là hiện tượng rối loạn dung nạp glucose, được phát hiện vào giai 2
  11. đoạn thứ hai hoặc thứ ba của thai kỳ mà trước thời kỳ mang thai không có dấu hiệu rõ ràng của bệnh đái tháo đường. Một trong những hậu quả của tình trạng béo phì ngày càng phổ biến cũng như trường hợp khi thai phụ đã lớn tuổi là sự tăng lên về tỷ lệ ĐTĐ thai kỳ trên thế giới, đặt ra một gánh nặng lớn lên hệ thống y tế công [11, 65]. Thực tế cho thấy ĐTĐ thai kỳ có nguy cơ gây ra nhiều biến chứng nghiêm trọng cho mẹ và thai nhi như phải sinh mổ, đẻ khó do kẹt vai, hội chứng macrosomia ở thai nhi [21]. Hơn nữa, thai phụ mắc ĐTĐ thai kỳ dễ mắc ĐTĐ tuýp 2 hoặc các bệnh về tim mạch sau mang thai [12, 53]; trong khi thai nhi dễ phát triển mắc béo phì hoặc ĐTĐ tuýp 2 sớm trong khi lớn [20]. 1.1.3. Cơ chế bệnh sinh và biến chứng 1.1.3.1. Cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ tuýp 1 ĐTĐ tuýp 1 được đặc trưng bởi sự tấn công qua trung gian miễn dịch và phá hủy các tế bào β đảo tụy - sản xuất insulin. Quá trình bệnh sinh được điều phối bởi các tế bào T-CD4 và T-CD8 đặc hiệu của tiểu đảo Langerhans, cũng như các tế bào B, và liên quan đến việc phá hủy các tế bào beta của tiểu đảo Langerhans. Trước tiên, các tế bào lympho (bạch huyết) bao quanh đảo nhỏ (viêm xung quanh tiểu đảo tụy), và sau đó xâm nhập vào vùng trung tâm của tiểu đảo, gây ra sự hủy hoại tế bào beta và cuối cùng là gây ra ĐTĐ tuýp 1. Bệnh phát sinh ở những người rối loạn về mặt di truyền, khởi phát trung bình lúc 10 – 14 tuổi. Tỷ lệ mắc bệnh ở các cặp song sinh là khoảng 60%, cho thấy các yếu tố môi trường cũng làm tăng nguy cơ mắc bệnh [38]. Trong số các yếu tố trên, các nghiên cứu cho thấy đặc điểm di truyền đóng vai trò quan trọng trong cơ chế phát sinh ĐTĐ tuýp 1, đặc biệt là những người mang kháng nguyên HLA DR3 và HLA DR4 vì chúng liên quan tới việc sản xuất các tự kháng thể như kháng thể kháng đảo tụy (ICA); kháng thể kháng acid glutamic decarboxylase 65 (GAD 65) và kháng thể kháng insulin (IAA: Insulin auto antibodies), [27]. Những cá nhân có rối loạn về di truyền sẽ tăng nguy cơ bị ĐTĐ tuýp 1 khi bị tấn công bởi yếu tố môi trường bên ngoài như virus quai bị, rubella, virus coxsackie B4. Các tự kháng thể IAA và GAD sẽ tấn công tế bào β đảo tụy khiến nó bị phá hủy, mất khả năng sản xuất insulin và hậu quả là gây ra ĐTĐ tuýp 1 [27]. 3
  12. 1.1.3.2. Cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ tuýp 2 Yếu tố di truyền kết hợp với môi trường tác động lên cơ thể gây ra tình trạng kháng insulin và giảm bài tiết insulin, dần gây ra ĐTĐ tuýp 2. Kháng insulin là sự hoạt động kém hiệu quả trong quá trình truyền tín hiệu của insulin từ receptor tới đích phân tử cuối cùng, dẫn tới giảm tác dụng của insulin. Gen mã hóa các enzyme và protein tham gia vào quá trình truyền tín hiệu của insulin như: insulin receptor substrate, phosphatidyl inositol-3-kinase hay tham gia vào quá trình bài tiết insulin như capain 10, yếu tố phiên mã 7-like 2 (the transcription factor 7-like 2) có liên quan tới bệnh ĐTĐ tuýp 2 [48]. Bên cạnh đó các yếu tố môi trường có thể làm tăng tiến triển của bệnh như lối sống không lành mạnh gồm việc giảm các hoạt động thể lực; thay đổi chế độ ăn uống theo hướng tăng tinh, giảm chất xơ gây dư thừa năng lượng. Ngoài ra chất lượng thực phẩm, các stress trong cuộc sống cũng tác động đến tình trạng bệnh. Tuổi thọ càng tăng, nguy cơ mắc bệnh càng cao, đây là yếu tố không thể can thiệp được. Hầu hết bệnh nhân béo phì hoặc thừa cân và béo phì vùng bụng với vòng eo to trong khi đó béo phì vùng bụng có liên quan với tăng acid béo trong máu, mô mỡ cũng tiết ra một số hormon làm giảm tác dụng của insulin ở các cơ quan đích như gan, tế bào mỡ, tế bào cơ (kháng insulin tại các cơ quan đích). Do hiện tượng kháng insulin, ở giai đoạn đầu xảy ra sự “bù” của các tế bào β đảo tụy khiến nó tăng tiết insulin nhiều hơn và dần dẫn đến sự suy kiệt tế bào β đảo tụy khiến tăng đường huyết và cuối cùng là bệnh nhân bắt đầu có những triệu chứng lâm sàng của ĐTĐ tuýp 2 [5]. 1.1.3.3. Biến chứng của ĐTĐ Bệnh ĐTĐ, cả tuýp 1 và 2, đều có thể gây ra những biến chứng từ nhẹ đến nghiêm trọng cho người bệnh với các biểu hiện cấp tính và mãn tính, đây là hậu quả từ tình trạng tăng glucose kéo dài. Các biểu hiện cấp tính như: nhiễm khuẩn do đường máu cao và suy giảm hệ miễn dịch; hôn mê do tăng áp lực thẩm thấu, nhiễm toan thể ceton. Các biến chứng mạn tính như: biến chứng võng mạc, thận, xơ vữa động mạch. Các biến chứng cấp tính có thể đe dọa tính mạng của bệnh nhân nếu không được xử lý kịp thời còn các biến chứng mạn tính có thể gây ra hậu quả ở các mức độ khác nhau từ giảm chất lượng cuộc sống của bệnh nhân tới khiến cho bệnh nhân tử vong. Biến chứng cấp tính thường gặp đối với ĐTĐ tuýp 1 còn biến chứng mạn tính thường gặp hơn ở các bệnh nhân ĐTĐ tuýp 2. Một trong những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng 25% bệnh thận ĐTĐ có thể mắc các biến chứng về thận, gây ảnh hưởng lớn đến chức năng lọc của cầu thận, và 4
  13. cuối cùng có thể dẫn đến suy thận nếu không điều trị kịp thời và đúng cách [2]. Ở Việt Nam, ước tính xấp xỉ 6% người lớn tuổi mắc ĐTĐ lâu ngày có nguy cơ mất thị lực do các biến chứng đáy mắt của bệnh lí võng mạc ĐTĐ. Phát hiện sớm và điều trị kịp thời võng mạc đái tháo đường có thể làm giảm nguy cơ ảnh hưởng tới thị lực của bệnh nhân ĐTĐ[1]. 1.1.4. Các nguyên tắc điều trị bệnh đái tháo đường Nguyên tắc điều trị chung đối với bệnh nhân ĐTĐ tập trung ở hai mục tiêu kép là kiểm soát tốt glucose máu, đặc biệt là lượng glucose máu khi đói và glucose máu sau ăn gần đạt khoảng sinh lý (<140 mg/dL hay 7,8 mmol/L), HbA1c đạt lý tưởng (4-6%); đồng thời ngăn ngừa, phát hiện sớm và điều trị sớm biến chứng của bệnh. 1.1.4.1. Điều trị ĐTĐ tuýp 1 Liệu pháp insulin được áp dụng chủ yếu trong điều trị ĐTĐ tuýp 1 do cơ chế thiếu hụt tuyệt đối insulin trong cơ thể. Ngày này, với sự phát triển của công nghệ bào chế, kết hợp với công nghệ sinh học, nhiều loại insulin mới ra đời (insulin tác dụng trung bình, tác dụng dài, ), kiểm soát đường huyết đã đem lại hiệu quả cao trong liệu pháp sử dụng insulin. Một nghiên cứu tổng quan của Sikorskaya và cộng sự (2021) đã cho thấy nhiều hứa hẹn trong việc bổ sung metformin như một liệu pháp điều trị bổ sung cho lứa tuổi thanh thiếu niên bị ĐTĐ tuýp 1. Thực vậy, metformin có tính an toàn cao và khả năng dung nạp tốt ở lứa tuổi vị thành niên [50]. Không dừng ở đó, các nhà khoa học đã và đang tìm hướng điều trị ĐTĐ tuýp 1 từ liệu pháp tế bào gốc; hình thành tuyến tụy từ sự biệt hóa của các tế bào gốc đa năng trên mô hình in vitro để hình thành các mô có chứng năng đảo tụy. Tuy nhiên liệu pháp còn gặp nhiều thách thức, đặc biệt là việc bảo vệ các tế bào khỏi chức năng của hệ thống miễn dịch [23]. 1.1.4.2. Điều trị ĐTĐ tuýp 2 Trong quá trình phát triển của ngành dược phẩm, rất nhiều nhóm thuốc trong điều trị tiểu đường đã được tìm ra phù hợp từng đích phân tử nhất định, góp phần giảm nhẹ diễn biến bệnh sinh của đái tháo đường. Một số đích tác dụng chính đã được xác định với nhiều nhóm thuốc khác nhau trong điều trị ĐTĐ [56] (Hình 1.1). 5
  14. Hình 1.1. Cơ chế tác dụng của các thuốc điều trị ĐTĐ tuýp 2 [56] Chú thích: AGI (α-glucosidase inhibitors): chất ức chế -glucose, DPP-4i (Dipeptidyl peptidase-4-inhibitors): chất ức chế enzyme DPP-4, GLP-1 RA (Glucagon-like peptide-1 receptor agonists): chất đồng vận thụ thể GLP-1, TZD: Thiazolidinediones, SGL-T2i (sodium-glucose cotransporter 2 inhibitor): chất ức chế kênh đồng vận chuyển natri-glucose, MET: Metformim Căn cứ vào hiệu quả điều trị trên lâm sàng, sự phối hợp của các nhóm thuốc trong điều trị để đạt được mục tiêu theo Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị đái tháo đường do Bộ Y tế (2020) được trình bày cụ thể trong Hình 1.2 [5]: 6
  15. 7 Hình 1.2. Lược đồ lựa chọn thuốc và phương pháp điều trị ĐTĐ tuýp 2 [5]
  16. Trong quá trình điều trị và theo dõi bệnh nhân, các nghiên cứu cũng đưa ra khuyến cáo về một số yếu tố cần xem xét khi chọn lựa thuốc điều trị cho bệnh nhân ĐTĐ gồm [5]: a) Hiệu quả giảm glucose huyết b) Nguy cơ hạ glucose máu: sulfonylurea, insulin c) Tăng cân: Pioglitazon, insulin, sulfonylurea d) Giảm cân: GLP-1 RA, ức chế SGLT2, ức chế DPP-4 (giảm cân ít) e) Không ảnh hưởng nhiều lên cân nặng: ức chế enzyme DPP-4, metformin, ức chế enzyme α-glucosidase f) Ảnh hưởng lên bệnh lý tim mạch do xơ vữa: - Hiệu quả có lợi (bằng chứng rõ ràng: GLP-1 RA và ức chế SGLT-2 trừ lixisenatide trung tính). - Có thể có lợi pioglitazone và metformin g) Ảnh hưởng lên các vấn đề về tim mạch, đặc biệt suy tim có phân suất tống máu giảm LVEF 65 tuổi): Không cần chỉnh liều GLP-1 RA, SGLT-2i - Suy thận: Không cần chỉnh liều GLP-1 RA, linaglipin đối với suy thận nhẹ, trung bình hay nặng. SGLT-2i được ưu tiên trên BN có eGFR 30-60 mL/phút/1,73m2 da hoặc albumin niệu > 30mg/g creatinin để giảm tiến triển bệnh thận mạn 8
  17. - Suy gan: Không cần chỉnh liều GLP-1 RA, SGLT-2i đối với suy gan nhẹ hoặc trung bình. Ở BN suy gan nặng, dapagliflozin có thể khởi trị với liều 5 mg, nếu dung nạp có thể tăng lên 10 mg. Empagliflozin không khuyến cáo trên bệnh nhân suy gan nặng. j) Giá thuốc, tính sẵn có, sự dung nạp và khả năng chi trả của bệnh nhân k) Phác đồ sử dụng dễ nhớ, dễ thực hiện và khả năng tuân thủ điều trị của người bệnh 1.2. Enzyme α-glucosidase 1.2.1. Giới thiệu chung về α-glucosidase Enzyme -glucosidase (E.C.3.2.1.20) là một nhóm các enzyme xúc tác thủy phân liên kết α-1,4-glycoside bao gồm một số loại như maltase, glucoinvertase, glucosidosucrase, maltase-glucoamylase, α- glucopyranosidase, glucosidoinvertase, α-D-glucosidase, α-glucosid hydrolase, α- 1,4-glucosidase, α-D-glucosid glucohydrolase. Đáng chú ý, các enzyme này thủy phân oligosaccharide nhanh hơn so với polysaccharide. Enzyme α-glucosidase là một enzyme họ exohydrolysis, có hoạt tính thủy phân liên kết α-1,4-glycoside ở đầu tận cùng không khử của carbohydrate giải phóng các phân tử α-D-glucose. Cơ chất phổ biến của enzyme -glucosidase là oligosaccharide, disaccharide, các aryl- và akyl-α-glucopyranoside, [41]. Enzyme -glucosidase là một trong những enzyme thuộc lớp glycoside hydrolase (GH), một lớp gồm các enzyme thường tách các liên kết glycoside giữa hai phân tử carbohydrate – một trong những liên kết mạnh nhất được tìm thấy trong các polymer tự nhiên. Tốc độ phân cắt các liên kết glycoside được tăng lên gấp 1017 lần so với phản ứng thông thường không có enzyme xúc tác [63]. Enzyme α-glucosidase phân bố trong các họ GH khác nhau như GH4, GH3, GH31, GH63, GH97 [25, 26], trong đó GH3 và GH31 là hai nhóm chủ yếu của enzyme α-glucosidase. Những enzyme α-glucosidase thuộc nhóm GH13 được phát hiện nhiều ở vi khuẩn, còn những sinh vật bậc cao hơn thường có enzyme α-glucosidase thuộc nhóm GH31. Enzyme α-glucosidase có nguồn gốc đa dạng, từ nhiều loài sinh vật (vi khuẩn, nấm mốc, động vật và thực vật). Chính nhờ đó, tính đặc hiệu cơ chất của enzyme cũng đa dạng hơn, và enzyme α-glucosidase được phân chia thành 3 loại dựa trên tính đa dạng này. Loại 1 là các enzyme α-glucosidase ưu tiên thủy phân các liên kết heteroside (glycoside) chẳng hạn sucrose và các aryl α-glucoside (ví dụ như p- 9
  18. nitrophenyl α-D-glucopyranoside - pNPG), hơn là các liên kết holoside, chẳng hạn như các α-glucobiose, malto-oligosaccharide, and α-glucan). Enzyme loại II và III thì ngược lại, hoạt động mạnh hơn trên các holoside và có hoạt tính thấp đối với các heteroside. Enzyme loại III giống loại II, nhưng khác nhau trong quá trình thủy phân polysaccharide: enzyme loại II có hoạt tính khá thấp trên α-glucan, trong khi loại III lại có hoạt tính cao [41]. Trong công nghiệp ứng dụng, sinh vật sản xuất chính enzyme α-glucosidase là vi khuẩn và nấm (Lactobacillus, Bacillus và Aspergillus) [22, 58]. Vi khuẩn ưa nhiệt tạo ra các chất có hoạt tính α-glucosidase hoạt động ngay cả ở các môi trường pH trung tính và kiềm, và ở nhiệt độ từ 20- 40°C [32]. 1.2.2. Cấu trúc của α-glucosidase Enzyme α-glucosidase nhóm GH13 và GH31 có những đặc điểm về cấu trúc, hình thái không gian và hoạt tính sinh học khác nhau, do chúng có sự khác biệt về nguồn gốc và tính đặc hiệu cơ chất. Đối với các enzyme -glucosidase GH13, chúng có cấu trúc tương đối giống với oligo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.10; O16G) và dextran glucosidase (glucan 1,6- α-glucosidase; EC 3.2.1.70; DG). Cho đến nay, cấu trúc không gian của enzyme α- glucosidase GH13 đã được xác định qua nhiều nghiên cứu, và cấu trúc tổng thể của chúng tương tự nhau, chủ yếu được hình thành từ 3 domain A, B và C [41] (Hình 1.3a, b). Hình 1.3. Cấu trúc không gian 3D của enzym α-glucosidase GH13 [41] Chú thích: A. Cấu trúc tổng quan của phức hợp Halomonas sp. α-glucosidase và maltose, B. Cấu trúc tổng quan của phức hợp Streptococcus mutans DG và isomaltotriose 10
  19. Đối với các enzyme - glucosidase nhóm GH31, hầu hết chúng phổ biến ở các sinh vật phụ thuộc vào tinh bột như một nguồn năng lượng chính trong cơ thể. Ví dụ, sucrase–isomaltase (SI) và maltase – glucoamylase (MGAM), được tiết ra tại ruột non của động vật có vú, có liên quan đến sự phân hủy tinh bột trong khẩu phần ăn. SI và MGAM chịu trách nhiệm thủy phân các oligo-saccharide thu được thành glucose. Mỗi polypeptit MGAM và SI bao gồm 2 thành phần enzyme khác nhau, tạo ra tổng số 4 α-glucosidase trong cấu trúc 2 enzyme này. Bốn enzyme có cấu trúc liên quan chặt chẽ với nhau do phát triển từ một nguồn gốc chung, đều được xếp vào họ glycoside hydrolase GH31 và có quan hệ mật thiết với nhau theo cấu trúc nếp gấp. Về danh pháp, vùng maltase của MGAM được gọi là NtMGAM và vùng glucoamylase được gọi là CtMGAM. Đối với SI, vùng isomaltase là NtSI và vùng sucrase là CtSI [46]. NtMGAM và CtMGAM giống nhau đều chịu trách nhiệm chính trong việc thủy phân các liên kết α-(1→4) nhưng khác nhau ở chỗ chúng thể hiện các ưu tiên khác nhau đối với các cơ chất có mức độ polyme hóa (DP) khác nhau: CtMGAM thích thủy phân các cơ chất có giá trị DP cao hơn NtMGAM [45]. NtSI có xu hướng thủy phân của các liên kết α-(1→6)-glucosidic [51]. CtSI có thể thủy phân các liên kết α- (12) trong sucrose [29]. Hình 1.4. Cấu trúc không gian 3D của enzyme α-glucosidase GH31 [41] (A. Mô hình cấu trúc của NtMGAM; B. Vùng hoạt động của NtMGAM) 1.2.3. Cơ chế hoạt động của enzyme α-glucosidase trong cơ thể Khi con người đưa thức ăn vào đường tiêu hóa, các phân tử cacbohydrate trong thức ăn sẽ được thủy phân, chia cắt thành các phân tử nhỏ bởi hệ enzyme trong ruột 11
  20. non. Cụ thể, các sản phảm giàu tinh bột, dạng glucid chính trong khẩu phần ăn sau khi qua dạ dày sẽ được enzyme α-amylase tiết từ tuyến tụy và nước bọt thủy phân thành các malto-oligosaccharid, chẳng hạn như maltose, maltotriose, và các malto- oligosaccharid mạch ngắn có các nhánh α-(1-6) [41]. Enzyme α-glucosidase được tiết ra từ diềm bàn chải tế bào ruột non, lại tiếp tục phân hóa các oligosaccharide thành các phân tử đường glucose nhỏ hơn rồi mới thẩm thấu qua màng ruột vào mạch bạch huyết rồi cuối cùng đổ về hệ tuần hoàn. Chính nhờ cơ chế này, việc ức chế hoạt động của enzyme α-glucosidase có thể làm hạn chế quá trình thủy phân carbohydrate và làm giảm, làm chậm sự thẩm thấu glucose vào máu [3, 8]. 1.3. Chất ức chế α-glucosidase 1.3.1. Giới thiệu và cơ chế hoạt động của chất ức chế enzyme α-glucosidase Chất ức chế enzyme α-glucosidase (α-glucosidase inhibitors-AGIs) là các chất làm giảm hoạt tính của enzyme α-glucosidase dẫn đến làm chậm quá trình tiêu hóa các chất carbohydrate thành đường đơn glucose ở ruột non, từ đó ngăn hiện tượng tăng đường huyết sau ăn. Hình 1.5. Cơ chế hoạt động của các chất ức chế enzyme α-glucosidase tại ruột non (AG: α-glucosidase; AGI: chất ức chế enzyme α-glucosidase) Phần lớn AGIs có khả năng gắn vào vùng liên kết với carbohydrate của enzyme -glucosidase vì chúng có cấu trúc tương tự với các disaccharide hoặc oligosaccharide. Các phức hợp này có ái lực lớn hơn phức hợp thông thường 12
  21. carbohydrate-glucosidase vì vậy hình thành cơ chế ức chế cạnh tranh enzyme. Do vậy, hoạt động của α-glucosidase tại tế bào niêm mạc của ruột non bị ức chế. Khi carbohydrate không được hấp thụ qua các lớp niêm mạc đường ruột, bị thủy phân dần dần ở tá tràng, hỗng tràng và hồi tràng, kết quả của quá trình này là làm giảm sự hấp thu của glucose [37]. Theo nhiều nghiên cứu, các loại thuốc AGIs điển hình, chẳng hạn như miglitol và acarbose, còn có thể tăng cường bài tiết GLP-1 (glucagonlike peptide-1), làm giảm cơn đói cũng như nhu cầu ăn uống [33, 55]. Bên cạnh đó, cũng có bằng chứng cho thấy rằng AGIs không ảnh hưởng đến bài tiết insulin. Ngày nay, có bốn AGIs trên thị trường: acarbose, miglitol, voglibose và DNJ (Hình 1.6). Tất cả bốn loại thuốc trên đều đã được đưa vào thị trường từ nhiều năm trước, và kể những năm 1990 thì không có AGI nào được chấp thuận sử dụng trên lâm sàng. Các nghiên cứu lâm sàng về acarbose và miglitol chỉ ra rằng AGIs có nhiều ưu điểm hơn các loại thuốc điều trị đái tháo đường dùng đường uống khác. Chúng không có tác dụng đối với những kênh vận chuyển glucose phụ thuộc natri hay sự bài tiết insulin, do đó chúng không ảnh hưởng đến việc tiêu thụ glucose cũng như gây hạ đường huyết trong cơ thể. Hơn nữa, AGIs cũng không gây ảnh hưởng trọng lượng cơ thể như insulin, sulfonylurea làm tăng cân hay nhóm GLP-1 RA, ức chế SGLT2 thường dẫn đến giảm cân. Tuy nhiên, chúng cũng có một số tác dụng phụ (chủ yếu trên đường tiêu hóa), chẳng hạn như đầy hơi, co thắt ruột và đau bụng. Mặc dù vậy, điều cần thiết là phải tìm ra một AGIs mới như một loại thuốc trị đái tháo đường hiệu quả có ít phản ứng phụ hơn. Hình 1.6. Cấu trúc của hoạt chất acarbose, miglitol, voglibose và DNJ [37] 13
  22. 1.3.2. Phân loại chất ức chế enzyme α-glucosidase Dựa vào cấu trúc cấu tạo của các AGIs, chúng được chia thành 2 loại chính là các hợp chất có cấu trúc giả đường và các hợp chất khác. Các hợp chất có cấu trúc giả đường thường là các dẫn xuất của mono- saccharide như glucose và galactose. Có nhiều phương pháp để thiết kế các dẫn chất mới của mono-saccharide như biến đổi cấu trúc tại vị trí C1 hay gốc C1-OH, mở vòng monosaccharide hoặc sự tái cấu trúc của glucose. Ngoài ra các cấu trúc azasugar giống glucose hay các muốn thiosugar cũng được xác định là nguồn lực tiềm năng để tạo ra các chất có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase. Năm 2013, Bian cùng cộng sự đã thiết kế một chuỗi các dẫn xuất từ monosaccharide với cấu trúc chung như hợp chất A [13] (Hình 1.7). Trong số đó, hợp chất 1 được xác định là chất ức chế - glucosidase tiềm năng nhất (IC50 = 2,3 μmol) so với đối chứng là acarbose (IC50 = 235,1 μmol) Hình 1.7. Cấu trúc của các dẫn xuất monosaccharide [13] Với các hợp chất có cấu trúc khác, các nghiên cứu cũng đã tìm ra nhiều hợp chất không có cấu trúc glycosyl nhưng cũng cho hoạt tính ức chế α-glucosidase tốt. Các hợp chất này được phân loại thành các nhóm nổi bật: imidazole và pyrazole, chromones và macrocyclic [37]. 14
  23. 1.3.3. Nguồn gốc chất ức chế enzyme α-glucosidase Hiện nay, chất ức chế enzyme -glucosidase đã được phát hiện ở nhiều loài sinh vật khác nhau từ động vật, thực vật đến vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn phong phú cho các hợp chất AGIs vẫn là thực vật [61, 62], nấm [16, 17, 31, 39, 44] và vi khuẩn [42, 66]. Bảng 1.1. Một số hoạt chất ức chế α-glucosidase từ vi sinh vật [57] STT Nguồn sinh vật Bản chất Tính đặc hiệu 1 Actinomycetes Pseudo- α-glucosidase trong nước bọt, tetrasaccharide tụy, ruột (acarbose) 2 Streptomyces Pseudo- α-glucosidase trong nước bọt, flavochromogenes oligosaccharide tụy, ruột, α-glucosidase của vi sinh vật 3 Streptomyces Polypeptide (có tính α-glucosidase của động vật fradiae axit) 4 Streptomyces Glycopeptide α-glucosidase ở tụy và ruột calidus 5 Bacillus sp.50 Monosaccharide α-glucosidase ở ruột (Nojirimycin) 6 Streptomyces Pseudo- α-glucosidase ở ruột hygroscopicus oligosaccharide (Valiolamide) 7 Cladosporium Glycopeptide α-glucosidase ở động vật có cladosporioides (tomastachin) vú 8 Cladosporium Glycopeptide α-glucosidase trong nước bọt herbarum và tụy 9 Aspergillus niger Glycopeptide α-glucosidase của Aspergillus 15
  24. 1.3.3.1. Nguồn gốc từ thực vật Năm 2017, hai chất gồm một stilbene glucoside mới (polygonumnolide D) và một glycoside dianthrone mới (polygonumnolide E) đã được phân lập từ dịch chiết EtOH 70% của rễ khô của cây hà thủ ô đỏ, tên khoa học là Polygonum multiflorum Thunb [61]. Cấu trúc của chúng đã được làm sáng tỏ bằng phương pháp đọc phổ NMR 1D và 2D cũng như dữ liệu khối phổ. Các hợp chất phân lập được đánh giá về các hoạt động ức chế -glucosidase của chúng trong ống nghiệm. Hai hợp chất trên cho thấy hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase với các giá trị IC50 tương ứng là 2,4 μM và 2,7 μM. Bốn pyrole alkaloid, là plicatanin A – D cũng được phân lập từ loài Chrozophora plicata, và cho thấy hoạt tính ức chế chống lại α-glucosidase với giá trị IC50 lần lượt 202,3 ± 0,33 μmol/L; 178,62 ± 0,78 μmol/L; 27,85 ± 0,75 μmol/L và 57,15 ± 0,44 μmol/L, hợp chất C cho thấy hoạt tính ức chế mạnh nhất, mạnh hơn acarbose (IC50 = 38,25 ± 0,12 μmol/L) [62]. β-sitosterol và β-sitosterol-3-O-β-D- glucopyranoside được phân lập từ Chrozophora plicata đã cho thấy hiệu quả ức chế enzyme α-glucosidase (tương ứng IC50 = 277,7 ± 0,003 μmol/L và 258,71 ± 0,07 μmol/L), nhưng hoạt tính ức chế thấp hơn acarbose (IC50 = 38,25 ± 0,12 μmol/L) [54]. Trong các thuốc điều trị ĐTĐ trên thị trường, các thuốc có nguồn gốc từ 1- deoxynojirimycin (DNJ) hay dẫn xuất của nó đang trở nên rất thông dụng do chúng có các hoạt tính sinh học độc đáo. DNJ lần đầu tiên được phân lập từ rễ của dâu tằm bởi Yagi (1976) [60], ngoài ra nó có nồng độ cao nhất trong lá dâu tằm, cũng như được tìm thấy trong các chất chuyển hóa của một số vi sinh vật, bao gồm cả Streptomyces và Bacillus. DNJ là một chất ức chế α-glucosidase mạnh và nó có các tác dụng sinh học khá như chống tăng đường huyết, chống béo phì, chống virus và chống khối u. Một số dẫn xuất của DNJ, như miglitol, miglustat và migalastat, đã được ứng dụng trên lâm sàng để điều trị các bệnh như tiểu đường và rối loạn lưu trữ lysosome. Ngày nay vẫn còn rất nhiều nghiên cứu cho thấy hiệu quả của việc tách chiết các hợp chất ức chế enzyme α-glucosidase từ thực vật đang được tiến hành. Tuy nhiên vẫn còn nhiều hạn chế để cho ra được sản phẩm cuối cùng trên thị trường cho tính chất phức tạp của thực vật, phụ thuộc và thời vụ, môi trường và tương đối tốn kém đặc biệt trên phạm vi công nghiệp Dược. 16
  25. 1.3.3.2. Nguồn gốc từ vi sinh vật Nguồn nguyên liệu vô cùng phong phú đến từ tự nhiên, phục vụ rất lớn cho lĩnh vực Công nghệ sinh học chính là vi sinh vật bởi lẽ chúng có một quần thể vô cùng rộng lớn, sức sống và phát triển mạnh và không gây ô nhiễm môi trường xung quanh. Chính vì vậy hướng đi phát triển các AGIs từ vi sinh vật là một hướng phát triển tiềm năng đã và đang được rất nhiều nhà nghiên cứu chọn lựa và đã có rất nhiều ưu điểm trên thị trường. Acarbose, cấu trúc O-[4,6-dideoxy-4[1s-(1,4,6/5)-4,5,6-trihydroxy-3- hydroxymethyl-2-cyclohexen-1-yl ] -amino- -D-glucopyranosyl] - (1 -> 4) - O- -D- glucopyranosyl- (1 -> 4) -D-glucopyranose, được tách chiết lần đầu từ hỗn hợp hoạt chất chuyển hóa thứ cấp trong môi trường nuôi cấy xạ khuẩn Actinoplanes sp. SE50 năm 1977 [24]. Sau đó các nhà khoa học đã tiếp tục tìm thấy hoạt chất này trong nhiều loài xạ khuẩn khác như: Actinoplanes sp. CKD485-1, Actinoplanes utahensis ZJB-08196, Actinoplanes sp. A56. Về cấu trúc, acarbose có bản chất tương tự một oligosaccharide gồm 4 phân tử carbohydrate trong đó 2 phân tử đầu tiên nối với bởi liên kết N-glycoside thay vì liên kết O-glycoside. Về cơ chế gây tác dụng sinh học, acarbose có cấu trúc tương tự như phân tử oligosaccharide – sản phẩm thủy phân của tinh bột trong đường tiêu hóa nhưng có ái lực với α-glucosidase cao hơn 104 - 105 lần. Do đó, acarbose cạnh tranh thuận nghịch với phân tử oligosaccharid từ tinh bột tại trung tâm hoạt động của enzyme α-glucosidase dẫn tới ức chế enzyme. Ngoài ức chế enzyme α-glucosidase theo cơ chế cạnh tranh thì acarbose còn ức chế enzyme α- amylase từ Aspergillus oryzae và α-amylase từ tụy người. Acarbose lần đầu tiên được đưa ra thị trường tại Đức bởi hãng Bayer vào năm 1990 và được FDA của Mỹ cấp phép năm 1995 để điều trị ĐTĐ tuýp 2. Hiện nay trên thị trường Việt Nam nó được bán với tên biệt dược là dorobay, glucobay hay glucarbose (100 mg). Valiolamine, một aminocyclitol đã được phân lập từ môi trường lên men của Streptomyces hygroscopicus subsp. limoneus và cấu trúc của nó đã được xác định là (1(OH),2,4,5/1,3)-5-amino-1-C-(hydroxymethyl)-1,2,3,4-cyclohexalletetrol. Valiolamine được nhận thấy thể hiện hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase, chống lại sucrase, maltase và isomaltase; mạnh hơn khi so với valienamine, validamine và hydroxyvalidamine – những hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase cũng được phân lập từ dịch lên men vi sinh vật [30]. Tại Hội nghị khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 2013, tác giả Đỗ Thị Tuyên cùng các cộng sự đã công bố nghiên cứu tách chiết và tinh sạch hoạt chất DNJ 17
  26. ức chế enzyme α-glucosidase từ chủng Bacillus subtilis VN9 phân lập tại Việt Nam [4]. Với dịch lên men nuôi cấy chủng vi khuẩn trên, nhóm nghiên cứu này đã tiến hành tủa cồn, cô đặc, chạy qua cột than hoạt tính và cột sephadex G75 thu được hợp chất với hiệu suất tinh sạch là 39,7%. Hợp chất cuối cùng này được đem đi thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase đạt 93% và bền với nhiệt. Bên cạnh đó, hợp chất này cũng được chạy sắc ký bản mỏng cùng với mẫu chuẩn DNJ và cho kết quả tương đồng với Rf = 0,34, kết quả phù hợp với số liệu được công bố quốc tế [40]. Từ các công bố trong nước cũng như thế giới, chúng tôi nhận định rằng có rất nhiều các nghiên cứu đã cho kết quả tích cực từ việc khai thác, tách chiết tinh sạch các hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase có sẵn trong tự nhiên. Đây cũng là tiền đề để chúng tôi tiếp tục quá trình nghiên cứu các điều kiện phù hợp cho quá trình tách chiết, tinh sạch hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ chủng Aspergillus niger - một chủng nấm mốc với nhiều tiềm năng ở Việt Nam. 1.4. Giới thiệu về chủng nấm sợi Aspergillus niger Chủng Aspergillus niger là một trong những loài vi sinh vật quan trọng nhất được sử dụng trong công nghệ sinh học. Đây là nguồn nguyên liệu đã và đang được sử dụng trong nhiều thập kỷ để sản xuất các loại enzyme và axit citric với quy mô công nghiệp [35]. Hình 1.8. Đặc điểm hình thái bào tử chủng A. niger VTCC 031 sau nuôi cấy 7 ngày trên đĩa thạch [18] Chủng A. niger là một chủng nấm sợi (fungi) thuộc lớp Eurotiomycetes, bộ Eurotiales, họ Trichocomaceae, chi Aspergillus. Trong tự nhiên, nó được tìm thấy 18
  27. trong đất, rác thải, trong phân ủ hoặc xác thực vật đang phân hủy. Reiss (1986) đã thu thập dữ liệu về ảnh hưởng của nhiệt độ, nước và độ pH đến sự phát triển của nhiều loài Aspergilli khác nhau. A. niger có thể phát triển trong phạm vi nhiệt độ rộng từ 6– 47°C, với khoảng nhiệt độ tối ưu tương đối cao ở 35–37°C. Hoạt độ nước tối thiểu cho sự phát triển là 0,88 - tương đối cao so với các loài Aspergillus. A. niger có thể phát triển trong phạm vi pH cực kỳ rộng: 1,4–9,8. Do vậy, với những khả năng trên, đặc biệt với khả năng sinh bào tử dồi dào đã giúp chúng có thể phân phối tự do trong không khí, đảm bảo sự xuất hiện phổ biến của các loài này. Điều kiện tối ưu nữa là sự phát triển của chúng là điều kiện ấm áp và ẩm ướt [49]. Trong công nghiệp, A. niger bắt đầu được sử dụng phổ biến với công dụng sản xuất axit citric bằng công nghệ lên men tạo sinh khối loài nấm sợi này, lần đầu tiên vào năm 1919. Axit citric được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp với doanh số bán ra rất lớn, vượt qua nhiều hợp chất chuyển hóa khác như như axit gluconic. Axit citric đồng thời cũng là chất tạo axit chính trong ngành công nghiệp thực phẩm và đồ uống. Trong lĩnh vực y dược, sắt citrat được sử dụng như một nguồn cung cấp sắt và axit citric, đảm bảo sự lưu trữ máu trong cơ thể. Trong mỹ phẩm và công nghiệp vệ sinh, nó được sử dụng như một chất đệm để điều chỉnh độ pH cũng như một chất chống oxy hóa. Bên cạnh axit citric, A. niger là một nguồn phong phú cung cấp các enzyme. Pectinase, protease và amyloglucosidase đã là các enzyme đầu tiên được khai thác và ban đầu được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt [19]. Pectin, một heteropolysaccharide, là thành phần chính trong trái cây và rau quả quan trọng. Một số enzyme, bao gồm pectin esterase, endo- và exopolygalacturonidases và pectin lyases, cũng được sản xuất từ A. niger bằng phân hủy pectin. Aspergillus niger được coi là một chủng nấm an toàn do chúng không gây bệnh và phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Con người tiếp xúc với bào tử của nó hàng ngày mà không biểu hiện bệnh. Trong một số trường hợp rất hiếm gặp, khi tiếp xúc với bụi bào tử mạnh, có ghi nhận phản ứng quá mẫn ở người chỉ trong một số ít trường hợp A. niger có thể xâm nhập vào cơ thể người gây các bệnh cơ hội, tuy nhiên trong hầu hết các trường hợp này bệnh nhân đều có tiền sử bệnh nặng hoặc đang điều trị ức chế miễn dịch, hoặc có suy giảm miễn dịch nghiêm trọng. Ở các vùng nhiệt đới, nhiễm trùng tai (bệnh viêm tai) xảy ra do A. niger xâm nhập vào ống tai ngoài nhưng có thể do tổn thương cơ học của hàng rào da. Các chủng A. niger tạo ra một loạt các chất chuyển hóa thứ cấp, nhưng chỉ có ochratoxin A mới có thể được coi là độc tố 19
  28. nấm mốc. Chỉ 3–10% các chủng được kiểm tra cho thấy kết quả có tạo ra độc tốc ochratoxin A vì vậy các chủng mới phân lập và chưa xác định phải được kiểm tra để thử khả năng sản xuất ochratoxin A trước khi chúng được phát triển thành sinh vật sản xuất. Sau khi đánh giá các đặc tính sinh học thì A. niger vẫn được đánh giá là một chủng nấm có thể sản xuất an toàn với quy mô công nghiệp. 1.5. Tình hình nghiên cứu hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ chủng Aspergillus trong nước và quốc tế 1.5.1. Trên thế giới Sở hữu một nguồn các hợp chất chuyển hóa thứ cấp đa dạng, nấm là một nguồn sản xuất AGIs chính. Butyrolactone I và II được phân lập từ Aspergillus terreus trong đó butyrolactone I (IC50 = 52,17 ± 5,68 μmol/L) có hoạt tính ức chế mạnh nhất đối với glucosidase của nấm Saccharomyces cerevisiae. Với butyrolactone II, chất này kém hoạt động hơn đối với α-glucosidase (IC50 = 96,01 ± 3,70 μmol/L), so với quercetin (IC50 = 14,6 ± 3,72 μmol/L) [17]. Năm 2013, Kang và cộng sự đã phân lập thành công một chất ức chế α- glucosidase được phát triển từ chủng nấm Aspergillus oryzae N159-1, được sàng lọc từ thực phẩm lên men truyền thống của Hàn Quốc [31]. Nồng độ của chất ức chế đạt đến mức cao nhất khi nấm được nuôi cấy trong môi trường nước đậu nành thử nghiệm ở 27℃ trong 5 ngày. Chất ức chế được tinh sạch bằng cách sử dụng một loạt các bước tinh chế như phương pháp siêu lọc, sắc ký lọc gel sephadex G-25, chiết pha rắn - trao đổi cation, sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo và sắc ký rây phân tử. Hiệu suất cuối cùng của quá trình tinh sạch là 1,9%. Kết quả phân tích sắc ký lỏng-khối phổ song song (LC-MS/MS) chỉ ra rằng chất ức chế α-glucosidase tinh chế là một tri-peptide, Pro-Phe-Pro, có trọng lượng phân tử là 360,1 Da. Giá trị IC50 của peptite chống lại hoạt động của α-glucosidase là 3,1 mg/mL. Aspergillus aculeatus, một loại nấm được phân lập từ mẫu đất lấy ở Indonesia, được nuôi cấy trong môi trường lỏng để khảo sát một hợp chất mới và các nhà khoa học đã tìm ra được một chất ức chế α-glucosidase mới [16]. Chiết xuất từ sợi nấm của A. aculeatus cho thấy hoạt tính chống lại enzyme α-glucosidase của loài nấm men Saccharomyces cereviseae tương đối cao, tiềm năng trong khi chúng có hoạt tính nhẹ chống lại α-glucosidase của động vật có vú với giá trị IC50 lần lượt là 9,57 µg/mL và 470,76 mg/mL. Các kết quả nghiên cứu cho thấy A. aculeatus là một nguồn tự nhiên 20
  29. đầy hứa hẹn có vai trò như một hợp chất dẫn đường trong việc phát hiện ra thuốc trị ĐTĐ. Đến năm 2018, Wu và cộng sự tiếp tục nghiên cứu và tìm ra các chất có tiềm năng cho hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase từ loài nấm mốc Aspergillus flavus QQSG-3. Hai ete diphenyl mới (1 và 2) và bốn sesquiterpenoit phenolic bisabolane mới (3 - 6), cùng với năm dẫn xuất liên quan đã biết trước đó được phân lập từ việc nuôi cấy nấm nội sinh A. flavus QQSG-3 thu được từ một nhánh tươi của cây Kandelia obobata, được thu thập từ thành phố Huệ Châu, tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc. Trong đó, các hợp chất 3, 5, 10 và 11 cho thấy tác dụng ức chế mạnh mẽ với giá trị IC50 trong khoảng 1,5 - 4,5 μM [59]. 1.5.2. Tại Việt Nam Quá trình nghiên cứu các hợp chất ức chế enzyme α-glucosidase còn khá hạn chế. Bước đầu đã và đang xác định và tìm được một vài chủng vi sinh vật cho hoạt tính mong muốn như B. subtilis VN9, B. subtilis YT20, Streptomyces sp. và đặc biệt là chủng nấm A. niger với tiềm năng cao [4, 6, 40]. Năm 2020, Phạm Minh Hồng và cộng sự đã nghiên cứu các điều kiện để nâng cao khả năng sinh tổng hợp hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng A. niger với nhiều kết quả khả quan [7]. Từ 13 chủng A. niger có hoạt tính ức chế α-glucosidase, nghiên cứu đã sàng lọc ra được chủng A. niger VTCC 031 có khả năng sinh tổng hợp các chất có hoạt tính ức chế α-glucosidase cao đạt 39,49%. Nghiên cứu cũng chỉ ra các thành phần dinh dưỡng và các điều kiện môi trường tối ưu để nâng cao khả năng sinh tổng hợp các hợp chất ức chế enzyme α-glucosidase từ chủng A. niger gồm 1% cao malt, 5% glucose, pH 5, 37oC, lắc 200 vòng/phút, lên men trong thời gian 7 ngày. Hoạt tính ức chế α-glucosidase sau tối ưu đạt 74,07% cao gấp 1,87 lần so với môi trường nuôi cấy ban đầu. Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng chỉ ra được phương pháp tách chiết bước đầu thu nhận hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase với hai dung môi tốt nhất là n-butanol và chloroform. Chủng A. niger là một loài vi sinh vật rất tiềm năng cho việc khai thác tìm ra hướng đi mới cho các phương pháp điều trị bằng thuốc đối với bệnh ĐTĐ. Chính vì vậy cần cần thiết để tiếp tục tiến hành các điều kiện thích hợp để tách chiết và tinh sạch hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase này từ dịch lên men của A. niger, từ đó tìm ra xác định được cấu trúc cụ thể và định danh cho hoạt chất này. 21
  30. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Chủng Aspergillus niger VTCC 031 được cung cấp từ Trung tâm bảo tồn chủng giống VTCC (Đại học Quốc gia Hà Nội). Chủng được hoạt hóa trong môi trường khoáng czapek, 72 giờ ở nhiệt độ 30 oC và pH môi trường 7. 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu : - Thời gian tiến hành nghiên cứu từ tháng 11 năm 2020 đến tháng 5 năm 2021 - Địa điểm nghiên cứu tại Phòng Công nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2.3. Thiết bị phòng thí nghiệm và hóa chất 2.3.1. Thiết bị phòng thí nghiệm Các thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm thuộc phòng CNSH enzyme và Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gene, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Bảng 2.1. Thiết bị thí nghiệm Thiết bị Hãng sản xuất (Nước) Box cấy vi sinh vật clean bench TTCG Công nghệ (Việt Nam) Cân phân tích Statorius (Thụy Sỹ) Máy đo pH Metrohm (Thụy Sỹ) Máy khuấy từ Metrohm (Thụy Sỹ) Máy ly tâm lạnh Hitachi (Nhật) Máy lắc khay vi thể Esco (Mỹ) Tủ lạnh sâu Sanyo (Nhật) Máy lắc ổn nhiệt lạnh Wisecube (Hàn Quốc) Nồi hấp khử trùng Tomy (Nhật) Máy đọc Elisa Diagnostic Automation (Mỹ) 22
  31. Máy cô quay Buchi (Thụy Sĩ) Bình chiết Glassco (UK) Bản mỏng TLC silica gel 60 F254 Merck (Đức) Cột sắc ký Duran Schott (Đức) Dụng cụ thí nghiệm: Các ống ly tâm eppendorf 2,0 ml; 1,5 ml; 0,5 ml. Các ống falcon 15 ml; 50 ml. Micropipet và đầu côn phù hợp với các thể tích 0,5 - 10 µL; 10 - 100 µL; 100 - 1000 µL. Dụng cụ thủy tinh: đĩa petri, cốc có mỏ, đũa thủy tinh, nhiệt kế, ống đong, chai đựng hóa chất. Dụng cụ nhựa khác: hộp đựng mẫu, giá để ống. Các dụng cụ đều đạt chuẩn phân tích. 2.3.2. Hóa chất Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết và một số chất chính được liệt kê dưới đây: Bảng 2.2. Các hóa chất sử dụng Tên hóa chất Hãng sản xuất (Nước) Acarbose Bayer (Đức) Cao malt Bio Basic Canada Inc (Canada) Agar (Việt Nam) D-glucose Xilong (Trung Quốc) Methanol Xilong (Trung Quốc) Iod Việt Nam Αlpha glucosidase, cơ chất p-nitrophenyl- Sigma (Mỹ) α-D-glucopyranoside Chloroform Merck (Đức) n-butanol Merck (Đức) Acid acetic Merck (Đức) Ethyl acetate Xilong (Trung Quốc) Silica gel 60 (0,063-0,2mm) Merck (Đức) 23
  32. Các dung dịch và đệm sử dụng được pha theo hướng dẫn của các bài thí nghiệm chuẩn có thành phần và nồng độ theo thành phần và nồng độ như sau: Bảng 2.3. Thành phần các loại đệm và dung dịch Dung dịch Thành phần, nồng độ Cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside nồng độ Cơ chất p-nitrophenyl-α- 5 mM pha trong đệm sodium phosphate 0,1 M pH D-glucopyranoside 6,9 α-glucosidase α-glucosidase 1-2 U/ml pha trong đệm sodium phosphate 0,1 M pH 6,9 Sodium phosphate 0,1 M 45% (v/v) NaH2PO4 và 55% (v/v) K2HPO4 Các hoá chất thông thường khác: HCl, NaOH, ethanol, nước khử RO. Các hoá chất này đều đạt tiêu chuẩn phân tích. 2.4. Môi trường nuôi cấy Môi trường hoạt hóa Czapek: 0,1% (w/v) NaNO3; 0,1% (w/v) K2HPO4; 0,05% o (w/v) MgSO4; 0,05% (w/v) KCl; 2% sucrose; pH 6,5; khử trùng 121 C, 1 atm, trong 15 phút. Môi trường nuôi cấy nấm: 5% D-glucose, 1% cao malt, pH 5, 37oC, lắc 200 vòng/phút, nuôi trong thời gian 7 ngày. 2.5. Quy trình tiến hành nghiên cứu Để thực hiện mục tiêu của đề tài, chúng tôi tiến hành tinh sạch hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase bằng cách chiết dịch nuôi cấy của chủng A. niger với n- butanol, tiếp đó là với hỗn hợp chloroform: methanol (1:1). Sau đó dịch chiết được chạy qua cột sắc ký silica gel 60 Mesh, và đánh giá hoạt tính cũng như mức độ tinh sạch hoạt chất ức chế từ dịch nuôi cấy đến sản phẩm tinh sạch cuối cùng. Khi đã tinh sạch, tiến hành đo IC50 của dịch chiết n-butanol, sản phẩm tinh sạch cuối cùng và acarbose làm đối chứng. Sau cùng chúng tôi sẽ kiểm tra độ sạch của mẫu tinh sạch cuối cùng bằng các phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS). Nội dung nghiên cứu được mô tả tóm tắt ở Hình 2.1. 24
  33. Tách chiết, tinh sạch hoạt Nghiên cứu chọn lựa các hệ dung chất ức chế α-glucosidase từ môi pha động chạy sắc ký cột ch ủng Aspergillus niger bằng thử sắc ký bản mỏng VTCC 031 Tinh sạch bằng cột sắc ký silica gel 60 Xác định giá trị IC50 của dịch chiết n-butanol và sản phẩm cuối tinh sạch Kiểm tra độ sạch bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao và sắc ký lỏng khối phổ Hình 2.1. Sơ đồ quy trình nghiên cứu 2.6. Phương pháp nghiên cứu 2.6.1. Xác định hoạt tính chất ức chế α-glucosidase Nguyên lý: α-glucosidase là enzyme thủy phân liên kết α-1,4-glycoside. Cơ chất sử dụng là p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid, chất này khi bị enzyme thủy phân sẽ tạo ra p-nitrophenyl có màu vàng và hấp thụ ở bước sóng 405nm. Khi α- glucosidase bị ức chế một phần, lượng p-nitrophenyl sinh ra sẽ ít hơn so với không có mặt của chất ức chế α-glucosidase, sự thay đổi này được xác định thông qua mật độ quang khi đo ở bước sóng 405 nm [28]. Các bước tiến hành: - Mỗi giếng bổ sung 40 µl đệm 0,1 M sodium phosphat pH 6,9; sau đó thêm vào mỗi giếng 10 µl dịch mẫu trong (đối với mẫu đối chứng thay bằng 10 µl đệm 0,1 M sodium phosphate pH 6,9 hoặc dung dịch môi trường nuôi cấy khi chưa bổ sung chủng vi sinh vật hoặc dung môi) - Thêm vào mỗi giếng 100 µl α-glucosidase 1-2 U/ml được pha trong đệm 0,1 M sodium phosphate pH 6,9. 25
  34. - Ủ hỗn hợp ở 30ºC, 10 phút, lắc 300 vòng/phút. - Thêm 50 µl cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside pha trong đệm 0,1M sodium phosphate pH 6,9. - Trộn hỗn hợp ủ ở 37ºC, 5 phút, lắc 300 vòng/phút - Đo OD405 thời điểm 0 phút và 5 phút khi cho cơ chất. Phần trăm ức chế α-glucosidase được xác định theo công thức: (∆ −∆ ) % Ức chế = đ 푡푛 × 100% ∆ đ Trong đó: ∆ đ : là sự thay đổi giá trị OD405 ở thời điểm 0 phút và 5 phút của mẫu đối chứng. ∆ 푡푛: là sự thay đổi giá trị OD405 ở thời điểm 0 phút và 5 phút của mẫu thí nghiệm. 2.6.2. Tách chiết, tinh sạch hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ dịch nuôi cấy Sau khi khảo sát, quá trình tinh sạch hoạt chất ức chế α-glucosidase từ môi trường nuôi cấy của nấm sợi A. niger VTCC 031 được tiến hành như sau: 26
  35. Hình 2.2. Các bước tiến hành tinh sạch hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng A. niger VTCC 031 2.6.2.1. Phương pháp sắc ký cột silica gel 60 Nguyên lý Sắc ký cột là một kỹ thuật phân tích phổ biến tại các phòng thí nghiệm dùng để tách hỗn hợp các chất hóa học thành các hợp chất riêng lẻ khác nhau. Sắc ký cột bao gồm hai pha pha động và pha tĩnh. Cột sắc ký silica gel có chữa thành phần pha 27
  36. tĩnh là các hạt hấp phụ rắn silica gel với nhiều loại kích thước (60-400 mesh), được nhồi trong cột thủy tinh thẳng đứng. Pha động dạng lỏng, được rót vào từ trên đỉnh cột và chảy xuống dưới cột nhờ tác dụng của trọng lực hoặc của áp suất bên ngoài (trong sắc ký cột nhanh – flash chromatography). Quá trình phân tách các chất đạt được nhờ khả năng hấp thụ (kết dính) khác nhau với pha động, pha tĩnh (với silica gel) của từng thành phần trong mẫu hoặc hỗn hợp hợp chất khác nhau. Thành phần có liên kết với với pha tĩnh càng lớn, sẽ càng di chuyển chậm trên cột sắc ký và ra khỏi cột sau. Trong nghiên cứu, chúng tôi lựa chọn hệ dung môi có độ phân cực thấp và silica gel pha thường cỡ hạt là 0,063 - 0,200 mm (Merck). Tiến hành Dịch chiết cuối (dịch lên men sau khi được chiết với n-butanol và tiếp đó là hỗn hợp chloroform: methanol) được lên cột sắc ký silica gel 60 có kích thước cột là (52 x 2 cm), được cân bằng với methanol. Tốc độ dòng chảy khoảng 25 ml/giờ. Thu thể tích mỗi phân đoạn 2 ml. Mỗi phân đoạn được đánh giá độ tinh sạch bằng sắc ký bản mỏng và đo hoạt tính. 2.6.2.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin-layer chromatography - TLC) Nguyên tắc Việc tách các chất trong sắc ký lớp mỏng dựa trên sự phân bố của các chất giữa hai pha: pha cố định (là chất hấp phụ được trải rộng trên bề mặt kính hoặc nhôm tạo thành một lớp mỏng); pha di động (là một dung môi thích hợp được đựng trong một bình có nắp đậy kín, trong đó đặt phiến kính). Nhờ lực mao dẫn, dung môi pha động di chuyển trên pha tĩnh, kéo theo các chất trong mẫu. Các chất di chuyển với tốc độ nhanh chậm khác nhau nên chúng dần dần được tách ra khỏi nhau dưới dạng các vết trên bản mỏng. Để đánh giá khả năng phân tách của từng chất trên bản sắc ký người ta quan tâm đến giá trị Rf đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất trong hệ thống sắc ký [47]. 푅 = Trong đó: a – Khoảng cách chuyển dịch của chất phân tích b – Khoảng cách chuyển dịch của chất dung môi Kết quả phân tách các chất trên bản sắc ký có thể được hiển thị bằng các phản ứng màu đặc trưng kèm theo việc so sánh với chất chuẩn. Khi việc phân tách các chất 28
  37. trong hỗn hợp không rõ ràng, người ta có thể thay đổi thành phần và (hoặc) tỷ lệ của các dung môi trong hỗn hợp dung môi sắc ký. Việc bổ sung các chất không phân cực cũng như tăng tỷ lệ của chúng sẽ tạo điều kiện cho các chất ít phân cực chạy nhanh hơn khỏi vạch xuất phát và ngược lại [9]. Tiến hành Chuẩn bị bản mỏng: Chuẩn bị bản mỏng theo kích thước mong muốn, sấy bản mỏng (khoảng 110ºC) trong tủ sấy nếu độ ẩm lớn hơn 60%. Tra mẫu: Đánh dấu vạch xuất phát của mẫu, cách ở mép dưới của bản mỏng khoảng 1cm. Dùng pipet loại nhỏ (micropipet) hoặc dùng ống chấm sắc ký có chia vạch thể tích (5-10 μl) để hút mẫu và chấm lên các vị trí đã được đánh dấu trên bản gel. Để các vết chấm khô hoàn toàn. Chạy sắc ký: Đặt bản gel sau khi chấm mẫu vào hệ thống bình sắc ký có nắp đậy, trong đó có chứa dung môi pha động gồm n-butanol : acid acetic : H2O (tỉ lệ 3:1:1). Mức dung môi luôn được giữ thấp hơn vạch xuất phát của mẫu. Dung môi sẽ theo lớp gel để chạy ngược lên và mang theo các chất cần phân tích. Khi vạch dung môi chạy đến gần mép trên của bản gel sắc ký thì phải làm ngừng quá trình sắc ký [9]. Bản gel được lấy ra, làm khô dung môi. Phát hiện vết: Kết quả phân tách các chất trên bản sắc ký được hiển thị bằng phản ứng màu đặc trưng dưới tác dụng của iod thăng hoa. 2.6.2.3. Nghiên cứu chọn lựa các hệ dung môi pha động chạy sắc ký cột Tiến hành sắc ký bản mỏng mẫu dịch lên men và dịch chiết cuối với CHCl3 với các hệ dung môi khác nhau để khảo sát khả năng phân tách các chất trong mẫu trên nền bản mỏng silica gel. Các hệ dung môi lần lượt được khảo sát là: - n-butanol : acid acetic : H2O = 3:1:1 - n-butanol : acid acetic : H2O = 2:2:1 - n-butanol : acid acetic : H2O = 4:2:1 - n-butanol : acid acetic : H2O = 5:3:2 - n-butanol : acid acetic : H2O = 5:1:4 - n-butanol : methanol : H2O = 5:3:2 - n-butanol : ethanol : H2O = 5:3:2 - n-butanol : methanol : H2O = 5:1:4 - n-butanol : acid acetic : ethyl acetat : H2O = 3:1:1:1 29
  38. 2.6.3. Xác định giá trị IC50 IC50 (nồng độ gây 50% hoạt tính ức chế) là một thước đo trong việc ức chế một chức năng sinh học hoặc hóa sinh đặc biệt. IC50 là một biện pháp định lượng cho biết mức độ cần thiết của một chất ức chế cụ thể để ức chế một quá trình sinh học nhất định hoặc thành phần sinh học bằng 50%. Thành phần sinh học có thể là enzyme, tế bào, thụ thể tế bào hoặc vi sinh vật. Giá trị IC50 thường có đơn vị là mmol/ml hoặc µg/ml. Các tiến hành xác định IC50 - Pha các dung dịch mẫu thử với các nồng độ thay đổi - Tiến hành đo hoạt tính ức chế α-glucosidase lần lượt các mẫu trên - Xác định phương trình đường chuẩn với R2 gần 1 là tối ưu - Từ đó tính ra nồng độ mẫu gây ra 50% hoạt tính ức chế 2.6.4. Kiểm tra độ tinh sạch bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao và sắc ký lỏng khối phổ Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) (sắc ký lỏng cao áp) ra đời 1967 - 1968 trên cơ sở cải tiến cao phương pháp sắc ký cột cổ điển. Đây cũng là một kỹ thuật để tách hỗn hợp các chất thành các thành phần riêng biệt dựa trên sự tương tác giữa chất phân tích với pha động (thường là chất lỏng) và pha tĩnh (thông thường là các chất rắn), dưới tác động của máy bơm áp suất cao để cho phép tách nhanh hơn. Để thực hiện kiểm tra độ tinh sạch, trong quá trình qua cột, mẫu thử được phát hiện các chất bằng việc sử dụng hệ thống đầu dò (detector). Hoạt động của đầu dò là để theo dõi dòng chảy dung môi giải ly cột để biết khi nào thì các hợp chất đi ra khỏi cột. Mỗi loại đầu dò có một nguyên tắc hoạt động khác nhau nhưng đều phải đạt đến mục đích cuối cùng bằng một tín hiệu điện tử và tiến hiệu này phải tỉ lệ với một số tính chất của chất phân tích như: mức hấp thụ UV, chỉ số khúc xạ Mức độ đáp ứng đầu dò phải tỉ lệ với số lượng của mỗi chất phân tích hiện diện trong hỗn hợp mẫu phân tích. Tùy theo tính chất của chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại đầu dò thích hợp và phải thỏa mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng đầu dò hấp thụ tia UV và đầu dò đo khối phổ (LC/MS). 30
  39. Bảng 2.4. Tính chất đặc trưng của đầu dò hấp thụ UV và đầu dò khối phổ Loại Giới Mức Nhạy Nhạy Hữu ích với Loại mẫu đầu dò hạn tuyến cảm với cảm với dung môi phân tích phát tính tốc độ nhiệt pha động phù hợp hiện dòng độ tăng phân (g/ml) chảy cực gradient UV 5.10-10 104-105 Không Thấp Có Hợp chất thơm, có nhiều nối đôi liên hợp. Khối 10-10 104-105 Không Không Có Tất cả các phổ loại hợp chất Một đầu dò sắc ký lỏng lý tưởng phải đạt một số tiêu chuẩn mà trong đó đầu đò khối phổ thỏa mãn phần lớn. Đó là đồ bền cao, không làm hư hại mẫu phân tích; có độ nhạy cao và cho kết quả có tính lặp lại; cho đáp ứng tương đối đối với những chất phân tích có cấu trúc hóa học tương đồng; không thay đổi khi có sự thay đổi nhiệt độ, áp suất; có thời gian đáp ứng ngắn, độc lập với vận tốc dòng chảy và dung môi rửa giải và dễ sử dung 2.6.5. Phương pháp xử lý số liệu Các thí nghiệm được tiến hành 3 lần độc lập, kết quả thu được xử lý và minh họa hình ảnh với phần mềm Microsoft Excel 2016. 31
  40. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả tinh sạch hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ chủng A. niger VTCC 031 3.1.1. Kết quả quá trình tách chiết hoạt chất ức chế α-glucosidase bằng chiết với các dung môi Chủng Aspergillus niger VTCC 031 được hoạt hóa trong môi trường khoáng Czapek, 72 giờ ở nhiệt độ 30 oC và pH môi trường 7. Sau đó, chiết chủng này từ đĩa thạch vào bình tam giác chứa môi trường 5% D-glucose, 1% cao malt, pH 5, nhiệt độ 37oC, lắc 200 vòng/phút, nuôi trong thời gian 7 ngày nhằm nuôi cấy vi sinh vật, thu dịch lên men (Hình 3.1). Dịch lên men sau nuôi cấy được xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase đạt 85,19%. (Bảng 3.1) Hình 3.1. Thu hoạch bình nuôi cấy chủng A. niger Khảo sát các nghiên cứu trước đó [6, 7, 16, 52], chúng tôi tiến hành tinh sạch hoạt chất ức chế α-glucosidase bằng cách chiết dịch sau lên men của chủng nấm A. niger VTCC 031 với hỗn hợp các dung môi sau đó tiến hàng chạy sắc ký cột để thu hoạt chất tinh sạch. Dịch sau lên men 7 ngày được đưa vào ống falcon (50 ml), ly tâm 4000 vòng/phút, 5 phút, 4oC, loại bỏ tế bào và các tạp chất. Dịch trong thu được dùng xác định hoạt tính ức chế -glucosidase và kiểm tra trên sắc ký bản mỏng (TLC). Sử dụng 100 ml dịch sau lên men để tiến hành tách chiết trong n-butanol theo tỉ lệ dịch sau lên 32
  41. men: dung môi = 1:1 (chiết 3 lần), lắc 40 phút ở nhiệt độ phòng, dịch chiết n- butanol thu được sau ly tâm 4000 vòng/phút, 10 phút, Dịch chiết n-butanol được cất cô quay thu cặn chiết cặn được hòa tan trong 20 ml hỗn hợp dung môi CHCl3: methanol (1:1). Lắc 30 phút, ly tâm 4000 vòng/phút, o 15 phút, 4 C, thu dịch chiết CHCl3-MeOH Hai mẫu dịch chiết n-butanol và dịch chiết CHCl3-MeOH được tiến hành xác định đo hoạt tính ức chế α-glucosidase và đạt kết quả lần lượt là 42,9% và 28,8% Bảng 3.1. Quá trình tách chiết hoạt chất ức chế α-glucosidase bằng các dung môi Mẫu Khối lượng Hiệu suất Hoạt tính ức chế cắn khô (g) thu hồi (%) α-glucosidase (%) Dịch lên men 3,8 100 85,19 Dịch chiết n-butanol 1,362 35,84 42,9 Dịch chiết CHCl3 - MeOH 1,04 27,36 28,8 Tiếp đó dịch chiết CHCl3-MeOH được tiến hành cô quay thu cặn chiết, và tính khối lượng cặn. Hòa tan cặn trong 5 ml methanol, rồi tiến hành chạy sắc ký cột silica gel 60. Tuy nhiên trước đó chúng tôi tiến hành thử các hệ dung môi tối ưu để chọn hệ dung môi pha động có hiệu quả phân tách các chất tốt nhất qua cột sắc ký silica gel 60. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của dịch nuôi cấy chủng A. niger đạt 85,19% cho thấy tiềm năng lớn trong nghiên cứu thuốc điều trị bệnh đái tháo đường của chủng vi sinh vật này. Tương tự như vậy, năm 2016, Singh và cộng sự đã sàng lọc hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ chủng Aspergillus awamori có hoạt tính lên tới 80% và xác định cấu trúc của các hoạt chất này [52]. Khi so sánh với các chi khác, hoạt tính ức chế cũng tương tự, và chúng đều là những hoạt chất tiềm năng để tiếp tục đi vào thử nghiệm tiền lâm sàng trên động vật trong điều trị ĐTĐ. Thực vậy, năm 2020, Mai Văn Hiên đã báo cáo về tiềm năng của hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng Streptomyces costaricanus HB6 và hoạt tính của nó đạt đến 84,97% [6]. Nguyễn Tiến Cường và cộng sự (2021) cũng đã nghiên cứu, tối ưu các điều kiện nuôi cấy chủng B. subtilis YT 20 phân lập ở Việt Nam. Chủng B. subtilis YT 20 có khả năng sinh tổng 33
  42. hợp hoạt chất ức chế α-glucosidase lên đến 91,5% sau khi được nuôi trong môi trường tối ưu [40]. 3.1.2. Nghiên cứu chọn lựa các hệ dung môi pha động chạy sắc ký cột Sau quá trình khảo sát 9 hệ dung môi, kết quả TLC thu được khi chạy với cùng 2 mẫu là dịch chiết n-butanol và dịch chiết CHCl3-MeOH, cụ thể như Hình 3.2. (I) (II) (III) (IV) (V) (VI) (VII) (VIII) (IX) Hình 3.2. Khả năng tách các chất trong các mẫu dịch chiết khi sử dụng 9 hệ dung môi khác nhau Chú thích: Thành phần các hệ dung môi lần lượt là (I) n–butanol : acid acetic : H2O = 3:1:1; (II) n-butanol : acid acetic : H2O = 2:2:1; (III) n-butanol : acid acetic : H2O = 4:2:1; (IV) n-butano l: acid acetic : H2O = 5:3:2; (V) n-butanol : acid acetic : H2O = 5:1:4; (VI) n-butanol : methanol : H2O = 5:3:2; (VII) n-butanol : ethanol : H2O = 5:3:2; (VIII) n-butanol : methanol : H2O = 5:1:4; (IX) n–butanol : acid acetic : ethyl acetat : H2O = 3:1:1:1. Với hai mẫu được chạy 1 là dịch chiết n-butanol và 2 là dịch chiết CHCl3-MeOH Kết quả trên cho thấy hệ dung môi (IX) n-butanol : ethyl acetat : acid acetic : H2O với tỉ lệ 3:1:1:1 có khả năng tách các chất trong dịch chiết một cách rõ ràng nhất, với các vạch rõ ràng, riêng rẽ. Việc sử dụng hệ dung môi này cũng phù hợp với nhiều nghiên cứu khác về tối ưu và phân lập hoạt chất ức chế α-glucosidase. Năm 2020, trong nghiên cứu tối ưu môi trường nuôi cấy chủng A. niger nhằm sinh tổng hợp hoạt chất ức chế α-glucosidase, Phạm Minh Hồng đã sử dụng hệ dung môi n-butanol : acid acetic : H2O với tỉ lệ 3:1:1 để chạy sắc ký bản mỏng trong bước đầu tinh sạch hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng A. niger [7]. Bên cạnh đó, tác giả Mai Văn Hiên (2020) trong quá trình tinh sạch hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ chủng 34
  43. xạ khuẩn Streptomyces sp. phân lập ở Việt Nam cũng sử dụng hệ dung môi n-butanol : acid acetic : H2O với tỉ lệ 5:1:4 để chạy sắc ký bản mỏng kiểm tra các mẫu tinh sạch sơ bộ [6]. Năm 2013, Ali và cộng sự sử dụng hệ dung môi n-butanol : acid acetic : H2O với tỉ lệ 4:1:5 làm dung môi pha động chạy sắc ký bản mỏng để kiểm tra độ tinh sạch của các mẫu dịch chiết từ cây Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl (Thymelaceae) [10]. 3.1.3. Kết quả tinh sạch bằng cột sắc ký silica gel 60 Để tinh sạch hoạt chất ức chế enzym α-glucosidase, cặn chiết thu được sau khi cô quay dịch chiết CHCl3-MeOH được hòa trong methanol và đưa lên cột sắc ký silica gel 60. Thể tích dịch lên cột là 5 ml, tốc độ dòng chảy khoảng 25 ml/h, thu thể tích mỗi phân đoạn 2 ml (thu 30 phân đoạn). Chúng tôi tiến hành lên cột 2 lần để thu được mẫu tinh sạch nhất với dung môi pha động là hệ dung môi n-butanol : ethyl acetat : acid acetic : H2O với tỉ lệ 3:1:1:1. Sau lần qua cột thứ nhất, các phân đoạn được chạy sắc ký bản mỏng để xác định được các phân đoạn có độ sạch cao và có hoạt tính ức chế - glucosidase cao nhất. Kết quả chạy TLC được trình bày trong hình 3.3. Hình 3.3. Sắc ký lớp mỏng kiểm tra độ tinh sạch các phân đoạn qua cột silica gel lần thứ nhất (DN: Dịch nổi; DC nBu: dịch chiết n-BuOH; 1-29: các phân đoạn thu được sau khi tinh sạch qua cột lần thứ nhất) Từ kết quả chạy TLC nhận thấy, các phân đoạn từ 17 đến 21 là các phân đoạn có băng đều chứa vết của chất có hoạt tính (hệ số Rf = 0,52) đậm, rõ ràng và ít chất tạp. Kết quả thử hoạt tính cũng cho thấy chúng có hoạt tính ức chế enzyme α- 35
  44. glucosidase. Vì vậy, cần kiểm tra lại lần nữa độ tinh sạch của các phân đoạn từ 17 đến 21, chúng tôi tiếp tục tiến hành chạy sắc ký bản mỏng với hàm lượng mỗi mẫu là 20 µl. Kết quả chạy TLC được trình bày trong hình 3.4. Nhận thấy vẫn còn một lượng tạp nhỏ tại mỗi phân đoạn do đó tiến hành gộp các phân đoạn từ 17 đến 21 và cho chạy cột sắc ký silica gel 60 lần thứ 2. Hình 3.4. Sắc ký lớp mỏng kiểm tra độ tinh sạch các phân đoạn từ 17 đến 21 sau khi qua cột silica gel lần thứ nhất ( DLC L1: mẫu trước khi lên cột lần thứ nhất; 17-21: các phân đoạn sau khi tinh sạch qua cột silica gel lần 1) Gộp các phân đoạn từ 17 đến 21 (5 ml) đưa lên cột lần thứ hai, với việc sử dụng hệ dung môi n-butanol : ethyl acetat : acid acetic : H2O với tỉ lệ 3:1:1:1 nhằm làm sạch hơn nữa các mẫu phân đoạn. Kết quả thu được 30 phân đoạn. Các phân đoạn được chạy TLC để xác định phân đoạn có độ sạch cao, đồng thời thử hoạt tính các phân đoạn tìm được. Kết quả chạy TLC được trình bày trong hình 3.5. 36
  45. Hình 3.5. Sắc ký lớp mỏng kiểm tra độ tinh sạch các phân đoạn qua cột silica gel lần hai (DLC L2: mẫu trước khi lên cột lần hai; 1-29: các phân đoạn sau khi tinh sạch qua cột silica gel lần 2) Sau khi kiểm tra các phân đoạn qua cột lần 2, nhận thấy có phân đoạn từ 25- 30 đã khá sạch, kết quả chạy TLC chỉ xuất hiện 1 vết của chất có hoạt tính chất tương đối rõ. Từ đó tiến hành gộp các phân đoạn này để thử hoạt tính ức chế α-glucosidase và cô quay thu cặn chiết để xác định IC50 và bước đầu xác định cấu trúc hoạt chất quan tâm. Kết quả tổng quát về hiệu suất thu hồi và hoạt tính ức chế enzyme α- glucosidase của các mẫu từ dịch nuôi cấy đến sản phẩm tinh sạch cuối cùng được trình bày trong bảng 3.1. Bảng 3.2. Tóm tắt quá trình tinh sạch thu nhận hoạt chất ức chế α- glucosidase từ chủng A. niger VTCC 031 Mẫu Khối lượng Hiệu suất Hoạt tính ức chế cắn khô (g) thu hồi (%) α-glucosidase (%) Dịch lên men 3,8 100 85,19 Dịch chiết n-butanol 1,362 35,84 42,9 Dịch chiết CHCl3 - MeOH 1,04 27,36 28,8 Mẫu tinh sạch cuối cùng 0,0044 0,116 45,75 sau khi qua cột silica gel 37
  46. Hình 3.6. Kiểm tra độ tinh sạch cả quá trình bằng TLC (1-dịch lên men, 2- dịch chiết n-butanol, 3-dịch chiết CHCl3-MeOH, 4-phân đoạn 25 lần 1, 5-phân đoạn 30 lần 2) Như vậy, mẫu tinh sạch thu được sau khi dịch lên men từ chủng A. niger VTCC 031 được chiết bằng hai bước dung môi với n-butanol và chiết bằng CHCl3: MeOH (1:1), cặn chiết được hòa tan trong DMSO và đưa qua cột silicagel 2 lần sử dụng hệ dung môi n-butanol: ethyl acetat: acid acetic: H2O với tỉ lệ 3:1:1:1, cho một vết hoạt chất đậm nét với giá trị Rf = 0,52 với hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase đạt 45,75%, với hiệu suất là 0,116%. Kết quả thử hoạt tính ức chế α-glucosidase của dịch nuôi cấy, dịch chiết n- butanol khá tương đồng với báo cáo của Phạm Minh Hồng năm 2020 trong nghiên cứu tối ưu hóa môi trường nuôi cấy chủng A. niger tổng hợp hoạt chất ức chế α- glucosidase [7]. Tuy nhiên vị trí vết hoạt chất trên băng TLC có sự khác biệt khi chúng tôi xác định được Rf = 0,52 thì Phạm Minh Hồng đã xác định Rf = 0,82 sử dụng hệ dung môi n- butanol: axit axetic: H2O theo tỉ lệ (3:1:1). Sự chênh lệch giữa hai giá trị Rf trên có thể là do sự khác nhau của các hệ dung môi được chọn làm pha động khi thực hiện TLC. Kiểm tra độ sạch của sản phẩm tinh sạch cuối cùng bằng đầu dò UV của HPLC thì kết quả cho thấy tại trong mẫu thử còn đến 3 chất ở các thời gian lưu tương ứng từ 20,273 phút, 21,368 phút và 22,975 phút (vẫn còn tạp bên cạnh hoạt chất chính cần tinh sạch) và phổ khối LC/MS cho khối lượng các chất tương ứng là 299,0 m/z, 447,1 m/z và 512,4 m/z (Hình 3.7). 38
  47. A B Hình 3.7. Kiểm tra độ tinh sạch bằng HPLC (A) và LC/MS (B) Lý do ở đây có thể giải thích là ba chất này có độ tương đồng lớn về độ phân cực dẫn đến chúng di chuyển rất sát nhau trong quá trình lên cột sắc khi dưới tác động của dung môi pha động (nhìn rõ trong kết quả HPLC). Điều này cho thấy khả năng có thể hệ dung môi sử dụng vẫn chưa phải là hệ dung môi lý tưởng nhất để tách các chất trong dịch chiết để thu hồi hoạt chất tinh sạch. Ngoài 3 chất chính còn các tạp nhỏ, cần xem xét tinh sạch tiếp tục cũng như hạn chế các tác nhân nhiễm tạp từ môi trường trong quá trình tinh sạch. Đề xuất giải pháp để tiếp tục tinh sạch là tiếp tục sắc ký cột silica gel với một hệ dung môi pha động thích hợp hơn. 39
  48. 3.2. Xác định IC50 của dịch chiết n-butanol và mẫu tinh sạch cuối cùng 3.2.1. IC50 dịch chiết n-butanol Từ 100 mg cắn khô sau khi cất cô quay dịch chiết n-butanol được pha thành các mẫu S1 đến S10 với các nồng độ khác nhau lần lượt là 10, 20, 30, , 100 mg/ml trong dung môi methanol. Các mẫu được xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase. Kết quả được thể hiện trên Bảng 3.2. Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính tại các nồng độ khác nhau của dịch chiết n-butanol Hoạt tính ức chế STT Mẫu Nồng độ (mg/ml) α-glucosidase (%) 1 S1 10 6,98 2 S2 20 6,98 3 S3 30 10,47 4 S4 40 18,60 5 S5 50 29,07 6 S6 60 29,07 7 S7 70 32,56 8 S8 80 40,70 9 S9 90 43,02 10 S10 100 53,49 40
  49. 60.00 y = 0.5236x - 1.7054 50.00 R² = 0.9703 (%) 40.00 30.00 20.00 Hoạt tính ức chế 10.00 0.00 0 20 40 60 80 100 120 Nồng độ (mg/ml) Hình 3.8. Xây dựng đường chuẩn hoạt tính ức chế α-glucosidase của dịch chiết n-butanol 100 y = 0.6537x + 29.629 80 R² = 0.9848 (%) 60 40 Hoạt tính ức chế 20 0 0 20 40 60 80 100 120 Nồng độ (µg/ml) Hình 3.9. Xây dựng đường chuẩn hoạt tính ức chế α-glucosidase của acarbose tinh khiết (Sigma) 3.2.2. IC50 sản phẩm tinh sạch cuối Các phân đoạn có hoạt tính ức chế α-glucosidase sau khi qua cột silica gel lần 2 được gộp lại và cất cô quay thu cặn. Từ cắn khô sau khi cất cô quay sản phẩm tinh sạch cuối cùng, chúng tôi tiến hành pha thành các mẫu S1 đến S5 với các nồng độ tương ứng là 500, 1000, 1500, 2000, 2500 µg/ml trong methanol. Các mẫu được xác 41
  50. định hoạt tính ức chế α-glucosidase. Kết quả xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase được thể hiện ở Bảng 3.3. Bảng 3.4. Hoạt tính ức chế α-glucosidase ở các nồng độ khác nhau của mẫu tinh sạch cuối Hoạt tính ức chế STT Mẫu Nồng độ (µg/ml) α-glucosidase (%) 1 S1 500 2,3 2 S2 1000 6,40 3 S3 1500 9,15 4 S4 2000 13,95 5 S5 2500 14,90 Từ các kết quả trên, chúng tôi tiến hành dựng đường chuẩn thể hiện cho hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của mẫu tinh sạch cuối cùng (Hình 3.10) và xác định được giá trị IC50 = 7649 g/ml so IC50 của acarbose tinh khiết (Sigma) là 31,16 g/ml (Hình 3.9). 18 16 y = 0.0066x - 0.485 R² = 0.9715 14 (%) 12 10 8 6 Hoạt tính ức chế 4 2 0 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 Nồng độ (µg/ml) Hình 3.10. Xây dựng đường chuẩn hoạt tính ức chế α-glucosidase của mẫu tinh sạch cuối cùng Mẫu tinh sạch cuối hoạt chất ức chế α-glucosidase từ dịch nuôi cấy của chủng A. niger VTCC 031 có giá trị IC50 là 7649 g/ml, cao hơn khá lớn so với đối chứng dương là acarbose tinh khiết. Điều này cho thấy, khả năng ức chế α-glucosidase ở 42
  51. mẫu tinh sạch này chưa được cao, trong khi dịch nuôi cấy ban đầu rất tiềm năng khi hoạt tính ban đầu đặt đến 85,19%. Điều này có thể do mô hình tinh sạch có hiệu suất chưa cao, khả năng tách chiết hoạt chất ức chế α-glucosidase còn thấp, bị thất thoát trong quá trình tinh sạch. Bên cạnh đó, mẫu còn chứa vài chất tạp điều này cũng ảnh hưởng đến giá trị IC50. Kết quả cũng phù hợp với một số nghiên cứu trên thế giới. Các chất ức chế α- glucosidase khác nhau được tinh sạch từ các chủng khác nhau có các giá trị IC50 là khác nhau và giá trị IC50 này phụ thuộc vào độ sạch của mẫu chứa hoạt chất ức chế. Các mẫu có độ tinh sạch hoạt chất ức chế α-glucosidase càng cao thì giá trị IC50 càng nhỏ. Thật vậy, hoạt chất ức chế α-glucosidase của cao chiết ethyl acetate từ chủng Streptomyces sp. IPBCC.b.15.1539 chỉ ra có giá trị IC50 đạt 0,047 μg/mL [34], trong khi đó hoạt chất ức chế AGIs từ chủng Streptomyces sp. S2A đạt giá trị IC50 là 21,17 g/mL [36]. Kang và cộng sự (2013) đã báo cáo giá trị IC50 của peptide tinh sạch từ chủng A. oryzae N159-1 đạt 3,1 mg/mL [36]. Dewi và cộng sự (2016) đã phân lập ra rubrofusarin, một hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ môi trường nuôi cấy chủng Aspergillus aculeatus, là một chất tiềm năng điều trị ĐTĐ thể hiện qua hoạt tính ức chế α-glucosidase của động vật có vú với IC50 đạt 92,70 µg/mL [16]. Ngoài ra còn có các chất thể hiện sự vượt trội hơn cả acarbose, như trong nghiên cứu xác định cấu trúc của các hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng nấm mốc Aspergillus flavus QQSG-3, có 4 chất đạt hoạt tính sinh học ức chế α-glucosidase với IC50 tương ứng là 4,5 – 3,1– 1,5 – 2.3 µM trong khi IC50 của acarbose là 840,2 µM [59]. 43
  52. KẾT LUẬN Từ những kết quả, số liệu thu được, chúng tôi đưa ra được những kết luận sau: - Chủng A. niger VTCC 031 có khả năng sinh tổng hợp các chất có hoạt tính ức chế α-glucosidase cao đạt 85,19% khi đo ở dịch lên men. Đã lựa chọn được hệ dung môi pha động lên cột tốt nhất n-butanol : acid acetic : ethyl acetate : H2O với tỉ lệ 3:1:1:1 - Bước đầu xây dựng được quy trình tinh sạch với các bước chính: chiết với dung môi n-butanol và sau đó là chiết với hệ dung môi chloroform: methanol tỉ lệ 1:1 (v/v); dịch chiết này được tinh sạch qua cột silica gel 60. Sản phẩm tinh sạch sơ bộ có hệ số Rf = 0,52 trên sắc ký lớp mỏng, hoạt tính ức chế α-glucosidase đạt 45,75% với hiệu suất thu hồi 0,116%. Qua TLC, độ sạch của mẫu tinh sạch cuối đã tăng lên đáng kể so với dịch lên men ban đầu tuy nhiên vẫn còn một chút chất tạp khi kiểm tra bằng HPLC và LC/MS. - Xác định được giá trị IC50 của dịch chiết n-butanol và mẫu sạch sơ bộ tương ứng là 98,74 mg/ml và 7,648 mg/ml so với hoạt chất sạch acarbose (Sigma) là 31,16 µg/ml 44
  53. ĐỀ XUẤT - Nghiên cứu lựa chọn ra hệ dung môi pha động tối ưu hơn để chạy cột sắc ký silica gel nhằm thu được hoạt chất tinh khiết - Xác định cấu trúc hoạt chất ức chế α-glucosidase tạo tiền đề cho bào chế tạo sản phẩm cho quá trình thử nghiệm tiền lâm sàng, với mục tiêu nghiên cứu ra thuốc mới điều trị bệnh đái tháo đường. 45
  54. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt 1. Châu Mỹ Chi (2021), "Nghiên cứu biến chứng mắt ở bệnh nhân đái tháo đường tại Bệnh viện Đa khoa Trung tâm Tiền Giang", Vietnam Journal of Diabetes and Endocrinology, 43, 11-19. 2. Đinh Thị Minh Hảo and Trần Thị Anh Thư (2020), "Bệnh thận đái tháo đường: vấn đề cần quan tâm", Vietnam Journal of Diabetes and Endocrinology, (38), 12-17. 3. Đỗ Quý Hải (2006), Giáo trình công nghệ sinh học enzyme, Đại học Khoa học - Đại học Huế, Việt Nam. 4. Đỗ Thị Tuyên, Vũ Văn Hạnh, Vũ Thị Thu Hằng, Đinh Kha Trình, and Đinh Thị Quyên (2013), Tách chiết, tinh sạch hoạt chất DNJ (1-Deoxynojirimycin) ức chế α- glucosidase từ chủng B. subtilis VN9 phân lập tại Việt Nam., Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 2013, Hà Nội. 5. Hội Nội tiết - Đái tháo đường Việt Nam (2020), "Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị Đái tháo đường của Hội nội tiết - Đái tháo đường Việt Nam". 6. Mai Văn Hiên (2020), Nghiên cứu các điều kiện sinh tổng hợp, tinh sạch và bước đầu xác định cấu trúc của hoạt chất ức chế alpha glucosidase từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. phân lập ở Việt Nam, Khóa luận tốt nghiệp Đại học Dược Hà Nội, Việt Nam. 7. Phạm Minh Hồng (2020), Sàng lọc và nghiên cứu các điều kiện để nâng cao khả năng sinh tổng hợp hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng A. niger Graduation thesis of Vietnam National University, Việt Nam. 8. Phạm Thị Trân Châu and Phan Tuấn Nghĩa (2009), Enzym và ứng dụng, Education Publisher, Vietnam. 9. Phan Tuấn Nghĩa (2012), Giáo trình Hóa sinh học thực nghiệm, Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam, Việt Nam. Tài liệu tiếng anh 10. Ali R. B., Atangwho I. J., Kuar N., Ahmad M., Mahmud R., and Asmawi M. Z. (2013), "In vitro and in vivo effects of standardized extract and fractions of Phaleria macrocarpa fruits pericarp on lead carbohydrate digesting enzymes", BMC Complement Altern Med, 13, 39. 11. American Diabetes A. (2021), "2. Classification and Diagnosis of Diabetes: Standards of Medical Care in Diabetes-2021", Diabetes Care, 44(Suppl 1), S15-S33. 12. Bellamy L., Casas J.-P., Hingorani A. D., and Williams D. (2009), "Type 2 diabetes mellitus after gestational diabetes: a systematic review and meta-analysis", The Lancet, 373(9677), 1773-1779. 13. Bian X., Fan X., Ke C., Luan Y., Zhao G., and Zeng A. (2013), "Synthesis and alpha- glucosidase inhibitory activity evaluation of N-substituted aminomethyl-beta-d- glucopyranosides", Bioorg Med Chem, 21(17), 5442-5450. 14. Bloomgarden Z. T. (2020), "Diabetes and COVID‐19", Journal of Diabetes, 12(4), 347-348. 15. Dabhi A. S., Bhatt N. R., and Shah M. J. (2013), "Voglibose: an alpha glucosidase inhibitor", J Clin Diagn Res, 7(12), 3023-3027. 16. Dewi R. T., Suparman A., Mulyani H., and Lotulung P. D. N. (2016), "Identification of a New Compound as α-Glucosidase Inhibitor from Aspergillus aculeatus", ANNALES BOGORIENSES, 20(1), 19-23. 46
  55. 17. Dewi R. T., Tachibana S., and Darmawan A. (2014), "Effect on α-glucosidase inhibition and antioxidant activities of butyrolactone derivatives from Aspergillus terreus MC751", Medicinal Chemistry Research, 23(1), 454-460. 18. Frisvad J. C., Moller L. L. H., Larsen T. O., Kumar R., and Arnau J. (2018), "Safety of the fungal workhorses of industrial biotechnology: update on the mycotoxin and secondary metabolite potential of Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, and Trichoderma reesei", Appl Microbiol Biotechnol, 102(22), 9481-9515. 19. G. M. F. and D. A. M. (1987), "Production of enzymes by fermentation", In: Rehm HJ, Reed G (eds) Biotechnology, vol 7a. VCH, Weinheim, , 65-102. 20. Group H. S. C. R. (2002), "The Hyperglycemia and Adverse Pregnancy Outcome (HAPO) Study", Int J Gynaecol Obstet, 78(1), 69-77. 21. Group H. S. C. R., Metzger B. E., Lowe L. P., Dyer A. R., Trimble E. R., Chaovarindr U., Coustan D. R., Hadden D. R., McCance D. R., Hod M., McIntyre H. D., Oats J. J., Persson B., Rogers M. S., and Sacks D. A. (2008), "Hyperglycemia and adverse pregnancy outcomes", N Engl J Med, 358(19), 1991-2002. 22. Gupta R., Gigras P., Mohapatra H., Goswami V. K., and Chauhan B. (2003), "Microbial α-amylases: a biotechnological perspective", Process Biochemistry, 38(11), 1599-1616. 23. Helman A. and Melton D. A. (2021), "A Stem Cell Approach to Cure Type 1 Diabetes", Cold Spring Harb Perspect Biol, 13(1). 24. Hemker M., Stratmann A., Goeke K., Schroder W., Lenz J., Piepersberg W., and Pape H. (2001), "Identification, cloning, expression, and characterization of the extracellular acarbose-modifying glycosyltransferase, AcbD, from Actinoplanes sp. strain SE50", J Bacteriol, 183(15), 4484-4492. 25. Henrissat B. (1991), "A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities", Biochem J, 280 ( Pt 2), 309-316. 26. Henrissat B. and Bairoch A. (1993), "New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities", Biochem J, 293 ( Pt 3), 781- 788. 27. Ilonen J., Lempainen J., and Veijola R. (2019), "The heterogeneous pathogenesis of type 1 diabetes mellitus", Nat Rev Endocrinol, 15(11), 635-650. 28. Jo S.-H., Ka E. H., Lee H. S., Apostolidis E., Jang H. D., and Kwon Y. I. (2009), "Comparison of Antioxidant Potential and Rat intestinal a-Glucosidases inhibitory Activities of Quercetin, Rutin, and Isoquercetin", International Journal of Applied Research in Natural Products, 2. 29. Jones K., Sim L., Mohan S., Kumarasamy J., Liu H., Avery S., Naim H. Y., Quezada- Calvillo R., Nichols B. L., Pinto B. M., and Rose D. R. (2011), "Mapping the intestinal alpha-glucogenic enzyme specificities of starch digesting maltase- glucoamylase and sucrase-isomaltase", Bioorg Med Chem, 19(13), 3929-3934. 30. Kameda Y., Asano N., Yoshikawa M., Takeuchi M., Yamaguchi T., Matsui K., Horii S., and Fukase H. (1984), "Valiolamine, a new alpha-glucosidase inhibiting aminocyclitol produced by Streptomyces hygroscopicus", J Antibiot (Tokyo), 37(11), 1301-1307. 31. Kang M. G., Yi S. H., and Lee J. S. (2013), "Production and Characterization of a New alpha-Glucosidase Inhibitory Peptide from Aspergillus oryzae N159-1", Mycobiology, 41(3), 149-154. 32. Kim N. R., Jeong D. W., Ko D. S., and Shim J. H. (2017), "Characterization of novel thermophilic alpha-glucosidase from Bifidobacterium longum", Int J Biol Macromol, 99, 594-599. 47
  56. 33. Lee A., Patrick P., Wishart J., Horowitz M., and Morley J. E. (2002), "The effects of miglitol on glucagon-like peptide-1 secretion and appetite sensations in obese type 2 diabetics", Diabetes Obes Metab, 4(5), 329-335. 34. Lestari Y., Velina Y., and Rahminiwati M. (2015), "Metabolites activity of endophytic Streptomyces sp. IPBCC. b. 15.1539 from Tinospora crispa l. miers: α- glucosidase inhibitor and anti-hyperglycemic in mice", International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Science, 7, 235-239. 35. Li C., Zhou J., Du G., Chen J., Takahashi S., and Liu S. (2020), "Developing Aspergillus niger as a cell factory for food enzyme production", Biotechnol Adv, 44, 107630. 36. Ling L., Han X., Li X., Zhang X., Wang H., Zhang L., Cao P., Wu Y., Wang X., and Zhao J. (2020), "A Streptomyces sp. NEAU-HV9: Isolation, identification, and potential as a biocontrol agent against Ralstonia solanacearum of tomato plants", Microorganisms, 8(3), 351. 37. Liu Z. and Ma S. (2017), "Recent Advances in Synthetic alpha-Glucosidase Inhibitors", ChemMedChem, 12(11), 819-829. 38. Martinov T. and Fife B. T. (2020), "Type 1 diabetes pathogenesis and the role of inhibitory receptors in islet tolerance", Ann N Y Acad Sci, 1461(1), 73-103. 39. Munasaroh S., Tamat S. R., and Dewi R. T. (2018), "Isolation and Identification of α-Glucosidase Inhibitor From Aspergillus Terreus F38", Indonesian Journal of Pharmacy, 29(2). 40. Nguyen T. C., Le T. H., Mai V. H., Hoang T. Y., Nguyen T. T., Dao T. M. A., Nguyen M. C., and Do T. T. (2021), "Optimization and Purification of α-glucosidase inhibitor from Bacillus subtilis YT20 isolated in vietnam", Vietnam Journal of Science and Technology, 59(2), 179-188. 41. Okuyama M., Saburi W., Mori H., and Kimura A. (2016), "alpha-Glucosidases and alpha-1,4-glucan lyases: structures, functions, and physiological actions", Cell Mol Life Sci, 73(14), 2727-2751. 42. Onose S., Ikeda R., Nakagawa K., Kimura T., Yamagishi K., Higuchi O., and Miyazawa T. (2013), "Production of the alpha-glycosidase inhibitor 1- deoxynojirimycin from Bacillus species", Food Chem, 138(1), 516-523. 43. Organization W. H. (2019), "Classification of diabetes mellitus", [cited 2021 11 May]; Available from: 44. Qiu P., Liu Z., Chen Y., Cai R., Chen G., and She Z. (2019), "Secondary Metabolites with alpha-Glucosidase Inhibitory Activity from the Mangrove Fungus Mycosphaerella sp. SYSU-DZG01", Mar Drugs, 17(8). 45. Ren L., Qin X., Cao X., Wang L., Bai F., Bai G., and Shen Y. (2011), "Structural insight into substrate specificity of human intestinal maltase-glucoamylase", Protein Cell, 2(10), 827-836. 46. Rose D. R., Chaudet M. M., and Jones K. (2018), "Structural Studies of the Intestinal alpha-Glucosidases, Maltase-glucoamylase and Sucrase-isomaltase", J Pediatr Gastroenterol Nutr, 66 Suppl 3, S11-S13. 47. Santiago M. and Strobel S. (2013), "Thin layer chromatography", Methods Enzymol, 533, 303-324. 48. Sanzana M. and Sanhueza L. (2019), "Pathogenesis of Type 2 Diabetes Mellitus", Type 2 Diabetes - From Pathophysiology to Modern Management. 49. Schuster E., Dunn-Coleman N., Frisvad J. C., and Van Dijck P. W. (2002), "On the safety of Aspergillus niger a review", Appl Microbiol Biotechnol, 59(4-5), 426-435. 48
  57. 50. Sikorskaya K., Zarzecka I., Ejikeme U., and Russell J. (2021), "The use of metformin as an add-on therapy to insulin in the treatment of poorly controlled type 1 diabetes mellitus in adolescents", Metabol Open, 9, 100080. 51. Sim L., Willemsma C., Mohan S., Naim H. Y., Pinto B. M., and Rose D. R. (2010), "Structural basis for substrate selectivity in human maltase-glucoamylase and sucrase-isomaltase N-terminal domains", J Biol Chem, 285(23), 17763-17770. 52. Singh B. and Kaur A. (2016), "Antidiabetic potential of a peptide isolated from an endophytic Aspergillus awamori", J Appl Microbiol, 120(2), 301-311. 53. Sullivan S. D., Umans J. G., and Ratner R. (2012), "Gestational diabetes: implications for cardiovascular health", Curr Diab Rep, 12(1), 43-52. 54. Tabussum A., Riaz N., Saleem M., Ashraf M., Ahmad M., Alam U., Jabeen B., Malik A., and Jabbar A. (2013), "α-Glucosidase inhibitory constituents from Chrozophora plicata", Phytochemistry Letters, 6(4), 614-619. 55. Takei I., Miyamoto K., Funae O., Ohashi N., Meguro S., Tokui M., and Saruta T. (2001), "Secretion of GIP in responders to acarbose in obese Type 2(NIDDM) patients", Journal of Diabetes and its Complications, 15(5), 245-249. 56. Thrasher J. (2017), "Pharmacologic Management of Type 2 Diabetes Mellitus: Available Therapies", Am J Cardiol, 120(1S), S4-S16. 57. Truscheit E., Hillebrand I., Junge B., Müller L., Puls W., and Schmidt D. Microbial α-Glucosidase Inhibitors: Chemistry, Biochemistry, and Therapeutic Potential. in Drug Concentration Monitoring Microbial Alpha-Glucosidase Inhibitors Plasminogen Activators. 1988. Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg. 58. van der Maarel M. J. E. C., van der Veen B., Uitdehaag J. C. M., Leemhuis H., and Dijkhuizen L. (2002), "Properties and applications of starch-converting enzymes of the α-amylase family", Journal of Biotechnology, 94(2), 137-155. 59. Wu Y., Chen Y., Huang X., Pan Y., Liu Z., Yan T., Cao W., and She Z. (2018), "alpha-Glucosidase Inhibitors: Diphenyl Ethers and Phenolic Bisabolane Sesquiterpenoids from the Mangrove Endophytic Fungus Aspergillus flavus QQSG- 3", Mar Drugs, 16(9). 60. Yagi M., Kouno T., Aoyagi Y., and Murai H. (1976), "The Structure of Moranoline, a Piperidine Alkaloid from Morus Species", Journal of the agricultural chemical society of Japan, 50(11), 571-572. 61. Yang J. B., Tian J. Y., Dai Z., Ye F., Ma S. C., and Wang A. G. (2017), "a- Glucosidase inhibitors extracted from the roots of Polygonum multiflorum Thunb", Fitoterapia, 117, 65-70. 62. Yin Z., Zhang W., Feng F., Zhang Y., and Kang W. (2014), "α-Glucosidase inhibitors isolated from medicinal plants", Food Science and Human Wellness, 3(3-4), 136- 174. 63. Yip V. L. and Withers S. G. (2004), "Nature's many mechanisms for the degradation of oligosaccharides", Org Biomol Chem, 2(19), 2707-2713. 64. Zhou F., Yu T., Du R., Fan G., Liu Y., Liu Z., Xiang J., Wang Y., Song B., and Gu X. (2020), "Clinical course and risk factors for mortality of adult inpatients with COVID-19 in Wuhan, China: a retrospective cohort study", The Lancet, 395(10229), 1054-1062. 65. Zhu Y. and Zhang C. (2016), "Prevalence of Gestational Diabetes and Risk of Progression to Type 2 Diabetes: a Global Perspective", Curr Diab Rep, 16(1), 7. 66. Zhu Y. P., Yamaki K., Yoshihashi T., Ohnishi Kameyama M., Li X. T., Cheng Y. Q., Mori Y., and Li L. T. (2010), "Purification and identification of 1- 49
  58. deoxynojirimycin (DNJ) in okara fermented by Bacillus subtilis B2 from Chinese traditional food (Meitaoza)", J Agric Food Chem, 58(7), 4097-4103. 50