›

Khóa luận Nghiên cứu sàng lọc vật liệu cố định enzyme để ổn định hoạt tính của enzyme Nattokinase

pdf 60 trang thiennha21 18/04/2022 7260
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu sàng lọc vật liệu cố định enzyme để ổn định hoạt tính của enzyme Nattokinase", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_nghien_cuu_sang_loc_vat_lieu_co_dinh_enzyme_de_on.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu sàng lọc vật liệu cố định enzyme để ổn định hoạt tính của enzyme Nattokinase

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN TÙNG LÂM NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VẬT LIỆU CỐ ĐỊNH ENZYME ĐỂ ỔN ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA ENZYME NATTOKINASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2021
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN TÙNG LÂM NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VẬT LIỆU CỐ ĐỊNH ENZYME ĐỂ ỔN ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA ENZYME NATTOKINASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH - 2016.Y Người hướng dẫn: 1. TS. Nguyễn Sỹ Lê Thanh Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2. TS. Vũ Thị Thơm Trường Đại học Y dược – Đại học Quốc Gia Hà Nội HÀ NỘI – 2021
  3. LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo TS. Nguyễn Sỹ Lê Thanh – phòng Công nghệ sinh học Enzyme – Viện Công nghệ sinh học – Viên Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Cô giáo TS. Vũ Thị Thơm – Trưởng bộ môn Y dược học cơ sở – Trường Đại học Y dược –ĐHQGHN là những người đã dành nhiều thời gian, tâm huyết, tận tình hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện hóa chất, thiết bị trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Hiền Trang cùng toàn thể các cán bộ trong Phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã chỉ bảo, giúp đỡ tận tình cho em trong suốt quá trình em thực hiện đề tài. Cuối cùng, em xin bày bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình thân yêu đã luôn khích lệ và ủng hộ em về mặt vật chất lẫn tinh thần để em có thể hoàn thành được luận văn này.
  4. DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Vật liệu polymer tự nhiên 9 Bảng 2.4. Cố định enzyme Nattokinase (NK) bằng Microcrystalline cellulose (MCC) 23 Bảng 3.4. Hàm lượng protein tổng số và hoạt tính thủy phân casein của mẫu enzyme tủa bằng cồn và muối ammonium sulfate 24 Bảng 3.7. Tóm tắt quá trình tinh sạch enzyme Nattokinase từ chủng B. subtilis27 Bảng 3.19. Hiệu suất gắn của enzyme Nattokinase với các chất mang 33
  5. DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của Nattokinase 4 Hình 1.2. Cơ chế tác dụng của Nattokinase 5 Hình 2.1. Sơ đồ quy trình nghiên cứu tìm vật liệu cố định enzyme NK 14 Hình 2.2. Đường chuẩn Tyrosine 21 Hình 2.3. Đường chuẩn Bradford 22 Hình 3.1. (A) Điện di SDS-PAGE mẫu enzyme sau khi kết tủa (M: marker, 1: tủa ammonium sulfate nồng độ 30 %, 2: tủa ammonium sulfate nồng độ 70 %, 3: tủa cồn, 4: dịch enzyme trước tủa). (B) Hoạt tính thủy phân fibrinogen của enzyme Nattokinase 25 Hình 3.2. Sắc kí đồ các phân đoạn enzyme Nattokinase sau khi qua cột DEAE-Sepharose 26 Hình 3.3. Điện di Nattokinase sau khi qua cột DEAE 27 Hình 3.4. Điện di γ-PGA 28 Hình 3.5. Hình ảnh kính hiển vi của Na-γ-PGA ở độ phóng đại 100X 28 Hình 3.6. γ-PGA ở dạng natri 29 Hình 3.7. Độ bền của NK và NK- Na-γ-PGA với các pH khác nhau sau 1h (A) và 24h (B) 30 Hình 3.8. Độ bền của NK và NK-Na-γ-PGA với các nhiệt độ khác nhau Sau 1h ủ (A), Sau 24 h ủ (B) 32
  6. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT NK : Nattokinase γ-PGA : γ-Polyglutamic acid MCC : Microcrystalline cellulose t-PA : tissue plasminogen activator - yếu tố hoạt hóa plasminogen PAI-1 : plasminogen-1 LDL : low-density lipoprotein – lipoprotein tỉ trọng thấp AD : bệnh Alzheimer TNF‐α : Tumour necrosis factor α IFN‐γ : Interferon- γ IL‐1β : Interleukin-1β MIP‐2 : Macrophage inflammatory protein-2 TCA : tricloacetic acid SDS-PAGE : sodium dodecyl sulphate–polyacrylamide gel electrophoresis DEAE : diethylaminoethyl
  7. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 4 1. Tổng quan về enzyme Nattokinase 4 1.1. Giới thiệu chung về Nattokinase 4 1.2. Cơ chế và tác dụng 5 2. Bacillus subtilis natto 6 2.1. Giới thiệu về Bacillus subtilis natto 6 2.2. Đặc điểm và hình thái của Bacillus subtilis natto 6 2.3. Ứng dụng của Bacillus subtilis natto 7 3. Vật liệu cố định enzyme 8 4. Chất mang sử dụng trong nghiên cứu cố định Nattokinase 9 4.1. Poly glutamic acid (PGA) 9 4.2. Microcrystalline cellulose (MCC) 10 5. Một số nghiên cứu về hướng của đề tài 10 5.1. Nghiên cứu trong nước 10 5.2. Nghiên cứu trên thế giới 11 CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 1. Vật liệu 13 1.1. Chủng 13 1.2. Hóa chất 13 2. Phương pháp nghiên cứu 13 2.1. Phương pháp nuôi cấy 15 2.2. Phương pháp tinh sạch enzyme 16 2.3. Phương pháp cố định enzyme Nattokinase (NK) 22 2.4. Xử lý số liệu 23
  8. CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 1. Tinh sạch enzyme Nattokinase và Na-γ-PGA từ B. subtilis 24 1.1. Tinh sạch enzyme Nattokinase 24 1.2. Tinh sạch Na-γ-PGA 28 2. Xác định khả năng làm bền enzyme Nattokinase của Na-γ-PGA 29 2.1. Xác định khả năng làm bền enzyme Nattokinase của Na-γ-PGA dưới ảnh hưởng của pH 29 2.2. Xác định khả năng làm bền enzyme Nattokinase của Na-γ-PGA dưới ảnh hưởng của nhiệt độ 31 3. Đánh giá hiệu suất gắn NK với chất mang Microcrystalline cellulose (MCC) 32 KẾT LUẬN 35 KIẾN NGHỊ 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
  9. ĐẶT VẤN ĐỀ Huyết khối là hiện tượng xuất hiện các cục máu đông trong động mạch hay các tĩnh mạch nằm bên trong cơ thể. Bình thường nó có tác dụng cầm máu trong các trường hợp chảy máu do tổn thương mạch máu. Khi quá trình đông máu xảy ra không do tổn thương thì được gọi là chứng huyết khối bệnh lý và có thể là nguyên nhân dẫn đến các bệnh như: tắc nghẽn mạch máu não, đột quỵ, nhồi máu cơ tim nguy hiểm hơn sẽ dẫn đến tử vong [52]. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO) năm 2016, toàn cầu có 17,9 triệu người tử vong do các bệnh tim mạch, nhiều hơn gấp 4 lần tổng số người tử vong của 3 bệnh lý HIV/AIDS, sốt rét và lao phổi. Nguyên nhân chính là do cục máu đông và biến chứng của nó. Có nhiều phương pháp điều trị huyết khối như sử dụng thuốc hoặc phẫu thuật. Tuy nhiên, các thuốc tan huyết khối như Alteplase, Streptokinase, Urokinase mặc dù có hiệu lực tức thì sau khi tiêm tĩnh mạch nhưng thời gian bán hủy ngắn, giá thành cao và chỉ tác động điều trị triệu chứng, không điều trị được căn nguyên của bệnh. Cả sử dụng thuốc tiêm tĩnh mạch và phẫu thuật đều có nguy cơ biến chứng cao. Natto, một loại thực phẩm làm từ đậu nành lên men với Bacillus subtilis đã được tiêu thụ như một loại thực phẩm truyền thống ở các nước châu Á trong hơn 2000 năm. Tiêu thụ natto được cho là một yếu tố đóng góp đáng kể vào tuổi thọ của dân số Nhật Bản. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng ăn nhiều natto có liên quan đến việc giảm nguy cơ tử vong tổng số bệnh tim mạch và đặc biệt là giảm nguy cơ tử vong do bệnh tim thiếu máu cục bộ [47]. Trước những năm 1980, rất ít người biết về việc tiêu thụ natto có lợi cho sức khỏe tim mạch tổng thể. Năm 1987, Sumi và cộng sự đã phát hiện ra rằng natto có chứa một loại enzyme tiêu sợi huyết mạnh có tên là Nattokinase (NK) [59]. Kể từ đó, một số lượng đáng kể nghiên cứu NK đã được thực hiện 1
  10. ở Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc và Hoa Kỳ, và những nghiên cứu này đã xác nhận rằng NK có nhiều tác dụng thuận lợi đối với sức khỏe tim mạch. NK không liên quan đến bất kỳ kinase nào đã biết mà là một serine protease được tinh chế và chiết xuất từ natto [64]. Ngoài ra, ưu điểm của NK còn bao gồm sự an toàn và tiện lợi khi sử dụng đường uống, quy trình sản xuất đơn giản với chi phí thấp hơn các loại thuốc chống huyết khối và hạ huyết áp khác. Tại Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc và các nước phương Tây bao gồm Úc, Hoa Kỳ, Canada và Châu Âu, các sản phẩm NK được sử dụng rộng rãi dưới dạng viên nén hoặc viên nang như các chất bổ sung dinh dưỡng để tăng cường sức khỏe bao gồm làm loãng máu, ngăn ngừa cục máu đông và cải thiện tuần hoàn [15]. Tuy nhiên, chưa có dữ liệu thuyết phục để chứng minh tính sinh khả dụng và chuyển hóa của NK qua đường uống. Hiệu quả của enzyme trong máu và tiêu hóa đòi hỏi nhiều nghiên cứu hơn để cải thiện độ ổn định của enzyme dưới điều kiện nhiệt độ và độ pH thay đổi bằng cách tăng cường các điều kiện cho bảo quản và sản xuất NK [17, 39]. Hiện nay, có nhiều phương pháp để ổn định và tăng cường hoạt động của enzyme như sử dụng các vật liệu để cố định enzyme hoặc biến đổi enzyme. Trong đó, cố định enzyme là phương pháp được sử dụng nhiều hơn. Enzyme cố định có ưu điểm hơn các enzyme tự do như được tái sử dụng nhiều lần trong thời gian dài, bền hơn với nhiệt, pH và các dung môi hữu cơ. Xuất phát từ những lý do trên, tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu sàng lọc vật liệu cố định enzyme để ổn định hoạt tính của enzyme Nattokinase” nhằm mục tiêu: 1. Tinh sạch được enzyme Nattokinase (NK) được lên men từ vi khuẩn B. subtilis 2
  11. 2. Khảo sát được độ bền với pH và nhiệt độ của NK khi gắn với các chất mang giúp cố định enzyme. 3
  12. CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 1. Tổng quan về enzyme Nattokinase 1.1. Giới thiệu chung về Nattokinase Nattokinase lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1980 bởi bác sĩ Hyroyuki Sumi. Khi tiến hành nghiên cứu khả năng làm tan cục máu đông của các loại thực phẩm, ông phát hiện ra dịch chiết từ natto - một loại sản phẩm truyền thống của Nhật Bản lên men từ đậu nành có khả năng làm tan cục máu đông nhanh, mạnh và gọi đó là enzyme “nattokinase” có nghĩa “enzyme trong natto”. Nattokinase là enzyme có khả năng chống đông máu mạnh hơn cả các urokinase. Enzyme này đã được chứng minh là an toàn và được sử dụng ở Nhật Bản trong hơn 20 năm qua [59]. Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của Nattokinase [69] Nattokinase hay còn gọi là subtilisin NAT là một enzyme có khả năng tiêu sợi huyết hiệu quả được sản xuất từ Bacillus subtilis. Nattokinase là một serine protease có cấu trúc là một chuỗi polypeptide đơn gồm 275 gốc acid amin, khối lượng phân tử là 27,728 kDa và điểm đẳng điện là pI=8,6 [69].Trung tâm hoạt động của N là bộ 3 xúc tác gồm nhóm hydroxyl của Ser221, imidazol của His64 và nhóm cacboxyl của Asp32. Cơ chất đặc hiệu của 4
  13. Nattokinase là cơ chất đặc hiệu chung của subtilisin: Suc-Ala-Ala-Pro-Phe- pNA [48]. Nattokinase ổn định trong khoảng pH từ 6-10 và nhiệt độ 30-60°C, mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70°C [22, 44] 1.2. Cơ chế và tác dụng Hình 1.2. Cơ chế tác dụng của Nattokinase [27] Nattokinase có đặc điểm sinh học giống như plasmin, phân hủy fibrin trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua 3 con đường (Hình 1.2): - Nattokinase phân hủy fibrin trực tiếp (A) - Nattokinase tăng cường plasmin thông qua hoạt hóa prourokinase (nội sinh) thành urokinase (B) - Nattokinase làm tăng nồng độ t-PA (tissue plasminogen activators -yếu tố hoạt hóa plasminogen) (C) [27, 41]. Ngoài tác dụng tiêu sợi huyết, chống huyết khối mạnh mẽ [58, 59], NK còn cho nhiều tác dụng như: tác dụng chống xơ vữa động mạch và hạ lipid máu [18, 53], tác dụng hạ huyết áp [23, 36], tác dụng chống kết tập tiểu cầu, chống đông máu [32], và các tác dụng bảo vệ thần kinh [20, 34]. 5
  14. Tuy nhiên, NK bất ổn định với sự thay đổi của nhiệt độ và pH, cần thiết phải có những nghiên cứu thêm để NK đạt độ ổn định cao hơn, tạo điều kiện thuận cho quá trình sản xuất, bảo quản NK, hơn nữa giúp enzyme bền hơn trong trình tiêu hóa cũng sẽ giúp tăng hiệu quả hoạt động của enzyme trong máu [17, 39]. 2. Bacillus subtilis natto 2.1. Giới thiệu về Bacillus subtilis natto Năm 1913, Tiến sĩ S. Sawamura đã phân lập được trực khuẩn natto và đặt tên là Bacillus subtilis natto. Natto đầu tiên sử dụng phương pháp nuôi cấy thuần chủng B. subtilis đã được bán bởi Giáo sư J. Hanzawa vào năm 1928 [69]. Bacillus subtilis natto thuộc loài Bacillus sutilis để lên men đậu tương luộc tạo natto. B. subtilis natto có cả dạng tế bào sinh dưỡng và dạng bào tử. Các bào tử thích hợp hơn để bảo quản. Vẫn chưa có bằng chứng chứng minh tác dụng riêng có lợi của vi khuẩn này. Tuy nhiên, đến nay chưa có chủng B. subtilis nào khác có thể lên men ra natto. Điều này là do natto với các đặc tính chỉ có thể được sản xuất với các chủng B. subtilis. Sử dụng các chủng B. subtilis tạo ra natto có mùi thơm đặc biệt, lớp vi khuẩn nhăn trên bề mặt đậu nành và độ dính mong muốn [51]. 2.2. Đặc điểm và hình thái của Bacillus subtilis natto B. subtilis natto là một loại vi khuẩn hình thành bào tử Gram (+) tự nhiên và được coi là an toàn [31]. Vì là vi khuẩn hiếu khí nên trong quá trình nuôi cấy B. subtilis natto cần phải bổ sung oxy. Nhiệt độ tối ưu là 37˚C - 43˚C và ngừng sinh trưởng ở 55˚C [46]. 6
  15. 2.3. Ứng dụng của Bacillus subtilis natto B. subtilis natto được sử dụng để sản xuất Fructooligosaccharides (FOSs) là các oligomer của fructose với mức độ trùng hợp thấp (DP) và được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm do liên tạo ra các đặc tính y sinh như cải thiện hấp thụ khoáng chất [42], chống ung thư [54], các hoạt động chống đái tháo đường [9], chống oxy hóa và bảo vệ gan [13]. B. subtilis natto cũng được sử dụng như một chủng sinh tổng hợp vitamin K2. Bằng cách phát hiện sự thay đổi điện thế oxy hóa khử trong quá trình sinh trưởng của B. subtilis, một nguồn cung cấp oxy tốt và trạng thái của màng tế bào được cho là có lợi cho quá trình tổng hợp vitamin K2 [7, 66]. Bacillus subtilis natto còn có ảnh hưởng tốt đối với động vật nhai lại. Nó có tiềm năng được ứng dụng như một chế phẩm sinh học dùng cho bò sữa. Uống B.subtilis natto đã được chứng minh có tác dụng thúc đẩy sự tăng trưởng và chức năng miễn dịch của bê sữa [61], tăng sự phát triển dạ cỏ của bê [60], cải thiện sản lượng sữa và thay đổi quá trình lên men dạ cỏ của bò sữa [50, 62]. Ngoài ra, B. subtilis natto có tác dụng điều hòa miễn dịch đối với đại thực bào. Nghiên cứu đo việc sản xuất TNF‐α, IFN‐γ, IL‐1β, IL‐6, IL‐12, IL‐ 10 và MIP‐2 bởi các tế bào RAW 264,7 được xử lý bằng B. subtilis natto để đánh giá các phản ứng miễn dịch và viêm của đại thực bào. Từ đó thấy rằng B. subtilis natto tăng cường chức năng miễn dịch của đại thực bào bằng cách thúc đẩy các phản ứng miễn dịch và viêm. Ứng dụng chính của B. subtilis natto là lên men đậu nành luộc tạo natto thu enzyme Nattokinase [65] và sản xuất γ-Polyglutamic acid (γ-PGA) là một loại polymer tan trong nước được sử dụng làm chất tạo màng sinh học ứng dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm [14]. γ- 7
  16. Polyglutamic acid (γ-PGA) là một trong những vật liệu tạo nên độ dính của chế phẩm natto [49]. 3. Vật liệu cố định enzyme Các vật liệu được sử dụng để cố định enzyme được gọi là chất mang hoặc ma trận hỗ trợ. Các đặc điểm của ma trận là quan trọng hàng đầu quyết định sự thành công và kết quả của enzyme cố định. Chất mang lý tưởng cần bao gồm các đặc điểm như chi phí thấp và thân thiện với môi trường, hoàn toàn trơ sau khi cố định và không cản trở các phản ứng mong muốn, có khả năng chống nhiệt, cơ học và cho phép enzyme hoạt động trong các điều kiện khác nhau. Ngoài ra, chất mang cần có độ ổn định cao, giúp tăng cường tính đặc hiệu của enzyme, có thể làm thay đổi pH tối ưu của enzyme để nó hoạt động đến giá trị mong muốn [57]. Trên cơ sở thành phần hóa học của chất mang, chúng được phân loại thành 2 nhóm chính: vật liệu cố định vô cơ và vật liệu cố định hữu cơ. Vật liệu cố định vô cơ thường bền với các tác động bên ngoài, khả năng chịu nhiệt và cơ học cao, không bị vi sinh vật ăn mòn, phân hủy, nhưng việc gắn với enzyme thường khó khăn. Tính năng đặc trưng là cung cấp độ cứng và độ xốp cho enzyme cố định [28, 57]. Một số vật liệu vô cơ thông dụng như: thủy tinh xốp, silica gel, aluminium, oxit kim loại, zirconia (oxit kim loại của zirconium) và nhiều các vật liệu khác Vật liệu cố định hữu cơ là những chất có các nhóm hoạt động hóa học như: -NH2, -COOH, -OH nên có thể dễ dàng gắn với enzyme. Tuy nhiên, độ bền với các tác động của môi trường không cao, đặc biệt là các polymer sinh học rất dễ bị vi sinh vật xâm nhập và tấn công. Vật liệu cố định hữu cơ được chia làm các polymer tự nhiên (Bảng 1.1) và các polymer tổng hợp. Các polymer tổng hợp là nhựa trao đổi ion có bề mặt xốp và không hòa tan trong tự nhiên. Những polymer này, vì cấu trúc của chúng nên có thể cố 8
  17. định enzyme rất mạnh. Chúng trơ trước sự tấn công của vi sinh vật. Một số polymer tổng hợp cố định enzyme như: Amberlite và DEAE cellulose được sử dụng để cố định α-amylase [37], PVC được sử dụng để cố định cyclodextrin glucosyltransferase, ngăn chặn sự bất hoạt do nhiệt của enzyme [3] Bảng 1.1. Vật liệu polymer tự nhiên Polymer tự nhiên Tính chất Alginate Có thể tái sử dụng, cải thiện sự ổn định của enzyme [19, 21]. Chitosan và chitin Được dùng kết hợp với alginate. Ít bị rửa trôi, hơn thế nữa đáng tin cậy để sử dụng cho bẫy enzyme, ở dạng hạt, có thể bẫy được nhiều enzyme hơn [8, 12]. Collagen Giữ lại đáng kể hoạt động sau nhiều chu kì tái sử dụng [16, 35]. Carrageenan Cải thiện sự ổn định, rẻ, bền và hiệu quả [33, 63]. (tuyến tính sunfat hóa polysaccharide) Gelatin Khả năng hấp phụ cao, thúc đẩy tải hiệu quả [55]. Cellulose Thường sử dụng để hấp phụ, liên kết ion, liên kết cộng hóa trị hoặc bẫy trong gel [4, 10, 45]. Tinh bột Ổn định. Sepharose Xốp, dễ hấp phụ, giữ được tính chất xúc tác ở các cực pH, nhiệt độ, nồng độ muối cao [29]. Pectin Được sử dụng cùng với glycerol làm chất hóa dẻo để giảm độ giòn của chất hỗ trợ Pectin-chitin và pectin-canxi alginate đã tăng cường khả năng chịu nhiệt, biến tính và các đặc tính xúc tác [11, 24]. 4. Chất mang sử dụng trong nghiên cứu cố định Nattokinase 4.1. Poly glutamic acid (PGA) Poly glutamic acid (PGA) là một polyme sinh học hòa tan trong nước có khả năng tự phân hủy, được tạo thành từ các đơn vị D- và L-glutamic acid 9
  18. [56]. PGA được chia thành hai dạng α-PGA và γ-PGA tùy thuộc vào việc gắn nhóm caboxyl. So với α-PGA, γ-PGA được sản xuất rộng rãi hơn bởi vi khuẩn đặc biệt là những loài thuộc chi Bacillus. Với ưu thế là một polyme tự nhiên, không độc với con người, không gây đáp ứng miễn dịch nên γ-PGA được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực ví dụ như: trong công nghiệp môi trường γ-PGA được sử dụng làm chất kết tụ, hỗ trợ quá trình lắng; trong sản xuất thực phẩm γ-PGA được sử dụng như một dạng phụ gia ổn định chất lượng sản phẩm, chất chống kết tinh ; trong y dược γ-PGA được dùng như các chất mang, chất giữ ẩm [70]. PGA đã đươc chứng minh có khả năng làm bền một số enzyme trong đó có cả Nattokinase [30, 40]. Hơn nữa, PGA cũng là sản phẩm thu được trong quá trình lên men natto sản xuất nattokinase từ Bacillus subtillis, do đó thực sự thích hợp trong việc làm chất mang phối trộn với nattokinase tăng độ bền enzyme trong quá trình sản xuất chế phẩm Nattokinase. 4.2. Microcrystalline cellulose (MCC) Cellulose bản chất là polysaccharide cấu tạo nên vách tế bào thực vật và là hợp chất hữu cơ có nhiều nhất trong sinh quyển. Cellulose và dẫn xuất của nó như CM cellulose, DEAE cellulose, triacetate cellulose, diacetate cellulose, micrystalline cellulose (MCC) được sử dụng rộng rãi làm chất mang để cố định enzyme. Cellulose có tính chất cơ lý khá tốt, giá rẻ có thể sử dụng ở dạng sợi và dạng vi hạt, dạng màng. 5. Một số nghiên cứu về hướng của đề tài 5.1. Nghiên cứu trong nước Ở Việt Nam hiện nay cũng đã có một số công trình nghiên cứu của trường đại học Bách khoa – Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, trường đại học Sư phạm- Đại học Đà Nẵng về vấn đề cố định enzyme bằng chất mang Chitosan và chất mang Cacboxymethylcellulose (CMC)-alginate. 10
  19. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu về cố định enzyme để ổn định hoạt tính của enzyme Nattokinase. Bùi Xuân Đông và cộng sự (2018) đã tiến hành nghiên cứu ezyme lipase cố định trên chất mang Chitosan-Fe3O4 bằng liên kết cộng hóa trị. Chất mang là phức hợp các hạt nano Fe3O4 được hấp phụ trên chitosan nên có từ tính. Enzyme liên kết với vi hạt thông qua cầu nối trung gian là glutaraldehyde. Kết quả cố định trên vi hạt chitosan-Fe3O4 đã được chế tạo thành công với hiệu suất gắn lipase lên chất mang đạt 75,1% so với lượng lipase tự do ban đầu [1]. Huỳnh Ngọc Oanh và cộng sự (2007) đã tiến hành khảo sát quá trình cố định enzyme α-amylase (termamyl) bởi chất mang CMC-alginate. Kết quả đạt được là hoạt tính của enzyme α-amylase (termamyl) cố định bởi gel CMC- alginate cao tại nồng độ alginate 75%, nồng độ CaCl2 6%. Nồng độ CMC thích hợp để cố định enzyme Termamyl là 2%. Hoạt tính enzyme Termamyl cố định phụ thuộc vào cơ chất, pH và nhiệt độ phản ứng. Kết quả cho thấy khả năng chịu nhiệt của enzyme cố định còn phụ thuộc vào chất mang. Cơ chất có kích thước càng nhỏ càng dễ tiếp xúc enzyme cố định. Tuy nhiên enzyme cố định sẽ bị thất thoát sau quá trình tái sử dụng, ở lần sử dụng thứ 10 hoạt tính giảm một nửa [2]. 5.2. Nghiên cứu trên thế giới Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về tìm vật liệu tăng cường sự ổn định cho hoạt động của enzyme. Lee và cộng sự (2010) đã tiến hành nghiên cứu tăng cường hoạt động và sự ổn định của enzyme bằng γ-Polyglutamic acid. γ-PGA ngăn chặn hiệu quả sự biến tính của enzyme bằng cách xử lý nhiệt và lặp lại quá trình đông lạnh-rã đông [40]. 11
  20. Deepak và cộng sự (2009) tiến hành tinh chế, cố định và xác định đặc tính của Nattokinase trên các hạt nano polyhydroxybutyrate (PHB). Trong nghiên cứu này, nattokinase được tinh chế từ Bacillus subtilis bằng sắc ký trao đổi ion và cố định trên các hạt nano polyhydroxybutyrate (PHB). Việc cố định Nattokinase trên các hạt nano PHB làm tăng 20% hoạt tính của enzyme. Sự cố định cũng góp phần tăng cường tính ổn định của enzyme. Hơn nữa, hoạt tính hoàn toàn được giữ lại khi bảo quản ở 4°C trong 25 ngày. Phương pháp này đã được chứng minh là rất đơn giản và có thể được thực hiện cho các enzym khác. [17]. Law và cộng sự (2007) đã nghiên cứu phát triển một công thức mới nhằm ổn định enzyme Nattokinase và kiểm soát tốc độ giải phóng của nó khi qua đường tiêu hóa bằng cách nén enzyme Nattokinase cùng các tá dược thành viên nén sau đó được phủ bởi hỗn hợp Eudragit® L100-55 (EL100-55) và Hydroxypropylcellulose (HPC) bằng cách nén trực tiếp [39]. 12
  21. CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu 1.1. Chủng Chủng được sử dụng là chủng vi khuẩn B. subtilis được thu nhận từ phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam (VAST). 1.2. Hóa chất Hóa chất sử dụng trong phòng thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết, một số hóa chất chính như: cao nấm men, pepton, agar, xanh methylene, Ethanol, tricloacetic acid (TCA), Folin, Microcrystalline cellulose (MCC) (Aladdin- Trung Quốc). 2. Phương pháp nghiên cứu 13
  22. Quy trình nghiên cứu vật liệu cố định enzyme Nattokinase được tóm tắt trên hình 2.1. Hình 2.1. Sơ đồ quy trình nghiên cứu tìm vật liệu cố định enzyme NK 14
  23. 2.1. Phương pháp nuôi cấy 2.1.1. Phương pháp tinh chế thu enzyme Nattokinase từ chủng vi khuẩn B. subtilis Chủng vi khuẩn B. subtilis bảo quản ở điều kiện -84°C được hoạt hóa lại trên môi trường LB đặc ở 37°C trong 24 giờ. Một khuẩn lạc riêng rẽ từ đĩa hoạt hóa được cấy chuyển vào 3 ml môi trường LB lỏng. Mẫu được nuôi lắc ở 37°C, 200 vòng/phút (rpm) trong 24 giờ. Chủng B. subtilis tiếp tục được chuyển vào bình lên men lớn 1 lít quy mô phòng thí nghiệm chứa 250 ml môi trường LB lỏng, sau đó nuôi lắc bình ở 37°C với tốc độ 200 rpm trong 48 giờ. Sau đó tiến hành ly tâm 5000 rpm trong 15 phút để thu dịch nổi phía trên chứa enzyme NK thô. 2.1.2. Phương pháp tinh chế γ-Polyglutamic acid (γ-PGA) từ chủng B. subtilis Chủng B. subtilis bảo quản ở điều kiện -84°C được hoạt hóa lại trên môi trường GSP đặc ở 37°C trong 24 giờ. Một khuẩn lạc riêng rẽ từ đĩa hoạt hóa được cấy vào 3 ml môi trường GSP lỏng, nuôi lắc ở 37°C, 200 rpm, 24 giờ. Chủng B. subtilis tiếp tục được chuyển vào bình lên men lớn 500 ml chứa 100 ml môi trường GSP lỏng, nuôi lắc ở 37°C, 200 rpm và 24 giờ. Sau khi nuôi lắc, tiến hành ly tâm 10000 rpm trong 10 phút ở 4°C thu dịch nổi chứa γ- PGA. Chất lỏng chứa γ-PGA được tinh chế bằng cách thêm NaCl 5M và Ethanol theo tỉ lệ 1:1,25:2,5. Sau đó, ly tâm 12.000 rpm trong 10 phút. Kết tủa của γ-PGA được làm khô ở nhiệt độ phòng và hòa tan trong đệm PBS 1X. 2.1.3. Điều chế Na-γ-PGA Để điều chế γ-PGA ở dạng muối natri, γ-PGA được trộn với NaOH 0,1 M ở máy lắc với tốc độ 200 rpm trong 24 giờ, sau đó hỗn hợp được thẩm tích trong bình nước cất lạnh 24 giờ. 15
  24. 2.2. Phương pháp tinh sạch enzyme 2.2.1. Phương pháp tủa bằng muối ammonium sulfate Phương pháp này dựa trên khả năng tạo kết tủa của các protein (bao gồm enzyme) ở một nồng độ muối xác định (tính theo % nồng độ bão hòa) để loại bỏ bước đầu protein tạp trong dịch enzyme thô ban đầu. Muối tốt nhất được sử dụng là (NH4)2SO4 vì nó có tác dụng làm ổn định phần lớn các loại enzyme. Dịch enzyme thô được tủa muối ammonium sulfate ở các nồng độ bão hòa 30 % và 70 % trong 30 phút ở 4°C. Sau đó ly tâm 12000 rpm trong 15 phút ở 4°C. Tủa thu được phơi khô ở nhiệt độ phòng, tiến hành hòa tủa với đệm PBS 1X để xác định hàm lượng protein và hoạt độ của enzyme NK. Lượng ammonium sulfate thêm vào dịch được xác định theo công thức [68] 515 ×( X− ) G= 0 100−(0,27×X) Trong đó: G: số gram muối ammonium sulfate thêm vào dịch enzyme thô X: nồng độ muối bão hòa cần thiết X0: nồng độ muối ban đầu 2.2.2. Phương pháp tủa bằng cồn Pha loãng dịch enzyme NK thô với cồn tuyệt đối tỉ lệ 1 NK: 4 EtOH trong 4 giờ ở -20°C. Sau đó ly tâm dịch 12000 rpm trong 15 phút ở 4°C. Tủa sau khi thu được phơi khô ở nhiệt độ phòng. Hòa tủa với đệm PBS 1X để xác định hàm lượng protein và hoạt độ của enzyme NK. 16
  25. 2.2.3. Phương pháp thẩm tích Phương pháp thẩm tích dùng để loại bỏ ammonium sulfate sau kết tủa ra khỏi dịch enzyme. Túi thẩm tích được hoạt hóa bằng đệm hoạt hóa túi thẩm tích, dịch tủa thu được cho vào túi đã hoạt hóa, đặt túi thẩm tích vào cốc nước cất khử trùng lạnh, khuấy nhẹ trên máy khuấy từ. Trong quá trình thẩm tích, nước cất lạnh được thay ba lần, hai lần đầu cách nhau 3 giờ, lần thứ ba để qua đêm. 2.2.4. Phương pháp điện di SDS-PAGE Độ tinh sạch của dịch enzyme được đánh giá bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 12,5 % theo phương pháp điện di biến tính của Laemmli và cộng sự (1970) [38]. Theo đó, trong môi trường chứa SDS các phân tử protein bị phá vỡ cấu trúc không gian và tích điện âm, do đó sẽ di chuyển về cực dương trong điện trường với tốc độ phụ thuộc vào khối lượng phân tử của chúng. Tiến hành Chuẩn bị bản gel: bản gel gồm hai lớp gel tách và gel co, lớp dưới là gel tách được đổ cách mặt trên 1,5 cm, để đông hoàn toàn trong 30 phút, sau đó đổ tiếp gel co ở phía trên, cài lược để định vị từng giếng riêng biệt, để 30 phút cho bản gel đông hoàn toàn và ổn định. Biến tính mẫu: Mẫu protein được bổ sung đệm xử lý mẫu dye 5x với tỷ lệ mẫu/dye là 5:1, biến tính ở 95°C, 10 phút, sau đó để tủ -20°C trong 1 phút. Điện di: Bản gel lắp vào hệ thống điện di và chạy với cường độ là 20 mA (10 - 15 phút) cho lớp gel co và 25 mA cho lớp gel tách đến khi hàng mẫu chạy xuống đáy bản gel. Sau điện di, bản gel được tách khỏi phiến kính rồi nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue trong 1,5 - 3 giờ, tẩy màu bằng dung dịch tẩy PAGE. Sau khi tẩy màu kiểm tra kết quả bằng mắt thường. 17
  26. 2.2.5. Phương pháp sắc kí trao đổi ion DEAE-Sepharose Cơ sở lý thuyết: Phương pháp này được thực hiện dựa trên sự khác nhau về tổng số điện tích của các protein enzyme, hay phản ứng trao đổi ion giữa protein tan được trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và các tác nhân trao đổi ion. Tác nhân trao đổi ion ở đây là DEAE (diethylaminoethyl) Sepharose mang điện tích dương. Các protein trong hỗn hợp với dung dịch đệm có độ pH tương ứng sẽ được tích điện. Các protein enzyme mang điện tích bị các nhóm tích điện trái dấu của chất trao đổi ion kéo lại và bám trên cột sắc kí. Sau đó, dùng dung dịch đệm chứa NaCl có nồng độ tăng dần theo gradient để phản hấp phụ thì phân tử protein enzyme sẽ bị đẩy ra khỏi chất trao đổi ion. Các protein enzyme nào có điện tích số nhỏ thì sẽ bị đẩy ra trước do lực liên kết với chất trao đổi ion yếu. Còn những protein enzyme nào có liên kết với chất trao đổi ion lớn hơn sẽ bị đẩy ra sau. Như vậy, chúng ta có thể tách được từng phần các loại protein enzyme. Quy trình thực hiện: Gel DEAE Sepharose đã được trương nở và hoạt hóa sẵn (GE Healthcare, Thụy Điển) được nhồi vào cột, rửa và cân bằng trong đệm Tris - HCl 0,02 M; pH 8. Các phân đoạn sau tủa muối và cồn được xác định hoạt tính thủy phân fibrin và hàm lượng protein, phân đoạn có hoạt tính riêng cao nhất sẽ được đưa lên cột. Dịch enzyme được đưa lên cột và cân bằng trong đệm Tris - HCl 0,02 M; pH 8. Các protein không hấp phụ được rửa ba lần bằng chính đệm trên. Còn protein hấp phụ được đẩy ra khỏi cột bằng gradient nồng độ muối NaCl biến thiên từ 0 - 1 M pha trong đệm Tris - HCl 0,02 M; pH 8. Tốc độ chảy 25 ml/giờ chia thành 30 phân đoạn. Mỗi phân đoạn 1,5 ml. 18
  27. 2.2.6. Phương pháp định tính enzyme NK bằng hoạt tính thủy phân fibrinogen Cơ sở lý thuyết: Hoạt tính thủy phân fibrinogen được xác định dựa theo phương pháp đĩa fibrinogen của Astrup và Mullertz [6]. Nguyên tắc: enzyme Nattokinase thủy phân fibrinogen và tạo vòng tròn trong suốt trên đĩa phản ứng. Tiến hành: Chuẩn bị đĩa: đĩa petri đường kính 10 cm chứa 10 ml dung dịch fibrinogen được tách trong NaCl 0,9 % (nồng độ 20 %) ngưng kết bằng 20 µl thrombin (100 U/ml). Chú ý đĩa đổ ở vị trí bằng phẳng, dung dịch được đổ đồng nhất, tránh tạo bọt khí. Để đĩa đông hoàn toàn ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Ủ phản ứng: nhỏ từng giọt 10 µl enzyme lên đĩa, ủ ở nhiệt độ 37°C trong 5 giờ. Khi đông tụ, fibrinogen có màu trắng đục, các vùng bị enzyme thủy phân sẽ có màu trong suốt quan sát được bằng mắt thường. 2.2.7. Phương pháp xác định hoạt tính thủy phân casein Theo Anson [5], phản ứng thủy phân casein 1 % theo tỉ lệ 1:2 (v/v). Trong phương pháp này, casein 1 % đóng vai trò làm cơ chất. Tyrosine được giải phóng trong quá trình enzyme xúc tác phản ứng thủy phân casein. Folin phản ứng với các tyrosine tự do tạo thành phức màu xanh có thể định lượng dựa vào đo quang phổ hấp phụ ở bước sóng 750 nm. Càng nhiều tyrosine được giải phóng, càng nhiều phức chất màu xanh được hình thành có nghĩa là hoạt độ enzyme càng mạnh. Tính toán hàm lượng Tyrosine sử dụng đường chuẩn Tyrosine. Xây dựng đường chuẩn tyrosine 19
  28. Quy trình xây dựng đường chuẩn tyrosine tiến hành tương tự như quy trình ủ phản ứng enzyme và casein ở trên với các nồng độ khác nhau. Chất chuẩn sử dụng L-tyrosine tinh khiết của hãng Merck. Đường chuẩn tyrosine có phương trình là y = 0,904x + 0,017. Trong đó, y là độ hấp phụ ở bước sóng 750nm (OD750nm) và x là nồng độ tyrosine (µmol). Công thức 푛ồ푛𝑔 độ 푡 표푠𝑖푛푒 × ∑ × độ ℎ 푙표ã푛𝑔 Hoạt tính enzyme (U/ml) = ư 푡 ư × 푒푛 푒 ư × ư à Với Vpư: thể tích phản ứng (ml) Công thức tính các thông số: Hoạt tính riêng (U/mg) = Hoạt tính (U/ml) / Hàm lương protein Hoạt tính tổng (U) = Hoạt tính (U/ml) x Thể tích (ml) Độ sạch (lần) = Hoạt tính riêng (mẫu) / Hoạt tính riêng (dịch nổi) Hiệu suất tinh sạch (%) = Hoạt tính tổng (mẫu) x 100 / Hoạt tính tổng (dịch nổi) Thực hiện phản ứng Ống đối chứng Ống thí nghiệm 125 µl enzyme 125 µl enzyme 625 µl TCA 6 % 250 µl casein 1 % 250 µl casein 1 % Các ống được ủ 37°C, 300 rpm và trong 30 phút để phản ứng xảy ra. Sau đó, bổ sung vào ống thí nghiệm 625 µl TCA 6 % để dừng phản ứng. Ly tâm ống thí nghiệm và đối chứng 10000 rpm trong 3 phút thu dịch trong. Thực hiện phản ứng tiếp theo. 250 µl dịch trong; 1 ml Na2CO3 6 %; 250 µl thuốc thử Folin 0,2 N 20
  29. Tiến hành đo OD750nm các mẫu đã chuẩn bị. Kết quả được đối chiếu trên đường chuẩn Tyrosine (Hình 2.1). Hình 2.2. Đường chuẩn Tyrosine 2.2.8. Phương pháp xác định hàm lượng protein Nồng độ của tổng số protein trong dung dịch enzyme được đo bằng xét nghiệm protein Bradford (Bradford, 1976). Nguyên tắc của phương pháp là Coomassie Brilliant Blue phản ứng với protein hình thành phức hợp màu có khả năng hấp phụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 595 nm, cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong mẫu. Xây dựng đường chuẩn Pha Bovine serum albumin huyết thanh bò (BSA) với nước cất theo các dải nồng độ từ 3 - 30 µg/ml. 100 µl BSA chuẩn được bổ sung 900 µl dung dịch Bradford working đảo đều và đo độ hấp phụ ở bước sóng 595 nm. Đường chuẩn có phương trình là y = 3,2213x + 0,0275. Trong đó, y là độ hấp phụ ở bước sóng 595 nm, x là hàm lượng protein (µg/ml). 21
  30. Tiến hành thí nghiệm Ống đối chứng Ống thí nghiệm 100 µl nước cất khử trùng 100 µl dịch mẫu phản ứng 900 µl Bradford working 900 µl Bradford working Tổng hàm lượng protein được xác định dựa vào đường chuẩn protein từ dung dịch albumin huyết thanh bò (Hình 2.2). Hình 2.3. Đường chuẩn Bradford 2.3. Phương pháp cố định enzyme Nattokinase (NK) 2.3.1. Cố định enzyme Nattokinase (NK) bằng Na-γ-PGA Guo và cộng sự (2019), Na-γ-PGA được sử dụng để cố định enzyme với tỉ lệ 3 enzyme:1 Na-γ-PGA [26]. Còn Hsieh và cộng sự (2009) sử dụng tỉ lệ 0,5 NK: 1 Na-γ-PGA [30]. Vì vậy trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành cố định enzyme với tỉ lệ 2 NK:1 Na-γ-PGA. Tiến hành: Nattokinase ở dạng hòa tan được bổ sung vào dịch Na-γ- PGA theo tỉ lệ khối lượng 2 NK:1 Na-γ-PGA và khuấy từ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó thực hiện xác định hàm lượng protein, hoạt tính và khả năng làm bền NK ở các điều kiện nhiệt độ và pH khác nhau. 22
  31. 2.3.2. Cố định enzyme Nattokinase (NK) bằng Microcrystalline cellulose (MCC) Theo Lu và cộng sự (2012) [43], Chúng tôi tiến hành cố định enzyme NK bằng Microcrystalline cellulose (MCC) theo các tỉ lệ và điều kiện khác nhau được trình bày ở bảng 2.4, sau đó sử dụng khuấy từ. Sau phản ứng, tiến hành ly tâm 10000 rpm, 10 phút, 4°C thu tủa chứa phức hợp enzyme - chất mang. Rửa phức hợp hai lần với đệm PBS 1X. Hòa tủa bằng đệm PBS 1X thu được phức hợp enzyme - chất mang thô, sau đó đo hoạt tính thủy phân casein của phức hợp và tính hiệu suất gắn. Bảng 2.4. Cố định enzyme Nattokinase (NK) bằng Microcrystalline cellulose (MCC) Thời gian Thành phần và tỉ lệ gắn Điều kiện phản ứng ( giờ) 5ml NK (25U):1g MCC 1 25°C 25ml NK (125U):1g MCC 1 25ml NK (125U):1g MCC 50°C 1 50°C, phá 25ml NK (125U):1g MCC 1 siêu âm 25ml NK (125U):0,5g MCC:15ml glycerol 2% 1 25ml NK (125U):0,5g MCC:15ml glycerol 2% 24 25ml NK (125U):0,5g MCC:20ml glycerol 5% 25°C 24 25ml NK (125U):0,5g MCC:14ml glycerol 24 5%:7ml Na-γ-PGA 2.4. Xử lý số liệu Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft excel 2016. 23
  32. CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 1. Tinh sạch enzyme Nattokinase và Na-γ-PGA từ B. subtilis 1.1. Tinh sạch enzyme Nattokinase 1.1.1. Tinh sạch sơ bộ enzyme Nattokinase Dựa vào các nghiên cứu đã công bố, dịch enzyme thô kết tủa bằng muối ammonium sulfate ở nồng độ 30 % và 70 %. Sau đó thẩm tích loại muối trong nước cất qua đêm ở 4°C rồi đo hàm lượng protein tổng số bằng phương pháp Bradford và hoạt tính thủy phân casein thu được kết quả theo bảng 3.4 và hình 3.1. Bảng 3.4. Hàm lượng protein tổng số và hoạt tính thủy phân casein của mẫu enzyme tủa bằng cồn và muối ammonium sulfate Hàm lượng protein Hoạt tính thủy Hiệu suất thu Các bước kết tủa tổng số (mg/ml) phân casein hồi (%) (U/ml) Dịch thô sau ly tâm 0,215 0,304 100 Kết tủa bằng cồn 0,762 4,088 26,86 30 Kết tủa bằng 0,218 0,532 1,4 muối % ammonium 70 0,801 5,522 36,28 sulfate % Kết quả từ bảng 3.4 cho thấy hoạt tính thủy phân casein của enzyme Nattokinase ở cặn thu được sau kết tủa bằng muối ammonium sulfate 30 % rất thấp bởi vì ở nồng độ này protein ít bị tủa, mục đích của bước này để loại được một số tạp chất, protein phụ. Dịch thu được sau bước tủa muối ammonium sulfate 30 % tiếp tục được tủa bằng ammonium sulfate 70 %. Cặn protein thu được sau muối ammonium sulfate 70 % được hòa lại trong đệm PBS cho hoạt tính thủy phân casein cao đạt 0,801 U/ml và hiệu suất thu hồi đạt 36,28 %. Đồng thời với phương pháp tủa ammonium sulfate chúng tôi tiến 24
  33. hành tủa với cồn tuyệt đối. Cặn protein thu được sau khi tủa cồn cũng được hòa với đệm PBS cho hoạt tính thủy phân tương đối cao 0,763 U/ml và hiệu suất thu hồi 26,86 %. A B Hình 3.1. (A) Điện di SDS-PAGE mẫu enzyme sau khi kết tủa (M: marker, 1: tủa ammonium sulfate nồng độ 30 %, 2: tủa ammonium sulfate nồng độ 70 %, 3: tủa cồn, 4: dịch enzyme trước tủa). (B) Hoạt tính thủy phân fibrinogen của enzyme Nattokinase Các mẫu thu được sau tủa được tiến hành điện di SDS-PAGE. Kết quả điện di protein cho thấy kết tủa bằng cồn xuất hiện băng có kích thước khoảng 27 kDa tương đối đậm, đây là kích thước của enzyme NK theo lý thuyết. Do đó chúng tôi lựa chọn mẫu tủa cồn để tiếp tục tinh sạch qua cột sắc kí ion DEAE - Sepharose. 1.1.2. Tinh sạch enzyme Nattokinase bằng sắc kí trao đổi ion DEAE - Sepharose Thể tích enzyme NK tủa bằng cồn để chạy qua cột sắc kí trao đổi ion DEAE-Sepharose là 2 ml, tốc độ chảy 25 ml/giờ. Thu 30 phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn là 1,5 ml. Kết quả kiểm tra hàm lượng protein tổng số bằng phương pháp Bradford, cho thấy các phân đoạn từ 19 đến 23 có hàm lượng protein tổng số cao hơn so với các phân đoạn khác (Bảng 3.5 phụ lục). Đồng thời kết quả đo hoạt tính thủy phân casein cũng cho thấy enzyme tập trung ở 25
  34. các phân đoạn này trong đó phân đoạt 23 cho hoạt tính enzyme cao nhất đạt 85 U/mg. Hình 3.2. Sắc kí đồ các phân đoạn enzyme Nattokinase sau khi qua cột DEAE-Sepharose Các phân đoạn từ 19 đến phân đoạn 23 được điện di kiểm tra bằng SDS-PAGE. Kết quả hình 3.3 cho thấy NK sau khi được tinh sạch qua cột sắc kí trao đổi ion DEAE đã loại được hầu hết các protein ngoại bào và thu được NK tinh khiết có khối lượng phân tử khoảng 27,7 kDa, phù hợp với kết quả tinh chế NK trong công trình nghiên cứu tinh chế và xác định đặc tính của enzyme NK trong món pho mát thực vật natto của Fujita và cộng sự (1993) [22]. 26
  35. Hình 3.3. Điện di Nattokinase sau khi qua cột DEAE Như vậy NK đã được tinh sạch qua hai bước tủa cồn và qua cột DEAE với hoạt tính riêng đạt 85 U/mg, độ sạch 60 lần, hiệu suất thu hồi 9,75%. Bảng 3.7. Tóm tắt quá trình tinh sạch enzyme Nattokinase từ chủng B. subtilis Protein Hoạt tính thủy phân Hiệu suất Các bước tinh Độ tinh tổng số casein thu hồi sạch sạch (lần) (mg/ml) U/ml U/mg (%) Dịch enzyme thô 0,215 0,304 1,416 1 100 Dịch tủa cồn 0,762 4,089 5,367 3,79 26,861 Sắc kí trao đổi ion DEAE đỉnh 0,005 0,399 85,64 60,48 9,75 23 Wang và cộng sự (2009) đã tiến hành tinh sạch NK bằng ammonium sulfate ở nồng độ từ 30 % đến 80 % với độ tinh sạch đạt 56,1 lần, hiệu suất thu hồi 43,2 % [65]. Kết quả này mặc dù cho hiệu suất thu hồi cao hơn nhưng độ tinh sạch tương đối phù hợp với kết quả nghiên cứu của chúng tôi. 27
  36. 1.2. Tinh sạch Na-γ-PGA Sau khi tinh chế γ-PGA từ việc nuôi cấy chủng B. subtilis, chúng tôi tiến hành điện di để xác định độ tinh sạch (Hình 3.4). Tiếp theo γ-PGA được trộn với dung dịch NaOH để tạo muối Na-γ-PGA và tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích. γ-PGA ở dạng muối ( Hình 3.5) có cấu trúc giống hình cầu dẫn đến ổn định hơn so với cấu trúc khác [67]. Hình 3.4. Điện di γ-PGA Cấu trúc cuộn của Na-γ-PGA có thể được hình thành do hai yếu tố. Thứ nhất, các nhóm cacboxylat đã khử cacbon gây mất ổn định và do đó không thể duy trì các liên kết hydro giữa các chuỗi bên và xương sống. Thứ hai, mỗi đơn phân của γ-PGA có một nhóm cacboxylat và mang điện tích âm có lực đẩy tĩnh điện mạnh, có khả năng chống lại tương tác nội phân tử của các liên kết hydro giữa CO và NH của nhóm amide [67]. Hình 3.5. Hình ảnh kính hiển vi của Na-γ-PGA ở độ phóng đại 100X 28
  37. Hình 3.6. γ-PGA ở dạng natri 2. Xác định khả năng làm bền enzyme Nattokinase của Na-γ-PGA 2.1. Xác định khả năng làm bền enzyme Nattokinase của Na-γ-PGA dưới ảnh hưởng của pH Trong dải pH được khảo sát từ 2 - 10 có thể quan sát thấy enzyme NK kém bền ở pH acid, cả hai mẫu NK tự do và NK-Na-γ-PGA đều mất hoàn toàn hoạt tính ở pH 2 và 4 sau 1 giờ ủ. Enzyme cũng tương đối kém bền ở pH kiềm cao (pH 10), sau 1 giờ ủ hoạt tính enzyme còn lại ở mẫu có Na-γ-PGA và không có Na-γ-PGA tương đương nhau 33 % và 35 %. Ở pH 6 - 8 enzyme hoạt động tương tốt, pH 6 hoạt tính còn lại ở hai mẫu có và không có Na-γ- PGA tương đương nhau lần lượt là 92 % và 81 % sau 1 giờ ủ. Tuy nhiên ở pH 8 có sự khác biệt rõ rệt giữa mẫu có bổ sung Na-γ-PGA và mẫu không bổ sung, ở mẫu NK tự do hoat tính enzyme còn lại đạt 100 %, trong khi đó ở mẫu NK- Na-γ-PGA hoạt tính enzyme đạt 160 % (Hình 3.7 A). Rõ ràng là mẫu có bổ sung Na-γ-PGA không những ổn định mà còn tăng cường hoạt tính enzyme, điều này có thể giải thích là do trong điều kiện pH thích hợp, liên kết peptide trong phân tử γ-PGA tương tác với các liên kết peptide của phân tử enzyme làm tăng hoạt tính enzyme. Lee và cộng sự cũng đã chứng minh γ- pGA có khả năng làm tăng cường hoạt tính của carbonic anhydrase thông qua 29
  38. sự gia tăng của tốc độ phản ứng, tác giả đã chứng minh PGA ngăn cản khả năng liên kết của cơ chất đồng thời sự tương tách giữa PGA và enzyme gây ra sự thay đổi về hình dạng của enzyme, dẫn đến tăng cường hoạt động và cải thiện sự ổn định [40]. Thêm vào đó pH 8 cũng đã được nghiên cứu là pH tối ưu cho hoạt động của Nattokinase [66]. A B Hình 3.7. Độ bền của NK và NK- Na-γ-PGA với các pH khác nhau sau 1h (A) và 24h (B) Tiếp tục tiến hành khảo sát độ bền enzyme ở pH 6 và 8 sau 24 giờ cho thấy ở cả hai pH hoạt tính enzyme còn lại ở mẫu NK-Na-γ-PGA đều cao hơn mẫu NK tự do. Sự chênh lệch thể hiện rõ ràng hơn ở pH 6 (85 % và 77 % tương ứng với NK-Na-γ-PGA và NK), và ở pH 8 không có sự khác biệt nhiều như so với 1h đầu (Hình 3.7 B). Như vậy γ-PGA cũng đã thể hiện khả năng tăng cường độ bền enzyme mặc dù hiệu quả chưa cao. Nghiên cứu Hsieh và cộng sự về khảo sát hoạt tính của nattokinase đóng gói siêu nhỏ trong Na-γ-pGA ở điều kiện pH < 5 trong 1 giờ cho thấy NK tự do mất hoạt tính trong khi NK đóng gói trong Na-γ-PGA còn lại 34 - 60 % hoạt tính [30]. So sánh với nghiên cứu của chúng tôi γ-PGA chưa thể hiện khả năng tăng cường độ bền của enzyme trong môi trường acid có thể là do mới chỉ một phần enzyme được gắn với γ-PGA, cần phải thay đổi tỉ lệ và điều kiện cố định để tăng hiệu suất cố định enzyme trong γ-PGA. 30
  39. 2.2. Xác định khả năng làm bền enzyme Nattokinase của Na-γ-PGA dưới ảnh hưởng của nhiệt độ Hiệu quả của γ-PGA với enzyme bị biến tính bởi nhiệt độ đã được kiểm tra bằng cách xử lý hai mẫu NK tự do và NK-Na-γ-PGA ở 28, 37 và 50°C, kiểm tra hoạt tính enzyme còn lại sau 1 giờ và 24 giờ ủ. Kết quả hình 3.8 cho thấy enzyme tương đối bền ở 28°C, với cả hai mẫu NK tự do và NK-Na-γ- PGA hoạt tính enzyme sau 24 giờ mất đi không đáng kể, hoạt tính còn loại khoảng 95-98%. Ở 37°C, sau 1 giờ đầu tiên enzyme ở cả hai mẫu không bị ảnh hưởng thậm chí hoạt tính còn vượt mức 100 % do khoảng nhiệt này (~40°C) đã được nghiên cứu là nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme [65]. Tuy nhiên sau 24 giờ ở 37°C hoạt tính enzyme giảm nhiều, ở mẫu NK tự do hoạt tính enzyme chỉ còn lại 53 %, ở mẫu NK-Na-γ-PGA hoạt tính enzyme còn lại 67 % cao hơn so với mẫu NK tự do. Khi nhiệt độ tăng lên đến 50°C sự khác biệt giữa hai mẫu NK và NK-Na-γ-PGA rất rõ ràng, sau 1 giờ ủ mẫu NK-Na-γ-PGA vẫn giữ được hoàn toàn hoạt tính enzyme, trong khi đó mẫu NK tự do hoạt tính enzyme chỉ còn lại 52 %, tiếp tục ủ đến 24h cả hai mẫu enzyme bị biến tính mất hoàn toàn hoạt tính. Hiệu quả bảo vệ enzyme với nhiệt độ của PGA cũng đã được công bố bởi Lee và cộng sự, với lipase ở dải 55°C - 85°C hoạt tính của enzyme khi có mặt PGA cao hơn so với không có PGA, thậm chí hoạt tính tương đối của enzyme khi bổ sung PGA cao hơn 100 % ở 70°C.Với α-amylase ở nhiệt độ 23, 37 và 50°C, hoạt tính của enzyme khi có mặt PGA cũng cao hơn so với khi không có PGA [40]. Hsieh và cộng sự cũng cho thấy khả năng chịu nhiệt của NK vi nang trong PGA cao hơn so với dạng tự do. NK tự do mất hoạt tính trong 1 giờ ở 60°C trong khi NK vi nang trong PGA giữ lại 18 % - 25 % hoạt tính [30]. Những kết này tương tự như nghiên cứu của chúng tôi. 31
  40. A B Hình 3.8. Độ bền của NK và NK-Na-γ-PGA với các nhiệt độ khác nhau Sau 1h ủ (A), Sau 24 h ủ (B) 3. Đánh giá hiệu suất gắn NK với chất mang Microcrystalline cellulose (MCC) Sau khi tiến hành khảo sát khả năng làm bền enzyme Nattokinase của Na-γ-PGA và nhận thấy hiệu suất ổn định tương đối cao (67,64 %). Do đó, chúng tôi tiếp tục tiến hành khảo sát vật liệu cố định enzyme với mong muốn tìm ra vật liệu có hiệu suất ổn định cao nhất. 32
  41. Bảng 3.19. Hiệu suất gắn của enzyme Nattokinase với các chất mang Thời gian Hiệu suất STT Thành phần và tỉ lệ gắn Điều kiện phản ứng (%) ( giờ) 1 2 NK:1 Na-γ-PGA 1 67,64 2 5 ml NK (25 U):1 g MCC 25°C 1 0,066 3 25 ml NK (125 U):1 g MCC 1 1,217 4 25 ml NK (125 U):1 g MCC 50°C 1 0,786 50°C, phá 5 25 ml NK (125 U):1 g MCC 1 0,68 siêu âm 25 ml NK (125 U):0,5 g MCC:15 ml 6 1 0,027 glycerol 2% 25 ml NK (125 U):0,5g MCC:15 ml 7 24 0,253 glycerol 2% 25°C 25 ml NK (125 U):0,5 g MCC:20 ml 8 24 1,22 glycerol 5% 25 ml NK (125 U):0,5 g MCC:14 ml 9 24 0,368 glycerol 5%:7 ml Na-γ-PGA Chúng tôi tiến hành cố định enzyme Nattokinase với Microcrystalline cellulose (MCC) theo các tỉ lệ 5 ml NK (25 U):1 g MCC và 25 ml NK (125 U):1 g trong thời gian 1 giờ nhận thấy tỉ lệ 25 ml NK (125 U):1 g MCC cho hiệu suất gắn cao hơn (Bảng 3.19). Vì vậy, tỉ lệ này được sử dụng để tiến hành các phản ứng tối ưu điều kiện gắn tiếp theo. Tiếp theo, ở tỉ lệ 25 ml NK (125 U):1 g MCC, chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ gắn ở 25°C, 50°C và 50°C sử dụng thêm phá siêu âm. Nhận thấy rằng, nhiệt độ để đạt hiệu suất cao hơn là 25°C. Điều này có thể giải thích là do khi ở nhiệt độ cao (ở 50°C) enzyme đã bị giảm hoạt tính, và trong điều kiện phá siêu âm cấu trúc của enzyme cũng bị ảnh hưởng do đó hiệu suất gắn 33
  42. ở hai điều kiện này không được cao. Vì vậy, chúng tôi sử dụng 25°C là nhiệt độ tối ưu của các phản ứng sau. Theo nghiên cứu của Gontijo và cộng sự (2018), tác giả có bổ sung glycerol vào cellulose để tạo chất gắn [25]. Do đó, chúng tôi cũng tiến hành bổ sung glycerol nhằm tăng hiệu suất gắn, phản ứng được thực hiện hỗn hợp chất mang MCC và glycerol 2 % rồi gắn với enzyme NK ở nhiệt độ 25°C trong 1 giờ và 24 giờ. Kết quả chỉ ra rằng thời gian để phản ứng đạt hiệu suất cao hơn là 24 giờ. Tiếp tục nghiên cứu để tìm phương pháp cố định NK đạt hiệu suất cao hơn, chúng tôi đã tăng nồng độ glycerol lên 5 %, thời gian phản ứng 24 giờ và kết quả cho thấy hiệu suất cao hơn các thí nghiệm trên. Cuối cùng, chúng tôi thực hiện phản ứng cố định enzyme NK bằng hỗn hợp MCC với Na-γ-PGA và glycerol 5 % trong thời gian phản ứng 24 giờ. Tuy nhiên, hiệu suất của thí nghiệm này thấp hơn hẳn, không phù hợp với nghiên cứu của Lu và cộng sự (2012) đã thành công gắn β –galactosidase với hiệu suất cố định cao là 61 % [43]. Như vậy, trong các vật liệu cũng như điều kiện gắn đã được khảo sát cho thấy hiệu quả gắn enzyme NK với MCC rất thấp. Do đó, chúng tôi chọn Na-γ-PGA làm vật liệu gắn NK cho nghiên cứu này. 34
  43. KẾT LUẬN Đã tinh sạch thành công Nattokinase từ chủng B. subtilis qua hai bước là tủa enzyme bằng cồn và sắc kí trao đổi ion DEAE-Sepharose. Nattokinase thu được có kích thước phân tử khoảng 27,7 kDa được thể hiện trên điện di SDS -PAGE, hoạt tính thủy phân casein đạt 85,64 U/mg, hiệu suất 9,75% và độ tinh sạch 60,48 lần so với dịch enzyme thô ban đầu. Na-γ-PGA có khả năng làm bền Nattokinase ở điều kiện nhiệt độ và pH khác nhau. Hoạt động Nattokinase có bổ sung Na-γ-PGA ở điều kiện nhiệt độ và pH enzyme 8 và 37°C ổn định hơn Nattokinase ở điều kiện nhiệt độ và pH enzyme thô ban đầu. KIẾN NGHỊ 1. Tiếp tục nghiên cứu các điều kiện tinh sạch enzyme Nattokinase từ chủng vi khuẩn B. subtilis để nâng cao hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của enzyme đạt cao nhất. 2. Cần nghiên cứu thêm về các tỉ lệ của hỗn hợp NK- Na-γ-PGA và thay đổi các điều kiện cũng như tìm kiếm thêm các vật liệu hỗ trợ cho sự cố định enzyme. 35
  44. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bùi Xuân Đông, Mỹ P.T., and Thi H.V.A. (2018), Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2, 377-383 2. Oanh H.N. and Thảo V.T. (2007), "Khảo sát quá trình cố định enzyme α-amylase (termamyl) bởi chất mang cmc-alginate", Science & Technology Development, 10(12). TÀI LIỆU TIẾNG ANH 3. Abdel-Naby M.A. (1999), "Immobilization of Paenibacillus macerans NRRL B-3186 cyclodextrin glucosyltransferase and properties of the immobilized enzyme", Process Biochemistry, 34(4), 399-405. 4. Al-Adhami A.J., Bryjak J., Greb-Markiewicz B., and Peczyńska-Czoch W. (2002), "Immobilization of wood-rotting fungi laccases on modified cellulose and acrylic carriers", Process Biochemistry, 37(12), 1387- 1394. 5. Anson M.L. (1938), "THE ESTIMATION OF PEPSIN, TRYPSIN, PAPAIN, AND CATHEPSIN WITH HEMOGLOBIN", J Gen Physiol, 22(1), 79-89. 6. Astrup T. and Mullertz S. (1952), "The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity", Arch Biochem Biophys, 40(2), 346-51. 7. Berenjian A., Mahanama R., Talbot A., Regtop H., Kavanagh J., and Dehghani F. (2014), "Designing of an Intensification Process for Biosynthesis and Recovery of Menaquinone-7", Applied Biochemistry and Biotechnology, 172(3), 1347-1357. 8. Betigeri S.S. and Neau S.H. (2002), "Immobilization of lipase using hydrophilic polymers in the form of hydrogel beads", Biomaterials, 23(17), 3627-3636. 9. Bharti S.K., Krishnan S., Kumar A., Rajak K.K., Murari K., Bharti B.K., and Gupta A.K. (2013), "Antidiabetic activity and molecular docking of fructooligosaccharides produced by Aureobasidium pullulans in poloxamer-407-induced T2DM rats", Food chemistry, 136(2), 813-821. 10. Bryjak J., Aniulyte J., and Liesiene J. (2007), "Evaluation of man- tailored cellulose-based carriers in glucoamylase immobilization", Carbohydrate research, 342(8), 1105-1109. 11. Ceniceros E.S., Ilyina A., Esquivel J.C., Menchaca D.R., Espinoza J.F., and Rodriguez O.M. (2003), "Entrapment of enzymes in natural polymer extracted from residue of food industry: preparation methods, 36
  45. partial characterisation and possible application", Becth Mock, 44, 84- 87. 12. Chang M.-Y. and Juang R.-S. (2007), "Use of chitosan–clay composite as immobilization support for improved activity and stability of β- glucosidase", Biochemical Engineering Journal, 35(1), 93-98. 13. Chen H.-L., Wang C.-H., Kuo Y.-W., and Tsai C.-H. (2011), "Antioxidative and hepatoprotective effects of fructo-oligosaccharide in D-galactose-treated Balb/cJ mice", British journal of nutrition, 105(6), 805-809. 14. Chen J., Shi F., Zhang B., Zhu F., Cao W., Xu Z., Xu G., and Cen P. (2010), "Effects of cultivation conditions on the production of gamma- PGA with Bacillus subtilis ZJU-7", Appl Biochem Biotechnol, 160(2), 370-7. 15. Chen P.T., Chiang C.J., and Chao Y.P. (2007), "Strategy to approach stable production of recombinant nattokinase in Bacillus subtilis", Biotechnol Prog, 23(4), 808-13. 16. Chen S., Song N., Liao X., and Shi B. (2011), "Immobilization of catalase on Fe (III) modified collagen fiber", Sheng wu gong cheng xue bao= Chinese journal of biotechnology, 27(7), 1076-1081. 17. Deepak V., Pandian S., Kalishwaralal K., and Gurunathan S. (2009), "Purification, immobilization, and characterization of nattokinase on PHB nanoparticles", Bioresour Technol, 100(24), 6644-6. 18. Duan Z., Jiang X., Jiang H., Zhang S., Dong M., and Zhao X. (1956), "Study on the antioxidative activity and effects on experimental hyperlipidemia of natto extract", Acta Nutrimenta Sinica, (04). 19. Elçin Y.M. (1995), "Encapsulation of urease enzyme in xanthan- alginate spheres", Biomaterials, 16(15), 1157-61. 20. Fadl N.N., Ahmed H.H., Booles H.F., and Sayed A.H. (2013), "Serrapeptase and nattokinase intervention for relieving Alzheimer's disease pathophysiology in rat model", Hum Exp Toxicol, 32(7), 721- 35. 21. Flores-Maltos A., Rodriguez-Duran L.V., Renovato J., Contreras J.C., Rodriguez R., and Aguilar C.N. (2011), "Catalytical Properties of Free and Immobilized Aspergillus niger Tannase", Enzyme Res, 2011, 768183. 22. Fujita M., Nomura K., Hong K., Ito Y., Asada A., and Nishimuro S. (1993), "Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese natto, a popular soybean fermented food in Japan", Biochem Biophys Res Commun, 197(3), 1340-7. 23. Fujita M., Ohnishi K., Takaoka S., Ogasawara K., Fukuyama R., and Nakamuta H. (2011), "Antihypertensive effects of continuous oral 37
  46. administration of nattokinase and its fragments in spontaneously hypertensive rats", Biol Pharm Bull, 34(11), 1696-701. 24. Gomez L., Ramírez H.L., Neira-Carrillo A., and Villalonga R. (2006), "Polyelectrolyte complex formation mediated immobilization of chitosan-invertase neoglycoconjugate on pectin-coated chitin", Bioprocess and Biosystems Engineering, 28(6), 387-395. 25. Gontijo de Melo P., Fornazier Borges M., Afonso Ferreira J., Vicente Barbosa Silva M., and Ruggiero R. (2018), "Bio-Based Cellulose Acetate Films Reinforced with Lignin and Glycerol", Int J Mol Sci, 19(4). 26. Guo Q., Su J., Yuan F., Mao L., and Gao Y. (2019), "Preparation, characterization and stability of pea protein isolate and propylene glycol alginate soluble complexes", Lwt, 101, 476-482. 27. Haritha M. and Meena V. (2011), "Nattokinase: A review of fibrinolytic enzyme", Chemical, environmental and pharmaceutical research, 2(1), 61-66. 28. Hartmann M. and Kostrov X. (2013), "Immobilization of enzymes on porous silicas–benefits and challenges", Chemical Society Reviews, 42(15), 6277-6289. 29. Hosseinkhani S., Szittner R., Nemat-Gorgani M., and Meighen E.A. (2003), "Adsorptive immobilization of bacterial luciferases on alkyl- substituted Sepharose 4B", Enzyme and microbial technology, 32(1), 186-193. 30. Hsieh C.-W., Lu W.-C., Hsieh W.-C., Huang Y.-P., Lai C.-H., and Ko W.-C. (2009), "Improvement of the stability of nattokinase using γ- polyglutamic acid as a coating material for microencapsulation", LWT- Food Science and Technology, 42(1), 144-149. 31. Itaya M., Nagasaku M., Shimada T., Ohtani N., Shiwa Y., Yoshikawa H., Kaneko S., Tomita M., and Sato M. (2019), "Stable and efficient delivery of DNA to Bacillus subtilis (natto) using pLS20 conjugational transfer plasmids", FEMS Microbiol Lett, 366(4). 32. Jang J.Y., Kim T.S., Cai J., Kim J., Kim Y., Shin K., Kim K.S., Park S.K., Lee S.P., Choi E.K., Rhee M.H., and Kim Y.B. (2013), "Nattokinase improves blood flow by inhibiting platelet aggregation and thrombus formation", Lab Anim Res, 29(4), 221-5. 33. Jegannathan K.R., Jun-Yee L., Chan E.-S., and Ravindra P. (2010), "Production of biodiesel from palm oil using liquid core lipase encapsulated in κ-carrageenan", Fuel, 89(9), 2272-2277. 34. Ji H., Yu L., Liu K., Yu Z., Zhang Q., Zou F., and Liu B. (2014), "Mechanisms of Nattokinase in protection of cerebral ischemia", Eur J Pharmacol, 745, 144-51. 38
  47. 35. Katwa L., Ramakrishna M., and Rao M.R. (1981), "Spectrophotometric assay of immobilized tannase", Journal of Biosciences, 3(2), 135-142. 36. Kim J.Y., Gum S.N., Paik J.K., Lim H.H., Kim K.C., Ogasawara K., Inoue K., Park S., Jang Y., and Lee J.H. (2008), "Effects of nattokinase on blood pressure: a randomized, controlled trial", Hypertens Res, 31(8), 1583-8. 37. Kumari A. and Kayastha A.M. (2011), "Immobilization of soybean (Glycine max) α-amylase onto Chitosan and Amberlite MB-150 beads: Optimization and characterization", Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 69(1-2), 8-14. 38. Laemmli U.K. (1970), "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", Nature, 227(5259), 680-5. 39. Law D. and Zhang Z. (2007), "Stabilization and target delivery of Nattokinase using compression coating", Drug Dev Ind Pharm, 33(5), 495-503. 40. Lee E.-H., Tsujimoto T., Uyama H., Sung M.-H., Kim K., and Kuramitsu S. (2010), "Enhancement of enzyme activity and stability by poly (γ-glutamic acid)", Polymer journal, 42(10), 818-822. 41. Liu C.-H., Wu J.-Y., and Chang J.-S. (2008), "Diffusion characteristics and controlled release of bacterial fertilizers from modified calcium alginate capsules", Bioresource technology, 99(6), 1904-1910. 42. Lopez H.W., Coudray C., Levrat-Verny M.A., Feillet-Coudray C., Demigné C., and Rémésy C. (2000), "Fructooligosaccharides enhance mineral apparent absorption and counteract the deleterious effects of phytic acid on mineral homeostasis in rats", J Nutr Biochem, 11(10), 500-8. 43. Lu L., Xu S., Zhao R., Zhang D., Li Z., Li Y., and Xiao M. (2012), "Synthesis of galactooligosaccharides by CBD fusion β-galactosidase immobilized on cellulose", Bioresour Technol, 116, 327-33. 44. Maeda H., Mizutani O., Yamagata Y., Ichishima E., and Nakajima T. (2001), "Alkaline-resistance model of subtilisin ALP I, a novel alkaline subtilisin", J Biochem, 129(5), 675-82. 45. Mislovičová D., Masárová J., Vikartovská A., Gemeiner P., and Michalková E. (2004), "Biospecific immobilization of mannan– penicillin G acylase neoglycoenzyme on Concanavalin A-bead cellulose", Journal of biotechnology, 110(1), 11-19. 46. Murooka Y. and Yamshita M. (2008), "Traditional healthful fermented products of Japan", J Ind Microbiol Biotechnol, 35(8), 791-8. 47. Nagata C., Wada K., Tamura T., Konishi K., Goto Y., Koda S., Kawachi T., Tsuji M., and Nakamura K. (2017), "Dietary soy and natto intake and cardiovascular disease mortality in Japanese adults: the Takayama study", Am J Clin Nutr, 105(2), 426-431. 39
  48. 48. Nakamura T., Yamagata Y., and Ichishima E. (1992), "Nucleotide sequence of the subtilisin NAT gene, aprN, of Bacillus subtilis (natto)", Biosci Biotechnol Biochem, 56(11), 1869-71. 49. Ogawa Y., Hosoyama H., Hamano M., and Motai H. (1991), "Purification and properties of gamma-glutamyltranspeptidase from Bacillus subtilis (natto)", Agric Biol Chem, 55(12), 2971-7. 50. Peng H., Wang J., Kang H., Dong S., Sun P., Bu D., and Zhou L. (2012), "Effect of feeding Bacillus subtilis natto fermentation product on milk production and composition, blood metabolites and rumen fermentation in early lactation dairy cows", Journal of animal physiology and animal nutrition, 96(3), 506-512. 51. Qiu D., Oshima H., Ohashi Y., and Itaya M. (2003), "Construction of physical maps of Bacillus subtilis (natto) strains", Nucleic Acids Res Suppl, (3), 207-8. 52. Raskob G.E., Angchaisuksiri P., Blanco A.N., Buller H., Gallus A., Hunt B.J., Hylek E.M., Kakkar A., Konstantinides S.V., McCumber M., Ozaki Y., Wendelboe A., and Weitz J.I. (2014), "Thrombosis: a major contributor to global disease burden", Arterioscler Thromb Vasc Biol, 34(11), 2363-71. 53. Ren N.N., Chen H.J., Li Y., McGowan G.W., and Lin Y.G. (2017), "[A clinical study on the effect of nattokinase on carotid artery atherosclerosis and hyperlipidaemia]", Zhonghua Yi Xue Za Zhi, 97(26), 2038-2042. 54. Serban D.E. (2014), "Gastrointestinal cancers: influence of gut microbiota, probiotics and prebiotics", Cancer Lett, 345(2), 258-70. 55. Shen Q., Yang R., Hua X., Ye F., Zhang W., and Zhao W. (2011), "Gelatin-templated biomimetic calcification for β-galactosidase immobilization", Process Biochemistry, 46(8), 1565-1571. 56. Shih I.L. and Van Y.T. (2001), "The production of poly-(gamma- glutamic acid) from microorganisms and its various applications", Bioresour Technol, 79(3), 207-25. 57. Sirisha V.L., Jain A., and Jain A. (2016), "Enzyme Immobilization: An Overview on Methods, Support Material, and Applications of Immobilized Enzymes", Adv Food Nutr Res, 79, 179-211. 58. Sumi H., Hamada H., Nakanishi K., and Hiratani H. (1990), "Enhancement of the fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nattokinase", Acta Haematol, 84(3), 139-43. 59. Sumi H., Hamada H., Tsushima H., Mihara H., and Muraki H. (1987), "A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese Natto; a typical and popular soybean food in the Japanese diet", Experientia, 43(10), 1110-1. 40
  49. 60. Sun P., Wang J.-Q., and Zhang H.-T. (2011), "Effects of supplementation of Bacillus subtilis natto Na and N1 strains on rumen development in dairy calves", Animal Feed Science and Technology, 164(3-4), 154-160. 61. Sun P., Wang J., and Zhang H. (2010), "Effects of Bacillus subtilis natto on performance and immune function of preweaning calves", Journal of Dairy Science, 93(12), 5851-5855. 62. Sun P., Wang J.Q., and Deng L.F. (2013), "Effects of Bacillus subtilis natto on milk production, rumen fermentation and ruminal microbiome of dairy cows", Animal, 7(2), 216-22. 63. Tümtürk H., Karaca N., Demirel G., and Şahin F. (2007), "Preparation and application of poly (N, N-dimethylacrylamide-co-acrylamide) and poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylamide)/κ-Carrageenan hydrogels for immobilization of lipase", International Journal of Biological Macromolecules, 40(3), 281-285. 64. Urano T., Ihara H., Umemura K., Suzuki Y., Oike M., Akita S., Tsukamoto Y., Suzuki I., and Takada A. (2001), "The profibrinolytic enzyme subtilisin NAT purified from Bacillus subtilis Cleaves and inactivates plasminogen activator inhibitor type 1", J Biol Chem, 276(27), 24690-6. 65. Wang C., Du M., Zheng D., Kong F., Zu G., and Feng Y. (2009), "Purification and characterization of nattokinase from Bacillus subtilis natto B-12", J Agric Food Chem, 57(20), 9722-9. 66. Wang H., Liu H., Wang L., Zhao G., Tang H., Sun X., Ni W., Yang Q., Wang P., and Zheng Z. (2019), "Improvement of menaquinone-7 production by Bacillus subtilis natto in a novel residue-free medium by increasing the redox potential", Appl Microbiol Biotechnol, 103(18), 7519-7535. 67. Wang L.-L., Chen J.-T., Wang L.-F., Wu S., Zhang G.-z., Yu H.-Q., Ye X.-d., and Shi Q.-S. (2017), "Conformations and molecular interactions of poly-γ-glutamic acid as a soluble microbial product in aqueous solutions", Scientific reports, 7(1), 1-11. 68. Wingfield P. (2001), "Protein precipitation using ammonium sulfate", Curr Protoc Protein Sci, Appendix 3, Appendix 3F. 69. Zheng Z.L., Zuo Z.Y., Liu Z.G., Tsai K.C., Liu A.F., and Zou G.L. (2005), "Construction of a 3D model of nattokinase, a novel fibrinolytic enzyme from Bacillus natto. A novel nucleophilic catalytic mechanism for nattokinase", J Mol Graph Model, 23(4), 373-80. 70. Ogunleye A., Bhat A., Irorere V.U., Hill D., Williams C., and Radecka I. (2015), "Poly-γ-glutamic acid: production, properties and applications", Microbiology, 161(1), 1-17. 41
  50. PHỤ LỤC Bảng 2.1. Thành phần các loại đệm và dung dịch 43 Bảng 2.2. Môi trường nuôi cấy 43 Bảng 2.3. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 44 Bảng 3.1. Hàm lượng protein của enzyme NK sau tủa 44 Bảng 3.2. Hoạt tính thủy phân casein của enzyme NK sau tủa 45 Bảng 3.3. Hiệu suất thu hồi của các phương pháp tủa enzyme NK sau tủa 45 Bảng 3.5. Hàm lượng protein của enzyme NK sau khi qua cột DEAE 46 Bảng 3.6. Hoạt tính của enzyme NK sau khi qua cột DEAE 47 Bảng 3.8. Hiệu suất gắn Na-γ-PGA vào NK 47 Bảng 3.9. Hoạt tính của NK và NK-Na-γ-PGA ủ 1 giờ ở các pH 47 Bảng 3.10. Hoạt tính tương đương của NK và NK-Na-γ-PGA ủ 1 giờ ở các pH 48 Bảng 3.11. Hoạt tính của NK và NK-Na-γ-PGA ủ 24 giờ ở các pH 48 Bảng 3.12. Hoạt tính tương đương của NK và NK-Na-γ-PGA ủ 24 giờ ở các pH 49 Bảng 3.13. Hoạt tính của NK và NK-Na-γ-PGA ủ 1 giờ ở các nhiệt độ 50 Bảng 3.14. Hoạt tính tương đương của NK và NK-Na-γ-PGA ủ 1 giờ ở các nhiệt độ 50 Bảng 3.15. Hoạt tính của NK và NK-Na-γ-PGA ủ 24 giờ ở các nhiệt độ 51 Bảng 3.16. Hoạt tính tương đương của NK và NK-Na-γ-PGA ủ 24 giờ ở các nhiệt độ 51 Bảng 3.17. Hoạt tính thủy phân enzyme của phức hợp Nattokinase (NK) – chất mang Microcrystalline cellulose (MCC) sau mỗi thí nghiệm 52 Bảng 3.18. Hoạt tính tổng của phức hợp Nattokinase (NK) – chất mang Microcrystalline cellulose (MCC) sau mỗi thí nghiệm 52 42
  51. Bảng 2.1. Thành phần các loại đệm và dung dịch Dung dịch Thành phần, nổng độ Bradford stock 100 ml 95% ethanol; 350 mg serva Blue G; 200 ml 88% solution phosphoric acid Bradford working 425 ml H2O; 15 ml 95% ethanol; 30 ml 88% phosphoric buffer acid; 30 ml Bradford stock solution Dung dịch A Đệm 1,5 M Tris-HCl; pH 8,8 Dung dịch B Đệm 0,5 M Tris-HCl; pH 6,8 Dung dịch C 30% acrylamid; 0,8% bis-acrylamid Dung dịch D 10% SDS (tinh thể); 25 mM EDTA Dung dịch nhuộm 0,1% (w/v) coomassie brilliant blue; 30% (v/v) methanol; PAGE 10% (v/v) acetic acid Dung dịch tẩy 60% (v/v) H2O; 30% (v/v) methanol; 10% (v/v) acid acetic PAGE Đệm điện di protein 20 mM Tris-HCl; 192 mM glycerin; 0,1% (w/v) SDS; pH 8,4 (biến tính) Đệm tra mẫu protein 0,05% brommophenol blue; 50% glycerol 100%; 10% SDS; 5X (biến tính) 10% β-mercaptho-ethanol pha trong đệm 0,312 M Tris-HCl, pH 6,8 Bảng 2.2. Môi trường nuôi cấy Tên môi Thành phần trường LB lỏng 1% pepton (w/v); 1% NaCl (w/v); 0,5% cao nấm men (w/v) LB đặc LB lỏng; 1,5-2% agar (w/v) GSP 1% pepton (w/v); 1,5% glucose (w/v); 1,5% glutamic acid (w/v) 43
  52. Bảng 2.3. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu Tên thiết bị Xuất xứ Box cấy vi sinh vật Laminar LB Sartorious (Đức) Cân phân tích BL150S Metrohm (Thụy Sĩ) Nồi khử trùng ES-315 Tony (Nhật) Máy quang phổ UV2500 Labomed (Mỹ) Tủ lạnh 4°C GR-N45VTV Toshiba (Nhật) Lò vi sóng Panasonic (Nhật) Tủ lạnh -84°C MDF-192 Sanyo (Nhật) Máy voltex OSI Rotolab (Đức) Máy nuôi lắc Centomat® HK Sartorious (Đức) Máy ly tâm lạnh to CF16RXII Hettich (Đức) Máy ly tâm lạnh Hettich Mikro 22R Hettich (Đức) Bảng 3.1. Hàm lượng protein của enzyme NK sau tủa Hàm lượng protein Các bước OD595nm Pha (mg/ml) Sai số kết tủa loãng TN1 TN2 TN1 TN2 Enzyme thô 0,726 0,713 1 0,217 0,213 0,003 30 0,685 0,776 1 0,204 0,232 0,019 70 0,687 0,657 4 0,82 0,782 0,0263 Cồn 0,675 0,606 4 0,805 0,719 0,061 44
  53. Bảng 3.2. Hoạt tính thủy phân casein của enzyme NK sau tủa Hoạt tính thủy phân Các bước OD750nm Pha casein (U/ml) Sai số kết tủa loãng TN1 TN2 TN1 TN2 Enzyme thô 0,225 0,325 1 0,245 0,363 0,0834 30 0,356 0,58 1 0,4 0,664 0,187 70 0,981 0,925 5 5,687 5,357 0,234 Cồn 0,664 0,756 5 3,817 4,36 0,384 Bảng 3.3. Hiệu suất thu hồi của các phương pháp tủa enzyme NK sau tủa Hoạt tính riêng Hoạt Thể Hiệu suất Các bước (U/mg) tính Sai số tích thu hồi kết tủa tổng TN1 TN2 (ml) (%) (U) Enzyme 1,141 1,69 0,388 250 76,1 100 thô 30 1,831 3,041 0,856 2 1,064 1,398 70 7,1 6,688 0,292 5 27,611 36,279 Cồn 5,01 5,722 0,504 5 20,442 26,861 45
  54. Bảng 3.5. Hàm lượng protein của enzyme NK sau khi qua cột DEAE Phân đoạn OD595nm Pha loãng Hàm lượng protein (mg/ml) 1 0 1 0 2 0,006 1 0 3 0,007 1 0 4 0,013 1 0 5 0,012 1 0 6 0,019 1 0 7 0,028 1 0 8 0,025 1 0 9 0,029 1 0 10 0,013 1 0 11 0,006 1 0 12 0,016 1 0 13 0,008 1 0 14 0,008 1 0 15 0,009 1 0 16 0,007 1 0 17 0,013 1 0 18 0,027 1 0 19 0,072 1 0,013971 20 0,103 1 0,023595 21 0,116 1 0,027631 22 0,046 1 0,005899 23 0,042 1 0,004657 24 0,03 1 0 25 0,012 1 0 26 0,01 1 0 27 0,004 1 0 28 0,02 1 0 29 0,009 1 0 30 0,001 1 0 46
  55. Bảng 3.6. Hoạt tính của enzyme NK sau khi qua cột DEAE Hoạt tính thủy phân Hoạt OD750nm Các casein (U/ml) tính Pha phân trung Sai số loãng đoạn TN1 TN2 TN1 TN2 bình (U/ml) 19 0,155 0,157 1 0,163 0,165 0,164 0,002 20 0,142 0,144 1 0,147 0,15 0,1487 0,002 21 0,239 0,242 1 0,262 0,265 0,264 0,002 22 0, 18 0,202 1 0,192 0,218 0,205 0,018 23 0,354 0,367 1 0,398 0,413 0,405 0,011 Bảng 3.8. Hiệu suất gắn Na-γ-PGA vào NK HTR (U/mg) HTR Sai số HTTĐ (%) HTTĐ Sai số TN1 TN2 TB TN1 TN2 TB (U/mg) (%) NK 2,525 2,4889 2,507 0,026 100,73 99,264 100 1,0398 NK- Na-γ- 1,65 1,742 1,696 0,065 65,808 69,485 67,647 2,599 PGA Bảng 3.9. Hoạt tính của NK và NK-Na-γ-PGA ủ 1 giờ ở các pH HTR (U/mg) HTR HTTĐ (%) Sai HTTĐ pH TB Sai số TN1 TN2 số TN1 TN2 TB (%) (U/mg) 6 2,099 2,145 2,122 0,032 76,631 78,277 77,454 1,164 NK 8 2,794 2,825 2,809 0,022 101,963 103,103 102,533 0,806 ĐC 2,731 2,748 2,739 0,012 99,683 100,317 100 0,448 NK- 6 2,398 2,353 2,375 0,032 86,321 84,697 85,509 1,148 Na-γ- 8 3,071 2,783 2,927 0,204 110,556 100,187 105,371 7,332 PGA ĐC 2,779 2,776 2,778 0,002 100,063 99,937 100 0,0883 47
  56. Bảng 3.10. Hoạt tính tương đương của NK và NK-Na-γ-PGA ủ 1 giờ ở các pH HTR HTR HTTĐ Sai HTTĐ (%) Sai pH (U/mg) TB TB số số TN1 TN2 (U/mg) TN1 TN2 (%) 2 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 6 2,26 2,16 2,219 0,07 82,837 79,164 81 2,59 NK 8 2,59 2,72 2,664 0,09 98,947 103,85 101,4 3,47 10 0,95 0,90 0,931 0,03 36,491 34,385 35,438 1,48 ĐC 2,59 2,65 2,627 0,03 98,947 101,05 100 1,48 2 0 0 0 0 0 0 0 0 NK- 4 0 0 0 0 0 0 0 0 Na- 6 2,58 2,56 2,577 0,01 93,191 92,317 92,754 0,61 γ- 8 3,56 3,85 3,708 0,2 153,63 166,364 160 8,999 PGA 10 0,885 0,674 0,779 0,149 38,182 29,091 33,636 6,428 ĐC 2,254 2,381 2,318 0,089 97,273 102,727 100 3,856 Bảng 3.11. Hoạt tính của NK và NK-Na-γ-PGA ủ 24 giờ ở các pH Hoạt tính OD750nm Pha HTTB pH (U/ml) Sai số loãng (U/ml) TN1 TN2 TN1 TN2 6 0,622 0,635 1 0,178 0,182 0,18 0,003 NK 8 0,822 0,831 1 0,237 0,240 0,239 0,002 ĐC 0,804 0,809 1 0,232 0,233 0,233 0,001 NK- 6 0,708 0,695 1 0,204 0,2 0,202 0,0027 Na- 8 0,902 0,819 1 0,261 0,236 0,249 0,017 γ- ĐC 0,818 0,817 1 0,236 0,236 0,236 0,0002 PGA 48
  57. Bảng 3.12. Hoạt tính tương đương của NK và NK-Na-γ-PGA ủ 24 giờ ở các pH OD750nm Pha Hoạt tính (U/ml) HTTB pH Sai số TN1 TN2 loãng TN1 TN2 (U/ml) 2 0 0 1 0 0 0 0 4 0 0 1 0 0 0 0 6 0,671 0,642 1 0,193 0,184 0,189 0,006 NK 8 0,158 0,165 1 0,041 0,044 0,043 0,001 10 0,069 0,066 1 0,015 0,014 0,015 0,0006 ĐC 0,158 0,161 1 0,041 0,042 0,042 0,0006 2 0 0 1 0 0 0 0 4 0 0 1 0 0 0 0 NK- Na- 6 0,763 0,756 1 0,22 0,218 0,219 0,001 γ- 8 0,186 0,2 1 0,049 0,054 0,052 0,002 PGA 10 0,059 0,049 1 0,012 0,009 0,011 0,002 ĐC 0,124 0,13 1 0,031 0,033 0,032 0,001 49
  58. Bảng 3.13. Hoạt tính của NK và NK-Na-γ-PGA ủ 1 giờ ở các nhiệt độ Nhiệt Hoạt tính OD750nm Pha HTTB độ (U/ml) Sai số loãng (U/ml) (˚C) TN1 TN2 TN1 TN2 0,26 0,29 28 1 0,072 0,083 0,077 0,008 1 8 0,29 37 0,32 1 0,083 0,089 0,086 0,004 8 NK 0,15 0,16 50 1 0,041 0,043 0,042 0,002 5 3 0,29 0,28 ĐC 1 0,081 0,079 0,08 0,0008 1 7 0,25 0,22 28 1 0,072 0,061 0,066 0,007 8 5 0,27 NK- 37 0,27 1 0,077 0,075 0,076 0,001 7 Na-γ- 0,23 0,25 PGA 50 1 0,063 0,071 0,067 0,006 1 8 0,25 ĐC 0,23 1 0,071 0,063 0,067 0,006 8 Bảng 3.14. Hoạt tính tương đương của NK và NK-Na-γ-PGA ủ 1 giờ ở các nhiệt độ Nhiệt Hoạt tính HTTB Sai HTTĐ (%) HTTĐ độ riêng (U/mg) Sai số (U/mg) số (%) (˚C) TN1 TN2 TN1 TN2 28 2,249 2,59 2,419 0,241 89,705 103,308 96,507 9,619 37 2,59 2,793 2,691 0,143 103,308 111,397 107,353 5,719 NK 50 1,272 1,345 1,3 0,052 50,735 53,676 52,205 2,08 ĐC 2,525 2,488 2,507 0,026 100,73 99,264 100 1,039 NK- 28 2,633 2,272 2,452 0,254 106,167 91,629 98,899 10,279 Na- 37 2,84 2,764 2,802 0,054 114,53 111,453 112,995 2,18 γ- 50 2,338 2,633 2,485 0,208 94,273 106,167 100,22 8,4105 PGA ĐC 2,633 2,272 2,452 0,254 106,167 91,63 98,898 10,279 50
  59. Bảng 3.15. Hoạt tính của NK và NK-Na-γ-PGA ủ 24 giờ ở các nhiệt độ Nhiệt OD Hoạt tính (U/ml) 750nm Pha HTTB độ Sai số loãng (U/ml) (˚C) TN1 TN2 TN1 TN2 28 0,307 0,303 1 0,085546 0,084366 0,084956 0,000834 37 0,168 0,19 1 0,044543 0,051032 0,047788 0,004589 NK 50 0 0 1 0 0 0 0 ĐC 0,319 0,32 1 0,089086 0,089381 0,089233 0,000209 28 0,268 0,243 1 0,074041 0,066667 0,070354 0,005215 NK- Na- 37 0,191 0,18 1 0,051327 0,048083 0,049705 0,002294 γ- 50 0 0 1 0 0 0 0 PGA ĐC 0,268 0,263 1 0,074041 0,072566 0,073304 0,001043 Bảng 3.16. Hoạt tính tương đương của NK và NK-Na-γ-PGA ủ 24 giờ ở các nhiệt độ Nhiệt HTR (U/mg) HTR HTTĐ (%) HTTĐ Sai Sai độ TB TB số số (˚C) TN1 TN2 (U/mg) TN1 TN2 (%) 28 2,673 2,636 2,654 0,026 95,867 94,54 95,206 0,935 37 1,391 1,594 1,493 0,143 49,917 57,19 53,55 5,142 NK 50 0 0 0 0 0 0 0 0 ĐC 2,783 2,793 2,788 0,006 99,834 100,165 100 0,233 28 2,742 2,469 2,605 0,193 101,006 90,945 95,975 7,113 NK- 37 1,901 1,78 1,84 0,084 70,02 65,596 67,806 3,13 Na-γ- PGA 50 0 0 0 0 0 0 0 0 ĐC 2,742 2,687 2,714 0,036 101 98,993 100 1,422 51
  60. Bảng 3.17. Hoạt tính thủy phân enzyme của phức hợp Nattokinase (NK) – chất mang Microcrystalline cellulose (MCC) sau mỗi thí nghiệm Hoạt tính thủy phân casein Các thí OD750nm Pha (U/ml) Sai số nghiệm loãng TN1 TN2 TN1 TN2 1 0,022 0,019 1 0,006 0,002 0,002 2 0,154 0,138 1 0,162 0,143 0,013 3 0,071 0,201 1 0,064 0,217 0,108 4 0,127 0,195 1 0,13 0,21 0,057 5 0,02 0,026 1 0,003 0,0106 0,005 6 0,101 0,112 1 0,099 0,112 0,009 7 0,127 0,142 1 0,129 0,147 0,012 8 0,06 0,052 1 0,0507 0,041 0,006 Bảng 3.18. Hoạt tính tổng của phức hợp Nattokinase (NK) – chất mang Microcrystalline cellulose (MCC) sau mỗi thí nghiệm Hoạt tính trung Hoạt tính tổng Các thí nghiệm Thể tích bình (U/ml) (U) 1 0,004 8 0,033 2 0,152 10 1,522 3 0,140 7 0,983 4 0,170 5 0,849 5 0,007 4,8 0,034 6 0,106 3 0,317 7 0,139 11 1,525 8 0,046 10 0,460 52