Khóa luận Nghiên cứu định lượng Atractylenolide III trong thân rễ bạch truật (Atractylodes macrophala Koidz) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao bắt cặp detector DAD

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu định lượng Atractylenolide III trong thân rễ bạch truật (Atractylodes macrophala Koidz) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao bắt cặp detector DAD

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC TRẦN NGỌC TUÂN NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ATRACTYLENOLIDE III TRONG THÂN RỄ BẠCH TRUẬT (Atractylodes macrophala Koidz) BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO BẮT CẶP DETECTOR DAD KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2019
2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC Người thực hiện : TRẦN NGỌC TUÂN NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ATRACTYLENOLIDE III TRONG THÂN RỄ BẠCH TRUẬT (Atractylodes macrophala Koidz) BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO BẮT CẶP DETECTOR DAD KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH2014.Y Người hướng dẫn: TS. Hoàng Lê Sơn PGS.TS. Nguyễn Thanh Hải HÀ N Ộ@I – School 2019 of Medicine and Pharmacy, VNU
3. LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới Tiến sĩ Hoàng Lê Sơn – Khoa Bào chế Chế biến và PGS.Tiến sĩ Nguyễn Thanh Hải – Chủ nhiệm bộ môn Bào chế khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Dược Liệu là những người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này. Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Bào chế - khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và khoa Bào chế Chế biến – Viện Dược Liệu, đã tạo điều kiện để tôi có thể thực hiện khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm, các Phòng ban khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội cùng toàn thể các thầy cô giáo trong khoa đã cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt những năm học tập, sinh hoạt và rèn luyện tại khoa. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh, động viên tôi trong lúc khó khắn cũng như trong quá trình thực hiện khóa luận này. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Trần Ngọc Tuân @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
4. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT LOD Giới hạn phát hiện (Limit Of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit Of Quantitation) HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) DAD Máy đo quang (Diode Array Detector) RSD Độ lệch chuẩn tương đối ACN Acetonitrile USP Dược điển Hoa Kì ICH Hội nghị quốc tế về hài hoà hoá các thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho con người @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
5. DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Tên bảng Số trang 1 Hóa chất thuốc thử dùng trong nghiên cứu. 9 2 Trang thiết bị, máy móc sủ dụng trong nghiên cứu. 9 Kết quả sắc ký đồ khảo sát hệ dung môi pha động với các 16 3 chương trình chạy đẳng dòng bằng HPLC-DAD, bước sóng phát hiện là 220nm. Kết quả diện tích pic của các lần chiết mẫu Bạch truật với 17 4 Ethanol 96% khi phân tích bằng HPLC-DAD. 5 Các thông số đánh giá HPLC đối với Atractylenolide III. 18 Kết quả độ tuyến tính của phương pháp HPLC định lượng 20 6 Atractylenolide III với dãy nồng độ chuẩn. Kết quả đánh giá tính thích hợp hệ thống của phương pháp 21 7 định lượng Atractylenolide III với mẫu chuẩn nồng độ 26µg/ml. Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp định lượng 22 8 Atractylenolide III với mẫu Bạch truật chiết với Ethanol 96%. Kết quả đánh giá độ thu hồi của phương pháp định lượng 22 9 trong mẫu thử thêm chuẩn Atractylenolide III. Kết quả xác định hàm lượng Atractylenolide III trong mẫu 23 10 Bạch truật Việt Nam và Trung Quốc. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
6. DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Tên hình Số trang 1 Công thức cấu tạo một số chất chính trong cây bạch truật. 4 2 Công thức cấu tạo của Atractylenolide III. 7 Sắc ký đồ phân tích ở bước sóng 220nm - 254nm và bước 3 15 sóng hấp thụ cực đại của Atractylenolide III. Sắc ký đồ HPLCđánh giá độ đặc hiệu của phương pháp 4 định lượng Atractylenolide III với mẫu thử, mẫu thử 28 thêm chuẩn và mẫu chuẩn. Sắc ký đồ HPLC của Atractylenolide III với nồng độ lần 5 19 lượt là 0,065µg/ml và 0,65µg/ml. Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và 6 diện tích pic của dung dịch chất chuẩn Atractylenolide 20 III. Sắc ký đồ phân tích Atractylenolide III trong mẫu Bạch 7 24 truật bằng HPLC-DAD. Phổ hấp thụ UV của thành phần khác trong mẫu Bạch 8 24 truật Việt Nam. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
7. MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 2 1.1. Giới thiệu chung về cây bạch truật 2 1.1.1. Tên khoa học 2 1.1.2. Mô tả thực vật, bộ phận dùng 2 1.1.3. Phân bố, thu hái và chế biến 2 1.1.4. Thành phần hóa học 3 1.1.5. Tác dụng dược lý 5 1.2. Tổng quan về vị thuốc Bạch thuật 7 1.3. Vài nét về hoạt chất Atractylenolide III 8 1.4. Các nghiên cứu định lượng Atractylenolide III trong cây bạch truật 8 CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9 2.1. Đối tượng nghiên cứu 9 2.2. Trang thiết bị, dung môi, hóa chất 9 2.3. Phương pháp nghiên cứu 10 2.3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký 10 2.3.2. Phương pháp xử lý mẫu 10 2.3.3. Thẩm định quy trình phân tích 10 2.3.4. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả 13 CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ 15 3.1. Xây dựng phương pháp định lượng Atractylenolide III 15 3.1.1. Xác định bước sóng phát hiện của chất chuẩn Atractylenolide III 15 3.1.2. Xây dựng điều kiện sắc ký trên mẫu Bạch truật bằng HPLC-DAD 15 3.1.3. Xác định điều kiện tối ưu hóa xử lý mẫu 17 3.1.4. Điều kiện chạy sắc ký HPLC 17 3.2. Thẩm định phương pháp phân tích @ School of Medicine and Pharmacy, 18 VNU
8. 3.2.1. Tính đặc hiệu của phương pháp 18 3.2.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 19 3.2.3. Độ tuyến tính 19 3.2.4. Độ thích hợp của hệ thống 21 3.2.5. Độ lặp lại 21 3.2.6. Độ đúng 22 3.3. Ứng dụng phương pháp xác định hàm lượng dược chất trong củ Bạch truật 23 CHƯƠNG 4 - BÀN LUẬN 25 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
9. MỞ ĐẦU Bạch truật là vị thuốc từ loài Atractylodes macrocephala Koidz (Họ Compossitae), có vị trí quan trọng trong các bài cổ phương hoặc đơn độc tại Đông Á trong hơn một ngàn năm nay để điều trị một số chứng bệnh như đau dạ dày, bụng trướng đầy, ung thư, chứng loãng xương và béo phì. Khoảng hơn bảy mươi hợp chất được xác định cấu trúc hóa học trong đó đa phần thuộc về nhóm sesquiterpenoid, phenolic acid và polyacetylene nhưng mối liên hệ với tác dụng trên lâm sàng là chưa rõ ràng. Cả chất tinh khiết lẫn cao dịch chiết đều thể hiện tác dụng dược lý mạnh như cải thiện hệ tiêu hóa thông qua thế bào IEC-6, kháng một số dòng tế bào ung thư gồm HepG2, LOVO, CEM, và MKN-45, kích thích miễn dịch, kháng viêm, chống oxy hóa, và cải thiện khả nhớ của chuột. Với những lợi ích trên lâm sàng và hiệu quả điều trị đã được chứng minh, cây Bạch truật bắt đầu di thực về Việt Nam từ những năm 1970 và giờ được trồng phổ biên tại Lào Cai, Sơn La, Hà Giang, Hà Nội và Lâm Đồng. Hiện tại, các nghiên cứu công bố về hàm lượng dược chất có trong Bạch truật di thực vẫn còn hạn chế. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu định lượng Atractylenolide III trong thân rễ bạch truật (Atractylodes macrophala Koidz) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao bắt cặp detector DAD” với hai mục tiêu dưới đây: - Xây dựng phương pháp định lượng Atractylenolide III trong thân rễ cây Bạch truật bằng phương pháp HPLC-DAD. - Ứng dụng phương pháp để định lượng hàm lượng Atractylenolide III trong mẫu Bạch truật Việt Nam và Trung Quốc. Lựa chọn chất nghiên cứu là Atractylenolide III giữa các hoạt chất chính thể hiện tác dụng bảo vệ đường tiêu hóa, chống loãng xương, cải thiện trí nhớ, và kháng viêm trên các mô hình dược lý được giải thích như sau. Hàm lượng Atractylenolide III thấp hơn so với atractylenolide I và II có thể gây khó khăn quá trình định lượng nhưng điều này phản ảnh một thực tế tác dụng của cao dịch chiết Bạch truật lại tốt hơn đơn chất riêng biệt. Kiểm soát chất nhỏ hơn sẽ có lợi ích hơn trong trường hợp này. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 1
10. CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu chung về cây bạch truật 1.1.1. Tên khoa học. Bạch truật có tên khoa học là Atractylodes macrocephala Koidz thuộc họ Cúc (Compossitae) [1]. 1.1.2. Mô tả thực vật, bộ phận dùng Đặc điểm: Cây thảo, sống lâu năm, có thân rễ to, mọc dưới đất. Thân thẳng, cao 0.3-0.8m, đơn độc hoặc phân nhánh ở bộ phận trên, phần dưới thân hóa gỗ. Lá mọc cách, dài. Lá ở phần dưới của thân có cuống dài, phần trên có cuống ngắn, gốc lá rộng, bọc lấy thân. Phiến lá xẻ sâu thành 3 thùy, thùy giữa rất lớn, hình trứng tròn, hai đầu nhọn, hai thùy bên nhỏ hơn, hình trứng mũi mác, phần gốc không đối xứng. Các lá ở gần ngọn thân có phiến nguyên, hình thuôn hoặc hình trứng mũi mác, mép có răng cưa. Đầu lớn, phần dưới có một lá bắc hình lá xẻ sâu, hình lông chim. Bao hình chuông, có lá bắc mỏng xếp thành 7 hàng. Lá bắc dưới nhỏ hình trứng tam giác, to dần ở phía trên. Hoa nhiều, tràng hình ống, phần dưới màu trắng, phần trên màu đỏ tím, xẻ làm 5 thùy hình mũi mác, xoắn ra ngoài. Năm nhị hàn liền nhau (có nhị bị thoái hóa), chỉ nhị hình sợi dẹp. Bầu thon mặt ngoài có lông nhung, màu nâu nhạt, đoạn trên có lông hình lông chim. Vòi hình chỉ màu tím nhạt đầu nhị xẻ thành 2 thùy nông hình đầu, mặt ngoài có lông ngắn. Quả bế, thuôn, dẹp, màu xám [2]. Bộ phận dùng làm thuốc: Dùng thân rễ cứng chắc, có dầu thơm nhẹ, ruột màu trắng ngà [2,10]. 1.1.3. Phân bố, thu hái và chế biến Phân bố: Bạch truật trồng chủ yếu ở Trung Quốc. Đến những năm 1970, Bạch truật đã bắt đầu di thực và hiện nay được trồng tại Lào Cai, Sơn La, Hà Giang, Hà Nội và Lâm Đồng [2,10]. Thu hái và sơ chế: Cây trồng bạch truật thu hái từ cuối tháng 10 đến đầu tháng 11 (thường từ 8-22/11). Lúc thu hoạch, chọn ngày nắng ráo, đất khô, nhổ từng cây nhẹ nhàng. Sau khi nhổ, lấy dao cất bỏ thân cây đem củ về chế biến [1,10]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 2
11. Chế biến: Bạch truật đã loại bỏ tạp chất, rửa sạch, ủ mềm, thái lát dày, làm khô. Sau khi sơ chế có thể tiến hành chế biến 2 loại Bạch truật sau: - Thổ Bạch truật: Lấy bạch truật phiến, dùng bột mịn phục long cán sao đến khi mặt ngoài có màu đất, rây bỏ đất, cứ 100 kg bạch truật phiến dùng 20 kg bột mịn phục long cán [1]. - Bạch truật sao: Lấy cám mật chích, cho vào trong nồi nóng, khi khói bốc lên thì cho bạch truật phiến vào sao cho đến khi có màu vàng sém, có mùi thơm cháy, lấy ra rây bỏ cám mật chích, cứ 100 kg bạch truật phiến dùng 40 kg cám mật chích. Có thể sử dụng cám gạo thay cám mật chích [1]. 1.1.4. Thành phần hóa học Thành phần hóa học trong cây bạch truật đã được xác định cấu trúc gồm 67 hoạt chất chính thuộc chia vào các nhóm sau: Sesquiterpenoids, triterpenoids, polyacetylenes, coumarins, phenylpropanoids, flavonoids, và flavonoid glycosides. Ngoài ra, hai nhóm steroid và benzoquinones gồm có 4 hoạt chất chiếm tỉ lệ thấp hơn trong cây bạch truật [7]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 3
12. Hình 1: Công thức hóa học mộ t@ số chSchoolất chính trong of câyMedicine Bạch truật. and Pharmacy, VNU 4
13. 1.1.5. Tác dụng dược lý Cải thiện chức đường tiêu hóa: Trong thử nghiệm lâm sàng trên chuột sử dụng cao bạch truật với hàm lượng 0,035 g/kg và 0,105 g/kg cho kết quả cải thiện trọng lượng của chuột, và thúc đẩy khả năng tiêu hóa của vi khuẩn đường ruột [2,7]. Hoạt động chống khối u: Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng trên người mắc ung thư, những người sử dụng cao ethanol bạch truật (1 – 4 mg/ml) trong 24 giờ cho thấy giảm đáng kể các tế bào ưng thư [2,7]. Tác dụng điều hòa miễn dịch: Các nghiên cứu trước đây đã phát hiện ra rằng khi sử dụng bạch truật cho tác dụng điều hòa miễn dịch. Bột bạch truật dùng đường uống với liều rất cao (1g/kg) sử dụng cho heo con trong 30 ngày cho kết quả tăng sinh tế bào lympho ngoại biên, chỉ số tăng trọng, nồng độ immunoglobulin G (IgG) trong huyết thanh, nồng độ IL-1 và IL-2, và biểu hiện mRNA PR-39. Những chỉ số này cho thấy rằng bạch truật có thể cải thiện sự trao đổi chất và chức năng miễn dịch của heo con [2,7]. Tác dụng chống viêm: Thử nghiệm trên những con chuột bị viêm đại tràng cấp tính do dextran sulfate gây ra, nghiên cứu sử dụng cao chiết bạch truật (100mg/kg) đã làm giảm biểu hiện của những yếu tố viêm như COX-2, iNOS, IL-1β, TNF-α, NF- B. Ngoài ra, những nghiên cứu sử dụng polyacetylenes (25 – 300 mg/kg) trên chuột có hiện tượng viêm gây ra bởi acetic acid hoặc dimethyl benzene thì trong 3 − 5 ngày đã được tìm thấy để ức chế đáng kể phản ứng viêm [26,7]. Điều trị bệnh Alzheimer và bảo vệ hệ thần kinh: Trong một mô hình thử nghiệm có sử dụng cao chiết xuất bạch truật với ethanol (0,5 – 2 mg/kg) được xây dựng để tăng cường trí nhớ, giảm tần suất sai lệch và giảm cholinesterase (AChE). Tác dụng của cao chiết bạch truật với ethanol có thể cải thiện tình trạng suy giảm trên chuột già. Ngoài ra, phương pháp điều trị 3 ngày với atractylenolide III (30 µg/ml) được xây dựng để cải thiện hoạt động của tế bào và ức chế apoptosis. Những tác dụng này cho thấy rằng atractylenolide III có hoạt tính bảo vệ thần kinh quan trọng [4,7]. Tác dụng chống lão hóa và chống oxy hóa: Cao bạch truật được chứng minh là có hoạt động chống lão hóa và chống oxy @ hóa School trên mô hình of chuMedicineột. Trên nhữ andng con Pharmacy, VNU 5
14. chuột sử dụng D-galactose, cao chiết bạch truật ngâm với nước được sử dụng làm tăng hoạt động NO synthase (NOs), tăng sản xuất NO, và giảm hàm lượng lipid peroxide (LPO) trong mô não. Các điều trị bằng polysacarides (100−200 mg/kg) cho chuột đã sử dụng D-galactose trong 6 tuần thấy rằng nồng độ MDA và lipofuscin (Lipo) cũng như hoạt động của monoamtin oxydase (MAO) giảm. Hơn nữa, điều trị này làm tăng glutathione peroxidase (GSH-Px), CAT, SOD và toàn bộ năng lượng hoạt động chống oxy hóa (T-AOC). Những tác dụng này cho thấy rằng polysacarides làm tăng hoạt động chống oxy hóa ở chuột già bằng cách ức chế tạo ra peroxit lipid và tăng hoạt tính enzyme chống oxy hóa [7]. Điều hòa nội tiết và tác dụng giảm co: Nghiên cứu sử dụng cao methanol bạch truật với liều rất cao 0,5−0,8 g/kg cho chuột gây rối loạn nội tiết bởi testosterone propionate trong 8 tuần cho thấy cải thiện chu kỳ động dục, mức độ hormone kích thích nang trứng (FSH) và giảm sự cân bằng của toàn bộ testosterone (TT), chỉ số androgen tự do (FAI), androstenedione phụ thuộc vào liều dùng. Cao chiết này cũng tăng kiểm soát biểu hiện của aquaporin-9 (AQP-9) và giảm kiểm soát biểu hiện của thụ thể FSH (FSHR), vì vậy, cao chiết xuất bạch truật với metanol có thể điều chỉnh tuyến sinh dục sản xuất hoóc môn và làm giảm chứng tăng huyết áp [7]. Điều trị béo phì và tăng cường chuyển hóa năng lượng: Những nghiên cứu sử dụng cao bạch truật (100-300 mg/kg) cho chuột béo phì do chế độ ăn nhiều chất béo trong 16 tuần dẫn đến giảm trọng lượng cơ thể, nồng độ lipid gan và nồng độ cholesterol toàn phần trong huyết thanh. Phương pháp sử dụng cao chiết bạch truật này dẫn đến sự tăng nồng độ insulin, và không dung nạp glucose. Những hiệu ứng này cho thấy rằng bạch truật có thể ngăn ngừa béo phì. Hơn nữa, sử dụng cao bạch truật (0,2 − 1,0 mg/ml) đến các tế bào C2C12 trong 24h tăng đáng kể giải phóng glucose, sự biểu hiện của PGC1α và palmitoyltransferase 1b chuyển hóa khoáng chất (CPT). Hơn nữa, cao bạch truật cũng làm giảm hàm lượng axit béo tự do (FFA). Khi kết hợp với nhau, những tác động này cho thấy bạch truật có thể kích thích chức năng ty thể và chuyển hóa năng lượng trong các mô cơ [2,7]. Tác dụng chống loãng xương: Nghiên cứu thử nghiệm trên các đại thực bào chuyển hóa từ tủy xương và chuột bị tác động b ở@i th ụSchool thể của ph ốofi tử Medicine NF-κB (RANKL; and mộ tPharmacy, VNU 6
15. cytokine thiết yếu thúc đẩy biệt hóa tế bào tiền hủy xương thành tế bào hủy xương), việc sử dụng cao chiết xuất bạch truật với ethanol cho thấy ức chế sự phân hóa tế bào hủy xương [7]. Hoạt tính kháng khuẩn: Cao bạch truật cũng đã được chứng minh là có hoạt động kháng khuẩn. Nghiên cứu sử cao chiết bạch truật (5-40 mg/ml) với tụ cầu vàng, E.Coli, và trực khuẩn mủ xanh trong 24 giờ cho thấy để ức chế đáng kể sự phát triển của các vi khuẩn này [2,7]. Tác dụng lợi niệu: Trên chuột thử nghiệm với cao chiết nước của bạch truật (1 – 10 g/ml) trong 30 phút cho thấy cao chiết có tác dụng ức chế tiểu quản thận tái hấp thu nước, tăng bài tiết Natri [4,7]. 1.2. Tổng quan về vị thuốc Bạch thuật Tính vị quy kinh: Khổ, cam, ôn. Vào kinh Tỳ và Vị [1]. Công năng chủ trị: Kiện tỳ, ích khí, táo thấp, lợi thủy, cố biểu, liễm hãn, an thai. Chủ trị: Tiêu hóa kém, bụng trướng, tiêu chảy, phù thũng, tự hãn, động thai. Cách dùng: Ngày dùng từ 6–12g, dạng thuốc sắc hoặc bột. Bạch truật sao cám, tẩm mật ong tăng tác dụng kiện tỳ, sao cháy có tác dụng chỉ huyết [1]. Kiêng kỵ: Đau bụng do âm hư nhiệt trướng, đại tiện táo, háo khát không dùng [1]. 1.3. Vài nét về hoạt chất Atractylenolide III Hình 2: Công thức cấu tạo của Atractylenolide III. Atractylenolide III có công thức phân tử là C15H20O3. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 7
16. Danh pháp IUPAC: (4 S,8 R,9 S)-9 -hydroxy-3,8 -dimethyl-5-methylidene 4,4 ,6,7,8,9-hexahydrobenzo(1)benzofuran-2-one. Tính chất: - Atractylenolide III là dạng bột màu trắng hoặc tinh thể màu trắng. - Atractylenolide III tan tốt trong nước, methanol, ethanol, và một số dung môi hữu cơ khác. - Atractylenolide III cho phổ hấp thụ cực đại ở 220nm [27]. Tác dụng dược lý: Atractylenolide III có tác dụng bảo vệ thần kinh, dạ dày, chống ung thư và chống viêm. Hoạt chất Atractylenolide III cũng có tác dụng kiểm soát miễn dịch bằng cách điều chỉnh chức năng của tế bào IL-6 trong tế bào mast. 1.4. Các nghiên cứu định lượng Atractylenolide III trong cây bạch truật Trong một nghiên cứu của nhóm tác giả Hao Cai và các đồng nghiệp vào năm 2012 đã định lượng hai hoạt chất trong Bạch truật là Atractynolid I và Atractynolid III với bước sóng cực đại 220nm. Máy Agilent Zorbax Eclipse XDB Cột C-18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm). Tốc độ dòng 1 ml/phút , tiêm 10µl và nhiệt độ cột là 250C. Hệ được sử dụng trong nghiên cứu này là ACN (A) và nước (B) với tỉ lệ 0-10 phút 30-60% A; 10-20 phút 60-65% A; 20-25 phút 65-100% A; 25-37 phút 100% A. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp xử lý mẫu với Ethanol 80%, chiết siêu âm trong 30 phút , sau đó lọc để thu được dịch chiết [7,13]. Theo dược điển Hong Kong định lượng được hoạt chất Atractylenolide III trong mẫu Bạch truật bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng với điều kiện bước sóng hấp thụ cực đại 220nm, cột silicagen liên kết ODS (5µm, 250 x 4,6mm), tốc độ dòng 1ml/phút và với hệ dung môi Methanol :Nước = 70 :30 trong 25 phút. Mẫu được xử lý bằng phương pháp siêu âm với 2g bột dược liệu trong 50 ml dung môi Ethanol 70%, siêu âm, có thể tiến hành chiết nhiều lần với thời gian kéo dài phù hợp với mục đích nghiên cứu mẫu [23]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 8
17. CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Mẫu nghiên cứu: thân rễ khô của Bạch truật với tên khoa học Atractylodes macrophala Koidz (họ Compossitae). Mẫu có nguồn gốc từ Hà Nội, Việt Nam và Liêu Ninh, Trung Quốc do Viện Dược Liệu cung cấp. 2.2. Trang thiết bị, dung môi, hóa chất Hóa chất – thuốc thử Hóa chất thuốc thử được cung cấp bởi nhà sản xuất có uy tín với độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng. Bảng 1: Hóa chất, thuốc thử dùng trong nghiên cứu. Nguyên vật liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn Atractylenolide III Trung Quốc Độ tinh khiết 98% Acetonitrile Merck-Đức HPLC Methanol Trung Quốc PA Ethanol Trung Quốc PA Thiết bị, dụng cụ Thiết bị máy móc được sử dụng đảm bảo chính xác và độ tin cậy theo thông tin như nhà sản xuất. Bảng 2: Trang thiết bị, máy móc sử dụng trong nghiên cứu. STT Tên thiết bị, dụng cụ Xuất xứ 1. Shimadzu LC – 20AD Nhật Bản 2. Shimadzu SPD – M20A Nhật Bản 3. Shimadzu SIL – 20A Nhật Bản @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 9
18. 4. Shimadzu CTO – 10AS Nhật Bản 5. Cột supelco Mỹ 6. Máy siêu âm MRC Việt Nam 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký Chúng tôi tiến hành sắc ký với cột Supleco C18(5µm, 250 x 4,6mm), tốc độ dòng 1ml/phút và thể tích tiêm mẫu 20µl để khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại và hệ dung môi pha động. - Khảo sát bước sóng: Tiến hành sắc ký với chất chuẩn Atractylenolide III bằng phương HPLC-DAD để tìm ra bước sóng hấp thụ cực đại của chất. - Khảo sát hệ dung môi pha động: Phương pháp khảo sát với các hệ dung môi ACN:Nước và Methanol:Nước. 2.3.2. Phương pháp xử lý mẫu Chuẩn bị mẫu chuẩn: - Dung dịch gốc: Cân chính xác khoảng 1mg chất chuẩn Atractylennolide III trong 1ml Methanol trong bình định mức 1ml. - Tiến hành pha dãy chuẩn trong bình định mức 1ml với các nồng độ 104; 52; 32,5; 26; 19,5; 13; 6,5; 3,25; 1,675; 0,65 và 0,065µg/ml từ dung dịch mẹ. Xử lý mẫu: Cân khoảng 0.2g bột dược liệu chiết với 5ml dung môi Nước, Methanol, và Ethanol 30; 50; 70; 90; 96% bằng phương pháp siêu âm. Sau đó định mức với bình định mức 5ml bằng dung môi. Lọc dung dịch qua màng 0,45µl trước khi tiến hành phân tích định lượng. 2.3.3. Thẩm định quy trình phân tích Theo tài liệu “Thẩm định quy trình phân tích: nội dung và phương pháp” (Validation of analytical procedures: text and methodology) của ICH (International Conference on Harmonization) ban hành @ vào School tháng 11 ofnăm Medicine 2005, các yếu andtố củ aPharmacy, VNU 10
19. một quy trình phân tích định lượng cần thẩm định gồm: độ đúng, độ chính xác, tính đặc hiệu, tính tuyến tính giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng [5,6,22,25]. Tính đặc hiệu Khái niệm: Là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất Trong phép phân tích định lượng, là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố khác, nhằm hướng đến kết quả chính xác. Phương pháp xác định: Sử dụng phương pháp thêm chuẩn sau chuẩn bị mẫu, cách này thường áp dụng đối với các phương pháp sắc ký. Sau khi chuẩn bị mẫu thử và phân tích mẫu thử trên thiết bị sắc ký thu được các pic sắc ký, ta thêm chuẩn vào mẫu đã chiết xuất và phân tích mẫu này. So sánh sắc ký đồ của hai mẫu để đánh giá tính đặc hiệu. Yêu cầu: Trên sắc ký đồ, pic mẫu thử phải trùng với vị trí của pic chất chuẩn và sắc ký đồ của chất nền không có pic nào. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Khái niệm: Giới hạn phát hiện (LOD) của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được và không cần phải xác định chính xác hàm lượng. Giới hạn định lượng (LOQ) của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể định lượng với độ đúng và độ chính xác phù hợp. Phương pháp xác định: Dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu S/N. LOD là nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị 2 – 3 và LOQ lại nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị gần bằng 10. Độ tuyến tính Khái niệm: Tính tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả của phương pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của đại lượng đo được như chiều cao hoặc diện tích pic (y) và nồng độ (x). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 11
20. Tính tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax+b với hệ số tương quan tuyến tính R2. Phương pháp xác định: - Khảo sát ở ít nhất 5 hoặc 6 mức nồng độ khác nhau. - Nồng độ cao nhất và thấp nhất phải nằm trong khoảng xác định của phương pháp. - Các mẫu được pha loãng từ mẫu chuẩn ban đầu. Yêu cầu: Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,995 ≤ R2 ≤ 1. Độ thích hợp hệ thống Khái niệm: Đánh giá độ thích hợp của hệ thống để đảm bảo hệ thống phù hợp để phân tích. Đánh giá sự phù hợp của hệ thống là các phép thử để chứng minh rằng hệ thống hoạt động đúng theo mục đích sử dụng. Phương pháp xác định: Tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn nhiều lần lặp lại vào hệ thống sắc ký và xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD). Số lần bơm tối thiểu 5 lần phải cho RSD nhỏ hơn 2% Nếu RSD lớn hơn 2% cần sử dụng 6 điểm. Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích pic và thời gian lưu ≤ 2%. Độ lặp lại Khái niệm: Độ lặp lại là sự ổn định trong phương pháp phân tích định lượng mẫu trong quá trình thực hiện. Phương pháp xác định: Trong phân tích hàng ngày, cần thực hiện song song tối thiểu 2 lần nhằm tránh được các sai số ngẫu nhiên gặp phải. Đánh giá mức độ chênh lệch giữa hai lần làm với giá trị trung bình, sự chênh lệch này phải thỏa mãn theo yêu cầu của từng phương pháp. Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) ≤ 2%. Độ đúng @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 12
21. Khái niệm: Độ đúng của phương pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng. Phương pháp xác định: Thêm một lượng chất chuẩn xác định vào mẫu thử hoặc mẫu trắng, phân tích các mẫu thêm chuẩn đó, làm lặp lại tối thiểu bốn lần bằng phương pháp khảo sát, tính độ thu hồi theo công thức sau đây: - Đối với mẫu thử: - Đối với mẫu trắng: Trong đó: R%: Độ thu hồi % : Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn : Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử : Nồng độ chất phân tích trong mẫu chuẩn : Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn Sau đó tính độ thu hồi chung là trung bình của độ thu hồi các lần làm lặp lại. Yêu cầu: Độ thu hồi đạt 98 - 102% và RSD ≤ 2%. 2.3.4. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp thống kê với chương trình Excel thông qua diện tích và thời gian lưu trên peak để xác định giá trị trung bình và độ lệch chuẩn tương đối (RSD). Công thức áp dụng xử lý kết quả: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 13
22. Trong đó: - là giá trị trung bình của các phép thử, được tính bằng công thức: - SD độ lệch chuẩn của độ đáp ứng. Trong đó SD được tính theo công thức: Công thức sử dụng trên Excel: Sử dụng hàm =stdev/average. Đánh giá kết quả thông qua các thông số: Hệ số kéo đuôi F, hệ số phân giải R, giá trị trung bình và độ lệch chuẩn tương đối RSD. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 14
23. CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ 3.1. Xây dựng phương pháp định lượng Atractylenolide III 3.1.1. Xác định bước sóng phát hiện của chất chuẩn Atractylenolide III Tiến hành khảo sát với mẫu chuẩn Atractylenolide III với nồng độ 6.5µg/ml điều kiênh cột Supleco C18, tốc độ dòng 1ml/phút, chế độ chạy sắc ký gradient dung môi ACN từ 20 đến 80% trong 60 phút. Kết quả thu được như hình 3. A B Hình 3: Sắc ký đồ HPLC và bước sóng hấp thụ cực đại của Atractylenolide III trong đó: A – sắc ký đồ chất chuẩn ở bước sóng 1- 254nm và 2- bước sóng 220nm; B – Bước sóng hấp thụ cực đại. Kết quả và nhận xét: Chúng ta thấy mẫu hấp thụ cực đại ở bước sóng 220nm. Dựa vào sắc ký đò, chúng tôi thấy rằng chất chuẩn Atractylenolide III mà chúng tôi sử dụng hoàn toàn đúng theo tiêu chuẩn nhà sản xuất với độ tinh khiết 98%. 3.1.2. Xây dựng điều kiện sắc ký trên mẫu Bạch truật bằng HPLC-DAD Chuẩn bị 1 mẫu thử với phương pháp xử lý mẫu nêu ở trên bằng dung môi Ethanol 96%. Tiến hành sắc ký kháo sát pha động với điều kiện sắc ký khảo sát pha động với cột pha đảo Supleco C18, tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu là 20µl, nhiệt độ phòng 250C và chế độ chạy đẳng dòng. Kết quả thu được như bảng 3: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 15
24. Bảng 3: Kết quả sắc ký đồ khảo sát hệ dung môi pha động với các chương trình chạy đẳng dòng bằng HPLC-DAD, bước sóng phát hiện là 220nm. Hệ dung môi Sắc ký đồ Hệ 1: Dataf ile Name:Et-AMTQ.2.lcd mAU 220nm,4nm Thời gian MeOH 200 150 100 0-15 7 50 0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min 0 tR=13,044 Dataf ile Name:EtOH-AM-ACN-20-80.lcd Hệ 2: mAU 254nm,4nm 5.0 Thời gian CAN 2.5 0-30 20 0.0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min tR= 27,481 Datafile Name:n-hexan-AM-ACN gradient 45-50.lcd Hệ 3: mAU 100 220nm,4nm 75 Thời gian CAN 50 25 0-30 45 0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 min tR= 19,835 Dataf ile Name:Et-AM-43ACN.5.lcd mAU Hệ 4: 25 220nm,4nm 20 Thời gian CAN 15 10 0-30 43 5 0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min tR= 23,356 tR (phút): Thời gian lưu của hoạt chất cần phân tích Atractylenolide III @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 16
25. Kết quả: Chúng tôi thấy hệ dung môi là ACN và Nước tỷ lệ 43:57 cho sắc ký đồ tốt nhất, phân tách rõ ràng, pic không có hiện tượng kéo đuôi, thời gian lưu đủ dài để rửa giải và không làm pic chồng lên nhau. 3.1.3. Xác định điều kiện tối ưu hóa xử lý mẫu Chúng tôi tiến hành xử lý mẫu bạch truật với dung môi Nước, Ethanol 30%, 50%, 70%, 96%, Methanol và n-hexane, bằng phương pháp siêu âm. Từ kết quả chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao với các mẫu được xử lý ở trên, chúng tôi thấy rằng việc xử lý mẫu bằng dung môi Ethanol 96% là tốt nhất. Tiếp theo, chúng tôi tiến hành xử lý mẫu bạch truật với dung dịch Ethanol 96% chiết bằng phương pháp siêu âm 3 lần trong 3 giờ. Kết quả thu được dưới bảng 4. Bảng 4: Kết quả diện tích pic của các lần chiết mẫu bạch với Ethanol 96% khi phân tích bằng HPLC-DAD. Lần chiết S pic Lần 1 216030 Lần 2 24229 Lần 3 0 Kết quả: Sau 2 lần chiết, hàm lượng dược chất trong dược liệu đã hết hoàn toàn. Lần chiết thứ 2, diện tich pic bằng 1/10 diện tích pic chiết lần 1. Nhận xét: Từ kết quả trên, chúng tôi lựa chọn phương pháp chiết sau âm mẫu Bạch truật 1 lần trong 1 giờ. 3.1.4. Điều kiện chạy sắc ký HPLC Dựa vào các nghiên cứu trên, chúng tôi đã xác định được điều kiện chạy sắc ký như sau: - Cột pha đảo Supleco C18 (5µm, 250 x 46mm). - Tốc độ dòng 1 ml/phút. - Nhiệt độ phòng 250C. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 17
26. - Bước sóng 220 nm. - Pha động là đẳng dòng với hệ dung môi ACN và Nước (43:57) trong 30 phút. Các thông số của peak được trình bày trong bảng 5. Bảng 5: Các thông số HPLC đánh giá đối với Atractylenolide III. STT Thông số đánh giá Giá trị 1 Thời gian lưu, tR 23,356 2 Diện tích pic (ứng với dung dịch chuẩn có nồng 2452822 độ 26µg/ml) 3 Độ phân giải, R 26,054 4 Hệ số kéo đuôi pic 1,244 5 Số đĩa lý thuyết 1662,6 3.2. Thẩm định phương pháp phân tích 3.2.1. Tính đặc hiệu của phương pháp Tiến hành phân tích 4 mẫu: Dung dịch Atractylenolid III chuẩn, dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu thử thêm chuẩn và dung dịch mẫu trắng với điều kiện phân tích HPLC đã trình bày ở trên, thu được kết quả đánh giá bằng sắc ký đồ tương ứng như hình 4. Hình 4: Sắc ký đồ HPLC đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp trong đó: 1- Mẫu trắng; 2- Mẫu thử; 3-M ẫ@u th ửSchool thêm chuẩ nof; 4 - MedicineMẫu chuẩn. and Pharmacy, VNU 18
27. Kết quả và nhận xét: Trên sắc ký đồ thu được cho thấy, thời gian lưu của 3 mẫu Atractylenolid III ở mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn là tương ứng với nhau và trên mẫu trắng không có. Pic Atractylenolid III không bị trùng với các pic khác. Phương pháp đã được xây dựng phù hợp với chất Atractylenolide III cần phân tích. 3.2.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Chúng tôi tiến hành chạy nền với điều kiện đã xây dựng ở trên. Dựa vào diện tích pic chất nền, chúng tôi tiến hành pha loãng dung dịch chuẩn đến khi S/N= 2-3 thì pha loãng thêm một lần nữa nếu S/N không nằm trong khoảng giới hạn Hình 5: Sắc ký đồ HPLC của trên thì giá trị đó là giá trị giới hạn phát Atractylenolide III với nồng độ lần lượt là hiện LOD, từ đó suy ra giới hạn định 0,065µg/ml và 0,65µg/ml. lượng LOQ. Kết quả và nhận xét: Tại nồng độ 0.065 µg/ml tỷ lệ S/N tương ứng là 5. Từ đó chúng tôi suy ra kết quả LOD với tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu S/N=3 thì giá trị LOD = 0,039µg/ml. Kết quả thu được như sau: - Giới hạn phát hiện (LOD): 0,039 (µg/ml). - Giới hạn định lượng (LOQ): 0,117 (µg/ml). 3.2.3. Độ tuyến tính Tiến hành chạy sắc ký dãy dung dịch chuẩn Atractylenolide III có nồng độ từ 104µg/ml đến 1,625µg/ml với các điều kiện như đã xây dựng ở trên. Kết quả khảo sát giữa nồng độ và diện tích pic của dung dịch Atractylenolide tương ướng trong bảng 6. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 19
28. Bảng 6: Kết quả độ tuyến tính của phương pháp HPLC định lượng Atractylenolide III với dãy nồng độ chuẩn. Nồng độ (µg/ml) Diện tích pic (mAU.s) Nồng độ tính lại từ đường chuẩn (µg/ml) 1.625 120783 2,487 3.25 243363 3,824 6.5 587771 7,580 13 1111158 13,287 19.5 1643712 19,095 26 2188350 25,034 32.5 2797135 31,673 52 4468481 49,899 104 9566241 105,490 Phương trình đường y= 91701x – 107362 R2 0,9987 Hình 6: Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic của mẫu chuẩn Atractylenolide III. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 20
29. Kết quả và nhận xét: Độ tuyến tính được đánh giá qua hệ số tương quan R2. R2 = 0,9987 cho thấy đường chuẩn có độ tuyến tính cao đảm bảo để thực hiện phép phân tích định lượng Atractylenolide III. 3.2.4. Tính thích hợp của hệ thống Tính thích hợp của hệ thống được thực hiện sắc ký tiêm 5 lần với một mẫu chuẩn nồng độ 26µg/ml. Kết quả được đánh giá thông qua giá trị độ lệch tương đối RSD (%) của diện tích pic và thời gian lưu sau 5 lần phân tích lặp lại cùng một mẫu chuẩn Atractylenolide III có nồng độ 26 µg/ml. Kết quả được trình bày dưới bảng7. Bảng 7: Kết quả đánh giá tính thích hợp hệ thống của phương pháp định lượng Atractylenolide III với mẫu chuẩn nồng độ 26µg/ml. STT Diện tích pic ( mAU.s) Thời gian lưu ( phút ) 1 2611305 23,169 2 2572585 23,152 3 2604363 23,363 4 2626525 23,398 5 2687905 23,445 Trung bình 2620537 23,305 RSD (%) 1,621 0,582 Kết quả và nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích pic và thời gian lưu đều nhỏ hơn 2%, kết quả cho thấy tính thích hợp của phương pháp đã xây dựng đạt. 3.2.5. Độ lặp lại Độ lặp lại được đánh giá theo phương pháp đã trình bày ở trên. Độ lặp lại được đánh giá thông qua chỉ sô độ chệch tương đối (RSD) của hàm lượng dược chất trong dược liệu 2%. Kết quả thu đượ c@ trình School bày trong bofảng Medicine 8. and Pharmacy, VNU 21
30. Bảng 8: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp định lượng Atractylenolide III với mẫu bạch truật chiết với Ethanol 96%. Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Khối lượng dược liệu (g) 0,2019 0,1975 0,1532 0,1989 0,1512 Hàm lượng Atractynolide III (%) 0,0822 0,0800 0,0789 0,0805 0,0808 TB hàm lượng (%) 0,0836 RSD (%) 1,2691 Kết quả và nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) 2% cho thấy phương pháp xây dựng có độ lặp lại cao. 3.2.6. Độ đúng Độ đúng được đánh giá theo phương pháp đã trình bày ở trên. Độ đúng được đánh giá qua độ thu đồ dược chất cần phân tích Atractylenolide III là 98-102% theo quy định của ICH và độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của 3 lần lặp lại mẫu đánh giá độ thu hồi 2%. Kết quả được trình bày dưới bảng 9. Bảng 9: Kết quả đánh giá độ thu hồi của phương pháp định lượng trong mẫu thử thêm chuẩn Atractylenolide III. Nồng độ Nồng độ Nồng độ thêm Nồng độ dược Độ thu hồi RSD dược chất thêm chuẩn mẫu chuẩn chất thu hồi (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) (%) (%) 44,080 19,8801 101,95 19,5 44,097 19,8970 102,04 0,20 24,2 44,021 19,8209 101,65 47,711 23,5112 98,37 23,9 1,79 47,974 23,7744 99,48 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 22
31. 49,027 24,3452 101,86 54,204 29,9667 101,96 29,39 54,084 29,8840 101,68 0,19 54,067 29,8671 101,62 Kết quả và nhận xét: Độ thu hồi trung bình của phương pháp định lượng Atractylenolide III trong dược liệu bạch truật bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC đạt trong khoảng 98-102%, chứng tỏ phương pháp đã xây dựng có độ đúng cao. 3.3. Ứng dụng phương pháp xác định hàm lượng dược chất trong củ bạch truật Phân tích hàm lượng Atractylenolide III trên 3 mẫu dược liệu Việt Nam và Trung Quốc bằng phương pháp đã xây dựng. Kết quả được trình bày trong bảng 10 và so sánh sắc ký đồ hai mẫu bạch truật Việt Nam truật và Trung Quốc dưới hình 8. Bảng 10: Kết quả xác định hàm lượng Atractylenolide III trong mẫu bạch truật Việt Nam và Trung Quốc. Mẫu Tên Mẫu Hàm lượng Atractylenolide III(%) Mẫu Việt Nam M1 0,0628 Mẫu Trung Quốc M2 0,0822 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 23
32. B A Hình 7: Sắc ký đồ phân tích Atractylenolide III trong mẫu Bạch truật bằng HPLC- DAD trong đó A- Bạch truật Việt Nam, B- Bạch truật Trung Quốc. Hình 8: Phổ hấp thụ UV của thành phần khác trong mẫu bạch truật Việt Nam. Nhận xét: Dựa vào kết quả cho thấy trong bạch truật trồng tại Việt Nam và Trung Quốc có hàm lượng Atractynolide III lần lượt là 0,06 và 0,08%, tương ứng. So sánh phổ đồ, trong bạch truật Việt Nam xuất hiện một số pic khác (UV trong hình 8), điều này cho thấy, bạch truật Việt Nam cần một số nghiên cứu khác về thành phần hóa học. Điều này lý giải tại sao áp dụng điều kiện chạy dược điển Hồng Kông lại thất bại trên mẫu dược liệu Việt Nam. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 24
33. CHƯƠNG 4 - BÀN LUẬN Trong nghiên cứu này, phương pháp định lượng Atractylenolide III trong thân rễ cây bạch truật được xây dựng và thẩm định. Trong đó, điều kiện pha động HPLC-DAD là MeOH :H2O có tỷ lệ 43 :57. Độ chính xác của phương pháp đạt sau khi thẩm định theo hướng dẫn của ICH. Kết quả áp dụng phương pháp vừa xây dựng cho thấy Atractynolide III trong mẫu trồng tại Việt Nam thấp hơn Trung Quốc. Do mẫu thu thập bị giới hạn số lượng, vẫn cần nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn để khẳng định chắc chắn sự khác biệt. Tuy nhiên, giá trị thu được cao hơn nhiều lần yêu cầu của dược điển Hồng Kông yêu cầu là 0,019%. Chứng tỏ, bạch truật thu hái tại Việt Nam có đủ điều kiện thâm nhập thị trường dược liệu Hồng Kông, nơi cửa ngõ giao thương bên ngoài vào Trung Quốc cũng như đi nhiều nơi khác trên thế giới. Bên cạnh đó, hai phổ đồ thu được thể hiện rõ sự khác biệt về peak phụ. Điều này cho thấy tiềm năng sinh học cũng như thành phần hóa học của cây trồng tại Việt Nam chưa được khám phá hết. Mặt khác, chính điều này gây khó khăn không thể áp dụng dược điển Hồng Kông trong phân tích mẫu Bạch truật tại Việt Nam. Phương pháp phân tích vừa xây dựng có thể áp dụng tốt cho đối tượng Dược liệu nguồn gốc từ Trung quốc. Từ đó, chúng tôi đề nghị tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học cũng như tác dụng dược lý của bạch truật tại Việt Nam. Và các nghiên cứu sau tập trung tăng số lượng mẫu để đưa ra giới hạn hàm lượng Atractynolide III trong tiêu chuẩn cơ sở của bạch truật trồng tại Việt Nam. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 25
34. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Điều kiện phân tích HPLC của Atractynolide III trên mẫu bạch truật như sau: - Hệ dung môi: ACN: nước (43: 57) - Cột sắc ký pha đảo: Supleco C-18(5µm, 250 x 4,6mm) - Thể tích tiêm mẫu: 20 µl - Bước sóng cực đại: 220 nm - Thời gian sắc ký: 30 phút Bạch truật thu hái tại Việt Nam có hàm lương Atractynolide III là 0,06% trong khi Trung Quốc là 0,08%. Phổ đồ của Bạch Truật Việt Nam có quan sát thấy khác biệt với Trung Quốc về peak phụ. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 26
35. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam Bạch truật IV, Nhà xuất bản Y học, pp. 693 - 694. [2] Bộ Khoa học và công nghệ (2007), Thực vật chí Việt Nam họ Cúc tập 7, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, pp. 523 – 524. [3] Trường Thụ Sinh (2012) , Trung Dươc Lâm Sàng, Nhà xuất bản Y học, pp. 314 – 316. [4] Viện Dược Liệu (1993), Tài nguyên cây thuốc Việt Nam Bạch truật, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật liệu, pp. 360 – 382. [5] Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hoá học và vi sinh vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật, pp.10-59. Tiếng Anh [6] Bilal Yilmaz, Emrah Alkan (2015), “Spectrofluorometric and Spectrofluorometric and UV Spectrofluorometric Methods for the Determination of Flurbiprofen in Pharmaceutical Preparations”, Journal of Pharmaceutical Analysis, 4(4). [7] Bo Zhu (2018), “The traditional uses, phytochemistry, and pharmacology of Atractylodes macrocephala Koidz”, Journal of ethnopharmacology. [8] Brian A. Bidlingmeyer (1992), Practical HPLC Methodology and Applications, Wiley Series in Engineering and Technology Management, pp. 67 – 103. [9] Danilo Corradini (2016), Handbook of HPLC second edition, Chromatographic science series, pp. 207 – 232. [10] Chinese Pharmacopoeia Commission (2015), Pharmacopoeia of the peoples republic of China – English Edition(2015), Chemical Industry Press, pp. 524 – 526. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
36. [11] Elsevier Science (2017), “Application of Atractylodes Macrocephala Koidz Extract in Methicillin - Resistant Staphylococcus Aureus”, Procedia engineering, 174, pp. 410 -415. [12] George Lunn, Norman R. Schmuff (2000) - HPLC Methods for Pharmaceutical Analysis, Wiley-Blackwell, pp. 232 – 250. [13] Hao Kai (2012), “Study on chemical fingerprinting of crude and processed Atractylodes macrocephala from different locations in Zhejiang province by reversed-phase high-performance liquid chromatography coupled with hierarchical cluster analysis”, Pharmacognosy magazine, 8(32). [14] Hildebert Wagner, Chromatographic Fingerprint Analysis of Herbal Medicines: Thin-layer and High Performance Liquid Chromatography of Chinese Drugs, Springer Science & Business Media, pp. 113 - 123. [15] Hson-Mou Chang(1986), Pharmacology and Applications of Chinese Materia Medica, World Scientific, pp. 349 - 353. [16] Kokane Vikrant (2014), “Formulation and evaluation of topical flurbiprofen gel using different gelling agents”, World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3(9), pp. 654 - 663. [17] Jiaju Zhou (2003), Traditional Chinese Medicines: Molecular Structures, Natural Sources and Applications, Wiley, pp. 235 - 242 . [18] Joel K. Swadesh (2000), HPLC: Practical and Industrial Applications, Second Edition CRC Press, pp. 25 - 35. [19] Lena Ohannesian (2001), Handbook of Pharmaceutical Analysis, CRC Press, pp. 9 – 12. [20] Monika Waksmundzka-Ha nos, Joseph Sherma (2010), High Performance Liquid Chromatography in Phytochemical Analysis, CRC Express, pp. 3 – 12. [21] Murray, Kermit K., et al (2013), "Definitions of terms relating to mass spectrometry (IUPAC Recommendations 2013)", Pure and Applied Chemistry, 85(7), pp. 1515-1609. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
37. [22] The Europaean Pharmacopieal Commission (2010), Pharmacopoeia Europaea 7th Edition vol 2, Maisonneuve, pp, 1047 – 1050. [23] The government of Hong Kong Special Administrative region (2002), Hong Kong Chinese Materia Medica Standards, Chinese medicine division, pp. 265 – 273. [24] Toshihiko T Hanai (2007), HPLC: A Practical Guide, Royal Society of Chemistry, pp. 11 – 29. [25] United States Pharmacopoeial Convention (2010), United States Pharmacopoeia 35th Edition, United States Pharmacopeial Convention, pp. 970 – 973. [26] Xu, Shizao (2018), “UPLC-MS/MS of Atractylenolide I, Atractylenolide II, Atractylenolide III, and Atractyloside A in Rat Plasma after Oral Administration of Raw and Wheat Bran-Processed Atractylodis Rhizoma”, Morecules, 23(12), pp. 3234. [27] Weici Tang, Gerhard Eisenbrand (2013), Chinese Drugs of Plant Origin: Chemistry, Pharmacology, and Use in Traditional and Modern Medicine, Springer Science & Business Media, pp.199 – 201 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU