›

Khóa luận Nghiên cứu chiết xuất phân lập một số hợp chất từ phân đoạn n - hexan của lá cây Khôi đốm (Sanchezia nobilis Hook.f)

pdf 49 trang thiennha21 18/04/2022 5290
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu chiết xuất phân lập một số hợp chất từ phân đoạn n - hexan của lá cây Khôi đốm (Sanchezia nobilis Hook.f)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_nghien_cuu_chiet_xuat_phan_lap_mot_so_hop_chat_tu.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu chiết xuất phân lập một số hợp chất từ phân đoạn n - hexan của lá cây Khôi đốm (Sanchezia nobilis Hook.f)

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC PHẠM THỊ HÀ NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ PHÂN ĐOẠN N – HEXAN CỦA LÁ CÂY KHÔI ĐỐM (Sanchezia nobilis Hook.f) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2019
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC PHẠM THỊ HÀ NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ PHÂN ĐOẠN N – HEXAN CỦA LÁ CÂY KHÔI ĐỐM (Sanchezia nobilis Hook.f) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2014.Y Người hướng dẫn: TS. Vũ Đức Lợi ThS. Bùi Thị Xuân Hà N @ội – School2019 of Medicine and Pharmacy, VNU
  3. LỜI CẢM ƠN Em là Phạm Thị Hà - sinh viên khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội. Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới TS. Vũ Đức Lợi - Chủ nhiệm Bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền, khoa Y Dược - Đại học Quốc Gia Hà Nội đã định hướng, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành khóa luận. Không chỉ vậy, Thầy còn truyền cho em những kiến thức, kĩ năng rất bổ ích là hành trang giúp em thêm tự tin bước sang ngưỡng cửa mới của cuộc sống. Em cũng xin cảm ơn ThS. Bùi Thị Xuân, giảng viên khoa Y Dược - Đại học Quốc Gia Hà Nội đã trực tiếp hướng dẫn tận tình, chu đáo, truyền đạt những kinh nghiệm thiết thực, giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận. Để hoàn thành được khóa luận này, em xin cảm ơn đề tài khoa học công nghệ cấp Đại học Quốc Gia Hà Nội mã số: QG.18.20 đã hỗ trợ kinh phí và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em và các bạn trong nhóm. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban chủ nhiệm khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, các cán bộ, giảng viên khoa Y Dược và thầy cô giáo tại các cơ sở khoa Y Dược liên kết đạo tạo đã tạo điều kiện cho em trong suốt thời gian 5 năm học tập và nghiên cứu chuyên ngành Dược học. Trong thời gian làm khóa luận và học tập tại Bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền, dưới sự hướng dẫn, chỉ bảo của các thầy cô, em cũng luôn cố gắng nỗ lực học tập và nghiên cứu, tuy nhiên do kiến thức còn hạn hẹp, thời gian nghiên cứu không được nhiều nên khóa luận của em không tránh khỏi thiếu sót. Em rất mong nhận được những lời nhận xét, góp ý quý báu của các thầy cô để khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ của em được hoàn thiện hơn. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  4. Cuối cùng, em xin kính chúc các thầy cô luôn mạnh khỏe, hạnh phúc và thành công hơn nữa trong cuộc sống của mình. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 28 tháng 04 năm 2019 Sinh viên Phạm Thị Hà @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  5. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, VIẾT TẮT STT Ký hiệu, viết Tên đầy đủ tắt 1 ORAC Khả năng hấp thụ gốc tự do (Oxygen radical absorbance capacity) 2 IC50 Nồng độ ức chế 50% (Half maximal inhibitory concentration) 3 CC Sắc ký cột 4 TLC Sắc ký lớp mỏng 5 pTLC Sắc ký lớp mỏng điều chế 6 S Singlet 7 Dd Doublet of doublet 8 EtOH Ethanol 9 ESI-MS Phổ khối ion hóa phun mù điện tử 10 DEPT Detortionless Enhancement by Polarization Transfer 11 m/z Khối lượng/điện tích 12 NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  6. DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình vẽ Tên hình vẽ Trang Hình 1.1 Hình ảnh cây Khôi đốm 5 Hình 1.2 Hình ảnh cơ quan sinh sản của cây Khôi đốm 6 Hình 1.3 Hình vẽ mô tả vi phẫu thân 7 Hình 1.4 Đặc điểm vi phẫu thân 8 Hình 1.5 Hình vẽ mô tả vi phẫu lá 9 Hình 1.6 Đặc điểm vi phẫu lá 9 Hình 1.7 Hình vẽ mô tả bột lá 10 Hình 1.8 Đặc điểm vi phẫu bột lá 11 Hình 1.9 Hình vẽ mô tả bột thân 12 Hình 1.10 Đặc điểm vi phẫu bột thân 12 Hình 1.11 Các hợp chất phân lập được từ cây Khôi đốm 14 Hình 1.12 Các hợp chất phân lập được từ lá cây Khôi đốm 15 Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất lá cây Khôi đốm phân đoạn n-hexan 25 Hình 3.2 Cấu trúc của hợp chất NS1 29 Hình 3.3 Cấu trúc của hợp chất NS2 32 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  7. MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về chi Sanchezia 3 1.1.1. Vị trí phân loại chi Sanchezia 3 1.1.2. Số lượng loài và sự phân bố các loài thuộc chi Sanchezia 3 1.1.2.1. Trên thế giới 3 1.1.2.2. Ở Việt Nam 4 1.1.3. Đặc điểm thực vật chi Sanchezia 4 1.2. Tổng quan về cây Khôi đốm 4 1.2.1. Phân bố 5 1.2.2. Đặc điểm thực vật cây Khôi đốm 5 1.2.3. Đặc điểm vi phẫu cây Khôi đốm 7 1.2.4. Đặc điểm vi học bột dược liệu 9 1.2.5. Thành phần hóa học của cây Khôi đốm 13 1.2.6. Một số tác dụng dược lý đã được nghiên cứu của cây Khôi đốm . 15 1.2.7. Công dụng theo Y học cổ truyền của cây Khôi đốm 18 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1.Đối tượng nghiên cứu 19 2.1.1. Nguyên liệu 19 2.1.2. Hóa chất, trang thiết bị 19 2.2. Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1. Phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất 20 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất 21 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 3.1. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất 24 3.2. Bàn luận 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ @ School of Medicine and Pharmacy, 36 VNU
  8. TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  9. MỞ ĐẦU Với điều kiện thiên nhiên ưu đãi, Việt Nam có một hệ sinh thái phong phú và đa dạng, một tiềm năng lớn về tài nguyên cây dược liệu nói riêng và tài nguyên dược liệu (thực vật, động vật, khoáng vật) nói chung. Theo Danh lục cây thuốc Việt Nam thì trong số hơn 12.000 loài thực vật Việt Nam thì có gần 5.000 loài có công dụng làm thuốc, điều đó thể hiện sự đa dạng về chủng loại cây dược liệu với sự phân bố rộng khắp cả nước. Trải qua hàng ngàn năm lịch sử, cha ông ta cũng đã phát hiện, tích lũy được kho tri thức khổng lồ về dược liệu và y học cổ truyền với rất nhiều bài thuốc dân gian. Ngày nay, các nhà khoa học dược, các tập đoàn dược phẩm lớn hiện đang chú trọng vào sàng lọc từ thiên nhiên để tìm ra các hoạt chất sinh học mới có dược tính mạnh hơn, ít độc hơn và với chi phí nghiên cứu phát triển thấp hơn so với tổng hợp hóa học. Đẩy mạnh khai thác tài nguyên thiên nhiên dựa trên các bài thuốc dân gian để phát triển thành những sản phẩm và thuốc có tác dụng chăm sóc sức khỏe. Nhiều tài liệu nghiên cứu nước ngoài cho thấy cây Khôi đốm có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, diệt côn trùng, ngoài ra còn có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm rất hiệu quả [20, 21]. Từ lâu người dân vùng dân tộc thiểu số đã dùng cây Khôi đốm chữa bệnh viêm dạ dày rất phổ biến. Cây Khôi đốm thuốc chi Sanchezia đã được Nguyễn Tiến Bân liệt kê trong “Danh mục các loài thực vật Việt Nam”, phân bố chủ yếu ở miền núi Tây Giang - Quảng Nam, Hòa Vang - Đà Nẵng, miền núi Chiêm Hóa, Na Hang - Tuyên Quang, tỉnh Nam Định [1]. Chi này chủ yếu phân bố ở phía Tây Nam Mỹ, một số ít loài phân bố về vùng phía Bắc và Đông Bắc của Bắc Mỹ, Trung Mỹ, vùng biển Caribbean và một số đảo ở Thái Bình Dương [9]. Ở Việt Nam hiện nay đã có một số nghiên cứu về đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây Khôi đ ố@m như School năm 2016, of TSMedicine Vũ Đức Lợ andi cùng Pharmacy, VNU 1
  10. nhóm nghiên cứu đã công bố nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng chống viêm của dịch chiết từ lá cây Xăng sê hay còn gọi là cây Khôi đốm, ngoài ra còn có một số đề tài nghiên cứu báo cáo khóa luận tốt nghiệp dược sĩ của dược sĩ Nguyễn Thị Mai vào năm 2017 và Vũ Thị Mây vào năm 2018. Tuy nhiên, các đề tài nghiên cứu vẫn còn chưa nhiều, để góp phần cung cấp những cơ sở tiền đề cho việc ứng dụng nguyên liệu cây Khôi đốm trong chăm sóc sức khỏe, chúng tôi đã lựa chọn và tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chiết xuất phân lập một số hợp chất từ phân đoạn n – hexan của lá cây Khôi đốm (Sanchezia nobilis Hook.f)” với những mục tiêu sau: 1. Chiết xuất phân lập được một số hợp chất từ phân đoạn n – hexan của lá cây Khôi đốm. 2. Xác định cấu trúc các hợp chất đã phân lập. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 2
  11. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về chi Sanchezia 1.1.1. Vị trí phân loại chi Sanchezia Theo “Hệ thống phân loại về ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)” [1, 26] của tác giả A.Takhtajan”, vị trí phân loại chi Sanchezia là: Giới Thực vật: Plantae Ngành Ngọc lan: Magnolipphyta Lớp Cỏ tháp bút: Equisetopsida C. Agardh Phân lớp Mộc lan: Magnoliidae Novák ex Takht Bộ Hoa môi: Lamiales Họ Ô rô: Acanthaceae Chi: Sanchezia 1.1.2. Số lượng loài và sự phân bố các loài thuộc chi Sanchezia 1.1.2.1. Trên thế giới Chi Sanchezia được đặt theo tên của giáo sư thực vật học ở Cadiz là Jose Sanchez vào thế kỷ XIX tại Cadiz, Tây Ban Nha [15, 19]. Lần đầu tiên vào năm 1794, chi này được Ruiz và Pavon mô tả có 2 loài. Đến năm 1964, Leonard và Smith đã công bố có 59 loài, trong đó có 26 loài được mô tả lần đầu tiên, đồng thời công bố khóa phân loại cho 59 loài này. Tuy nhiên, vào năm 2015, Tripp và Koenemann đã thống kê lại lịch sử phát triển và lập danh mục 55 loài thuộc chi Sanchezia [28]. Các nhà khoa học thực hiện dự án The Plant list đã xác định có 75 tên loài thuộc chi, trong đó có 54 tên khoa học được chấp nhận (72,0%), 12 tên @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 3
  12. chưa xác định được chính xác thông tin (16,0%) và 9 tên được xác định là tên đồng nghĩa (12,0%) [37]. Chi Sanchezia thường được trồng làm cây cảnh, phân bố ở phía Tây Nam Mỹ, một số ít loài phân bố ở vùng phía Bắc và Đông Bắc của Bắc Mỹ, Trung Mỹ, vùng biển Caribbean và nhiều hòn đảo ở khu vực Ấn Độ - Thái Bình Dương như quần đảo Cook, Hawaii, Fiji và New Caledonia [9, 12, 30]. 1.1.2.2. Ở Việt Nam Chi Sanchezia ở Việt Nam chỉ có 1 loài, được Nguyễn Tiến Bân liệt kê trong “Danh mục các loài thực vật Việt Nam” là cây Khôi đốm (Sanchezia nobilis Hook. F), phân bố chủ yếu ở miền núi Tây Giang - Quảng Nam, Hòa Vang - Đà Nẵng, miền núi Chiêm Hóa, Na Hang - Tuyên Quang, tỉnh Nam Định [1]. 1.1.3. Đặc điểm thực vật chi Sanchezia Chi Sanchezia là loại cây bụi hay cây cỏ xanh nửa mùa. Sống trên cạn, rừng mưa nguyên sinh, rừng nhiệt đới thứ sinh [3]. Hoa mọc đơn độc hoặc hợp lại thành chùm, thường lớn, có màu vàng, cam, đỏ hoặc tím, mọc ở ngọn. Lá bắc có màu đỏ dài khoảng 5cm, lá đài màu xanh đậm, có vân trắng kem hoặc vàng, hình mác, dài khoảng 26cm. Đài 5 thùy, tràng 5, dính nhau thành hình ống, nhị 4, 2 nhị thò ra, bao phấn 2 ô. Quả nang, 6 - 8 hạt, hạt hình cầu [17]. Thân cây trơn màu xanh, rễ cây không có lông [3]. 1.2. Tổng quan về cây Khôi đốm Tên khoa học: Sanchezia speciosa Leonard Sanchezia nobilis Hook. F. Tên Việt Nam: Khôi đốm, Xăng sê, Ngũ sắc [1] @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 4
  13. 1.2.1. Phân bố Cây phân bố chủ yếu ở miền núi Tây Giang - Quảng Nam, Hòa Vang - Đà Nẵng, miền núi Chiêm Hóa, Na Hang - Tuyên Quang, Nam Định, đặc biệt nơi có khí hậu nhiệt đới, mát mẻ, trong lành [1]. Cây Khôi đốm có nguồn gốc từ Peru, Ecuador [2]. 1.2.2. Đặc điểm thực vật cây Khôi đốm Khôi đốm là loại cây bụi thường xanh lâu năm được Phạm Hoàng Hổ mô tả trong “Cây cỏ Việt Nam”. Cây thường cao 0,5 - 1,5m, có khi cao lên khoảng 3m, thân màu xanh lá cây, gân chính của lá màu lục, đỏ hoặc vàng, gân bên màu trắng, không có lông [3]. Lá đơn, mọc đối hình chữ thập, dài 10 - 25cm, rộng 3 - 7cm, nhẵn, mép lá hơi lượn sóng, mặt trên có màu xanh đậm, mặt dưới xanh nhạt, hệ gân lông chim, có 9 - 12 đôi gân bên, cuống lá ngắn [10, 23]. Hình 1.1: Hình ảnh cây Khôi đốm Hoa của cây Khôi đốm mọc liên tục quanh năm, mọc thành cụm hoa bông ở ngọn, có cuống ngắn, thường gồm 3 bông nhỏ trở lên; có lá bắc màu lục hay đỏ, hình trứng, đỉnh tù, nhẵn, @ ôm Schoollấy 1 cụm hoa,of Medicine cao 4 - 5cm, taiand đều; Pharmacy, VNU 5
  14. tiểu nhị thò dài, thụ 2, nép 2, nang 8 hột [3, 10, 24]. Hoa lưỡng tính, màu xanh lục mờ, mùi hoa nhạt đặc trưng [10]. Hình 1.2: Hình ảnh cơ quan sinh sản của cây Khôi đốm[4] Chú thích: 1. Cụm hoa; 2. Hoa nguyên vẹn; 3. Các bộ phận của hoa; 4. Đài; 5. Tràng; 6,7. Bộ nhị; 8. Bầu cắt ngang; 9. Bầu cắt dọc. Đài nhiều, hình vảy, dài 1,5 - 1,8cm , rộng 3 - 5mm, tròn ở đỉnh [23]. Tràng cảu cánh hoa hợp nhất, hình ống tròn, cao 4 - 5,5cm, rộng 7 - 8cm ở phía trên, thu hẹp dần xuống dưới đến 3mm, màu vàng, có sáp; các thùy dài 3 - 4mm, tròn, có khía; chỉ nhị dài, nhị 4 trong đó có 2 nhị phát triển dài 4 - 4,5cm, có lông và 2 nhị tiêu giảm [3, 24]. Quả nang có 8 hạt, có nơ, hình trụ [3]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 6
  15. 1.2.3. Đặc điểm vi phẫu cây Khôi đốm ❖ Thân Thân già vi phẫu hình vuông. Cấu tạo từ ngoài vào trong gồm: ngoài cùng là lớp biểu bì cấu tạo bởi một hàng tế bào, có lông che chở đơn bào; thứ hai là mô dày gồm 6 - 8 hàng tế bào xếp thành hình tròn khép kín; kế đến là lớp mô mềm gồm 5 - 7 lớp tế bào, bên trong có chứa tinh thể calcioxalat hình kim và các hạt tinh bột đơn; libe gần như hình tròn khép kín, libe ở ngoài, gỗ ở trong, thỉnh thoảng bị ngăn cách bởi một số tế bào mô mềm; mô mềm ruột cấu tạo bởi nhiều lớp tế bào, các tế bào thành mỏng, to, hình đa giác xếp lộn với nhau; bên ngoài cùng có thêm một lớp bần. Thân non vi phẫu hình tròn. Cấu tạo tương tự thân già, nhưng không có lớp bần bên ngoài cùng [7, 10]. Hình 1.3: Hình vẽ mô tả vi phẫu thân [10] @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 7
  16. Hình 1.4: Đặc điểm vi phẫu thân [4] ❖ Lá Hình ảnh vi phẫu gân lá có 2 mặt trên và dưới lồi lên. Cấu tạo của biểu bì trên và dưới là một hàng tế bào đa giác xếp đều đặn nhau; mô dày trên và dưới với nhiều lớp tế bào thành dày lên ở các góc. Mô mềm cấu tạo bởi các tế bào thành mỏng hình gần như tròn có chứa các tinh thể canxi oxalat và các hạt tinh bột, rải rác có các bó mạch phụ. Libe gỗ xếp thành hình vòng cung gồm libe ở phía ngoài và gỗ ở phía trong. Một số tế bào biểu bì thành lông che chở, lông tiết [10]. Hình ảnh vi phẫu cuống lá giống như hình chén, đặc điểm tương tự như gân lá, tuy nhiên có thêm lớp mô dày sát lớp biểu bì [10]. Vi phẫu phiến lá gồm biểu bì trên và biểu bì dưới cấu tạo gồm một hàng tế bào đa giác sắp xếp đều đặn nhau.@ School Mô giậu ngayof Medicine dưới biểu bì trên and cấ uPharmacy, VNU 8
  17. tạo gồm hai hàng tế bào hình chữ nhật sắp xếp đều đặn nhau. Mô khuyết cấu tạo gồm các tế bào hình gần tròn xếp lộn xộn [10]. Hình 1.5: Hình vẽ mô tả vi phẫu lá [10] Hình 1.6: Đặc điểm vi phẫu lá [4] 1.2.4. Đặc điểm vi học bột dược liệu ❖ Bột lá @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 9
  18. Bột lá có màu xanh nhạt, vị hơi đắng, hình ảnh soi dưới kính hiển vi thấy có chứa nhiều mảnh khác nhau như: mảnh biểu bì, mảnh biểu bì mang lông tiết, mảnh biểu bì mang lỗ khí, mảnh mô khuyết, mảnh mô mềm, mảnh mô giậu, mảnh mô dày, mảnh mạch xoắn và mạch điểm. Bột lá có chứa tinh thể calci oxalat hình kim, có chứa hạt tinh bột và có lông tiết, lông che chở [7, 10]. Hình 1.7: Hình vẽ mô tả bột lá [10] @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 10
  19. Hình 1.8: Đặc điểm vi phẫu bột lá [4] Chú thích:1. Lỗ khí; 2. Mảnh mô mềm; 3. Mảnh mô dày; 4. Mảnh mạch xoắn; 5,6. Mảnh mạch điểm; 7. Tinh thể calci oxalat hình kim. ❖ Bột thân Bột thân có màu xanh lá hơi vàng, vị đắng. Hình ảnh dưới kính hiển vi cho thấy: mảnh biểu bì mang lông che chở, có lỗ khí, mảnh bần màu nâu, mảnh mạch xoắn và mạch điểm, tinh thể calci oxalat hình kim, sợi, có chứa hạt tinh bột và có lông che chở [7,10]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 11
  20. Hình 1.9: Hình vẽ mô tả bột thân [10] Hình 1.10: Đặc điểm vi phẫu bột thân [4] Chú thích: 1. Mảnh mô mềm; 2. Mảnh mô mềm chứa hạt tinh bột; @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 12
  21. 3. Mô dày; 4. Mạch xoắn; 5,6. Mạch điểm; 7. Tinh thể calci oxalat hình kim; 8. Sợi; 9. Hạt tinh bột; 10. Lông che chở. 1.2.5. Thành phần hóa học của cây Khôi đốm Năm 2013, Ahmed E. Abd Ellah và các cộng sự của ông đã phân lập được 5 chất trong đó có 1 hợp chất matsutake alcohol và 4 hợp chất alcohol glycosid từ dịch chiết methanol của phần trên mặt đất của cây Khôi đốm: - 1-Octen-3-ol (1) - 3-O-β-glucopyranosyl-1-octen-3-ol (2) - 3-O-β-glucopyranosyl-(1-6)-β-glucopyranosyl-1-octen-3-ol (3) - 3-O-β-arabinopyranosyl-(1-6)-β-glucopyranosyl-1-octen-3-ol (4) - 3-O-β-arabinopyranosyl-(1-6)-β-glucopyranosyl-(1-6)-β- glucopyranosyl-1-octen-3-ol (5) Ahmed E và các cộng sự cũng đã phân lập được 6 hợp chất từ dịch chiết methanol của lá và rễ cây Khôi đốm: - 9-O-β -glucopyranosyl trans-cinnamyl alcohol (6) - 9-O-β-xylopyranosyl-(1→6)-O-β-glucopyranosyl-(1→6)-O-β- glucopyranosyltrans-cinnamyl alcohol (7) - Syringin (8) - 4-O-β -glucopyranosyl dehydrodiconiferyl alcohol (9) - Hai hợp chất benzyl alcohol glycosid: 7-O-β -glucopyranosyl benzyl alcohol (10) và7-O-β-apiofuranosyl-(1→6)-O-β -glucopyranosyl benzyl alcohol (11) Nhóm nghiên cứu phân lập được 3 hợp chất flavonoid từ dịch chiết methanol lấy từ hoa của cây Khôi đốm: - apigenin-7-O-β–glucopyranosid (12) - apigenin-7-Ogentiobiosid (13) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 13
  22. - apigenin-7-O- β–glucuronopyranosid (14) [8] Hình 1.11: Các hợp chất phân lập được từ cây Khôi đốm Năm 2015, theo nghiên cứu định tính của Seline Omondi và J. C. Omondi, lá cây Khôi đốm có chứa các nhóm chất antharaquinon và saponin, không chứa các hợp chất thuộc nhóm terpenoid, steroid và flavonoid [18]. Cũng vào năm đó, nhóm nghiên cứu của Md. Abu Shuaib Rafshanjani cho thấy lá cây Khôi đốm có chứa các hợp chất thuộc nhóm alcaloid, glycosid, flavonoid, carbohydrat, steroid, phenolic, saponin và tannin. Các chất trên được tìm thấy tất cả trong phân đoạn ethyl acetat chiết xuất từ lá cây, riêng đối với flavonoid và các hợp chất phenolic không được tìm thấy trong phân đoạn n-hexan [19]. Năm 2016, Tiến sĩ Vũ Đức Lợi và nhóm nghiên cứu đã tách chiết được 4 hợp chất từ lá cây Khôi đốm [17]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 14
  23. - Sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (daucosterol) (1) - 3-Metyl-1H-benz [f] indolo-4,9-dion (2) - Quercetin 3-O-α-L-rhamnopyranosid (quercitrin) (3) - Quercetin 3-O-β-D-galactopyranosid (hyperosid) (4) Hình 1.12: Các hợp chất phân lập được từ lá cây Khôi đốm Ngoài ra, trong đề tài nghiên của thạc sĩ Bùi Thị Xuân năm 2018 nhóm nghiên cứu đã phân lập được 3 hợp chất: 9-methoxycanthin-6-on, 9- hydroxyheterogorgiolid , O-methyl furodysinin lacton [5]. 1.2.6. Một số tác dụng dược lý đã được nghiên cứu của cây Khôi đốm ❖ Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, diệt côn trùng Năm 2014, Abu Shuaib đã nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm và diệt côn trùng của cây Khôi đốm bằng phương pháp khuếch tán đĩa, với phép thử hoạt tính trên bề mặt. Ông đã tiến hành trên 15 loài vi khuẩn @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 15
  24. Gram dương và Gram âm, 6 loài nấm và côn trùng Tribolium castaneum (Herbst) và đưa ra kết quả trong 3 phân đoạn thu được từ dịch chiết ethanol của cây Khôi đốm, các chất chiết được trong dung môi chloroform cho tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm tốt hơn hai phân đoạn ether dầu hỏa và ethyl acetat [21]. Trong 3 phân đoạn: phân đoạn chloroform có tác dụng kháng khuẩn mạnh trên các chủng Escherichia coli, Salmonella paratyphi, Bacillus megaterium, Shigella flexneri, Pseudomonas aeruginosa và Shigella shiga, phân đoạn ethyl acetate có tác dụng tốt trên chủng vi khuẩn Shigella sonnei và Shigella dysenteriae, phân đoạn bằng dung môi ether dầu hỏa có hiệu lực thấp nhất. Giá trị trị MIC của các phân đoạn chloroform, ethyl acetat, ether dầu hỏa trên 15 chủng vi khuẩn này lần lượt nằm trong khoảng từ 16-64 μg/ml, 32-128 μg/ml và 64-128 μg/ml [21]. Nghiên cứu cũng cho thấy tỷ lệ diệt côn trùng Tribolium Castaleum (Herbst) với liều lượng 50mg/ml trong 48h của phân đoạn chloroform là 60%, phân đoạn ethyl acetat là 40% và của phân đoạn ether dầu hỏa là 20% [21]. Các nhà nghiên cứu đã đánh giá tác dụng kháng nấm của dịch chiết trên 6 chủng nấm. Kết quả nghiên cứu cho thấy phân đoạn chloroform có tác dụng tốt trên các chủng Candida albicans, Rizopus oryzae, Aspergillus niger và Trycophyton rubrum. Phân đoạn ethyl acetat có tác dụng ức chế vừa phải trên chủng Rizopus oryzae và Trycophytonrubrum, phân đoạn ether dầu hỏa hầu như không có tác dụng [21]. Vùng ức chế đối với các chủng nấm của các phân đoạn nằm trong khoảng 8 ± 0,01 cho tới 18 ± 0,41 mm với nồng độ 50µg/đĩa. ❖ Tác dụng chống oxy hóa, chống viêm Theo nghiên cứu in vitro của nhóm nghiên cứu Paydar M, dịch chiết methanol có chỉ số ORAC là 55,77 ± @ 1,73µM School TE/100 of µg.mL Medicine-1, trong khi and dịch Pharmacy, VNU 16
  25. chiết quercetin có chỉ số ORAC là 63,07 ± 0,9373 µM TE/100 µg.mL-1, cho thấy lá cây Khôi đốm có tác dụng chống oxy hóa mạnh [20]. Năm 2016, theo nghiên cứu chiết xuất ethanol của lá cây Khôi đốm của tiến sĩ Vũ Đức Lợi và các cộng sự đã cô lập được 4 hợp chất: - Quercetin 3-O-α-L-rhamnopyranosid (quercitrin) (1) - Quercetin 3-O-β-D-galactopyranosid (hyperosid) (2) - Sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (daucosterol) (3) - 3-Metyl-1H-benz [f] indolo-4,9-dion (4) Tác dụng chống oxy hóa theo thứ tự giảm dần từ hợp chất 2 > hợp chất 1 > hợp chất 4 > hợp chất 3. Hợp chất 2 có giá trị IC50 là 20.83 ± 1,29 mg/ml. Tác dụng chống viêm theo thứ tự giảm dần tử hợp chất 4 > hợp chất 3 > hợp chất 2 > hợp chất 1. Hợp chất 4 có giá trị IC50 là 193.70 ± 5.24 μg/mL cho thấy sự ức chế mạnh nhất [27]. Với liều 1,5 kbw dịch chiết từ lá Khôi đốm đã cho tác dụng giảm phù bắp chân do Carrageenan gây ra đáng kể [20]. ❖ Tác dụng gây độc tế bào ung thư Năm 2013, Paydar và nhóm nghiên cứu của mình đã đánh giá tính gây độc tế bào ung thư in vitro của dịch chiết methanol từ lá cây Khôi đốm trên các tế bào ung thư vú ở người, ung thư da SK-MEL-5 và tế bào màng trong tĩnh mạch ở người như tế bào nội mô mạch rốn HUVRC bằng phương pháp MTT. Dịch chiết methanol cho thấy tác dụng ức chế sự tăng trưởng dòng tế bào MCF-7 là tốt nhất, trên dòng tế bào SK-MEL-5 cho tác dụng vừa phải và tác dụng yếu trên dòng tế bào HUVEC. IC50 của 3 dòng tế bào trên lần lượt là 23,20 ±1,18µg.mL-1, 62,56± 5,32µg.mL-1, 91,15± 2,8µg.mL-1. Trong khi doxorubicin có tác dụng ức chế mạnh trên cả 3 dòng tế bào với IC50 lần lượt là 1,93 ±0,12; 7,95± 0,92; 8,29± 1,37µg.mL-1. Như vậy, dịch chiết methanol @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 17
  26. của lá cây Khôi đốm có tác dụng gây độc tế bào chọn lọc hơn so với doxorubicin [20]. Năm 2015, Md. Abu Shuaib Rafshanjani và các cộng sự cũng tiến hành nghiên cứu về tiềm năng gây độc tế bào ung thư của lá cây Sanchezia speciosa Hook. F tại Bangladesh cũng đưa ra kết luận dịch chiết của lá cây phân đoạn n – hexan và ethyl acetat cho tác dụng gây độc tế bào đáng kể so với nồng độ gây chết trung bình (LC50) (19,95/10 g/ml so với 12,88 g/ml). Nghiên cứu cho thấy lá cây này có tiềm năng trong việc kiểm soát các tế bào ung thư [19]. 1.2.7. Công dụng theo Y học cổ truyền của cây Khôi đốm Từ lâu, người dân vùng dân tộc thiểu số đã dùng cây Khôi đốm chữa bệnh viêm dạ dày rất phổ biến. Đây là cây mọc hoang ở nhiều vùng núi và được trồng làm cảnh tại các nhà vườn nên dễ dàng tìm thấy và sử dụng. Theo dân gian, cách dùng lá cây Khôi đốm chữa đau dạ dày rất đơn giản, có thể dùng lá tươi hoặc lá khô đều được. Ngoài việc ăn sống còn có thể sắc lá khô thay nước chè uống hằng ngày. Người dân còn truyền nhau về tác dụng giải rượu rất tốt của lá cây Khôi đốm. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 18
  27. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Nguyên liệu Lá cây Khôi đốm được lựa chọn và thu hái tại Thị trấn Cổ Lễ, huyện Trực Ninh, tỉnh Nam Định ngày 15/01/2018. Sau khi thu hái tiến hành xử lý mẫu, phơi sấy, bảo quản trong túi nilon kín và được đem đi giám định tên khoa học tại Viện Dược Liệu bởi ThS. Nguyễn Quỳnh Nga kết luận là: Sanchezia nobilis Hook.f. họ Acanthaceae (họ Ô rô) với tên Việt Nam là cây Khôi đốm hoặc Xăng xê. Mẫu lá cây được lưu tại: Phòng tiêu bản, Khoa Tài Nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu (số hiệu tiêu bản: DL-150118). 2.1.2. Hóa chất, trang thiết bị ❖ Hóa chất - Các dung môi dùng để chiết xuất và phân lập: EtOH 80%, n-hexan, ethyl acetat (EtOAc), methanol (MeOH), aceton (Ac), đạt tiêu chuẩn tinh khiết. - Các hóa chất dùng để định tính: FeCl3, NaOH, H2SO4, HCl, phenolphtalein, fehling, - Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột là silicagel pha thường cỡ hạt 0,063- 0,200 mm (Merck), (0,040 - 0,063 mm, Merck). Bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck) (silicagel, 0,25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm) ❖ Trang thiết bị - Sắc ký cột: sử dụng silicagel cỡ hạt 0,063- 0,200 mm (Merck) và cỡ hạt 0,040- 0,063 mm (Merck) với các loại cột sắc ký có kích cỡ khác nhau. - Nhiệt độ nóng chảy: đo trên máy SMP10 BioCote, Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 19
  28. - Góc quay cực riêng: đo trên máy PLR-4, MRC scientific instruments, Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR: được ghi trên máy Bruker Avance 500MHz tại Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội. - Phổ khối ESI-MS: đo trên máy AGILENT 1260 Series LC-MS ion Trap (Agilent Technologies, Hoa Kỳ). - Dụng cụ thí nghiệm: Pipet, ống nghiệm, bình nón, bình chiết, cốc có mỏ, bình gạn, - Các thiết bị khác: tủ sấy, tủ hút, cân phân tích, 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất Mẫu lá cây Khôi đốm (2,5 kg) sau khi đã rửa sạch, phơi khô, thái nhỏ được ngâm chiết bằng dung môi ethanol 80% (3 lần, mỗi lần 8L), sử dụng thiết bị chiết siêu âm ở 40oC trong vòng 3 giờ. Lọc các dịch chiết ethanol thu được qua giấy lọc, gộp dịch lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao chiết tổng ethanol. Phân tán cao chiết ethanol này trong nước cất và chiết phân bố bằng n- hexan (3 lần). Cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn ký hiệu là H. Tiến hành xử lý và phân lập hợp chất từ phân đoạn n-hexan chủ yếu sử dụng phương pháp sắc ký cột. Các phân đoạn trong quá trình phân lập được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng. Sắc ký cột (CC): thực hiện với chất hấp phụ là silicagel pha thường và pha đảo, lựa chọn hệ dung môi có độ phân cực tăng dần. Silicagel pha thường cỡ hạt là 0,063 - 0,200mm (Merck) và cỡ hạt 0,040 - 0,063mm (Merck) với các loại cột sắc ký có kích cỡ khác nhau. Sắc ký lớp mỏng (TLC): thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60G F254 (Merck), độ dày 0,2@ mmSchool và RP -of18F 254sMedicine, độ dày 0,25 and mm Pharmacy, VNU 20
  29. (Merck). Sau khi triển khai sắc ký, bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm và 365nm, sau đó được phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol và đốt nóng trên bếp điện từ. 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập qua 2 bước chính: - Bước 1: Thực hiện đo nhiệt độ nóng chảy, phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) thiết lập bộ dữ liệu của chất phân lập được. - Bước 2: So sánh các dữ liệu các chất thiết lập đó với các dữ liệu các chất đã công bố. ❖ Phổ khối lượng (MS) Phương pháp phổ khối lượng (MS) là một kỹ thuật phân tích hóa học giúp xác định hàm lượng và loại chất hóa học có trong một mẫu bằng cách đo tỷ lệ khối lượng trên điện tích và số lượng của các ion pha khí. Phổ khối lượng là kỹ thuật phân tích đo phổ về khối lượng của các phân tử tích điện khi chúng di chuyển trong điện trường. Mẫu được ion hóa trở thành các phân tử tích điện khác nhau và được phân tách dựa vào sự sai khác về giá trị m/z trong đó m là khối lượng, z là điện tích. Dữ liệu phổ khối được tự động ghi lại và sử dụng để nhận dạng protein bằng các công cụ tin sinh học. Trong cùng một điều kiện ion hóa, sự phân mảnh tạo thành các ion con từ ion mẹ sẽ tuân theo những định luật nhất định. Các chất có cấu trúc tương tự nhau sẽ tạo ra những phân mảnh giống nhau dựa vào đó và các phương pháp phổ khác ta có thể xác định được cấu trúc của một chất chưa biết. So sánh phổ khối của một chất chưa biết với phổ khối của một chất đã biết có thể giúp định danh chất chưa biết đó chính xác [6]. ❖ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 21
  30. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR là một phương pháp vật lý hiện đại nghiên cứu cấu tạo của các hợp chất hữu cơ, đặc biệt các phân tử phức tạp như các hợp chất thiên nhiên. Phương pháp phổ NMR nghiên cứu cấu trúc phân tử bằng sự tương tác bức xạ điện tử tần số radio với tập hợp hạt nhân được đặt trong từ trường mạnh. Các hạt nhân này là một phần của nguyên tử và các nguyên tử lại được tập hợp thành phân tử. Đặt một chất có hạt nhân lên sẽ được sắp xếp lại theo hai hướng: một hướng thuận chiều với từ trường và ngược chiều với từ trường, đến khi đạt đến mức độ cân bằng giữa hai trạng thái này với một tỉ lệ xác định của 2 trạng thái. Chiếu lên chất đó một bức xạ điện tử có tần số thích hợp, các spin sẽ hấp thu năng lượng (cộng hưởng) và chuyển lên mức năng lượng cao (sắp xếp ngược chiều với từ trường) nhưng khi ta ngưng chiếu xạ, các spin hạt nhân sẽ giải phóng năng lượng để trở về trạng thái cân bằng. Để thu được phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các chất ta xác định năng lượng mà các hạt nhân cùng một loại nguyên tố trong phân tử hấp thu (hay giải phóng). Xác định năng lượng cộng hưởng này bằng cách xác định tần số cộng hưởng theo từng tần số trong suốt dải tần số cộng hưởng được gọi là cộng hưởng từ hạt nhân quét hoặc ghi nhận đồng thời mọi tần số cộng hưởng rồi sử dụng biến đổi Fourier để tách riêng tần số cộng hưởng của từng hạt nhân. Kỹ thuật xác định bằng cộng hưởng từ hạt nhân biến đổi Fourier transform - NMR, FT - NMR là kỹ thuật sử dụng chủ yếu hiện nay. Dựa vào mục đích và mức độ phức tạp của cấu trúc mà thực hiện đo một hay nhiều loại phổ khác nhau như: xác định phổ của cùng một loại hạt nhân (1H hay 13C) như trong các phổ một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) hoặc các mối tương quan giữa các loại hạt nhân trong các phổ hai chiều (COSY). Phổ proton (1H-NMR hay proton NMR) cho biết môi trường hóa học của proton trong phân tử. Phổ proton của 1 proton hay 1 nhóm proton có cùng môi trường hóa học thể hiện trên @ phổ School có thể là of1 đỉnh Medicine, vậy nên đ ỉnhand này Pharmacy, VNU 22
  31. có thể là đỉnh đơn, đôi, ba thành phần. Diện tích mỗi đỉnh tỷ lệ với số lượng proton của đỉnh từ đó có thể biết số lượng proton của đỉnh đó. Tương tư như phổ proton, phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C- NMR) cung cấp các thông tin về môi trường hóa học của carbon. Dựa vào khoảng chuyển dịch ta có thể biết được cấu trúc của nó: trong khoảng 0 - 60ppm thường là các carbon lai hóa sp3 không liên kết với dị tố, chuyển dịch trong khoảng 45 - 85ppm là carbon liên kết đơn với oxy (alcol, ether), ngoài ra carbon lai hóa sp2 chuyển dịch trong khoảng 100 - 150ppm, nếu có liên kết (đôi) với oxy có thể dịch chuyển tới 240 ppm. Phổ NMR của carbon là những vạch đơn, mỗi vạch ứng với một carbon của phân tử hoặc nhiều hơn 1 carbon nếu có chung môi trường hóa học. Kỹ thuật DEPT (Detortionless Enhancement by Polarization Transfer) giúp xác định số lượng proton trên carbon cho biết số lượng proton liên kết trên mỗi carbon, gián tiếp cho biết số C và H trong phân tử. Các kỹ thuật phổ hai chiều cho các thông tin về tương tác giữa C và H gắn trực tiếp trên nó, giữa các proton của carbon kế cận nhau (phổ COSY) hay phổ tương tác dị nhân (HETCOR) giữa proton và các carbon kế cận (kỹ thuật HSQC) hoặc giữa các carbon xa hơn (long-range HETCOR, thường dùng hiện nay là HMBC) hoặc giữa các proton gần nhau trong không gian (NOESY, ROESY) [5]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 23
  32. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất Ngâm chiết mẫu lá cây Khôi đốm (2,5 kg) sau khi qua xử lý, rửa sạch, phơi khô bằng dung môi ethanol 80% (3 lần, mỗi lần 8L) ở nhiệt độ phòng (ngập trên dược liệu khoảng 2 - 3cm). Đậy nắp bình và ngâm ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Rút thu lấy dịch chiết lần một, bổ sung thêm dung môi ngập dược liệu 2 -3cm thu lấy dịch chiết lần 2 và tương tự như thế thu lấy dịch chiết lần 3. Lọc các dịch chiết ethanol thu được qua giấy lọc, gộp dịch lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được khoảng 150g cao chiết toàn phần. Phân tán 100g cao chiết toàn phần trong nước cất nóng với tỷ lệ thể tích cao đặc trên nước cất nóng là 1:1 thu được dịch chiết nước. Dịch chiết nước đem lắc với dung môi n-hexan khoảng 500ml/1 lần trong 3 lần thu được phân đoạn dịch chiết n-hexan. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm và cô quay cách thủy ở nhiệt độ 60oC thu được cắn của phân đoạn n-hexan (9,2g) ký hiệu là H. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 24
  33. Hình 3.1: Sơ đồ chiết xuất lá cây Khôi đốm phân đoạn n-hexan ❖ Giai đoạn phân lập 1: Áp dụng phương pháp sắc ký cột hấp phụ với chất nhồi cột là silicagel với sắc ký cột cỡ hạt 0,063 - 0,200mm (Merck). Chuẩn bị cột: - Cột sắc ký có đường kính 5 cm, được lắp thẳng đứng trên giá, tráng sạch bằng cồn. - Chất nhồi cột: Silicagel được hoạt hóa ở 100oC/2h trong tủ sấy rồi lấy ra để nguội trong bình hút ẩm. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 25
  34. - Lót 1 lớp bông ở đáy cột, đổ vào cột 40ml dichlomethan, mở khóa cho dung môi chảy từ từ để đẩy hết bọt khí trong lớp bông ra ngoài. Khi lớp dung môi còn khoảng 3cm thì khóa cột. - Nhồi cột: trộn silicagel với một lượng vừa đủ dung môi dichlomethan thành hỗn dịch rồi đổ lên cột, vừa đổ vừa gõ nhẹ quanh thành cột để hạt nén, thoát hết bọt khí và phân bố đều, bằng mặt, rửa thành cột bằng dichlomethan. Chiều dài cột silicagel là 15cm. - Ổn định cột: kiểm tra để đảm bảo cột ở vị trí thẳng đứng, nén cột bằng cách dùng quả bóp cao su gõ nhẹ, đều, đối xứng xung quanh thân cột tới khi không còn bọt khí trong cột, để cột ổn định. Tiến hành sắc ký cột hấp phụ: - Mở khóa cột cho dung môi dichlomethan chảy đến sát bề mặt silicagel, khóa cột lại. - Đưa chất lên cột: 8g cắn n-hexan được phân lập trên cột sắc ký với chất hấp phụ silicagel sử dụng hệ dung môi n-hexan : dichloromethan (15:1; v/v). Điều chỉnh tốc độ rửa giải 1ml/phút. - Hứng dịch rửa giải vào các ống và kiểm tra bằng SKLM, gộp các ống từ 2- 16, thu được phân đoạn H1, gộp các ống từ 17 - 20, thu được phân đoạn H2, tương tự thu được phân đoạn H3. ❖ Giai đoạn phân lập 2: Áp dụng phương pháp sắc ký cột hấp phụ với chất nhồi cột là silicagel với sắc ký cột cỡ hạt 0,063 - 0,200mm (Merck). Tiến hành chuẩn bị cột tương tự như giai đoạn 1 với cột sắc ký có đường kính 3cm. - Tiến hành sắc ký cột cắn phân đoạn H1 với chất hấp phụ silicagel, hệ dung môi n-hexan : dichloromethan (10:1; v/v), kiểm tra các ống hứng @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 26
  35. dịch rửa bằng SKLM, gộp các ống có cùng thành phần và bốc hơi dung môi thu được 4 phân đoạn nhỏ gồm H1.1, H1.2, H1.3, H1.4. - Phân đoạn H1.1 được tiếp tục phân tách trên cột sắc ký silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan : ethylacetat (10:1; v/v) thu được hợp chất ký hiệu NS1 (12 mg). Phân đoạn H1.2 được tiếp tục phân tách trên cột sắc ký silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan : dichlometan (5:1; v/v) thu được hợp chất ký hiệu hợp chất NS2 (18mg). Hợp chất NS1: Sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (daucosterol) 0 Tinh thể có màu trắng đục, tnc = 285 C, Rf = 0,45 (dichloroform : methanol, 8:1). Hợp chất NS1 phản ứng với thuốc thử H2SO4 10%/EtOH cho màu hồng tươi rồi chuyển dần xanh tím. IR (KBr, cm-1) 3430 (OH), 2938 (C- H), 1635 (C = CH), 1077 (C-O-C), 1021 (C-O-C). ESI-MS:m/z 599,1 + [M+Na] . Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT của chất NS1 và chất tham khảo được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1: Dữ liệu phổ DEPT, 1H- và 13C-NMR của NS1 và chất tham khảo [11, 25] NS1 Oa,b NS1 Oa,c δC δC δH (ppm) δH (ppm) Vị trí C DEPT ppm ppm (Mult, J=Hz) (Mult, J=Hz) 1 CH2 36,9 37,3 2 CH2 31,2 29,4 CH 3,54 sextet (7,0) 3 76,9 78,5 3,56(d; 7,0) 4 CH2 39,2 38,4 5 C 140,4 141,3 CH 5,35 (d; 5,0) 5,35 (m) 6 121,2 122,3 @ School5,36(d; 5,0) of Medicine and Pharmacy, VNU 27
  36. 7 CH2 31,5 31,8 8 CH 31,2 30,6 9 CH 49,7 50,7 10 C 36,2 36,8 11 CH2 20,4 20,4 12 CH2 38,4 40,3 13 C 41,9 42,7 14 CH 55,5 56,9 15 CH2 25,4 23,8 16 CH2 29,1 26,7 17 CH 56,3 56,6 18 CH3 11,8 12,4 0,68 (s) 0,67(s) 19 CH3 19,1 19,6 0,94 (s) 20 CH 35,3 34,5 0,92 (d; 6,5) 21 CH3 18,6 19,4 1,00 (d; 6,3) 22 CH2 33,2 32,6 23 CH2 27,6 24,9 24 CH 45,2 46,4 25 CH 28,8 28,9 0,78 (m) 26 CH3 19,7 19,8 0,79-0,87 (m) 0,94 (d; 5,4) 27 CH3 18,9 20,1 0,79-0,87 (m) 0,89 (d; 6,3) 28 CH2 22,4 21,7 0,88 (m); 29 CH3 11,8 12,5 0,79-0,87 (m) 0,87 (m) 1' CH 100,9 103,0 4,14 (d; 8,0) 2' CH 76,6 75,8 3,44 (m) 3' CH 73,5 79,0 3,25 (m) 4' CH 70,1 72,1 3,32 (m) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 28
  37. 5' CH 76,7 78,9 3,48 (m) 6' CH2 61,1 63,3 3,75 (d; 12,0) a ) b ) c ) G) đo trong CDCl3, 100 MHz, 300 MHz, của chất tham khảo daucosterol Hình 3.2: Cấu trúc của hợp chất NS1 Hợp chất NS1 phản ứng với thuốc thử H2SO4 10 %/EtOH cho màu hồng tươi rồi chuyển xanh tím dần chứng tỏ NS1 thuộc nhóm sterol. Phổ IR * -1 xuất hiện đỉnh hấp thụ cực đại ở v max 3430 cm đặc trưng cho nhóm O-H; * - 1 đỉnh ở v max 2938 cm đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết C-H; đỉnh * * -1 ở v max 1635 đặc trưng cho liên kết >C=C<; đỉnh ở v max 1077, 1021 cm đặc trưng cho liên kết C-O-C. Phổ khối ESI-MS của hợp chất cho pic ion phân tử ở m/z: [M+Na]+ =599,1 tương ứng với khối lượng phân tử M = 576. Điều này phù hợp với khối lượng và công thức phân tử của hợp chất NS1. Mặt khác phổ 1H-NMR có các tín hiệu đặc trưng cho hợp phần β-D-Glucozit như: 8 tín hiệu đặc trưng cho 8 nguyên tử hidro, trong đó tín hiệu ở 3,25 ppm (m, 2H) đặc trưng cho H-3', tín hiệu ở 3,44-3,48 (m, 2H) đặc trưng cho H-2', H-5'. Đối với hợp phần β-Sitosterol: gồm 20 tín hiệu đặc trưng cho 20 nguyên tử hidro, trong đó tín hiệu ở 0,68 (s, 3H) đặc trưng cho H-13, tín hiệu ở 0,78-0,88 (m, 13 9H) đặc trưng cho 3 nhóm CH3 tại vị trí 25 và 28. Phổ C-NMR của chất NS1 xuất hiện 35 tín hiệu carbon, v ớ@i 29 School tín hiệu thu ofộc Medicinekhung sterol và and 6 tín Pharmacy, VNU 29
  38. hiệu của một đường glucose, các tín hiệu đặc trưng như tín hiệu tại 140,4 và 121,2ppm thuộc về liên kết đôi tại vị trí C5 và C6, tín hiệu tại 100,9ppm là carbon anomeric của đường. Từ các kết quả nêu trên so sánh với dữ liệu phổ đã công bố [11,25] hợp chất NS1 được xác định là: Sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (hay còn gọi là daucosterol). Hợp chất NS2: Stigmasterol o Tinh thể hình kim màu trắng, tnc = 170-172 C. + Phổ ESI-MS: m/z 395,2 [M+H-H2O] , Công thức phân tử: C29H48O (M = 412). Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT của chất NS2 và chất tham khảo [35] được trình bày ở bảng 3.2. Bảng 3.2: Dữ liệu phổ DEPT, 1H- và 13C-NMR của NS2 và chất tham khảo [35] NS2 Pa,b NS2 Pa,c Vị trí C DEPT δC δC δH (ppm) δH (ppm) ppm ppm (Mult, J=Hz) (Mult, J=Hz) 1 CH2 37,3 31,9 2 CH2 31,6 36,5 3 CH 71,8 71,8 3,52 (m) 3,53 ( m) 4 CH2 42,3 40,5 5 C 140,7 140,7 6 CH 121,7 121,7 5,36 (brd; 3,5) 5,36 (d; 5,2) 7 CH2 31,8 31,6 8 CH 31,8 31,9 9 CH 50,1 50,1 10 C 36,6 37,2 11 CH2 21,1 21,2 12 CH2 39,7 39,7 13 C 42,3 42,3 14 CH 56,8 56,8 15 CH2 24,5 25,5 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 30
  39. 16 CH2 28,9 28,9 17 CH 56,1 55,9 18 CH3 12,1 12,2 0,85 (s) 1,01 (s) 19 CH3 19,4 19,4 1,02 (s) 1,01 (s) 20 CH 40,6 42,2 21 CH3 21,1 19,0 0,92 (d; 6,5) 1,01 (s) 22 CH 138,2 129,3 5,16(dd;8,5;15,0) 5,15(m); 5,02 (m) 23 CH 139,4 138,3 5,03(dd; 8,5; 15,0) 5,15(m); 5,02 (m) 24 CH 51,2 51,2 25 CH2 31,9 31,9 26 CH3 21,2 21,2 0,83 ( t; 8,5) 0,81 (s) 27 CH3 19.1 21.1 0,82 (d; 6,8) 0,81 (s) 28 CH2 25,3 24,4 0,83 (d, 6,8) 0,82 (d, 6,8) 29 CH3 12,2 12,0 0,79 ( d; 9,5) 0,81 (s) a ) b ) c ) G) đo trong CDCl3, 100 MHz, 400 MHz, của chất tham khảo stigmasterol o Hợp chất NS2 dạng tinh thể hình kim màu trắng, tnc = 170-172 C. Phổ + khối lượng ESI-MS cho pic ion phân tử m/z 395,2 [M+H-H2O] tương ứng với công thức phân tử là C29H48O (M = 412). Phổ 1H-NMR cho thấy sự có mặt của hai nhóm thế methyl bậc ba 0,85 (s, H-18); 1,02 (s, H-19), ba nhóm thế methyl bậc hai 0,92 (d, J=6,5 Hz, H- 21); 0,83 (d, J=6,8 Hz; H-28); 0,79 (d, J=9,5 Hz; H-29) và một nhóm thế methyl bậc một 0,83 (t, J=8,5Hz; H-26). Trên phổ cũng xác nhận sự có mặt của nhóm –OH tại C-3 3,52 (m, H-3) và hai cặp nối đôi tại C-5/C-6 5,36 (1H, brd, J=3,5 Hz; H-6); C-22/C-23 5,16 (1H, dd, J=15,0; 8,5 Hz; H-22); 5,03 (1H, dd, J=15,05; 8,5 Hz, H-23). Phổ 13C-NMR của NS2 xuất hiện 29 tín hiệu được xác định là thuộc vào một khung sterol. Căn cứ vào những tín hiệu trên các phổ DEPT ta thấy có 6 nhóm methyl tại 12,1 (C-18); 19,4 (C-19); 21,1 (C-21); 21,2 (C-26); 25,3 (C- 28); 12,2 (C-29); 9 nhóm methylen tại 37,3 (C-1); 31,6 (C-2); 42,3 (C-4); 31,8 (C-7); 21,1 (C-11); 39,7 (C-12); 24,5 (C-15); 28,9 (C-16); 31,9(C-25); 11 nhóm methin tại 71,8 (C-3); 121,7 (C-6); 31,8(C-8); 50,1 (C-9); 56,8 (C- @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 31
  40. 14); 56,1 (C-17); 40,6 (C-20); 138,2 (C-22); 139,3 (C-23); 51,2 (C-24); 19,1(C-27) và 3 carbon bậc bốn tại 140,7 (C-5); 36,6 (C-10); 42,2 (C-13). Kết hợp so sánh phổ NMR giữa NS2 và stigmasterol [35] thấy hoàn toàn phù hợp tại các vị trí tương ứng. Như vậy, NS2 được xác định là stigmasterol. Hình 3.3: Cấu trúc của hợp chất NS2 3.2. Bàn luận Kết quả đề tài đã phân lập được 2 hợp chất từ phân đoạn n-hexan là Sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (daucosterol) và Stigmasterol bằng phương pháp ngâm chiết với dung môi EtOH, sau đó xác định cấu trúc thông qua kết quả đo góc quay cực riêng, nhiệt độ nóng chảy, phổ khối và phổ cộng hưởng từ hạt nhân so với dữ liệu phổ công bố của các chất liên quan. Đây đều là hai chất lần đầu tiên phần lập được từ lá cây Khôi đốm tại Thị trấn Cổ Lễ, huyện Trực Ninh, tỉnh Nam Định. • Sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (daucosterol): Theo nghiên cứu của các nhà khoa học Jiang L., Yang N. vào năm 2014 [31] daucosterol có khả năng thúc đẩy sự tăng sinh của các tế bào gốc thần kinh. Tế bào gốc thần kinh (NSC) là các tế bào có khả năng tự tái tạo nhưng bị hạn chế. Kết quả nghiên cứu cho thấy daucosterol làm tăng đáng kể số lượng tế bào, có tác dụng như yếu tố làm tăng trưởng nguyên bào sợi @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 32
  41. và các yếu tố giúp tăng trưởng biểu bì tạo tiền đề cho việc ứng dụng trong y học lâm sàng và sử dụng daucosterol thay thể yếu tố tăng trưởng hiệu quả với chi phí thấp [31, 33]. Ngay sau đó, vào năm 2015 [32], các nhà khoa học này đã thiết kế nghiên cứu về tác động của daucosterol đối với sự sống sót của các tế bào thần kinh bị thiếu oxy và glucose, mô phỏng tái cấu trúc (OGD/R) cho thấy sau khi điều trị bằng daucosterol đã làm giảm đáng kể sự suy giảm của tế bào thần kinh. Daucosterol tăng mức độ biểu hiện của protein IGF1, làm giảm sự điều hòa của p-AKT và p-GSK-3β, do đó kích hoạt đường dẫn tín hiệu AKT. Tác dụng bảo vệ thần kinh của daucosterol bị ức chế khi có picropodophyllin (PPP), chất ức chế thụ thể của yếu tố tăng trưởng giống như insulin (IGF1R). Daucosterol có thể được phát triển như một loại thuốc điều trị đột quỵ do thiếu máu cục bộ [32]. Ngoài ra, Daucosterol còn được nghiên cứu có tác dụng ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thư [14, 22]. Năm 2015, ChuankeZhao và các đồng nghiệp đã thiết kế nghiên cứu nhằm đánh giá hiệu quả chống ung thư của daucosterol đối với sự tăng sinh của tế bào ung thư trong ống nghiệm. Kết quả cho thấy daucosterol ức chế sự tăng sinh của dòng tế bào ung thư vú MCF-7 và dòng tế bào ung thư dạ dày MGC804, BGC 823và AGS [36]. Đầu năm 2019, Ping Gao và Xiaopeng Huang công bố nghiên cứu về tác dụng ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư tuyến tiền liệt thông qua việc kích hoạt JNK, mở ra những hướng đi mới trong việc nghiên cứu tác dụng của daucosterol [13]. Tháng 4 năm 2019, daucosterol còn được các nhà khoa học Jin Jang, Su-Man Kim, Su-Min Yee đến từ Hàn Quốc đưa ra nghiên cứu chứng minh tác dụng ức chế viêm đại tràng ở chuột [29]. Như vậy, những nghiên cứu trên cho thấy tiềm năng rất lớn trong việc nghiên cứu ứng dụng daucosterol vào lĩnh vực phòng và chữa bệnh, @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 33
  42. nâng cao sức khỏe con người. • Stigmasterol: Dựa theo nghiên cứu của Arslan Khan và các đồng nghiệp năm 2017 [34], stigmasterol có tác dụng hiệp đồng với kháng sinh ampicillin như một mô hình của nhóm kháng sinh beta lactam. Sự kết hợp cho thấy tác dụng kháng sinh tốt hơn đáng kể trên tất cả các vi khuẩn thử nghiệm. Hiệu quả quan sát thấy được cả vi khuẩn gram dương và gram âm thể hiện rõ qua nồng độ ức chế phân đoạn thấp (FIC) trên xét nghiệm Checkerboard. Kết quả cho thấy sự kết hợp của ampicillin và stigmasterol có tác dụng bổ trợ trong điều trị nhiễm trùng do mầm bệnh sản xuất beta lactam [34]. Ngoài ra stimasterol còn có tác dụng bảo vệ, chống lại sự tăng sinh Ang II của dòng tế bào cơ trơn động mạch chủ A7r5. Sự tăng sinh quá mức của các tế bào cơ trơn mạch máu là nguyên nhân quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của một số bệnh tim mạch. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng stigmasterol có hiệu quả trong việc ức chế sự tăng sinh tế bào mạch máu bằng cách sử dụng các tế bào A7r5. Cơ chế chủ yếu là do sự bắt giữ của chu trình tế bào và thúc đẩy quá trình apotosis. Ngoài ra, stigmasterol còn có tác dụng ức chế đã được phát hiện liên quan đến việc giảm sản xuất ROS, tăng cường hoạt động SOD và CAT, giảm sự phong phú của cyclin A, CDK2, PCNA, bax và bcl-2, và tăng mức protein p53. Nghiên cứu cung cấp ý nghĩa cho sự phát triển của các chiến lược điều trị để bảo vệ chống lại các bệnh lý tim mạch nhất định [19]. Với mong muốn góp phần cung cấp những cơ sở tiền đề cho việc ứng dụng nguyên liệu lá cây Khôi đốm trong chăm sóc sức khỏe, đề tài nghiên cứu đã phân lập được 2 hợp chất trên, đây đều là những chất lần đầu tiên phân lập được từ lá cây Khôi đốm tại Thị trấn Cổ Lễ, huyện Trực Ninh, tỉnh Nam Định. Cùng với những đề tài nghiên cứu trước đây về thành phần hóa học của @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 34
  43. lá cây Khôi đốm cho thấy đây là nguồn dược liệu rất hữu ích cần nghiên cứu, khai thác phát triển hơn nữa từ những bài thuốc dân gian mang lại tác dụng chữa bệnh hiệu quả. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 35
  44. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ❖ Kết luận Sau quá trình nghiên cứu thực nghiệm, đề tài khóa luận đã thu được một số kết quả như sau: - Chiết xuất, phân lập: Sử dụng phương pháp chiết ngâm chiết với dung môi EtOH 80% và bằng phương pháp sắc ký cột để chiết xuất phân lập được 2 hợp chất từ lá của cây Khôi đốm thu hái tại tỉnh Nam Định. - Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được: Thông qua kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, phổ tử ngoại - khả kiến, phổ khối, phổ cộng hưởng hạt nhân và so sánh với các dữ liệu công bố của các hợp chất liên quan, 2 hợp chất được xác định là Sitosterol-3-O-β-D- glucopyranosid (daucosterol) (NS1), Stigmasterol (NS2). Đây là lần đầu tiên 2 hợp chất này được phân lập từ lá cây Khôi đốm tại Thị trấn Cổ Lễ, huyện Trực Ninh, tỉnh Nam Định. ❖ Kiến nghị - Tiếp tục triển khai nghiên cứu, phân lập các hợp chất khác để có thể xác định thêm các thành phần trong loài Sanchezia nobilis Hook.f ở Nam Định. - Định lượng các hợp chất đã phân lập được từ phân đoạn n-hexan của lá cây Khôi đốm. - Dựa trên kết quả đã nghiên cứu về thành phần hóa học, cần nghiên cứu đánh giá tác dụng sinh học về tác dụng chống viêm giảm đau, chống loét dạ dày và các tác dụng sinh học khác của dịch chiết loài Sanchezia nobilis Hook.f. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 36
  45. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Nguyễn Tiến Bân (2005), Danh mục các loài thực vật Việt Nam, tập III, Hà Nội, Nhà xuất bản Nông nghiệp, tr.272-273. 2. Phan Văn Chiêu (2011), Đông nam dược nghiệm phương, Nhà xuất bản Thuận Hóa, tr.856. 3. Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất bản Trẻ, quyển 3, tr. 39. 4. Nguyễn Thị Mai (2017), “ Nghiên cứu thành phần hóa học lá cây Xăng sê”, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ Đại học, Khoa Y Dược, ĐHQGHN. 5. Ngô Vân Thu và Trần Hùng (2011), Dược liệu học I, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, pp. 255-256 6. Bùi Thị Xuân, Vũ Đức Lợi, Vũ Thị Mây và cộng sự, (2018), "Một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi đốm (Sanchezia nobilis Hook.f.)", Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội, 34 (1), tr. 42-47. 7. Bộ môn Dược liệu Đại học Dược Hà Nội (2009), Thực tập dược liệu, pp. 54-69. Tài liệu tiếng Anh 8. Abd-Ellah A., Mohamed K., Backheet E., et al. (2014), "Cinnamyl Alcohol, Benzyl Alcohol, and Flavonoid Glycosides from Sanchezia nobilis", Chemistry of Natural Compounds,50(5), pp.715-717. 9. Adams C (1972), "Flowering plants of Jamaica, Mona, Jamaica", University of the West Indies, pp 785-788. 10. Ahmed E. Abd-Ellah, Khaled M. Mohamed, Enaam Y. Backheet and Mahmoud H. Mohamed (2006), ‘‘Macro-and micromorphology of Sanchezia nobilis Hook. cultivated in Egypt: leaf, stem and flower’’, Bull. Pharm. Sci., Assiut University, Vol. 29, Part 2, pp. 300-327. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  46. 11. Arora M, Kalia A. (2013), “Isolation and characterization of stigmasterol and β-sitosterol-D-glycoside from ethanolic extract of the stems of Salvadora pérsica Linn”, Int J Pharm Pharm Sci,5:245-9. 12. Ellah A. E. A., Mohamed K. M., Backheet E. Y. (2013), "Matsutake alcohol glycosides from Sanchezia nobilis", Chemistry of Natural Compounds,48 (6), pp. 930-933. 13. Gao, P., Huang, X., Liao, T., Li, G., Yu, X., You, Y., & Huang, Y. (2019), "Daucosterol induces autophagic-dependent apoptosis in prostate cancer via JNK activation. BioScience Trends". 14. Han, B., Jiang, P., Liu, W., Xu, H., Li, Y., Li, Z. (2018), "Role of Daucosterol Linoleate on Breast Cancer: Studies on Apoptosis and Metastasis", Journal of Agricultural and Food Chemistry,66(24), 6031-6041. 15. Leonard E. C. and Smith L. B. (1964), "Sanchezia and related American Acanthaceae", Rhodora, 66(768), pp. 313-343. 16. Li, C., Liu, Y., Xie, Z., Lu, Q., & Luo, S. (2015), "Stigmasterol protects against Ang II-induced proliferation of the A7r5 aortic smooth muscle cell-line", Food & Function,6(7), 2266-2272. 17. Loi Vu Duc, Tung Bui Thanh, Ha Vu Hoang and Tuyen Nguyen Manh (2016), “Phytochemical and anti-inflammatory effect from the leaf of Sanchezia speciosaLeonard growing in Vietnam”, Journal of Chemical and Pharmaceutical Research,8(7),pp. 309-315. 18. Onyango S. O. J. (2015), "Phytochemical analysis of fifty (50) selected plants found in the University Botanic Garden, Maseno, Kenya for their chemotaxonomic values", Journal of Medicinal Herbs and Ethnomedicine, 1, pp. 130-135. 19. Parvin S., Rafshanjani M. A. S., Kader M. A. (2015), "Preliminary phytochemical screening and cytotoxic potentials from leaves of Sanchezia speciosa Hook. f", International Journal of Advances in Scientific Research, @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  47. 1(3), pp. 145-150. 20. Paydar M., Wong Y. L., Moharam B. A. (2013), "In vitro anti-oxidant and anti-cancer activity of methanolic extract from Sanchezia speciosa leaves", Pakistan Journal of Biological Sciences,16(20), pp. 1212-1215. 21. Rafshanjani M., Parvin S., Kader M. (2014), "In vitro antibacterial, antifungal and insecticidal activities of ethanolic extract and its fractionates of Sanchezia speciosa Hook. f", Int Res J Pharm,5(9), pp. 717-720. 22. Rajavel, T., Mohankumar, R., Archunan, G., Ruckmani, K., & Devi, K. P. (2017), "Beta sitosterol and Daucosterol (phytosterols identified in Grewia tiliaefolia) perturbs cell cycle and induces apoptotic cell death in A549 cells". Scientific Reports. 23. Sciences W. A. o. and Sciences. W. A. o. (1922), "Journal of the Washington Academy of Sciences", Washington Academy of Sciences,86(3), pp 6-3169. 24. Sciences W. A. o. and Sciences. W. A. o. (1926), "Journal of the Washington Academy of Sciences", Washington Academy of Sciences,86(3), pp 9-2258. 25. Seebacher W, Simic N, Weis R, Saf R, Kunert O. (2003), “Complete assignments of 1H and 13C NMR resonances of oleanolic acid, 18α-oleanolic acid, ursolic acid and their 11-oxo derivatives.” Magn Reson Chem,41:636-8. 26. Takhtadzhian A. L. (1997), "Diversity and classification of flowering plants", Columbia University Press, New York, USA, pp. 355-356. 27. Tung Bui Thanh, Loi Vu Duc, Hai Nguyen Thanh , Vung Nguyen Tien (2017), “In vitro antioxidant and anti-inflammatory activities of isolated compounds of ethanol extract from Sanchezia speciosa Leonard’s leaves”, Jbasic clin physiol pharmacol,28(1), pp. 79-84. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  48. 28. Tripp E. A. and Koenemann D. M. (2015), "Nomenclatural Synopsis of Sanchezia (Acanthaceae), Fifty Years Since Last Treated", Novon,24(2), pp. 213-221. 29. Jang, J., Kim, S.-M., Yee, S.-M., Kim, E.-M., Lee, E.-H., Choi, H.-R., Kim, S.-H. (2019), "Daucosterol suppresses dextran sulfate sodium (DSS)- induced colitis in mice", International Immunopharmacology, 72, 124-130. 30. Jean-Yves Meyer, Christophe Lavergne, (2004), "Beautés fatales: Acanthaceae species as invasive alien plants on tropical Indo-Pacific Islands", Diversity and Distributions,10 pp. 333-347. 31. Jiang, L., Yang, N., Yuan, X., Zou, Y., Zhao, F., Chen, J., Lu, D. (2014), "Daucosterol promotes the proliferation of neural stem cells", The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology,140, 90-99. 32. Jiang, L., Yuan, X., Yang, N., Ren, L., Zhao, F., Luo, B., Chen, G. (2015), " Daucosterol protects neurons against oxygen–glucose deprivation/reperfusion-mediated injury by activating IGF1 signaling pathway", The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology,152, 45-52. 33. Ji, Z.-H., Xu, Z.-Q., Zhao, H., & Yu, X.-Y. (2017), Neuroprotective effect and mechanism of daucosterol palmitate in ameliorating learning and memory impairment in a rat model of Alzheimer’s disease", Steroids,119, 31-35. 34. Yenn, T. W., Arslan Khan, M., Amiera Syuhada, N., Chean Ring, L., Ibrahim (2017), "Stigmasterol: An adjuvant for beta lactam antibiotics against beta-lactamase positive clinical isolates", Steroids, 128, 68-71. 35. Young-Sang Kim, X.-F.L., Kyong-Hwa Kang, BoMi Ryu & Se Kwon Kim (2014), "Stigmasterol isolated from marine microalgae Navicula incerta induces apoptosis in human hepatoma HepG2 cells BMB Rep",47(8): p. 433-438. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  49. 36. Zhao, C., She, T., Wang, L., Su, Y., Qu, L., Gao, Y., Shou, C. (2015), "Daucosterol inhibits cancer cell proliferation by inducing autophagy through reactive oxygen species-dependent manner", Life Sciences,137, 37- 43. Link 37. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU