Khóa luận Nghiên cứu chế tạo hệ kháng sinh nano trên cơ sở hạt nano oxit sắt từ

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu chế tạo hệ kháng sinh nano trên cơ sở hạt nano oxit sắt từ

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  TRẦN THỊ NGỌC BÍCH NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO HỆ DOXYCYCLINE NANO TRÊN CƠ SỞ HẠT NANO OXIT SẮT TỪ (Fe3O4) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2019
2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  Người thực hiện: TRẦN THỊ NGỌC BÍCH NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO HỆ DOXYCYCLINE NANO TRÊN CỞ SỞ HẠT NANO OXIT SẮT TỪ (Fe3O4) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: QHY.2014 GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN 1: TS HÀ PHƯƠNG THƯ GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN 2: PGS.TS DƯƠNG THỊ LY HƯƠNG HÀ NỘI – 2019 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
3. LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận một cách hoàn chỉnh, tôi xin chân thành cảm ơn sự hướng dẫn nhiệt tình của quý thầy cô, anh chị tại Viện Khoa học vật liệu – Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ. Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Hà Phương Thư và PGS.TS Dương Thị Ly Hương, hai cô đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS. Nguyễn Hoài Nam, anh đã đưa ra cho tôi những lời khuyên bổ ích trong quá trình nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn anh, chị làm việc tại phòng Vật liệu nano y sinh, Viện Khoa học vật, Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ cũng đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện nghiên cứu. Cuối cùng tôi xin cảm ơn các thầy cô trong Khoa Y Dược cũng tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu. Hà Nội, ngày 03 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Trần Thị Ngọc Bích @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
4. DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Alg Alginate DLS Dynamics Light Scattering Tán xạ ánh sáng động EDX Energy-dispersive X-ray Phổ tán sắc năng lượng tia X spectroscopy FDA Food and Drug Aministration Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ FEG Polyethylene glycol FESEM Field Emission Scanning Kính hiển vi điện tử quét Electron Microscopy FTIR Fourier-transform infrared Quang phổ chuyển đổi hồng spectroscopy ngoại Fourier HIV Human immunodeficiency Vi rút suy giảm miễn dịch ở virus người IR Infrared radiation Phổ hồng ngoại PVP Poly vinyl pyrrolidone ROS Reactive oxygen species Gốc tự do oxy hóa XRD X-ray Diffraction Nhiễu xạ tia X @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
5. DANH MỤC HÌNH Hình 1: Cơ chế kháng khuẩn của nano oxit sắt từ Fe3O4 7 Hình 2: Cơ chế kháng khuẩn của hạt nano bạc (Nano Ag) 11 Hình 3: Cấu trúc phân tử của Doxycycline 12 Hình 4: Quy trình chế tạo hệ mang kháng sinh Doxycycline trên cơ sở hạt nano oxit sắt từ Fe3O4 17 Hình 5: Giản đồ nhiễu xạ tia X của các hạt nano: (a)- Nano bạc, (b)- Nano Fe3O4, (c)-Nano Fe3O4@SiO2, (d)- Nano Fe3O4@SiO2-Ag, 21 (e)-Nano Fe3O4@SiO2-Ag/Doxy/Alg 21 Hình 6: Phổ hồng ngoại FTIR của các hợp chất 23 Hình 7: Phổ EDX mẫu Fe3O4@SiO2-Ag với tỉ lệ bạc đầu vào 5% Ag 24 Hình 8: Phổ EDX mẫu Fe3O4@SiO2-Ag với tỉ lệ bạc đầu vào 10% Ag 24 Hình 9: Phổ EDX mẫu Fe3O4@SiO2-Ag với tỉ lệ bạc đầu vào 15% Ag 25 Hình 10: Hình ảnh FESEM của các hệ mẫu thu được khi thay đổi nồng độ alginate và nồng độ kháng sinh (M1.X, X=1,2,3 và M2.Y, Y=1,2,3) 26 Hình 11: Phân bố kích thước hạt của các hệ mẫu thu được khi thay đổi nồng độ Alg (M1.X) và nồng độ kháng sinh (M2.X) 27 Hình 12: Ảnh hưởng của nồng độ alginate đến kích thước trung bình của hệ phân tán Fe3O3@SiO2-Ag/Doxy/Alg 29 Hình 13: Ảnh hưởng của nồng độ Doxycycline đến kích thước trung bình của hệ phân tán Fe3O4@SiO2-Ag/Doxy/Alg 29 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
6. DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Tỷ lệ các thành phần trong các hệ mẫu được thực hiện 19 Bảng 2: Đặc trưng tinh thể của các hạt nano oxit sắt từ Fe3O4 và nano bạc 22 Bảng 3: Thành phần bạc trên các hạt nano Fe3O4 @SiO2-Ag 25 Bảng 4: Kích thước trung bình của các hệ mẫu 28 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
7. MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Tình trạng kháng kháng sinh 3 1.2. Các hệ dẫn thuốc nano 3 1.3. Đặc tính kháng khuẩn của hạt nano kim loại 6 1.4. Kháng sinh Doxycycline 12 1.5. Kết hợp kháng sinh với nano kháng khuẩn 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. Đối tượng nghiên cứu 15 2.2. Nguyên liệu, hóa chất 15 2.3. Thiết bị 16 2.4. Phương pháp nghiên cứu 16 2.4.1. Chế tạo hạt nano sắt từ 16 2.4.2. Chế tạo hạt nano oxit sắt từ Fe3O4 bọc bởi SiO2 (Fe3O4@SiO2) 18 2.4.3. Chế tạo hạt Fe3O4@SiO2 gắn kết bạc (Fe3O4@SiO2-Ag) 18 2.4.4. Chế tạo hệ Fe3O4@SiO2-Ag mang kháng sinh Doxycycline (Fe3O4@SiO2 Ag/Doxy/Alg) 18 2.5. Phương pháp đánh giá đặc tính hóa lý 19 2.5.1. Phương pháp nhiễu xạ tia X (XRD) 19 2.5.2. Phổ hồng ngoại FTIR 19 2.5.3. Phương pháp hiển vi điện tử quét (FESEM) 19 2.5.4. Phương pháp phổ tán sắc năng lượng tia X (EDX) 20 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1. Giản đồ nhiễu xạ tia X 21 3.2. Phổ hồng ngoại FTIR @ School of Medicine and 22 Pharmacy, VNU
8. 3.3. Phổ tán sắc năng lượng tia X (EDX) 24 3.4. Ảnh hiển vi điện tử quét (FESEM) 26 3.5. Phân bố kích thước (DLS) 27 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
9. MỞ ĐẦU Lịch sử của kháng sinh thương mại đầu tiên được tóm tắt ngắn gọn, cùng với dữ liệu từ Hoa Kì và WHO, cho thấy tỷ lệ tử vong giảm do các bệnh truyền nhiễm trong thế kỷ 20, từ dưới một nửa số ca tử vong xuống dưới 10%. Nửa sau thế kỷ 20 chứng kiến việc sử dụng kháng sinh làm chất kích thích tăng trưởng cho động vật làm thực phẩm cho con người trong chế độ ăn uống, và cuối thế kỷ 20 đầu thế kỷ 21 đó là sự khởi đầu và gia tăng nhanh chóng của việc vi khuẩn kháng kháng sinh [11]. Kháng kháng sinh là một vấn đề phức tạp đã vượt qua các ranh giới quốc tế. Nó được dự đoán sẽ giết chết 10 triệu người trên toàn cầu mỗi năm và gây thiệt hại cho nền kinh tế toàn cầu 100 nghìn tỷ đô la Mỹ vào năm 2050 [20]. Tình trạng kháng kháng sinh ngày càng gia tăng trên khắp thế giới, ngay cả ở cơ sở y tế có trang thiết bị đầy đủ hiện đại nhất, thì việc điều trị cũng rất khó khăn, phải phối hợp với thuốc có độc tính cao và gây nhiều tác dụng phụ cùng chi phí vô cùng tốn kém. Một số trường hợp cũng có qua khỏi. Tuy nhiên, kháng kháng sinh là thuận nghịch, sức đề kháng trong cộng đồng của những người được điều trị bằng kháng sinh giảm theo cấp số nhân đến một năm sau khi kết thúc điều trị bằng kháng sinh. Các nghiên cứu tổng quan được thực hiện có hệ thống đã chứng minh rằng kháng sinh chỉ có thể mang lại lợi ích nhỏ cho các bệnh nhiễm trùng [20]. Các chiến dịch y tế công cộng ở nhiều quốc gia đã tìm cách xóa bỏ quan niệm cho rằng kháng sinh là cần thiết nhất và gửi một số các thông điệp về tình trạng kháng kháng sinh hiện nay. Vì vậy, cần có những giải pháp mới trong việc nâng cao hiệu quả sử dụng của kháng sinh và giảm thiểu tình trạng kháng kháng sinh hiện nay. Trong những năm gần đây, với sự phát triển của công nghệ nano, những hệ dẫn thuốc nano đã cho thấy tiềm năng to lớn của chúng trong việc vận chuyển và phân phối thuốc hiệu quả tới các tác nhân gây bệnh, làm tăng tác dụng hiệu quả điều trị của thuốc. Hiệu quả mà các hệ dẫn thuốc nano đem lại bắt nguồn từ những đặc tính lý hóa đặc biệt của chúng. Sở hữu kích thước siêu nhỏ, tỉ lệ diện tích bề mặt / thể tích lớn, các hạt nano tạo ra sự tiếp xúc bề mặt với vi khuẩn lớn tạo điều kiện @ thuận School lợi để thâmof Medicine nhập vào tế bàoand vi Pharmacy, VNU 1
10. khuẩn. Chúng có khả năng làm thay đổi chức năng của tế bào như tính thấm và hô hấp. Ngoài ra, chúng có ảnh hưởng đến sự phân chia của tế bào, ức chế hoặc phá vỡ cấu trúc protein có nitơ, lưu huỳnh hoặc ngăn cản sự sao chép DNA của vi khuẩn bằng cách can thiệp vào các nhóm sulfhydryl [15]. Ngày nay, việc sử dụng các hạt nano kháng khuẩn ngày càng được chú ý. Các loại vật liệu nano có tính kháng khuẩn như vàng, niken, bạc, oxit sắt, kẽm oxit, titan đioxit đã xuất hiện nhưng bạc là vật liệu có tính kháng khuẩn mạnh nhất và được nghiên cứu phổ biến hiện nay vì nó có khả năng kháng khuẩn tốt với vi khuẩn, vi rút và các vi sinh vật nhân thực khác. Tuy nhiên, việc sử dụng các hạt nano kim loại trên có thể gây ra một số tác dụng phụ không mong muốn đối với tế bào vật chủ. Chẳng hạn như nano bạc gây ra hiện tượng da bị nhuộm màu xanh hay xanh xám (argyria) khi sử dụng với lượng lớn, còn đối với nano kẽm gây ra các tổn thương đối với gan, thận [1]. Do vậy, nhằm khắc phục tác dụng phụ của nano kim loại cũng như giảm thiểu tình trạng kháng kháng sinh, các nhà nghiên cứu đã đưa ra một giải pháp là tạo ra những hệ dẫn thuốc nano kết hợp kháng sinh với các hạt nano kháng khuẩn. Dựa trên những vấn đề trên, với mong muốn tạo ra hệ dẫn thuốc hiệu quả, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chế tạo hệ kháng sinh nano trên cơ sở hạt nano oxit sắt từ” với mục tiêu: (i) Bào chế hệ nano sắt từ gắn nano bạc (ii) Bào chế hệ dẫn thuốc nano sắt từ gắn nano bạc và kháng sinh Doxycycline @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 2
11. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tình trạng kháng kháng sinh Kháng kháng sinh không phải là một hiện tượng gần đây, nhưng trong vài thập kỷ qua, vi khuẩn, nấm và nấm men đã phát triển sức đề kháng đáng kể chống lại nhiều loại thuốc tổng hợp truyền thống và hiện đại. Các vi khuẩn kháng thuốc giờ đây không chỉ có mặt trong bệnh viện mà đã xuất hiện ra bên ngoài bệnh viện. Tại sao lại có sự lây lan nhanh như vậy. Một là, sự di chuyển của con người và hàng hóa dễ dàng hơn nhiều so với trước đây và do đó các bệnh truyền nhiễm đã phát triển ở một nơi cụ thể có thể dễ dàng được chuyển giao trên toàn thế giới. Và thứ hai là sự “thích nghi” của vi khuẩn khi môi trường sống của chúng thay đổi và đỉnh cao đó là sự tiến hóa của chúng. Vì vậy, cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn cần xác định để có thể ngặn chặn con đường kháng thuốc của vi khuẩn. Cơ chế kháng kháng sinh của các loài vi khuẩn là khác nhau. Jose M. Munita và Cesar A. Arias đã phân loại cơ chế theo con đường sinh hóa kháng thuốc là (i) sửa đổi phân tử kháng khuẩn, (ii) ngăn chặn hợp chất kháng sinh đến đích (bằng cách giảm xâm nhập hoặc đẩy các chất kháng vi khuẩn ra), (iii) thay đổi và / hoặc bỏ qua vị trí đích và (iv) do các quá trình thích nghi tế bào [40]. Do vậy, ngăn cản các cơ chế trên và nâng cao khả năng vận chuyển kháng sinh tới đích hứa hẹn là phương pháp tiềm năng trong việc giảm thiểu tình trạng kháng kháng sinh. 1.2. Các hệ dẫn thuốc nano Sự phát triển một hệ dẫn thuốc là một nhiệm vụ đầy thách thức đòi hỏi phải lựa chọn cẩn thận không chỉ nguyên tắc hoạt động mà còn cả về vật liệu để làm nguyên liệu, vì các rào cản của vật chủ có thể làm cản trở hiệu quả tác dụng của thuốc. Chẳng hạn như da thì lớp sừng là rào cản chính đối với sự tiếp cần của các thuốc qua da. Deepinder Singh và cộng sự, cho rằng 95% thuốc bôi ngoài da được rửa sạch khỏi bề mặt mặt trong vòng vài phút sau khi bôi [34]. Vì vậy, lần lượt các nghiên cứu về các hệ dẫn thuốc ra đời. Dưới đây chúng tôi đưa ra một vài hệ dẫn thuốc phổ biến như liposome, polyme, các hạt nano, @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 3
12. Hệ dẫn thuốc trên cơ sở liposome Liposome là những túi nhỏ hình cầu, trong đó một hoặc nhiều phân tử thuốc được bao quanh hoàn toàn bởi các phân tử ưa nước và kỵ nước. Liposome được sử dụng rất rộng rãi vì các khả năng đặc biệt của chúng. Đó là mang được các chất điều trị cả kỵ nước và ưa nước với hiệu quả cao, bảo vệ các thuốc đóng gói tránh những tác động không mong muốn của điều kiện bên ngoài, chức năng hóa với các phối tử cụ thể có thể tác dụng vào các đích tế bào, mô và các cơ quan cụ thể, được phủ các polyme trơ và tương thích sinh học, chẳng hạn như polyethylen glycol (PEG), kéo dài thời gian bán hủy của liposome trong máu, và hình thành các công thức mong muốn với thành phần, kích thước, diện tích bề mặt và các tính chất khác cần thiết [42]. Liposome được sử dụng phổ biến để vận chuyển thuốc kháng sinh vì cấu trúc lipid kép của nó giống màng tế bào và có thể dễ dàng kết hợp với các vi khuẩn truyền nhiễm [28]. Liposome có các ưu điểm để trở thành chất dẫn thuốc: cải thiện dược động học và phân bố sinh học, giảm độc tính, tăng cường hoạt động chống lại các tác nhân gây bệnh trong nội bào, chọn lọc đích tác dụng, tăng cường hoạt động chống lại các mầm bệnh ngoài tế bào, đặc biệt là khắc phục khả năng kháng thuốc của vi khuẩn [28]. Mặc dù có những ưu điểm thích hợp để sử dụng làm chất dẫn thuốc nhưng liposome cũng có các nhược điểm cần được khắc phục. Một trong những nhược điểm đó là thời gian tồn tại của liposome ngắn, làm hạn chế sự ổn định của thuốc. Doxil là thuốc dạng liposome đầu tiên được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (FDA) phê duyệt để điều trị bệnh AIDS liên quan đến sacom Kaposi vào năm 1995 [42]. Hệ dẫn thuốc trên cơ sở polyme Một hệ dẫn thuốc khác cũng được sử dụng rộng rãi trong lâm sàng là polyme. Các polyme dựa trên công nghệ nano tạo ra các hạt keo polyme có kích thước siêu hiển vi, trong đó một tác nhân điều trị có thể được gắn hoặc bọc trong mạng lưới polyme hoặc hấp phụ hoặc liên hợp với bề mặt. Các tác nhân điều trị có kích thước nhỏ đặc biệt là các chất chống ung thư thường có hai điểm bất lợi: thời gian bán hủy ngắn nên phải thường xuyên theo dõi và @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 4
13. không tác dụng vào các đích cụ thể dẫn đến các tác dụng phụ không mong muốn [42]. Vì vậy, việc kết hợp các hạt nano polyme với thuốc có thể cải thiện được các bất lợi trên trong điều trị. Có sự kết hợp này là do các đặc tính của polyme. Thứ nhất, các hạt nano polyme có cấu trúc ổn định và có thể được tổng hợp với kích thước rõ ràng. Thứ hai, tính chất của hạt như là kích thước, thế zeta và các dạng giải phóng của thuốc có thể được điều chỉnh chính xác bằng cách chọn các độ dài polyme, chất hoạt động bề mặt và các dung môi hữu cơ khác nhau trong quá trình tổng hợp. Thứ ba, bề mặt các hạt nano polyme thường chứa các nhóm chức có thể thay đổi về mặt hoá học của các phân tử thuốc hoặc các đích tác dụng của phối tử. Việc vận chuyển kháng sinh tới đích, các hạt nano polyme đã được bao phủ nhiều lần bằng lectin, một protein liên kết với các carbohydrate đơn giản hoặc phức tạp có mặt trên hầu hết các thành tế bào vi khuẩn. Tuy nhiên, vẫn còn rất nhiều khó khăn chủ yếu là do độc tính của polyme, tính miễn dịch, phân bố sinh học không đặc hiệu, sự mất ổn định trên in vivo, khả năng mang thuốc và thải thuốc. Hệ dẫn thuốc trên cơ sở các hạt nano kim loại Một hệ dẫn thuốc khác cũng được quan tâm là các hạt nano kim loại đã thu hút các nhiều nhà nghiên cứu từ nhiều lĩnh vực khoa học khác nhau trong suốt thập kỷ qua vì những tính chất đặc biệt của chúng [21]. Các hạt nano kim loại có hình dạng, kích thước khác nhau (từ 10 đến 100 nm) cũng đã được nghiên cứu như các hệ thống chẩn đoán và vận chuyển thuốc. Các hạt nano kim loại phổ biến nhất chứa các kim loại như vàng, niken, bạc, oxit sắt, oxit kẽm, gadolini và titan dioxit. Sử dụng các hạt nano kim loại có nhiều ưu điểm vì các đặc tính độc nhất của nó như là tính xúc tác, tính quang học, tính điện tử, hoạt tính kháng khuẩn và từ tính. Đặc biệt là khả năng điều chỉnh các tính chất của chúng bằng cách thay đổi kích thước và hình dạng các hạt nano. Nhưng nó cũng có nhược điểm có thể bị giữ lại và tích tụ sau khi sử dụng thuốc. Vì vậy, việc đưa các hạt nano kim loại vào điều trị cần được nghiên cứu để tránh được các tác dụng phụ khi dùng thuốc. Với sự phát triển của công nghệ ngày nay, công nghệ nano là một lĩnh vực nghiên cứu mà nhiều nhà khoa học quan tâm. Những đặc tính ưu việt của nó có thể giúp giải quyết các vấn đề về@ khả School năng hòa of tan Medicine hoặc độ ổn định and của Pharmacy, VNU 5
14. thuốc góp phần làm tăng hiệu quả trị liệu của tác nhân hoạt tính và giảm thiểu các phản ứng phụ do thuốc gây ra. Tuy nhiên, có thể có những vấn đề về độc tính đáng kể liên quan đến các hạt nano, điều này đòi hỏi sự giải quyết. Trong vài năm gần đây đã có các nghiên cứu về độc tính khi tiếp xúc với các sản phẩm công nghệ nano gây ra những rủi ro nghiêm trọng cho hệ thống sinh học trong cơ thể. Vấn đề độc tính thậm chí trở nên nghiêm trọng hơn đối với các hạt nano tiêm tĩnh mạch, vì kích thước một phần xác định sự phân bố của mô [22]. Do đó, số phận cuối cùng của các hạt nano và thành phần của chúng trong cơ thể, đặc biệt là những chất không phân huỷ sinh học sẽ như thế nào. Các thành phần này hoặc các sản phẩm phân hủy của chúng có thể gây ra các hoạt động miễn dịch và dược lý mà chúng ta vẫn chưa biết. Vì vậy cần thêm các nghiên cứu về độc tính của hệ nano để đạt được kết quả điều trị như mong muốn. 1.3. Đặc tính kháng khuẩn của hạt nano kim loại Hạt nano sắt từ Nano kim loại từ tính có thể được hình thành từ các kim loại như coban, niken, mangan và sắt hoặc hợp kim và các oxit của chúng. Tuy nhiên, chỉ có các nano oxit sắt từ đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm chấp thuận cho sử dụng lâm sàng do các đặc tính vốn có của chúng [34]. Và chúng đã được chứng minh là có tính kháng khuẩn với nhiều loài vi khuẩn như S. aureus, S. epidermidis và E. coli [5, 39]. Nano sắt từ là một trong những dạng hàng đầu về vật liệu nano với tiềm năng đạt được tiến bộ lớn trong các kỹ thuật chẩn đoán và điều trị hiện tại, tiềm năng này xuất phát từ các tính chất vật lý vượt trội của chúng về bản chất từ tính và khả năng hoạt động ở cấp độ tế bào và phân tử [30]. Nano sắt từ có hai điểm đặc biệt đáng để quan tâm. Điểm đặc biệt thứ nhất là hầu hết các hạt nano sắt từ có tính kháng khuẩn do thành phần sử dụng tổng hợp nano sắt từ. Các nhóm vi khuẩn khác nhau thì nhạy cảm với các hạt nano khác nhau. Hơn nữa các yếu tố như kích thước, hình dạng, thành phần khác nhau cũng có thể làm cho sự tác động trên vi khuẩn cũng khác nhau. Nghiên cứu vi mô về khả năng kháng vi khuẩn của hạt nano sắt từ trên sự tăng trưởng của Escherichia coli. Kết quả cho thấy sự gia tăng bất thường về độ dài của @ tế Schoolbào vi khuẩn, of Medicinemức độ phân chiaand tế Pharmacy, VNU 6
15. bào, do đó ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn [30]. Ngoài ra, nano sắt từ còn hoạt động tối đa chống lại Pseudomonas aeruginosa. Các phản ứng oxy hóa tạo ra bởi các hạt nano sắt từ tạo ra các gốc tự do có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn mà không gây hại cho các tế bào vật chủ (Hình 1) [35]. Tính kháng khuẩn của nano sắt từ đã là một lợi thế để vật liệu nano này được các nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu. Tương tác với vi khuẩn Ít gốc tự do Vỏ chitosan Tương tác với vi khuẩn Nhiều gốc tự do Hình 1: Cơ chế kháng khuẩn của nano oxit sắt từ Fe3O4 Điểm đặc biệt thứ hai của nano sắt từ đó là khả năng vận chuyển kháng sinh. Khi sử dụng hệ dẫn thuốc để đưa thuốc tới đích tác động có nhiều hàng rào cản trở con đường đến. Đó là niêm mạc, hấp thu không đặc hiệu của các hạt nano sắt từ và sự không đặc hiệu của thuốc. Một trong những cơ chế giúp thuốc được đưa tới đích thuận lợi hơn là sự thoát mạch. Sau khi sử dụng nano sắt từ, (i)chúng sẽ tham gia sự nhập bào qua trung gian thụ thể và sự hình thành thể nội bào, tiếp đến là (ii) sự acid hóa nội bào bằng bơm proton dẫn đến áp suất thẩm thấu cao, trương nở và cuối cùng là giai đoạn (iii) giải phóng hạt nano và các chất điều trị đã kết hợp. Bên cạnh đó nano sắt từ cũng có nhược điểm của nó. Nhược điểm chủ yếu là độ tan của nano sắt từ là vì sự tích tụ do năng lượng bề mặt cao, hấp phụ các protein huyết tương, oxy hóa và ăn mòn. Và nano sắt từ còn có đặc tính siêu thuận từ mà có khuynh hướng @ kết School tụ lại với of nhau Medicine nhờ năng lượng and bề Pharmacy, VNU 7
16. mặt cao [3]. Vì vậy để khắc phục các nhược điểm trên thực tế các hạt nano sắt từ được phủ bên ngoài một lớp bảo vệ gọi là vỏ. Các chất được sử dụng để bao phủ là: các lớp phủ với vỏ hữu cơ polyme (PEG và poly-L-lysine, poly propylen và poly ethyleneimime và axit poly-L-lactic), polysaccarit (dextran, chitosan và heparan sulfat), protein (Albumin huyết thanh) và các chất hoạt động bề mặt (axit oleic, lauryl sarcosinat, Pluronic F-127). Và chính lớp phủ polyme này đã tạo thành khoảng không gian để ngăn chặn sự tích tụ lại với nhau của các hạt nano sắt từ. Đồng thời, chúng cũng điều chỉnh các tính chất bề mặt như là điện tích bề mặt và chức năng hóa học của nano sắt từ. Việc sử dụng lớp phủ polyme bên ngoài nano làm cho chúng tăng sự ổn định và hệ bền hơn. Tuy nhiên việc bọc ngoài này có thể làm thay đổi lượng thuốc kháng sinh được giải phóng ra. Vấn đề nồng độ vi khuẩn là quan trong trong quá trình tiêu diệt vi khuẩn. Nếu nồng độ thấp không đủ để tiêu diệt vi khuẩn, còn nếu nồng độ quá nhiều có thể gây các tác dụng không mong muốn cho vật chủ. Một ứng dụng phổ biến của lớp phủ là sử dụng chitosan để bao phủ bên ngoài các hạt nano sắt từ. Với chitosan là một polyme có giá thành thấp, tương thích sinh học, không độc hại, có độ ổn định về hóa và nhiệt học [33] nên được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu. Shen và cộng sự đã phát triển một phương pháp điều trị tích hợp cho bệnh ung thư và các biến chứng do thuốc gây ra trong quá trình điều trị ung thư thông qua hệ thống vận chuyển thuốc kép [9]. Trong nghiên cứu của họ, thuốc doxorubicin và verapamil kết hợp sơ bộ với vỏ chitosan phủ trên nano sắt từ. Do vậy, việc bào chế ra một hệ dẫn thuốc kiểm soát nồng độ của thuốc là một vấn đề quan trọng. Hạt nano bạc Các hạt nano kim loại đã thu hút nhiều sự chú ý trong nghiên cứu khoa học vì tính linh hoạt của chúng trong các lĩnh vực khác nhau như kỹ thuật, y học, hóa học và vật lý. Ngày nay, với sự phát triển nhanh chóng của vi sinh vật kháng lại các thuốc chống vi trùng truyền thống và việc chèn các loại thuốc / hợp chất mới là khó khăn, cần phải tìm kiếm các lựa chọn thay thế đầy hứa hẹn, đó là một câu hỏi quan trọng về an toàn sức khỏe cộng đồng [12]. Cùng với đó là sự phát triển của cơ chế@ khángSchool kháng of sinh Medicine làm tăng thời and gian Pharmacy, VNU 8
17. trong điều trị bệnh, thời gian nằm viện lâu hơn và chi phí do các thiết bị và phương tiện cũng tăng lên. Vì vậy. các nano kim loại sẽ hứa hẹn là một công nghệ đem lại hiệu quả và giảm tối thiểu các vấn đề gặp phải trên. Các hạt nano được lựa chọn vì chúng nó là kim loại cần thiết cho thực vật và không độc hại trong phạm vi nồng độ rộng [29]. Các loại vật liệu nano đã thay đổi như đồng, kẽm, titan [14], magie, vàng [2] và bạc đã xuất hiện nhưng nano bạc đã được chứng minh là hoạt động mạnh nhất vì nó có khả năng kháng khuẩn tốt đối với vi khuẩn, vi rút và các vi sinh vật nhân thực khác. Do đặc tính kháng khuẩn mạnh của mình mà nano bạc được nghiên cứu rất nhiều trên lâm sàng. Trong thời gian dài bạc đã được sử dụng trong các ứng dụng như y học, vật tư nha khoa, vật liệu bọc thép không gỉ, vật liệu vải, quản lý nước, Đặc biệt là trong y học, bạc được sử dụng để chữa một số bệnh như bỏng, chấn thương kéo dài hoặc chống vi khuẩn, vi rút, Tuy nhiên, bạc trước đây dưới dạng là thuốc khử trùng nhưng có tác dụng phụ nguy hiểm vì khi tiếp xúc với bạc có thể gây ra bệnh agyria, độc cho tế bào động vật có vú [7]. Bạc được biết đến là nguyên tố có khả năng khử khuẩn mạnh nhất tồn tại trong tự nhiên và đã được ứng dụng từ rất lâu để phát triển thuốc chống nhiễm khuẩn. Giữa thế kỷ 20, sự phát minh ra thuốc kháng sinh với hiệu lực kháng khuẩn mạnh đã làm cho mức độ sử dụng thuốc có nguồn gốc từ bạc giảm đi. Tuy nhiên chỉ 30 năm sau đó, người ta nhận thấy hiện tượng đề kháng kháng sinh ở nhiều loài vi sinh vật, vì vậy tính năng kháng khuẩn của bạc lại được chú ý [1]. Các thuốc có nguồn gốc từ bạc có phổ kháng khuẩn rộng và rất hiếm khi bị vi khuẩn kháng tác dụng [23]. Nano bạc cũng đã được ứng dụng rộng rãi trong một loạt các ứng dụng kháng khuẩn trong nhiều nghiên cứu, như là điều trị vết thương [18], chống lại các chủng trên lâm sàng [16, 17], mầm bệnh bệnh viện [24], mầm bệnh trong thực phẩm [4]. Các thuốc từ bạc đều có chung một nguyên tắc là thuốc cần phải giải phóng bạc dưới dạng ion để cho tác dụng [25]. Vì vậy, hiện nay việc ứng dụng ion bạc và kim loại bạc cũng như nano bạc là cần thiết. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 9
18. Tác dụng kháng khuẩn của bạc đối với vi khuẩn gram dương và gram âm là khác nhau. Theo một số báo cáo nghiên cứu vi khuẩn gram âm nhạy cảm với nano bạc hơn vi khuẩn gram dương [6, 8], một số nhà nghiên cứu khác thì có kết quả ngược lại [8, 27]. Có sự khác nhau này là do sự khác nhau về thành phần cấu trúc và phân tử của các loài vi khuẩn và cũng bị ảnh hưởng bởi nồng độ vi khuẩn cùng với nồng độ, kích thước và hình dạng hạt nano [8]. Và cơ chế hoạt động kháng khuẩn này khá là phức tạp (Hình 2). Về bản chất, các hạt nano sẽ làm giải phóng bạc để thực hiện hoạt động kháng khuẩn. Các hạt nano bạc nhỏ có tính kháng khuẩn nhiều hơn do diện tích tiếp xúc bề mặt màng vi khuẩn nhiều hơn [8]. Ag+ có điện tích dương tương tác với thành tế bào vi khuẩn mang điện tích âm làm biến đổi hình thái tế bào và tăng tính thấm của tế bào hoặc rò rỉ tế bào gây chết tế bào [8]. Nano bạc có ái lực tương tác nhiều hơn với phốt pho và các phân tử sinh học có chứa lưu huỳnh có trong ngoại bào (protein màng), và các thành phần nội bào (cơ sở DNA, protein); những phân tử sinh học này ảnh hưởng sự phân chia tế bào, hô hấp và sự sống sót của tế bào [8]. Ngoài ra, sự tương tác của nano bạc với nhóm thiol có thể là nguyên nhân gây ra loạt phản ứng oxy hóa sinh gốc tự do oxy hóa (ROS), dẫn đến ức chế enzyme hô hấp và gây chết. Ion bạc hoạt động như là một chất kháng khuẩn bằng cách tương tác với thành tế bào peptidoglycan và màng sinh chất [31] và ngăn cản sự sao chép DNA của vi khuẩn bằng cách can thiệp vào các nhóm sulfhydryl trong protein [15]. Để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của nano bạc, Kim và công sự đã đánh giá hoạt động kháng khuẩn của hạt nano bạc đối với E. coli và Staphylococcus aureus và chứng minh rằng E. coli bị ức chế ở nồng độ thấp, trong khi tác dụng ức chế tăng trưởng đối với S. aureus kém nhạy hơn [32]. Pseudomonas aeruginosa và Vibrio cholerae đã được tìm thấy có khả năng kháng thuốc cao hơn E. coli và Salmonella typhi. Tuy nhiên, ở nồng độ trên 75 μg / ml, sự phát triển của các vi khuẩn này gần như bị xóa bỏ hoàn toàn đối với nano bạc [29]. Shameli và cộng sự đã báo cáo hoạt động kháng khuẩn của các hạt nano bạc có kích thước khác nhau trong PEG chống lại vi khuẩn gram dương (S. aureus) và vi khuẩn gram âm (Salmonella typhimurium) [13]. Họ cũng đưa ra kết luận rằng các hoạt động kháng khuẩn của nano bạc trong PEG (polyethylen glycol) có thể được thay @ đổi School bằng cách ofkiểm Medicine soát kích thước and của Pharmacy, VNU 10
19. các hạt nano, trên thực tế, hoạt động của nano bạc giảm khi kích thước hạt tăng [29]. Cơ chế hoạt động kháng khuẩn khá phức tạp, được biểu diễn dưới hình sau: Gián đoạn chuỗi vận chuyển điện tử Rò rỉ vách tế bào Màng sinh chất Vách tế bào Vi khuẩn Mất ổn định ribosome Tương tác với ADN Tương tác với các enzyme Sản xuất gốc tự Chết do oxy hóa Hình 2: Cơ chế kháng khuẩn của hạt nano bạc (Nano Ag) Khả năng đáng chú ý thứ hai của bạc là tác dụng chống nấm. Ngoài hoạt tính kháng khuẩn, hoạt tính kháng nấm của nano bạc cũng được nghiên cứu rộng rãi và các hạt nano này có hiệu quả tương đương với nhiều loại thực vật cũng như nấm gây bệnh cho người. Nano bạc có tác dụng chống nấm nhanh và hiều quả trên nhiều loài phổ biến như Aspergillus, Candida và Saccharomyces [1]. Nano tiểu phân bạc kích thước 13.5+-2.6 nm còn có hiệu quả trong diệt nấm men phân lập từ vú bò bị viêm [1]. Gajbhiye và cộng sự đã chứng minh tiềm năng kháng nấm của nano bạc được sinh tổng hợp chống lại một số mầm bệnh nấm phổ biến như Phoma glomerata, P. herbarum, Fusarium semitectum, Trichoderma sp và C. albicans, nano bạc đã được tìm thấy có hiệu quả chống lại tất cả các loại nấm thử nghiệm này [36]. Nano bạc còn có tác dụng chống vi rút. Nano tiểu phân bạc đường kính trung bình 10nm có khả năng ức chế đến 98% sự tái tạo của virut HIV-1 trong khi nano vàng cùng đường kính chỉ cho hiệu quả ở mức thấp (6-20%) [41]. Humberto và công sự (2010) cho rằng nano tiểu phân bạc phát huy tác dụng kháng virut HIV ở giai đoạn đầu của @quá Schooltrình nhân bảnof Medicinevà giai đoạn sau and xâm Pharmacy, VNU 11
20. nhập của virut [1]. Hạt nano bạc được phủ bằng poly (N-vinyl-2-pyrrolidone) (PVP) và phạm vi kích thước 1-10nm là hiệu quả nhất để ức chế sự sao chép của HIV [26]. Các hạt oxit sắt từ và nano bạc đã được chứng minh có tác dụng kháng khuẩn. Ngoài ra, chúng còn được cho là có khả năng nân cao hiệu quả của các loại thuốc kháng sinh. Cùng với sự phát triển của công nghệ là sự phát triển của tình trạng kháng kháng sinh, nên việc kết hợp các hạt nano có tính kháng khuẩn sẽ là phương pháp tăng hiệu quả điều trị cũng như giảm thiểu tình trạng kháng kháng sinh. 1.4. Kháng sinh Doxycycline Doxycycline là một tetracycline bán tổng hợp thế hệ thứ hai và nó khác với tetracycline truyền thống ở khả năng liên kết với canxi thấp hơn [43]. Doxycycline có thời gian bán hủy dài nên một ngày một liều, đi qua hàng rào máu não hiệu quả, hấp thu và dung nạp tốt. Doxycycline có hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng với nồng độ ức chế tối thiểu khoảng 0,016 – 2 μg/ml [10]. Nghiên cứu của Col và O'Connor, các tetracycline đã được sử dụng rộng rãi trong môi trường lâm sàng và đứng thứ hai sau penicillin trong tổng số tấn được sử dụng mỗi năm trên toàn thế giới, tạo ra việc chọn lọc mạnh mẽ dẫn đến việc trao đổi các gen kháng tetracycline liên quan đến plasmid hoặc transposone (gen nhảy) trong và giữa các loài vi khuẩn với nhau [37]. Tuy nhiên, hiện nay vi khuẩn đã tạo ra cơ chế kháng doxycycline. Hình 3: Cấu trúc phân tử của Doxycycline @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 12
21. 1.5. Kết hợp kháng sinh với nano kháng khuẩn Việc kết hợp kháng sinh với nano có tính kháng khuẩn đã được nghiên cứu và chứng minh hiệu quả trong việc tiêu diệt vi khuẩn và hạn chế tình trạng kháng kháng sinh. Một số các nhà khoa học đã nghiên cứu về sự kết hợp này, đặc biệt là sự kết hợp giữa kháng sinh và nano bạc vì tính kháng khuẩn mạnh của nano bạc. Nghiên cứu đầu tiên về sự kết hợp này được thực hiện bởi Ping và cộng sự [19]. Các tác giả đã nghiên cứu khả năng diệt khuẩn của nano bạc gắn kháng sinh amoxicillin trên vi khuẩn E.coli. Kết quả đã cho thấy, khi sử dụng riêng lẻ nano bạc và amoxicillin, nồng độ ức chế tối thiểu đạt được lần lượt là 40 µg/ml và 0.525 mg/ml. Tuy nhiên, khi sử dụng dạng kết hợp để ức chế sự phát triển của vi khuẩn tương tự thì chỉ cần 0,150 mg/ml amoxicillin và 5 µg/ml nano bạc. Ngoài ra, các tác giả còn đưa ra những cơ chế hoạt động khác nhau cho sự kết hợp nano bạc và amoxicillin: - Thứ nhất, khi sử dụng kết hợp nano bạc với amoxicillin, vi khuẩn có thể kháng lại cơ chế của một trong hai tác nhân, thì tác nhân còn lại sẽ tiêu diệt vi khuẩn theo một cơ chế khác hoàn toàn so với cơ chế vi khuẩn đã kháng. - Thứ hai, nếu trong trường hợp không xảy ra hiện tượng kháng kháng sinh, tác động hiệp đồng của nano bạc và amoxicillin có thể được gây ra bởi sự liên kết giữa các phân tử amoxicillin với các hạt nano bạc. Phân tử amoxicillin sở hữu nhiều nhóm hoạt động như nhóm hydroxyl hay nhóm amino, có khả năng tạo một hệ liên kết với lõi là các hạt nano bạc được bao quanh bởi các phân tử amoxicillin. Chính hệ liên hợp này, theo một cách nào đó, làm tăng cường hoạt tính kháng khuẩn. - Thứ ba, các hạt nano bạc đóng vai trò làm hệ mang hiệu quả giúp vận chuyển kháng sinh qua lớp màng tế bào vi khuẩn. Các hạt nano bạc với kích thước nhỏ, diện tích bề mặt lớn có thể dễ dàng qua lớp màng tế bào được cấu tạo bởi các phân tử kỵ nước phospholipids và glycoprotein so với những phân tử ưa nước amoxicillin. Sự kết hợp kháng sinh-nano bạc không những làm tăng hiệu quả tiêu diệt vi khuẩn mà còn tạo nên một tác @dụng School rất lớn là chofố ngMedicine lại sự kháng andkháng Pharmacy, VNU 13
22. sinh của vi khuẩn. Đây là một vấn đề rất lớn khi sử dụng các loại kháng sinh. Nhiều loài vi khuẩn có khả năng phát triển các cơ chế để kháng lại tác dụng của kháng sinh. Cơ chế của sự kết hợp kháng sinh với nano bạc (hoặc bạc ion) được cho là liên quan tới ức chế các loại protein có khả năng gây ra hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn. Khi đó, kháng sinh xâm nhập vào tế bào vi khuẩn sẽ không chịu sự ức chế của các protein này và do đó, tạo nên tác dụng tiêu diệt vi khuẩn. Ngoài ra bản thân các hạt nano bạc cũng có khả năng kháng khuẩn. Do vậy, sự kết hợp giữa kháng sinh-nano bạc sẽ chống lại sự kháng kháng sinh của vi khuẩn và tạo nên hiệu quả tiêu diệt vi khuẩn cao hơn. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 14
23. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Vật liệu nano kháng khuẩn 2.2. Nguyên liệu, hóa chất STT Tên hóa chất Xuất sứ 1 FeCl3 Sigma-Aldrich 2 FeCl2.4H2O Sigma-Aldrich 3 Doxycycline hydrochloride Sigma-Aldrich 4 Alginic acid sodium salt Sigma-Aldrich Tetraethyl orthosilicate (TEOS) 5 Sigma-Aldrich (Si(OC2H5)4) 6 AgNO3 Nhật Bản 7 NaBH4 Sigma-Aldrich 8 Ethanol Merk 9 Amoniac Merk 10 Nước cất - @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 15
24. 2.3. Thiết bị STT Tên thiết bị Mục đích sử dụng 1 Thiết bị tổng hợp vi sóng Tổng hợp hạt nano sắt từ 2 Cân phân tích Cân hóa chất 3 Máy khuấy từ Tổng hợp vật liệu Dụng cụ thủy tinh (bình 3 cổ, ống đong, 4 Tổng hợp vật liệu pipet ) Thí nghiệm phóng thích 5 Túi thẩm tách thuốc 2.4. Phương pháp nghiên cứu Hệ vật liệu nano mang kháng sinh trên nền hạt nano oxit sắt từ Fe3O4 được chế tạo theo quy trình gồm nhiều bước thể hiện trên hình 4. 2.4.1. Chế tạo hạt nano sắt từ Các hạt nano sắt từ Fe3O4 được tổng hợp bằng phương pháp đồng kết tủa Fe2+ và Fe3+ với phương trình hóa học sau: 2FeCl3 + FeCl2 + 8NH3 + 4H2O Fe3O4 + 8NH4Cl Hòa tan FeCl3 và FeCl2 trong HCl 2M trong bình cầu ba cổ rồi thêm nước cất. Lắp bình phản ứng vào máy vi sóng. Sau đó sục khí N2 (1-2 phút) trong dung dịch, rồi rút khí lên cao để tạo môi trường. Phản ứng xảy ra trong o thiết bị vi sóng là: 70 C trong 8 phút. Sau 8 phút bắt đầu xả NH3 rồi duy trì nhiệt độ 70oC trong vòng 15 phút. Sau khi phản ứng kết thúc, cho sản phẩm ra rửa 3 lần với nước cất (500 ml nước cất / 1 lần rửa) để loại bỏ NH3 còn dư để thu được sản phẩm. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 16
25. nFeCl3 : n FeCl2.4H2O = 2:1 HCl 2M Hỗn hợp dung dịch Fe3+ và Fe2+ Thiết bị tổng NH3 2M hợp vi sóng Rửa bằng nước cất 3 lần Hạt nano Fe3O4 Ethanol + nước Ethanol + TEOS Rung siêu âm Khuấy 12 h Rửa 3 lần Fe3O4@SiO2 AgNO3 0.01M Nhiệt độ thấp NaBH4 Khuấy trong 1h Rửa Fe3O4@SiO2-Ag Doxycycline Khuấy 1h Fe3O4@SiO2-Ag/Doxy Dung dịch alginate Rung siêu âm Fe3O4@SiO2-Ag/Doxy/Alg Hình 4: Quy trình chế tạo hệ mang kháng sinh Doxycycline trên cơ sở hạt nano oxit sắt từ Fe3O4 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 17
26. 2.4.2. Chế tạo hạt nano oxit sắt từ Fe3O4 bọc bởi SiO2 (Fe3O4@SiO2) Pha loãng hỗn dịch nano Fe3O4 trong nước cất/ethanol với tỉ lệ thể tích 1/1. Khuấy từ trong 10 phút để hệ phân tán đều. Nhỏ từ từ dung dịch TEOS (tetraethyl orthosilicate) trong ethanol cho vào dung dịch trên, khuấy từ 15 phút. Sau dó thêm dung dịch NH3 đặc vào hỗn hợp trên, khuấy từ qua đêm. Kết thúc phản ứng, hạt nano oxit sắt từ được thu lại bằng nam châm và rửa 3 lần bằng nước cất rồi lắng để thu sản phẩm. Lớp SiO2 được hình thành theo phản ứng: Si(OC2H5)4 + 4H2O = Si(OH)4 + 4 C2H5OH. Si(OH)4 = SiO2 + 2H2O 2.4.3. Chế tạo hạt Fe3O4@SiO2 gắn kết bạc (Fe3O4@SiO2-Ag) Chuẩn bị dung dịch AgNO3 (2 mg/ml), điều chỉnh pH bằng dung dịch NH3 (2M) đến pH=8. Chuẩn bị dung dịch Fe3O4@SiO2 (2 mg/ml), điều chỉnh pH bằng dung dịch NH3 (2M) đến pH=8. Cho dung dịch AgNO3 vào dung dịch nano theo tỷ lệ thích hợp. Phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ thấp o + (10 C) khuấy từ liên tục trong 45 phút. Thêm NaBH4 theo tỷ lệ để khử Ag theo phương trình: 0 2AgNO3 + 2NaBH4 = 2Ag + H2 + B2H6 + 2NaNO3. Kết thúc phản ứng, sản phẩm được lắng bằng nam châm và rửa 2 lần bằng nước cất. Phân tán sản phẩm trong nước cất. 2.4.4. Chế tạo hệ Fe3O4@SiO2-Ag mang kháng sinh Doxycycline (Fe3O4@SiO2 Ag/Doxy/Alg) Hệ phân tán nano Fe3O4@SiO2-Ag được thêm từ từ vào dung dịch chứa kháng sinh Doxycycline. Để ổn định hệ phân tán, dung dịch Alginate (Alg) được thêm từ từ vào hỗn hợp nano sắt từ và kháng sinh. Toàn bộ các công đoạn được thực hiện trong điều kiện khuấy từ liên tục. Các mẫu được thực hiện nhằm theo dõi sự ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh và Alginate tới kích thước của hệ thu được. Thông số kỹ thuật các hệ mẫu được thể hiện trong bảng 1. Quá trình tải thuốc được thực hiện trong vòng 24 giờ ở điều kiện nhiệt @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 18
27. độ phòng. Kết thúc quá trình, sản phẩm được được lắng bằng nam châm và rửa bằng nước cất (3 lần). Bảng 1: Tỷ lệ các thành phần trong các hệ mẫu được thực hiện Kí hiệu mẫu Nồng độ (mg/mL) Fe3O4 Alg Doxy M1.1 2 0.5 2 M1.2 2 2 2 M1.3 2 4 2 M2.1 2 2 0.5 M2.2 2 2 2 M2.3 2 2 4 2.5. Phương pháp đánh giá đặc tính hóa lý Các đặc tính vật lý và hóa học của vật liệu được xác định bằng các phương pháp đặc trưng sau: 2.5.1. Phương pháp nhiễu xạ tia X (XRD) Phương pháp XRD giúp xác định cấu trúc, thành phần pha dựa trên số lượng, vị trí và cường độ peak trên phổ nhiễu xạ tia X, từ đó dự đoán được cấu trúc mạng và xác định bản chất vật liệu. 2.5.2. Phổ hồng ngoại FTIR Phương pháp này cung cấp thông tin về cấu trúc phân tử nhanh, không yêu cầu các phương pháp tính toán phức tạp. Các phổ khác nhau có mặt trong phổ hồng ngoại tương ứng với các nhóm chức đặc trưng và các liên kết có trong phân tử hợp chất hóa học. Bởi vậy, nó được coi là “dấu vân tay” để xác định các hợp chất. 2.5.3. Phương pháp hiển vi điện tử quét (FESEM) Phương pháp FESEM là sử dụng loại kính hiển vi có thể tạo ra ảnh với độ phân giải cao của bề mặt mẫu vật bằng cách sử dụng một chùm điện tử (chùm các electron) hẹp quét trên bề mặt mẫu. Việc tạo ảnh của mẫu được @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 19
28. thực hiện thông qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật. 2.5.4. Phương pháp phổ tán sắc năng lượng tia X (EDX) Phổ tán sắc năng lượng tia X là kỹ thuật phân tích thành phần hóa học của vật rắn dựa vào việc ghi lại phổ tia X phát ra từ vật rắn do tương tác với các bức xạ (chủ yếu là chùm điện tử có năng lượng cao trong kính hiển vi điện tử). Khi chùm điện tử có năng lượng lớn được chiếu vào vật rắn, nó sẽ đâm xuyên sâu vào nguyên tử vật rắn và tương tác với các lớp điện tử bên trong của nguyên tử. Tần số tia X phát ra là đặc trưng với nguyên tử của mỗi chất có mặt trong chất rắn. Việc ghi nhận phổ tia X phát ra từ vật rắn sẽ cho thông tin về các nguyên tố hóa học có mặt trong mẫu đồng thời cho các thông tin về tỉ phần các nguyên tố này. 2.5.5. Phương pháp tán xạ laze động (DLS) Phương pháp được sử dụng để xác định phân bố kích thước các hạt trong hệ phân tán @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 20
29. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Giản đồ nhiễu xạ tia X Fe O 3 4 Ag (311) (511) (440) (220) (400) (e) (422) (111) (311) (200) (220) (d) (c) (b) (a) 30 40 50 60 70 80 2 Hình 5: Giản đồ nhiễu xạ tia X của các hạt nano: (a)- Nano bạc, (b)- Nano Fe3O4, (c)-Nano Fe3O4@SiO2, (d)- Nano Fe3O4@SiO2-Ag, (e)-Nano Fe3O4@SiO2-Ag/Doxy/Alg Đặc trưng cấu trúc tinh thể của các hợp chất được thể hiện ở hình 4. Nano sắt từ có các nhiều xạ đặc trưng ở góc 2θ lần lượt là 31o, 36o, 43o, 53o, 57o và 63o tương ứng với các mặt tinh thể (220), (311), (400), (422), (511) và (440) (Bảng 1). Các nhiễu xạ đặc trưng của nano bạc tại các góc 2θ là 38o, 44o, 64o và 77o ứng với lần lượt các mặt tinh thể (111), (200), (220) và (311) (Bảng 2) Giản đồ nhiễu xạ tia X của Fe3O4@SiO2 (hình c) không thấy sự khác biệt nhiều so với giản đồ tia X của Fe3O4 (hình b). Có thể lý giải điều này là do sự tạo thành lớp SiO2 ở dạng vô định hình. Quá trình thuốc Doxycyclin và Alginate lên hệ Fe3O4@SiO2 không làm thay đổi các đỉnh nhiễu xạ của Fe3O4@SiO2 ban đầu. Những kết quả trên cho thấy sự tạo thành các hạt nano sắt từ Fe3O4 và sự có mặt của Ag trên hệ Fe3O4@SiO2. Để phân tích rõ hơn về @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 21
30. sự có mặt của SiO2, Doxycycline và Alginate trên hệ được chế tạo, phổ hồng ngoại FTIR sẽ được phân tích trong phần tiếp theo. Bảng 2: Đặc trưng tinh thể của các hạt nano oxit sắt từ Fe3O4 và nano bạc Nano Fe O Nano Ag 3 4 2θ (hkl) 2θ (hkl) o o 31 (220) 38 (111) o o 36 (311) 44 (200) o o 43 (400) 64 (220) o o 53 (422) 77 (311) o 57 (511) o 63 (440) 3.2. Phổ hồng ngoại FTIR Kết quả phổ IR cho thấy các nhóm chức năng đặc trưng của các chất (Hình 5). Các dao động tại vị trí 1653 và 1630 cm-1 được cho là các liên kết C=O trong Doxycycline và alginate. Dao động C=C trong vòng của Doxycycline được thể hiện tại vị trí 1452 cm-1. Dao động của liên kết Si-O -1 của SiO2 trong Fe3O4@SiO2(1100 cm ) đã bị dịch chuyển nhẹ tới vị trí 1119 -1 cm trong phổ FTIR của Fe3O4@SiO2-Ag/Doxy/Alg. Dao động C-O của Alginate tại vị trí 1032 cm-1 cũng đã dịch chuyển tới vị trí 1035 cm-1. Dao động của liên kết Fe-O trong Fe3O4 tại vị trí 586 cm-1 cũng có sự dịch chuyển -1 tới vị trí 592 cm trong phổ FTIR của Fe3O4@SiO2-Ag/Doxy/Alg. Những bằng chứng trên đã cho thấy sự thành công trong việc chế tạo thành công hệ mang kháng sinh Doxycycline dựa vào hệ nano sắt từ. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 22
31. Hình 6: Phổ hồng ngoại FTIR của các hợp chất @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 23
32. 3.3. Phổ tán sắc năng lượng tia X (EDX) Phổ tán sắc năng lượng tia X (EDX) được sử dụng để xác định thành phần Bạc (Ag) bám trên bề mặt hạt sắt từ. Hình 7: Phổ EDX mẫu Fe3O4@SiO2-Ag với tỉ lệ bạc đầu vào 5% Ag Hình 8: Phổ EDX mẫu Fe3O4@SiO2-Ag với tỉ lệ bạc đầu vào 10% Ag @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 24
33. Hình 9: Phổ EDX mẫu Fe3O4@SiO2-Ag với tỉ lệ bạc đầu vào 15% Ag Bảng 3: Thành phần bạc trên các hạt nano Fe3O4 @SiO2-Ag Tỉ lệ Ag/Fe3O4 đầu vào (% khối lượng) 5%Ag 10%Ag 15%Ag Lượng Ag đã sử dụng đầu vào (mg) 3,75 7,50 11,25 Lượng Ag bám vào hạt sắt từ (mg) (Kết 0,74 1,86 2,15 quả thu bằng phương pháp EDX) Hiệu suất (%) 19,73 24,80 19,11 Bằng cách giữ nguyên khối lượng của hạt Fe3O4@SiO2 và thay đổi khối lượng Ag đầu vào, chúng tôi thu được các kết quả như bảng 3. Khi lượng Ag đầu vào tăng lên thì tăng lượng bạc bám trên nano. Nhưng khi tăng Ag từ 10% lên 15% thì hiệu suất Ag bám trên hệ Fe3O4@SiO2 giảm mặc dù tổng lượng Ag bám trên các hạt nano Fe3O4@SiO2 vẫn tăng. Điều này có thể được lý giải do quá trình gắn kết hạt Ag lên bề mặt hạt nano sắt từ đã đạt tới trạng thái bão hòa. Vì vậy mà lượng Ag tăng nhưng hiệu suất gắn bạc lại giảm. Để thực sự lý giải được giả thiết này, những thí nghiệm chi tiết hơn phải được thực hiện trong khoảng đầu vào Ag từ 10-15%. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 25
34. 3.4. Ảnh hiển vi điện tử quét (FESEM) M1.1 M2.1 M1.2 M2.2 M 2 .3 M1.3 M2.3 Hình 10: Hình ảnh FESEM của các hệ mẫu thu được khi thay đổi nồng độ alginate và nồng độ kháng sinh (M1.X, X=1,2,3 và M2.Y, Y=1,2,3) Hình ảnh hiển vi của các hệ hạt nano sau quá trình tải thuốc Doxycycline và bền hóa bằng alginate được thể hiện trên hình 6. Các kết quả FESEM của sản phẩm thu được khi thay đổi nồng độ Alg (M1.X) và kháng sinh (M2.X). Kết quả cho thấy các mẫu đều có kích thước nhỏ dạng cầu, dao @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 26
35. động khoảng 20-30 nm. Kích thước có xu hướng tăng lên khi tăng nồng độ polyme và kháng sinh. Ở những nồng độ kháng sinh và alginate nhỏ hơn 2 mg/ml, các hạt phân bố đều, ít có hiện tượng kết đám xảy ra. Hiện kết đám được quan sát rõ ràng trên các mẫu có nồng độ kháng sinh và alginat cao (4 mg/ml). Để có kết quả chi tiết hơn, phương pháp tán xạ laze động được sử dụng để nghiên cứu phân bố kích thước và kích thước trung bình của các hệ thu được trong trạng thái phân tán trong dung dịch. 3.5. Phân bố kích thước (DLS) M1.1 M2.1 M1.2 M2.2 M1.3 M2.3 Hình 11: Phân bố kích thước hạt của các hệ mẫu thu được khi thay đổi nồng độ Alg (M1.X) và nồng độ kháng sinh (M2.X) Phương pháp tán xạ laze động (DLS) được sử dụng để xác định kích thước thủy động học của các hạt nano phân tán trong nước. Trong những thí nghiệm này, nồng độ chuẩn của các mẫu dựa trên nồng độ của các hạt nano Fe3O4. Nồng độ chuẩn được giữ cố định trong tất cả các phép đo là 2 mg Fe3O4/ml. Các kết quả thu được thể hiện @ trênSchool hình 11 of. Medicine and Pharmacy, VNU 27
36. Bảng 4: Kích thước trung bình của các hệ mẫu Kích thước Kí hiệu Nồng độ (mg/mL) trung bình mẫu (nm) Fe3O4 Alg Doxy M1.1 2 0.5 2 63 M1.2 2 2 2 86 M1.3 2 4 2 163 M2.1 2 2 0.5 82 M2.2 2 2 2 86 M2.3 2 2 4 198 Các giá trị kích thước (bảng 4) thu được lớn hơn những gì quan sát được từ ảnh FESEM. Nguyên nhân là do trạng thái tồn tại khác nhau của vật liệu khi được đo bằng các phương pháp khác nhau. Đối với phương pháp FESEM, mẫu được chụp ở trạng thái khô, các polyme (alginate) tồn tại ở trạng thái chặt chẽ hơn. Trong khi đó, đối với phương pháp DLS, các hạt tồn tại trong môi trường nước, các phân tử polyme có hiện tượng trương nở làm cho bán kính động học của hạt sẽ tăng lên. Từ các kết quả trên, kích thước hạt trung bình của hệ bị ảnh hưởng bởi nồng độ alginate và nồng độ kháng sinh Doxycyclin. Khi nồng độ Alg tăng từ 0,5 – 4 mg/ml thì kích thước trung bình có sự thay đổi lớn từ 63-163nm (bảng 4, hình 12). Với vai trò như những chất làm bền không gian, khi khối lượng của Alginate tăng lên, sự bao bọc quanh các hạt rắn có mật độ lớn hơn, polyme trong nước trương nở với lượng lớn hơn làm tăng bán kính thủy động của hạt phân tán do vậy mà kích thước trung bình tăng. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 28
37. 180 160 140 120 D (nm) D 100 80 60 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 Nong do Alg (mg/ml) Hình 12: Ảnh hưởng của nồng độ alginate đến kích thước trung bình của hệ phân tán Fe3O3@SiO2-Ag/Doxy/Alg 200 180 160 140 120 D (nm) D 100 80 60 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 Nong do Doxy (mg/ml) Hình 13: Ảnh hưởng của nồng độ Doxycycline đến kích thước trung bình của hệ phân tán Fe3O4@SiO2-Ag/Doxy/Alg Khi thay đổi nồng độ kháng sinh cũng xảy ra sự thay đổi về kích thước trung bình của hệ, kích thước tăng lên (bảng 4, hình 13). Các loại muối có thể có ảnh hưởng rất lớn tới sự phân bố kích thước hạt của các hệ phân tán nano, khi tăng nồng độ các muối trong hệ phân tán, kích thước trung bình của các hạt trong hệ phân tán có thể tăng từ 5 đến 100nm [38]. Hiện tượng này có thể đề cập tới sự thay đổi giá trị điện tích bề mặt của các hạt nano. Kháng sinh là một chất tan, tồn tại dạng ion mang đi@ện Schooltrong dung of dị ch,Medicine nên khi tăng and nồng Pharmacy, VNU 29
38. độ của chúng lên thì tương tác tĩnh điện giữa các phân tử kháng sinh và bề mặt hạt nano bị thay đổi, có thể làm ảnh hưởng đến độ bền của hệ. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 30
39. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Trong đề này, chúng tôi đã nghiên cứu thành công: - Hệ nano sắt từ gắn nano bạc - Quy trình chế tạo hệ mang thuốc kháng sinh (Doxycycline) trên cơ sở hạt nano oxit sắt từ (Fe3O4) gắn bạc và được làm bền alginate. Việc kết hợp nhiều thành phần có tính kháng khuẩn (Nano Fe3O4, bạc và kháng sinh) được kì vọng sẽ làm tăng hiệu quả kháng khuẩn của hệ dẫn thuốc thu được, đồng thời có thể đối phó với tình trạng kháng kháng sinh đang ngày càng trở nên đáng lo ngại. Các yếu tố ảnh hưởng đến phân bố kích thước hạt của hệ kháng sinh gồm nồng độ alginate và nồng độ kháng sinh đã được khảo sát. Kết quả cho thấy, khi tăng nồng độ của alginate và kháng sinh sẽ làm tăng kích thước trung bình của hệ phân tán. Hệ có kích thước trung bình nhỏ hơn 100 nm khi nồng độ alginate nhỏ hơn 2 mg/ml và nồng độ kháng sinh nhỏ hơn 2 mg/ml. Để đánh giá được hiệu quả thực tế của hệ kháng sinh nano đã chế tạo, cần nhiều hơn những thí nghiệm liên quan tới quá trình chế tạo vật liệu cũng như thử nghiệm trên các đối tượng vi khuẩn trên thực tế: định lượng kháng sinh trong hệ bào chế, xác định đặc tính phóng thích thuốc từ hệ vật liệu và thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của vật liệu trên một số loài vi khuẩn. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 31
40. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Thanh Hải, Chử Thị Thu Huyền, Nguyễn Thanh Bình và Trịnh Ngọc Dương (2014), " Nano tiểu phân bạc và triển vọng ứng dụng trong Dược học", VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, 30(2), p. 23-32. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 2. Ahmad Z, Pandey R, Sharma S and Khuller G K (2006), " Alginate nanoparticles as antituberculosis drug carriers: formulation development, pharmacokinetics and therapeutic potential", Indian J Chest Dis Allied Sci, 48(3), p. 171-176. 3. Assa F, Jafarizadeh-Malmiri H, Ajamein H, Vaghari H, Anarjan N, Ahmadi O and Berenjian A (2017), " Chitosan magnetic nanoparticles for drug delivery systems", Crit Rev Biotechnol, 37(4), p. 492-509. 4. Atiyeh B S, Costagliola M, Hayek S N and Dibo S A (2007), " Effect of silver on burn wound infection control and healing: review of the literature", Burns, 33(2), p. 139-148. 5. Azhar S L and Lotfipour F (2012), " Magnetic nanoparticles for antimicrobial drug delivery", Pharmazie, 67(10), p. 817-821. 6. Banerjee P, Satapathy M, Mukhopahayay A and Das P (2014), " Leaf extract mediated green synthesis of silver nanoparticles from widely available Indian plants: synthesis, characterization, antimicrobial property and toxicity analysis", Bioresources and Bioprocessing, 1(1), p. 3. 7. Chaloupka K, Malam Y and Seifalian A M (2010), " Nanosilver as a new generation of nanoproduct in biomedical applications", Trends Biotechnol, 28(11), p. 580-588. 8. Chandrasekaran R, Gnanasekar S, Seetharaman P, Keppanan R, Arockiaswamy W and Sivaperumal S (2016), " Formulation of Carica papaya latex-functionalized silver@ School nanoparticles of Medicine for its improved and Pharmacy, VNU
41. antibacterial and anticancer applications", Journal of Molecular Liquids, 219, p. 232-238. 9. Chen X and Schluesener H J (2008), " Nanosilver: a nanoproduct in medical application", Toxicol Lett, 176(1), p. 1-12. 10. Col N F and O'Connor R W (1987), " Estimating worldwide current antibiotic usage: report of Task Force 1", Rev Infect Dis, 9(3), p. S232- 243. 11. Dodds D R (2017), " Antibiotic resistance: A current epilogue", Biochem Pharmacol, 134, p. 139-146. 12. Dos Santos C A, Seckler M M, Ingle A P, Gupta I, Galdiero S, Galdiero M, Gade A and Rai M (2014), " Silver nanoparticles: therapeutical uses, toxicity, and safety issues", J Pharm Sci, 103(7), p. 1931-1944. 13. Gajbhiye M, Kesharwani J, Ingle A, Gade A and Rai M (2009), " Fungus-mediated synthesis of silver nanoparticles and their activity against pathogenic fungi in combination with fluconazole", Nanomedicine, 5(4), p. 382-386. 14. Gu H, Ho P L, Tong E, Wang L and Xu B (2003), " Presenting Vancomycin on Nanoparticles to Enhance Antimicrobial Activities", Nano Letters, 3(9), p. 1261-1263. 15. Kim J S, Kuk E, Yu K N, Kim J H, Park S J, Lee H J, Kim S H, Park Y K, Park Y H, Hwang C Y, Kim Y K, Lee Y S, Jeong D H and Cho M H (2007), " Antimicrobial effects of silver nanoparticles", Nanomedicine, 3(1), p. 95-101. 16. Krithiga N, Rajalakshmi A and Jayachitra A, Green Synthesis of Silver Nanoparticles Using Leaf Extracts of Clitoria ternatea and Solanum nigrum and Study of Its Antibacterial Effect against Common Nosocomial Pathogens. Vol. 2015. 2015. 8. 17. Kuppusamy P, Ichwan S J, Parine N R, Yusoff M M, Maniam G P and Govindan N (2015), " Intracellular @ School biosynthesis of Medicine of Au and and Ag Pharmacy, VNU
42. nanoparticles using ethanolic extract of Brassica oleracea L. and studies on their physicochemical and biological properties", J Environ Sci, 29, p. 151-157. 18. Kuppusamy P, Yusoff M M, Maniam G P and Govindan N (2016), " Biosynthesis of metallic nanoparticles using plant derivatives and their new avenues in pharmacological applications - An updated report", Saudi Pharm J, 24(4), p. 473-484. 19. Li P, Li J, Wu C, Wu Q and Li J (2005), " Synergistic antibacterial effects of β-lactam antibiotic combined with silver nanoparticles", Nanotechnology, 16(9), p. 1912-1917. 20. McCullough A R, Parekh S, Rathbone J, Del Mar C B and Hoffmann T C, A systematic review of the public's knowledge and beliefs about antibiotic resistance-authors' response. J Antimicrob Chemother. 2016 Aug;71(8):2366. doi: 10.1093/jac/dkw163. Epub 2016 May 10. 21. Moghimi S M, Hunter A C and Murray J C (2005), " Nanomedicine: current status and future prospects", Faseb J, 19(3), p. 311-330. 22. Munita J M and Arias C A (2016), " Mechanisms of Antibiotic Resistance", Microbiol Spectr, 4(2), p. 0016-2015. 23. Nam G, Rangasamy S, Purushothaman B and Song J M (2015), " The Application of Bactericidal Silver Nanoparticles in Wound Treatment", Nanomaterials and Nanotechnology, 5, p. 23. 24. Patil M, Anirudh R, Ngabire D and Kim G-D, Green Synthesis of Silver Nanoparticles Using Water Extract from Galls of Rhus Chinensis and Its Antibacterial Activity. Vol. 27. 2016. 1737-1750. 25. Patil M P and Kim G D (2017), " Eco-friendly approach for nanoparticles synthesis and mechanism behind antibacterial activity of silver and anticancer activity of gold nanoparticles", Appl Microbiol Biotechnol, 101(1), p. 79-92. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
43. 26. Poyhonen H, Nurmi M, Peltola V, Alaluusua S, Ruuskanen O and Lahdesmaki T (2017), " Dental staining after doxycycline use in children", J Antimicrob Chemother, 72(10), p. 2887-2890. 27. Radzig M A, Nadtochenko V A, Koksharova O A, Kiwi J, Lipasova V A and Khmel I A (2013), " Antibacterial effects of silver nanoparticles on gram-negative bacteria: influence on the growth and biofilms formation, mechanisms of action", Colloids Surf B Biointerfaces, 102, p. 300-306. 28. Salouti M and Ahangari A, Nanoparticle based Drug Delivery Systems for Treatment of Infectious Diseases. 2014. 29. Schabes-Retchkiman P S, Canizal G, Herrera-Becerra R, Zorrilla C, Liu H B and Ascencio J A (2006), " Biosynthesis and characterization of Ti/Ni bimetallic nanoparticles", Optical Materials, 29(1), p. 95-99. 30. Senthil M and Ramesh C, Biogenic synthesis of Fe3O34 nanoparticles using tridax procumbens leaf extract and its antibacterial activity on Pseudomonas aeruginosa. Vol. 7. 2012. 1655-1661. 31. Seth D, Choudhury S R, Pradhan S, Gupta S, Palit D, Das S, Debnath N and Goswami A (2011), " Nature-inspired novel drug design paradigm using nanosilver: efficacy on multi-drug-resistant clinical isolates of tuberculosis", Curr Microbiol, 62(3), p. 715-726. 32. Shameli K, Ahmad M B, Jazayeri S D, Shabanzadeh P, Sangpour P, Jahangirian H and Gharayebi Y (2012), " Investigation of antibacterial properties silver nanoparticles prepared via green method", Chem Cent J, 6(1), p. 6-73. 33. Shen J M, Gao F Y, Yin T, Zhang H X, Ma M, Yang Y J and Yue F (2013), " cRGD-functionalized polymeric magnetic nanoparticles as a dual-drug delivery system for safe targeted cancer therapy", Pharmacol Res, 70(1), p. 102-115. 34. Singh Malik D, Mital N and Kaur G (2016), " Topical drug delivery systems: a patent review", Expert @ Opin School Ther Pat, of 26(2),Medicine p. 213-228. and Pharmacy, VNU
44. 35. Sun C, Lee J S and Zhang M (2008), " Magnetic nanoparticles in MR imaging and drug delivery", Adv Drug Deliv Rev, 60(11), p. 1252- 1265. 36. Sun R W, Chen R, Chung N P, Ho C M, Lin C L and Che C M (2005), " Silver nanoparticles fabricated in Hepes buffer exhibit cytoprotective activities toward HIV-1 infected cells", Chem Commun, 28(40), p. 5059-5061. 37. Tang L, Wang X, Guo B, Ma M, Chen B, Zhan S and Yao S, Salt- triggered liquid phase separation and facile nanoprecipitation of aqueous colloidal gold dispersion in miscible biofluids for direct chromatographic measurement. Vol. 3. 2013. 15875-15886. 38. Tang L, Wang X, Guo B, Ma M, Chen B, Zhan S and Yao S (2013), " Salt-triggered liquid phase separation and facile nanoprecipitation of aqueous colloidal gold dispersion in miscible biofluids for direct chromatographic measurement", RSC Advances, 3(36), p. 15875- 15886. 39. Taylor E N and Webster T J (2009), " The use of superparamagnetic nanoparticles for prosthetic biofilm prevention", Int J Nanomedicine, 4, p. 145-152. 40. Tran N, Mir A, Mallik D, Sinha A, Nayar S and Webster T J (2010), " Bactericidal effect of iron oxide nanoparticles on Staphylococcus aureus", Int J Nanomedicine, 5, p. 277-283. 41. Trefry J C and Wooley D P (2013), " Silver nanoparticles inhibit vaccinia virus infection by preventing viral entry through a macropinocytosis-dependent mechanism", J Biomed Nanotechnol, 9(9), p. 1624-1635. 42. Zhang L, Gu F X, Chan J M, Wang A Z, Langer R S and Farokhzad O C (2008), " Nanoparticles in medicine: therapeutic applications and developments", Clin Pharmacol Ther, 83(5), p. 761-769. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
45. 43. Zhang L, Li Y, Wang Y, Sajid A, Ahmed S and Li X (2018), " Integration of pharmacokinetic-pharmacodynamic for dose optimization of doxycycline against Haemophilus parasuis in pigs", J Vet Pharmacol Ther, 41(5), p. 706-718. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU