›

Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học vỏ thân cây đinh lăng trổ Polyscias guilfoylei Bail. Họ Nhân Sâm (Araliaceae) - Nguyễn Thị Kim Liên

pdf 78 trang thiennha21 15/04/2022 4670
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học vỏ thân cây đinh lăng trổ Polyscias guilfoylei Bail. Họ Nhân Sâm (Araliaceae) - Nguyễn Thị Kim Liên", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_khao_sat_thanh_phan_hoa_hoc_vo_than_cay_dinh_lang.pdf

Nội dung text: Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học vỏ thân cây đinh lăng trổ Polyscias guilfoylei Bail. Họ Nhân Sâm (Araliaceae) - Nguyễn Thị Kim Liên

  1. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM  Nguyễn Thị Kim Liên KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA HỌC Chuyên ngành : Hóa Hữu Cơ KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VỎ THÂN CÂY ĐINH LĂNG TRỔ Polyscias guilfoylei Bail. Họ Nhân Sâm (Araliaceae) Tp. Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2012 Trang 1
  2. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA HỌC Chuyên ngành : Hóa Hữu Cơ KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VỎ THÂN CÂY ĐINH LĂNG TRỔ Polyscias guilfoylei Bail. Họ Nhân Sâm (Araliaceae) Hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Ánh Tuyết Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Kim Liên Tp. Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2012 Trang 2
  3. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, em xin chân thành cảm ơn: Cảm ơn Cô Nguyễn Thị Ánh Tuyết và thầy Dương Thúc Huy đã theo sát, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, cung cấp kiến thức, động viên em trong suốt thời gian thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp. Được Cô và Thầy hướng dẫn là một may mắn lớn của em trong năm học cuối cùng này tại trường đai học Sư Phạm. Em xin cảm ơn Cô và Thầy! Cảm cô Nguyễn Kim Phi Phụng,đã tạo điều kiện giúp đỡ, đóng góp những ý kiến quí báu để em hoàn thành đề tài của mình. Cảm cô Lê Thị Thu Hương, thầy Nguyễn Thụy Vũ đã cho em những ý kiến, kinh nghiệm quý báu để em hoàn thành đề tài. Cảm ơn tất cả quí Thầy Cô của khoa Hóa đã tận tình dạy dỗ em trong suốt bốn năm qua để em có kiến thức hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình. Cảm ơn bạn tất cả các bạn Nguyễn Vũ Mai Trang, bạn Nguyễn Trần Bảo Huy, bạn Nguyễn Thị Minh Trang, bạn Lê Thị Tú Trinh đã giúp đỡ, chia sẽ cùng tôi những khó khăn, vui buồn trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Cảm ơn ba mẹ đã nuôi nấng, dạy dỗ, là chỗ dựa tinh thần vững vàng nhất giúp tôi vượt qua mọi khó khăn và đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp này. Xin gửi lời chúc tốt đẹp nhất đến mọi người! Trang 3
  4. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN 1 LỜI MỞ ĐẦU 3 Chương 1: TỔNG QUAN 5 1.1 MÔ TẢ THỰC VẬT 5 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 5 1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH 19 Chương 2: THỰC NGHIỆM 24 2.1 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 24 2.2 KHẢO SÁT NGUYÊN LIỆU 24 2.3 ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO 25 2.4 TÁCH CÁC PHÂN ĐOẠN TỪ CAO BUTANOL 28 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT LIEN-Bu1 34 3.2 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT LIEN-Bu2 37 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 47 4.1 KẾT LUẬN 47 4.2 ĐỀ XUẤT 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 A. PHẦN TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 50 B. PHẦN TÀI LIỆU TIẾNG ANH 51 C. PHẦN TÀI LIỆU TRÊN MẠNG INTERNET 53 Trang 4
  5. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU Nước ta là một nước nhiệt đới, nóng ẩm nên nguồn thực vật rất phong phú và đa dạng. Chính sự phong phú , đa dạng đó mà ngành hóa học hợp chất thiên nhiên phát triển rất mạnh mẽ, góp phần rất lớn vào sự phát triển của y học, chăm sóc sức khỏe cho người dân. Từ lâu, dân gian đã biết dùng các loài Đinh lăng để bồi bổ sức khỏe, tăng sức đề kháng cho cơ thể, chống lão hóa, hay điều trị một số bệnh như: nhức đầu, đau tức ngực, ức chế sự phát triển của tế bào ung thư buồng trứng Chính vì các loài Đinh lăng có nhiều hoạt tính sinh học như vậy, nên chúng tôi chọn cây Polyscias guilfoylei Bail., để nghiên cứu. Cây Polyscias guilfoylei Bail., chỉ mới được nghiên cứu sơ bộ về thành phần hóa học, trên lá cây [14, 5] nên chúng tôi quyết định tiếp tục nghiên cứu theo hướng: khảo sát thành phần hóa học trên vỏ thân cây Polyscias guilfoylei Bail. Trang 5
  6. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT TRONG BÀI KHÓA LUẬN s (singlet) : mũi đơn. d (doublet) : mũi đôi. dd (doublet- doublet) : mũi đôi – đôi. m (multiplet) : mũi đa. br s (broad singlet) : mũi đơn rộng. br d (broad doublet) : mũi đôi rộng. J : hằng số ghép. RP – 18 : Reversed Phase C-18 NMR (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) : phổ cộng hưởng từ hạt nhân. DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer) HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence) : tương quan H-C qua 1 nối. HMBC (Heteronuclear Multiplet Bond Coherence) : tương quan H-C qua 2, 3 nối. COSY (COrrelation SpectroscopY) : phổ tương quan giữa proton- proton. C: cloroform; M: metanol; H: nước. Trang 6
  7. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 MÔ TẢ THỰC VẬT. Cây Đinh lăng trổ còn có tên khoa học là Polyscias guilfoylei Bail., họ Nhân sâm (Araliaceae). Cây bụi, cao 3-4m, thân cây ít phân nhánh. Lá đa dạng, lá có màu lục sáng, viền trắng, chia lông chim đều đặn, cuống lá ngắn và to, có sọc hay có đốm, lá chét thuôn, có răng không đều. Vùng phân bố: Cây được trồng khắp mọi nơi ở Việt Nam để làm kiểng và làm hàng rào. Hình 1: Cây Đinh lăng trổ Polyscias guilfoylei Bail. 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC. Chi Polyscias là chi lớn thứ hai trong họ Nhân sâm [24], cho đến nay trên thế giới chỉ có một số loài của chi Polyscias được nghiên cứu thành phần hóa học như: P. filicifolia Bail., P. scutellaria (Burm. f.) Merr., P. amplifolia (Baker) Harms., P. dichroostachya Baker., P. fulva, P. murrayi Harms và Polyscias sp. nov. Trong số này, đặc biệt là loài Polyscias fruticosa (L.) Harms được quan tâm và nghiên cứu rất nhiều về mặt hóa học. Do Polyscias guilfoylei Bail., chưa được nghiên cứu thành phần hóa học ở Việt Nam và trên thế giới. Cho nên chúng tôi xin trình bày thêm thành phần hóa học của một số loài khác thuộc chi Polyscias đã được nghiên cứu ở trong và ngoài nước. 1.2.1 Polyscias amplifolia (Baker) Harms. Năm 2003, Prakash Chaturvedula V. S. và cộng sự [38] đã cô lập từ quả bốn hợp chất là: • Acid 3–O–β–D–galactopyranosyloleanolic (1). • Acid 3–O–β–D–galactopyranosyl-(1 4)-β-D-galactopyranosyloleanolic (2). • Acid 3–O–β–D–galactopyranosyl-(1 4)-β-D-xylopyranosyloleanolic (3). • Acid 3–O–β–D–galactopyranosyl-(1 4)- α–L–arabinopyranosyloleanolic (4). Trang 7
  8. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Các hợp chất này đều thuộc loại saponin có phần aglycon là acid oleanolic. 1.2.2 Polyscias dichroostachya Baker. Năm 1990, Gopalsmy N. cùng cộng sự [25] đã cô lập được bốn hợp chất là: 3– O–α–L–arabinopyranosylhederagenin (5); 3–O–α–L–rhamnopyranosyl-(1 2)–α–L– arabino-pyranosylhederagenin (6); 3–O–β–D–glucopyranosyl-(1 2)–α–L– arabinopyranosylhe-deragenin (7); 3–O–α–L–rhamnopyranosyl-(1 2)–α–L– arabinopyranosylhederagenin– 28–O–β–D–glucopyranosid (8). Các hợp chất này đều thuộc loại saponin có phần aglycon là acid hederagenin. 1.2.3 Polyscias filicifolia Balf. Năm 2007, Nguyễn Thúy Anh Thư và cộng sự [13] đã cô lập được các hợp chất: • Hợp chất steroid: stigmasterol (9); spinasterol (10); 3-O-β-D- glucopyranosylstigmas-terol (11). • Hợp chất phenolic: 3,5,7,3',4'-pentamethoxyflavone (12); 5,4'-dihydroxy-3,7-di-(O- α-L-rhamnopyranosyl)flavone (13). • Hợp chất saponin có aglycon là acid oleanolic: acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)- β-D-glucuronopyranosyloleanolic (14). • Hợp chất triterpenoid: acid oleanolic (15). 1.3.4. Polyscias fulva (Hiern) Harms. Năm 2001, Bedir cùng cộng sự [22] đã cô lập từ phần trên mặt đất các hợp chất: • Các hợp chất saponin có phần aglycon là hederagenin: 3-O-α-L-rhamnopyranosyl -(1 2)-α-L-arabinopyranosylhederagenin (6). 3-O-α-L- rhamnopyranosyl -(1 2)-α-L-arabinopyranosylhederagenin-28-O-α-L- rhamnopyranosyl-(1 4)-β-D-glucopyranosyl-(1 6)-β-D-glucopyranosyl ester (16). • Hợp chất phenolic: 5,7,3',4'-tetrahydroxy-3-O-β-D-glucopyranosylflavone (17). • Hợp chất saponin khác: 12-oxo-3β,16β-20(S)-trihydroxydammar-24-en-3-O-α-L- rham-nopyranosyl-(1 2)-β-D-glucopyranosid (18). Năm 2004, A. C. Mitaine Offer [31]và cộng sự đã cô lập từ phần vỏ thân cây này các hợp chất: Trang 8
  9. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp • Hợp chất steroid: β-sitosterol (19); 3-O-β-D-glucopyranosyl-β-sitosterol (20); 3-O- β-D-glucopyranosylstigmasterol (11). • Hợp chất phenolic: lichexanthon (21). • Hợp chất triterpenoid: acid oleanolic (15); hederagenin (22). • Các hợp chất saponin có phần aglycon là hederagenin: 3-O-α-L-arabinopyranosyl- hederagenin (5); 3–O–α–L–rhamnopyranosyl-(1 2) –α–L– arabinopyranosylhederagenin (6); 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1 2)-α-L-arabinopyranosylhederagenin-28-O-α-L- rha-mnopyranosyl-(1 4)-β-D-glucopyranosyl-(1 6)-β-D-glucopyranosyl ester (16). • Các hợp chất saponin có aglycon là acid oleanolic: acid 3-O-α-L-rhamnopyranosyl- (1 2)-α-L-arabinopyranosyloleanolic (23). • Các hợp chất saponin khác: 3-O-α-L-arabinopyranosylcollinsogenin (24); acid 3-O- α-L-rhamnopyranosyl-(1 2)-α-L-arabinopyranosylechynocystic (25). • Hợp chất ceramid và cerebrosid:(2S,3S,4R,8E)-2-[(2’R)-2’- hydroxypalmitoylamino]-8- octadecen-1,3,4-triol (26); 1-O-β-D-glucopyranosyl- (2S,3S,4R,8E)-2-[(2’R)-2’- hydro-xylpalmitoylamino]-8-octadecen-1,3,4-triol (27). 1.2.5. Polyscias fruticosa (L.) Harm. Năm 1989, Nguyễn Khắc Viện [16] đã nghiên cứu và cho thấy trong rễ có 4% saccarose, một chất kết tinh A chưa xác định cấu trúc hóa học, có điểm sôi trong khoảng 158-161oC, tan nhiều trong cloroform và aceton. Năm 1990, Nguyễn Thới Nhâm và cộng sự [12] đã công bố trong thành phần của rễ, thân và lá có các glycosid, alcaloid, tanin, vitamin B1 và khoảng 20 loại acid amin như arginin, alanin, asparagin, acid glutamic, leucin, lysin, phenylalanin, prolin, threonin, tyrosin, cystein, tryptophan, metionin Năm 1990, Brophy Joseph J. và cộng sự [26] đã dùng phương pháp GC-MS để phân tích thành phần tinh dầu của lá cây mọc ở Fiji và Thái Lan. Kết quả cho thấy trong tinh dầu có khoảng 24 cấu tử, trong đó có 4 chất chính là: β-elemen (28); β- germacren-D (29); E- γ-bisabolen (30) và α-bergamoten (31). Năm 1991, Võ Xuân Minh cùng cộng sự [9] đã khảo sát hàm lượng saponin toàn Trang 9
  10. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp phần trong các bộ phận của cây Đinh lăng với kết quả: rễ (0,49%), vỏ rễ (1,00%), lõi rễ (0,11%) và lá (0,38%). Năm 1992, trong nghiên cứu tiếp theo, Võ Xuân Minh [10] cho biết trong cây Đinh lăng có các alcaloid, glucosid, saponin, các vitamin tan trong nước như B1, B2, B6, C. Nghiên cứu cũng cho thấy rễ cây Đinh lăng có chứa tới 20 acid amin. Năm 1992, Lutomski và cộng sự [29] đã cô lập từ rễ 5 hợp chất thuộc loại hợp chất polyacetylen: (8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol (32); (8E)-heptadeca- 1,8-dien-4,6-diyn-3-ol-10-on (33); (8Z)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol-10-on (34); falcarinol (35) và panaxydol (36). Cũng vào năm 1992, Nguyễn Thị Nguyệt và cộng sự [11] đã cô lập được acid oleanolic (15). Năm 1995, Chaboud A. và cộng sự [17] đã cô lập từ lá một saponin triterpen, đó là acid 3-O-β-D-galactopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyloleanolic (37). Năm 1996, Chaboud A. và cộng sự [18] đã cô lập từ lá khô, một saponin triterpen là acid 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-28-O-β-D- glucopyranosyl-oleanolic (38). Năm 1998, Võ Duy Huấn cùng cộng sự [42] đã cô lập được 11 saponin triterpen: Acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1 4)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic (14); acid 3- O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic (39); Acid 3-O-[β-D- gluco-pyranosyl-(1→2), β-D-glucopyranosyl-(1→4)] -β-D- glucuronopyranosyloleanolic (40); acid 3-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1→2), β-D- glucopyranosyl(1→4)] -β-D-glucurono-pyranosyloleanolic (41); acid 3-O-[β-D- galactopyranosyl-(1→2), β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D- glucuronopyranosyloleanolic (42); 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D- glucuronopyranosyloleanolic-28-O-β-D-glucopyranosyl ester (43); 3-O-[β-D- glucopyra-nosyl-(1→2), β-D-glucopyranosyl-(1→3)] -β-D- glucuronopyranosyloleanolic -28-O-β-D-glucopyranosyl ester (44); 3-O-[α-L- arabinopyranosyl-(1→2), β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-β-D- glucuronopyranosyloleanolic -28-O-β -D-glucopyranosyl ester (45); 3-O-[β-D- Trang 10
  11. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp galactopyranosyl-(1→2), β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucuronopyranosylole- anolic-28-O-β -D-glucopyranosyl ester (46); 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D- glucuronopyranosyloleanolic-28-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl ester (47); 3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2), β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-β-D- glucuro-nopyranosyloleanolic -28-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D- glucopyranosyl ester (48). 1.2.6 Poyscias murrayi Harms. Năm 2004, Malcolm S. Buchanan và cộng sự [30] đã cô lập từ cây Poyscias murrayi Harms. các chất thuộc loại hợp chất phenolic. 3-(4-hydroxyphenyl)propionyl choline (49); acid 3,4-di-O-3-(4- hydroxyphenyl)propio-nyl-1,5- dihydroxycyclohexancarboxylic (50); acid 3,5-di-O-3- (4-hydroxyphenyl)propio-nyl-1,4-dihydroxycyclohexancarboxylic (51); acid 3-(4- hydroxy-phenyl)propanoic (52); acid 3-(3,4dihydrophenyl)propanoic (53); acid 3,5- dicaffeoyl-muco-quinic (54). 1.2.7 Polyscias nodosa (Blume) Seem. Năm 1913, Vander Haar và cộng sự [41] đã cô lập được một hợp chất sapogenin có CTPT C26H44O4, chưa xác định được cấu trúc hóa học. 1.2.8 Polyscias scutellaria (Burm. f.) Merr. Năm 1988, S. Paphassarang và cộng sự [34] đã cô lập được hợp chất 3-O-β-D- glucopyranosyloleanan (55). Năm 1989, S. Paphassarang cùng cộng sự [35, 36] đã cô lập các saponin có aglycon là acid oleanolic: • Acid 3-O-β-D-glucuronopyranosyloleanolic (56). • Acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1 2)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic (39). • Acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1 3)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic (57). 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1 3)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic-28-O-β-D- glucopyranosyl ester (58) và acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1 2)-β-D- glucopyranosyl-(1 4)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic (40). Trang 11
  12. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Năm 1990, S. Paphassarang cùng cộng sự [37] đã cô lập từ lá thêm hai hợp chất saponin là: acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic (39) và 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D- glucuronopyrano-syloleanolic-28-O-β-D-glucopyranosyl ester (44). Đến năm 2008, Nguyễn Thị Thúy Hằng [3] cũng cô lập từ cây này mọc ở Việt Nam các hợp chất: stigmasterol (9); spinasterol (10); 3-O-β-D- glucopyranosylstigmasterol (11); 3,5,7,3',4'-pentamethoxyflavone (12); 3-O-β-D- glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucuro-nopyranosyloleanolic-28-O-β-D-glucopyranosyl ester (43) và 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic-28-O- methyl ester (59). 1.2.9 Polyscias sp. nov. Năm 1991, M. Lussignol và cộng sự [28] đã cô lập được từ lá một hợp chất: 5,7,3',4'-tetrahydroxy-3-O-β-D-glucopyranosylflavone (17). 1.2.10 Polyscias balfouriana Bail. Năm 2007, Nguyễn Thị Ánh Tuyết và cộng sự [32] đã tách từ lá cây được 12 chất: 5-hydroxymethylfurfural (60); stigmasterol (9); spinasterol (10); 3-O-β-D- glucopyrano-sylstigmasterol (11); 3-O-β-D-glucopyranosylspinasterol (61); acid oleanolic (15); acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranosyloleanolic (62); 5,3'-dihydroxy-4'-metho-xy-3,7-di-(O-α-L-rhamnopy-ranosyl)flavone (63); acid 3-O- β-D-glucopyranosyl-(1 3)-6'-O-methyl-β-D-glucuronopyranosyloleanolic (64); acid 3-O-β-D-glucopyranosyl→-(1 4)-6'-O-methyl-β-D-glucuronopyranosyloleanolic (65); acid 3-O-β-D-glucopyrano-→syl-(1 4)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic (14); 3-O-β- D-glucopyranosyl (1 4)-β-D-glucu→ ronopyranosyloleanolic-28-O-β-D-glucopyranosyl ester (43). → Năm 2010, Nguyễn Thị Ánh Tuyết, và cộng sự [33] đã tách từ rễ cây được 3 hợp chất saponin: acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1 3)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic (58); acid 3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)→, β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-β-D- glucurono-pyranosyloleanolic (40); acid 3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2), β-D- glucopyranosyl-(1→3),β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-β-D-glucuronopyranosyloleanolic Trang 12
  13. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp (66). 1.2.11 Polyscias guilfoylei Bail Năm 2009, Nguyễn Thị Ánh Tuyết đã cô lập được 7 hợp chất từ lá cây Polyscias guilfoylei Bail[14]. Acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→4) -β-D- glucuronopyra-nosyloleanolic (60); acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1 4)-β-D- glucuronopyranosyl-oleanolic (14); acid oleanolic (15); 3-O-β-D-glucopyranosyl- (1→4)-β-D-glucuronopyra-nosyloleanolic-28-O-β-D-glucopyranosyl ester (43); acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D- glucuronopyranosyloleanolic (67); acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1 3)-β-D- glucuronopyranosyloleanolic (58); acid 3-O-β-D-glucuro-nopyranosyloleanolic (56). Trang 13
  14. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp 1.2.12 CÔNG THỨC CÁC HỢP CHẤT. H3C CH3 H3C CH3 CH CH COOH CH3 CH3 COOH 3 3 OH OH OH O OH OH H CH3 H CH3 O HO O H O HO O O O OH H HO H H3C CH3 OH H3C CH3 (1) (2) CH3 CH3 H3C H3C CH3 CH3 COOH CH3 CH3 COOH OH HO H CH O H CH 3 O 3 HO OH O O OH O OH O O O HO H HO H H3C CH3 H3C CH3 HO OH OH OH (4) (3) H3C CH3 H3C CH3 CH3 CH3 COOH CH3 CH3 COOH OH OH H CH3 H CH3 O O O O H HO O H H H C OH H3C O 3 CH2OH CH2OH H3C O (5) HO HO OH (6) CH3 CH3 H3C H3C OH CH3 CH3 COOH CH3 CH3 COO O H HO O O H CH3 OH H CH3 O O HO OH O HO HO O HO O OH H H H3C H3C HO CH2OH O CH2OH HO H3C O (7) HO HO OH (8) H3C H3C CH CH 3 H 3 H CH3 H CH3 H H H H HO HO (9) (10) Trang 14
  15. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp OCH3 OCH3 H3C CH H CO O 3 H 3 CH3 H OCH3 O CH O H H 3 OH O O (12) HO HO OH (11) OH CH3 H3C O O H3C O HO CH3 CH3 COOH HO OH O OH O H3C O OH H CH3 HO HOOC O HO O O O OH HO HO HO H H3C CH3 (13) OH OH (14) CH3 CH3 H3C H3C CH3 CH3 COOH CH3 CH3 COO O H CH3 OH H CH3 O OH O HO O HO O H H H C H C 3 O 3 HO OH HO CH3 CH2OH HO H3C O HO (15) HO HO OH O H3C O HO HO OH (16) OH CH HO 3 OH O HO O CH CH 3 3 OH OH O O HO CH3 HO OH O O O HO H O O H C 3 O H C CH OH HO 3 2 HO HO OH HO (17) (18) H C H3C 3 CH CH3 3 H H CH3 H CH3 H OH H H H H O HO O HO HO (19) OH (20) Trang 15
  16. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp OH CH3 O H3C H3CO O OCH3 (21) CH3 CH3 COOH H CH3 HO H H3C CH2OH (22) CH3 H3C CH3 H3C CH3 CH3 COOH CH3 CH3 COOH OH OH H CH3 CH3 O OH O HO O H H3C O O CH3 HO H3C CH2OH H3C O HO HO HO OH (24) (23) H3C CH3 O H N 6 OH CH3 CH3 COOH OH HO OH OH CH3 6 O HO HO O H C CH O 3 3 (26) H3C O HO HO OH (25) O H N 6 OH OH OH HO O HO O OH 6 HO (27) (28) (29) (30) HO O Trang 16
  17. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp (31) (33) OH OH O OH (32) (34) OH OH O (35) (36) CH3 CH3 H3C H3C CH3 CH3 COOH CH3 CH3 COO OH OH O H CH3 H CH3 O O HO OH HO O O O HO HO OH H H OH H3C H3C O H3C CH3 OH CH3 O HO HO O HO HO HO OH OH (38) (37) CH3 CH3 H3C H3C CH3 CH3 COOH CH3 CH3 COOH OH H CH3 HOOC H CH3 O HOOC HO O HO O O O HO HO O OH H HO OH H3C H CH3 HO O H3C O O CH3 HO O HO HO HO OH OH (39) (40) CH3 CH3 H3C H3C CH3 CH3 COOH CH3 CH3 COOH OH H CH3 HOOC H CH O OH 3 HO O HOOC HO O O HO O O OH H HO HO O OH H C O O 3 CH HO H O 3 H C HO O 3 CH OH O 3 HO HO OH OH (41) HO (42) CH3 H3C O CH3 CH3 C O OH H CH3 O HOOC O HO O HO HO O O HO OH H OH H3C CH3 OH HOHO (43) Trang 17
  18. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp CH3 H3C CH3 CH3 COO O OH H CH3 HOOC HO OH O H O HO O O O HO H H C HO O 3 CH HO OH HO O 3 OH HOHO (44) CH3 H3C CH3 CH3 COO OH O HOOC HO O H CH3 O HO OH HO O HO OH O OH O O H H3C HO CH3 HO HO OH (45) CH3 H3C CH3 CH3 COO O HO HOOC H CH3 O O HO OH HO HO O O HO OH OHH O O H O H3C HO CH3 HO HO OH (46) CH3 H3C CH3 CH3 COO O OH HO H CH3 HOOC OH HO O O HO O O HO HO O H OH H H C 3C CH 3 O OH 3 HO HO OH (47) CH3 H3C CH3 CH3 COO OH O HO HOOC H CH HO O 3 OH O HO O HO HO O HO O OH O O H H3C H C O CH3 3 HO HO HO OH HO OH (48) Trang 18
  19. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp O O OH N HO O O HO HO O HO O (49) OH O (50) O OH O O HO OH OH HO O HO HO O O OH OH O OH (52) (53) (51) O OH CH3 H3C OH HO HO O OH O O OH CH3 CH3 O OH (54) OH H CH3 HO O O HO H H3C CH OH 3 (55) CH3 H3C CH3 CH3 COOH H CH3 HOOC O O HO HO H H 3C CH OH 3 (56) CH3 H3C CH3 CH3 COOH H CH3 HO HOOC O O O HO O H H HO 3C CH HO OH 3 OH (57) CH3 H3C CH3 CH3 COO O H CH3 OH HO HOOC O HO O O HO O H H HO 3C CH HO HO OH 3 OH OH (58) Trang 19
  20. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp CH3 H3C CH3 CH3 COOCH3 OH H CH3 HOOC O O O O HO HO HO H H3C CH3 OH OH (59) H3C CH 3 H O CH3 HO O OH H H (60) O HO O HO OH (61) CH3 H3C OH O O OCH3 H3C O CH CH COO 3 3 HO O HO O OH OH HO H H CH3 OH O O O HO H3C O HO O HO H OH HO OH H C 3 HO CH3 OH (62) (63) CH3 CH3 H3C H3C CH3 CH3 COOH CH3 CH3 COOH OH OH H CH O OCH3 H CH3 O OCH3 3 C HO O C O O HO O O HO HO O O HO O HO H OH H H3C H3C OH CH3 CH3 OH OH (64) (65) CH3 H3C CH3 CH3 COOH OH O HO H CH3 HO HOOC O O O OH O HO O H H 3C CH O 3 O OH HO HOHO OH HOHO (66) Trang 20
  21. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp CH3 H3C CH3 CH3 COOH OH O HO H CH3 HO HOOC O O O OH O HO O H H3C CH OH 3 OH HOHO (67) 1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH Theo tài liệu tham khảo, chỉ tìm thấy một nghiên cứu về dược tính trên cây Polyscias guilfoylei Bail., đó là nghiên cứu trên lá tươi: dịch trích nước và dịch trích diclorometan của lá cây Polyscias guilfoylei Bail., có khả năng quyến rũ ruồi trái cây[1]. Chính vì cây Polyscias guilfoylei Bail., chưa được nghiên cứu nhiều nên chúng tôi xin trình bày thêm dược tính của một số cây khác cùng chi. Theo bác sĩ Huỳnh Ngọc Tựng [15] , các loài cây Đinh lăng được trồng ở Việt Nam đều dùng làm thuốc được. Tuy nhiên, có một số loài cây Đinh lăng vẫn chưa tìm thấy tài liệu nghiên cứu một cách cụ thể về dược tính. Trong số các cây thuộc chi Polyscias nêu trên thì cây Đinh lăng Polyscias fruticosa (L.) Harms được nghiên cứu nhiều nhất về thành phần hóa học cũng như dược tính. Bên cạnh đó cũng có một số nghiên cứu về dược tính trên các cây P. filicifolia, P. guilfoylei, P. scutellaria, P. amplifolia, P. dichroostachya, P. fulva và P. murrayi. 1.3.1 Polyscias fruticosa (L.) Harms. Các thí nghiệm trên chuột cho thấy cây Polyscias fruticosa có khả năng làm tăng tiết niệu gấp trên năm lần so với bình thường, làm tăng sức đề kháng của chuột đối với các bức xạ siêu cao tầng, kéo dài thời gian sống của chuột bị nhiễm ký sinh trùng sốt rét Plasmodium berghei, làm tăng tác dụng của thuốc chống sốt rét cloroquin [3, 8]. Thực nghiệm trên người cho thấy, cây Polyscias fruticosa làm tăng khả năng chịu đựng của bộ đội, vận động viên thể thao [6], khác với Nhân sâm, Polyscias fruticosa không làm tăng huyết áp [2,8]. Năm 1985, Ngô Ứng Long và cộng sự [7] đã nghiên cứu độc tính của Đinh lăng cho thấy liều gây chết LD50 của Đinh lăng theo đường tiêm phúc mạc là 32,9 g/ 1kg Trang 21
  22. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp chuột. Kết quả cho thấy với liều uống hàng ngày 60 g/1kg, sau 3 ngày có hiện tượng chuột chết, như vậy, Đinh lăng là thuốc ít độc. Nếu so sánh với Nhân sâm về giá trị LD50 cùng đường tiêm phúc mạc thì Đinh lăng ít độc kém 3 lần. Đinh lăng giúp cơ thể người bị suy mòn nhanh chóng hồi phục, ăn ngon, ngủ tốt . Dùng Đinh lăng nấu nước uống hàng ngày như thuốc bổ. Các hợp chất polyacetylen như (8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol trích được từ cây Panax vietnamensis và Polycias fruticosa cho thấy có hoạt tính kháng chủng khuẩn Gram dương, kháng nấm Candida albican nhưng không kháng được chủng khuẩn Gram âm. Năm 2001, Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự [4] đã dùng chuột nhắt trắng để thử nghiệm tác dụng chống trầm cảm và stress của Polyscias fruticosa. Kết quả cho thấy cao Polyscias fruticosa có tác dụng chống trầm cảm và phục hồi thời gian ngủ bị rút ngắn bởi stress, ở liều 45-180 mg/kg thể trọng, khoảng liều này cũng có tác dụng khác như tăng lực, kích thích hoạt động của não bộ và nội tiết, tăng sức đề kháng của cơ thể, chống viêm và xơ vữa động mạch. Một số bài thuốc dân gian từ cây Polyscias fruticosa: Chữa mệt mỏi, biếng hoạt động: Rễ Đinh lăng phơi khô thái mỏng, 0,50g thêm 100 ml nước, đun sôi trong 15 phút, chia 2-3 lần uống trong ngày. Chữa sốt lâu ngày, nhức đầu, háo khát, ho, đau tức ngực, nước tiểu vàng: Đinh lăng tươi (rễ, cành) 30g, lá hoặc vỏ chanh 10g, vỏ quýt 10g, lá tre tươi 20g, cam thảo đất 30g, rau má tươi 30g, me chua đất 20g. Các vị cắt nhỏ, đổ ngập nước, sắc đặc lấy 250ml, chia uống 3 lần trong ngày. Lợi sữa: Lá Đinh lăng tươi 50 – 100g, bong bóng lợn 1 cái, băm nhỏ, trộn với gạo nếp, nấu cháo ăn. Hoặc rễ Đinh lăng tươi 30 - 40g, thêm 500ml nước, sắc còn 250ml, uống nóng, ngày uống 1-2 lần, uống trong 2 – 3 ngày. Chữa đau tử cung: Cành và lá Đinh lăng sao vàng, sắc uống như chè. Chữa mẫn ngứa do dị ứng: Lá Đinh lăng 80g, sao vàng, sắc uống, dùng trong 2 -3 tháng. Lá Đinh lăng phơi khô đem lót gối hoặc trải giường cho trẻ em nằm giúp phòng bệnh kinh giật Trang 22
  23. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Gần đây, năm 2012 TS. Lê Thanh Hưng, khoa Sinh, trường ĐH Khoa học Tự nhiên,ĐH Quốc gia TPHCM, người trực tiếp nghiên cứu cho biết, đinh lăng là cây thuốc quý. Lá, vỏ thân cây, đặc biệt là rễ có thể dùng để làm thuốc: Rễ đinh lăng có chứa rất nhiều chất như gluxit, vitamin B1, B2, B6, 20 axit amin đặc biệt là chất saponin tương tự như nhân sâm, có tác dụng làm tăng miễn dịch cơ thể, chống lão hóa, tăng cường tuần hoàn não, giúp ngon giấc, làm tăng sức đề kháng cho cơ thể. Và đã thực hiện một nghiên cứu là điều chế ra “bia dinh dưỡng”, bia có vị thơm giống bia bình thường được bán ngoài thị trường. Điều đặc biệt của loại bia này là bia được bổ sung nhiều chất dinh dưỡng như saponin, khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin B1, B2, B6 và nhiều axit amin [43] 1.3.2 Polyscias amplifolia (Baker) Harms. Chaturvedula v.s.prakash và cộng sự [38] đã cho biết ba hợp chất từ quả là: acid 3-O-β-D-galactopyranosyloleanolic; acid 3-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-β-D- galactopy-ranosyloleanolic và acid 3-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-α-L- arabinopyranosyl-oleanolic có hoạt tính ức chế sự phát triển dòng tế bào ung thư buồng trứng A2780 ở người. 1.3.3 Polyscias balfouriana Bail. Theo Phan Quốc Kinh [44], thực phẩm chức năng với tên thương mại là CERATO, có bán trên thị trường với thành phần chứa là cao Tật lê, cao Dâm dương hoắc và cao Đinh lăng lá tròn (Polyscias balfouriana) có tác dụng giúp nam giới bồi bổ sức khỏe, nâng cao thể trạng, giảm đau mỏi lưng gối, ù tai, di tinh, mộng tinh. Sản phẩm này đã được Công ty cổ phần dược vật tư y tế Thành Vinh nghiên cứu và sản xuất dựa vào công thức của Genix (sản phẩm được sử dụng rộng rãi ở Bắc Mỹ và Tây Âu), nhưng cải biến một thành phần của Genix để CERATO có hoạt Hình 2: Thực phẩm tính cao hơn, mạnh hơn, đó là thay thế cao Đinh Lăng - chức năng CERATO Polyscias fruticosa bằng cao Đinh Lăng lá tròn - Polyscias balfouriana. Trang 23
  24. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Dịch trích butanol của lá và rễ cây Polyscias balfouriana đều có tác dụng chống loét khi thử nghiệm trên chuột, trong đó, dịch trích butanol từ lá có tác dụng mạnh hơn dịch trích từ rễ [39]. 1.3.4 Polyscias filicifolia Bail. Dịch trích từ sinh khối của tế bào cây Polyscias filicifolia có khả năng kháng rất mạnh chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus và kháng yếu với 3 chủng: Micrococcus flavus, Streptococcus pyogenes và Streptococcus agalatiae [21, 23]. Dịch trích 40% etanol từ sinh khối của những tế bào nuôi cấy của cây Polyscias filicifolia áp dụng lên giống Salmonella typhimurium TA 98 và TA 100 cho hoạt tính mạnh về kháng đột biến gen [20]. Rượu thuốc từ cây Polyscias filicifolia có tác dụng bảo vệ và phục hồi quá trình tổng hợp protein khi tim heo thiếu oxygen [27]. 1.3.5 Polyscias murrayi Harms. Một số dẫn xuất của acid 3-(4-hydroxyphenyl)propanoic được cô lập từ cây Polyscias murrayi như 3-(4-hydroxyphenyl)propionylcholine; acid 3,4 -di-O-3- (4- hydro-xyphenyl)-1,5-dihydroxypropionylcyclohexancarboxylic; acid 3,5-di-O-3-(4- hydroxy-phenyl)-1,4-dihydroxypropionylcyclohexancarboxylic và acid 3-(4-hydro- xyphenyl) propanoic có khả năng ức chế hoạt tính xúc tác của men Itk (interleukin-2- inducible T-cell) [30]. 1.3.6 Polyscias scutellaria Merr. Cao trích có chứa saponin của cây Polyscias scutellaria áp dụng trên chuột albino cho thấy có khả năng làm vết thương nhanh lên da non [19]. Trang 24
  25. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Chương 2 : THỰC NGHIỆM 2.1 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ. 2.1.1 Hóa Chất. o - Dung môi: clorofom, metanol, alcol 95 , ete dầu hỏa, butanol. - Silica gel: silica gel 60, 0.04 – 0.06 mm, Merck dùng cho sắc kí cột. - Silica gel pha đảo, RP – 18, Merck dùng cho sắc kí cột. - Sắc kí bản mỏng loại 25D – Alufolien 20 x 20, Kiesel gel 60F254, Merck. - Sắc kí bản mỏng loại 25DC, RP – 18, Merck. - Thuốc thử hiện hình sắc kí bản mỏng: H2SO4 đặc. 2.1.2 Thiết Bị - Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu. - Cột sắc kí. - Máy cô quay chân không Heidolph, máy sấy. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR được thực hiện trên máy cộng hưởng từ hạt nhân BRUKER AC.500, tần số cộng hưởng 500MHz. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR kết hợp kỹ thuật DEPT được thực hiện trên máy cộng hưởng từ hạt nhân BRUKER AC.500, tần số cộng hưởng 125MHz. - Phổ LC–MS được ghi trên máy sắc ký lỏng ghép khối phổ LCQ – FINIGANT, cột nhồi ADSERBPHERE UHF C18. Tất cả phổ được ghi tại phòng phân tích cấu trúc, Viện Hóa Học - Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, 18 - Hoàng Quốc Việt, quận Cầu Giấy, Hà Nội. 2.2 KHẢO SÁT NGUYÊN LIỆU. 2.2.1 Thu hái và xử lí mẫu Cây Đinh lăng trổ Polyscias guilfoylei Bail., được thu hái tại tỉnh Khánh Hòa vào tháng 7 năm 2011, được định danh bởi ThS. Liêu Hồ Mỹ Trang, Bộ môn Hóa Thực vật, trường Đại học Y Dược TP. HCM. Vỏ cây tươi sau khi thu hái, loại bỏ những vỏ sâu bệnh, rửa sạch, để ráo, sấy khô, nghiền nhuyễn thành bột, được sử dụng cho phần nghiên cứu. Trang 25
  26. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp 2.2.2 Xác định độ ẩm Độ ẩm của cây được xác định theo công thức Trọng lượng tươi – Trọng lượng khô Độ ẩm (%) = x 100 Trọng lượng tươi Mẫu cây tươi sau khi làm sạch được sấy khô ở nhiệt độ 60 – 65oC đến khi khối lượng không đổi, thực hiện 3 lần, so sánh lượng vỏ rễ và vỏ thân tươi và khô, suy ra độ ẩm trung bình của mẫu. Mẫu cây tươi sau khi làm sạch được sấy khô ở nhiệt độ 60 – 65oC đến khi khối lượng không đổi, thực hiện 3 lần, so sánh lượng vỏ thân tươi và khô, suy ra độ ẩm trung bình của mẫu. Bảng 1: Độ ẩm của các bộ phận cây Polyscias guilfoylei Bail. Mẫu cây Trọng lượng tươi (g) Trọng lượng khô (g) Độ ẩm (%) Vỏ thân 3621 1442 49.80 2.3 ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO. 2.3.1 Điều chế cao etanol. Sử dụng phương pháp ngâm dầm ở nhiệt độ phòng để điều chế các cao etanol. 0 Bột khô của vỏ thân được ngâm dầm bằng dung môi etanol 95 trong 24 giờ. Sau đó lọc, lấy dịch trích, thu hồi dung môi. Tiếp tục thực hiện nhiều lần cho đến khi lượng cao thu được không đáng kể, thu được cao etanol của vỏ thân cây. 2.3.2 Điều chế cao hexan và cao butanol. Lấy phần cao etanol đem tiến hành chiếc lỏng -lỏng với hexan, sau đó đem thu hồi dung môi ta thu được cao hexan, sau đó tiếp tục chiếc lỏng - lỏng với butanol, sau đó thu hồi dung môi thu được cao butanol . Quá trình điều chế các cao được trình bày trong sơ đồ 1. Sơ đồ 1: Sơ đồ điều chế các cao trong vỏ thân cây đinh lăng trổ Bột vỏ khô 1.44Trang kg 26
  27. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp -Ngâm, tận trích bằng etanol -Lọc, cô quay thu hồi dung môi -Chiết lỏng – lỏng với hexan - Lọc cô quay thu hồi dung môi - Chiết lỏng-lỏng với butanol -Lọc ,cô quay thu hồi dung môi Cao butanol (20.90 g) Trang 27
  28. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Tiến hành chấm sắc kí bản mỏng và kết quả như hình sau: Chấm sắc kí bản mỏng cao butanol và cao hexan với hệ phân cực thấp 100% Cloroform, kết quả thu được như sau. Hình 3: Sắc kí bản mỏng cao hexan và cao butanol H: cao hexan, Bu: cao butanol Chấm sắc kí bản mỏng cao butanol và cao hexan với hệ phân cực cao hơn C:M 4:1 , kết quả thu được như sau: Hình 4. Sắc kí bản mỏng cao hexan và cao butanol. Nhận xét: Khi chấm sắc kí bản mỏng với hệ phân cực thấp thì cao hexan hiện các vết rõ, cao butanol thì vết không hiện được. Trang 28
  29. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Khi chấm sắc kí bản mỏng với hệ phân cực cao hơn C:M 4:1 thì cao hexan các vết bị đẩy lên cao, còn cao butanol các vết trải dài ra. Theo tài liệu tham khảo thì phần lớn các hợp chất hiện diện trong chi Polyscias là saponin thường nằm trong cao butanol. Bên cạnh đó cũng tiến hành khảo sát cao hexan nhưng kết quả thu được là β- stigmasterol, các acid béo và dầu béo. Từ đó chúng tôi quyết định khảo sát cao butanol. 2.4 TÁCH CÁC PHÂN ĐOẠN TỪ CAO BUTANOL Sắc kí cột silica gel áp dụng cho 20.90 g cao butanol giải ly bằng các hỗn hợp dung môi có độ phân cực tăng dần. Dịch giải ly từ cột sắc kí được hứng vào các bình tam giác 500ml. Sau đó, dùng máy cô quay thu hồi dung môi, phần cao thu được đựng vào các hủ bi. Dùng sắc kí bản mỏng để kiểm tra phần cao thu được, những phần giống nhau gôm lại thành một phân đoạn. Kết quả được 6 phân đoạn (I-VI), các phân đoạn được trình bày trong sơ đồ 2 và bảng 2. Sơ đồ 2: Các phân đoạn được tạo thành từ cao butanol Cao butanol 20.90 g + Sắc kí cột silica gel. + Giải ly C : M + Cô quay thu hồi dung môi. I II V VI III IV (1.34g) (1.20g) (5.20 g) (1.45 g) (2.50g) (5.28 g) 2.4.1 Sắc kí cột silica gel cho phân đoạn III ( sơ đồ 2). Sắc kí cột silica gel áp dụng cho phân đoạn III (2.50g), giải ly bằng các hỗn hợp dung môi có độ phân cực tăng dần. Dịch giải ly từ cột sắc kí được hứng vào các bình tam giác 250ml. Sau đó, dùng máy cô quay thu hồi dung môi, phần cao thu được đựng vào các hủ bi. Dùng sắc kí bản mỏng để kiểm tra phần cao thu được, những phần Trang 29
  30. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp giống nhau gôm lại thành một phân đoạn. Kết quả được 4 phân đoạn (III.1-III.4), các phân đoạn được trình bày trong bảng 3. Phần cao thu được từ phân đoạn III.2 có khối lượng(1.10g) . Sau đó tiếp tục sắc kí cột silica gel nhiều lần, giải ly bằng hệ dung môi có độ phân cực tăng dần. Kết quả thu được chất bột màu trắng (17mg). Kiểm tra bằng sắc kí bản mỏng với hệ dung môi C : M (4 : 1) cho một vết rõ, màu tím, Rf = 0.45. Hợp chất này được kí hiệu là LIEN- Bu1. 2.4.2 Sắc kí cột silicagel cho phân đoạn V (bảng 2). Sắc kí bản mỏng cho phân đoạn V có khối lượng (5.20 g) thu được trong cao butanol cho thấy có vết màu tím và vết rõ. Tiến hành sắc kí cột silica gel áp dụng cho 5.20g của phân đoạn V, giải ly bằng các hỗn hợp dung môi có độ phân cực tăng dần. Dịch giải ly từ cột sắc kí được hứng vào các bình tam giác 500ml. Sau đó, dùng máy cô quay thu hồi dung môi, phần cao thu được đựng vào các hủ bi. Dùng sắc kí bản mỏng để kiểm tra phần cao thu được, những phần giống nhau gôm lại thành một phân đoạn. Kết quả được 5 phân đoạn ( V.1-V.5), các phân đoạn được trình bày trong bảng 4. 2.4.2.1 Sắc kí cột pha đảo cho phân đoạn V.3 ( bảng 4). Tiến hành sắc kí bản mỏng pha thường cho phân đọan V.3 có khối lượng 2.60 g, với hệ dung môi giải ly C:M:H (7:3:0.5) cho thấy vết tách không rõ (hình 5). Hình 5: Sắt kí bản mỏng pha thường cho phân đoạn V.3 Trang 30
  31. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Tiến hành sắc kí bản mỏng pha đảo cho phân đọan V.3 có khối lượng 2.60 g, với hệ dung môi giải ly M:H (7:3) cho thấy vết tách rõ (hình 6). Hình 6: Sắt kí bản mỏng pha đảo cho phân đoạn V.3 Từ kết quả trên, tiến hành sắc kí cột silica gel pha đảo RP – 18 cho phân đoạn V.3 (2.60 g), giải ly bằng hệ dung môi M : H (1 : 1). Kết quả thu được 4 phân đoạn (V.3.1- V.3.4), được trình bày ở bảng 5. 2.4.2.2 Sắc kí cột pha đảo cho phân đoạn V.3.3 ( bảng 5). Tiếp tục sắc kí cột silica gel pha đảo cho phân đoạn V.3.3 có khối lượng 0.65g , giải ly bằng hệ dung môi M:H (1:1). Kết quả thu được 3 phân đoạn ( V.3.3.1-V.3.3.3), được trình bày trong bảng 6. 2.4.2.4 Sắc kí cột silica gel cho phân đoạn V.3.3.2 ( bảng 6). Phần cao thu được từ phân đoạn V.3.3.2 có khối lượng (0.25 g). Sau đó tiếp tục sắc kí cột silica gel nhiều lần, giải ly bằng hệ dung môi có độ phân cực tăng dần. Kết quả thu được chất bột màu trắng (36mg). Kiểm tra bằng sắc kí bản mỏng với hệ dung môi C : M : H (7:3:0.5) cho một vết rõ, màu tím, Rf = 0.25. Hợp chất này được kí hiệu là LIEN-Bu2. Trang 31
  32. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Bảng 2: Sắc kí cột silica gel trên cao butanol (20.90 g). Phân Dung môi Trọng lượng Kết quả Ghi chú đoạn giải ly cao (g) sắc kí bản mỏng I 100% C 1.34 g Vết không rõ Chưa khảo sát C:M II 1.20 g Vết không rõ Chưa khảo sát 19:1 C:M Khảo sát thu được III 2.50 g Vết rõ 9:1 LIEN-Bu1(17 mg) C:M Sv.Nguyễn Trần IV 5.28 g Vết rõ (4:1) Bảo Huy khảo sát C:M Khảo sát thu được V 5.20 g Vết rõ (7:3) LIEN-Bu2(36 mg) C:M:H VI 1.45 g Vết không rõ Chưa khảo sát (7:3:0.5) Ghi chú: C: cloroform, M: methanol, H: nước Bảng 3: Sắc kí cột silicagel cho phân đoạn III (2.50g). Phân Dung môi Trọng lượng Kết quả sắc kí Ghi chú đoạn giải ly cao (g) bản mỏng C:M III.1 0.50 g Vết không rõ ràng Chưa khảo sát 9:1 C:M Khảo sát thu III.2 1.10 g Vết tím còn dơ rất ít 4:1 được LIEN-Bu1 C:M Vết vàng lẫn nhiều III.3 0.20 g Chưa khảo sát 4:1 vết dơ C:M III.4 0.120 g Vết không rõ ràng Chưa khảo sát 7:3 Trang 32
  33. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Bảng 4: Sắc kí cột silica gel cho phân đoạn V (5.20g). Trọng Phân Dung môi Kết quả sắc kí bản lượng cao Ghi chú đoạn giải ly mỏng (g) C:M V.1 0.30g Vết không rõ ràng Chưa khảo sát 4:1 C:M Có vết màu tím kèm V.2 0.70g Chưa khảo sát 7:3 theo nhiều vết dơ C:M:H Khảo sát thu V.3 2.60g Có vết tím rõ ràng 7:3:0.5 được LIEN-Bu2 C:M:H V.4 0.25g Vết không rõ ràng Chưa khảo sát 3:2:0.2 C:M V.5 0.12g Vết không rõ ràng Chưa khảo sát (1:1) Bảng 5: Sắc kí cột pha đảo cho phân đoạn V.3 (2.60g). Trọng Phân Dung môi Kết quả sắc kí bản lượng cao Ghi chú đoạn giải ly mỏng (g) M:H V.3.1 0.25g Vết không rõ ràng Chưa khảo sát 2:3 M:H Vết tím không rõ ràng V.3.2 0.15g Chưa khảo sát 1:1 M:H Vết tím rõ ràng Khảo sát thu V.3.3 0.65g 1:1 được LIEN-Bu2 M:H V.3.4 0.11g Vết không rõ ràng Chưa khảo sát 3:2 Trang 33
  34. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Bảng 6: Sắc kí cột pha đảo cho phân đoạn V.3.3 (0.65g). Dung môi Trọng lượng Kết quả sắc kí Phân đoạn Ghi chú giải ly cao (g) bản mỏng M:H V.3.3.1 0.10 g Vết không rõ Chưa khảo sát 1:1 M:H Khảo sát thu V.3.3.2 0.25 g Vết rõ 1:1 được LIEN-Bu2 M:H Nhiều vết chồng V.3.3.3 0.08 g Chưa khảo sát 7:3 lên nhau Trang 34
  35. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT LIEN-Bu1. Hợp chất LIEN-Bu1 thu được từ phân đoạn III.2 của vỏ thân cây Polyscias guilfoylei Bail có những đặc điểm sau: - Chất bột vô định hình màu trắng. - Phổ 1H-NMR ( phụ lục 1) cho thấy: δppm: 4.31 ( -O-CH-O, d, J=7.5 Hz); 5.44 (=CH-, dt, J=5.0/2.5 Hz); 1.35-1.31 (-CH2-); 0.92 (-CH3, t, J=7.0 Hz). - Phổ 13C-NMR ( phụ lục 2) cho thấy: δppm: 177.1 (>C=O); 131.5; 131.3 (=CH-); 78.0-71.5 (>CH-O-); 51.6 (>CH-N); 62.6 (-CH2-OH); 35.7-23.7 (-CH2-); 14.4 (-CH3). - Phổ COSY, HSQC, HMBC (phụ lục 4, 5, 6). BIỆN LUẬN CẤU TRÚC: Phổ 1H-NMR và HSQC ( phụ lục 1, 5) cho thấy ) cho thấy có một proton anomer ở δ 4.31 (d, J = 7.5 Hz) tương ứng với carbon anomer có δC 104.6 ppm, như vậy trong cấu trúc của hợp chất LIEN-Bu1 có một phân tử đường. 1 Ngoài ra trong phổ H-NMR còn xuất hiện hai proton olefin tại δH 5.44 ( dt, J=5.0/2.5 Hz), các proton của nhóm metylen –CH2- cộng hưởng trong vùng (δH 1.35- 1.31 ppm) và 6 proton của hai nhóm metyl –CH3 nằm cuối mạch dài cộng hưởng ở vùng δH 0.92 (t, J = 7.0 Hz). Phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT-NMR, (phụ lục 2,3) cho thấy hợp chất này có một carbon tứ cấp >C=O amid (δC 177.1 ppm), một carbon đặc trưng cho C-N (δC 51.6 ppm) hai carbon olefin –CH= (δC 131.5 và 131.3 ppm), 7carbon loại >CH-O- (δC 78.0 -71.5 ppm), một carbon loại –CH2-OH (δC 62.6 ppm), một carbon loại –O-CH2- (δC 69.9), các –CH2- (δC 35.7-23.7 ppm ) và carbon –CH3 nằm ở cuối mạch dài (δC 14.4 ppm). Từ những dữ liệu trên cho thấy LIEN-Bu1 là một cerebrosid có gắn một phân tử đường. Phổ HSQC cho phép gán các tín hiệu proton và carbon tương ứng. Proton 1 1 anomer δH 4.31 (d, J = 7.5 Hz, H-1") có tương quan H- H COSY đến xâu chuỗi H- 2"/H-3"/ H-4"/H-5"/H-6" trong vùng δH 3.20-3.38 và vùng δH (3.70-3.90). Từ đó Trang 35
  36. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp có thể gán các tín hiệu carbon dựa vào phổ HSQC. Phổ HMBC thể hiện một số tương quan như H-1" với C-3" (δC 78.0); H-2" với C-1" (δC 104.6), C-3"( δC 78.0), C-4" ( δC 71.5); H-4" với C-3" (δC 78.0), C-5" (δC 77.9), C-6" (δC 62.6). Như vậy phần đường glucose có cấu hình β do hằng số ghép của proton anomer là 7.5 Hz. Tương quan HMBC từ tín hiệu proton anomer H-1" (δH 4.31) đến tín hiệu δC 69.9 ( C-1), cho nên phân tử đường gắn qua vị trí C-1. Proton có δH 3.62 có tương quan HMBC đến các tín hiệu δC 69.9 (C-1), δC 51.6 ( C-2), δC 73.0 nên C-3 có gắn 1 1 nhóm –OH, tương quan H- H COSY giữa tín hiệu δH 3.62 và δH 3.54 vậy C-4 có gắn nhóm –OH Tương quan HMBC cho thấy từ tín hiệu δH 3.62 (H-3) đến tín hiệu có δC 33.0 (C-5), từ tín hiệu δH 3.54 (H-4) đến tín hiệu δC 27.1 ( C-6), δH 2.05 (H-7) đến δC 131.5, 131.3. Các tương quan xâu chuỗi trong 1H-1H COSY từ tín hiệu H-4 đến H-5/H-6/H- 7/H-8. Như vậy, LIEN-Bu1 là cerebrosid với phần ceramid gồm 2 phần: phần acid là acid béo có mang nhóm hydroxyl –OH ở vị trí số 2', phần aminoalcol có mang 3 nhóm hydroxyl ở vị trí 1, 3, 4 và có nối đôi ở vị trí số 8, hai proton olefin có hằng số ghép J = 5 chứng tỏ hai proton ghép cis với nhau. Phần đường β–D-glucose với các số liệu phổ NMR được trình bày trong bảng 7. Tuy nhiên các dữ liệu phổ NMR chưa xác định được chiều dài của mạch carbon. Khi so sánh số liệu phổ NMR của hợp chất LIEN-Bu1 với số liệu phổ của hợp chất aralia cerebrosid [40], cho thấy sự tương đồng cho nên đề nghị cấu trúc của hợp chất LIEN-Bu1 là: O H N m OH OH OH HO O HO O OH OH n Trang 36
  37. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Bảng 7: Số liệu phổ NMR của hợp chất LIEN-Bu1 Aralia Hợp chất LIEN-Bu1 cerebrosid STT δH (ppm) HMBC δC (ppm) δC(ppm) (J-Hz) (1H-13C) 4.07 (dd, 10.5/6.5; 3.83(dd, 1 69.9 1", 3 70.5 10.5/4.0) 2 4.28, m 51.6 1 51.7 3 3.62, ( dd, 12.5/6.5) 75.6 1,2,4 75.9 4 3.54 ( dt, 6.5) 73.0 72.4 5 33.0 - 6 27.1 - 7 33.7 32.1 8 5.44, (dt, 5.0/2.5) 131.5 9, 10 130.8 9 5.44( dt, 5.0/2.5) 131.3 8, 10 130.6 10 33.7 33.0 (-CH2-)n 35.7-23.7 -CH3 0.92 (t, 7.0) 14.4 1' 177.1 175.6 2' 4.0 (t, 3.5) 72.9 1', 3' 72.4 (-CH2-)m 35.7-23.7 - Trang 37
  38. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp -CH3 0.92 (t, 7.0) 14.4 - 1" 4.31, (d, 7.5) 104.6 1, 2", 3" 105.6 2" 3.20 (dd, 9.0/8.0) 75.0 1", 3", 4" 75.1 3" 3.30 (dd) 78.0 4", 5" 78.4 4" 3.30 (dd) 71.5 3", 5", 6" 71.4 5" 3.38 (t,9.0) 77.9 4" 78.6 6" 3.90 ( d,10.5); 3.70 (d, 5.5) 62.6 4", 5" 62.6 3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT LIEN-Bu2 Hợp chất LIEN-Bu2 (36 mg) thu được từ phân đoạn V.3.3.3 của vỏ thân cây Polyscias guilfoylei Bail có những đặc điểm như sau: - Hợp chất ở dạng bột vô định hình, màu trắng. - Phổ LC-MS (phụ lục 7, 8) cho mũi ion giả phân tử với m/z= 955.29 [M-H]-1 - Phổ 1H-NMR (pyridin-d5) ( phụ lục 9) δppm: 5.97 ( d, J=8.5 Hz); 5.29 ( br s); 5.23 (d, J=7.5 Hz); 4.97 ( d, J=8.0 Hz); 4.77 ( 1H, d, J=8.5 Hz); 4.75 (1H, d, J=8.5 Hz); 3.21 ( dd, J=10.5/4.0 Hz); 2.99 ( d, J=10.5 Hz). - Phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT-NMR ( pyridin-d5), (phụ lục 10, 11), δppm: 176.8 (>C=O), 175.3 (>C=O), 143.5 (=C CH-O- cộng hưởng trong vùng δC 70.1-85.4 ppm. Chứng tỏ, LIEN-Bu2 là saponin với phần Trang 38
  39. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp aglycon là acid oleanolic được xác định qua hai mũi cộng hưởng đặc trưng của carbon olefin C-12 và C-13 ở δC 122.3 (-CH=, C-12); 143.5 (=C CH-O-) tại δH 3.21 ( dd, J= 10.5/4.0 Hz); proton H-18 (>CH-) cộng hưởng ở δH 2.99 ( d, J=10.5), cùng với sự xuất hiện các mũi đơn ở vùng từ trường cao là những mũi cộng hưởng đặc trưng cho proton, của 7 nhóm –CH3 gắn vào carbon tứ cấp của acid oleanolic ở δH 1.11, 0.88, 0.82, 0.77, và 0.64. Phần đường còn được thể hiện qua các mũi cộng hưởng của proton anomer tại δH 5.97 ( d, J=8.5 Hz); 5.23 (d, J=7.5 Hz); 4.97 ( d, J=8.0 Hz); 4.77 ( d, J=8.5 Hz); 4.75 ( d, J=8.5 Hz). Phổ HSQC và HMBC còn cho thấy carbon C-3 của acid oleanolic cộng hưởng tại δC 89.4 và 89.3 ppm; hai proton anomer có δH 4.77 và δH 4.75 tương quan với C-3 của acid oleanolic, như vậy hợp chất LIEN-Bu2 có hai carbon C-3 và hai carbon này có gắn đường. Do đó LIEN-Bu2 là hỗn hợp hai saponin có chung phần aglycon là acid oleanolic, đều này cũng phù hợp với phổ đồ LC-MS của hợp chất LIEN-Bu2. Trong phổ đồ LC có hai pic với thời gian lưu nằm sát nhau (11.26 và 11.35). Chứng tỏ LIEN- Bu2 là hỗn hợp hai chất . Saponin thứ nhất ( LIEN-Bu2a). Như đã trình bày ở trên, phổ HMBC cho thấy sự tương quan giữa proton anomer δH 4.77 ( H-1'a) với C-3 có δC 89.3, như vậy LIEN-Bu2a có phân tử đường gắn qua C-3 của acid oleanolic . Phổ COSY, HSQC, HMBC giúp xác định được vị trí của các phân tử đường gắn vào nhau và nối vào aglycon . Phổ COSY xuất hiện sự tương quan giữa proton anomer H-1'a với proton δH 4.03 ( m ), cho nên H-2'a có δH là 4.03. Tương tự, phổ COSY sẽ giúp xác định các proton H-3'a, H-4'a, H-5'a. Phổ HSQC thể hiện sự tương quan giữa proton anomer H-1'a với carbon có δC 105.0 nên C-1'a có δC là 105.0. Các proton H-2'a, H-3'a, H-4'a, H-5'a lần lượt tương quan với các carbon có δC 74.3 ( C-2'a); 85.4 ( C-3'a); 70.3 ( C-4'a); 75.5 ( C-5'a). Trang 39
  40. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Phổ HMBC giúp xác định lại các proton cũng như các carbon qua một số tương quan như: H-2'a với C-1'a; H-2'a, H-4'a, H-5'a với C-3'a. Bên cạnh đó, phổ HMBC còn xuất hiện tương quan giữa H-4'a, H-5'a với carbon cacboxyl có δC 175.3 (-COOH). Do đó, phân tử đường thứ nhất gắn qua C-3 của acid oleanolic là đường acid glucuronic. Ngoài ra, trong phổ HMBC còn xuất hiện tương quan giữa proton anomer δH 5.23 ( d, J=7.5 Hz) với carbon C-3'a (δC 85.4); proton anomer δH 5.97 ( d, J=8.5 Hz) với C-28 của acid oleanolic (δC 176.8), như vậy phân tử đường thứ hai ( đường glucose) gắn vào đường acid glucuronic qua C-3'a, phân tử đường thứ 3 ( đường glucose) gắn qua C-28 của acid oleanolic. Ba phân tử đường điều có cấu hình β do hằng số ghép của 3 proton anomer là 7.5-8.5 Hz. Độ dịch chuyển hóa học của các proton và carbon của phân tử đường thứ2 và phân tử đường thứ 3 được xác định dựa vào phổ COSY, HMBC, HSQC và được trình bày trong bảng 8. Như vậy, hợp chất LIEN-Bu2a được dự đoán là một saponin có phần aglycon là acid oleanolic , phần có 3 phân tử đường gồm: 1 phân tử đường acid glucuronic và 2 phân tử đường glucose . Khi đó, công thức của LIEN-Bu2a là C48H76O19. Phổ LC-MS -1 (ghi nhận ion âm) cho mũi ion giả phân tử ở m/z=955.29 ([M-H] phù hợp với công thức phân tử C48H76O19 , M=956. Từ những dữ liệu trên khi so sánh với số liệu phổ nghiệm của hợp chất acid 3- O-β-D-glucopyranosyl-(1 3)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic.[14] ,có nhiều điểm tương đồng nên đề nghị cấu trúc của hợp chất LIEN-Bu2a là: 3-O-β-D- glucopyranosyl-(1→3)- glucuronopyranosyloleanolic-28-O-β-D-glucopyranosyl ester (LIEN-Bu2a). Saponin thứ 2 (LIEN-Bu2b. Như đề cập ở trên, tương tự LIEN-Bu2a , LIEN-Bu2b cũng là một saponin có phần aglycon là acid oleanolic , có phân tử đường gắn qua C-3 của acid oleanolic qua tương tác của proton anomer có δH 4.75 với C-3 (δC 89.4) Việc xác định vị trí của các phân tử đường gắn vào nhau và nối vào aglycon được dựa vào các phổ COSY, HSQC, HMBC. Tương quan HMBC từ δH 4.75 ( d, J=8.5) đến tín hiệu δC 89.4 ( C-3 của acid oleanolic) cho thấy phân tử đường thứ nhất Trang 40
  41. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp gắn vào acid oleanolic qua C-3. Proton anomer H-1'b có tương quan 1H-1H COSY đến xâu chuỗi H-2'b/H-3'b/H-4'b/H-5'b. Phổ HSQC cho phép gắn các tín hiệu proton và carbon tương ứng.Tương quan HMBC từ tín hiệu δH 4.32 ( H-5'b) đến carbon cacboxyl δC 175.3 cho biết phân tử đường thứ nhất là đường acid glucuronic. Phân tử đường thứ 2 ( đường glucose) gắn vào đường acid glucuronic tại C-4', được xác định qua tương quan HMBC từ tín hiệu δH 4.97 ( d, J=8.0 Hz, H-1"b) đến tín hiệu δC 82.2 ( C-4'b). Phân tử đường thứ 3 (đường glucose) gắn vào acid oleanolic qua tương quan HMBC từ tín hiệu δH 5.97 ( d, J= 8.5 Hz) đến tín hiệu δC 176.8 (C-28). Các phân tử đường này cũng có cấu hình β do hằng số ghép của ba proton anomer này là 7.5-8.5 Hz. Như vậy, LIEN-Bu2b cũng được dự đoán là saponin có phần aglycon là acid oleanolic, phần đường gồm có: 2 phân tử đường glucose và 1 phân tử đường acid glucuronic, ứng với công thức phân tử C48H76O19 . -1 Phổ LC-MS cũng cho cùng mũi ion giả phân tử ở m/z=955.29 ([M-H] phù hợp với công thức phân tử C48H76O19 , M=956. Việc phân tích dữ liệu phổ nghiệm và so sánh với dữ liệu phổ nghiệm của hợp chất: 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic-28-O-β-D- [42] glucopyranosyl ester cho thấy có sự tương đồng nên cấu trúc hợp chất LIEN-Bu2b được đề nghị là: 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic- 28-O-β-D- glucopyranosyl ester. Như vậy, LIEN-Bu2 là hỗn hợp hai saponin: 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)- β-D-glucuronopyranosyloleanolic-28-O-β-D-glucopyranosyl ester ( LIEN-Bu2a) và 3- O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic-28-O-β-D- glucopyranosyl ester ( LIEN-Bu2b) với tỉ lệ 3:1. Trang 41
  42. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp 29 30 20 12 18 13 22 25 11 26 17 28 COO 1 1''' O 10 15 H OH 6' H 6'' HOOC 3 5 27 HO 6''' OH 5'' O HO O HO O O HO H 3''' 3' HO 3'' 1'' 1' 24 HO OH OH 25 H H 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic-28-O-β-D- glucopyranosyl ester ( LIEN-Bu2a) CH3 H3C O CH3 CH3 C O OH H CH3 O HOOC O HO O HO HO O O HO OH H OH H3C CH3 OH HOHO 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic-28-O-β-D- glucopyranosyl ester ( LIEN-Bu2b). Bảng 8: Số liệu phổ NMR của hợp chất LIEN-Bu2a Hợp chất so sánh [14] Hợp chất LIEN-Bu2a (pyridine – d5) (pyridine – Vị trí d5) δH (ppm) Loại cacbon δC (ppm) δC (ppm) (J-Hz) Trang 42
  43. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp 1 -CH2- 38.0 38.9 2 -CH2- 25.6 26.3 3.21,( dd, 3 >CH-OH 89.3 89.6 10.5/4.0) 4 >C CH- 55.2 56.1 6 -CH2- 17.8 18.7 7 -CH2- 31.8 33.3 8 >C CH- 47.3 48.2 10 >C C C CH- 2.99, (d, 10.5) 41.5 42.2 19 -CH2- 45.7 46.7 20 >C< 30.1 31.1 21 -CH2- 33.3 34.5 22 -CH2- 32.4 33.4 23 -CH3 1.11, s 27.5 28.4 24 -CH3 0.88, s 16.8 17.1 25 -CH3 0.64, s 14.8 15.6 Trang 43
  44. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp 26 -CH3 0.82, s 16.3 17.6 27 -CH3 1.11, s 25.5 26.3 28 >C=O 176.8 180.2 29 -CH3 0.82, s 32.4 33.3 30 -CH3 0.77, s 23.0 23.9 1' >CH-OH 4.77, (d, 8.5) 105.0 105.9 2' >CH-OH 4.03, m 74.3 74.6 3' >CH-OH 4.22, m 85.4 87.9 4' >CH-OH 4.11, m 70.3 71.7 5' >CH-OH 4.23, m 75.5 75.9 6' -COOH 175.3 175.5 1'' >CH-OH 5.23, (d, 7.5) 103.8 105.7 2'' >CH-OH 3.86, m 73.9 75.2 3'' >CH-OH 4.07, m 76.6 78.0 4'' >CH-OH 4.09, m 70.9 71.5 5'' >CH-OH 3.85, m 77.1 78.2 6'' -CH2OH 61.2 62.2 1"' >CH-OH 5.97, (d, 8.5) 94.8 2"' >CH-OH 4.04, m 72.8 3"' >CH-OH 3.85, m 77.9 4"' >CH-OH 4.05, m 70.0 5"' >CH-OH 4.12, m 77.2 6"' -CH2OH 61.3 Bảng 9: Số liệu phổ NMR của hợp chất LIEN-Bu2b Trang 44
  45. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Hợp chất so sánh [42] Hợp chất LIEN-Bu2b (pyridine – d5) Vị trí (pyridine – d5) δH (ppm) Loại cacbon δC (ppm) δC (ppm) (J-Hz) 1 -CH2- 38.0 38.7 2 -CH2- 25.6 26.5 3.21,( dd, 3 >CH-OH 89.4 89.3 10.5/4.0) 4 >C CH- 55.2 55.8 6 -CH2- 17.8 18.5 7 -CH2- 31.8 33.1 8 >C CH- 47.3 48.1 10 >C C C CH- 2.99,( d, 10.5 ) 41.5 41.8 19 -CH2- 45.7 46.3 20 >C< 30.1 30.8 Trang 45
  46. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp 21 -CH2- 33.3 34.1 22 -CH2- 32.6 33.1 23 -CH3 1.11, s 27.5 28.2 24 -CH3 0.88, s 16.8 17.0 25 -CH3 0.64, s 14.8 15.5 26 -CH3 0.82, s 16.3 17.5 27 -CH3 1.11, s 25.5 26.1 28 >C=O 176.8 176.4 29 -CH3 0.82, s 32.4 32.6 30 -CH3 0.77, s 23.0 23.5 1' >CH-OH 4.75, ( d, 8.5) 105.3 106.8 2' >CH-OH 4.03, m 74.3 74.9 3' >CH-OH 4.11, m 76.2 76.4 4' >CH-OH 4.27, m 82.2 82.5 5' >CH-OH 4.32, m 76.3 75.8 6' -COOH 175.3 172.3 1'' >CH-OH 4.97, ( d, 8.0) 103.4 104.7 2'' >CH-OH 3.85, m 73.7 74.9 3'' >CH-OH 4.23, m 76.6 78.1 4'' >CH-OH 4.09, m 70.2 71.7 5'' >CH-OH 4.13, m 77.1 78.5 6'' -CH2OH 61.2 62.7 1"' >CH-OH 5.97, ( d, 8.5) 94.8 95.8 2"' >CH-OH 4.04, m 72.8 74.1 3"' >CH-OH 3.85, m 77.9 79.2 Trang 46
  47. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp 4"' >CH-OH 4.05, m 70.0 71.3 5"' >CH-OH 4.12, m 77.2 78.9 6"' -CH2OH 61.3 62.4 Trang 47
  48. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 KẾT LUẬN. Việc khảo sát thành phần hóa học của cây Đinh lăng trổ Polyscias guilfoylei Bail., thu hái tại Khánh Hòa đã thu được những kết quả như sau: Từ phân đoạn III cao butanol đã cô lập được hợp chất LIEN-Bu1, sử dụng các phương pháp phân tích hóa lí hiện đại NMR, kết hợp so sánh với các tài liệu tham khảo đã đề nghị cấu trúc LIEN-Bu1 là một cerbrosid: O H N m OH OH OH HO O HO O OH OH n LIEN-Bu1 Từ phân đoạn V cao butanol đã cô lập được hợp chất LIEN-Bu2 , sử dụng các phương pháp phân tích hóa lí hiện đại NMR, kết hợp so sánh với các tài liệu tham khảo đã đề nghị cấu trúc LIEN-Bu2 là một hỗn hợp hai saponin: 3-O-β-D- glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic-28-O-β-D-glucopyranosyl ester và 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic-28-O-β- D-glucopyranosyl ester (LIEN-Bu2a và LIEN-Bu2b) với tỉ lệ (3:1) Công thức của hợp chất LIEN-Bu2a và LIEN-Bu2b được đề nghị như sau: Trang 48
  49. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp CH3 H3C CH3 CH3 COO O OH H CH3 HOOC HO OH O HO O HO O O HO H H3C HO CH3 HO OH OH 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic -28-O-β-D-glucopyranosyl ester (LIEN-Bu2a) CH3 H3C O CH3 CH3 C O OH H CH3 O HOOC O HO O HO HO O O HO OH H OH H3C CH3 OH HOHO 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic -28-O-β-D-glucopyranosyl ester (LIEN-Bu2b). Trong số các hợp chất đã được cô lập thì hợp chất LIEN-Bu1 thuộc loại cerebrosid và LIEN-Bu2a lần đầu tiên được cô lập từ cây Polyscias guilfoylei Bail. 4.2 ĐỀ XUẤT: Do hạn chế về thời gian nên còn rất nhiều phân đoạn chúng tôi chưa nghiên cứu. Vì vậy, thời gian tới chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu những phân đoạn còn lại, đồng thời tiến hành thử hoạt tính sinh học đối với các loại cao và các hợp chất đã cô lập được. Ngoài phần lá và vỏ thân thì phần rễ của các cây thuộc chi Polyscias cũng thường được sử dụng để làm thuốc, và những nghiên cứu trước đó cũng cho thấy rễ của một số cây thuộc chi Polyscias có chứa rất nhiều hoạt chất như: saponin, acid amin, vitamin Do đó thời gian tới chúng tôi sẽ tiến hành thu hái nguyên liệu và khảo sát trên phần rễ của cây để góp phần làm rõ hơn thành phần hóa học của cây Đinh lăng trổ Polyscias guilfoylei Bail. Trang 49
  50. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO A. PHẦN TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1]. Đỗ Huy Bích, Nguyễn Tập, Trần Toàn, Trần Hùng, Vũ Ngọc Lệ, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Phạm Duy Mai, Bùi Xuân Chương (1993), Tài nguyên cây thuốc Việt Nam, Viện Dược liệu, Chương trình tạo nguồn nguyên liệu làm thuốc, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, 394 – 40. [2]. Võ Văn Chi (1997), Tự điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, TP. HCM, 178. [3]. Nguyễn Thị Thúy Hằng (2008), Tìm hiểu thành phần hóa học của cây Polyscias scutellaria, Luận văn Thạc sĩ khoa học hóa học, Trường ĐH KHTN TP. HCM. [4]. Nguyễn Thị Thu Hương, Lương Kim Bích (2001), Nghiên cứu tác dụng chống trầm cảm và stress của Đinh lăng, Tạp chí Dược liệu, 6 (2-3), 84-86 [5]. Văn Bá Lãnh (2011), Khảo sát thành phần hóa học cây Đinh lăng trổ Polyscias guilfoylei var. quinquefolia Bail. Họ Nhân Sâm (Araliaceae), Khóa luận tốt nghiệp cử nhân hóa học, Trường ĐH Sư phạm TP.HCM. [6]. Ngô Ứng Long, Tác dụng tăng lực và bổ chung của Đinh lăng, Tóm tắt công trình Đinh lăng 1964 – 1974 (1977), Nội san Đại học Quân Y, 41 – 45. [7]. Ngô Ứng Long, Nguyễn Khắc Viện (1985), Tạp chí dược học, 1, 17. [8]. Đỗ Tất Lợi (1995), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB KHKT, 1030. [9]. Võ Xuân Minh (1991), Góp phần tìm hiểu về thành phần hóa học và dạng bào chế của cây Đinh lăng”, Tạp chí Dược học, 3, 19-21. [10]. Võ Xuân Minh (1992), Nghiên cứu về saponin Đinh lăng và dạng bào chế từ Đinh lăng, Luận án PTS KH Y dược, Đại học Dược Hà Nội. [11]. Nguyễn Thị Nguyệt, Võ Xuân Minh, Nguyễn văn Bàn (1992), Một số kết quả nghiên cứu về saponin trong Đinh lăng, Tạp chí Dược học, 3, 15-16. [12]. Nguyễn Thới Nhâm, Nguyễn Thị Thu Hương, Lương Kim Bích (1990), Tác dụng dược lí của cao toàn phần chiết xuất từ rễ và lá Đinh lăng Polyscias fruticosa L. Harms., Araliaceae, Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học, Viện Dược liệu. [13]. Nguyễn Thúy Anh Thư (2007), Tìm hiểu thành phần hóa học của cây Polyscias filicifolia, Luận văn Thạc sĩ khoa học hóa học, Trường ĐH KHTN TP. HCM. Trang 50
  51. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp [14]. Nguyễn Thị Ánh Tuyết (2009), Tìm hiểu thành phần hóa học của một số cây thuộc chi polyscias họ nhân sâm (Araliaceae), luận án TS hóa học, Trường ĐHKHTN, tr 65-82, 2010 [15]. Huỳnh Ngọc Tựng (2000), Tạp chí Thuốc và Sức khỏe, 174, 11-12. [16]. Nguyễn Khắc Viện (1989), Góp phần nghiên cứu tác dụng dược lí của cao rễ Đinh lăng trên một số chức năng của cơ thể, Luận án PTS. ngành Dược lý, Học viện Quân Y. B. PHẦN TÀI LIỆU TIẾNG ANH [17]. Chaboud A., Rougny A., Proliac A., Raynaud J., Cabalion P. (1995), A new triterpenoid saponin from Polyscias fruticosa, Fr. Pharmazie, 50(5), 371. [18]. Chaboud A., Rougny A., Proliac A., Raynaud J., Cabalion P. (1996), A oleanolic saponin from Polyscias fruticosa Harms var yellow leaves, Pharmazie, 51(8), 611- 612. [19]. Divakar M. C., Devi S. Lakshmi, Kuma P. Senthil, Rao S. B. (2001), Studies on wound healing property of Polyscias scutellaria leaf saponins, Indian Journal of Natural Products, 17(2), 37–42 (CA., 139, 191308). [20]. Dvornyk A. S., Dugan O. M., Kunakh V. A. (1999), Estimation of antimutagenic activities of the extracts from the biomass of cultured cells of some medicinal plants, Dopovidi Akademiyi Nauk Ukrayiny, 7, 166-169. [21]. Dvornyk A. S., Pererva T. P., Kukakh V. A. (2002), Screening substances derived from cultures of medicinal plants for antimutagenic activity in the Escherichia coli – bacteriophage lamdba system, Tsitol Genet, 36(2), 3-10. [22]. Erdal Bedir, Ngeh J. Toyang, Ikhlas A. Khan, Larry A.,Walker, Alice M. Clark (2001), A new dammarane-type triterpene glycoside from Polyscias fulva, Journal of Natural Products., 64(1), 95-97. [23]. Furmanowa M., Nosov A. M., Oreshniko A. V., Klushin A. G., Kotin M., Starosciak, B., Sliwinska A., Guzewska J., Block R. (2002), Antimicrobial activity of Polyscias filicifolia cell biomass extracts, Pharmazie, 57(6), 424-426. [24]. Gregry M. Plunkett, Porter P. Lowwry II, Ninh V. Vu (2004), Phytogenetic relationship among Polyscias (Araliaceae) and close relatives from the Western Indian Ocean Basin, International Journal of plant Science, 165, 681. Trang 51
  52. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp [25]. Gopalsamy N., Gueho J., Julien H. R., Owadally A. W., Hostettmann K. (1990), Molluscidal saponin from Polyscias dichroostachya, Phytochemistry, 29 (3), 793-5. [26]. Joseph J. Brophy, Erich V. Lassak, Apichart Suksamrarn (1990), Constituents of the volatile leaf oils of Polyscias fruticosa (L.) Harms., Flavour and Fragrance Journal, 5, 197-182. [27]. Kasauskas A., Viezelience D. (2005), Effect of Polyscias filicifolia Bailey biomas culture on the activity of pig heart aminoacyl-tRNA synthetases under anoxia, Federation of European Biochemical Scociety (FEBS) Journal. [28]. Lussignol M., Raynaud J., Cabalion P. (1991), Deux mono-O-glycosylflavonoides des feuilles de Polyscias sp. nov. (Araliacées), Fr. Pharmaceutica Acta Helvetiae, 66(5-6). [29]. Lutomski J., Luan T. C. and Hoa T. T. (1992), Polyacetylenes in the Araliaceae family, Herba Polonica, 38(1), 3-11. [30]. Malcolm S. Buchanan, Anthony R. Carroll, Annette Edser, John Parisot, Rama Addepalli, Ronald J. Quinn (2005), Tyrosine kinase inhibitors from the rainforest tree Polyscias murrayi, Phytochemistry, 66, 481-485. [31]. Mitaine-Offer A. C, Tapondjou L.A., Lontsi D., Sondengam B.L., Choudhary M.I., Atta-ur-Rahman, Lacaille-Dubois M.-A (2004), Constituents isolated from Polyscias fulva, Biochemical Systematic and Ecology, 32, 607-610. [32]. Nguyen Thi Anh Tuyet, Nguyen Ngoc Suong, Nguyen Kim Phi Phung (2007), Two novel Oleanolic glycosides from Polyscias Balfouriana (Araliaceae), Journal of chemistry,46 (3), P.379-384, 2008. [33]. Nguyen Thi Anh Tuyet, Bach Thanh Lua, Nguyen Ngoc Suong, Nguyen Kim Phi Phung (2010), Three Oleanane saponins from roots of Polyscias Balfouriana (Araliaceae), Journal of chemistry, 48(4B), P.255-260, 2010. [34]. Paphassarang S., Raynaud J., Lussignol M. (1988), Polyscias saponin-P7 from Polyscias scutellaria Burm. F. (Araliaceace), Fr. Pharmazie, 43(4), 296-297. [35]. Paphassarang S., Raynaud J., Lussignol M., Becchie M. (1989), Triterpenic glycoside from Polyscias scutellaria, Phytochemistry, 28(5), 1539-1541. [36]. Paphassarang S., Raynaud J., Lussignol M., Becchie M. (1989), Triterpenoid saponins from Polyscias scutellaria, Journal of Natural Products, 52(2), 239-42. Trang 52
  53. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp [37]. Paphassarang S., Raynaud J., Lussignol M., Cabalion P. (1990), A new oleanolic glycoside from Polyscias scutellaria, Journal of Natural Products, 53(1), 163-166. [38]. Prakash Chatuvedula V. S., Jennifer K. Schilling, James S. Miller, Rabodo Andriantsiferana, Vincent E. Rasamison, David G. Kingston (2003), New cytotoxic oleanane saponins from the infructescences of Polyscias amplifolia from the Madagascar rainforest, Planta Medica, 69(5), 440-444. [39]. Sandhya S., Vinod K.R., Madhu Diwakar C., Nema Rajesh Kumar (2010), Evaluation of antiulcer activity of root and leaf extract of Polyscias balfouriana var.marginata, J. Chem. Pharm. Res., 2(1), 192-195 [40]. Sam Sik Kang, Ju Sun Kim, Yong Nan Xu, Young Hee Kim (1999), Isolation of a new cerebroside from the root bark of Aralia elata, Journal of Natural Products, 62, 1059-1060. [41]. Vander Haar A. W. (1912), Phytochemische Untersuchungen in der Familie der Araliaceae. I. Saponinartige Glykoside aus den Blättern von Polyscias nodosa und Hedera helix, Arch. Pharm, 250, 424-235 [42]. Vo Duy Huan, Satoshi Yamamura, Kazuhiro Ohtani, Ryoji Kasai, Kazuo Yamasaki, Nguyen Thoi Nham and Hoang Minh Chau (1998), Oleanane saponin from Polyscias fruticosa, Phytochemistry, 47(3), 451-457. C. PHẦN TÀI LIỆU TRÊN MẠNG INTERNET [43]. [44]. Trang 53
  54. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Xác nhận của chủ tịch hội đồng: Xác nhận của giáo viên phản biện: Xác nhận của giáo viên hướng dẫn: Trang 54
  55. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR của hợp chất LIEN-Bu1 Trang 55
  56. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 1a: Phổ 1H-NMR của hợp chất LIEN-Bu1 Trang 56
  57. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 1b: Phổ 1H-NMR của hợp chất LIEN-Bu1 Trang 57
  58. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 2: Phổ 13C-NMR của hợp chất LIEN-Bu1 Trang 58
  59. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 3: Phổ 13C-NMR kết hợp phổ DEPTcủa hợp chất LIEN-Bu1 Trang 59
  60. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 4: Phổ COSY của hợp chất LIEN-Bu1 Trang 60
  61. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 5: Phổ HSQC của hợp chất LIEN-Bu1 Trang 61
  62. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 5a: Phổ HSQC của hợp chất LIEN-Bu1 Trang 62
  63. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 6: Phổ HMBC của hợp chất LIEN-Bu1 Trang 63
  64. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 7: Phổ đồ LC của hợp chất LIEN-Bu2 Trang 64
  65. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 8: Phổ đồ MS của hợp chất LIEN-Bu2 Trang 65
  66. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 9: Phổ 1H-NMR của hợp chất LIEN-Bu2 Trang 66
  67. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 9a: Phổ 1H-NMR của hợp chất LIEN-Bu2 Trang 67
  68. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 9b: Phổ 1H-NMR của hợp chất LIEN-Bu2 Trang 68
  69. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 9c: Phổ 1H-NMR của hợp chất LIEN-Bu2 Trang 69
  70. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 10: Phổ 13C-NMR của hợp chất LIEN-Bu2 Trang 70
  71. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 10a: Phổ 13C-NMR của hợp chất LIEN-Bu2 Trang 71
  72. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 11: Phổ 13C-NMR kết hợp phổ DEPTcủa hợp chất LIEN-Bu2 Trang 72
  73. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 12: Phổ COSY của hợp chất LIEN-Bu2 Trang 73
  74. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 12a: Phổ COSY của hợp chất LIEN-Bu2 Trang 74
  75. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 13: Phổ HSQC của hợp chất LIEN-Bu2 Trang 75
  76. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 13a: Phổ HSQC của hợp chất LIEN-Bu2 Trang 76
  77. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 14: Phổ HMBC của hợp chất LIEN-Bu2 Trang 77
  78. Nguyễn Thị Kim Liên Khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 14a: Phổ HMBC của hợp chất LIEN-Bu2 Trang 78